CS212755B2

CS212755B2 - Method of preparing 1-(l-(-)-gama-amino-alfa-hydroxybutyryl)-canamycine a

Info

Publication number: CS212755B2
Application number: CS752681A
Authority: CS
Inventors: Takayuki Naito; Susumu Nakagawa; Masahisa Oka
Original assignee: Bristol Myers Co
Priority date: 1974-05-23
Filing date: 1975-04-17
Publication date: 1982-03-26
Also published as: DE2514817A1; BE828192A; FR2273009B1; SU1190988A3; AR205114A1; IL46995A0; ATA243175A; DE2514817C2; IL46995A; AT339478B; FR2273009A1; PL102734B1

Abstract

1- L-(-)-gamma-amino-alpha-hydroxybutynyl -kanamycine A is prepd. by reacting 6'-N-benzyloxycarbonyl kanamycine A with an aldehyde, and condensing the protected intermediate with the N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide ester of L-gamma-benzyloxycarbonylamino-alpha-hydroxybutyric acid. Prod. is an antibacterial having greater activity than kanamycine A.

Description

Předložený vynález se týká způsobu výroby l-[L-( — j-y-amifio-a-hydroxybutyryl]-kaňamyclnu A vzorce IV:The present invention relates to a process for the preparation of 1- [L- (- j-γ-amifio-α-hydroxybutyryl) -cannamycin A of formula IV:

i-'and-'

Í/V)Í / V)

V kanamycinu A jsou obsaženy 4 primární aminoskupiny v .polohách 1, 3, 6‘ a 3“. Bylo zjištěno, že nejvíce reaktivní je 6*-amino6kupina, následuje 1-aminoskupina, to se zřetelem na reakce s elektrifilním činidlem. Obě aminoskupiny v polohách 3 a 3“ jsou méně reaktivní než kterákoli z aminoskupin v polohách 1 nebo 6‘, ale reagují rovněž za vzniku nežádoucích acylovaných látek, vznikajících v malých výtěžcích.Kanamycin A contains 4 primary amino groups at positions 1, 3, 6 ‘and 3 '. It has been found that the most reactive is the 6'-amino group, followed by the 1-amino group, with respect to the reactions with the electrophilic reagent. Both the 3 and 3 'amino groups are less reactive than either the 1 or 6 am amino groups, but also react to form undesired acylated species, resulting in low yields.

Podle toho je cílem tohoto vynálezu nalézt výhodnější postup, než jak se dosud používá v tomto směru podle amerických patentových spisů 3 781268 a 3 974137, přičemž je třeba, aby při tomto postupu docházelo >k selektivnějšímu acylování 1-amino21275S sku,piny ve srovnání s dalšími aminoškupinami v molekule.Accordingly, it is an object of the present invention to find a more advantageous process than hitherto used in this regard according to U.S. Pat. Nos. 3,778,668 and 3,797,437, which requires a more selective acylation of the 1-amino21275S group compared to that of the group. other amino groups in the molecule.

Předmětu tohoto vynálezu se dosáhlo náležením způsobu přípravy sloučeniny uve deného zde vzorce IV, přičemž se tento postup vyznačuje tím, že zahrnujé postupně reakční stupně tak, že se v prvém stupni působí na sloučeninu vzorce IIThe object of the present invention is achieved by providing a process for the preparation of a compound of formula (IV) herein, characterized in that it comprises sequentially reaction steps such that a compound of formula (II) is treated in a first step

Cíle tohoto vynálezu bylo dosaženo tím, -y-amino-w-hydroxybutyryl]-kanamycinu A že vynález vytváří způsob výroby L-[L-( —)- ' vzorce IV .The object of the invention was achieved by -y-amino-1-hydroxybutyryl] -canamycin A that the invention provides a process for the preparation of the L- [L- (-) - 'formula IV.

jehož podstata spočívá v tom, že v prvém stupni postupu se působí na 6‘-N-benzyloxykarbonylkanamycin A vzorce IIcharacterized in that, in the first step of the process, 6‘-N-benzyloxycarbonylcanamycin A of formula II is treated

C HzNH-C оо-сн^с₆н_£ C H 2 NH-C о--^ с _{6 6} _£

aldehydem že skupiny, kterou tvoří benzaldehyd, salicylaldehyd, p-nitrobenzaldehyd, p-methoxybenzaldehyd a pivaldehyd v molárním poměru 1 mol 6‘-N-benzyloxykarbonylkanamycinu A vzorce II na 3 moly aldehydu v prostředí absolutního ethanolu, methanolú, n-propanolu, methylenchloridu, 2-propanolu, n-butanolu, sek.butanolu, terc.butylalkoholu, tetrahydrofuranu, dioxanu, dimethylformamidu nebo acetonu či jejich směsí nebo směsí uvedených rozpouštědel s vodou za teploty v rozmezí od 5°C až do teploty varu pod zpětným chladičem po dobu od 30 minut do 5 hodin za vzniku 6‘-karbobenzoxy-l,3,3“-,trialdehydokanamycinu A obecného vzorce IIIan aldehyde that the groups consisting of benzaldehyde, salicylaldehyde, p-nitrobenzaldehyde, p-methoxybenzaldehyde and pivaldehyde in a molar ratio of 1 mole of 6'-N-benzyloxycarbonylkanamycin A of formula II to 3 moles of aldehyde in absolute ethanol, methanol, n-propanol, methylene chloride 2-propanol, n-butanol, sec-butanol, tert-butyl alcohol, tetrahydrofuran, dioxane, dimethylformamide or acetone or mixtures thereof or mixtures of the abovementioned solvents with water at a temperature ranging from 5 ° C to reflux for 30 minutes to 5 hours to give 6'-carbobenzoxy-1,3,3 '-, trialdehyde-kanamycin A of formula III

kde Z znamená zbytek vzorcewherein Z is a radical of formula

-N=CW-0 aebo -N~CH-0 (CH^ _& -N = CW-O or -N-CH-O (CH ^ _&

Oři načež se ve druhém stupni působí na 6‘-karbobenzoxy-l,3,3“-tri-aldehydokanamycin A obecného vzorce III bezprostředně bez isolování N-hydroxy-6-nonbornen-2,3-dikarboxyimidesterem kyseliny L-/-benzyloxykarbonylamino-a-hydroxymáselné vzorce XXHowever, in the second step, the 6'-carbobenzoxy-1,3,3'-trialdehyde-canamycin A of formula III is reacted immediately without isolation with the N-hydroxy-6-nonbornene-2,3-dicarboxyimide ester of L-t-benzyloxycarbonylamino- α-hydroxybutyric formula XX

v poměru 1 mol 6'-karbobenzoxy-l,3,3“-triin a ratio of 1 mole of 6'-carbobenzoxy-1,3,3 '-tri

