DE2514817A1

DE2514817A1 - Verfahren zur herstellung eines kanamycinderivats

Info

Publication number: DE2514817A1
Application number: DE19752514817
Authority: DE
Inventors: Takayuki Naito; Susumu Nakagawa; Masahisa Oka
Original assignee: Bristol Myers Co
Current assignee: Bristol Myers Co
Priority date: 1974-05-23
Filing date: 1975-04-04
Publication date: 1975-12-04
Also published as: FR2273009A1; SU1190988A3; BE828192A; AT339478B; AR205114A1; DE2514817C2; ATA243175A; CS212755B2; IL46995A; IL46995A0; FR2273009B1; PL102734B1

Description

PATENTANWÄLTE I PROF. DR. DR. J. REITSTÖTTER j

DR.-ING. WOUFRAM BUNTE ^RI Aft 17

DR. WERNER KINZEBACH *" ^ ¹^⁰ ' ' j

D-βΟΟΟ MÜNCHEN 4O, BAUERSTRASSE 22 · FERNRUF (O89) 37 β8 S3 · TELEX 0218208 ISAR D POSTANSCHRIFT: D-βΟΟΟ MÜNCHEN 43. POSTFACH 7SO

München, 4. April 1975 M/16 074

BRISTOL-MYERS COMPANY

345 Park Avenue New York, N.Y.10022/USA

Verfahren zur Herstellung eines Kanamycinderivats

Die Erfindung betrifft ein neues und wesentlich wirksameres Verfahren zur Herstellung von l-/l-(-)- p-Amino-CX. -hydroxybutyry!/-kanamycin A (IV) der Formel IV

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251481?

IV

CH₂-NH₂

Kanamycin A weist vier primäre Aminfunktionen an den 1-r, 3-, 6'-i und 3"-Positionen des Moleküls auf. Es wurde festgestellt, daß die 6'-Aminfunktion die reaktivste ist und die 1-Aminfunktion die zweitreaktivste Gruppe bei Behandlung mit einem elektrophi len Mittel darstellt. Sowohl die 3 als auch die 3"-Positionen sind weniger reaktiv als entweder die 1- oder 6¹-Aminfunktionen, sie reagieren jedoch, wobei man geringe Prozentanteile an ungewünschten acylierten Materialien erhält.

Demgemäß ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein befriedigenderes Verfahren als das bislang von unseren Mitarbeitern in der US-Patentanmeldung Serial Mo. 330 377 und DOS 2234315 angewendete Verfahren zu schaffen, wobei dieses Verfahren selektiver auf die Acylierung der 1-Aminfunktion als die der anderen im Molekül vorliegenden Aminfunktionen gerichtet ist.

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Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird durch das Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Formel IV

CH2-NH2

NH₂.

IV·

gelöst, dadurch gekennzeichnet, daß man in aufeinanderfolgenden Stufen

A) die Verbindung der Formel II

H Il CH₂-N-C-O-CH₂-C₆H₅

HO

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mit einem Aldehyd, ausgewählt unter Benzaldehyd, SaIicylaldehyd , p-Ni trobenzaldehyd, p-Methoxybenzal dehyd und Pivaldehyd in eineir Verhältnis von einem Mol Verbindung II zu mindestens 3 Mol Aldehyd behandelt, wobei die Verbindung der Formel III

III

entsteht, worin Z für einen Rest der Formeln

steht; und

-N = C-/ Λ

H oder -N=C - C-

-N = C-/ VOCH.

-CH CH. CH,

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5 25H817

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B) die Verbindung III in situ mit der Verbindung der Formel XX

N-O-C-CH-CH₂-CH₂-NH-C-O-CH₂-C₆H₅ OH

XX

■ in einem Verhältnis von einem Mol Verbindung III zu mindestens ! 0,5 Mol Verbindung XX, behandelt und anschließend den Rückstand in situ zur Herstellung einer Verbindung der Formel IV hydriert

' Insbesondere wird Stufe A) vorzugsweise in einem mit Wasser ι mischbaren Lösungsmittel, wie einem alkoholischen Lösungsmittel beispielsweise absolutem Äthanol, Methanol, n-Propanol , Isopropanol, n-Butanol , sek.-Butanol , tert.-Butanol , einem [ Ätherlösungsmittel, beispielsweise Tetrahydrofuran, Dioxan j oder anderen polaren, aprotischen oder protischen Lösungsmitteln, wie beispielsweise Dimethylformamid und Aceton oder Mischungen davon, oder Mischungen davon mit Wasser, in·einem Temperaturbereich von ungefähr 5⁰C bis ungefähr Rückfluß wähj rend eines Zeitraums von ungefähr 30 Minuten bis ungefähr j 5 Stunden durchgeführt.

Stufe B) wird vorzugsweise mit einem Verhältnis von Verbindung III zu Verbindung XX von ungefähr 1:1 in einem Temperaturbereich von ungefähr -1O⁰C bis ungefähr +35⁰C, jedoch bevorzugter in einem Bereich von +5⁰C bis ungefähr 25⁰C während eines Zeitraums, bis die Acylierung vollständig ist, jedoch mindestens 1 bis 3 Stunden, anschließendem Entfernen des organischen Lösungsmittels vor der Hydrierung, durchgeführt. Die in situ

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Hydrierung wird mit Wasserstoff in Gegenwart eines Metallkatalysators, ausgewählt unter Palladium, Platin, Raney-Niekel , Rhodium, Ruthenium und Nickel, jedoch bevorzugter Palladium und am bevorzugtesten Pal 1adium-auf-Aktivkohle in Wasser oder in einem System aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel , ausgewählt unter Wasser und Dioxan, Tetrahydrofuran, Äthylenglykoldimethyläther, Propylenglykoldimethyläther und dergleichen, jedoch bevorzugter Wasser bei einem pH von 3 bis 5, jedoch am bevorzugtesten einem pH 4, durchgeführt.

Eine bevorzugtere Ausflihrungsform stellt das obige Verfahren zur Herstellung der Verbindung IV dar, dadurch gekennzeichnet, daß man in aufeinanderfolgenden Stufen:

A) die Verbindung der Formel II

CH₂-N-C-O-CH₂-CgHe

HO

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mit einem Aldehyd, ausgewählt unter Benzaldehyd, SaIicylaldehyd, p-Nitrobenzaldehyd und p-Methoxybenzaldehyd in einem Verhältnis von einem Mol Verbindung II zu mindestens drei Mol Aldehyd, in absolutem Äthanol, Methanol, n-Propanol , sek.-Butanol , tert.-Butanol , Methylenchlorid, Tetrahydrofuran, Dioxan, Dimethylformamid oder Aceton, oder Mischungen davon mit Wasser, in einem Temperaturbereich von 5⁰C bis 4O⁰C während eines Zeitraums von ungefähr 30 Minuten bis ungefähr 5 Stunden, behandelt, wobei die Verbindung der Formel III

HO

III

hergestellt wird, worin Z einen Rest der Formeln

^H J~\ ^H

-N=C-f V-NO₂ , -N = C

H
oder N = C-

darstellt; und

OCH.

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B) Verbindung III in situ oder nach Isolierung mit der Verbindung der Formel XX

0 0

Il

N-O-C-CH-CH₂-CH₂-NH-C-O-CH₂-C₆H₅ OH

XX

in einem Verhältnis von einem Mol Verbindung III zu ungefähr 0,5 bis 1,0 Mol Verbindung XX in einem Bereich von +5⁰C bis 35⁰C während 1 bis 3 Stunden in einem Lösungsmittelsystem wie in Stufe A) beschrieben, behandelt, anschließend das organische Lösungsmittel entfernt und den Rückstand in situ mit Wasserstoff in Gegenwart eines Metal 1katalysators , vorzugsweise ausgewählt unter Palladium, Platin, Raney-Niekel , Rhodium, Ruthenium und Nickel, jedoch bevorzugt Palladium und noch bevorzugter Pailadium-auf-Aktivkohle, in Wasser oder in einem System aus Wasser und einem

mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, vorzugsweise ausgewählt unter Wasser und Dioxan, Tetrahydrofuran, Äthylenglykol- dimethylather und Propylenglykoldimethyläther, jedoch vorzugsweise Wasser, bei einem pH von 3 bis 5, jedoch vorzugsweise 4, hydriert, wobei man die Verbindung der Formel IV erhält.

Eine bevorzugtere Ausführungsform ist das Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Formel IV

50 9849/0 85 7

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25H817

CH₂-NH₂ HO-. J

IV

dadurch gekennzeichnet, daß man in aufeinanderfolgenden Stufen

A) die Verbindung der Formel II

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19

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mit einem Aldehyd, ausgewählt unter Benzaldehyd, SaIicy1 aldehyd und p-Nitrobenzaldehyd in einem Verhältnis von einem Mol Verbindung II zu ungefähr drei Mol Aldehyd in absolutem Äthanol, Methanol, n-Propanol , Isopropanol, n-Butanol , sek.-Butanol , tert.-Butanol , Tetrahydrofuran, Methylenchlorid, Dioxan, Dimethylformamid oder Aceton, oder einer Mischung davon mit Wasser, bei ungefähr 5⁰C bis 40⁰C während eines Zeitraums von ungefähr 30 Minuten bis ungefähr 5 Stunden, behandelt, wobei man die Verbindung der Formel III

-N-C-O-CH--CH

HO

III

erhält, worin Z für einen Rest der Formeln HO

steht; und

NO« oder -N=C

- 10 -

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B) Verbindung III in situ oder nach Isolierung mit der Verbindung der Formel XX

0 0

-0-C-CH-CH₂-CH₂-NH-C-O-CH₂-C₆H₅ OH

XX

in einem Verhältnis von einem Mol Verbindung III zu ungefähr 0,5 bis 0,85 Mol Verbindung XX in einem Bereich von +15⁰C bis 3O⁰C während 1 bis 3 Stunden in einem Lösungsmittelsystem, wie in Stufe A) beschrieben, behandelt, anschließend das organische Lösungsmittel entfernt und den Rückstand in situ mit Wasserstoff in Gegenwart eines Metallkatalysators, vorzugsweise ausgewählt unter Palladium, Platin, Raney-Niekel, Rhodium, Ruthenium und Nickel, jedoch bevorzugt Palladium, und bevorzugter Pal 1adium-auf-Aktivkohle, in Wasser oder

in einem System aus Wasser und einem mit

Wasser mischbaren Lösungsmittel, vorzugsweise ausgewählt unter Wasser und Dioxan, Tetrahydrofuran, Äthylenglykoldimethyläther und Propylenglykoldimethyläther, jedoch vorzugsweise Wasser, bei einem pH von ungefähr 4, behandelt, wobei man die Verbindung der Formel IV erhält.

Eine am meisten bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel IV

- 11 -

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HO

H₂N

EO

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dadurch gekennzeichnet, daß man in aufeinanderfolgenden Stufen: ι

A) die Verbindung der Formel II

- 12 -

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ti

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mit Benzaldehyd in einem Verhältnis von einem Mol Verbindung II pro drei Mol Benzaldehyd in einer ungefähr 1:1 Mischung von Wasser und Tetrahydrofuran bei ungefähr 2O⁰C bis ungefähr 3O⁰C bei einem pH von ungefähr 10 während ungefähr 2 bis 4 Stunden behandelt, wobei man die Verbindung der Formel IHa

III·

erhält; und

B) Verbindung IHa in situ oder nach Isolierung mit der Verbindung der Formel XX

O O

N-O-C-CH-CH₂-CH₂-NH-C-O-CH₂-C₆H₅ OH

XX

in einem Verhältnis von einem Mol Verbindung 111a zu 0,6 bis 0,75 Mol Verbindung XX bei einer Temperatur im Bereich von ungefähr 20⁰C bis ungefähr 3O⁰C während eines Zeitraums von 1 bis 3 Stunden in einem Lösungsmittelsystem, Wie-in Stufe A)

- 13 -

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beschrieben, einer Mischung von Methylenchlorid, Methanol und Wasser oder einer Mischung von Dimethylformamid, Aceton und Wasser, behandelt, anschließend das organische Lösungsmittel im Vakuum entfernt, den pH mit Ammoniumhydroxid auf 4 einstellt und den Rückstand in situ mit Wasserstoff bei atmosphärischem Druck.in Gegenwart von Palladium-auf-Aktivkohle hydriert, wobei man die Verbindung der Formel IV erhält.

