DK148303B

DK148303B - Fremgangsmaade til fremstilling af cysteinholdige peptider

Info

Publication number: DK148303B
Application number: DK012379AA
Authority: DK
Inventors: Wolfgang Koenig
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1978-01-12
Filing date: 1979-01-11
Publication date: 1985-06-03
Also published as: EP0003122A1; DK12379A; DE2960279D1; EP0003122B1; DE2801175A1; HU180787B; US4212796A; JPS54100321A

Description

i 148303 o

Opfindelsen angår en særlig fremgangsmåde til fremstilling af cysteinholdige peptider.

Ved syntesen af cysteinholdige peptider har tri-tyl-(Trt)-gruppen til beskyttelse af mercaptofunktionen 5 haft større og større betydning. Den sure fraspaltning af denne beskyttelsesgruppe stødte imidlertid på vanskeligheder ved højeremolekylære peptider. Således kunne beskyttelsesgrupperne kun ved gentagne behandlinger med HBr og trifluoreddikesyre eller HF fraspaltes fra en in-10 sulin-A-kæde, hvis 4-cysteingrupper var beskyttet ved tritylgrupper, jfr. Z. Naturforsch. 24 b, 1128 (1969).

Udbyttet af insulin-A-kæde-tetrasulfonater ved fuldtbe-skyttet kæde var kun 21%.

Ren trifluoreddikesyre bevirker ingen fraspaltning 15 (Chem. Ber, 101, 681 (1968)); efter at trifluoreddikesyre-opløsningen af S-tritylforbindelsen imidlertid blev hældt ud i vand, kunne der ved H-Cys(Trt)-OH iagttages en 70-75°/>'s fraspaltning. Ved peptider var fraspaltningshastigheden dog kun maksimalt 67%. (J. Chem. Soc. (c) 1970, 20 2683).

S-tritylgruppen ved cysteinholdige peptider fraspaltes derfor for det meste ved iodoxidation i organiske opløsningsmidler (j. Amer. Chem. Soc. 74 (1952), 1862?

Helv. Chim. Acta 51 (1968), 2061) eller i vandig eddikesyre 25 (DAS I.917.939)· Ved denne oxidation fremkommer det tilsva rende cystinderivat direkte, og en deblokering under regenerering af mercaptofunktionen er således ikke mulig ad denne vej. En yderligere ulempe ved denne metode er, at iod som stærkt oxidationsmiddel ved oxidationsfølsomme peptider kan 30 danne biprodukter.

Medens trifluoreddikesyreblandinger med vand eller kationfangeren anisol påvirker fraspaltningen af S-trityl-grupper ugunstigt, har det overraskende vist sig, at blandinger af trifluoreddikesyre med mercaptaner er et udmærket 35 og mildt fraspaltningsmedium for S-tritylgrupper.

148303 o

Den foreliggende opfindelse angår således en fremgangsmåde til fremstilling af cysteinholdige peptider ud fra de tilsvarende peptider, hvori mercapto-grupperne er beskyttet med S-trityl-grupper, ved fra-5 spaltning af S-tritylgruppeme ved hjælp af trifluored- dikesyre, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at S-tritylpeptiderne behandles med en blanding af en mercaptan og trifluoreddikesyre, idet der anvendes en trifluoreddikesyrekoncentration på mindst 30 rumfangs-10 procent.

Som mercaptaner kommer både aliphatiske og aromatiske mercaptaner, f.eks. ethylmercaptan, mercaptoeddikesyre eller thiophenol, i betragtning. Særlig gunstig har ethylmercaptan vist sig at være, idet den er let flygtig og 15 let kan fjernes med ether. Der anvendes fortrinsvis blandinger, der pr. 1 mol stof, fra hvilke tritylgrupperne skal fraspaltes, indeholder 100 mol mercaptan eller mere.

Trifluoreddikesyrekoncentrationen er mindst 30 rumfangsprocent, men bør helst ikke være under 40-50 rumfangs-20 procent. Reaktionstiden for tritylfraspaltningen er ved en 50 rumfangsprocents trifluoreddikesyre-ethylmercap-tan-opløsning 10-60 minutter, for det meste 30 minutter.

Til oparbejdning indføres der hensigtsmæssigt i vand. Efter indføringen i overskydende vand fremkommer peptidet 25 alt efter opløseligheden enten ved fraskillelse ved sugnihg eller ved frysetørring af den med ether udrystede vandige fase.

Det for beskyttelsesgrupperne befriede peptid kan også isoleres ved udfældning i organiske opløsningsmidler, 30 f.eks. diethylether, diisopropylether eller eddikeester.

Denne oparbejdningsmetode anvendes fortrinsvis, når de fremkomne peptider er tungtopløselige i vand. Eventuelt tilstedeværende let surt fraspaltelige beskyttelsesgrupper, såsom 3,5-dimethoxy-a,a-dimethylbenzyloxycarbonyl-(Ddz)-gruppen, 35

O

3 148303 tert.butyloxycarbonyl-(Boc)-gruppen eller tert.butyl-esteren og -etheren, fraspaltes ligeledes ved den her omhandlede fremgangsmåde.

Alt efter arten af disse beskyttelsesgrupper må 5 reaktionstiden udvides mere eller mindre. Til en fuldstændig fraspaltning af beskyttelsesgrupperne af tert.-butyl-typen er f.eks. ca. 4 timer nødvendige i en 50 rumfangsprocents trifluoreddikesyre-ethylmercaptan-op-løsning. Ved længere peptider med flere beskyttede mer-10 captogrupper kan en gentagelse af fraspaltningen være fordelagtig.

Som reaktionsbiprodukt fremkommer der f.eks. ved tritylfraspaltningen med trxfluoreddikesyre og ethylmercap— tan S-tritylmercaptoethan, som ved oparbejdningen går over 15 i den organiske fase.

Særlig værdifuld er fremgangsmåden iiøJLge opfindelsen ved højere peptider, for hvilke iodfraspaltningen på grund af opløseligheden eller oxydationsfølsomheden ikke længere er mulig. Peptider, der kun er dårligt opløse-20 lige i methanol eller vandig eddikesyre, opløses med lethed i de her omhandlede trifluoreddikesyre-mercaptan-blandinger.

Således fremstilles der f.eks. ved behandling to gange med mercaptoethanol og trxfluoreddikesyre af de 4 S-tritylgrupper og de 7 tert.butyl-(But)-beskyttelses-25 grupper, en syntetisk opbygget beskyttet humaninsulin- -A-kæde i ca. 65%'s udbytte, jfr. eksempel 9. Denne frie reducerede insulin-A-kæde omdannes til karakterisering til tetrasulfonatet. Der fremkommer et produkt, som både i den sure elektroforese og tyndtlagschromatografisk er 30 identisk med den naturlige humaninsulin-A-kæde.

De fremkomne cysteinholdige peptider er enten direkte terapeutisk anvendelige som f.eks. somatostatin til behandling af Pancreatitis eller tjener til syntese af højere, terapeutisk værdifulde peptider.

35

O

4 148303

Eksempel 1 a) H-Cys-Asn-OH-trifluoracetat 5 a^) Til en blanding af 25 ml ethylmercaptan (330 npiol) og 25 ml trifluor eddike syre sættes der under omrøring· 5» 34 g· (lO mmol) H-Cys(Trt)-Asn-OBu^ (Helv. Chim. Acta J?4, 398 (1971)). Der omrøres i 4 timer ved stuetemperatur, og blandingen hældes i 250 ml vand. Der ekstraheres derefter tre 10 gange med ether, og den vandige fase frysetørres. Udbyttet er 3,271 g (89 %) . - +3,0° (c=l, i methanol).

c^^o^s . ce3cooh . h2o (367,3):

Beregnet: C=29,4o%\ H=4,39$5 N*ll,44j6| S=8,73$} H20=4,9$.

15 Fundet: C=30,5 %', H=4,0 %-, Nell, 2 %·, S=8,9 ?£,· H20=k,6%.

a2) Til en blanding af 7,5 ml ethyhnercaptan (100 rtpiol) og 7,5 ml trifluoreddikesyre sættes der under omrøring 1,6 g -tø (3 mmol) H-Cys(Trt)-Asn-OBu . Der henstilles i 4 timer 20 ved stuetemperatur, og blandingen rystes i 50 ml diisopro- pylether. Fældningen fraskilles ved sugning, vaskes med diisopropylether og tørres. Udbyttet er 1 g (91%>) , = + 3,6° (c = 1, i vand).

Forbindelsen er tyndtlagschromatografisk identisk 25 .

med den under a^) fremkomne forbindelse.

a3) Udgangsmateriale analogt med eksempel a2).

X stedet for diisopropylether anvendes der diethylether.

Udbytte: 0,95 g (86%). /a 7^ = + 3° (c = 1, i vand).

30 ~ D

Forbindelsen er tyndtlagschromatografisk identisk med den under a^) fremkomne forbindelse.

a^) Til en blanding af 3,7 ml mercaptoeddikesyre og 3,7 ml trifluoreddikesyre sættes der under omrøring 35 <jj 533,7 mg (l mmol) H-Cys(Trt)-Asn-OBu . Der omrøres ved stue-

O

5 1A 8 3 O 3 temperatur i 4 timer, og blandingen rystes i 50 ml diethyl- ether. Fældningen fraskilles ved sugning og vaskes med diethylether. Udbytte: 210 mg (57$). - 2,9° (c = 1, i vand).

5 b) (H-Cys-Asn-OH)2 (lodoxidation af H-Cys-Asn-OH) 2,6 g (7 mmol) H-Cys-Asn-OH . CF^COOH . HgO opløses i 25 ml 4o$'s eddikesyre og titreres med 0,1 N iod-10 -opløsning i eddikesyre. Der forbruges 67,8 ml iodopløs-ning ( = 97$ af det teoretiske).