-aldeihydo-kanamycinu A vzorce III na 0,5 mol N-h'ydroxy-6-nonbornen-2,3-dikarboxyimidesťeru kyseliny L-y-benzyloxykarbonylamino-a-hydroxymáselné vzorce XX za teploty v rozmezí od —10 °C do -|-35 °C po dobu jedné hodiny v těchže rozpouštědlech, která byla uvedena v prvém stupni, načež se organické rozpouštědlo odstraní a zbytek se bezprostředně hydrogenuje vodíkem za přítomnosti kovového katalyzátoru ze skupiny, kam patří palladium, platina, Raney-ův nikl, rhodium, ruthenium a nikl v prostředí vody nebo rozpouštědla mísitelného s vodou ze skupiny, kterou tvoří voda a dioxan, tetrahydrofuran, dimethylether ethylenglykolu a dimethylether propylenglykolu za hodnoty pH 3 až 5 za vzniku l-[L-( — )-y-amino-a-hydroxybutyrylj-kanamycmu A vzorce IV.-aldehyde-kanamycin A of formula III per 0.5 mol of N-hydroxy-6-nonbornene-2,3-dicarboxyimide of the N -benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybutyric acid of formula XX at a temperature ranging from -10 ° C to - | - 35 ° C for one hour in the same solvents as in the first step, after which the organic solvent is removed and the residue is immediately hydrogenated with hydrogen in the presence of a metal catalyst from the group consisting of palladium, platinum, Raney nickel, rhodium, ruthenium and nickel in water or a water miscible solvent selected from the group consisting of water and dioxane, tetrahydrofuran, ethylene glycol dimethyl ether and propylene glycol dimethyl ether at pH 3-5 to give 1- [L- (-) -y-amino-α-hydroxybutyryl] - camamycin A of formula IV.

Je výhodné, když šé v prvém stupni postupu působí na 6‘-N-benzyloxykarbonylkanamycin A vzorce II aldehydem ze skupiny, kterou tvoří benzaldehyd, salycylaldehyd, p-nitrobenzaldehyd a p-methoxybenzaldehyd v poměru 1 mol 6‘-N-benzyloxykarbonylkanamycinu A vzorce II na 3 moly aldehydu v prostředí absolutního ethylalkoholu, methylalkoholu, p-propylalkoholu, isopropylalkoholu, methylenchloridu, n-butylalkoholu, sek.butylalkoholu, terc.butylalkoholu, tetrahydrofuranu, dioxanu, dimethylformamidu nebo acetonu za teploty v rozmezí od 5 °C do 40 °C po dobu 30 minut až 5 hodin za vzniku 6‘-karbobenzoxy-l,3,3“-tri-aldehydokanamycinu A obecného· vzorce III, kde Z znamená zbytek vzorcePreferably, in the first step of the process, 6'-N-benzyloxycarbonylkanamycin A of formula II is treated with an aldehyde selected from the group consisting of benzaldehyde, salycylaldehyde, p-nitrobenzaldehyde and p-methoxybenzaldehyde in a ratio of 1 mol of 6'-N-benzyloxycarbonylkanamycin A of formula II to 3 moles of aldehyde in an environment of absolute ethyl alcohol, methyl alcohol, p-propyl alcohol, isopropyl alcohol, methylene chloride, n-butyl alcohol, sec-butyl alcohol, tert-butyl alcohol, tetrahydrofuran, dioxane, dimethylformamide or acetone at temperatures between 5 ° C and 40 ° C for 30 minutes to 5 hours to give 6'-carbobenzoxy-1,3,3'-trialdehyde-canamycin A of formula III, wherein Z is a radical of formula

-N=CH-N = CH

a ve druhém stupni se působí na 6‘-karbobenzoxy-l,3,3“-trialdehydokan-amycin A obecného vzorce III bezprostředně v reakční směsi nebo po isolování N-hydroxy-6-norbornen-2,3-dikarboximidesterem kyseliny L-y-benzyloxykarbonylamino-a-hydroxymáselné vzorce XX v poměru 1 mol 6‘-karbobenzoxy-l,3,3“-tri-aldehydokanamycinu A vzorce III na 0,5 až 1 mol N-hydroxykarbonylaimino-a-hydroxymáselné vzorce XX v teplotním rozmezí od +5 °C do +35 °C po dobu jedné hodiny až 3 hodin v soustavě rozpouštědel, jak jsou uvedena v prvém stupni, načež se rozpouštědlo oddestiluje a zbytek se hydrogenuje bezprostředně vodíkem za přítomnosti kovového katalyzátoru ze skupiny, kterou tvoří palladium, platina, Raněy-ův nikl, rhodium, ruthenium a nikl ve vodě nebo v prostředí rozpouštědel mísitelných s vodou, jako je voda a dioxan, tetrahydrofuran, dimethylester ethylenglyko lu a dimethylether propylenglykolu za hodnoty pH 3 až 5 za vzniku l-[L-( — )-/-amino-«-hydroxybutyrylj-kanamycinu A vzorce IV.and in a second step, the 6'-carbobenzoxy-1,3,3'-trialdehyde-amycin A of formula III is reacted immediately in the reaction mixture or after isolation with N-hydroxy-6-norbornene-2,3-dicarboximide ester with L-benzyloxycarbonylamino acid -α-hydroxybutyrate of formula XX in a ratio of 1 mole of 6'-carbobenzoxy-1,3,3'-tri-aldehyde-canamycin A of formula III to 0.5 to 1 mole of N-hydroxycarbonylaimino-α-hydroxybutyrate of formula XX in the temperature range of +5 ° C to + 35 ° C for one to three hours in a solvent system as described in the first step, after which the solvent is distilled off and the residue is hydrogenated immediately with hydrogen in the presence of a metal catalyst from the group consisting of palladium, platinum, nickel, rhodium, ruthenium and nickel in water or in water-miscible solvents such as water and dioxane, tetrahydrofuran, ethylene glycol dimethyl ester and propylene glycol dimethyl ether at pH 3-5 to give 1- [L- (-) - / -amino- N -hydroxybutyryl-kanamycin A of formula IV.

Dále je výhodné, když se v prvém stupni působí na 6‘-N-benzyloxykarbonylkanamycin A vzorce II aldehydem ze skupiny, kterou tvoří benzaldehyd, salicylaldehyd, a p-nitrobenzaldehyd, v poměru 1 mol 6‘-N-benzyloxykarbonylkanamycinu A vzorce II na asi 3 moly aldehydu v prostředí absolutního ethylalkoholu, methylalkoholu, n-propylalkoholu, isopropylalkoholu, n-butylalkoholu, sek.butylalkoholu, terc.butylalkoholu, tetrahydrofuranu, dioxanu, methylenchloridu, dimethylformamidu nebo acetonu nebo jejich směsí, či Jejich směsí s vodou za teploty v rozmezí 5 °C až 40 °C po dobu 30 minut až 5 hodin za vzniku 6‘-karbobenzoxy-l,3,3“-tri-aldehydokanamycinu A obecného vzorce III, kde Z znamená zbytek vzorceIt is further preferred that, in a first step, 6'-N-benzyloxycarbonylcanamycin A of formula II is treated with an aldehyde selected from the group consisting of benzaldehyde, salicylaldehyde, and p-nitrobenzaldehyde in a ratio of 1 mole of 6'-N-benzyloxycarbonylkanamycin A of formula II to about 3 moles of aldehyde in absolute ethyl alcohol, methyl alcohol, n-propyl alcohol, isopropyl alcohol, n-butyl alcohol, sec-butyl alcohol, tert-butyl alcohol, tetrahydrofuran, dioxane, methylene chloride, dimethylformamide or acetone or mixtures thereof, or mixtures thereof with water at temperatures 5 ° C to 40 ° C for 30 minutes to 5 hours to give 6'-carbobenzoxy-1,3,3'-trialdehyde-kanamycin A of formula III wherein Z is a radical of formula