Die am meisten bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden j Erfindung ist das Verfahren zur Herstellung der Verbindung "der | Formel IV !

dadurch gekennzeichnet, daß man in aufeinanderfolgenden Stufen:;

A) die Verbindung der Formel II

- 14 -

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1S

25H817

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mit Salicylaldehyd in einem Verhältnis von einem Mol Verbindung II pro drei Mol SaIicylaldehyd in einer ungefähr 1:1 Mischung von Wasser und Tetrahydrofuran bei ungefähr 20 C bis ungefähr 3O⁰C bei einem pH von ungefähr 8 während ungefähr 2 bis 4 Stunden behandelt, wobei man die Verbindung der Formel IHb

HIb

erhält; und

- 15 -

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B) Verbindung HIb in situ oder nach Isolierung mit der Verbindung der Formel XX

0 0

-0-C-CH-CH₂-CH₂-NH-C-O-CH₂-C₆H₅

OH

XX

in einem Verhältnis von einem Mol Verbindung IHb zu ungefähr 0,6 bis O_:75 Mol Verbindung XX bei einer Temperatur im Bereich von ungefähr 2O⁰C bis ungefähr 3O⁰C während eines Zeitraums von 1 bis 3 Stunden in einem Lösungsmittelsystem, wie in Stufe A) beschrieben oder einer Mischung von Dimethylformamid, Aceton und Wasser, behandelt, anschließend das organische Lösungsmittel im Vakuum entfernt, den pH mit Ammoniumhydroxid auf 4 einstellt und den Rückstand in situ mit Wasserstoff bei atmosphärischem Druck in Gegenwart von Pal 1adium-auf-Aktivkohle hydriert, wobei man die Verbindung der Formel IV erhält.

In der vorliegenden Anmeldung bedeutet der Begriff " (ni edri g)Al-| kyl" einen Alkylrest mit gerader oder verzweigter Kette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen. Der Begriff "(niedrig)Alkanol" steht für einen gesättigten Alkohol mit gerader oder verzweigter Kette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, der eine OH-Funktion enthält.

Gegenstand der Erfindung ist auch eine Modifikation des oben beschriebenen Verfahrens unter Anwendung einer Arbeitsweise von noch größerem "in situ"-Charakter, die jedoch dieselben überlegenen Ausbeuten an Verbindung der Formel IV zu geringeren Kosten liefert.

- 16 -

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So kann die Verbindung der Formel XX beispielsweise in situ hergestellt und mit der Verbindung der Formel III in einer bequemen Stufe umgesetzt werden. So kann die Verbindung der Formel IV wie oben beschrieben hergestellt werden, worin in Stufe B) die Reaktion dadurch gekennzeichnet ist, daß man die in Stufe A) wie oben beschrieben entweder in situ oder nach Isolierung erhaltene Verbindung III mit den Verbindungen der Formeln

0 0

H-O-C-CH-CH₂-CH₂-NH-C-O-CH₂-C₆H₅ OH

VI und

N-OH

XIX

gefolgt von der Zugabe von Di cyclohexylcarbodiimid in einem Verhältnis von einem Mol Verbindung III zu ungefähr 0,5 bis 1,0 Mol jeweils an Verbindung VI und Dicyclohexylcarbodiimid und ungefähr 0,005 bis 0,25 Mol Verbindung XIX in einem Temperaturbereich von ungefähr -1O⁰C bis ungefähr +35⁰C, jedoch vorzugsweise in einem Bereich von +5⁰C bis ungefähr 25⁰C, während mindestens 10 Stunden in einem Lösungsmi t'telsystem, wie in Stufe A) beschrieben, behandelt, anschließend das organische Lösungsmittel entfernt und den Rückstand in situ wie zuvor beschrieben, hydriert, wobei man die Verbindung der Formel IV erhält.

- 17 -

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Eine bevorzugte Ausführungsform der obigen Modifikation umfaßt die Verwendung eines Verhältnisses von einem Mol Verbindung III zu ungefähr 0,5 bis 0,85 Mol jeweils an Verbindung VI und Di cyclohexylcarbodiimid und ungefähr 0,05 bis 0,425 Mol Verbindung XIX in einem Bereich von +5⁰C bis 25⁰C während 1 bis 3 Stunden in einem Lösungsmittelsystem, wie in Stufe A) beschrieben, oder, man verwendet alternativ ein Verhältnis von einem Mol Verbindung III zu ungefähr 0,5 bis 0,8 Mol jeweils an Verbindung VI und Dicyclohexylcarbodiimid und ungefähr 0,05 bis 0,425 Mol Verbindung XIX in einem Bereich von +15⁰C bis +3O⁰C während 15 bis 25 Stunden. Am meisten bevorzugte Bedingungen sind ein Verhältnis von einem Mol Verbindung III zu ungefähr 0,6 bis 0,75 Mol jeweils an Verbindung VI und an Di cyclohexylcarbodiimid und ungefähr 0,06 bis 0,375 Mol Verbindung XIX in einem Bereich von 2O⁰C bis +3O⁰C während 15 bis 25 Stunden.

Teil der vorliegenden Erfindung ist auch ein neues und verbessertes Verfahren zur Herstellung des Ausgangsmaterials, nämlich der Verbindung der Formel II

II

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} 25H817

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dadurch gekennzeichnet, daß man Kanamycin A in Form der freien Base mit N-Benzyloxycarbony1oxy-5-norbornen-2 ,3-dicarboximid in einem Verhältnis von ungefähr 0,5 bis ungefähr 1,5 Mol N-Benzy1oxycarbonyloxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid pro Mol Kanamycin A oder insbesondere in einem Verhältnis von ungefähr 1:1, behandelt, gefolgt von Reinigen, beispielsweise durch organische Lösungsmittelextraktion mit einem Lösungsmittel, wie n-Butanol und Chromatographie aer wässrigen Phase.

Die obige Reaktion wird vorzugsweise in einem wässrigenwassermischbaren organischen Lösungsmittelsystem, wie beispielsweise Tetrahydrofuran-Wasser und bevorzugter in einer Konzentration von ungefähr 40 bis 60 % Tetrahydrofuran in einem Temperaturbereich von ungefähr O⁰C bis ungefähr 25⁰C oder, bevorzugter, ungefähr 5⁰C bis ungefähr 1O⁰C, während höchstens 6 Stunden, jedoch bevorzugter während ungefähr 4 Stunden, durchgeführt.

Die Verbindung IV, das l-N-/~L-(-)- f^-amino- öl -hydroxybutyryl_7kanamycin A (BB-K8) weist eine ausgezeichnete antibakterielle Aktivität auf, die dem Kanamycin A als solchem überlegen erscheint. Nachfolgend werden zwei Tabellen erläutert, die die minimalen Hemmkonzentrationen (MIC) von Kanamycin A und von Verbindung IV (BB-K8) gegen eine Vielzahl gram-positiver und gram-negativer Bakterien, erhalten durch die Steers-Agar-Verdünnungsmethode (Tabelle 1) und die zweifache Verdünnungsmethode (Tabelle 2), zeigen. Bei der der Tabelle 1 zugrunde liegenden Untersuchung wurde ein Müller-Hinton-Agarmedium und bei der der Tabelle 2 zugrunde liegenden Untersuchung wurde eine Heart-Infusionsbrühe verwendet.

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TABELLE 1 (MIC mg/ml)

Organismus	Kanamycin A (6-8198)	- 20 -	Verbindung IV (BB-K8) Versuch No.4
Alk.faecalis A-9423	16	8
A-20648	> 125	> 125
Ent.cloacae A-0656	4	4
species A-20364	> 125	2
hafniae 1 A-20674	1	1
, E. coli A-0636	2	1
" " A-20664	16	4
" " A-20665	> 125	1
" " A-20507	32	2
" " A-20520	>125	4
" " A-20365	> 125	1
" " A-20684	2	2
" " A-20682	>125	2
¹¹ " A-20683	> 125	8
" " A-20681	>125	2
¹¹ " A-15119	4	4
K.pneumoniae A-0967	4	4
" species A-20328	>125	2
¹¹ " A-20330	• 32	32·
" " A-20634	>125	4
" pneumoniae A-20680	> 125	4
¹¹ " A-0077	1	1
Pr.mirabilis A-9900	2	2

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TABELLE 1 (MIC mg/ml)

Organismus

Pr. morganii A-15153

¹¹ vulgaris A-9555 rettgeri A-9636 mirabilis A-20645

Alk. faecalis A-9423 A-20648

Ent. cloacae A-0656 species A-20364

" hafniae 1 A-20674

E. coil A-0636

" " A-20664 " " A-20665 ¹¹ " A-20507 ¹¹ " A-20520 " " A-20365 ¹¹ " A-20684 ¹¹ " A-20682 " " A-20683 ¹¹ " A-20681 ¹¹ " A-15119

(Fortsetzung)	Verbindung IV (BB-K8) Versuch No.4
Kanamycin A (6-8198)	CVJ
2	1
2	0,25
0,25	4
4	8
16	>125
>125	4
4	cvj
>125	1
1	1
2	4
16	1
> 125	2.
32	4
>125	1
>125	2
cvj	cvj
>125	8
>125	2
>125	4
4

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TABELLE 1 (MIC mg/ml)

	Organismus	pneumoniae A-0967	alkalifaciens A-	50984	Kanamycin A (6-8198)	Verbindung IV (BB-K8) Versuch No.4	9
(Fortsetzung)	K.	species A-20328	aeruginosaA-20229	4	t 4
Il	A-20330	A-0943A	>125	2
Il	A-20634	A-20653	32	32
Il	pneumoniae A-20680	species A-20601	> 125	4
Il	A-0077	A-20621	>125	4
Il ! I	mirabilis A-9900	maltophilia A-20620	1	1
I Pr	morganii A-15153	.enteritidis A-0531	2	2
Pr	vulgaris A-9555	derby A-20087	2	2
K	rettgeri A-9636		2	1
Il	mirabilis A-20645	0,25	0,25
i ' Il	mirabilis A-20454	4	4
Il	Providencia stuartii A-20615	2	2
Ii	2	' 1
Ps.	20676 1	1
Il	32	2
Il	125	16
Il	. >125	32
Il	125, 63	16
Il	>125	> 125
SaI	32	>125
Il	1	0,5
	> 125	1
	- 22 -
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M/16 074	TABELLE 1 (MIC mg/ml)	A-9933	(Fortsetzung)	I Schafsblut	25H817
		A-20460	Kanamycin A (6-8198)	63
		A-20459	2	125
Organismus	Ser. marcescens A-20019	A-9684	4	32, 16	Verbindung IV (BB-K8) Versuch No.4
	11 Il	A-20670	> 125	125	4
	Il Il	20671	4	125	8
Il Il	. A-20673	4	125	4, 2
Shig. flexneri	p. A-20678	2	63, 32	16
Aeromonas sp.	A-9606	2	125	4 :
Arizona sp. A-	A-4749	4	2
Citrobacter sp	A-9537	4	1 !
Edwardsiella s	A-20610	1	I 4
Staph. aureus	A-20240	0,5	4
Il Il	A-15197	2	1
Il Il	Medium +4 5	> 125	1
Il Il	A-9854	>125	1
Il Il	A-9575	1	2
Il Il	A-20200	8
Mueiler-Hinton	A-9604	2
Str. faecalis	A-15040
Il Il	A-20065	63
Str. pyogenes	A-9585	>125
Il Il	A-20159	32
Il Il	125
Il Il	125
D. pneumoniae	125
Il Il	63
>125

- 23 509849/0857

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TABELLE 2 (MIC mg/ml)

Organismus

D.pneumoniae + 5% Serum A-0585

Str.pyrogenes + 5% Serum A-9004

Staph.aureus Smith A-9537 Staph.aureus A-9497 Staph.aureus A-20239 Staph.aureus A-20240 Enter.cloacae A-0656 Enter.species A-20364 K.pneumoniae A-9867 E.coli K-12 ML1410 A-20361 E.coli K-12 ML1630 A-20363 E.coli K-12 A-9632 E.coli A-20664 E.coli A-20665 Pr.mirabilis A-9900 Pr.morganii A-15153 Pr.vulgaris A-9436 Ps.aeruginosa A-20227 Kanamycin A
(6-8196)

63

Verbindung IV

(BB-K8) Versuch No. 4

125	125
0,5	0,5
0,5	0,5
125	4
125	4
2	2
125 2	2 4
2	4
125	2
2	1
32	8
125	8
2	16·
4	16
1	2
4	1

- 24 -

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M/16 074

IS

Organismus

TABELLE 2 (MIC mg/ml) (Fortsetzung)

Kanamycin A (6-8196)

Verbindung IV

(BB-K8) Versuch No.