Derpå inddampes der. Remanensen opløses i vand, og den vandige opløsning udrystes med ether. Den vandige fase frysetørres. Udbytte: 2,42 g (97,6$).

15 . 0,8 HJ . H20 (35^,6) :

Beregnet: 0=23,71% H=4,20$j N=ll,85% S=9,04% J=28,63$.

Fundet: 0=24,1 % H=4,l % N=10,5 % S=8,6 % J=28,4 $.

20 500 mg af den ovenfor fremkomne forbindelse opløses i en smule vand og chromatograferes over Amberlite ® IR 45 (acetat-form) (25 x 1,5 cm). Eluatet frysetørres.

Udbytte: 26θ,θ4 mg (67$ af det teoretiske beregnet på uoxi- 2> 5 o 25 deret materiale). /= - 62,1° (c = 1, i vand).

C^EL^N^O^S . 0,25 CH3C00H . H.,0 (268,3):

Beregnet: C=33,57$} H=6,01% N=15,66$; eddikesyre = 5,59$} H20=6,71$; 30 Fundet: 0=34,6 $} H=5,7 $} N=16,0 $} eddikesyre = 5,7 $} H20=6,9 $.

35

O

6 148303

Eksempel 2 a) H-Leu-Glu-Asn-Tyr -Cy s -As n-OH-1 r if luor ac etat 5 639,8 mg (θ-,5 mmol) H-Leu-Glu(OBu^)-Asn-Tyr(Bu^)- -Cys(Trt)-Asn-OBu^ . CF^COOH opløses i en blanding af 2,5 ml ethylmercaptan (33 irmol) og 2,5 ml trifluoreddikesyre. Der an-røres i 4 timer ved stuetemperatur, og reaktionsblandingen hældes i 50 ml vand. Den vandige fase ekstraheres tre gange Ί0 med ether og frysetørres. Udbytte: 331,5 mg (73$)· = -30,4° (c = 1, i vand).

C^H^NgO^S . CF3C00H . 2 HgO (904,9):

Beregnet: 0=43,80$; H=5,45$f N=12,38$; S=3,54$.

15 Fundet: 0=44,4 $; H=5,6 $; N=12,3 °/0; S=3,8 $.

b) Fremstilling af udgangsforbindelsen H-Leu-Glu(OBu^)-Asn--Tyr(Bu^)-Cys(TrtJ-Asn-OBu^-trifluoracetat 20 b^) Ddz-Leu-OTcp 33,3 g Ddz-Leu-0H (Ann. Chem. 1973. 1652-1662) (94,3 mmol) opløses med 19,6 g (0,1 mol) 2,4,5-trichlor-phenol i 350 ml eddikeester. Hertil sættes der ved 0°C en 25 opløsning af 20,4 g DCC (dicyclohexylcarbodiimid) i 60 ml eddikeester. Der omrøres i 3 timer ved 0°C og natten o-ver ved stuetemperatur. Det udfældede dicyclohexylurin-stof fraskilles ved sugning, og filtratet inddampes. Remanensen krystalliserer med petroleumsether natten over i 30 kølerum. Udbytte: 39,2 g (73,6% beregnet på H-Leu-OMe .

HC1). Smp. 108°C, [a]p9 = 31,3° (c = 1, i dimethylacet-amid) .

C24H28N06C13 (532,83): 35 Beregnet: 0=54,10$; H=5,30$; N=2,62$; 01=20,01$.

Fundet: 0=54,7 $; H=5,4 $; N=2,9 $; 01=19,3 $·

O

7 148303

bg) Ddz-Leu-GluiOBu*)-Asn-Tyr(Bu^)-OH . 0,5 H^O

27,7 g (50 mmol) H-Glu(OBu*)-Asn-Tyr(Bu^)-OH 5 (Chem. Ber. 110. 1-11 (1977)) suspenderes i 150 ml dimethyl-formamid. Efter tilsætning af 6,75 g HOBt (1-hydroxyben-zotriazol) (50 mmol) fremkommer der en opløsning. Der afkøles til 0°C og tilsættes 6,5 ml (50 mmol) N-ethylmor-pholin og 28 g (52,5 mmol) Ddz-Leu-OTcp, hvor Tcp beteg-10 ner 2,4,5-trichlorphenylester. Der omrøres 1 _time ved 0°C og 3 timer ved stuetemperatur. En FluoranP-prøve viser, at hele aminokomponenten endnu ikke er afreageret.

Der tilsættes derefter endnu en gang 1,3 g Ddz-Leu-OTcp (2,5 mmol), og dette får lov at reagere nogle timer ved_ (r) 15 stuetemperatur. Såfremt udgangsproduktet ifølge Fluoraire -prøven er negativt, oparbejdes der. Opløsningsmidlet afdestilleres i højvakuum, og remanensen opløses i eddikeester. Der indstilles på pH=4 med iskoldt citratpufferstof (pH=3). Derefter vaskes eddikeesterfasen én gang 20 med citratpufferstof (pH=4) og to gange med vand. Der tørres over Na2S04 og inddampes. Remanensen rives med en blanding af ether og petroleumsether i forholdet 1:1.

Der henstilles nogle timer i kølerum og fraskilles ved sugning. Udbytte: 35,35 g (80,25%); smp. 222-223°C; 25 L a-7D5 =-23,7° (c = 1, i methanol).

^2*^ (881,o4):

Beregnet: 0=60,00^; H=7,55$; N=7,95$.

Fundet: C=60,0 °/o; H=7,6 °/o·, N=8,0 30 •j- i.

b3) Ddz-Leu—Glu(OBu )-Asn-Tyr(Bu )-Cys(Trt)-Asn-OBu

Til en til 0°C afkølet opløsning af 26,4 g 35 (30 mmol) Ddz-Leu-Glu(OBu^)-Asn-Tyr(Bu^)-OH-hemihydrat, 16,0 g (30 mmol) H-Cys(Trt)-Asn-OBu^ og 4,05 S (3° nraiol) HOBt i 60 ml dimethylformamid sættes der en til 0°C afkø- 148303 δ ο let opløsning af 6,6 g DCC i 20 ml dimethylformamid. Udgangsproduktet omrøres 2 timer ved 0°C og natten over ved stuetemperatur. Dicyclohexylurinstoffet fraskilles ved sugning og vaskes med 20 ml dimethylformamid. Filtratet hæl- 5 des tinder omrøring forsigtigt i ca. 250 ml afkølet NaHCO - 3 opløsning og ekstraheres med 600 ml eddikeester. Eddike-esterfasen udrystes 1 gang med 300 ml NaHCO^-oplØsning, 1 gang med 300 ml citratpufferstof (pH=4) og 1 gang med 100 ml WaHCO^-opløsning efter hinanden, tørres over Na„S0^ og inddampes. Remanensen rives med ether. Udbytte: 28-3¾ g (67-81$). Smp. 161-165, = - 13,1° (c = 1, i CH2C12).

C74H98W8°16S (^-387,73):

Beregnet: 0=64,05$; H=7,12$; N=8,07$; S=2,31$.

15 Fundet: 0=63,8 $; H=7,3 $5 N=8,0$; S=2,7 $.

b^ ) H-Leu-Glu(OBu*)-Asn-Tyr(Bu^)_Cys(Trt)-Asn-OBu^--trifluoracetat 20 27,75 g (l0 mmol) Ddz-Leu-Glu(OBu*)-Asn-Tyr(Bu^)--Cys(Trt)-Asn-OBu sættes ved stuetemperatur til en blanding af 17,5 ml trifluoreddikesyre (0,2 mol), 3,5 ml vand og 330 ml methylenchlorid (= ca. 350 ml 5$ * s trifluoredd'ike-25 syre med 1$ vand i methylenchlorid). Der omrøres 2 timer ved stuetemperatur. Derpå afkøles der til 0°C, trifluor-eddikesyren neutraliseres med 17,75 ml (220 mmol) pyridin, og der inddampes i vakuum. Remanensen opløses i 250 ml eddikeester og udrystes 3 gange med 25 ml vand. Eddikeesterfasen 30 inddampes uden i forvejen at være blevet tørret. Remanensen tørres i højvakuum og rives med ether, (i stedet for diethylether kan der også anvendes diisopropylether). Fældningen fraskilles ved sugning, vaskes med ether og tørres. Udbytte: 25,2 g.

Til yderligere rensning opvarmes der portioner å ca. 6 g 35 til kogning i 30 ml eddikeester, som centrifugeres i varm tilstand. Hver af fældningerne røres sammen to gange med

O

9 148303 ether, centrifugeres og tørres over i højvakuum.

Udbyttes 22,3 S (86*6). Smp. 178-182°C, 161-164°C, 166-171°C, = - 3,5 til + 4,0° (c = l, i 90°/o's eddikesyre).

5 °61.H85N80ll.SF3 <1279’5)i

Beregnet: C=60,08$; H=6,70^; N—8,76^; S—2,51?έ·

Pundet: C=59,4 H=6,5 N=9,l S=2,9 fo·

Aminosyreanalyses Asp (2,0), Glu (l,05), Cys (0,87), 10 Leu (0,99), Tyr (l,05).

Eksempel 3 a) H-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn-OH-trifluoracetat 15 Ί* 814 mg (O,5 mmol) H-Tyr(Bu )-Gln-Leu-Glu (OBu )— -Asn-Tyr(But)-Cys(Trt)-Asn-OBut-trifluoracetat opløses i en blanding af 5 ml ethylmercaptan (67 mmol) og 5 ml trifluoreddlke-syre. Der henstilles i 4 timer ved stuetemperatur, og reak-20 tionsblandingen hældes i 50 ml vand. Den vandige fase eks-traheres tre gange med ether og frysetørres.