NO_Z nebo -N=CH-ť ^NO ₂ or -N = CH 2 '

OH načež se ve druhém stupni působí na 6‘-karbobenzoxy-l,3,3“-tri-aldehydokanamycin A vzorce III bezprostředně v reakční směsi nebo po isolací N-hydroxy-6-nonbornen-2,3-dikarboximidesterem kyseliny L-y-benzyloxykarbonylaimino-a-hydroxymáselné vzorce XX v poměru 1 mol 6‘-karbobenzoxy-l,3,3“-tri-aldehydokanamycinu A vzorce III na 0,5 mol až 1 mol N-hydroxy-6-nonbornen-2,3-dikarboximidesteru kyseliny L-y-benzyloxykarbonylamino-a-hydroxymáselné vzorce XX v teplotním rozmezí od +5 °C do +35 stupňů Celsia po dobu jedné hodiny až 3 hodin v soustavě rozpouštědel, jak jsou uvedena v prvém stupni, načež se rozpouštědlo oddestiluje a zbytek se hydrogenuje bezprostředně vodíkem za přítomnosti kovového katalyzátoru ze skupiny, kterou tvoří palladium, platina, Raney-ův nikl, rhodium, ruthenium a nikl, ve vodě nebo v prostředí rozpouštědla mísitelného s vodou, jako je voda a dioxan, tetrahydřofuran, dimethylether ethylenglykolu a dimethylether propylenglykolu za hodnoty pH od asi 4 za vzniku 1- [ L- (—] -χ-amino-a-hydroxybutyrylj-kanamycinu A vzorce IV.OH is then treated in the second step with 6'-carbobenzoxy-1,3,3'-trialdehyde-canamycin A of formula III immediately in the reaction mixture or after isolation of N-hydroxy-6-nonbornene-2,3-dicarboximide ester with L-benzyloxycarbonylaimino acid -α-hydroxybutyric formula XX in a ratio of 1 mole of 6'-carbobenzoxy-1,3,3'-tri-aldehyde-canamycin A of formula III per 0.5 mole to 1 mole of N-hydroxy-6-nonbornene-2,3-dicarboximide ester Ly-benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybutyric formula XX in the temperature range from +5 ° C to +35 degrees Celsius for one hour to 3 hours in the solvent system as mentioned in the first step, after which the solvent is distilled off and the residue is hydrogenated immediately with hydrogen in the presence of a metal catalyst from the group consisting of palladium, platinum, Raney nickel, rhodium, ruthenium and nickel, in water or in a water-miscible solvent environment such as water and dioxane, tetrahydrofuran, ethylene glycol dimethyl ether and dimethyl ether propylene glycol at a pH of from about 4 to give 1- [L- (-) -. alpha.-amino-.alpha.-hydroxybutyryl]-kanamycin A of formula IV.

Dále Je výhodné, když se v prvém stupni působí na 6‘-N-benzyloxykarbonylkanamycin A vzorce II benzaldehydem v poměru 1 mol 6‘-N-benzylOxykarbonylkanamycinu A vzorce II na 3 moly benzaldehydu ve směsi vody a tetrahydrofuranu v poměru 1:1 za teploty od 20°C do 3O'°C po dobu 2 až 4 hodiny za pH 10 za vzniku 6‘-karbobenzoxy-l,3,3“-tri-salicylkanamycinu A vzorce lilaIt is further preferred that, in the first step, 6'-N-benzyloxycarbonylkanamycin A of formula II is treated with 1 mole of 6'-N-benzyloxycarbonylkanamycin A of formula II to 3 moles of benzaldehyde in a 1: 1 mixture of water and tetrahydrofuran at 1 from 20 ° C to 30 ° C for 2 to 4 hours at pH 10 to give 6'-carbobenzoxy-1,3,3'-tri-salicylkanamycin A of formula IIIa

a na 6‘-karbobenzoxy-l,3,3“-trisali'Cylkanamycin A vz-orce lila -se působí ihned po - přípravě nebo po isolování N-hydroxy-6-nonbornen-2,3-dikarboximidesterem kyseliny L-y-benzyloxykarobnylamino-ia-hydroxymáiselné vzorce XX v poměru 1 mol 6‘-karbobenzoxy-l,3,3“-trisalicylkanamycinu A vzorce lila na 0,6 až 0,75 mol N-hydroxy-6-nonbornen-2,3-dikarboximidesteru kyseliny L-y-benzyloxykarbonylaimino-a-hydroxymáselné vzorce XX za teploty v rozmezí 20° Celsia až 30 °C po- dobu 1 hodiny až 3 hodin v rozpouštědlech, jak byla uvedena v před-chozím stupni, ve směsi methylenchloridu, methylalkoholu a vody nebo ve směsi dimethylformamidu, acetonu a vody, načež se rozpouštědlo oddesti-luje ve vakuu, přidáním vodného roztoku amoniaku se hodnota pH upraví na 4 a zbytek se bezprostředně in šitu hydrogenuje vodíkem za normálního tlaku a za přítomnosti palladia na uhlí za vzniku 1 - [ L - ( — ) -y-amino-a-hy droxybuty ry 1 ] -kanamycinu A vzorce IV.and the 6'-carbobenzoxy-1,3,3'-trisalylCylkanamycin A from IIIa is treated immediately after - or after isolation with N-hydroxy-6-nonbornene-2,3-dicarboximide ester with L-benzyloxycarbnylamino- .alpha.-hydroxymethyl XX in a ratio of 1 mole of 6'-carbobenzoxy-1,3,3'-trisalicylkanamycin A of formula IIIa to 0.6 to 0.75 mol of N-hydroxy-6-nonbornene-2,3-dicarboximide ester Ly- benzyloxycarbonylaimino-α-hydroxybutyric formula XX at a temperature in the range of 20 ° C to 30 ° C for 1 hour to 3 hours in solvents as mentioned in the previous step, in a mixture of methylene chloride, methanol and water or in a mixture of dimethylformamide, acetone and water, then the solvent is distilled off in vacuo, the pH is adjusted to 4 by addition of aqueous ammonia solution and the residue is immediately hydrogenated in situ with hydrogen under normal pressure and in the presence of palladium on carbon to give 1- [L - (-) of γ-amino-α-hydroxybutyl] -canamycin A of formula IV.

