Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia l-(L-)-(-'-amino-a-hydroksybutyrylo)kanamy- cyny A o wzorze 1. Wiadomo, ze kanamycyna A zawiera w cza¬ steczce cztery pierwszorzedowe grupy aminowe w pozycjach 1, 3, 6' i 3". Udowodniono, ze podczas dzialania na te czasteczke czynnikiem elektrofi- lowym najbardziej reaktywna grupa aminowa jest grupa w pozycji 6' a druga najreaktywniejsza grupa aminowa jest grupa w pozycji 1. Obie gru¬ py aminowe w pozycjach 3 i 3' sa mniej reaktyw¬ ne niz grupy w pozycjach 1 lub 6', ale ulegaja reakcji w niewielkim stopniu, dajac pewna ilosc niepozadanych ubocznych produktów acylacji. Znany jest sposób wytwarzania zwiazku o wzo¬ rze 1 na drodze acylowania kanamycyny A przy uzyciu grup blokujacych, stosowanych zwykle do blokowania grup aminowych, np. grupy benzylo- ksykarbonylowej i nastepnego acylowania otrzy¬ manego zwiazku za pomoca srodka acylujacego, stanowiacego pochodna N-hydroksysukcynimidu kwasu a-hydroksy-y-aminomaslowego. Jednak re¬ akcja ta przebiega z niska wydajnoscia rzedu o- kolo 9*Vo ze wzgledu na mala selektywnosc, po¬ wodujaca tworzenie sie niepozadanych pochod¬ nych acylowanych w pozycji 3 i 3". Z lepsza selektywnoscia ale i to zaledwie z 10°/a wydajnoscia przebiega sposób wytwarzania zwiaz¬ ku o wzorze 1, prowadzony przy selektywnym zabezpieczeniu trzech grup aminowych aromatycz- nymi aldehydami, tworzacymi z blokowanymi gru¬ pami aminowymi zasady Schiffa i nastepnym acy- lowaniu otrzymanej zasady Schiffa pochodna N- -hydroksysukcynimidu kwasu a-hydroksy-y-amino- maslowego oraz katalitycznym odszczepieniu grup zabezpieczajacyeh. Stwierdzono, ze zwiazek o wzorze 1 mozna wy¬ tworzyc z o wiele wieksza wydajnoscia rzedu okolo 3610/*, jesli obok grup blokujacych tworza¬ cych z grupami aminowymi zasade Schiffa zasto¬ suje sie nowy, selektywnie dzialajacy srodek acy- lujacy. Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze reakcji poddaje sie zwiazek o wzorze 2, z alde¬ hydem takim jak aldehyd benzoesowy, salicylo¬ wy, p-nitrobenzoesowy, p-metoksybenzoesowy i piwalowy, w proporcji molowej zwiazku o wzorze 2 do aldehydu jak 1 do co najmniej 3, po czym otrzymany zwiazek o wzorze ogólnym 3, w którym Z oznacza jedna z giru(p o wzorach 4, 5, 6, 7 lub 8 poddaje sie ewentualnie in situ dzialaniu zwiaz¬ ku o wzorze 9 w proporcji molowej, odpowiednio, jak 1 do co najmniej 0,5, a korzystnie 1 i otrzy¬ many produkt uwodarnia in situ do zwiazku o wzorze 1. Pierwszy etap przeprowadza sie korzystnie w mieszajacym sie z woda rozpuszczalniku takim jak rozpuszczalnik alkoholowy, na przyklad abso¬ lutny etanol, metanol, n-propanol, izopropanol, n- -butanol, II rzed.-butanol, rozpuszczalnik eterowy. 102 7343 na przyklad tetrahydrofuran, dioksan lub inne polarne, aprotyczne lub protonowe rozpuszczal¬ niki, takie jak dwumetyloformainid i aceton lub ich mieszaniny, lub ich mieszaniny z woda, w temperaturze od okolo 5°C do okolo temperatury wrzenia, w ciagu od okolo 30 minut do okolo 5 godzin. Drugi etap reakcji przeprowadza sie stosujac zwiazek o wzorze 3 i zwiazek o wzorze 9, ko¬ rzystnie w stosunku okolo 1:1, w temperaturze od okolo -^10°C do okolo +35°C, ale korzystnie w zakresie od 5°C do okolo 25°C, w ciagu okresu co najmniej 1—3 godzin, po czym przed uwodor¬ nieniem usuwa sie rozpuszczalnik organiczny. Uwodornienie in situ przeprowadza sie za po¬ moca wodoru w obecnosci katalizatora metalicz¬ nego, takiego jak pallad, platyna, nikiel Raney*a, rod, ruten i nikiel, korzystnie w obecnosci palla¬ du, a zwlaszcza palladu na weglu aktywnym, w wodzie lub w mieszajacym sie z woda ukladzie rozpuszczalników, takim jak woda z dioksanem, czterohydrofuranem, eterem dwumetylowym gli¬ kolu etylenowego, eterem dwumetylowym gliko¬ lu propylowgo i tym podobne, korzystnie w wo¬ dzie, przy wartosci pH 3—6, korzystnie 4. Korzystny sposób wytwarzania zwiazku o wzo¬ rze 1 polega na tym, ze zgodnie z wynalazkiem zwiazek o wzorze 2 poddaje sie reakcji z alde¬ hydem, takim jak aldehyd benzoesowy, salicylo¬ wy, . p-nitrobenzoesowy i p-metoksytoenzoesowy, przy proporcji molowej zwiazku o wzorze 2 do aldehydu jak 1 do co najmniej 3 w absolutnym etanolu, metanolu, n-propanolu, III rzed.-butanolu, chlorku metylenu, czterohydrofuranie, dioksanie, dwumetyloformamidzie lub acetonie albo w mie¬ szaninie tych rozpuszczalników z woda. Reakcje prowadzi sie w temperaturze &—40°C, w ciagu od okolo 30 minut do okolo 5 godzin, uzyskujac zwiazek o wzorze ogólnym 3, w którym Z oznacza grupy o wzorach 4, 5, 6 lub 7. Nastep¬ nie w drugim etapie zwiazek o wzorze ogólnym 3 po uprzednim wydzieleniu lub in situ, poaOaje sie reakcji ze zwiazkiem o wzorze 9, w proporcji molowej zwiazku o wzorze 3 do zwiazku o wzorze 9, jak 1 do 0,5—1 w temperaturze 5—35 °C, w ciagu 1—3 godzin i w rozpuszczalnikach wymie¬ nionych w etapie pierwszym. Nastepnie rozpusz¬ czalnik organiczny usuwa sie i pozostalosc uwo- darnia sie in situ za pomoca wodoru w obecnosci katalizatora metalicznego, takiego jak pallad, pla¬ tyna, nikiel Reney'a, rod, ruten i nikiel, ale ko¬ rzystniej w obecnosci palladu, a zwlaszcza palla¬ du na weglu aktywnym, w wodzie lub ukladzie rozpuszczalników mieszajacych sie z woda, Ko¬ rzystnie takich jak woda z dioksanem, czterohy- ss drofuranem, eterem dwumetylowym glikolu ety¬ lenowego i eterem dwumetylowym glikolu pro- pylenowego, ale przede wszystkim w wodzie, przy wartosci pH 3—5, a zwlaszcza 4. Szczególnie korzystnie wytwarza sie zwiazek o 60 wzorze 1, jesli zgodnie z wynalazkiem zwiazek o wzorze 2 poddaje sia reakcji z aldehydem takim jak aldehyd benzoesowy, salicylowy i p-nitroBen- zoesowy w proporcji molowej zwiazku o wzorze 2 do aldehydu jak 1 do co najmniej3. 