Udbytte: 59° mg (98^). /a_7jp = -15,3° (c = 1, 1 90$'s eddikesyre).

25 c^5H63Nii°i6S · CF^COOH . 2 h2o (1196,2):

Beregnet: 0=47,19$; H=5,73fo‘, N=12,88fo·, S=2,68fo.

Pundet: 0=47,0 $; H=5,6 % N=12,0 $; S=3,0 $.

k) Fremstilling af udgangsstoffet H-TvriBu7)-Gln-Leu--Glu(OBu )-Asn-Tvr(Bu^)-Cvs(Trt)~Asn-OBut-trifluor~ acetat bx) H—Tyr (But) -QMe . Km 300 g (778 mmol) Z-Tyr(Bu^)-0Me (Ann. Chem. 696.

226 (1966)) opløses i 1 liter methanol og hydrogeneres ka— 148303 ίο o talytisk (Pd/BaSO^)-katalysator) på en autoburette (tilsætning af ca. 2 N methanolisk HCl) ved pH=4,5· Efter at hydrogeneringen er afsluttet, fraskilles katalysatoren ved sugning, og filtratet inddampes. Remanensen rives med ether.

5 Udbytte: 189,2 g (84,50). Smp. 154-156°C.

/ = + 15,0° (c = 1, i methanol).

cl4H22N03C1 (287>79):

Beregnet: C=58,430} H=7,70; N=4,860.

10 Fundet: C=58,6 % H=7,6$; N=4,8 °/o.

b^) Ddz-Tyr(Bu^)-OMe

Til en opløsning af 71»95 g (O,25 mol) H-Tyr(Bu^)-t5 -OMe . HCl i 110 ml dimethylformamid sættes der under isafkøling og omrøring 35 ml (0,25 mol) triethylamin og 79,5 g (O,3 mol) Ddz-azid. Efter 5 minutters forløb tilsættes der yderligere 35 ml (0,25 mol) triethylamin. Derpå fjernes isbadet, og der bringes på stuetemperatur. Efter 20 , .

30 minutters forløb tilsættes der 7 ml (50 mmol) triethylamin, og der omrøres i 3 timer ved stuetemperatur. Udgangsproduktet henstår natten over ved stuetemperatur og fordeles mellem 250 ml eddikeester og 250 ml vand. Bddike- esterfasen vaskes efter tilsætning af is tre gange med 25 f 125 ml iskoldt citratpufferstof (pH=3) pr. gang, én gang med 250 ml mættet NaHCO^-opløsning og én gang med 125 ml vand, tørres over Na^SO^ og inddampes. Der tørres i højvakuum.

Udbytte: 118,2 g olie (99*^0).

30

b^) Ddz-Tyr(Bu^)-OH

118,2 g (2^9,5 mmol) af den under 2) opnåede olie-35 agtige Ddz-Tyr(Bu*)-OMe opløses i 500 ml 1,2-dimethoxyethan, og der tilsættes en spatelspids thymolphthalein. Hertil 11 148303 o sættes der dråbevis under omrøring 250 ml' 1 N NaOH· Der omrøres» indtil udgangsproduktets blå farve er blegnet·

Derpå tilsættes der lidt efter lidt i flere portioner endnu 120 ml 1 N NaOH, indtil opløsningen ikke længere taber farve 5 (merforbruget af natriumhydroxidopløsning fremgår af eddi· keesterindholdet i udgangsproduktet)· Derefter neutraliseres der med citronsyre, og opløsningen inddampes· Der sættes isvand til remanensen, hvorefter der ved 0°C indstilles på en pH-værdi på 3,5 med citronsyre. Den fremkomne olie *0 optages i eddikeester· Eddikeesterfasen udrystes to gange med 200 ml citratpufferstof (pHs4) og to gange med 200 ml vand. Eddikeesterfasen tørres over NagSO^, destilleres fra og tørres i højvakuum. Der bliver et gullig-hvidt amorft stof tilbage.

15 Udbytte: 99,5 g (86,8$). Smp. ca. 38-4o°C, £åj^2 = ♦ 4l,5° (c s 1, i methylenchlorid).

C25H33N0? (**59,55):

Beregnet: C=65,3*$i H=7,2*$j N=3,05$.

20 Pundet* C=65,0 H=7,3 fif N=3,0 $>.

b^) Ddz-Tvr(Bu*)-Gln-ONb

Til en opløsning af 25,2b g (55 mmol) Ddz-Tyr-25 (Bu*)-OH, 15,88 g (50 mmol) Η-Gln-ONb . HC1 (Chem. Ber.

110. 1-11 (1977)) og 6,75 S HOBt-monohydrat i 100 ml dime-thylformamid sættes der ved - 3°C 6,k ml (50 mmol) N-ethyl-morpholin og 10,5 g DCC. Der omrøres i 1 time ved 0°C og i 6 timer ved stuetemperatur, hvorefter der henstilles natten 20 over ved stuetemperatur. Fældningen fraskilles ved sugning, og filtratet inddampes. Den fremkomne olie opløses i eddikeester, og opløsningen vaskes efter hinanden med en NaHC03-opløsning, et citratpufferstof (pH=3) og vand, tørres over NagSO^ og inddampes. Olien rives pulveragtig med 35 petroleumsether og fraskilles ved sugning. Til yderligere rensning koges forbindelsen med 3 x 100 ml diisopropyl-

O

12 148303 ether og fradekanteres. Til sidst rives der med kold diisopropylether, der fraskilles ved sugning og efterva-skes med petroleumsether.

Udbytte: 32,8 g (91$); smp. 80-90°C. ~ + 15»1° 5 (c = 1, i methanol).

c37h46n4oi:l (722,81):

Beregnet: C=6l,48$j H=6,4l^; N=7,75°/°·

Fundet: C=6l,3 H=6,7 °k N=7,9 (o.

10 b^) Ddz-Tyr(But)-Gln-OH-DCHA (DCHA = dicyclohexylamin)

Til en opløsning af 32,5 S 5 mmol) Ddz-Tyr(Bu^)--Gln-ONb (ONb = p-nitrobenzoylester) i 500 ml methanol sæt-15 tes der 5 ml vand og Pd/BaS04-katalysator, og der hydrogeneres i 7 timer. Derpå fraskilles der fra katalysatoren ved sugning, og filtratet inddampes. Den resterende olie opløses i 250 ml eddikeester. Hertil sættes der 11,3 ml (55 mmol) dicyclohexylamin. Der henstilles nogle timer i 20 kølerum, hvorefter fældningen fraskilles ved sugning. Filterremanensen rives med eddikeester i en morter, der fraskilles ved sugning og tørres i vakuum. Udbytte: 27 g (78%). Smp. 170-171°C. [aj33 = + 10,2° (c = 1, i methanol).

25 ck2H6hNk°9 (769,0):

Beregnet: C=65,696} H=8,39$, N=7,28$.

Fundet: 0=65,^5 H=8,5 °M N=7,3 °/o.

30 bg) Ddz-Tyr(Bu^)-Gin-OH

2,9 g (3,77 mmol) Ddz-Tyr(But)-Gln-0H . DCHA fordeles mellem eddikeester og citratpufferstof (pH=3). Eddike-esterfasen vaskes neutral med vand, tørres over NagSO^ og 35 13 148303 inddampes. Der bliver et amorft produkt tilbage.

Udbyttes 2 g (90$). Snip. 110-115°C. /"a_7^2 = + 19,8° (c =s 1, i methanol).

5 °3οΗ*Λ°9 (587»68)s

Beregnet: C=6l,31$$ H=7,03$j N=7,15$.

Fundet: 0=60,6 $; H=7,2 $; N=7,0 $.

J. ,i.

b„) Ddz-Tyr(Bu )-Gln-Leu-Glu(OBu )-Asn-Tyr(Bu )-Cys(Trt)-t 10 -Asn-OBu 9,7 g (16,5 mmol) Ddz-Tyr(Bu*)-Gln-OH, 19,2 g (l5 mmol) H-Leu-Glu(OBu^)—Asn-Tyr(Bu^)-Cys(Trt)-Asn-OBu^ . CF^COOH og 2,025 g (15 mmol) HOBt opløses i 30 ml dimethyl-15 formamid under omrøring og ved stuetemperatur. Derpå afkøles der til 0°C, og der tilsættes 1,95 ml (l5 mmol) N-ethyl-morpholin og en opløsning af 3»3 g (l6 mmol) DCC i 9 ml dime-thylformamid. Der omrøres i 1 time ved 0°C og i 4 timer ved stuetemperatur, og der henstilles natten over ved stuetem-20 peratur, hvorefter dicyclohexylurinstoffet fraskilles ved sugning. Der eftervaskes to gange med 4,5 ml dimethylform-amid hver gang. Filtratet får lov at strømme til 159 ml af en mættet NaHCO^-opløsning under omrøring, og omrøringen fortsættes, indtil der fremkommer en pulveragtig fældning.

25 Fældningen fraskilles ved sugning, rives med citratpufferstof (pH=3), fraskilles ved sugning og vaskes neutralt med vand. Fældningen tørres i højvakuum.

Udbytte 23,1 g.

Det rå stof opvarmes på dampbad omtrent til koge-30 punktet. Den tynde suspension anbringes natten over i kølerum, og fældningen fraskilles ved sugning. Der vaskes med eddikeester og ether.

Udbytte: 20 g (76,8$). ~ “ 10»2° (c = 1, i methanol).

Suspensionen sønderdeles fra 205°C og forkulles ved 35 ca. 250°C.

C9SH123N11°20S (W35.15).