Dále je výhodné, když se v prvém stupni působí na -6‘-N-benzyloxykarbonylkanamycin - A vzorce - II salicylaldehydem v poměru 1 mol x‘-N-benzyloxykarbonylkanamycinu A vzorce II na 3 moly -solicylaldehydu ve směsi vody a tetrahydrofuranu v poměru 1:1 za teploty 20 “C až 30 °C po dobu 2 až 4 hodin za pH 8 za vzniku 6‘-karbobenzoxy-l,3,3“-tri-o-hydroxybenzalkana)mycinu vzorce HlbIt is further preferred that, in a first step, 6'-N-benzyloxycarbonylkanamycin-A of formula II is treated with salicylaldehyde in a ratio of 1 mol x'-N-benzyloxycarbonylkanamycin A of formula II to 3 moles of salicylaldehyde in a 1: 1 mixture of water and tetrahydrofuran 1 at 20 ° C to 30 ° C for 2 to 4 hours at pH 8 to give 6'-carbobenzoxy-1,3,3 "-tri-o-hydroxybenzalkaniline mycine of formula IIIb

O ((lib} a na 6‘-karbobenzoxy-l,3,3“-tri-o-hydrc)xybenzalkanamycin A vzorce Illb se působí ihned po přípravě nebo po isolování N-hydrcxy-6-norbcrnen-2,3-dikarboximidesterem kyseliny L-y-benzyloxykarbonylamino-α-hydroxymáselné vzorce XXX v poměru 1 mol 6‘-karbobenzoxy-l,3,3“-tri-o-hydrcxybenzalkanamycinu A vzorce Illb na 0,6 až 0,75 mol N-hydroxy-6-norbornen-2,3-dikarboxiímidesteru kyseliny L-y-benzyloxykarbonylamino-a-'hydroxy(máselné vzorce XX za teploty v rozmezí 20 °C až 30 °C po dobu 1 hodiny až 3 hodin v prostředí rozpouštědel popsaných v prvém stupni nebo ve směsi dimethylformamidu, acetonu a vody, načež se organické rozpouštědlo oddestiluje ve vakuu, přidáním vodného roztoku amoniaku se hodnota pH upraví na 4 a zbytek se- hydrogenuje bezprostředně vodíkem za normálního tlaku a za přítomnosti palladia na uhlí za vzniku l-[L-(—j-y-amino-cr-hydroxybutyryl]-<kana.mycinu A vzorce IV.O ((IIb) and 6'-carbobenzoxy-1,3,3'-tri-o-hydrc) xybenzalkanamycin A of formula IIIb is treated immediately after preparation or after isolation with N-hydroxy-6-norbrenene-2,3-dicarboximidester Ly-benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybutyric acid of formula XXX in a ratio of 1 mole of 6'-carbobenzoxy-1,3,3 '-tri-o-hydroxybenzalkanamycin A of formula IIIb to 0.6 to 0.75 mole of N-hydroxy-6-norbornene -2,3-dicarboximide of Ly-benzyloxycarbonylamino-α-hydroxy (butyric formula XX) at temperatures ranging from 20 ° C to 30 ° C for 1 hour to 3 hours in the solvents described in the first step or in a mixture of dimethylformamide, acetone and water, whereupon the organic solvent is distilled off in vacuo, the pH is adjusted to 4 by addition of aqueous ammonia solution and the residue is hydrogenated immediately with hydrogen under normal pressure and in the presence of palladium on carbon to give 1- [L - (-. n-hydroxybutyryl] - cananamycin A of formula IV.

Dále je výhodné, když se ve druhém stupni působí na 6^t-karboben'zoxy-l,3,3“-tri-aldeihydokanamycin A obecného vzorce III in šitu nebo po isolaci kyselinou L-y-benzyloxykarbonylamino-a-hydroxymájselnou vzorce VI a N-hydroxy-5-norbornen-endo-2,3-dikarboximideim vzorce XIXIt is further preferred that in the second step, a 6 ^t -karboben'zoxy-l, 3,3 "tri-aldeihydokanamycin A of formula III in situ or after isolation of the acid-Ly-benzyloxycarbonylamino-a-hydroxymájselnou formula VI and N hydroxy-5-norbornene-endo-2,3-dicarboximideim of formula XIX

H—O—CO—CH—CH2—CHž—H — O — CO — CH — CH2 — CH2—

OH —NH—ООО—CH2—CeH5 (VI)OH — NH — ООО — CH2 — CeH5 (VI)

(X(X) s následujícím přidáním dicyklohexylkarbodlimidu v poměru 1 mol 6‘-karbobenzoxy-l,3,3“-tri-aldehydokanamycinů A vzorce III na 0,5 až 1,0 mol kyseliny L-y-benzyloxykarboňylamino-ar-hydroxymáselné vzorce VI a dicyklohexylkarbodiimidu, a 0,005 až 0,25 mol N-hydroxy-5-norbornen-endo-2,3-dikarboximidu vzorce XIX v teplotním rozmezí od —10 °C do +'35 °C po dobu 10 hodin v rozpouštědlech, jak byla popsána v prVéni stupni, načež se oddestiluje organické rozpouštědlo a zbytek se hydrogenuje bezprostředně, jak je popsáno v bodech 1 až 3, za vzniku 1- [ L- (—) -y-amino-a-hy dr oxybutyry 1 ] -kanaimycinu A vzorce IV.(X (X) followed by the addition of dicyclohexylcarbodimide in a ratio of 1 mole of 6'-carbobenzoxy-1,3,3'-trialdehyde-canamycins A of formula III to 0.5 to 1.0 mole of Ly-benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybutyric acid of formula VI and dicyclohexylcarbodiimide, and 0.005 to 0.25 moles of N-hydroxy-5-norbornene-endo-2,3-dicarboximide of formula XIX in the temperature range from -10 ° C to + 35 ° C for 10 hours in solvents as described in the first step, after which the organic solvent is distilled off and the residue is hydrogenated immediately as described in 1 to 3 to give 1- [L- (-) -y-amino-α-hydroxybutyryl] -canaimycin A of formula IV.

Dále je výhodné, když na 6*-karbobenzoxy-l,3,3“-tri-aldehydokanamycin A vzorce III se působí bezprostředně nebo po isolaci kyselinou L-y-benzyloxykarbonylamino-a-hydroxyímáselnou vzorce VI a N-hydroxy-5-norbornen-endo-2,3-dikarboximidem ” ' vzorce XIX a následujícím přidáním dicyklohexylkarbodiimidu v poměru 1 mol 6‘-karbobenzoxy-l,3,3“-tri-aldehydokanamycinu A vzorce III na 0,5 až 0,85 mol kyseliny L-y-benzyloxykarbonylamino-á-hydroxymáselné vzorce VI a dicyklohexylkarbodiimidu a 0,05 až 0,425 mol N-hydroxý-5-norbornen-endo-2,3-dikarboximidu vzorce XIX v teplotním rozmezí od +5 °C do 25 °C po dobu 1 hodiny až 3 hodin v rozpouštědlech, jak byla popsána v přivém stupni.It is further preferred that the 6'-carbobenzoxy-1,3,3'-trialdehyde-canamycin A of formula III is treated immediately or after isolation with Ly-benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybutyric acid of formula VI and N-hydroxy-5-norbornene-endo -2,3-dicarboximide XIX followed by the addition of dicyclohexylcarbodiimide in a ratio of 1 mole of 6'-carbobenzoxy-1,3,3'-trialdehyde-canamycin A of formula III to 0.5 to 0.85 mole of L-benzyloxycarbonylamino- .alpha.-hydroxybutyric formula VI and dicyclohexylcarbodiimide and 0.05 to 0.425 moles of N-hydroxy-5-norbornene-endo-2,3-dicarboximide of formula XIX in the temperature range from +5 ° C to 25 ° C for 1 hour to 3 hours in solvents as described in the first step.