65 734 4 Reakcje przeprowadza sie w absolutnym eta¬ nolu, metanolu, n-propanolu, izopropanolu, n-bu- tanolu, II rzed.-butanolu; III rzed.-butanolu, cztero¬ hydrofuranie, chlorku metylenu, dioksanie, dwu- s metyloformamidzie lub acetonie lub w mieszani¬ nie tych rozpuszczalników z woda, w temperatu¬ rze od okolo 5°C do okolo 40°C, w ciagu od okolo minut do okolo 5 godzin, uzyskujac zwiazek o wzorze ogólnym 3, w którym Z oznacza grupe lt o wzorach 4, 5 lub7. ~" W drugim etapie zwiazek o wzorze ogólnym 3 poddaje sie in situ lub po uprzednim wydziele¬ niu go, reakcji ze zwiazkiem o wzorze 9, w pro¬ porcji molowej zwiazku; o wzorze 3 do zwiazku o Wzorze 9, jak i okolo 0,5—0,85 w temperaturze —30°C w ciagu 1—3 godzin. Reakcje przeprowadza sie w ukladach rozpusz¬ czalników przedstawionych w etapie pierwszym. Nastepnie po usunieciu rozpuszczalnika organicz¬ nego pozostalosc uwodarnia sie in situ za pomoca wodoru w obecnosci katalizatora metalicznego, korzystnie takiego jak pallad, platyna, nikiel Ra- ney'a, rod, ruten i nikiel, korzystniej pallad, ale najkorzystniej w obecnosci .palladu na weglu ak¬ tywnym. Uwodarnianie prowadzi sie w wodzie lub ukladach rozpuszczalników mieszajacych sie z woda, takich jak woda z dioksanem, czterohy¬ drofuranem, eterem dwumetylowym glikolu ety- a lowego i eterem dwumetylowym glikolu propy- lenowego, korzystnie w wodzie przy wartosci pH okolo 4, uzyskujac zwiazek o wzorze 1. Najkorzystniejszy sposób wytwarzania zwiazku o wzorze 1 zgodnie z wynalazkiem polega na 36 tym, ze zwiazek o wzorze 2 poddaje sie dzialaniu aldehydu benzoesowego w proporcji molowej zwiazku o wzorze 2 do aldehydu benzoesowego jak 1:3, w mieszaninie 1: 1 wody z tetrahydro- furanem, w temperaturze od okolo 20°C do okolo 4H 30°C przy wartosci pH okolo 10, w ciagu 2—4 godzin, po czym otrzymany zwiazek o wzorze 10 poddaje sie in situ lub po uprzednim wydziele¬ niu, reakcji ze zwiazkiem o wzorze 9, w propor¬ cji molowej zwiazku o wzorze 10 do zwiazku o 45 wzorze 9, jak 1 do 0,6—0,75, w temperaturze od okolo 20ÓC do okolo 30°C w ciagu 1—3 godzin w wyzej wymienionych rozpuszczalnikach takich jak mieszanina chlorku metylenu, metanolu i wo¬ dy lub mieszanina dwumetyloformamidu, acetó- 50 nu i wody. Nastepnie usuwa sie rozpuszczalnik organiczny pod zmniejszonym cisnieniem, dopro¬ wadza pH do wartosci 4 za pomoca wodorotlenku amonu i otrzymany zwiazek uwodornia in situ za pomoca wodoru pod cisnieniem atmosferycznym w obecnosci palladu na weglu. Inny korzystny sposób wytwarzania zwiazku o wzorze 1 zgodnie z wynalazkiem polega na tym, ze zwiazek o wzorze 2 poddaje sie reakcji z al¬ dehydem salicylowym, w proporcji molowej zwiaz¬ ku o wzorze 2 do aldehydu salicylowego jak 1:3, w mieszaninie 1:1 wody z tetrahydrofuranem, w temperaturze od okolo 20°C do okolo 30°C, przy wartosci pH okolo 8 w ciagu od okolo 2—4 godzin, uzyskujac zwiazek o wzorze 11, który in situ lub po uprzednim wydzieleniu poddaje 9ie102 734 reakcji ze zwiazkiem o wzorze 9 w proporcji mo¬ lowej zwiazku o Wzorze 11 do zwiazku o wzorze 9 jak 1 do 0,6—0,75. Reakcje prowadzi sie w temperaturze od okolo °C do okolo 30°C, w ciagu 1—3 godzin, w wy¬ zej podanych rozpuszczalnikach lub w mieszani¬ nie dwumetyloformamidu, acetonu i wody. Na¬ stepnie usuwa sie rozpuszczalnik organiczny pod umniejszonym cisnieniem doprowadza odczyn do wartosci pH, za pomoca wodorotlenku amonu i uwodornia pozostalosc in situ za pomoca wodoru pod cisnieniem atmosferycznym w obecnosci pal¬ ladu na weglu. Uzyte w niniejszym opisie wynalazku okresle¬ nie nizsza grupa alkilowa oznacza grupe alkilowa prosta lub rozgaleziona o 1—6 atomach wegla. Okreslenie ,nizszy alkanol" oznacza nasycony al¬ kohol o prostym lub rozgalezionym lancuchu, za¬ wierajacy 1—6 atomów wegla i jedna grupe hy¬ droksylowa. Reakcje wedlug wynalazku korzystnie prowadzi sie przy stosowaniu zwiazków wytwarzanych in situ, poniewaz takie postepowanie znacznie zmniej¬ sza koszt. Na przyklad zwiazek o wzorze 9 wytwarza sie in situ i poddaje reakcji ze zwiazkiem o wzorze 10 w tym samym etapie reakcji. Zwiazek o wzorze 1 mozna wiec wytworzyc jak to opisano wyzsj lub po wyodrebnieniu i nastepnym poddaniu re¬ akcji ze zwiazkami o wzorze 12 i o wzorze 13 po dodaniu dwucykloheksylokarbodwuimidu, w pro¬ porcji molowej zwiazku o wzorze 10 do zwiazku 0 wzorze 12 i dwucyMoheksylokarbodwuimidu^jak 1 : 0,5—1,0 i okolo 0,005 do 0,25 zwiazku o wzorze 13. Ta reakcja prowadzona jest w temperaturze od okolo —10°C do okolo +35°C, korzystnie, od +5°C do okolo H-25°C, przy czym w ciagu ostat¬ nich 10 godzin reakcje prowadzi sie w rozpusz¬ czalnikach, jak uprzednio opisane, a otrzymany produkt uwodornia wedlug wyzej opisanego spo¬ sobu, lub ewentualnie w ilosci po okolo 0,5 do 0,8 mola zwiazku o wzorze 12 i cykloheksylokar- bodwuimidu na 1 mol zwiazku o wzorze 3 oraz okolo 0,05 do 0,425 mola zwiazku o wzorze 13 w temperaturze 15—30°C, w ciagu 15—25 godzin. Naj¬ korzystniejsze