14 148303

Aminosyreanalyse: Asp Glu Cys Leu Tyr

Beregnet: 2,0 2,0 1,0 1,0 2,0

Pundet: 2,00 2,01 0,75 0,99 1,95 5 b„) H-Tvr(But)-Gln-Leu-Glu(0But)-Asn-Tyr(But)-Cys(Trt)- ° *fc -Asn-OBu -triffluoracetat *b "t 3,5 g (2 mmol) Ddz-Tyr(Bu )-Gln-Leu-Glu(OBu )--Asn-Tyr(Bu )-Cys(Trt)-Asn-OBu opløses under omrøring i 10 en blanding af 1,75 ml trifluoreddikesyre (20 mmol)» 0,35 ml vand og 33 ml methylenchlorid (= ca. 35 ml af en 5%'s trifluoreddikesyreopløsning med 1% vand) og 3.5 ml anisol. Der omrøres i 3 timer ved stuetemperatur, hvorefter der tilsættes 2 ml (24,8 mmol) pyridin og ind- 15 dampes i højvakuum. Remanensen rives med ether, fraskilles ved sugning, vaskes med vand og tørres over P^O^.

Udbytte: 3,35 g.

Til yderligere rensning opvarmes forbindelsen kort til kogning med 20 ml eddikeester, hvorefter den fraskilles 20 ved sugning i varm tilstand. Der eftervaskes med ether.

Udbytte: 3,0 g (92%). Smp. 255-265°C (sønderdeling).

]_ 0C_7j^ = - 23,8° (c = 1, i methanol).

C80H109N11°16S * CF3COOH (1626,9): 25

Aminosyreanalyse: Asp Glu Cys Leu Tyr

Beregnet: 2 2 1 1 2

Pundet: 1,95 2,08 0,81 1,07 2,04 30 Eksempel 4 a) H—Cvs-Ser-Leu-OH-trifluoracetat 564 mg (0,97 mmol) H-Cys(Trt)-Ser-Leu-OH . H20 35 (Chem. Ber. 103. 2034 (l970)) opløses i en blanding af 2.5 ml ethylmercaptan (33 imol) og 2,5 ml trifluoreddikesyre. Der henstilles i 30 minutter ved stuetemperatur, hvorefter ud- 15 148303 gangsproduktet rystes i 50 ^ van<i« Den vandige fase ud— etherificeres tre gange og frysetørres.

23 o

Udbytte: 331 mg (78#). £&JO * - 15,4 (c = 1, i methanol) .

5 c12H21N3°4s * CFgCOOH # j^o (435,4):

Beregnet: 0=38,62$; H=5,56$, N=9,65$·.

Pundet: 0=38,7 $; H=6,0 $5 N=9,4 fo.

10 Det samme resultat som ovenfor opnås, når 564 mg H—Cys(Tri)Ser—Leu—OH . HgO spaltes i en blanding af 11 ml trifluor eddike syre og U ml thiophenol (107 ranol) (ellers samme 27 o betingelser som ovenfor). Udbytte 337 mg (79%). [(X]^ = “15,2 (c = 1, methanol).

15 Eksempel 5 a) H-Ile-Cys-Ser-Leu-OH-trifluoracetat 677 mg (0,91 mmol) H-Ile-Cys(Trt)-Ser-Leu-OH .

20 0,3 CF^-C00H . 1,5 H20 opløses i en blanding af 2,5 ml ethylmercaptan (33 mmol) og 2,5 ml trifluoreddikesyre. Der amrøres i 30 minutter ved stuetemperatur, hvorefter reaktionsblandingen hældes i 50 ml vand under omrøring. Den vandige fase ekstraheres tre gange med ether og frysetørres derefter.

25 Udbytte: 506 mg (98fo). J_vJ-q = - H»3° (c =1, i methanol).

C18H34N4°6S * CF3C00H · H2° (566,6):

Beregnet: 0=42,39$, H=6,58$; N=9,89$.

Pundet: 0=42,4 $; H=7,0 fo·, N=10,6fo.

30

b) Fremstilling af udgangsproduktet H-Ile-Cys(Trt)-Ser--Leu-OH

b1) Ddz-Ile-OTcp 35

Til en til 0°C afkølet opløsning af 87 g (246 mmol) Ddz-Ile-OH (Ann. Chem. 76^, 162-172 (1972)) og 16 148303 48,6 g (246 nunol) 2,4,5-trichlorphenol i 700 ml eddikeester sættes der en kold opløsning af 52 g (252 mmol) DCC i 175 ml eddikeester. Der omrøres i 3 timer ved 0°C og henstilles natten over ved stuetemperatur. Dicyclohexylurin-5 stoffet fraskilles ved sugning, og filtratet inddampes i vakuum. Remanensen krystalliserer med petroleumsether.

Udbytte: 105,6 g (80,5$). Smp. 92-94°C. ~ “ 22,6°C

(c = 1, i methanol).

10 C24H28N06C13 (532,86):

Beregnet: 0=54,10$; H=5,30$; N=2,63$; 01=19,96$.

Fundet: 0=54,4 $; H=5,4 $; N=2,8 $; 01=19,5 $.

b2) Ddz-Xle-Cys(Trt)-Ser-Leu-0H . 1 HgO

15

Til en opløsning af 69,8 g (120 mmol) H-Cys(Trt)--Ser-Leu-OH-monohydrat (Chem. Ber. 103. 2034-2θ4θ (1970)) og 16,2 g (l20 mmol) HOBt i 300 ml dimethylformamid sættes der ved stuetemperatur 63,95 S (120 mmol) Ddz-Ile-OTcp, og 20 der omrøres i 4 timer ved stuetemperatur. Derefter tilsættes der endnu en gang 5,33 g (lO mmol) Ddz-Ile-OTcp, når der stadig er tripeptid til stede. Der henstilles natten over ved stuetemperatur, hvorefter opløsningsmidlet destilleres fra i vakuum. Den resterende olie fordeles mellem 400 ml 25 eddikeester og 250 ml mættet natriumcarbonatopløsning, idet natriumsaltet af Ddz-tetrapeptidet forbliver i eddikeesteren. Eddikeesterfasen afkøles og udrystes i rækkefølge med ca.

120 ml 1 N citronsyreopløsning (den vandige fase skulle efter udrystningen have ca. pH=3-4), 150 ml citratpuffer-30 stof (pH=3) og 2 gange med 200 ml vand. Eddikeesterfasen tørres derpå over Na2S0^ og inddampes i vakuum. Remanensen rives med petroleumsether og fraskilles ved sugning.

Udbytte: 99,8 g (90$). Smp.(l30) 135-l4o°C (sønderdeling).

= -34,1° (c = l, i methanol).

35 C49H62N4°10S ‘ 1 H2° i?17»1)*

Beregnet: C=62,93$; H=7,ll$; N=6,02$; S=3,42$.

Fundet: 0=63,0 $; H=6,8 $; N=5,8 $; S=3,4 $.

17 148303

b3) H-Ile-Cvs(Trt)-Ser-Leu-OH

2»7 g (2,9k mmol) Ddz-Ile-Cys(Trt)-Ser-Leu-OH opløses 1 52 ml af en 5%'s trifluoreddikesyre-methylenchlo-5 ridopløsning med 1% vand, og der omrøres i 4 timer ved stuetemperatur. Derpå neutraliseres der med 3 ml pyridin, og opløsningen inddampes i vakuum. Remanensen rives med vand, fraskilles ved sugning, vaskes med vand og tørres over PgO. Til yderligere rensning udkoges stoffet to gange med 10 hver gang 30 ml eddikeester og fraskilles ved sugning i varm tilstand.

Udbytte: 1,51 g (70%). Zq_7D = + 3,7 (c = 1, i 90%'s eddikesyre).

15 C H^gN^OgS . 0,3 CF3C00H . 1,5 H.,0 (738,l):

Beregnet: 0=61,18%; H=7,00%; N=7,59%; 01^00011=4,63%.

Fundet: C=6l,0 %; H=7,0 %; N=7,7 %; CF3C00H=4,7 %.

Eksempel 6 20

a) H-Ile-Cvs-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn-OH

3,429 g (l,5 mmol) H-Ile-CysiTrtJ-Ser-Leu-TyriBu*)--Gln-Leu-Glu(OBu )-Asn-Tyr(Bu )-Cys(Trt)-Asn-OBu -trifluor-25 acetat opløses i en blanding af 19 ml etbylmercaptan (250 mmol) og 19 ml trifluoreddikesyre. Der omrøres i 4 timer ved stuetemperatur, hvorefter reaktionsblandingen under omrøring hældes i 250 ml vand. Fældningen fraskilles ved sugning, vaskes med ether og tørres. Der rives derpå med ether, fraskilles 30 ved sugning og tørres. Udbytte: 1,964 g. Dette stof spaltes endnu en gang som ovenfor beskrevet. Udbytte 1,6 g (6l%).

Af filtraterne kan der efter ekstraktion med ether og frysetørring opnås yderligere i alt 330 mg af stoffet.

Samlet udbytte: 1,93 g (73%).

35 18 148303

O

c63h95n15o21s2 . cf3cooh . 10 h20 (1756,9):

Beregnet: 0=44,43$; H=6,65$, N=ll,96$; S=3,65$.

Fundet: 0=44,1 $; H=6,0 $; N=ll,6 $; S=4,3 $.

5 NMR-spektret viser ingen Bu^-signaler og kun et spor (ca, y/o) af triphenylmethylsignalet. De 18 protoner af methylsignalet af isoleucin og de to leuciner ved δ = 0,7-1,0 står i det rigtige forhold til de 8 aromatiske protoner af tyrosinerne ved δ = 6,5“7»1 ppm.