Dále je výhodné, když se ve druhém stupni působí na 6‘-karbobenzoxy-l,3,3“-tri-aldehydokanamycin A vzorce III bezprostředně po reakci kyselinou L-y-benzyloxykarbonylamino-oí-hydroxymálselnou vzorce XIX s následujícím přidáním dicyklohexylkarbodiimidu v poměru 1 mol 6*-karbobenzoxy-l,3,3“-tri-aldehydokanamycinu A vzorce III ná 0,5 až 0,8 mol kyseliny L-y-benzyloxykar bonylamino-<a-hydroxymáselné vzorce VI a dicyklohexylkarbodiimidu a 0,05 až 0,425 mol N-hydroxy-5-norbornen-endo-2,3-dikarboximidu vzorce XIX v teplotním rozmezí od +15 °C do +30 °C po dobu 15 až 25 hodin.It is further preferred that in the second step 6'-carbobenzoxy-1,3,3'-tri-aldehyde-canamycin A of formula III is reacted immediately after the reaction with Ly-benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybutyric acid of formula XIX followed by addition of dicyclohexylcarbodiimide in a 1 mol ratio 6 * -carbobenzoxy-1,3,3'-tri-aldehyde-kanamycin A of formula III with 0.5 to 0.8 moles of N-benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybutyric acid of formula VI and dicyclohexylcarbodiimide and 0.05 to 0.425 moles of N- hydroxy-5-norbornene-endo-2,3-dicarboximide of formula XIX in a temperature range of +15 ° C to +30 ° C for 15 to 25 hours.

Dále je výhodné, když se ve druhém stupni působí na 6‘-karbobenzoxy-l,3,3“-trisyllcylkanamycin A vzorce lila in šitu nebo po isolaci kyselinou L-y-benzyloxykarbonylamino-ia-hydroxyimáselnou vzorce VI a N-hydroxy-5-norbornen-endo-2,3-dikarboximidem vzorce XIX za míchání a s následujícím přidáním dicyklohexylkarbodiimidu v poměru 1 mol 6*-karbobenzoxy-l,3,3“-trisalicylkanamycinu A vzorce lila na 0,6 až 0,75 mol kyseliny L-y-benzyloxykarbonylamino-a-hydroxymáselné vzorce VI a dicyklohexylkarbodiimidu a 0,06 až 0,375 mol N-hydroxy-5-norbornen-endo-2,3-dikarboximidu vzorce XIX v teplotním rozmezí +25 °C až +35 °C po dobu 15 až 25 hodin ve směsi tetrahydrofuranu a vody v poměru 1:1.It is further preferred that, in a second step, 6'-carbobenzoxy-1,3,3'-trisyllcylkanamycin A of formula IIIa is treated in situ or after isolation with Ly-benzyloxycarbonylamino-β-hydroxybutyric acid of formula VI and N-hydroxy-5-norbornene -endo-2,3-dicarboximide of formula XIX with stirring followed by addition of 1 mole of 6'-carbobenzoxy-1,3,3'-trisalicylkanamycin A of formula IIIa to 0.6 to 0.75 mol of Ly-benzyloxycarbonylamino- α-hydroxybutyric formula VI and dicyclohexylcarbodiimide and 0.06-0.375 mol of N-hydroxy-5-norbornene-endo-2,3-dicarboximide XIX in the temperature range of +25 ° C to +35 ° C for 15 to 25 hours in 1: 1 tetrahydrofuran / water.

Dále je výhodné, když se ve druhém stupni působí na 6‘-karbobenzoxy-l,3,3“-tri-o-hydroxybenzalkanamycin A vzorce Illb in šitu nebo po isolaci kyselinou L-y-benzyloxykarbonylamino-a-hydroxymáselnou vzorce VI a N-hydroxy-5-norbornen-endo-2,3-dikarboximidem vzorce XIX za míchání a s následujícím přidáním dicyklohexylkarbodiimidu v poměru 1 mol 6-karbobenzoxy-l,3,3“-tri-o-hydroxybenzalkanamycinu A vzorce Illb na 0,6 až 0,75 mol kyseliny L-χ-benžyloxykarbonylamino-a-hydroxymáselné vzorce VI a dicyklohexylkarbodiimidu a 0,06 až 0,375 mol N-hydroxy-5-norbornen-endo-2,3-dikarboxamidu vzorce XIX v teplotním rozmezí +20 °C až 30 °C po dobu 15 až 25 hodin ve směsi tetrahydrofurahu a vody v poměru 9 :1.It is further preferred that, in a second step, 6'-carbobenzoxy-1,3,3'-tri-o-hydroxybenzalkanamycin A of formula IIIb is treated in situ or after isolation with Ly-benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybutyric acid of formula VI and N-hydroxy With 5-norbornene-endo-2,3-dicarboximide of formula XIX with stirring and followed by addition of dicyclohexylcarbodiimide in a ratio of 1 mol of 6-carbobenzoxy-1,3,3'-tri-o-hydroxybenzalkanamycin A of formula IIIb to 0.6 to 0, 75 mol of L-χ-benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybutyric acid of formula VI and dicyclohexylcarbodiimide and 0.06 to 0.375 mol of N-hydroxy-5-norbornene-endo-2,3-dicarboxamide of formula XIX in the temperature range +20 ° C to 30 ° C for 15-25 hours in 9: 1 tetrahydrofuran / water.

Sloučenina 1-N- [ L- (—) -y-amino-a-hydroxybutyryl kanamycin A vzorce IV se vyznačuje vynikající antibakteriální účinností, která se jeví být vyšší, než je účinnost samotného kanamycinu А. V následujících dvou tabulkách poměru 1 mol sloučeniny vzorce III na asi 0,5 až 1,0 molů každé ze sloučenin vzorce VI a karbodiimidu, a asi 0,005 až 0,25 mol sloučeniny vzorce XIX v teplotním rozmezí od asi —10 až asi. do +35 stupňů Celsia, ale s výhodou od asi +5°C do asi 25 °C po nejméně 10 hodin v soustavě rozpouštědel, jak jsou popsána ve stupni A, načež se organická rozpouštědla odstraní, a zbytek se hydrogenuje in šitu, jak to zde bylo popsáno výše, za vzniku sloučeniny vzorce IV.The compound 1-N- [L- (-) -. Alpha.-amino-.alpha.-hydroxybutyryl kanamycin A of formula IV exhibits an excellent antibacterial activity which appears to be higher than that of kanamycin A alone. In the following two tables, a ratio of 1 mole of the compound of formula III to about 0.5 to 1.0 moles of each of the compounds of formula VI and carbodiimide, and about 0.005 to 0.25 moles of the compound of formula XIX over a temperature range of about -10 to about. to +35 degrees Celsius, but preferably from about + 5 ° C to about 25 ° C for at least 10 hours in a solvent system as described in step A, after which the organic solvents are removed and the residue is hydrogenated in situ as described hereinabove, to give a compound of formula IV.