Ps.species A-20499 Ps.aeruginosa A-20653 Ps .species A-20621 Ser.marcescens A-20019 Ser.marcescens A-20141 63

125

16

4 4

125

16

- 25 -

509849/0857

Λ 25U817

Μ/16 074

Die obigen MIC-Daten zeigen, daß Verbindung IV (BB-K8) dem Kanamycin A hinsichtlich seiner Aktivität, insbesondere gegen Kanamycin A-resistente Organismen, überlegen ist.

Die MIC-Daten korrelieren auch gut mit den in vivo Ergebnissen für alle drei Organismen, gegenüber denen Kanamycin A und Verbindung IV untersucht wurden.

Verbindung IV und Kanamycin A waren gleich wirksam bei Infektionen von Mäusen, die durch Kanamycin Α-sensitive Stämme von E. coli A-15119 und Staph. aureus A-9537, hervorgerufen wurden Obgleich die CD₅₀-Werte (heilende Dosis bei 50 % von lethal infizierten Mäusen) bei Stahp. aureus A-9537 zunächst nahelegen, daß Verbindung IV etwas weniger aktiv als Kanamycin A ist, dürfte dieser kleine Unterschied jedoch wahrscheinlich nicht signifikant sein, da die Dosierungshöhen weit auseinanderlagen (5-fache Verdünnung).

Wie erwartet war das Kanamycin A gegenüber dem Kanamycinresistenten Stamm von E. coli A-20520 in vivo nicht sehr wirksam, wogegen Verbindung IV eine ausgeprägte Schutzwirkung zeigte. Verbindung IV war angenähert lOmal wirksamer gegen diesen E. coli-Stamm, wenn sie in einer 4-fach-Behandlung anstelle einer 2-fach-Behandlung, verabreicht wurde.

- 26 -

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Verbindungen

cn ο co OO ' *- ro CO ^¹

Verbindung IV

ei ch
ndun

de
g ι

r
V

TABELLE

OCOCCUS
A-9537

3

VO

-Akti

vi

ta

ten von

Es
A-

cheri
20520

chi

'16 07-

a col i

Vergl
Verbi

chs-
r

in vitro- und in
und Kanamycin A

CD_5O ^b

vi

Es
A-

cheri
15119

ch

i a

col i

MI

C

^CD50

Versu
numme

Staphyl
aureus

2,0 X 2

MI

C

^CD50

2

66
5

X 2
X 4

MIC

2

X 2

1
2

1
_c

Kanamycin A

0,5 X 2

4X2

125

200 X 2 200 X 4

¹MIC

'CD

50

Minimale Hemmkonzentration (yug/ml) . Die Tests wurden wie von Chisholm et al. (Antimicrob. Agents and Chemotherapy, 1969, Seite 244, 1970) beschrieben, unter Verwendung von Muel1er-Hinten-Agar als Testmedium, durchgeführt.

heilsame Dosis, 50 % (mg/kg/behandelt X Anzahl von Behandlungen). Mäuse wurden subkutan bei 1 und 4 Stunden nach dem Insult behandelt, wenn zwei Behandlungen erfolgten und bei 0, 2, 4 und 6 Stunden nach dem Insult, wenn vier Behanldungen durchgeführt wurden. Die weiteren Aspekte des Tests wurden wie von Price et al. (J. of Antibiotics 22, 1, 1969) beschrieben, durchgeführt.

nicht untersucht.

25H817

M/16 074

Verbindung IV ist wertvoll als antibakterielles Mittel, als Beifuttermittel bei Tierfutter, als therapeutisches Mittel bei Geflügel und Tieren, einschließlich des Menschen, und ist besonders wertvoll bei der Behandlung infektiöser Erkrankungen, die durch gram-positive und gram-negative Bakterien hervorgej rufen werden.

■ Bei oraler Verabreichung ist Verbindung IV brauchbar als Zu-

I satzbehandlung zur präoperativen Sterilisation des Darms.

: Sowohl die aerobe als auch die anaerobe Flora, die auf dieses

Arzneimittel anspricht, werden im Dickdarm vermindert. In Verbindung mit angemessener mechanischer Reinigung ist sie ' brauchbar bei der Vorbereitung von Dickdarmoperationen.

Verbindung IV ist wirksam bei der Behandlung systemischer bakterieller Infektionen bei Menschen, wenn sie parenteral ] im Dosierungsbereich von ungefähr 250 mg bis ungefähr 3000 mg pro Tag in aufgeteilten Dosen, drei- bis viermal täglich, verabreicht wird. Im allgemeinen ist die Verbindung wirksam,

■ wenn sie in einer Dosierung von ungefähr 5,0 bis 7,5 mg/kg Körpergewicht alle 12 Stunden verabreicht wird.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen.

Beispiel 1

5-Norbornen-endo-2,3-di carbonsäureanhydrid (XVIII)

Die Herstellung erfolgt gemäß der Arbeitsweise von 0. Diels und K. Aider, Ann. 460, 98 (1928). Zu einer gerührten Suspension von 98,1 g (1 Mol) Maleinanhydrid in 500 ml trockenem Benzol gibt man tropfenweise 66,1 g (1 Mol) Cyclopentadien unter Rühren. Die Mischung wird gerührt, wobei man einen

- 28 -

509849/0857

25H817

M/16 074

kristallinen Niederschlag erhält, der durch Filtrieren gesammelt und aus Ligroin (im wesentlichen n-Hexan/Benzol (1:1)) umkristallisiert wird, wobei man 116 g (71 %) des Titelprodukts mit Schmelzpunkt 164 bis 166⁰C erhält (Literatur: Schmelzpunkt 164 bis 165⁰C).

j Beispiel 2

! N-Hydroxy-S-norbornen-endo-Z.S-dicarboximid (HONB) (XIX)

Die Herstellung wird gemäß der Arbeitsweise von L. Bauer ; und S.V. Miarka, J. Org. Chem. , 24, 1293 (1959) durchgeführt. 115 g (0,7 Mol) des Norbornenanhydrids (XVIII) werden zu einer Lösung von Hydroxylamin, das durch Zugabe von 47,5 g (0,45 Mol) Natriumcarbonat zu einer Lösung von 60,5 g (0,87 Mol) Hydroxylamin-hydrochlorid in 140 ml Wasser, hergestellt wurde, zugegeben. Die Mischung wird 1 Stunde auf 60 bis 70⁰C erhitzt und über Nacht in einem Kühlschrank stehengelassen. Die Kristalle werden durch Filtrieren gesammelt, mit 120 ml kalter 5n HCl gewaschen und getrocknet, wobei man 84,9 g (70 %) Verbindung XIX mit Schmelzpunkt 172⁰C erhält. Die Mutterlauge wird auf \ pH 2 angesäuert und lOmal mit 70 ml CHCl₃ extrahiert. Eindampfen der CHClg-Extrakte ergibt die zweite Ausbeute an Verbindung XIX (7,2 g, 6 %) mit Schmelzpunkt 170 bis 172⁰C.

Beispiel

N-Hydroxy-5-norbornen-2 ,3-di carboximidester von L-fr^-Benzyloxycarbonylamino- 0^ -hydroxybuttersäure (XX)

2,06 g (0,01 Mol) Dicyclohexylcarbodiimid (DDC) werden bei

1O⁰C zu einer gerührten Lösung von 2,53 g (0,01 Mol) L-f^-Benzyl

oxycarbonylamino- o(-hydroxybuttersäure und 1,79 g (0,01 Mol)

- 29 -

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M/16 074

SO 25H817

Verbindung XIX in 50 ml trockenem Tetrahydrofuran (THF) zugegeben. Die Mischung wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Den ausgefällten Dicyclohexylharnstoff entfernt man durch Filtrieren und wäscht mit THF. Das Filtrat und die ! Waschflüssigkeiten werden vereinigt und im Vakuum eingedampft. 4,5 g des öligen Rückstandes werden durch eine Si 1ikagelsäule durchgegeben und mit Äthylacetat eluiert, wobei man 4,0 g (96 %) des aktiven Esters XX in Form eines farblosen Öls erhält. Infrarot-Spektren (IR; gut aufgelöst): 3300, 1820, 1780, 1735, 1720, 1695 cm" . Kernmagnetische Resonanzspektren /"NMR (CDCl₃ + 1 Tropfen D₂0)7: <f(in ppm) 1,63 (2H, q, J=9Hz), 2,15 (2H, m), 3,40 (6H, m) , 4,60 (IH, d-d, J = 7 und 5 Hz), 5,13 (2H, s), 6,20 (2H, breit), 7,40 (5H, s).

Beispiel

N-Behzyloxycarbonyloxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid (XVII) '

Zu einer gerührten Lösung von 2,64 g (0,066 Mol) Natriumhydroxid in 50 ml Wasser gibt man 3,58 g (0,02 Mol) N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid (XIX) bei 10⁰C zu. Zur Lösung gibt man j

tropfenweise 6,82 g (0,04 Mol) Benzyloxycarbony1chlorid und j zwar im Verlauf von 40 Minuten bei 0 bis 5 C, und man rührt ! die Mischung 4 Stunden bei Raumtemperatur. Zur Reaktionsmischung werden 20 ml η-Hexan zugegeben, wobei man einen weißen Niederschlag erhält, der durch Filtrieren gesammelt und an der Luft getrocknet wird. Das rohe Produkt wird aus Benzol/n-Hexan kristallisiert, wobei man 5,1 g (81 %) farblose Prismen der Verbindung XVII mit Schmel zpunkt .121 bis 122⁰C erhält. ·.

IR (KBr): 1810, 1780, 1740, 1630 cm"¹.

NMR (Aceton-dg): d"(in ppm), 1,66 (2H, breit s) , 3,45 (4H, m) , 5,37 (2H, s), 6,12 (2H, t, J = I,5Hz), 7,48 (5H, s).