10 b) Fremstilling af udgangsstoffet H-Jle-Cys(Trt)-Ser-Leu--Tyr f Bu^)-Gln-Leu-Glu(OBu^)-Asn-Tyr(Bu^)-Cys(Trt)-Asn--OBu^-trifluoracetat 15 b. ) Ddz-lle-Cys(Trt)-Ser-Leu-Tyr(Bu^)-Gln-Leu-Glu(OBu^)- • 4- 4.

-Asn-Tyr(Bu )-Cys(Trt)-Asn-OBu

Til en opløsning af 22,8 g (l4 mmol) H-Tyr(But)--Gln-Leu-Glu(OBu^)-Asn-Tyr(Bu^)-Cys(Trt)-Asn-OBu^, l4,1 g 20 (15j4 mmol) Ddz-lle-Cys(Trt)-Ser-Leu-0H . 1 H^O og 2,08 g (15,4 mmol) HOBt og 1,8 ml (l4 mmol) N-ethylmorpholin i 70 ml dimethylformamid sættes der ved 0°C 3»^· S (l6,4 mmol) DCCI (dicyclohexylcarbodiimid). Der omrøres i 1 time ved 0°C og i 3 timer ved stuetemperatur og henstilles natten 25 over ved stuetemperatur, hvorefter fældningen fraskilles ved sugning. Filtratet inddampes i vakuum, og remanensen rives i rækkefølge med en NaHCO^-opløsning, citratpufferstof (pH=3), NaHCO^-opløsning og vand og fraskilles hver gang ved sugning. Der tørres over P2°5‘ 30 Udbytte: 33,18 g (99%).

Til yderligere rensning suspenderes det tørre stof i 300 ml varm eddikeester og opvarmes kort på dampbad. Efter tilsætning af 300 ml ether fraskilles der endnu i varm tilstand ved sugning. Der eftervaskes med ether og tørres i 35 højvakuum.

Udbytte: 28,1 g (84$). Smp. 265-270°C (sønderdeling).

DJf = -20,3° (c = 1, i dimethylformamid).

19 148303

Derpå opvarmes der yderligere med 100 ml methanol, og efter henstand i kølerum (natten over) fraskilles der ved sugning og tørres.

Udbytte: 23,75 S (71$). β-Jp2 = (c =1> 1 dimethyl- 5 formamid).

C129Hl69W15°25S2 (2394,o):

Aminosyreanalyse: 10 Asp Ser Glu Cys Ile Leu Tyr

Beregnet: 2 12 2 12 2

Fundet: 2,10 0,95 1,77 0,^9 0,83 2,10 1,98 b„) H—Ile-Cvs(Trt)-Ser-Leu-Tyr(Bu*)-Gln-Leu-Glu(OBu*)-Asn- ^ J.

15 -Tyr(Bu )-Cys(Trt)-Asn-OBu -trifluoracetat 2k g (ca. 30 mmol) Ddz-Ile-Cys(Trt)-Ser-Leu-Tyr-(Bu*)-Gln-Leu-Glu(Bu*)-Asn-Tyr(Bu*)-Cys(Trt)-Asn-OBu* opløses i en blanding af 8,75 ml (lOO mmol) trifluoreddikesyre, 20 1,75 ml vand og 165 ml methylenchlorid (= ca. 175 ml af en 5$'s trifluoreddikesyre-methylenchlorid-opløsning med 1$ vand) og 17,5 ml anisol under omrøring. Der omrøres i k timer ved stuetemperatur. Derpå tilsættes der 10 ml (124 mmol) pyridin og inddampes. Remanensen rives med ether, 25 fraskilles ved sugning, vaskes med ether og tørres i vakuum. Stoffet rives derefter med vand, fraskilles ved sugning, vaskes med vand og tørres over P^O,..

Til yderligere rensning udkoges forbindelsen 2 gange med hver gang 100 ml eddikeester, og der fraskilles hver 30 gang ved sugning i varm tilstand.

Udbytte: 22,7 g (99$)· Smp. 234°C (sønderdeling).

= - 11,7° (c = ~1, i dimethylformamid).

C117H155N15°21S2 · CF3C00H <2285-8>! 35 20 148303 o

Amino syreanalys e:

Asp Ser Glu Cys Ile Leu Tyr

Beregnet: 2 12 2 12 2

Pundet: 2,05 0.,99 1,88 0,43 0,73 2,12 2,05 5

Eksempel 7 a) H-Cys-Cys-Thr-Ser-OH-trifluoracetat 10 615,8 mg (O,5 mmol) Ddz-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Thr- *ts (Bu )-Ser(Bu )-OH opløses i en blanding af 2,5 ml ethylmer-captan (33 irmol) og 2,5 ml trifluoreddikesyre. Der omrøres i 4 timer ved stuetemperatur, og reaktionsblandingen hældes i 50 ral vand. Den vandige fase ekstraheres tre gange med ether 15 og frysetørres. Udbytte: 240 mg (88$). / <X_7^ = -24,3° (c = 1, i vand).

013Η24Ν40?52 . CF^COOH . HgO (544,5):

Beregnet: 0=33,08$; H=5,00$; N=10,29$; S=ll,77$.

20 Fundet: 0=34,4 $; H=5,l $; N=10,o $; S=ll,l $.

b) Fremstilling af udgangsstoffet Ddz-Cys(Trt)-Cvs(Trt)--Thr(But)-Ser(But)-OH

25 b^ Z-Thr(But)-Ser(But)-0H

Til en suspension af 16,1 g (θ,1 mol) H-Ser(Bu )--OH (Chem. Ber. <F7, 2^90 (1964)) i 100 ml dimethylformamid sættes der ved 0°C 12,8 ml (0,1 mol) N-ethylmorpholin og 30 40,6 g (θ,1 mol) Z-Thr(Bu^)-0Su (Hoppe Seyler's Z. Physiol.

Chem. 346, 60 (l966)). Derpå omrøres der i 5 timer ved stuetemperatur, og der henstilles natten over ved stuetemperatur.

Tyndtlagschromatografisk kontrol på Η-Ser (Bu*") -OH (løbe- 35 middel: iseddike/n-butanol/vand = 2:8:2).

Såfremt der tyndtlagschromatografisk ikke kan konstateres noget H-Ser(Bu )-0H, fraskilles der fra det eventuelt uopløste materiale ved sugning. Filtratet inddampes, 21 148303 og remanensen fordeles mellem ether og 110 ml 1 N citronsyre. Den etheriske fase vaskes endnu en gang neutral med 100 ml 0,5 N citronsyre og derefter med vand eller en NaCl-opløsning. Den etheriske fase tørres over Na^SO^, ind-5 dampes og tørres i højvakuum. Udbytte: 32,5 S amorft produkt (72$).

J_ 0.7^2 = + 24,1° (c = 1, i methanol).

C22H36N2°7 (^2,55): 10 Beregnet: C=6l,04$; H=8,02$; N=6,19$·

Fundet: C=60,3 $$ H=7,4 $; N=6,2 $.

b2) H-Thr(But)-Ser(But)-OH . HC1 15 25 g (55,24 mmol) Z-Thr(Bu )-Ser(Bu )-0H opløses i 200 ml methanol og hydrogeneres katalytisk på en auto-titrator under tilsætning af methanol . HC1 (pH=4,5).

Efter at hydrogeneringen er afsluttet, fraskilles der fra Pd/BaSO^-katalysatoren ved sugning, og filtratet inddampes 20 og tørres i højvakuum. Udbytte 1,1 g amorft produkt (19,60 = 100$). = + 27° (c = 1, i methanol).

C15H31N2°5C1 (354’9){

Beregnet: 0=50,77$; H=8,80$; N=7,89$· 25 Fundet: 0=50,9 $; H=8,8 $5 N=7,8 $.

b^) Ddz—Cys(Trt)-OH

Til en suspension af 36,4 g (θ,1 mol) H-Cys(Trt)-30 -OH (j. Org. Chem. ^0, 1340 (1965)) i 200 ml dimethylform-amid sættes der 28 ml (0,2 mol) triethylamin og 26,5 S (0,1 mol) Ddz-azid. Der omrøres i 24 timer ved 4o°C. Derpå inddampes opløsningen, og remanensen fordeles mellem 100 ml iskold 1 N citronsyre og eddikeester. Eddikeesterfasen ud— 35 rystes med citratpufferstof (pH=3) og en NaCl-opløsning, tørres over NagSO^ og inddampes. Der tørres i højvakuum.

Udbytte 37»6 g amorft produkt (64$).

22 148303 Z«JD = + 27,0° (c = 1, i methanol).

C^H^NOgS (585,7):

Beregnet: 0=69,72$; H=6,02$; N=2,39$.

5 Fundet: 0=69,3 H=6,3 1«; N=2,6 $>.

b^) Ddz-Cys(Trt)-OTcu

Til en opløsning af 5,9 g (oa, 10 mmol) Ddz-Cys-10 (Trt)-OH og 2,2 g (li mmol) 2, h, 5-trichlorphenol i 50 nil absolut tetrahydrofuran sættes der ved 0°C 2,3 g DCC, opløst i 15 ml tetrahydrofuran, og der omrøres i 2 timer ved 0°C og henstilles natten over ved stuetemperatur.

DC-urinstoffet fraskilles ved sugning, og opløsningen ind— 15 dampes. Remanensen opløses i methylenchlorid og filtreres over 100 g kiselgel 60. Der elueres med methylenchlorid.

Udbytte 6,2 g amorft produkt (81$).

/oiJ-q = + 10,3° (c = 1, i methanol).

20 C4oH36C13N°6S (765,17):

Beregnet: 0=62,79$; B=k,7b%; N=1,83^5 S=h,19$.

Fundet: C=6l,0 $; H=4,7 $; N=l,7 $; S=b,2 $.