Výhodné provedení postupu podle tohoto vynálezu s přihlédnutím к výše uvedené modifikaci zahrnuje použití poměru 1 molu sloučeniny vzorce III na asi 0,5 až 0,85 mol každé ze sloučenin vzorce VI a dicyklohexylkarbodiimidu, a asi 0,05 až 0,425 mol sloučeniny vzorce XIX v rozmezí od +5°C do asi 25 °C po 1 až 3 hodiny v soustavě rozpouštědel, jak je popsána ve stupni A, nebo jinak alternativně použití poměru 1 molu sloučeniny vzorce III na asi 0,5 až 0,8 molů každé ze sloučenin vzorce VI a dicyklohexylkarbodiimidu, a asi 0,05 až 0,425 mol sloučeniny vzorce XIX v rozmezí od +15 °C do +30 °C po 15 až 25 hodin. Nejvýhodnější podmínky představuje poměr 1 molu sloučeniny vzorce III к asi 0,6 až 0,75 mol každé ze sloučenin vzorce VI a dicyklohexylkarbodiimidu a asi 0,06 až 0,375 mol sloučeniny vzorce XIX v rozmezí 20 až 3'0 °C po 15 až 25 hodin.A preferred embodiment of the process of the present invention taking into account the above modification comprises using a ratio of 1 mole of the compound of formula III to about 0.5 to 0.85 mol of each of the compounds of formula VI and dicyclohexylcarbodiimide, and about 0.05 to 0.425 mol of the compound of formula XIX range from + 5 ° C to about 25 ° C for 1 to 3 hours in a solvent system as described in Step A, or alternatively alternatively using a ratio of 1 mole of the compound of Formula III to about 0.5 to 0.8 moles of each compound of formula VI and dicyclohexylcarbodiimide, and about 0.05 to 0.425 moles of the compound of formula XIX in the range of +15 ° C to +30 ° C for 15 to 25 hours. Most preferred conditions are a ratio of 1 mole of the compound of formula III to about 0.6 to 0.75 moles of each of the compounds of formula VI and dicyclohexylcarbodiimide and about 0.06 to 0.375 moles of the compound of formula XIX in the range of 20 to 30 ° C for 15 to 25 hours.

Rovněž tvoří část podle tohoto vynálezu nový a zlepšený způsob přípravy výchozí látky, tedy sloučeniny vzorce IIAlso part of the invention is a new and improved process for the preparation of the starting material, i.e. the compound of formula II

Postup se vyznačuje tím, že se působí na volnou bázi kanamycinu A N-benzyloxykarbonyloxy-5-norbornen-2,3-dikarboximidem v molárním poměru od asi 0,5 do asi 1,5 molů této právě uvedené látky na mol kanamycinu A, nebo zvláště v poměru asi 1:1. Následuje čištění produktu, například extrakcí organickým rozpouštědlem za použití takového rozpouštědla, jako· je n-butylalkohol s následujícím chromatografováním vodné fáze.The process is characterized in that the free base of kanamycin A is treated with N-benzyloxycarbonyloxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide in a molar ratio of from about 0.5 to about 1.5 moles of this substance per mole of kanamycin A, or especially in a ratio of about 1: 1. This is followed by purification of the product, for example by extraction with an organic solvent using a solvent such as n-butyl alcohol followed by aqueous phase chromatography.

Výše uvedená reakce se s výhodou provádí v organickém rozpouštědle, mísitelném s vodou, jako je například směs tetrahydrofuranu a vody, s výhodou o koncentraci tetrahydrofuranu 40 až 60 % v teplotním rozmezí od asi O° do asi 25 °C, nebo s výhodou od asi 5 do asi 10 °C po nejvýše 6 hodin, ale s výhodou po dobu asi 4 hodin.The above reaction is preferably carried out in a water-miscible organic solvent such as a mixture of tetrahydrofuran and water, preferably at a concentration of 40 to 60% tetrahydrofuran in a temperature range of about 0 ° to about 25 ° C, or preferably about 5 to about 10 ° C for up to 6 hours, but preferably for about 4 hours.

Sloučenina vzorce IV, tj. l-N-[L-( — )-y-amino-a-hydroxybutyryl ] kanamycin A (BB-K8] se vyznačuje vynikající antibakteriální účinností, jež se zdá být vyšší, než je účinnost samotného kanamycinu А. V dalších 2 tabulkách jsou uvedeny hodnoty minimální inhibiční koncentrace kanamycinu A a sloučeniny vzorce IV (BB-K8) proti četným gram-positivníím a gram-negativním mikroorganismům, jak byly získány postupem ředění na agaru podle Steers-e (tabulka lj a postupem dvojnásobného ředění (tabulka 2]. Jako prostředí byl použit agar podle Muellera a Hintona při zjišťování ve spojitosti s tabulkou 1, a infusní zápara ze srdce při studiích ve spojitosti s tabulkou 2.The compound of formula IV, i.e. 1N- [L- (-) -y-amino-.alpha.-hydroxybutyryl] kanamycin A (BB-K8), exhibits excellent antibacterial activity which appears to be superior to that of kanamycin A alone. The following 2 tables show the minimum inhibitory concentrations of kanamycin A and the compound of formula IV (BB-K8) against numerous gram-positive and gram-negative microorganisms as obtained by the Steers agar dilution procedure (Table 1j and the double dilution procedure). The medium used was Mueller and Hinton agar for the detection in connection with Table 1, and the infusion of heart from the studies in connection with Table 2.

Tabulka 1 (minimální inhibiční koncentrace mg/ml)Table 1 (minimum inhibitory concentration mg / ml)

Mikroorganismus Microorganism kanamycin A (6-8198] Kanamycin A (6-8198) Sloučenina IV (BB-K8, šarže č. 4) Compound IV (BB-K8, Lot # 4) Alk. faecalis A-9423 Alk. faecalis A-9423 16 16 8 8 A-20648 A-20648 nad 125 nad 125 nad 125 nad 125 . Ent. cloacae A-0656 . Ent. cloacae A-0656 4 4 4 4 Ent. species A-20364 Ent. A-20364 nad 125 nad 125 2 2 Eent. hafniae 1 A-20674 Eent. hafniae 1 A-20674 1 1 1 1 E. coli A-2636 E. coli A-2636 2 2 1 1 A-2066 A-2066 16 16 4 4 A-20665 A-20665 nad 125 nad 125 1 1 A-20507 A-20507 32 32 2 2 A-20520 A-20520 nad 125 nad 125 4 4 A-20365 A-20365 nad 125 nad 125 1 1 A-20684 A-20684 2 2 2 2 A-20682 A-20682 nad 125 nad 125 2 2 A-20683 A-20683 nad 125 nad 125 8 8 A-20681 A-20681 nad 125 nad 125 2 2 A-15119 A-15119 4 4 4 4 K. pneumoniae Α-Ό967 K. pneumoniae Α-Ό967 4 4 4 4 K. species A-20328 K. species A-20328 nad 125 nad 125 2 2 A-20330 A-20330 32 32 32 32 A-20634 A-20634 nad 125 nad 125 4 4 K. pneumoniae A-20680 K. pneumoniae A-20680 nad 125 nad 125 4 4 A-0077 A-0077 1 1 1 1 Pr. mirabilis A-9900 Ex. mirabilis A-9900 2 2 2 2 Pr. morganii A-15-153 Ex. morganii A-15-153 2 2 2 2 vulgaris A-9555 vulgaris A-9555 2 2 1 1 rettgeri A-9636 Rettgeri A-9636 0,25 0.25 0,25 0.25 mirabilis A-20645 mirabilis A-20645 4 4 4 4