warunki dla tej reakcji to uzycie zwiazku o wzorze 3 w ilosci 1 mola na okolo 0,6—0,75 mola zwiazków o wzorze 12 i dwucyklo- heksylokarbodwuimidu i okolo 0,06—0,375 mola zwiazku o wzorze 13, w temperaturze 10—30°C, w ciagu 15—25 godzin. Zwiazek o .wzorze 1, l-N-(L»-)-(-y-amido-a-hy- drotesybutyrylo)kanamycyna A (BB-K8) wykazuje doskonale dzialanie przeciwbakteryjne, lepsze niz sama kanamycyna A. Przedstawiono to ponizej w dwóch tabelach pokazujacych najmniejsze ste¬ zenia hamujace (MIC) kanamycyny A i zwiaztu o wzorze 1 (BB-K 8) przeciwko róznym Gram-do- datnirn i Gram-ujemnym bakteriom, uzyskanym metoda rozcienczen agarowych, Steersa (tablica I) i metoda kolejnych rozcienczen (tablica II). Przy opracowywaniu tablicy I stosowano pozyw¬ ke Mueller-Histon Agar Medivum, a przy tablicy II Heart InfusionBroth. „ Tablica I (MIC mg/ml) 90 40 45 50 55 60 65 Drobnoustrój 1 Alk. faecalis » » Ent. cloacae „ szczep „ hafniae 1 E. coli 1 *» " ' »» » " ' " ' » » t " ' II 1 II l K. pneumoniae „ szczep » »» » » K. pneumoniae 1 »» »» Pr. mirabilis „ morganii „ vulgaris „ rettgeri „ mirabilis Alk. Faecalis 1 »» »» Ent. cloacae „ szczep 1 „ nafniae E. coli 1 »» t 1 ii i 1 ii i 1 u i 1 " ' 1 ii i 1 ii i 1 ii i 1 ii i 1 ii i K. [pneumoniae „ szczep 1 ii ii 1 ii ii „ pneumoniae 1 ii ii Pr. mirabilis Pr. morganii „ wulgaris „ Retitgeri „ mirabilis ii ii A-9423 A-20648 A-0656 A-20364 A-20674 A-0636 A-20664 A-20665 A-20507 A-20520 A-20365 A-20684 A-20682 A-20683 A-S0681 A-15119 A-0967 A-20328 A-20330 A-20634 A-20680 A-0077 A-9900 A-15153 A-95S5 A-9636 A-20645 A-9423 A-20648 A-06556 A-20364 A-20674 A-0636 A-20664 A-20665 A-20507 A-20525 A-20365 A-20684 A-20682 A-20683 A-20681 A-15T19 A-0967 A-20328 A-20330 A-20634 A-20680 A-0077 A-9900 A-15153 A-9555 A-9636 A-20645 A-20454 Kana¬ mycyna A (6-8198) 2 16 125 4 125 1 2 16 125 32 125 125 2 125 125 125 4 4 125 32 125 125 1 ' -1 2 2 2 ^ 0^5 4 16 125 4 : 125 1 2 16 125 32 125 125 2 125 125 125 4 4 125 32 125 125 1 2 2 2 0,25 4 2 Zwiazek o wzo¬ rze 1 . (BB-K 8) 3 8 125 4 2 1 1 4 1 2 4 1 2 2 8 1 2 4 4 2 32 4 4 1 2 2 1 0,25 4 8 125 4 2 1 1 4 l 2 4 I 2 2 8 2 4 4 2 32 4 4 1 2 2 i 0,25 4 2102 734 d.c. tablicy I c.d. tablicy II 1 Prowidencia struartii A-20615 Provideneia alkalifaciens Ps. aeruginosa ) i 1 » „ szczep 1 »» » „ maltophilie Sal. enteritidis „ derby Ser. marcescens 1 ' » 1 »» » » Shig. flexneri Aeromonas sp. Arizona sp. j Citrobacter sp. Edwardsiella sp. Staph. aureus » 1 .» » 1 »» '» »» » » Pozywka Muelle- ra-Hinitona+4*/o krwi owczej Str. faecalis 1 a „ pyogenes i y n i j * a a Str, „ D. pneumoniae D. pneuimoniae A-20676 A-20229 A-0943A A-20653 A-20601 A-20621 A-20620 A-0531 A-20087 A-20019 A-9933 A-20460 A-20459 A-9684 A-20670 A-20671 A-20673 A-20678 A-9606 A-4749 A-9537 A-20610 A-20240 A-15197 A-9854 A-9575 A-20200 A-20139 A-9604 A-15040 A-20065 A-9585 A-120159 2 2 1 32 125 125 125,63 125 32 1 125 2 4 125 4 4 2 2 4 4 1 0,5 2 125 125 1 63 125 32,16 125 125 125 125 63,32 125 3 1 1 2 16 32 16 125 125 ' 0,5 1 4 8 4,2 16 4 2 ' 1 4 4 1 ' 1 1 2 8 2 63 125 32 125 125 125 125 ¦ 63 125 Tablica II (MIC mg/ml) Drobnoustró - D. pneumoniae ± surowicy Str. pyrogenes ± 5°/o surowicy Staph. aureus Smith Staph. aureus Staph. aureus i ii ii Enter. cloacae Enter. szczep K. pneumoniae i ' A-0585 A-9604 A-9537 A-9497 A-20239 A-20240 A-0656 A-20364 A-9867 E/coli K-12 ML. 1410 A-20361 „ „ „ ML 1630 A-20363 | E. coli K-12 A-9632 Kana- mycy- na A (6-8198) 63 125 0,5 0,5 125 125 2 125 2 2 125 1 2 Zwiazek o wzo¬ rze 1 (BB-K8) 63 125 0,5 0,5 4 4 2 2 4 4 2 .. 1 40 45 50 55 60 65 E. coli ii ii Pr. mirabilis Pr. morganii Pr. vulgaris Ps. aeruginosa Ps. szczep Ps. aeruginosa Ps. szczep Ser. marcescens Ser. marcescens A-20664 A-20665 A-9900 A-15153 A-9436 A-20227 A-20499 A-20653 A-20621 A-20019 A-20141 32 125' 2 4 1 4 63 125 125 2 16 8 ' 1 8 * 16 ¦ 16 2 1 4 4 125 4 16 Podane powyzej wielkosci najmniejszych ste¬ zen hamujacych wskazuja, ze zwiazek o wzorze 1 (BB-K8) wyikazuje lepsza aktywnosc niz kana¬ mycyna A, szczególnie przeciwko drobnoustrojom opornym na kanamycyne. Wielkosci najmniejszych stezen hamujacych (MIC) wykazuja równiez dobra korelacje z uzy¬ skanymi in vivo wynikami dla wszystkich trzech drobnoustrojów, dla których przeprowadzono ba¬ dania z kanamycyna A i zwiazkiem o wzorze 1. Zwiazek o wzorze 1 i kanamycyna A byly je¬ dnakowo skuteczne przeciwko zakazeniom u my¬ szy czulymi na dzialanie kanamycyny A szczepa¬ mi E. coli A-15119 i Staph. aureus A-9537. Acz¬ kolwiek wielkosc CD50 (dawka lecznicza dla 50% smiertelnie zakazonych myszy) dla Staph, atreus A-9537 wskazuje, ze zwiazek o wzorze 1 jest troche mniej aktywny niz kanamycyna A, to ta niewielka róznica jest prawdopodobnie nieistotna ze wzgledu na to, ze wielkosci dawek znacznie sie róznia/ (pieciokrotnie rozcienczone). Jak spodziewano sie, kanamycyna A nie wy¬ kazuje skutecznosci in vivo przeciwko szczepom D. coli A-20520, opornemu na kanamycyne, pod¬ czas gdy zwiazek o wzorze 1 wykazuje zaznacza¬ jace sie dzialanie ochronne. Zwiazek o wzorze 1 wykazuje okolo dziesieciokrotnie wyzsza aktyw¬ nosc przeciwko temu szczepowi E. coli przy po¬ dawaniu go w czterech porcjach niz we dwóch. Zwiazek o wzorze 1 ma znaczenie jako srodek przeciwbakteryjny, jako odzywczy dodatek do pasz zwierzecych, jako srodek .terapeutyczny w lecze¬ niu drobiu i