Ifølge elementaranalyse skulle forbindelsen vare 97%'s.

25

bjj) Ddz-Cys (Trt) -Thr( Bu^ ) -Ser( Bu^ ) -OH

i.

Til en opløsning af 31,8 g (θ,1 mol) H-Thr(Bu )--Ser(Bu^)-OH (eller tilsvarende mere alt efter vand eller 30 syreindhold) og 13,5 g HOBt (0,1 mol) i 100 ml dimethylformamid sættes der ved 0°C 12,8 ml (0,1 mol) N-ethylmorpholin og 76,5 g (0,1 mol) Ddz-Cys(Trt)-0Tcp. Derpå omrøres der i ca. 6 timer ved stuetemperatur, og opløsningen inddampes i højvakuum. Remanensen fordeles mellem isvand og eddike- 35 ester. Eddikeesterfasen udrystes med en NaHCO_-opløsning, *h *fc ^

idet Ddz-Cys(Trt)-Thr(Bu )-Ser(Bu )-0H forbliver i eddike-esterfasen som natriumsalt. Derefter udrystes der ved 0°C

23 148303 med 100 ml 1 N citronsyre og 100 ml citratpufferstof (PH=3), og der vaskes neutralt med vand. Eddikeesterfasen tørres over NagSO^ og inddampes, og remanensen tørres i højvakuum. Til yderligere rensning omkrystalliseres forbin-5 delsen fra en blanding af ether og petroleumsether, idet den etheriske opløsning langsomt og dråbevis sættes til den tilstedeværende petroleumsether. Udbytte 44,5 S (50$). Smp. 116—128°C (sønderdeling).

/a_7^2 = + 25,5° (c = 1, i methanol).

10 C49H63N3°10S (88^j13)s

Beregnet: 0=66,42$; H=7,17$J N=4,74$.

Fundet: 0=66,1 $$ H=7,4 $; N=4,7 $.

15 b^) H-Cys(Trt)-Thr(Bu^)-Ser(Bu^)-OH-trifluoracetat 8,8 g (lO mmol) Ddz-Cys(Trt)-Thr(Bu^)-Ser(Bu^)-OH opløses ved stuetemperatur i en blanding af 8,75 ml (0,1 mol) trifluoreddikesyre, 1,75 ml vand og 165 ml methy-20 lenchlorid (= ca. 175 ml 5°/>'s trifluoreddikesyre i methylen-chlorid med 1$ vand). Der henstilles i 1,5 time ved stuetemperatur, og der gøres neutralt med 8,85 ml (0,11 mol) pyridin. Opløsningen inddampes, og remanensen fordeles mellem eddikeester og vand. Eddikeesterfasen vaskes endnu to 25 gange med vand, tørres over Na^SO^ og inddampes. Remanensen opløses i en smule ether og sættes langsomt og dråbevis til petroleumsether.

Udbytte: 4,2 g (54$). Smp. 85-95°C (sønderdeling).

= + 68,5° (c = 1, i methanol).

30 c3?h49n3o6s . cf3cooh (777,9):

Beregnet: 0=60,21$; H=6,48$; Ν=5,4θ$; S=4,12$.

Fundet: 0=60,7 $5 H=6,7 $5 N=5,2 $; S=4,2 $.

35 b?) Ddz-Cvs(Trt)-Cvs(Trt)-Thr(But)-Ser(But)-OH

Til en opløsning af 5,3 g (6,8 mmol) H-Cys(Trt)- 24 148303 -Thr(Bu )-Ser(Bu )-OH-trifluoracetat og 0,95 g (0,7 mmol) HOBt i 15 ml dimethylformamid sættes der ved 0°C 0,9 ml (0,7 mmol) N-ethyl-morpholin og 5»35 g (7 mmol) Ddz-Cys-(Trt)OTcp. Der omrøres i l4 timer ved stuetemperatur, og 5 opløsningen inddampes, når tripeptidet er afreageret, (Såfremt der kan påvises endnu ureageret tripeptid, må der tilsættes endnu noget Ddz-Cys(Trt)—OTcp). Remanensen optages i eddikeester. Eddikeesterfasen vaskes neutralt efter hinanden med 10-20 ml mættet NaHCO^-opløsning, med 7 ml 10 IN citronsyre og 10 ml citratpufferstof og med en RaCl- -opløsning, tørres over Na^SO^ og inddampes. Remanensen rives med petroleumsether.

Til yderligere rensning udfældes der fra en blanding af ether og petroleumsether, eller der omrøres med 15 diisopropylether. Der kan ligeledes omkrystalliseres fra en blanding af methanol og vand.

Udbytte: 6 g (71/0· Smp. 118-130°C (sønderdeling).

/ (X_7jj = + 11,6° (c = 1, i methanol).

20 C71H82N401]LS2 (1231,6):

Beregnet: 0=69,23%; H=6,71%; N=4,55?0 S=5,21%.

Pundet; 0=67,2%; H=6,3 %; N=4,l %; S=5,3 %.

Ifølge elementaranalyse er forbindelsen kun ca. 97%'s.

25

Eksempel 8 a) H-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr^Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr--Cys-Asn-OH 30 983 mg (0,34 mmol) H-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Thr(Bu^)--Ser(Bu^)-Ile-Cys(Trt)-S er-Leu-Tyr(Bu^) >-Gln-Leu-Glu(OBu ^)--Asn-Tyr(Bu )-Cys(Trt)-Asn—OBu —trifluoracetat opløses i en blanding af 7,5 ml efchylmercaptan (100 irmol) og 7,5 ml trifluor-35 eddikesyre. Der omrøres i 4 timer ved stuetemperatur, og reaktionsblandingen hældes i 50 ml diethylether. Der fremkommer en fældning, der fraskilles ved sugning. Nutsch- 25 148303

O

-remanensen vaskes med ether og tørres.

Udbytte 54l mg.

Da der i NMR-spektret endnu var et lille trityl-signal synligt, blev fraspaltningen gentaget endnu en gang 5 med 420 mg af den ovenfor opnåede forbindelse. Udbytte 506,7 mg af en uidentificeret, ukendt urenhed, der igen fjernes. Til bedre karakterisering blev SH-peptidet omdannet til S-tetrasulfonatet: 450 mg af den ovennævnte forbindelse (se anmærkning nedenfor) suspenderes i 19,6 ml 10 tris-HCl-pufferstof (0,1 M, pH=7,19). Efter tilsætning af 9,16 g urinstof omrøres der i 10 minutter, og der tilsættes ved stuetemperatur 621 mg natriumsulfit og 621 mg natriumtetrathio-nat. Der fremkommer en klar opløsning. Efter 3 timers reaktionstid ved stuetemperatur henstilles der natten over i køle-15 rum (4°C). På andendagen dialyseres udgangsproduktet mod 5x5 liter vand og frysetørres. -

Udbytte: 438,9 mg (ca. 51% beregnet på beskyttet peptid og proteinindhold).

[a]^= - 51° (c = 1, i vand).

20 Anmærkning: der isoleres den ønskede forbindelse, som dog indeholder en uidentificeret urenhed.

NMR-spektret viser intet signal for tritylprotoner.

X den sure elektroforese løber tetrasulfonatet ensartet og noget hurtigere end det tilsvarende tetrasulfonat af human-25 -insulin-A-kæden.

C76H117N19°39S8 <2177,5)s Aminosyreanalyse j 30 Asp Thr Ser Glu Cys Ile*^ Leu Tyr

Ber. 212241 22 F. 2,00 0,96 1,76 1,88 2,73 1,17 2,27 1,98 *) 26,5$ deraf er D-allo-Ile.

35 Ifølge aminosyreanalyse har peptidet et protein indhold på ca. 69$.

26 148303 b) Fremstilling af udgangsstoffet H-Cvs(Trt)-Cvs(Trt)-Thr-(Bu*)-SerfBu*)-Ile-Cvs(Trt)-Ser-Leu-Tvr(Bu*)-Gln-Leu--Gluf OBu* ) -Asn-Tvr f Bu**) «Cys ( Trt) -Asn-OBu*-trifluoracetat 5 b.) Dda-Cvs iTrt)-Cvs(Trt)-Thr(Bu*)-S er(Bu*)-Ile-Cvs(Trt)-

X i» . x X

-Ser-Leu-Tvr(Bu Ti -Gln-Leu-Glu( OBu ) -Asn-Tvrf Bu ) -Cvs-fTrt)-Asn-OBu*

Til en opløsning af 16 g (7 mmol) H-Ile-Cys(Trt)-10 -Ser-Leu-Tyr ( Bu* ) -Gln-Leu-Glu ( OBu* ) -Asn-Tyr (Bu*) -Cys- (Trt)-Asn-OBu*-trifluoracetat, 9,5 g (7*7 mmol) Ddz-Cys-(Trt)-Cys(Trt)-Thr(Bu*)-Ser(Bu*)-OH, 1,04 g (7,7 mmol) HOBt og 0,9 ml (7 mmol) N-ethylmorpholin i 70 ml af en dimethyl» formamid-dimethylacetamid-blanding (l:l) sættes der ved 0°C 15 1,7 S (8*25 mmol) DCC. Der omrøres i 2 timer ved 0°C og der efter ved stuetemperatur. Der henstilles natten over, og næste dag omrøres der endnu engang i 5 timer ved stuetemperatur. Det udfældede DC-urinstof fraskilles ved sugning. Filtratet inddampes til halvdelen i højvakuum og sættes der-20 efter dråbevis og under omrøring til isvand. Fældningen fraskilles ved sugning og vaskes i rækkefølge med NaHCO^-opløs-ning, citratpufferstof (pH»3), NaHCO^-opløsning og vand og tørres over P^O^. Til yderligere rensning omrøres der med 100 ml eddikeester under opvarmning. Efter tilsætning af 25 200 ml ether fraskilles fældningen ved sugning i varm til stand og tørres. Derpå opvarmes stoffet med 220 ml 50#'s vandig methanol og til sidst med 200 ml methanol og fraskilles hver gang ved sugning i varm tilstand. Udbytte 19,^2 g (81#). Smp. 250-260°C (sønderdeling).