- 30 -

E09849/0857

	r^Hl	5^NO5	•	H	4	,83;	34	N	4	,47
M/16 074	C	65,	17;	H	4	,73;		N	4	,44
Analyse C₁-	C	65,	50;
berechnet:
gefunden:

25H817

Beispiel 5

6'-N-Benzy1oxycarbony1 kanamycin A (II) /"6* -Cbz-Kanamycin k]

Zu einer gerührten Lösung von 4,84 g (0,01 Mol) Kanamycin A in Form der freien Base in 50 ml 50 %-igem wässrigen THF gibt man 3,14 g (0,01 Mol) Verbindung XVII in mehreren Portionen im Verlauf von 1 Stunde bei 7⁰C zu. Man rührt die Mischung weiterhin 4 Stunden und dampft dann im Vakuum ein, um das organische Lösungsmittel zu entfernen. Die erhaltene wässrige Lösung wird mit 150 ml Wasser verdünnt und mit zwei 100 ml-Portionen mit Wasser gesättigtem Butanol extrahiert. Die Butanolschicht wird mit 100 ml Wasser gewaschen und im Vakuum eingedampft, wobei man 1,78 g Poly-Cbz-kanamycin A erhält. Die wässrige Schicht und die Waschflüssigkeiten werden vereinigt und im Vakuum auf ungefähr 50 ml konzentriert. Die : wässrige Lösung wird durch eine Säule mit CG-50-Ionenaustauscher harz (NH₄ ⁺, 140 ml) gegeben, die nacheinander mit 200 ml Wasser, 1,9 Liter 0,05 η NH₄OH, 1,9 Liter 0,1 η NH₄OH und schließlich j 1 Liter 0,3 η NH₄OH, entwickelt wird. Das Eluat wird in 20 ml- ! Fraktionen aufgefangen und auf der Basis des Rf-Werts bei der Dünnschichtchromatographie /TLC (S-114; 6'-Cbz-kanamycin Rf = 0,23, Kanamycin Rf = 0,07)7, in die nachfolgenden zwei Fraktionen aufgeteilt. Jede Fraktion wird im Vakuum eingedampft und aer Rückstand wird im Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet.

- 31 -

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U 25H817

M/16 074

Fraktion Röhren-Nr. eluiert mit Menge Identität

1 106-144 0,1 η NH.OH 3,44 g 6"-Cbz-Kana-

⁴ (56 %) myei η (II)

2 203-212 0,3 η NH-OH 0,54 g Kanamycin

(11 %) wiedergewonnen

Auf diese Weise hergestelltes 6'-Cbz-Kanamycin (II) ist nach TLC auf einer Si 1ikagelplatte sehr rein und homogen; Schmelzpunkt 217 bis 219⁰C. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften stehen im Einklang mit einer authentischen Probe.

Beispiel

l-N-A-(-)- fr-Amino-ql -hydroxybutyryljkanamycin A (BB-K8; IV) über die Schiffsche Base mit Benzaldehyd

Zu einer gerührten Lösung von 6,19 g (0,01 Mol) 6'-Cbz-Kanamycin (II) in 50 ml 50 %-igem THF gibt man 3 ml (0,03 Mol) Benzaldehyd. Die Mischung wird 3 Stunden bei Rauroteiaperatur gerührt, auf 5⁰C gekühlt und dann mit einer Lösung von 4 g (0,01 Mol) Verbindung XX in 50 ml THF behandelt. Die Mischung wird 1 Stunde bei 5⁰C gerührt, mit 6 η HCl auf pH 2 eingestellt, eine weitere Stunde bei Raumtemperatur gerührt und anschließend im Vakuum eingedampft, um das organische Lösungsmittel zu entfernen. Die erhaltene wässrige Lösung wäscht man mit 20 ml CH₂Cl₂, der pH wird mit 10 % NH₄OH auf 4 eingestellt und man hydriert über Nacht mit 1,25 g 10 % Pailadium-auf-Aktivkohle unter atmosphärischem Druck bei Raumtemperatur. Den Katalysator filtriert man ab und wäscht mit 20 ml Wasser. Das FiI trat und die Waschflüssigkeiten werden vereinigt, mit 10 % NH₄OH auf pH 8 eingestellt und durch eine Säule mit CG-50 (NH₄+, 200 ml) durchgegeben, die mit 0,4 Liter Wasser, 1,2 Liter 0,1 η NH₄OH, 2,06 Liter 0,3 η NH₄OH, 0,92 Liter 0,5 η NH₄OH und schließlich 1,2 Liter 1,0 η NH₄OH eluiert wird. Das Eluat

- 32 -

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■25H817

M/16 074

wird in 20 ml-Fraktionen aufgefangen und auf der Basis des Rf-Werts bei der TLC auf einer Si 1ikagelplatte (S-IlO, Ninhydrin) und den Scheibentest unter Verwendung von B.subtilis PCI 219 und P.aeruginosa A 9843, in die nachfolgenden Fraktionen aufgeteilt. Jede Fraktion wurde im Vakuum eingedampft und gefriergetrocknet.

- 33 -

509849/0857

Fraktion

Röhren-Nr.

90-99

	co	2	152-161
	I	3	162-169
	4	170-197
O
CD OO	5	198-203
4> CD	6	238-257
Ό857

w'assr.NH.OH eluiert Gew.-Ausbeute

0,3 η

0,3 η 0,3 η

0,3 η - 0,5 η

0,5 η 1,0 η

mg (8 %) mg (6 %)

Bi ο-Aus beute

mg (33%) 1490 mg (30%)

*1

mg (3 %)

*2

mg (30%) 1350 mg (23%)'

mg (2 %) mg (2 %)

*2

*1

♦ 2 Kanamycin wiedergewonnen

BB-K

BB-K 29 + BB-K

BB-K 8 + BB-K

BB-K

di acy 1 i erte Verbindung

gegen B. subtilis PCI 219 bestimmt

gegen K. pneumoniae A 20680, der gegenüber BB-K 8 empfindlich und gegenüber Kanamycin, BB-K 11 und BB-K 29 sehr resistent ist, bestimmt.

SS 25U817

M/16 074

1,877 g der Fraktion 4 werden in 10 ml entionisiertem Wasser gelöst. Die Lösung wird mit 10 % HCl auf pH 6 eingestellt und auf einer CG-50-Säule (NH₄ ⁺, 15 ml) adsorbiert, die mit 100 ml 0,3 η NH₄OH und 200 ml 0,5 η NH₄OH, eluiert wird. Das Eluat wird in 20 ml-Fraktionen aufgefangen. Die Röhren-Nummern 6 und 8 bis 17 sind Ninhydrin-positi ν. Die Röhren-Nummern 8 bis 17 werden vereinigt und im Vakuum auf angenähert 1 ml konzentriert Das Konzentrat wird mit 3 ml MeOH behandelt und filtriert. Das Filter wäscht man mit 0,5 ml 75 %-igen wässrigem MeOH. Man vereinigt das Filtrat und die Waschflüssigkeiten, verdünnt mit weiteren 10 ml MeOH und läßt über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Der amorphe Niederschlag wird filtriert, das Filtrat wird angeimpft, wobei man farblose Kristalle von Verbindung IV erhält, die mit einer authentischen Probe identisch sind. Das Filtrat wird im Vakuum eingedampft und lyophi1isiert. Ausbeute und Untersuchung jeder Fraktion sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben.

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509849/0857

•IV

Amorphes Pulver

cn	I	Kristall	e
ο
co	I
00	I	Lyophi 1 i	sertes
	, I	PuIver
CD	I co
■^	cn
CD	I ι
OO	¹
CTJ

	e	mg	B.subt	Unters	uchung	u/mg	B.subti	Ausb	rs 1—· cn	eute
		mg	737	ilis		μ/mg	0,9	lis	O	K. pneumoni ae
		1163	μ/mg			19			1,1 %
Meng			μ/mg				%	19 %

70				K.pneumoniae
1098		927
	1087

180 mg 608 jj/mg 504 u/mg

1,9 %

1,6 %

BB-K 11 ist 3"-N-A-(-)-^-Amino-(^-hydroxybutyryl7-kanamycin A BB-K 29 ist 3-N-/t-(-)- p-Ami no-c*-hydroxybutyry!/-kanamycin A.

Beispiel 7

Herstellung von L-(-)- y -Benzyloxycarbonyl amino- c*-hydroxybuttersäure (VI)

7,4 g (0,062 Mol) L-(-)-^-Amino-c*-hydroxybuttersäure werden zu einer Lösung von 5,2 g (0,13 Mol) Natriumhydroxid in 50 ml

[ Wasser zugegeben. Zur gerührten Lösung gibt man tropfenweise bei 0 bis 5⁰C während eines Zeitraums von 0,5 Stunden 11,7 g (0,068 Mol) Carbobenzoxychlorid und rührt noch eine weitere Stunde bei derselben Temperatur. Die Reaktionsmischung wird

j mit 50 ml Äther gewaschen, mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure auf pH 2 eingestellt und mit vier 80 ml-Portionen Äther extrahiert. Die Ätherextrakte werden vereinigt, mit einer kleinen Menge gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Das Filtrat wird im Vakuum eingedampft und der erhaltene Rückstand wird aus Benzol kristallisiert, wobei man 11,6 g (74 %) farblose Platten mit Schmelzpunkt 78,5 bis 79,5⁰C erhält.

_D - ⁴»⁵° (^c=2> CH₃OH). Infrarot-Spektrum (IR) /KBrJ:

^ c=o 1740, 1690 cm" . Kernmagnetische Resonanz (NMR) (Aceton-d₆) ($(in ppm von TMS) 2,0 (2H, m), 3,29 (2H, d-d, j=6,7 und 12 Hz), 4,16 (IH, d-d, J = 4,5 und 8 Hz), 4,99 (2H, s 6,2 (2H, breit), 7,21 (5H , s).

Analyse ^ci2^H15^N05 ^:

berechnet: C 56,91; H 5,97; N 5,53 gefunden : C 56,66; H 5,97; N 5,47

—-—37~- 509849/0857

?514817

M/16 074 ~ ^v

Beispiel 8

N-Hydroxysuccinimi dester von L-(-j-f-Benzyl oxy carbonylami η ο-pc-hydroxy buttersäure (VII)

Eine Lösung von 10,6 g (0,042 Mol) Verbindung VI und 4,8 g (0,042 Mol) N-Hydroxysuccinimid¹ in 200 ml Äthylacetat wird auf O⁰C gekühlt und anschließend werden 8,6 g (0,042 Mol)

! Dicyclohexylcarbodiimid zugesetzt. Man hält die Mischung,

liber Nacht in einem Eisschrank. Der abgeschiedene Dicyclo-

[ hexylharnstoff wird abfiltriert und das Filtrat wird auf

j ungefähr 50 ml unter vermindertem Druck konzentriert, wobei

' man farblose Kristalle von Verbindung VII erhält, die durch

' Filtrieren gesammelt werden. Ausbeute 4,6 g mit Schmelzpunkt

121 bis 122,5⁰C. Das Filtrat wird im Vakuum zur Trockne ein-

^; gedampft und der kristalline Rückstand wird mit 20 ml einer

j Mischung aus Benzol/n-Hexan gewaschen, wobei man eine zu-

¹ sätzliche Menge an Verbindung VII erhält. Die Gesamtausbeute

ι beträgt 13,4 g (92 %).
ί

Rl_n 1,5° (c=2, CHCU) IR (KBr) V¹C=O 1810, 1755, 1740,

] 1680 cm"¹. NMR (Aceton-d_ß) cf (i η ppm von TMS) 2,0 (2H , m) ,

; 2,83 (4H, s), 3,37 (2H, d-d, J=6,5 und 12,5 Hz), 4,56 (IH, m),

j 4,99 (2H, s), 6,3 (2H, breit), 7,23 (5H, s).

Analyse ^ci6^H]ß^N2⁰7 ^:

berechnet: C 54,85; H 5,18; . N 8,00

gefunden : C 54,79, 54,70; H 5,21, 5,20; N 8,14, 8,12.

¹ G.W. Anderson et al., J.Am.Chem.Soc. , 86, 1839 (1964)

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Μ/16 074

Beispiel Herstellung von N-(Benzyloxycarbonyloxy)succinimid

23 g (0,2 Mol) N-Hydroxysuccinimid werden in einer Lösung von 9 g (0,22 Mol) Natriumhydroxid in 200 ml Wasser gelöst. Zur gerührten Lösung gibt man tropfenweise 34 g (0,2 Mol) Carbobenzoxychlorid unter Wasserkühlung zu und rührt dann die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur, um das Carbobenzoxyderivat abzuscheiden, das durch Filtrieren gesammelt, mit Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet wird. Die Ausbeute beträgt 41,1 g (82 %).