Mikroorganismus Microorganism kanamycin A (6-8198) Kanamycin A (6-8198) Sloučenina IV (BB-K8, šarže č. 4) Compound IV (BB-K8, Lot # 4) Alk. faecalis A-9423 Alk. faecalis A-9423 16 16 8 8 A-20648 A-20648 nad 125 nad 125 nad 125 nad 125 Ent. cloacae A-0656 Ent. cloacae A-0656 4 4 4 4 species A-20364 A-20364 nad 125 nad 125 2 2 hafniae 1 A-20674 hafniae 1 A-20674 1 1 1 1 E. coli A-0636 E. coli A-0636 2 2 1 1 A-20664 A-20664 16 16 4 4 A-20665 A-20665 nad 125 nad 125 1 1 A-20507 A-20507 32 32 2 2 A-20520 A-20520 nad 125 nad 125 4 4 A-20365 A-20365 nad 125 nad 125 1 1 A-20684 A-20684 2 2 2 2 A-20682 A-20682 nad 125 nad 125 2 2 A-20683 A-20683 nad 125 nad 125 8 8 A-20681 A-20681 nad 125 nad 125 2 2 A-15119 A-15119 4 4 4 4 K. pneumoniae A-0967 K. pneumoniae A-0967 4 4 4 4 species A-20328 species A-20328 nad 125 nad 125 2 2 A-20330 A-20330 32 32 32 32 A-20634 A-20634 nad 125 nad 125 4 4 K. pneumoniae A-20680 K. pneumoniae A-20680 nad 125 nad 125 4 4 A-0077 A-0077 1 1 1 1 Pr. mirabilis A-9900 Ex. mirabilis A-9900 2 2 2 2 morganii A-15153 morganii A-15153 2 2 2 2 vulgarls A-9555 Vulgarls A-9555 2 2 1 1 rettgeri A-9636 Rettgeri A-9636 0,25 0.25 0,25 0.25 mirabilis A-20645 mirabilis A-20645 4 4 4 4 Pr. mirabilis A-20454 Ex. mirabilis A-20454 2 2 2 2 Providencia stuartii A-20615 Providencia stuartii A-20615 2 2 1 1 alkalifaciens A-20676 alkalifaciens A-20676 1 1 1 1 Ps. aeruginosa A-20229 Ps. aeruginosa A-20229 32 32 2 2 A-0943A A-0943A 125 125 16 16 A-20653 A-20653 nad 125 nad 125 32 32 species A-20601 species A-20601 125, 63 125, 63 16 16 A-20621 A-20621 nad 125 nad 125 nad 125 nad 125 maltophilia A-20620 maltophilia A-20620 32 32 nad 125 nad 125 Sal. enteritidis A-0531 Hall. Enteritidis A-0531 1 1 0,5 0.5 derby A-20087 derby A-20087 nad 125 nad 125 1 1 Ser. marcescens A-20019 Ser. marcensens A-20019 2 2 4 4 A-9933 A-9933 4 4 8 8 A-20460 A-20460 nad 125 nad 125 4,2 4.2 A-20459 A-20459 4 4 16 16 Shig. flexneri A-9684 Shig. A-9684 flexners 4 4 4 4 Aeromonas A-20670 Aeromonas A-20670 2 2 2 2 Arizona s|p. A-20671 Arizona s | p. A-20671 2 2 1 1 Cltrobacter sp. A-20673 Cltrobacter sp. A-20673 4 4 4 4 Edwardsiella sp. A-20678 Edwardsiella sp. A-20678 4 4 4 4 Staph. aureus A-9606 Staph. Aureus A-9606 1 1 1 1 A-4749 A-4749 0,5 0.5 1 1 A-9537 A-9537 2 2 1 1 A-20'610 A-20'610 nad 125 nad 125 2 2 A-20240 A-20240 nad 125 nad 125 8 8 A-15197 A-15197 1 1 2 2

Prostředí Mueller-Hinton + 4% ovčí krveMueller-Hinton + 4% sheep blood

Str. faecalis A-9854 Str. faecalis A-9854 63 63 63 63 A-9575 A-9575 125 125 nad over 125 125 Str. pyogenes A-20200 Str. pyogenes A-20200 32, 16 32, 16 32 32 A-9604 A-9604 125 125 125 125 A-15040 A-15040 125 125 125 125 A-20Q65 A-20Q65 125 125 125 125 D. pneumoniae A-9585 D. pneumoniae A-9585 63, 32 63, 32 63 63 A-20159 A-20159 125 125 nad over 125 125

Tabulka 2 minimální inhibiční koncentrace (mg/ml)Table 2 Minimum inhibitory concentration (mg / ml)

Organismus Organism kanamycin A (6-8196) Kanamycin A (6-8196) sloučenina IV (BB-K8 šarže č. 4] Compound IV (BB-K8 Lot # 4) D. pneumoniae +5% séra D. pneumoniae + 5% serum A-0585 A-0585 63 63 63 63 Str. pyrogenes - r5°% séra Str. pyrogenes - r5% serum A-9604 A-9604 125 125 125 125 Staph. aureus Smith A-9537 Staph. Aureus Smith A-9537 0,5 0.5 0,5 0.5 A-9497 A-9497 0,5 0.5 0,5 0.5 A-20239 A-20239 125 125 4 4 A-20240 A-20240 125 125 4 4 Enter. cloa-cae A-0656 Enter. cloa-cae A-0656 2 2 2 2 species A-20364 A-20364 125 125 2 2 K. pneumoniae A-9867 K. pneumoniae A-9867 2 2 4 4 E. coli K-12 ML1410 A-20361 E. coli K-12 ML1410 A-20361 2 2 4 4 K-12 ML1630 A-20363 K-12 ML1630 A-20363 125 125 2 2 K-12 A-9632 K-12 and 9632 2 2 1 1 A-20664 A-20664 32 32 8 8 A-20665 A-20665 125 125 8 8 Pr. mirabilis A-9900 Ex. mirabilis A-9900 2 2 16 16 morganii A-15153 morganii A-15153 4 4 16 16 vulgaris A-9436 vulgaris A-9436 1 1 2 2 Ps. aeruginosa A-20227 Ps. aeruginosa A-20227 4 4 1 1 species A-20499 species A-20499 63 63 • 4 • 4 aeruginisa A-20653 Aeruginisa A-20653 125 125 4 4 aeruginosa A-20653 - . aeruginosa A-20653-. 125 125 125 125 Ser. marcescens A-20019 Ser. marcensens A-20019 2 2 4 4 A-20141 A-20141 16 16 16 16

Z výše uvedených údajů o hodnotách minimální inhibiční koncentrace je patrné, že sloučenina vzorce IV (PB-K8) se vyznačuje výhodnějšími vlastnostmi se - zřetelém na účinnost, pež kahamyčip A, zvláště v případě organismů, řesistentních na kanamycin a: ?-'.·· - : ·..· ZFrom the above data on the minimum inhibitory concentration values, it can be seen that the compound of formula IV (PB-K8) has more advantageous properties with respect to efficacy, kahamycin A, especially for kanamycin-resistant organisms and:? · - : ·..· OF

Hodnoty minimálních íňhibičních ' koncentrací lže rovněž dobře - porovnat s výsledky in vivo pro všechny 3 organismy, pa něž - byl testován kanamycin a sloučenina vzorče iV.The values of the minimum inhibitory concentrations can also be compared well with the in vivo results for all 3 organisms of which kanamycin and the compound of formula IV were tested.