30 /"α_7^2 - - 14,2° (c = 1, i dimethylformamid) .

°188H235N19031s1. · 2 H2° (3421.il·) =

Beregnet: C=66,00#j H=7,o4#j N=7,78#j S*3»75#·

Fundet: 0*65,^ #f H*7,l #; N=8,0# ; S=3,8 #.

35 27 148303

Aminosyreanalyse (efter oxidation af cystein til cystein-sulfonat) :

Asp Thr Ser Glu Cys Ile Leu Tyr 5 Ber.s 21224122

Fundet: 1,99 0,89 1,69 1,92 3,97 0,87 2,07

Tyrosin mangler, idet det bliver nedbrudt ved oxidationen.

10 b2) H-Cvs(Trt)-Cys(Trt)-Thr(Bu*)-Ser(But)-Ile-CvsfTrt)--Ser-Leu-Tyr(Bu*)-Gln-Leu-Glu(OBu*)-Asn-Tyr(Bu*)-Cys-(Trt)-Asn-OBu*-trifluoracetat 15 10,26 g (3 mmol) Ddz-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Thr(Bu*)- -Ser(Bu*)-XIe-Cys(Trt)-Ser-Leu-Tyr(Bu*)-Gln-Leu-Glu(OBu*)-i/ t -Asn-Tyr(Bu )-Cys(Trt)-Asn-OBu opløses i en blanding af 5,25 ml (60 mmol) trifluoreddikesyre, 1,05 ml vand og 99ml methylenchlorid (= ca. 105 ml af en 5</°'s trifluoreddi-20 kesyre-raethylenchlorid-opløsning med 1 °/o vand) og 10,5 ml anisol under omrøring. Der omrøres i 4 timer ved stuetemperatur. Der tilsættes derefter 10,5 ml pyridin og inddampes.

Der efterdestilleres i højvakuum. Den olieagtige remanens rives med ether, og fældningen fraskilles ved sugning og 25 tørres. Derpå vaskes stoffet med vand og tørres over Po0_.

^ 5

Til yderligere rensning koges forbindelsen tre gange med hver gang 100 ml eddikeester, og hver gang fraskilles den ved sugning i varm tilstand.

Udbytte 7,96 g (8l°/o) , Smp. 240-245°C (sønderdeling).

30 L*Jl3 - - 10,0° (c = 1, i dimethylformamid).

C176H221N19°27SI> · OT3C00H (3277,15) 35 28 148303

Aminosyreanalyse:

Asp Thr Ser Glu Cys lie Len Tyr

Ber: 21 2 2 4 1 2 2 5 Fundet: 1,96 0,80 1,49 2,03 3,21 1,10 2,04 1,78

Eksempel 9 10 a) H-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu- -Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn-OH (= humaninsulin-A--kasde-tetrasulfonat) 772 mg (0,2 mmol) H-Gly-Ile-Val-GluiOBu^-Gln-15 -Cys(Trt)-Cys(Trt)-Thr(Bu*)-Ser(But)-Xle-Cys(Trt)-Ser-Leu- -Tyr(Bu^)-Gln-Leu-Glu(OBu*)-Asn-Tyr(Bu*)-Cys(Trt)-Asn-Obu* . CF^COOH suspenderes i en blanding af 5 ml ethylmercaptan (67 nmol) og 5 ml trifluoreddikesyre. Der omrøres i 4 timer ved stuetemperatur og rystes i 50 ml ether. Den fremkomne fældning 20 fraskilles ved sugning og vaskes med ether. Udbytte 542 mg.

Denne operation gentages med de 542 mg af forbindelsen.

Udbytte 385,9 mg. Ved et indhold på 80$> protein svarer dette til et udbytte på ca. 65°/o.

25 C99B155N25°35S4 i2383»8).

Til karakterisering fremstilles tetrasulfonatet analogt med eksempel 8a ud fra 360 mg stof. Udbyttet er 370,8 mg (ca, 60$ beregnet på beskyttet insulin-A-kæde).

30 /qjJ1 = - 72,9° (c = 1, i vand).

C99H155N25°47S8 (27°4>* 35 29 148303

Aminosyreanalyse:

Asp Thr Ser Glu Gly Cys Val Ile Leu Tyr

Ber ϊ 2124141222 5 Fundet: 1,84 0,90 1,62 4,o4 0,94 3,½ 0,89 1,81 *^2,2 2,2 ψ) summen af 0,44-D-allo-Ile og 1,37 Ile X.

10 b) Fremstilling af udgangsstoffet H-Gly-Ile-Val-Glu(OBu )--Gin-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Thr(But)-Ser(But)-Ile-Cvs(Trt)--Ser-Leu-Tyr(Bu^)-Gln-Leu-Glu(OBu^)-Asn-Tyr(Bu^)-Cys-(Trt)-Asn-0But . CF3C00H

15 bx) Ddz-Val-OTcp

Til en opløsning af 113,3 g (°»33^ mraol) Ddz-Val-OH og 65,9 g (0,33^ mmol) 2,4,5-trichlorphenol i 300 ml eddikeester sættes der ved 0°C en opløsning af 72,1 g (θ,35 mmol) 20 DCC i 100 ml eddikeester. Der omrøres i 1 time ved 0°C og 3 timer ved stuetemperatur. DC-urinstoffet fraskilles ved sugning, og filtratet inddampes. Remanensen krystalliseres med petroleumsether.

Udbytte: 111,45 g (64$). Smp. 73-76°C.

25 /<l7d5 =-28,7° (c = 1, i methanol).

C23H26N06C13 (518,84):

Beregnet: C=53,24$; H=5,05$; N=2,70$.

Fundet: C=53,5 $5 H=5,2 $; N=2,9 $.

30

b2) Ddz-Val-Glu(OBu*)-OH

Til en opløsning af 30,5 g (l50 mmol) H-GluiOBu*)--0H og 20,25 g (150 mmol) HOBt i 200 ml dimethylformamid 35 sættes der 19,2 ml (150 mmol) N-ethylmorpholin og 77,8 g Ddz-Val-OTcp. Der omrøres i 4 timer ved stuetemperatur.

Såfremt der i DC ikke længere kan påvises noget H—Glu(OBu^)- 30 148303 -OH, inddampes der i Højvakuum, (i modsat fald afsluttes reaktionen ved tilsætning af en smule Ddz-Val-OTcp). Den fremkomne olie fordeles mellem 300 ml eddikeester og 300 ml vand, Eddikeesterfasen udrystes to gange med hver 5 gang 150 ml citratpufferstof (pH=3) og én gang med 150 mi vand, tørres over Na^SO^ og inddampes.

Udbytte 138*7 g (78,7 g = 100$). Den fremkomne olie omsættes yderligere som 150 mmol uden yderligere rensning og karakterisering.

10 °26ηΚ0Ν2°9 (524.6)· b ) Ddz-Val-Gluf OBu^-Gln-ONb 15 Til en opløsning af 138,7 g (= 150 mmol) rå, foru renet Ddz-Val-Glu(0Bu^)-OH, 47,65 g (l50 mmol) H-Gln-0Nb . HC1 og 20,25 g (150 mmol) HOBt i 450 ml dimethylformamid sættes der ved 0°C 19*2 ml (l50 mmol) N-ethylmorpholin og 33 g (l60 mmol) DCC. Der omrøres 1 time ved 0°C og 4 timer 20 ved stuetemperatur. Der henstilles natten over ved stuetemperatur, hvorefter fældningen fraskilles ved sugning og filtratet inddampes i højvakuum. Den fremkomne olie fordeles mellem 300 ml eddikeester og 300 ml vand. Eddikeesterfasen udrystes i rækkefølge med mættet NaHCO^-opløsning, citrat-25 pufferstof (pH=3)* mættet NaHCO^-opløsning og vand, tørres over Na^SO^ og inddampes. Olien krystalliserer med ether.

Der vaskes med ether. Udbyttes 110,95 g (94$).

Smp. 135-138°C, 138-l42°C.

= -49,4 (c = 1, i methanol).

30 C38H53N5°13 t787’9)*

Beregnet: C=57,93$} H=6,78$; N=8,89$.

Fundet: 0=57,8 $; H=7,0 $; N=9,2 $.

35 b^) H-Val-Glu-(0But)-Gln-ONb-trifluoracetat 39,4 g (50 mmol) Ddz-Yal-GluiOBu^J-Gln-ONb opløses 31 148303 i en blanding af 875 ml af en 5$*s trifluoreddikesyre--methylenchlorid-blanding (med 1 $ vand) (= 500 mmol tri-fluoreddikesyre) og 87,5 ml anisol. Der henstilles i 30 minutter ved stuetemperatur, og der neutraliseres med 5 50 ml pyridin og inddampes. Der eftertørres i højvakuum.

Remanensen fordeles mellem eddikeester og vand. Eddike-esterfasen udrystes endnu to gange med en smule vand, tørres over Na2S0^ og inddampes. Remanensen rives med ether og tørres i højvakuum. Udbytte 23,6 g amorft stof (69$)· 10 = - 5,3° (c = 1, i methanol).

C26H39N509 . CF3C00H (679,67):

Beregnet: C=49,48$j H=5,93$, N=10,30$.

Fundet: C=50,0 $5 H=5,8 $; N=10,l $.

15 b^) Ddz-Gly-Ile-OMe

Til en opløsning af 14,54 g (80 mol) H-Ile-0Me .