Umkristallisation aus Benzol/n-Hexan (10:1) ergibt farblose Prismen, die bei 78 bis 79⁰C schmelzen.

G.W. Anderson et al., J.Am.Chem.Soc., 86, 1839 (1964).

Beispiel 10 Herstellung von 6'-Carbobenzoxykanamycin A (II)

Eine Lösung von 42,5 g (90 mMol) Kanamycin A in Form der freien Base in 450 ml Wasser und 500 ml Dimethylformamid (DMF) werden auf unter 9⁰C gekühlt und heftig gerührt. Zu der Lösung gibt man tropfenweise im Verlauf von ungefähr 2 Stunden eine Lösung von 22,4 g (90 mMol) N-(Benzyloxycarbonyloxy)succinimid in 500 ml DMF. Die Mischung wird bei -10 bis O⁰C über Nacht und anschließend einen Tag bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung dampft man unter vermindertem Druck unterhalb ungefähr 50⁰C ein. Der ölige Rückstand wird in einer Mischung von 500 ml Wasser und

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074 ** 25H817

500 ml Butanol gelöst, die Mischung wird filtriert, um unlösliches Material zu entfernen und in zwei Schichten aufgetrennt. Das Butanol und die wässrigen Schichten werden zweimal mit 500 ml mit Butanol gesättigtem Wasser und zweimal mit 500 ml mit Wasser gesättigtem Butanol behandelt, wobei man eine Technik anwendet, die der der Gegenstromverteilung gleich ist. Die drei wässrigen Schichten werden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft,! wobei man einen öligen Rückstand erhält, von dem ein Teil - I beim Stehen bei Raumtemperatur kristallisiert. Zum Rückstand, j einschließlich der Kristalle, gibt man ungefähr 100 ml Methanol, die das Ul lösen und es von den Kristallen abtrennen. Nach j Zugabe von ungefähr 300 ml Äthanol wird die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur gehalten, wobei man eine kristalline Masse erhält, die durch Filtrieren gesammelt wird. Sie wiegt 44 g. Das Produkt enthält eine kleine Menge an Kanamycin A; dies wird durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von n-PropanolZPyridinZEssigsäureZWasser (15:10:3:12) als Lösungsmittelsystem und Ninhydrin als Spray-Reagenz, festgestellt.

Das rohe Produkt wird in 300 ml Wasser gelöst und auf einer Säule (30 mm Durchmesser) mit CG-50-Ionenaustauscherharz (NH^⁺-Typ, 500 ml) chromatographiert. Die Säule wird mit 0,1 η Ammoniumhydroxidlösung beschickt und das Eluat wird in 10 ml-Fraktionen aufgesammelt. Das gewünschte Produkt befindet sich in den Röhren Nummern 10 bis 100, wogegen Kanamycin A von den sich langsamer bewegenden Fraktionen gewonnen wird und das (die) Positionsisomere(en) des Produkts sich anscheinend in den schneller bewegenden Fraktionen befinden. Die Fraktionen 10 bis 110 werden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft, wobei

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M/16 074

25U817

man 24,6 g (45 %) farbloses Produkt, das 6-Carbobenzoxykanamycin A (II) /"6'-Cbz-Kanamycin PJ erhält, das bei 204⁰C zu schmelzen und sich zu verfärben beginnt und das bei 212⁰C unter Gasentwicklung zersetzt. Π^Ί +106° (c=2 H₂O).

TLC (Silikagel F254; Ninhydrin).

Rf-Wert

Lösungsmitte!system

6'-Cbz-Kanamyein A Kanamycin- A

n-PrOH-Pyridin-AcOH-H₂O 0,42 0,33 0,15 ' 0,04

(15:10:3:12) (haupts.) (weniger)

Aceton-AcOH-H₂0 (20:6:74)

CHCl₃-MeOH-CNH₄OH-H₂O (1:4:2:1)

AcOMe-n-PrOH-C.NH₄OH (45:105:60)

0,24

0,76

0,22

0,14

0,50

0,04

Durch Anthron/Schwefelsäure entdeckt.

Durch TLC mit einem der untersuchten Lösungsmittelsysteme stellt man fest, daß das Endprodukt von 2 geringeren Komponenten begleitet ist. Jedoch wird das Endprodukt ohne weitere Reinigung zur Herstellung von BB-K8 (IV) verwendet.

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2 5 K 8 1 7

M/16 074 /O I ^o I /

Beispiel Π

Herstellung von L-(-)- f^-Amino- ^ -hydroxybuttersäure aus Ambutyrosin A oder B oder Mischungen davon

; 5,0 g Ambutyrosin A /fUS-Patentschri f t 3 541 0787 werden 1 Stun- ^; de mit 160 ml 0,5 η Natriumhydroxid am Rückfluß gehalten. Das Hydrolysat wird mit 6 η HCl neutralisiert und auf einer ; Säule mit CG-50 (NH₄ ⁺-TyP) chromatographiert.· Die gewünschte ! L-(-)- p^-Amino- ot-hydroxybuttersäure wird durch Entwickeln ' der Säule mit Wasser und Entfernen des Wassers durch Gefrier- ^: trocknung isoliert. Die L-(-)- p-Amino- ot -hydroxybuttersäure ist als kristallines Material mit einem Schmelzpunkt von 212,5 bis 214,5⁰C /'Kolonne 2, Zeilen 31 bis 38 der US-Patentschrift ■ 3 541 0787 charakterisiert.

Beispiel 12

Herstellung von L-( -)- j/~-Amino- o( -hydroxybuttersäure aus DL-c^-Hydroxy-^-phthaiimidobuttersäure

A) Dehydroabietyl ammoni um-L-o< -hydroxy- (Λ-phthali mi dobutyrat;

Zu einer Lösung von 25 g (0,1 Mol) 2-Hydroxy- p-phthalimidobuttersäure in 200 ml Äthanol gibt man eine Lösung von 29 g (0,1 Mol) Dehydroabiety1amin in 130 ml Äthanol. Die Lösung wird 1 Minute heftig geschüttelt und 5 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen; während dieser Zeit kristallisieren feine Nadeln aus. Die Kristalle werden durch Filtrieren gesammelt, mit 50 ml Äthanol gewaschen und an der Luft getrocknet, wobei man 30,1 g (56 %) eines Diastereomeren des Dehydroabietylaminsalzes mit Schmelz-

- 42 509849/0857

25H817

M/16 074

punkt 93 bis 94⁰C erhält. F₀^]²⁴ +15° (c=2,5, MeOH). Um-

kristallisation aus 300 ml Äthanol ergibt 23,2 g (43 %) reines Produkt mit Schmelzpunkt 94 bis 95⁰C.

Γ Π²⁴

[_ocj +10,8° (c=2,5, MeOH). Weitere Umkristall isation

ändert weder den Schmelzpunkt noch die spezifische Drehung.

Analyse C₃₂H₄₂N₂O₅-H₂

berechnet: C 69,54; gefunden : C 69,58;

Y.Saito et al., Tetrahedron Letters, 1970, 4863.

B) L-( -)- fr- -Amino- o< - hydroxy buttersäure:

H	8	,02;	N	5	,07
H	8	,08;	N	5	,07

Zu einer Lösung von 1,5 g (0,014 Mol) Natriumcarbonat in 40 ml Wasser gibt man 5,3 g (0,01 Mol) Dehydroabietylammoni um-L-c* -hydroxy- f^-phthal imi dobutyrat und 60 ml Äther. Die Mischung wird heftig geschüttelt, bis der gesamte Feststoff gelöst ist. Die Ätherschicht wird abgetrennt. Man wäscht die wässrige Lösung zweimal mit 20 ml-Portionen Äther und dampft unter vermindertem Druck auf 15 ml ein. Zum Konzentrat gibt man 10 ml konzentrierter Chlorwasserstoffsäure und hält die Mischung 10 Stunden am Rückfluß. Nach dem Kühlen wird ausgeschiedene Phthalsäure durch Filtrieren entfernt. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingedampft. Den Rückstand löst man in 10 ml Wasser und dampft die Lösung zur Trockna ein. Diese Operation wird zweimal wiederholt, um überschüssige Chlorwasserstoffsäure zu entfernen. Den zurückgebliebenen Sirup löst man in 10 ml Wasser

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M/16 074

und filtriert, um eine kleine Menge unlöslicher Phthalsäure zu entfernen. Das Filtrat wird auf einer Säule mit IR-120 (H⁺, 1 cm χ 35 cm) adsorbiert, die Säule wird mit 300 ml Wasser gewaschen und mit 1 η Ammoniumhydroxidlösung eluiert. Das Eluat wird in 15 ml-Fraktionen gesammelt. Die Ninhydrinpositiven Fraktionen 10 bis 16 werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft, wobei man einen Sirup erhält, der allmählich kristallisiert. Die Kristalle verreibt man mit Äthanol, filtriert und trocknet in einem Vakuumexsicca-i tor, wobei man 0,78 g (66 %) L-(-)-p-Amino-o4-hydroxybutter-

säure mit Schmelzpunkt 206 bis 207⁰C erhält. Γ η 24

LJ η ~²⁹ (c=2,5, HoO). Das IR-Spektrum ist mit der authentischen Probe, die aus Ambutyrosin erhalten wurde, identisch.

Beispiel 1_3

Herstellung von 6'-Carbobenzöxy-1,3,3"-tri-p-nitrobenzalkanamycin A (I lic)

9,0 g (14,5 mMol) 6'-Carbobenzoxykanamycin A werden in 500 ml absolutem Äthanol bei 24⁰C suspendiert und 8,7945 g (58,2 mMol) p-Nitrobenzaldehyd werden zugegeben. Die Mischung wird zum Rückfluß erhitzt. Während dieser Zeit ändert sich die Mischung zu einer klaren, gelben Lösung; beim Rückfluß bildet sich jedoch schnell ein weißer Feststoff. Die Mischung wird 3 Stunden zum Rückfluß erhitzt, anschließend abgekühlt und das Produkt wird durch Filtrieren gesammelt und mit etwas absolutem Äthanol gewaschen. Die Ausbeute beträgt 14,0 g (94,5 %) eines weißen kristallinen Feststoffs mit Schmelzpunkt 233 bis 234° (unkorrigiert) ; es handelt sich um das Titelprodukt IHc.