zwierzat, w tym i ludzi i jest szcze¬ gólnie cenny w zwalczaniu chorób infekcyjnych wywolanych przez bakterie Gram-dodatnie i Gram- -ujemne Przy podawaniu doustnym, zwiazek o wzorze 1 jest uzyteczny jako dodatkowy srodek w przed- operacyjnej sterylizacji wnetrznosci. Zarówno tle¬ nowa jak i beztlenowa flora bakteryjna wykazuje wrazliwosc na ten lek i rozwój jej zostaje za¬ hamowany w znacznym stopniu. Zwiazek ten wraz z nalezytym, mechanicznym myciem, jest uzyteczny w chirurgii okreznicy. Zwiazek o wzorze 1 jest skuteczny w leczeniu bakteryjnym zakazen ukladowych u ludzi przy podawaniu pozajelitowym w dawkach od okolo 250 mg do okolo 3000 mg dziennie, przy podawa¬ niu trzy lub cztery razy w Ciagu dnia. Ogólnie,102 734 9 10 Tablica III Zestawienie aktywnosci in vitrp i in vivo zwiazku-, o wzorze 1 i kanamycyny A Zwiazek Zwiazek o wzorzej 1 Kanamycyna A Numer testu 1 2 l 2 Staphylococcus , sureus A-9537 a) MIC 1 c 2 b) CD50 2,0x2 0,5x2 # Escherichia coli A-15119 1 a) MIC 2 4 | b) CD50 2x2 4x2 Escherichia coli A-20520 a) MIC 2 125 b) CD50 66x2 5x4 200x2 200x4 | Objasnienia: a)" MIC — najmniejsze stezenie hamujace (^g/ml). Test przeprowadzono w sposób opisany przez Chis- holma i wspólpracowników (Antimicrob. Agenta and Chemotherapy — 1969, str. 244, 1970) stosujac jako pozywke testowa agar Muellera-Histena. b) CD50 — dawka lecznicza, (mg/kg wagi ciala) i krotnosc podania. W przypadku podawania dwukrot¬ nego myszom podawano preparat podskórnie po 1 godzinie i po 4.godzinach po zakazeniu, na¬ tomiast w przypadku podawania czterokrotnego podawano preparat natychmiast po zakaze¬ niu i po uplywie 2, 4 i 6 godzin. Oprócz tego test byl przeprowadzany w sposób opisany przez Price i wspólpracowników (J. of Antibioties 22:1, 1969). c) — nie badano. zwiazek jest skuteczny przy podawaniu w ilosci okolo 5,0—7,5 mg/kg wagi ciala w ciagu 12 go¬ dzin. Przyklad I. Wytwarzanie bezwodnika kwa¬ su 5-norbornenoendodwukarboksylowego-2,3, sta¬ nowiacego produkt wyjsciowy o wzorze 13 dla wytworzenia zwiazku o wzorze 9. Reakcje przeprowadza sie metoda ojpisana przez O. Dielsa i K. Adlera w Ann, 460, 98, (1928). "bo mieszanej zawiesiny .98,1 g (1 mol) bezwodnika maleinowego 'w 500 ml suchego benzenu wkrapla sie przy chlodzeniu 66,1 g (1 mol) cyklopentadienu. Mieszanine reakcyjna miesza sie do wydzielenia krystalicznego osadu. OsacJ ten odsacza, sie i re- krystalizuje z mieszaniny ligtoiny (w szczególnos¬ ci z n-heksanu) i benzenu, w stosunku 1 :1, uzy¬ skujac 116 g (71*/*) produktu tytulowego o tem¬ peraturze topnienia 164—166°C (temperatura top¬ nienia podana w literaturze wynosi 164—165°C)., Przyklad II. Wytwarzanie N-hydtoksyimi- du kwasu 5-norbornenoendodwukarboksylowego- -2,3 (wzór 13). Reakcje przeprowadza sie wedlug metody opi¬ sanej przez L. Bauera i S. V. Miarka, J. Org. Chem. 24, 1293 (1959). 115 g (0,7 mola) bezwodni¬ ka norbornenowego otrzymanego jak w przykla¬ dzie I dodaje sie do. roztworu hydroksyalominy uzyskanego z 47,5 g (0,45 mola) weglanu sodu do¬ danego do roztworu 60,5 g (0,87 mola) chlorowo¬ dorku hydroksyloaminy w 140 ml wody. Miesza¬ nine ogrzewa sie w temperaturze 60—70°C w cia¬ gu 1 godziny i pozostawia w ciagu nocy w chlod¬ ni. Wydzielone krysztaly odsacza, sie, przemywa 120 ml zimnego 5n kwasu solnego i suszy uzy¬ skujac 84,9 g (70*/*) zwiazku o wzorze 13 o tempe¬ raturze topnienia 172°C. Lugi pokrystaliczne za¬ kwasza sie do pH 2 i ekstrahuje 10 razy po 70 ml chloroformu. Po odparowaniu ekstraktów chloro¬ formowych uzyskuje sie druga porcje (7,2 e^/o) zwiazku o wzorze 13 o temperaturze topnienia 170—172°C. Przyklad III. Wytwarzanie estru N-hydro^ 36 40 45 5b 55 65 ksy - 5 - norboneno. - 2,3 - dwukarbokByimidowego kwasu L-y-benzylóksykarbouyloamino-a-hydroksy- maslowego (wzór 9). Do roztworu 2,53 g (0,01 mola) kwasu L-y-ben- zyloksykarbonyloamino - a - hydroksymaslowego i 1,79 g (0,01 mola) zwiazku o wzorze 13 w 50 ml czterohydrofuranu dodaje sie przy mieszaniu w tetmiperaturze 10°C 2,06 g {0,01 mola) dwucyklo- heksyiokarbodwuimidu. Mieszanine reakcyjna mie¬ sza sie w ciagu nocy w temperaturze pokojowej. Wydzielony w postaci osadu dwucykloheksylo- mocznik odsacza sie i przemywa czterowodorofu- ranem. Przesacz i roztiwór z przemycia laczy sie i odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem. Olei¬ sta pozostalosc (4,5 g) przepuszcza sie przez ko¬ lumne wypelniona zelem krzemionkowym, stosu¬ jac jako eluent octan etylu. Uzyskuje sie 4,0 g (96P/o) aktywnego estru o wzorze 9 w postaci bez¬ barwnego oleju. Widmo w podczerwieni (film): 3300, 1820, 1780, 1735, 1720 i 1695 c-*. \ Widmo magnetyczne rezonansu protonowego (CDCL3+1 kropla DaO): 6 w ppm = 1,63 (211, q J = 9 Hz), 2,15 (2H, m) 3,40 (6H, m), 4,60 (1H, d-d, J = 7 i 5 Hz), 513 <2H, s), 620 (2H, szeroki), 7,40 (5H, s) ppm. ' Przyklad IV. Wytwarzanie N-benzyloksy- karbonyloksy - 5 - norborneno - 2,3 - dwukarbo- ksyiimidu. Do mieszanego roztworu 2,64 g (0,066 mola) wo¬ dorotlenku sodu w 50 ml wody dodaje sie 3,58 g (0,02 mola) N-hydroksy-5-nortoorneno-2,3-dwukar*» boksyimidu) Do tego roztworu wkrapla sie w ciagu 40 minut w temperaturze 0—5°C 6,83 g (0,04 mola) chlorku benzyloksykarbonylu i mieszanine reakcyjna mie¬ sza sie w ciagu 4 godzin w temperaturze poko¬ jowej. Do mieszaniny reakcyjnej dodaje sie 20 ml n-heksanu uzyskujac bialy osad* który