HC1 og 10,8 g (80 mmol) HOBt i 50 ml dimethylformamid sæt-20 tes der ved -3°C 10,3 ml (80 mmol) N-ethylmorpholin og ved 0°C 40 g (84 mmol) Ddz-Gly-OTcp. Der omrøres i 3 timer ved stuetemperatur og henstilles natten over. (X DC kunne der næste dag stadig konstateres noget H-Ile-0Me. Der blev derfor endnu en gang tilsat 2,86 g (6 mmol) Ddz-Gly-OTcp, 25 som orarørtes. Efter 5 timers forløb kunne der ikke konstateres noget H-Ile-0Me). Den i DC for H-Ile-0Me frie opløsning inddampes i højvakuum, og den fremkomne olie fordeles mellem eddikeester og vand. Eddikeesteropløsningen vaskes i rækkefølge med mættet NaBUO^opløsning, citratpufferstof 30 (pH=3), NaHC03-opløsning og vand og tørres over NagSO^.

Eddikeesteropløsningen filtreres over 400 g basisk AlgO^ og eluatet inddampes og tørres i højvakuum. Udbyttet er 30,6 g sej olie (90$). = “ 6,8° (c = 1, i methanol).

35 C21H32N207 (424,5):

Beregnet: 0=59,42$; H=7,60$$ N=6,60$.

Fundet: C=59,l $i H=7,7 $J N=6,3 $.

32 148303

O

bg) Ddz-Gly—Ile—OH

10 S (23,56 mmol) Ddz-Gly-Ile-OMe opløses i en blanding af 24 ml dioxan og 8 ml vand og titireres mod thy-5 molphthalein som indikator med 1 N NaOH, Forbruget alt efter eddikeesterindholdet er mere end 23 ml.(Ddz-Gly-Ile—Ome indeholder alt efter tørringsgraden endnu mindre mængder eddikeester, som ligeledes forsæbes og således forbruger NaOH). Efter neutralisation med citronsyre destilleres dioxa-10 nen. Remanensen optages i vand og indstilles ved 0°C på pH=3 med 2 N citronsyre. Den udfældede olie ekstraheres med eddikeester. Den vandige fase gøres om nødvendigt endnu en gang sur til pH=3 og ekstraheres med eddikeester. De forenede eddi-keesterekstrakter udrystes én gang med vand, tørres over 15 Na^O^ og inddampes. Der tørres i højvakuum. Stoffet er amorft. Udbytte 8,9 g {9%°/°) · Smp. 80-90°C.

Lqjff = + 4,2° (c = 1, i methanol).

C20H30N2°7 (4ΐ0>48)! 20 Beregnet: 0=58,52$; H=7,37$; N=6,83$.

Fundet: 0=58,8$; H=7,5 $; N=6,5 $.

b?) Ddz-Glv-Ile-Val-Glu(0But)-Gln-ONb 25 Til en opløsning af 15,8 g (38,5 mmol) Ddz-Gly- -Ile-0H, 23,8 g (35 mmol) H-Val-Glu(0But)-Gln-ONb-trifluor-acetat og 5,2 g (38,5 mmol) HOBt i 60 ml dimethylformamid sættes der ved 0°C 4,48 ml (35 mmol) N-ethylmorpholin og 8,47 g (4l mmol) DCC. Der omrøres i 1 time ved 0°C, flere 30 timer ved stuetemperatur og henstilles natten over ved stuetemperatur. Der fremkommer en gelé, som indrøres i en afkølet NaHCO^-opløsning. Produktet fraskilles ved sugning og rives i rækkefølge med citratpufferstof (pH=3), NaHCO^-opløsning og vand og fraskilles ved sugning hver gang. Der 35 tørres over F^O^.. Udbytte 40,3 g.

Til yderligere rensning omkrystalliseres der fra 500 ml ethanol. Udbytte 21,45 g (64$). Smp. 205-207°C.

/ = - 12,3° (c = 1, i dimethylformamid).

En mindre del udgangsstof med ringere udbytte har 33 148303 følgende data: Smp. 212-2l4°C. = -16,1° ( c = l, i dimethylformamid).

C46H67N7°15 i958’1)·' 5 Beregnet: C=57,57$; H=7,05$; N=10,23$.

Fundet: C=57,6 $; H=7,2 $; N=10,0 $.

bg) Ddz-Glv-Ile-Val-Glu(OBut)-Gln-OH

4- 10 19,16 g (20 mmol) Ddz-Gly-Ile-Val-Glu-(OBu )-Gln-ONb opløses i en blanding af 100 ml dimethylformamid og 100 ml methanol. Efter tilsætning af Pd/BaSO^ hydrogeneres der katalytisk. Efter 6 timers forløb er alt hydrogeneret. Suspensionen opvarmes til ca. 70°C og fraskilles fra katalysa-15 toren i varmen ved sugning. Der eftervaskes med varmt dimethylformamid. Filtratet inddampes, og remanensen rives med 100 ml methanol. Der henstilles natten over i kølerum, og der fraskilles ved sugning og eftervaskes med kold methanol. Tørring i vakuum over P^O^.

20 Udbytte: 14 g (85$). Smp. 238-24l°C (sønderdeling).

OJf - -13,3° (c = 1, i dimethylformamid).

°3?Β62κ6°Χ3 (822,97)»

Beregnet: 0=56,92$; H=7,59$; N=10,21$.

25 Fundet: 0=56,0 $; H=7,6 $; N=10,8 $.

b9) Ddz-Gly-Zle-Val-Glu(OBu*)-Gln-Cvs(Trt)-Cvs(Trt)-Thr-(Bu^)-Ser(Bu^)-Ile-Cys(Trt)-Ser-Leu-Tyr(Bu^)-Gln-Leu--Glu(OBu^)-Asn-Tyr(Bu^)-Cys(Trt)-Asn-OBu^ 30

Til en opløsning af 3,28 g (l mmol) H-Cys(Trt)- j_ J.

-Cys(Trt)-Thr(Bu )-Ser(Bu )-Ile-Cys(Trt)-Ser-Leu-Tyr(Bu )--Gln-Leu-Glu(OBu^)-Asn-Tyr(Bu^)-Cys(Trt)-Asn-OBu^-trifluor-acetat, 1 g (ca. 1,2 mmol) Ddz-Gly-Ile-Val-Glu(oBu^)-Gln-35 -OH og 162 mg HOBt (l,2 mmol)i 20 ml af en blanding af dimethylformamid og dimethylacetamid (l:l) sættes der 0,13 ml N-ethylmorpholin og ved 0°C 310 mg (1,5 mmol) DCC.

34 148303

Der omrøres 1 time ved 0°C og 6 timer ved stuetemperatur og henstilles natten over. Der fremkommer en tyk gelé, hvortil der sættes isvand. Den fremkomne fældning fraskilles ved sugning og rives i rækkefølge med NaHCO^—opløsning, 5 citratpufferstof (pH=3), NaHCO^-oplØsning og vand og fra skilles hver gang ved sugning. Der vaskes med vand og tørres over Po0_. Til yderligere rensning udkoges der 2 gange 2 5 med hver gang 25 ml eddikeester, og der fraskilles ved sugning i varm tilstand. Udbytte: 2,87 g {7%°/°) · Smp. 260-278°C 10 (sønderdeling).

^ Λ jfj j_ oc_7jj = - 24,5° (c = 1, i dimethylformamid).

C215H281N25°39S4 (3968,07).

15 Aminosyreanalyse:

Asp Thr Ser Glu Gly Cys Val Ile Leu Tyr

Ber: 2124l4l222 Fun- det:2,06 0,88 2,04 3,97 1,01 2,59 0,60 1,45 1,93 1,93 20 b1Q) H—Giv—Ile—Val—Glu(0But)-Gln-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Thr-( Bu1") -Ser ( Bu^ ) -lle-Cvs ( Trt) -Ser-Leu-Tyr ( Bu* ) -Gln--Leu-Glu(OBu^)-Asn-Tyr(Bu^)-Cys(Trt)-Asn-OBu^-tri-fluoracetat 25 2,78 g (0,7 mmol) Ddz-Gly-Ile-Val-GluiOBu^-Gln--Cys(Trt)-Cys(Trt)-Thr(But)-Ser(But)-Ile-Cys(Trt)-Ser--Leu-Tyr(Bu^)-Gln-Leu-Glu(OBu^)-Asn-Tyr(Bu^)-Gys(Trt)--Asn-OBu^ omrøres sammen med 2,5 ml anisol i 25 ml af 30 en 5°/o's trifluoreddikesyre-methylenchlorid-opløsning med 1 °/o vand (= ca. l4 mmol tr if luor eddikesyre) i 4 timer ved stuetemperatur. Der tilsættes derpå 1,4 ml pyridin og inddampes først i vandstrålepumpevakuum og til sidst i højvakuum. Remanensen rives med ether, fraskilles ved sugning 35 og vaskes med ether og tørres. Stoffet rives derefter med vand, fraskilles ved sugning, vaskes med vand og tørres over 1*2^5· Yderligere rensning koges der to gange med 35 148303 hver gang 50 ml eddikeester, og der fraskilles ved sugning i varm tilstand. Udbytte 1,85 S (68,5%). Smp. 275-270°C (sønderdeling).

]_ α = -24,0° (c = l, i dimethylformamid) .

5 C203H267M«°35S!. ' CT3C00H (3859,8)

Amino syreanalys e:

Asp Thr Ser Glu Gly Cys Val Ile Leu Tyr 10 Ber: 2 1 2 4 1 4 1 22 2

Pundet: 2,05 1,08 1,80 4,00 0,97 2,4o 0,71 1,51 2,06 1,88