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_M/16074

Analyse C₄₇H₅₁N₇O₁₉ :

berechnet:	I yj J. C	55	J. Ό ,46;	H	5	,05;	N	9	,63
gefunden:	C	55	,39;	H	5	,08;	N	9	,60

Beispiel Ij4

Herstellung von l-N-A-(-)- j/*-Ami no- pt - hydroxy bu ty ry !/-kanamycin A (IV)

5,0 g (4,91 mMol) 6'-Carbobenzoxy-1,3,3"-tri-p-nitrobenzalkanamycin A werden in 50 ml Dimethylformamid (DMF) bei 24⁰C gelöst. 2,064 g (5,895 mMol) L-(-)-^-Benzyloxycarbonylamino- -hydroxybuttersäure-N-hydroxysuccinimidester werden in 20 ml DMF bei 24⁰C gelöst und langsam unter heftigem Rühren im Vferlauf von 75 Minuten zu der Lösung der Schiff'schen Base (111c) zugegeben. Die Lösung wird bei 24⁰C über Nacht gerührt. Unter Verwendung eines Dampfstrahl Vakuums (steam-ejector vacuum) wird die Lösung bei ungefähr 4O⁰C getrocknet (flashed dry). Sie wird dann wiederholt mit 100 ml Methanol getrocknet (flashed), wobei man ein viskoses öl erhält. Das öl wird in 100 ml 1:1 Dioxan:Wasser gelöst und 10 ml Eisessig werden zugesetzt. Die Lösung gibt man in einen 500 ml Parr-Kolben, zusammen mit 2,5 g 5 % Pd/C (Engelhard) und reduziert bei 3,16 kg/cm² (45 psi) H₉ 4 Stunden bei 24⁰C. Der gesamte Druckabfall

2 während dieser Zeit (geschlossene Flasche) beträgt 6,12 kg/cm (87 psi), einschließlich periodischer Druckkorrekturen. Die Mischung wird durch ein Bett, aus Diatomeenerde filtriert, das dann mit dreimal 50 ml 50 %-igem wässrigem Dioxan gewaschen wird. Die vereinigten Filtrate werden zur Trockne destilliert (flashed) und mit 100 ml n-Butanol azeotropiert und schließlich wiederholt mit Methanol zur Trockne destilliert

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25H817

(flashed), wobei man ein viskoses öl erhält. Es wird in 30 ml Methanol gelöst und langsam in 1000 ml kalten (5 bis 1O⁰C) Diethylether unter heftigem Rühren gegossen. Nachdem man die erhaltene Suspension eine halbe Stunde in einem Eisbad gerührt hat, wird der Niederschlag durch Filtrieren gesammelt und unmittelbar in einem Vakuumexsiccator über ΡρΟς getrocknet. Die Produktmischung wiegt 4,9620 g. Durch TLC (Dünnschichtchromatographie) wird gezeigt, daß es hauptsächlich aus Verbindung IV, Kanamycin A, und einigen Spuren· von di- und trisubstituiertem Kanamycin A, einschließlich 4-Amino-2-hydroxybuttersäure, besteht.

Die verschiedenen Fraktionen werden unter Verwendung einer 40 χ 100 mm Glassäule, die mit Amberlite IRC-50 (NH₄ ⁺-Form, Typ I, 0,148 mm/0,074 mm (100/200 mesh)) beschickt ist, um ein Harzbett von ca.980 mm zu schaffen, aufgetrennt. Die Säule wird mit 4,600 g der in 1 ml Wasser gelösten rohen Mischung beladen. Die Säule eluiert man mit einem Gradienten von Wasser zu 2 η ΝΗ,ΟΗ, wobei das Eluat in 15 ml-Fraktionen gesammelt wird. Man sammelt 295 Fraktionen und wäscht dann die Säule mit 1,5 Liter 3 η NH.OH. Die Fraktionen werden auf der Basis der optischen Drehungen vereinigt und die Feststoffe werden hieraus durch Lyophi1isieren isoliert.

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M/16 074

Frakti on No.	Zusammen setzung	Gewicht in Gramm	1654	Korrek tur auf Gewi cht des ge samten ro hen Pro dukts in Gramm	Biounter suchung	% Aus beute
120-150	kana A	1,	40	1,257 .	809	42,6
201-224	BB-K29	0,	6523	0,43	-	*
228-241	BB-K8	0,	0,7036	786+101*	19,2**

Mittel aus-4 Plattenuntersuchungen, + Standardabwei chung.

** Berücksichtigt man das wiedergewonnene kana A, so beträgt die Umwandlung in BB-K8 (IV) 33,5 %.

Bei diesem Versuch beträgt das Verhältnis von BB-K8/kana A 0,45.

Die Verbindung IV, ist, so wie sie aus dieser Arbeitsweise gewonnen wird, mit einem authentischen Produkt identisch, das durch die in der anhängigen Anmeldung, Serial No.221 beschriebene Methode erhalten wird. Der Schmelzpunkt beträgt 194° (Zersetzung) UX~|²¹ +85° (c=2, H₂O). Die relative Wirksamkeit gegen B. subtilis (Agarplatte) beträgt 960tf7mg. (Standard: Kanamycin A in Form der freien Base).

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ftf 25U817

M/16 074 ⁷*

Analyse C₂₂H₄₃N₅O₁₃-ZH₂CO₃ :

berechnet: C 40,62; H 6,68; N 9,87

gefunden : C 40,21; 39,79; H 6,96, 6,87; N 9,37, 9,49

Beispiel 15

Herstellung des Monosulfatsalzes von l-N-/L-( -)- p~-Ami noo<-hydroxybutyryi7kanamycin A

Ein Mol l-N-A-(-)- C^-Amino-oi -hydroxybutyryljkanamy ein A wird in 1 bis 3 Liter Wasser gelöst. Die Lösung wird filtriert, um irgendwelche ungelösten Feststoffe zu entfernen. Zu der gekühlten und gerührten Lösung gibt man 1 Mol Schwefelsäure, gelöst in 500 ml Wasser, zu. Man läßt die Mischung 30 Minuten rühren und gibt anschließend zur Mischung kaltes Äthanol zu, bis ein Niederschlag auftritt. Die Feststoffe werden durch Filtrieren gesammelt und es wird festgestellt, daß es sich um das gewünschte Monosulfatsalz handelt.

Beispiel 16

Herstellung des Oisulfatsalzes von l-tl-fl-C-)-^- hydroxybutyryljkanamycin A (BB-K8 " 2HgSQ

35 g l-N-/l-(-)-f-Amino-oC-hydroxybutyryl/kanamycin A-{in Form des MonQbicarbonat-trihydrats) werden in 125 ml entionisiertero Wasser gelöst« Man stellt einen pH von angenähert 9,0 fest. 0er pH wird mit 50 % Volumen/Volumen Schwefelsäure auf 7 bis 7,5 abgesenkt.

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M/16 074

Man gibt 8 1/2 g Darco G-60 (Aktivkohle) zu und schlämmt die Mischung 0,5 Stunden bei Umgebungstemperatur auf. Der Kohlenstoff wird durch geeignetes Filtrieren entfernt und mit 40 ml Wasser gewaschen. Das Waschwasser wird zum Filtrat zugegeben.

Das vereinigte Filtrat/Waschwasser (siehe oben) wird mit 50 % Volumen/Volumen Schwefelsäure auf pH 2 bis 2,6 gebracht. ! Eine große Menge Kohlenstoffdioxid entweicht. Man läßt die " ! Lösung unter Rühren 20 Minuten unter Laborvakuum, um zusätzliches Kohlendioxid auszutreiben.

Zu der entgasten Lösung werden 8 1/2 g Darco G-60 zugegeben. I Die Mischung wird 0,5 Stunden bei Umgebungstemperatur aufi geschlämmt. Der Kohlenstoff wird durch geeignetes Filtrieren j entfernt und 35 ml entionisiertem Wasser gewaschen. Das Was-I ser wird zum Filtrat zugegeben.

i Das vereinigte FiItrat/WaschflUssigkeit wird mit 50 % Volumen/

Volumen Schwefelsäure auf pH 1 bis 1,3 eingestellt. Diese j Lösung wird unter schnellem Rühren im Verlauf von 10 Minuten j mit 600 bis 800 ml Methanol (3 bis 4 Volumina Methanol) ver- ! setzt. Die Mischung wird 5 Minuten bei pH 1 bis 1,3 gerührt, ! durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 0,148 mm (100 mesh) I durchgegeben, 2 Minuten gerührt und 5 Minuten stehengelassen. ί Die Hauptmenge der überstehenden Flüssigkeit wird dekantiert. j Die verbleibende Aufschlämmung wird auf geeignete Weise

filtriert, mit 200 ml Methanol gewaschen und bei 5O⁰C 24 Stunden im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute an amorphem BB-K8

(Dihydrogensulfat), beträgt 32 bis 34 g; T₀H ²² = +74,75;

^c I ¹D H₂O

Zersetzung bei 220 bis 223⁰C.

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£09849/0857

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Elementaranalyse (auf trockener Basis⁺)

% C 32,7, 33,5, 32,3 33,5

% N 8,78, 8,7, 8,2, 8,8 8,97

% S . 8,75, 8,9, 7,8, 8,85 ■ 8,2

% Asche keine

⁺ Wassergehalt nach Karl Fisher: 2,33, 1,79, 2,87 % (Theorie für Monohydrat beträgt 2,25 % Wasser). Dieses Salz ist hygroskopisch, es verflüssigt sich jedoch nicht. Nach der Lagerung eines aliquoten Anteils in Luft bei Raumtemperatur während 80 Stunden nimmt der Wassergehalt auf 9,55, 9,89 % zu (Theorie für ein Pentahydrat: 10,33 % Wasser).

Beispiel 17

1-N-/"L~(~)~ j/~-Amino-fr4 -hydroxybutyryUkanamycin A (IV) über die Abwesenheit eines Schiff'sehen Basen-Zwischenprodukts

Zu einer gerührten Lösung von 1,36 g (2,2 mMol) 6'-N-Cbz-Kanamycin (II) in 60 ml 50 %-igem wässrigen THF werden tropfenweise 930 mg (2 mMol) des aktiven Esters XX in 10 ml THF im Verlauf von 30 Minuten bei Raumtemperatur zugegeben. Die Mischung wird über Nacht gerührt und dann mit 1,0 g 10 % Palladium-auf-Aktivkohle unter atmosphärischem Druck bei Raumtemperatur hydriert. Der Katalysator wird entfernt und mit Wasser gewaschen. Das Filtrat und die WaschflUssigkeiten werden vereinigt und im Vakuum eingedampft, um das organische Lösungsmittel zu entfernen. Die erhaltene wässrige Lösung wird durch eine Säule mit CG-50 (NH₄ ⁺, 70 ml) durchgegeben, die nacheinander mit

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B09849/0857

Si 25U817

M/16 074

0,4 Liter Wasser, 0,5 Liter 0,1 η NH₄OH, 0,5 Liter 0,3 η NH₄OH, 1 Liter 0,5 η NH₄OH und schließlich mit 0,5 Liter 1 η NH₄OH beschickt wird. Das Eluat wird in 20 ml-Fraktionen gesammelt und auf der Basis des Rf-Werts bei der TLC auf einer Silikagelplatte (S-IlO, Ninhydrin) und dem Scheibentest unter Verwendung von B. subtilis PCI 219 und K. pneumoniae Typ 22 #3038 A 20680 in Fraktionen aufgeteilt. Jede Fraktion wird im Vakuum eingedampft und lyophi1isiert.

Beispiel 18

6'-Carbobenzoxy-1,3,3"-trisalicylal kanamycin A

9,0 g (14,5 mMol) 6'-Carbobenzoxykanamycin A werden in 500 ml absolutem Äthanol bei 24⁰C suspendiert und 58,2 mMol Salicylaldehyd werden zugegeben. Die Mischung wird zum Rückfluß erhitzt. Während dieser Zeit ändert sich die Mischung zu einer klaren, gelben Lösung; beim Rückfluß bildet sich jedoch schnell ein weißer Feststoff. Die Mischung wird 3 Stunden zum Rückfluß erhitzt, anschließend gekühlt und das Produkt wird durch Filtrieren gesammelt und mit einer kleinen Menge absolutem Äthanol gewaschen. Der Schmelzpunkt nach der Umkristallisation aus 4:1:5 Tetrahydrofuran/Methanol/Heptan beträgt nach dem Trocknen 196 bis 198⁰C.

¹ Analyse C₄₇H₅₄N₄O₁₆ :

• berechnet: C 60,62; H 5,86; . N 6,02 ! gefunden : C 58,67; H 5,73; N 5,98

Wasser nach der Karl Fischer-Methode: 2,45

Analyse, um den Wassergehalt korrigiert:
gefunden: C 60,14; H 5,60; N 6,13.