odsacza sie i suszy na powietrzu. Surowy produkt krysta¬ lizuje sie w mieszaninie benzenu i heksanu, uzy¬ skujac 5,1 g-i&l*h) bezbarwnych pryzm N-benzylo-11 ksykarbonyloksy - 5 - norborneno - 2,3 - dwukar- boksyiniidu o temperaturze topnienia 121—i22°C. Widmo w podczerwieni (KBr): 1810, 1780, 1740, 1630 amr1. Widmo magnetycznego rezonansu protonowego (aceton-d6): = 1,66 (2H, szeroki s), 3,45 (4H, m), ,37 (2H, s), 6,12 (2H, t, J = 1,5 Hz), 7,48 (5H, s) ppim. Analiza elementarna: obliczono dla C17H15N05: C = 65,17#/«, H = 4,84f/o, N = 4,47»/o oznaczono: C = 65,50*/*, H = 4,73V«, N = 4,44%. Przyklad V. Wytwarzanie 6/-N-benzyloksy- karfbonylokatnamycyny A (wzór 2) (6'-Obz-fcana- mycyna A). Do mieszanego roztworu 4,84 kg (0,01 mola) wodnej zasady kanamycyny A w 50 ml 50"/* wod¬ nego roztworu czterohydrofuranu dodaje sie 3,14 g (0,01 mola) N-benzyloksykarbonyloksy-5-norbor- neno-2,3-dwukarboksyimidu w kilku porcjach w ciagu godziny w temperaturze t°C. Mieszanine reakcyjna miesza sie w ciagu nastepnych 4 go¬ dzin i odparowuje rozpuszczalnik pod zmniejszo¬ nym cisnieniem. Uzyskany wodny roztwór roz¬ ciencza sie 150 ml wody 1 ekstrahuje dwiema porcjami po 100 ml butanolu nasyconego woda. Warstwe bgianolowa przemywa sie 100 ml wody i odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem uzysku¬ jac 1,78 g poli-Cbz-kanamycyny A. Faze wodna i roztwór z przemycia laczy sie i zateza pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci okolo 50 ml. Wodny roztwór iprzepuszcza sie przez kolumne wypelniona zywica jonowymienna CC-50 (NH4+, 140 ml) przemyta kolejno 200 ml wody, 1,9 1, 0,n NH4OH, 1,9 1 0,1 n NH4OH, 1,0 1 0,3 n NH4OH. Bluaty zbiera sie w porcjach po 20 ml i na |pod- stawie cjjromatografii cienkowarstwowej biorac pod uwage wielkosci RF dzieli sie je na dwie frakcje (6/-C5bz4canamycyna A — Rr = 0,23, ka- namycyna A—Rr —0,07). Kazda z frakcji opra¬ cowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem i pozo¬ stalosc suszy sie pod zmniejszonym cisnieniem nad pieciotlenkiem fosforu. Tablica IV Fra^ | keja 1 2 Nr pro¬ bówki 106—144 203—212 Eluacja za pomoca 0,lnNH4OH 0,3 n NH4OH Ilosc 3,44g (56%) 0,54gi (11%) Identyr fikacja 6f-Cbzw -kanamy- -cyna (II) odzyskana kanattny- cyna | *Uzyskana w taki sposób 6'-Cbz-kanamycyna (wzór 2) jest bardzo czysta i wykazuje jednorod¬ nosc w analizie metoda chromatografii cienko¬ warstwowej na plytkach pokrytych zelem krze¬ mionkowym. Temperatura topnienia produktu wy¬ nosi 217^219°C. Wlasnosci fizykochemiczne sa zgodne z próbka wzorcowa. P r z y k lad VI. Wytwarzanie l-N-(L-)-(-y- -amino-a-hydrofcsybutyrylo-)-kanamycyna A (BB- -K8, wzór 1) poprzez zasade Schiffa z benzalde¬ hydem. )2 734 12 Bo roztworu 6,19 (0,01 mola) 6'-Cbz-kanamycy- ny (wzór 2) w 50 ml czterohydrofuranu dodaje sie przy mieszaniu 3 ml (0,03 mola) aldehydu benzoesowego. Mieszanine reakcyjna miesza siew ciagu 3 godzin w temperaturze pokojowej, ochla¬ dza do temperatury 5°C i (poddaje reakcji z roz¬ tworem 4 g zwiazku o wzorze 9 (0,01 mola) w 50 ml czterowodorofuranu. Mieszanine reakcyjna miesza sie w ciagu 1 godziny w temperaturze 5°C, doprowadza pH do 2 za pomoca 6n kwasu solne¬ go, miesza w ciagu nastepnej godziny w tempe¬ raturze pokojowej i odparowuje pod zmniejszo¬ nym cisnieniem w celu usuniecia rozpuszczalnika organicznego. Uzyskany roztwór wodny przemy- wa sie 20 ml chlorku metylenu, doprowadza dg pH 4 za pomoca 10Vo NH4OH i uwodarnia w cia- igu nocy z dodatkiem palladu na weglu, pod ois- hieniem atmosferycznym w temperaturze pokojo¬ wej. Katalizator odsacza sie i przemywa 20 ml wody. Przesacz i roztwór z przemycia laczy sie, doprowadza do pH 8 za pomoca 10Vo NH4OH i przepuszcza przez kolumne wypelniona zywica CG-50 (NH^, 200 ml) która przemywa sie ko¬ lejno 0,4 1 wody, 1,2 1 0,1 n NH4OH, 2,06 1 0,3 n NH4OH, 0,92 i 0,5 n NH4OH i w koncu 1,2 1 1,0 n NH4OH. Eluaty zbiera sie w porcjach po 20 ml i dzieli sie te frakcje ,na podstawie wielkosci RF oznaczonych metoda chromatografii cienkowar¬ stwowej na plytkach pokrytych zelem krzemibn- kowym (8—110, ninhydryna) i na podstawie me¬ tody plytkowej przy uzyciu B. subtilis PCI 219 i P. aerugenosa A 9843. Kazda z frakcji odparo¬ wana pod zmniejszonym cisnieniem i liofilizowano. Wydajnosc i oznaczenie kazdej frakcji podano. w tablicy V. Frakcje 4 (1,877 g) rozpuszcza sie w 10 ml od- jonizowanej wody. Roztwór doprowadza sie do pH 6 za pomoca 10*/o kwasu solnego i adsorbuje na zywicy CG-50 (NH4+, 15 ml), która nastepnie «o eluuje sie za pomoca 100 ml 0,3 n NH4OH i 200 ml 0,5 n NH4OH. Eluaty zbiera sie w porcjach po 20 ml Probówki 6 i 8^17 daja dodatni wynik w próbie z ninhydryna. Probówki 8—17 laczy sie i zateza pod zmniejszonym cisnieniem do okolo 1 ml. Ste- 45 zony roztwór poddaje sie dzialaniu 3 ml metanolu i saczy. Saczek przemywa sie 0,5 ml 75Vo wodne¬ go roztworu metanolu. Przesacz i roztwór z prze¬ mycia; laczy sie, rozciencza dodatkowo 10 ml me¬ tanolu i pozostawia w ciagu nocy w temperaturze 50 pokojowej. Powstaly bezpostaciowy osad przesacza sie i przesacz zaszczepia sie uzyskujac bezbarwne krysztaly zwiazku o •wzorze 1, identycznego z próbka wzorcowa. Przesacz odparowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem i liofilizuje. 55 Wydajnosc i oznaczenia kazdej frakcji podano w tablicy VI. BB-K11 oznacza 3"-N-(L-)-(-v-amino-a-hydro- ksybutyrylo)kanamycyne A. BB-K 29 oznacza 3-N-(Lr-)-(-y-amino-a-hydro- 60 ksybutyrylo)kanamycyne| A. Przyklad VII. Wytwarzanie l-N(L-)-(-y- -amino-a-hydroksybutyrylo)kanamycyny A (wzór 1). ,0 g (4,91 milimola) 6/-karbobenzyloksy-ll3,3'*- $5 -trój-p-tfiitrobenzalokanamycyny A rozpuszcza sie102 734 13 14 Tablica V Frakcja 1 2 3 4 1 6 Próbka nr 90— 99 152—161 162—169 170^197 198—203 238—257 Roztwór wodny NH4OH eluujacy 0,3 N 0,3 N 0,3 N 0,3 N—0,5 N 0,9 N 1,0 N Wydajnosc wagowa 1603 mg (33^/t) 483 mg (8«/o) 376 mg (6°/o) 1877 mg (30*/©) 100 mg (2*/») 146 m£ (2%) Wydajnosc biologiczna 1490 mg (3 © 196 mg (S9/*)?" 1350 mg (23#/t)M« © © odzyskana 1 kanamycyna BB-K 29 BB-K 29+ BB-K 8 BB-K 8+ BB-K U BB-K 11 pochodna dwuacylowa Objasnienia: M! — oznaczono wobec szczepu B. subtilis PCI 219 M2 — oznaczono wobec szczepu K. pneumoniae A 20680, kitóry jest wrazliwy na zwiazek BB-K 8 i wy¬ soce oporny na kanamycyne, BB-K 11 i BB-K 29. © — oznacza, ze dana frakcja nie zawierala zwiazku o wzorze 1. Tablica VI Zwiazek 0 wzorze 1 Bezpostaciowy proszek Krysztaly Liofilizowany proszek Ilosc 70 mg 1098 mg 180 mg Oznaczenie Wydajnosc 1 B. subtilis 737 u/mg 1163 u/mg 608 u/mg! K. pneumoniae 927 u/mg 1087 u/mg 504 u/mg B. subtilis 0,9% l,9Vt lii K. . 1 pneumoniae w 50 ml dwumetyloformamidu w temperaturze 24°C. 2,064 g (5,895 milimoli) estru N-hydroksysuff- cynimidowego kwasu L-(-)-y-benzyloksykarbonylo- amiino-«-hydromaslawego rozpuszcza sie w 20 ml dwumetyloformamidu w temperaturze 24°C i roz¬ twór ten dodaje sie przy intensywnym mieszaniu do roztworu zasady Schiffa w" ciagu 75 minut. Roztwór miesza sie w ciagu nocy. Stosujac zmniej¬ szone cisnienie uzyskane za pomoca parowej pom¬ py ssacej z roztworu usuwa sie rozpuszczalnik w temperaturze okolo 40^. Zadaijac pozostalosc 100 ml metanolu i ponownie go usuwajac uzyskuje sie lepki olej. Olej ten rozpuszcza sie w 1O0 ml me¬ tanolu i ponownie go usuwajac uzyskuje sie lepki olej. Olej ten rozpuszcza sie w 100 ml mieszaniny dioksanu i wody w stosunku 1:1 i dodaje sie 10 ml lodowatego kwasu octowego. Roztwór umiesz¬ cza sie w reaktorze Parra o pojemnosci 500 ml i uwodornia sie pod olsnieniem 34-5 atmosfery z do¬ datkiem 2,5 g 5°/t palladu na weglu (Engelhard) w temperaturze 24°C. Calkowity spadek cisnienia w ciagu czterogodzinnego uwodorniania wynosi 6,04 atmosfery (zamkniety reaktor) w tym liczac okre¬ sowe uzupelnienie cisnienia. Mieszanine saczy sie przez warstwe ziemi okrzemkowej. Warstwe ziemi okrzemkowej przemywa sie nastepnie 3X50 ml 50*/# roztworem wodnym dioksanu. Polaczone przesacze suszy sie i poddaje destylacji azeotro- powej ze 100 ml n-butanolu i w koncu suszy sie x metanolem uzyskujac lepki olej. Olej ten roz¬ puszcza sie w 30 ml metanolu i powoli wlewa przy intensywnym mieszaniu do 1000 ml ochlo¬ dzonego do temperatury 5—10°C eteru dwuetylo- wego. Po mieszaniu na lazni lodowej w ciagu 1/2 godziny wydzielony osad odsacza sie i suszy nad P205 w eksykatorze prózniowym. Uzysku¬ je sie mieszanine produktów w ilosci 4,9620 g, w której stwierdzono na podstawie chromatografii cienkowarstwowej, ze glównym produktem jest 85 zwiazek o wzorze 1, kanamycyna A i pewne ilos¬ ci sladowe dwu- i trójpodstawionej kanamycy¬ ny A, w tym kwas 4-amino-2-hydroksymaslowy. Stosujac szklana kolumne o wymiarach 40 X X100 mm wyipelniona Amberlitem IRC-50 (w po- 40 staci NH5+, tyipu I, 100 (200 mesh) o wysokosci zloza 980 mm uzyskuje sie rozdzial tych róznych frakcji. Przez kolumne przepuszcza sie 4,600 g su¬ rowej mieszaniny rozpuszczonej w 1 ml wody. Kolumne eluuje sie wodnym roztworem amoniaku 45 w gradiencie stezenia amoniaku od 0 do 2 n roz¬ tworu NH4OH. Eluaty zbiera sie w porcjach po 15 ml. Po zebraniu 295 frakcji kolumne przemywa sie 1,5 1 3 m NH4OH. Poszczególne frakcje laczy sie na podstawie pomiaru starecalnosci optycznej i 50 poddaje sie liofilizacji, uzyskujac stale produkty. W tym doswiadczeniu stosunek BB-K 8 (kana¬ mycyna A wynosi 0,45. Uzyskany w wyniku tego doswiadczenia produkt jest identyczny z produk¬ tem uzyskanym zgodnie z metoda opisana w opl- 55 sie zgloszenia patentowego w Stanach Zjednoczo¬ nych Ameryki nr 22137$ o temperaturze topnie¬ nia 194°C z rozkladem i (a^D+BS^c = 2 w wo¬ dzie. Aktywnosc rzeczywista przeciwko B. subti¬ lis (plytka agarowa) = 960 mcg/mg standard: wol¬ go na zasada kanamycyny A. Analiza elementarna: obliczono dla CnH^gOi* 2H2C03: C = 40,©2V«, H = 6,68*/t, N = 9,87Vt. oznaczono: C = 40,21°/t, 39,79*/t, H = 6,96%, 6,87Vo, 63 N = 9,37%, 9,49i/o.i 102 734 Tablica VII 16 Nr frakcji 1120^150 201^224 2218—241 Preparat kana* A BB-K 29 BB-K 8 Waga gramy 1,1654 0,40 0,6523 Skorygowana waga w stosunku do cal¬ kowitej wagi suro¬ wego produktu igramy 1,257 0,43 0,7036 Oznaczenia biologiczne 809 786 ±101 * Wydajnosc % ; | 42,6 19,2 ** | * — srednia z 4 plytek, ± odczylenia standardu ** — o ile mozna oprzec sie na ilosci odzyskanej kanamycyny A, wydajnosc BB-K 8 (wzór 1) wynosi 33,5%. Przyklad VIII. Wytwarzanie soli jednosiar- czanowej I-N^(L-M-y-amino-a-hydroksybutyrylo)- -kanamycyny A. 1 mol l-N-(L-)-(-y-amino-a-'hydroksybutyrylo) kanamycyny A rozpuszcza sie 1—3 litrów wody. *° Roztwór przesacza sie w celu usuniecia nieroz¬ puszczalnych substancji stalych. Do tego roztworu dodaje sie przy chlodzeniu i mieszaniu roztwór 1 mola kwasu siarkowego w 500 ml