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U 25H817

M/16 074

Beispiel 19

Herstellung von l-N-Zi--( -)- ^-Amino- c<-hydroxybutytryl7kanamycin A über die in situ-Arbei tsweise

Man schlämme in einer geeigneten Vorrichtung 1000 g (1,074 Mol) 6 '-Carbobenzoxy-1,3,3"-tri-salicylal kanamycin A in 11.400 ml THF bei 22 bis 25⁰C auf. Man gebe 600 ml Wasser unter Rühren zu. Die Lösung erfolgt in ungefähr 10 Minuten. Man gebe in Form von Feststoffen 181,5 g (0,716 Mol) 4-Benzyloxycarbonylamino-2-hydroxybuttersäure und 0,12 Mol N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid zur Lösung zu. Der pH bewegt sich im Bereich von 5,5 bis 6,0. Man halte die Temperatur bei 22 bis 25⁰C und gebe 162,3 g (0,787 Mol) Dicyclohexylcarbodiimid, gelöst in 3000 ml trockenem THF zu. Die Aufschlämmung wird dann 24 Stunden bei 22 bis 25⁰C gerührt und anschließend auf 0 bis 5⁰C gekühlt, um den Dicyclohexylharnstoff im Verlauf von 2 Stunden auszukristallisieren.

Der Harnstoff wird durch Filtrieren entfernt und der Kuchen wird mit 800 ml 95/5 THF/Wasser gewaschen. Filtrat und Waschflüssigkeiten werden vereinigt und unter Vakuum in ihrem Volumen verringert und zwar auf ein Volumen von 3000 ml. 4000 ml Methanol werden zugegeben und das Volumen wird wiederum im Vakuum auf 3000 ml verringert.

Zu der so erhaltenen Lösung gibt man 2000 ml absolutes Methanol bei 4O⁰C zu und impft dann mit 6'-Carbobenzoxy-l ,3 ,3"-trisalicylalkanamycin A an und läßt 0,5 bis 1 Stunden abkühlen und kristallisieren. Anschließend gibt man 2000 ml Wasser im Verlauf von einer halben Stunde zu und zwar unter gutem Rühren bei ungefähr 22 bis 25⁰C wahrend 2 Stunden. Die Temperatur wird dann während 1 Stunde auf 0 bis 5⁰C gesenkt.

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Si 25H817

M/16 074

Man entferne die Feststoffe durch Filtrieren und wasche mit 900 ml kaltem 2:1 Methanol/Wasser und anschließend 800 ml Methanol. Die Filtrate und WaschflUssigkeiten sind aufzuheben. Der Kuchen besteht im wesentlichen aus wiedergewonnenem 6¹-Carbobenzoxy-1,3,3"-tri-salicylalkanamycin A.

Die obigen Filtrate werden mit 1000 ml Wasser verdünnt. Hierzu gibt man 2000 ml Methylenchlorid. Bei 25⁰C wird der pH mit 6 η HCl auf 1,8 bis 2,0 abgesenkt. Dieser pH ist 1/2 · Stunden zu halten.

Man trenne die Methylenchloridschicht ab und wasche die wässrige Phase mit weiteren 2000 ml Methylenchlorid. Die vereinigten organischen Phasen werden für eine mögliche Wiedergewinnung des SaIicylaldehyds aufgehoben.

Der pH der wässrigen Phase wird mit konzentriertem Ammoniumhydroxid auf 3,5 bis 4,0 erhöht. Diese Lösung wird bei Raum-

2 2

temperatur bei einem Druck von 3,52 kg/cm (50 lb/in ) mit Wasserstoffgas in Gegenwart von 5 % Pd/C hydriert. Die Bioausbeute an gewünschtem Produkt beträgt in Lösung 30 bis 45 % der Theorie.

Beispiel 20

Herstellung von Verbindung IV unter Verwendung verschiedener Mol-Prozentanteile an N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid, während die anderen Mol-Prozentanteile konstant gehalten werden

j Ersetzt man in der Arbeitsweise gemäß Beispiel 20 die dort verwendeten 0,12 Mol N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid (HONB) durch die nachfolgenden verschiedenen molaren Prozentanteile, so erhält man die nachfolgenden prozentualen Ausbeuten an Verbindung IV:

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M/16 074	Mol % HONB	Sf	% Ausbeute an	251 ^
Experiment Nr.		bindung IV	Ver-
	0	9,33
1	2	20,07
2	10	31,72
3	50	36,-52
4	100	36,01
5

Den obigen Ergebnissen ist zu entnehmen, daß die Reaktion in völliger Abwesenheit von HONB zur Verbindung IV führt. Jedoch kann auch ersehen werden, daß die besten Ausbeuten an Ver bindung IV erhalten werden,wenn der molare Prozentanteil an HONB 10 bis 50 % der molaren Menge an verwendeter 4-Benzyloxycarbonylamino-2-hydroxybuttersäure bei der Acylierungsreaktion ausmacht. Der genaue Mechanismus, nach dem die Acylierung des blockierten Kanamycin A erfolgt, ist nicht bekannt. Jedoch wird beobachtet, daß die Anwesenheit des HONB auf irgendeine Weise zu besseren Ausbeuten als denjenigen führt, die bislang erhalten wurden.

Beispiel 21

Herstellung von l-N-A-(- )- ^-A mi no- pc -hydroxybutyryljkanamycin A (IV)

18,6 g (20,0 mMol) 6'-Carbobenzoxy-1,3,3"-tri-salicylalkanamycin A, das wie in Beispiel 18 beschrieben hergestellt ist, werden in 55 ml Dimethylformamid (DMF) bei 45⁰C gelöst, Zur cbigen Lösung gibt man 7,3 ml Wasser und 102 ml Aceton.

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50 9 849/0857

H/U 07,

Man läßt die Lösung auf ungefähr 25⁰C abkühlen und gibt 50 ml einer Lösung von Aceton und L-(-)-ψ -Benzyloxycarbonylamino-C'ⁱ- -hydroxybuttersäure-N-hydroxy-succinimidester (9,9 mMol auf einmal zu. Die Reaktionsmischung wird bei ungefähr 25⁰C 40 Stunden lang gerührt. Anschließend gibt man 150 ml Wasser und einige Kristalle an 6'-Carbobenzoxy-1,3,3"-trisalicylalkanamycin A zu und rührt die Mischung 1 Stunde bei ungefähr 25°, gefolgt von 3 Stunden bei 0 bis 5⁰C. Der Oberschuß und unumgesetzte SaIicylaldehyd-Schiff'sehe Base kristallisiert und wird auf einem Filter gesammelt. Der Filterkuchen wird mit 60 ml 50 %-igem wässrigen Aceton gewaschen. Der Kuchen wird getrocknet und gewogen, wobei man 9,4 g wiedergewonnene Schiffsche Base mit Schmelzpunkt (roh) 170 bis 185⁰C erhält.

Das obige Filtrat wird mit 40 ml Methylenchlorid behandelt und der pH wird von 6,2 auf 2,0 eingestellt, um weiteres Ausgangsmaterial zu entfernen. Die Schichten werden abgetrennt und die wässrige Schicht wird mit zweimal 40ml Methylenchlorid extrahiert. Der pH der wässrigen Schicht wird auf 3,7 eingestellt und ein kleines Volumen an Aceton und Methylenchlorid wird im Vakuum gereinigt. Die wässrige Lösung wird dann mit 3,0 g 5 % Pd/C Katalysator bei 24⁰C 15 Stunden bei 3,16 kg/cm (45 psi) Wasserstoff hydriert. Die Reaktionsmischung wird durch Diatomeenerde filtriert, um den Katalysator zu entfernen. Das Filtrat wird auf ein Volumen von 100 ml eingestellt. Eine 1 ml-Probe dieser Lösung wird für den Platten- und Scheibentest entfernt. Der Plattentest zeigt 1936 p7ml an Verbindung IV und der Scheibentest ergibt 2325 pVml, was einer 33,4 %-igen Ausbeute an Endprodukt entspricht.

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M/16 074 ^S6 ^25U817

Die verbleibenden 99 ml Lösung werden auf ein Volumen von ungefähr 30 ral konzentriert und durch Säulenchroraatographie, wie zuvor beispielsweise in Beispiel 14 beschrieben, weiter verarbeitet. Die vereinigten Fraktionen, die die Verbindung IV enthalten (500 ml) werden auf ungefähr 20 ml konzentriert, wozu man 45 ml Methanol, gefolgt von tropfenweiser Zugabe von ungefähr 25 ml Isopropanol , zugibt, um das Produkt zu kristallisieren. Das kristalline Material wird auf einem Filter gesammelt, mit 50/50 Methanol/Isopropanol gewaschen und. getrocknet, wobei man 2,31 g BB-K8, Verbindung der Formel IV, erhält. Der Plattentest der Feststoffe ergibt 836p7mg,was eine Reinheit von 83,6 % anzeigt und eine tatsächliche Ausbeute an reiner Verbindung der Formel IV von 33,3 %, bezogen auf 9,9 mMol Ausgangsmaterial.

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Claims

M/16 074

25U817

Patentansprüche

1.' Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel IV

CH₂-NM₂'

dadurch gekennzeichnet, daß man in aufeinanderfolgenden Stufen

A) die Verbindung der Formel II

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25H817

HO

E₂N

mit einem Aldehyd, ausgewählt unter Benzaldehyd, Salicylaldehyd, p-Nitrobenzaldehyd, p-Methoxybenzaldehyd und Pivaldehyd in einem Verhältnis von 1 Mol Verbindung II zu mindestens 3 Mol Aldehyd behandelt, wobei die Verbindung der Formel III

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S3

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25H817

III

entsteht, worin Z einen Rest der Formeln

-N = C

VOCH₃

HO

H -N = C

CH

oder -N = C - Cr CH.

•CH.

darstellt; und

B) Verbindung III in situ mit der Verbindung der Formel XX

O

N-O-C-CH-CH₂-CH₂-NH-C-O-CH₂-C₆H₅ OH

XX

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25U817

M/16 074

in einem Verhältnis von 1 Mol Verbindung III zu mindestens 0,5 Mol Verbindung XX behandelt und anschließend den Rückstand in situ hydriert, wobei die Verbindung der Formel IV erhalten wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

A) die Verbindung der Formel II mit einem Aldehyd, ausgewählt unter Benzaldehyd, p-Nitrobenzaldehyd, Salicylaldehyd, p-Methoxybenzaldehyd und Pivaldehyd in einem Verhältnis von 1 Mol Verbindung II zu mindestens 3 Mol Aldehyd in absolutem Äthanol, Methanol, n-Propanol, Methylenchlorid, Isopropanol , n-Butanol , sek.-Butanol , tert.-Butanol, Tetrahydrofuran, Dioxan, Dimethylformamid oder Aceton oder Mischungen davon oder einer Mischung mit Wasser in einem Temperaturbereich von 5⁰C bis ungefähr Rlickflußtemperatur während eines Zeitraums von ungefähr 30 Minuten bis ungefähr 5 Stunden behandelt, wobei die Verbindung der Formel III entsteht, in der Z einen Rest der Formeln

Ij \

0CH

H oder -N=C - C;

CH.

•ch!

CH'.

darstellt; und

B) Verbindung III mit der Verbindung der Formel XX in einem Verhältnis von 1 Mol Verbindung III zu

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ff 25U817

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mindestens 0,5 Mol Verbindung XX in einem Temperaturbereich von ungefähr -10° bis ungefähr +35⁰C während mindestens einer Stunde in einem Lösungsmittelsystem wie in Stufe A) beschrieben, behandelt, anschließend das organische Lösungsmittel entfernt und den Rückstand in situ mit Wasserstoff in der Gegenwart eines Metallkatalysators, ausgewählt unter Palladium, Platin, Raney-Niekel, Rhodium, Ruthenium und Nickel in Wasser oder in einem System aus Wasser und einem mit Wassermischbaren Lösungsmittel, ausgewählt unter Wasser und Dioxan, Tetrahydrofuran, Äthylenglykoldimethyläther und Propylenglykoldimethyläther bei einem pH von 3 bis hydriert, wobei die Verbindung der Formel IV erhalten wird.

3. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gej kennzeichnet, daß man

A) die Verbindung der Formel II mit einem Aldehyd, aus- ! gewählt unter Benzaldehyd, Saucylaldehyd, p-Nitro benzaldehyd und p-Methoxybenzaldehyd in einem Verhältnis von 1 Mol Verbindung II zu mindestens 3 Mol Aldehyd in absolutem Äthanol, Methanol, n-Propanol , Isopropanol, Methylenchlorid, n-Butanol, sek.-Butanoi« tert.-Butanol, Tetrahydrofuran, Dioxan, Dimethylformamid oder Aceton oder einer Mischung davon oder einer Mischung davon mit Wasser, in einem Temperaturbereich von 5⁰C bis 4O⁰C während eines Zeitraums von ungefähr 30 Minuten bis ungefähr 5 Stunden, behandelt, wobei die Verbindung der Formel III erhalten wird, in der Z für einen Rest der Formeln

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M/16 074

25H817

oder -N=C-/ VOCH

steht; und

B) Verbindung III in situ oder nach Isolierung mit der Verbindung der Formel XX in einem Verhältnis von 1 Mol Verbindung III zu ungefähr 0,5 bis 1,0 Mol Verbindung XX in einem Bereich von +5⁰C bis 35⁰C während einer bis 3 Stunden in einem Lösungsmittelsystem wie in Stufe A) beschrieben behandelt, anschließend das Lösungsmittel entfernt und den Rückstand in situ mit Wasserstoff in Gegenwart eines Metallkatalysators , ausgewählt unter Palladium, Platin, Raney-Niekel , Rhodium, Ruthenium und Nickel, in Wasser oder in einem System aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, ausgewählt unter Wasser und Dioxan, Tetrahydrofuran, Äthylenglykoldimethyläther und Propylenglykoldimethyläther bei einem pH von 3 bis 5 hydriert, wobei die Verbindung der Formel IV entsteht.

Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man

A) die Verbindung der Formel II mit einem Aldehyd, ausgewählt unter Benzaldehyd, SaIi cyl aldehyd und p-Nitrobenzaldehyd in einem Verhältnis von 1 Mol Verbindung II zu ungefähr 3 Mol Aldehyd in absolutem Äthanol, Methanol, n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol , sek.-Butanol , tert.-

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25H817

M/16 074

Butanol , Tetrahydrofuran, Dioxan, Methylenchlorid, Dimethylformamid oder Aceton oder einer Mischung davon oder Mischungen davon mit Wasser in einem Temperaturbereich von 5⁰C bis 40⁰C während eines Zeitraums von ungefähr 30 Minuten bis ungefähr 5 Stunden, behandelt, wobei die Verbindung der Formel III entsteht, in der Z für einen Rest der Formeln

steht; und

B) Verbindung III in situ oder nach Isolierung mit der Verbindung der Formel XX in einem Verhältnis von 1 Mol Verbindung III zu 0,5 bis 0,85 Mol Verbindung XX in einem Temperaturbereich von +5⁰C bis 30⁰C während 1 bis 3 Stunden in einem Lösungsmittelsystem, wie in Stufe A) beschrieben, behandelt, anschließend das Lösungsmittel entfernt und den Rückstand in situ mit Wasserstoff in Gegenwart eines Metallkatalysators, ausgewählt unter Palladium, Platin, Raney-Niekel , Rhodiun Ruthenium und Nickel, in Wasser oder in einem System aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, ausgewählt unter Wasser und Dioxan, Tetrahydrofuran, Äthylenglykoldimethyläther und Propylenglykoldimethyläther bei einem pH von ungefähr 4 hydriert, wobei die Verbindung der Formel IV erhalten wird;

5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man

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25H817

A) die !Verbindung der Formel II mit Benzaldehyd in einem Verhältnis von 1 Mol Verbindung II zu ungefähr 3 Mol Benzaldehyd in ungefähr einer 1:1 Mischung von Wasser und Tetrahydrofuran bei ungefähr 2O⁰C bis ungefähr 30⁰C während ungefähr 2 bis 4 Stunden bei einem pH von ungefähr 10 behandelt, wobei die Verbindung der Formel IHa

entsteht; und

B) Verbindung IHa in situ oder nach Isolierung mit der Verbindung der Formel XX in einem Verhältnis von 1 Mol Verbindung IHa zu 0,6 bis 0,75 Mol Verbindung XX bei einer Temperatur im Bereich von ungefähr 2O⁰C bis ungefähr 3O⁰C während eines Zeitraums von 1 bis 3 Stunden in einem Lösungsmittelsystem, wie in Stufe A) beschrieben, einer Mischung von Methylenchlorid, Methanol und Wasser oder einer Mischung von Dimethylformamid, Aceton und Wasser, behandelt, anschließend das organi-

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sehe Lösungsmittel im Vakuum entfernt, den pH mit Ammoniumhydroxid auf 4 einstellt und den Rückstand in situ mit Wasserstoff bei atmosphärischem Druck in Gegenwart von Palladium-auf-Aktivkohle hydriert, wobei die Verbindung der Formel IV entsteht.

6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man

A) die Verbindung der Formel II mit SaIicylaldehyd in einem Verhältnis von 1 Mol Verbindung II zu ungefähr 3 Mol SaIicylaldehyd, in ungefähr einer 1:1 Mischung von Wasser und Tetrahydrofuran bei ungefähr 2O⁰C bis ungefähr 30⁰C während ungefähr 2 bis 4 Stunden bei einem pH von ungefähr 8 behandelt, wobei eine Verbindung der Formel IHb

HO—^ CH₂-N-C-O-CH₂-C'₆H₅ '

Q-S-n

CH₂OH no H \>J

IZIb

entsteht; und

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B) Verbindung IHb in situ oder nach Isolierung mit der Verbindung der Formel XX in einem Verhältnis von 1 Mol Verbindung IHb zu ungefähr 0,6 bis 0,75 Mol Verbindung XX bei einer Temperatur im Bereich von ungefähr 2O⁰C bis ungefähr 3O⁰C während eines Zeitraums von 1 bis 3 Stunden in einem Lösungsmittelsystem, wie in Stufe A) beschrieben, oder einer Mischung von Dimethylformamid, Aceton und Wasser, behandelt, anschließend das organische Lösungsmittel im Vakuum entfernt, den pH mit Ammoniumhydroxid auf 4 einstellt und den Rückstand in situ mit Wasserstoff bei atmosphärischem Druck in Gegenwart von Pailadium-auf-Aktivkohle hydriert, wobei die Verbindung der Formel IV erhalten wird.

Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe B) eine Verbindung der Formel III in situ oder nach Isolierung mit den Verbindungen der Formeln

0 0

H-O-C-CH-CH₂-CH₂-NH-C-O-CH₂-C₆H₅ OH

VI und

N-OH

XIX

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gefolgt von der Zugabe von Di cyclohexylcarbodiimid in einem Verhältnis von 1 Mol Verbindung III zu ungefähr 0,5 bis 1,0 Mol jeweils an Verbindung VI und Dicyclohexylcarbodiimid und ungefähr 0,005 bis ungefähr 0,25 Mol Verbindung XIX in einem Temperaturbereich von ungefähr -1O⁰C bis ungefähr +35⁰C während mindestens 10 Stunden in einem Lösungsmittelsystem, wie in Stufe A) beschrieben, behandelt, anschließend das organische Lösungsmittel-entfernt und den Rückstand in situ wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 beschrieben hydriert, wobei die Verbindung der Formel IV entsteht.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe B) eine Verbindung der Formel III in situ oder nach Isolierung mit den Verbindungen der Formeln

H-O-C-CH-CH₂-CH₂-NH-C-O-CH₂-C₆H₅

OH

VI

und

- OH

XIX

gefolgt von der Zugabe von Dicyclohexyl carbodi imi d in einem Verhältnis von 1 Mol Verbindung III zu ungefähr 0,5 bis 0,85 Mol jeweils an Verbindung VI und Di cyclohexylcarbo-

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diimid und ungefähr 0,05 bis 0,425 Mol Verbindung XIX in einem Bereich von +5⁰C bis 25⁰C während 1 bis 3 Stunden in einem Lösungsmittelsystem, wie in Stufe A) beschrieben, behände!t.

9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe B) eine Verbindung der Formel III in situ mit den Verbindungen der Formeln

0 0

H-O-C-CH-CH ,,-CH₀-NH-C-O-CH₀-C,H i 2 <- to

OH

VI

und

N-OH

XIX

gefolgt von der Zugabe von Di cyclohexylcarbodiiraid in einem Verhältnis von 1 Mol Verbindung III zu ungefähr 0,5 bis 0,8 Mol jeweils an Verbindung VI und Di cyclohexylcarbodiimid und ungefähr 0,05 bis 0,425 Mol Verbindung XIX in einem Bereich von +15⁰C bis +3O⁰C während 15 bis 25 Stunden behandelt. ·

10. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe B) eine Verbindung der Formel IHa in situ oder nach Isolierung mit den Verbindungen der Formeln

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H-O-C-CH-CH₂-CH₂-NH-C-O-CH₂-C₆H₅ OH

VI

und

¹ ' * · 'N - OH

XIX

unter Rühren, gefolgt von der Zugabe von Dicyclohexylcarbodiimid in einem Verhältnis von 1 Mol Verbindung III zu ungefähr 0,6 bis 0,75 Mol jeweils *n Verbindung VI und Dicyclohexylcarbodiimid und ungefähr 0,06 bis 0,375 ! Mol Verbindung XIX in einem Bereich von +25⁰C bis +35⁰C

während 15 bis 25 Stunden, in einer 1:1 Mischung von Tetrahydrofuran und Wasser, behandelt.

11. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe B) eine Verbindung der Formel IHb in situ oder nach Isolierung mit den Verbindungen der Formeln

0 0

H-O-C-CH-CH₂-CH₂-NH-C-O-CH₂-C₆H₅ OH

VI

und

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N-OH

unter Rühren, gefolgt von der Zugabe von Di cyclohexyl-" carbodiimid in einem Verhältnis von 1 Mol Verbindung IHb zu ungefähr 0,6 bis 0,75 Mol jeweils an Verbindung VI und Dicyclohexylcarbodiimid und ungefähr 0,06 bis 0,375 Mol Verbindung XIX in einem Bereich von +20⁰C bis 3O⁰C während 15 bis 25 Stunden in einer 9:1 Mischung von Tetrahydrofuran und Wasser, behandelt.

12. Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Formel II

CH₂-NH-i-O-CH₂-C_eH,

HO.

U M \

ZZ

dadurch gekennzeichnet, daß man Kanamycin A in Form der freien Base mit N-Benzyloxycarbonyloxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid in einem Verhältnis von ungefähr 0,5 bis un·

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gefahr 1,5 Mol N-Benzyloxycarbonyloxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid pro Mol Kanamycin A behandelt, und anschließend reinigt.

13. Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis von Kanamycin zu N-Benzyloxycarbonyloxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid ungefähr 1:1 beträgt und die Reaktion in einem wässrigen-mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittelsystem in einem Temperaturbereich von ungefähr O⁰C bis 25⁰C während höchstens 6 Stunden durchgeführt wird, gefolgt von Reinigen durch organische Lösungsmittelextraktion und Chromatographie.

14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 und 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis von Kanamycin zu N-Benzyloxycarbonyloxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid 1:1 beträgt und die Reaktion in 50 bis 60 %-igem, wässrigem Tetrahydrofuran in einem Temperaturbereich von ungefähr 5° bis ungefähr 1O⁰C während ungefähr 4 Stunden unter Rühren durchgeführt wird, gefolgt von Entfernen des Tetrahydrofuran im Vakuum, Extraktion des wässrigen Rückstands mit n-Butanol und Reinigung der wässrigen Phase durch Chromatographie.

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