wody. Miesza¬ nie reakcyjna miesza sie w ciajgu 30 mintit, a nastepnie dodaje sie ochlodzony etanol w celu wydzielania osadu. Osad odsacza sie uzyskujac pozadana sól jednosiarczanowa. Przyklad IX. Wytwarzanie soli dwusiar- czanowej I-N-(L-)-(-y-amino-a-hydroksybutyrylo) kanamycyny A (BE-K8, 2H^S04), 35 g I-N-(L-)- -(-y-amino^a-hydroksybutyrylo)-kanamypyny A) w postaci jednowodoroweglanu trójhydratu) rozpusz¬ cza sie "w 125 ml odjonozowanej wody. Wartosc pH roztworu wynosi Okolo 9. Za pomoca 50°/o objetosc (objetosc kwasu siarkowego obniza sie pH roztworu do 7—7,5). Do mieszaniny dodaje sie 8,5 g aktywnego we¬ gla Darco G-60 i mieszanine miesza sie w tempe- 40 raturze pokojowej w ciagu pól godziny. Wegiel usuwa sie na drodze odsaczenia i przemywa 40 ml wody. Wode pochodzaca z przemycia dodaje sie do przesaczu. Za pomoca 50% objetosc/objetosc kwasu siarko- « wego doprowadza sie pH powyzszego roztworu do wartosci 2—2,6. W tym1 czasie wydziela sie duza ilosc dwutlenku wegla. Roztwór umieszcza sie w komorze prózniowej i miesza w ciagu 20 minut w celu usuniecia pozostalej ilosci dwutlenku we- 50 gla. 8,5 g wegla Darco G-60 dodaje sie do odgazo- wanego roztworu i mieszanine reakcyjna miesza sie w ciagu pól godziny w temperaturze pokojo¬ wej. Wegiel odsacza sie, przemywa 35 ml odjoni- 55 zowanej wody, która dolacza sie nastepnie do przesaczu. W polaczonych roztworach doprowadza sie za pomoca 50% objetosc/objetosc kwasu siar¬ kowego pH do wartosci 1—il,3. Roztwór ten do¬ daje sie przy intensywnym mieszaniu w cftagu 60 minut do 600—800 ml metanolu (3—4 objetosci metanolu). Mieszanine te miesza sie w ciagu 5 ' minut w pH 1—1,2, przepuszcza sie przez sito o rozmiarze 100 mesh i pozostawia w ciagu 5 mi¬ nut do wytracenia osadu, Wiekszosc roztworu 69 znad osadu dekantuje sie, a pozostala zawiesine odsacza sie, przemywa 200 ml metanolu i suszy pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 5(PC w ciagu 24 godzin uzyskujac 32—34 g bezposta¬ ciowego zwiazku BB-K 8 (dwuwodorosiarczan)2 o temperaturze rozkladu 220—223°C i ( )22D H2D = = +74,75. Analiza elementarna (w przeliczeniu na sucha zasade) *: % C % N % S % Asch 32,7 8,78 8,75 zero 33,5 8,7 8,9 32,3 8,2 7,8 33,5 8,8 8,97 8,85 8,2 * — oznaczenie wody metoda Karla Fischera: 2,33, 1,79, 2,87% (zawartosc wody dla monohydratu wynosi teoretycznie 2,25%). Uzyskana sól jest higroskopijna, jednak nie wy¬ kazuje zjawiska rozplywania sie. Po pozostawie¬ niu tego osadu na powietrzu w temperaturze po¬ kojowej w ciagu 18 godzin zawartosc wody wzra¬ sta do 9,55, 9,89% (teoretycznie zawartosc wody dla ipieciohydratu wynosi 10,33%). Przyklad X. Wytwarzanie 6/Tkarbobenzo- ksy-l,3,3"-trójsalicylalokanamycyny A, Do zawiesiny 9,0 g (14y5 milimola) 6'-karbojben- zoksykanamycyny A w 500 ml absolutnego etano¬ lu dodaje sie w temperaturze 24°C 58,2 milimola aldehydu salicylowego. Mieszanine ogrzewa sie w temperaturze wrzenia i w ciagu tego czasu mie¬ szanina przeksztalca sie w klarowny, zólty roz¬ twór, z którego w ciajgu ogrzewania wytraca sie szybko bialy osad. Mieszanine ogrzewa sie .we wrzeniu w ciagu 3 godzin, ochladza i odsacza wy¬ dzielony produkt. Produkt przemywa sie niewiel¬ ka iloscia absolutnego etanolu, uzyskujac po re¬ krystalizacji z mieszaniny czterohydrofuranu, me¬ tanolu i heptanu w stosunku 4:1:5 i po wysu-, szenjiu produkt o temperaturze topnienia 196—, —il03°C. Analiza elementarna: obliczono dla C47H54N4016: G = 60,62%, H = 5,88%, N = 6,02%. oznaczono: C = 58,67%, H = 5,73%, N = 5,98%. Oznaczenie wody metoda Karla Fischera — 2,45%. Analiza elementarna po uwzglednieniu zawar¬ tosci wody: oznaczono: C = 60,14%, H = 5,60%, N = 6,13%. Przyklad XI, Wytwarzanie l-N-(L-)-(-^-10*734::. 17 -amino-a-hydroksybutyrylo)kananiycyny A metoda in; situ. Do umieszczonej w odpowiedniej aparaturze za¬ wiesiny 1000 g (1,074 mola) 6'-karboibenzoksy-l,3, 3"-trójsalicylalokanamycyny A w 11400 ml czte- rohydrofufanu dodaje sie przy mieszaniu w tem¬ peraturze 22—25°C 600 ml wody. Rozpuszczanie zachodzi w ciagu okolo 10 minut. Do roztworu dodaje sie 181,5 g (0,716 mola) kwasu 4-benzylo- oksykarbonyloamino - 2 - hydroksymaslowego i 0,12 mola N-hydroksyimidu kwasu 5-norbornenon- dwukarboksylowego-2,3. Po zakonczeniu dodawa¬ nia pH roztworu ustala sie w granicach 5,5—6,0. Utrzymujac temperature roztworu w zakresie 22— *-^25°C dodaje sie 162,3 g (0,787 mola) dwucyklohe- ksylokarbodwuimidu rozpuszczonego w 3000 ml czterohydrofuranu. Zawiesine miesza sie w ciagu . 24 godzin w temfperaturze 22—25°C, a nastepnie chlodzi sie roztwór w temperaturze 0—5°C w ciagu 2 godzin w celu wydzielenia krystalicznego osadu dwucykloheksylomocznika. Mocznik odsacza sie i osad przemywa sie 800ml mieszaniny czterohydrofuranu i wody w stosun¬ ku 95:5. Przesacz i roztwór z przemycia laczy sie i usuwa sie rozpuszczalnik pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci 3000 ml. Do pozostalosci dodaje sie 4000 ml metanolu i ponownie zateza sie roztwór pod zmniejszonym cisnieniem do ob¬ jetosci 3000 ml. Do tak otrzymanego roztworu dodaje sie w. temperaturze 40°C 2000 ml absolutnego metanolu. Roztwór zaszczepia sie nastepnie 6'-karbobenzp- ksy-l,3,3"-trójsalicylalokanamycyna A i pozosta¬ wia do ochlodzenia i krystalizacji w ciagu 0,5^-1 godziny.. Nastepnie przy intensywnym mieszaniu dodaje sie w ciagu 0,5 godziny w temperaturze 22—25°C 2000 ml wody (i miesza w ciagu 2.godzin, po czym obniza sie temperature do 0—5^C w ciagu 1 godziny. Wydzielony osad odsacza sie, przemywa za po¬ moca 900 ml mieszaniny metanolu i wody w sto¬ sunku 2; 1 oraz 800 ml metanolu. Przesacz i roz-, twory z przemywania zachowuja sie.. Odsaczony osad stanowi zasadniczo 6/-karbobenzoksy-l,3,3"- . -trójsalicylalokanamycyna A. Powyzsze przesacze rozciencza sie dodatkiem 1G00 ml chlorku metylenu. W temperaturze 25°C obniza sie za pomoca 6 n kwasu solnego pH roz¬ tworu do 1,8—2,0 i pozostawia sie roztwór w tym pH w ciagu 0,5 godziny. Po rozdzieleniu faz, faze wodna przemywa sie 2000 ml chlorku metylenu. Polaczone fazy organiczne zachowuje sie ze wzgle¬ du na mozliwosc odzyskania aldehydu salicylo¬ wego. Za pomoca stezonego roztworu wodorotlenku amonu doprowadza sie pH fazy wodnej do 3,5-— —4,0. Roztwór ten poddaje sie wodorólizie w tem¬ peraturze pokojowej pod cisnieniem 3,5 atmosfery w obecnosci 5°/o palladu na weglu. Wydajnosc biologiczna pozadanego produktu w roztworze wy¬ nosi 30—45% wydajnosci teoretycznej. Przyklad XII. Wytwarzanie zwiazku o wzo¬ rze 1 stosujac róznoprocentowa zawartosc molo¬ wa N-hydroksyimidu kwasu 5-norbornenodwukar~ boksylowego-2,3 przy zachowaniu stalych procen- 18 towych zawartosci. molowych innych : substratów. •_ PostepujacJak w przykladzie XI i stosujac za¬ miast 0,12 mola N-hydroksyimidu kwasu 5-nor- . bornenodwukarboksylowego-2,3 rózne procentowe' zawartosci molowe przedstawione ponizaj uzysku¬ je sie nastepujace wydajnosci procentowe zwiaz¬ ku o wzorze 1: Tablica VIII Doswiad¬ czenie" 1 2 3 4 •/o molowy N^hydro- ksy-imidu kwasu 5- -norbornenodwukar- boksylowego-2,3 0 2 50 100 M wydaj¬ nosci zwliazku o wzorze 1 9,33 ,07 31,72 36,52 . 36,01 Z podanych rezultatów wynika, ze reakcja two¬ rzenia sie zwiazku o wzorze 1 zachodzi w nie¬ obecnosci N-hydroksyimidu kwasu 5-norbornerio-: dwukarboksylowego-2,3. Jednakze wynika Tówniez, ze najlepsza wydajnosc zwiazku o wzorze 1 uzy¬ skuje sie wtedy, gdy procentowa zawartosc mo¬ lowa N-hydroksyimidu kwasu 5-norbornenodwu- karboksylowego-2,3 wynosi od 10 do 50% zawar- tosci molowej kwasu 4-^benzylóoksykarbonyloami- no-2-hydroksyma5lowego uzytego w reakcji acy- lowania. Dokladny mechanizm wedlug którego zachodzi proces acylowania zablokowanej kana-" mycyny A nie jest znany. Jednakze widoczne jest, 39 ze w obecnosci N-hydroksyimidu kwasu 5-norbor- neno-dwukarboksyIowego-2,3,. uzyskuje sie w. nie¬ wyjasniony sposób lepsze wydajnosci niz uzyski-: wane uprzednio. Przyklad XIII. Wytwarzanie l-N-(L-)-(-^ -amino-a-hydrpksybutyrylo)kanamycyny A (wzór 1), 18,6 g (20 milimoli) e^karbobenzoksy-l^^-trój-r saiicylalcfcanamycyny A uzyskanej jak w przyklap.. dzie XI rozpuszcza sie w 55 ml dwumetyloforma-r midu w temperaturze 4&°C. Do powyzszego roz-.. tworu dodaje sie 7,3 ml woóty i 102 ani acetonu.. Roztwór pozostawia sie do ochlodzenia do. tem¬ peratury okolo 25°C i dodaje sie jednorazowo. 50 ml roztworu 9,9 milimola estru Nrhydroksy- sukcynimidowego kwasu L-(-)-benzylooksykarbb- 50 nylo-hydroksymaslowego. Mieszanine reakcyjna miesza sie w temperaturze okolo 25°C w-ciagu 40 godzin. Nastepnie dodaje sie 150 ml wody i kjlka krysztalów 6'-karbobenzOksy-l,3,3''-trójsaliTv cylalokanamycyny A i mieszanine.reakcyjna mie-. sza sie w temperaturze okolo 25°C w ciagu 1 go-.. dziny, a pózniej iw ciagu 3 godzin w temperatu¬ rze 0—5°C. Nadmiar i nieprzereagowana zasade Schiffa z aldehydem salicylowym odsacza sie. Osad przemywa sie 60 ml 50*/#-owego wodnego roztworu acetonu i suszy, uzyskujac 9,4 g odzy¬ skanej zasady Schiffa o temperaturze topnienia 170^185°C (surowy zwiazek). Uzyskany powyzej przesacz poddaje sie cizia- 65 laniu 40 ml chlorku metylenu i obniza sie pH102 734 19 mieszaniny z 6,2 do 2,0 w celu usuniecia dal¬ szych substratów. Po rozdzieleniu faz, faze wod¬ na ekstrahuje sie 2X40 ml chlorku metylenu i pH fazy wodnej doprowadza sie do 3,7. Niewielkie ilosci chlorku metylenu i acetonu usuwa sie pod zmniejszonym cisnieniem. Faze wodna poddaje sie wodorolizie w temperaturze 24°C z dodatkiem 3,0 g */t palladu na weglu jako katalizatora, pod cis¬ nieniem 3,15 atmosfery. Mieszanine uwodornia sie w ciagu 15 godzin, saczy przez ziemie okrzemko¬ wa w celu usuniecia katalizatora. Objetosc prze¬ saczu doprowadza sie do okolo 100 ml. Jeden mi- lilitr roztworu pobiera sie na oznaczenie plytko¬ we i krazkowe. Oznaczenie plytkowe wykazuje zawartosc 1936 mcg/ml zwiazku o wzorze 1, a oznaczenie krazkowe 1325 mcg/ml, co odpowiada 33,4*/* wydajnosci koncowego produktu. Pozostale 99 ml roztworu zateia sie do objetosci okolo 30 ml i przepuszcza przez kolumne chroma¬ tograficzna w sposób opisany w przykladzie VII. Polaczone frakcje o objetosci 500 ml zawierajace zwiazek o wzorze 1 zateia sie do objetosci okolo ml, po czym dodaje sie 45 ml metanolu, a nastepnie wkrapla sie okolo 25 ml izopropanolu w celu wydzielenia produktu. Krystaliczny pro¬ dukt odsacza sie, przemywa mieszanina metano¬ lu i izopropanolu w stosunku 50:50 i suszy, uzy¬ skujac 2,31 g zwiazku BB-IC8 o wzorze 1. Ozna¬ czenie osadu metoda plytkowa wykazuje aktyw¬ nosc $36 mcg/mg, co odpowiada czystosci &,&/• i stanowi 33,3f/t wydajnosci zwiazku o wzorze 1 w przeliczeniu na 9^9 milimola substancji wyjscio¬ wej- __¦.._!•: 1*9 PL PL PL PL