Sloučenina IV a kanamycin A jsou rův^ něž stejně účinné při infekcích - - myší, způsobených kmeny E ' coli A-15119 a Staph. aureus A-9537, senšitivními na kanamycinCompound IV and kanamycin A are also equally effective in infections in mice caused by strains E 'coli A-15119 and Staph. aureus A-9537, sennitive to kanamycin

A. - Ačkoliv z hodnot CDso (léčivá dávka pro 50% smrtelně infikovaných myší) se dá odvodit, že sloučenina vzorce IV je poněkud méně účinná- ve- - srovnání - s - kanamycineim A, nemá -tento malý rozdíl - zřejmě - vůbec důležitost, - - protože· - hladiny - dávek - - byly značně zředěné - - (pětinásobné ředění). .A. - Although the CD 50 values (therapeutic dose for 50% fatally infected mice) indicate that the compound of formula IV is somewhat less potent - compared to - kanamycineim A, this has little difference - apparently - at all important - - because - - dose levels - - were significantly diluted - - (5-fold dilution). .

. Proti kmenům ,E. coli A-20520, resistentním na kanamycin, není příliš - při testech in - vivo kanamycin A účinný — jak se dalo předpokládat — zatím co u sloučeniny vzorce IV se jeví zřetelný ochranný účinek. Sloučenina vzorce IV je asi desetkrát účinnější proti kmenům E. coli při podávám čtyřdenním režimem, než dvoudenním.. Against Tribes, E. kanamycin-resistant coli A-20520 is not very effective - as could be expected - in the in vivo in vivo tests - while the compound of formula IV appears to have a clear protective effect. The compound of formula IV is about ten times more potent against E. coli strains when administered on a four-day regimen than a two-day regimen.

Srovnání účinností sloučeniny vzorce IV a kanamycinu A in vitro a in vivoComparison of in vitro and in vivo efficacy of the compound of formula IV and kanamycin A

Látka Substance Počet Number Staphylococcus Staphylococcus Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli testů tests aureus A-9537 Aureus A-9537 A-15119 A-15119 A-20520 A-20520 MIC - CDso^b MIC - CD 50 ^b MIC BALL CDso CD 50 MIC CDso MIC CD 50 Sloučenina Compound vzorce IV of formula IV 1 1 1 2,0 . 2 1 2,0. 2 2 2 2.2 2.2 2 66 . 2 2 66. 2 2 2 ___c ___ ___c ___ — - — . -. — 5 . 4 - 5. 4 Kanamycin A Kanamycin A 1 1 2 0,5 . 2 2 0,5. 2 4 4 4 . 2 4. 2 125 200 , 2 125 200, 2 2 2 — — - - — - — - — 200 . 4 - 200. 4 MIC = minimální MIC = minimum inhibiční koncentrace (ug/ml). inhibitory concentration (µg / ml). Testy byly provedeny, jak to popisuje The tests were performed as described

Chísholm a spol., Antimicrob. Agents and Ghemotherapy, - 1929, str. 244 (1970). Použité prostředí: -agar Mueller-Hinten bCDso — léčivá dávka (dosis curativa), 50 % (mg/kg při použití násobeno počtem použití). Myším se podává za 1 a 4 hodiny po infikování subkutánně při dvou podáních, a za 0, 2, 4 a 6 hodin po infikování při čtyřech podáních. Jinak byly testy provedeny, jak to popisují Price a spol., J. of Antiblotics, 22, 1 (1969).Chisholm et al., Antimicrob. Agents and Ghemotherapy, 1929, p. 244 (1970). Environment used: -agar Mueller-Hinten bCD 50 - dosis curativa drug dose, 50% (mg / kg in use multiplied by the number of uses). Mice are administered 1 and 4 hours post-infection subcutaneously at two administrations, and at 0, 2, 4 and 6 hours post-infection at four administrations. Otherwise, assays were performed as described by Price et al., J. of Antiblotics, 22, 1 (1969).

^c = netestováno ^c = not tested

Sloučenina vzorce IV je cennou látkou jako antibakteriální činidlo, výživná přísada do krmivá pro zvířata, therapeuticky použitelná látka pro - drůbež, zvířata i lidi, a zvláště se hodí k léčbě infekčních onemocnění, způsobených gram-negatlvními i grampositivními mikroorganismy.The compound of formula IV is a valuable substance as an antibacterial agent, an animal nutritional additive, a therapeutically useful substance for poultry, animals and humans, and is particularly useful for the treatment of infectious diseases caused by both gram-negative and gram-positive microorganisms.

Při orálním podávání se hodí sloučenina vzorce IV Jako pomocný prostředek při předoperativním sterilisování střevního· traktu. V tlustém střevě tím dojde k omezení růstu . jak aerobní, tak anaerobní flory, · pokud je citlivá na tuto látku. Ve spojení s ·' dostačujícím mechanickým třením je tato látka vhodná k přípravě a úpravě lékařského náčiní.For oral administration, the compound of formula IV is useful as an adjuvant in preoperative sterilization of the intestinal tract. This will reduce growth in the large intestine. both aerobic and anaerobic flora, if sensitive to the substance. In conjunction with sufficient mechanical friction, it is suitable for the preparation and conditioning of medical devices.

Při podávání lidem je sloučenina vzorce IV účinná při bakteriálních infekcích za parenterálního podávání v dávkovacím rozsahu od asi 250 mg až asi 3000 mg denně za rozdělení této dávky na 3 až 4 denně. Obvykle se sloučenina vyznačuje účinností při ' podávání každých 12 hodin v dávce asi 5,0 až 7,5 mg na kg hmotnosti těla.When administered to humans, the compound of formula IV is effective in bacterial infections with parenteral administration in a dosage range of from about 250 mg to about 3000 mg per day, divided into 3 to 4 times per day. Typically, the compound is effective every 12 hours at a dose of about 5.0 to 7.5 mg per kg body weight.

Popis vhodných provedeníDescription of suitable embodiments

Příklad 1 'Example 1 '

Anhydrid kyseliny 5-norbornen-endo-2,3-dikarboxylové (XVIII)5-Norbornene-endo-2,3-dicarboxylic acid anhydride (XVIII)

Postupuje se podle . údajů O. Díelse a K. Aldera, Ann, Chem. 460, 98 (1928). . Do . míchané suspénse 98,1 . g . (1 . mol) . anhydriďu kyseliny maleinové. v ' 500. ml. suchého' . .benzenu se ' . přidává . po' kapkách za ' chlazení' '66,1 gramu '.'('1· ..mol j:' cyklopentadienu; za_: míofiá.· ríí se z .' reakční směsi.vyloučí,krystalická sraženina, ' jež ' sé odsaje 'a krysťalisací..'zě směsi. ligroinu . (což . je. v .podštatě.· .. n-hekán) aibénzenu.. 1:1. . .se Získá .116 g ' (.71%). 'áioučeniny, jejíž složení.' Je uvedeno 'Vházvu, b. t, 164 áž: ’166.°C .. (literatura ' uvádí; 194 až; 1..6.5.¹° celsia);''. z;;; 0'·Proceed according to. data from O. Diels and K. Alder, Ann, Chem. 460, 98 (1928). . Do. mixed slurry with 98.1. g. (1 mol). maleic anhydride. in '500. ml. dry '. 'benzene se'. adds. after 'dropwise under cooling position '66 1 gram.''(' 1 · j ..mol 'cyclopentadiene; _for: míofiá. · RII z.' směsi.vyloučí reaction, a crystalline precipitate, 'which' is aspirated and crystallization from a mixture of ligroin (which is essentially n-hecan) and aibenzene 1: 1 to give 116 g (71%) of the compound. whose composition. "It is stated 'Vházvu, b. p. 164 to' 166 ° C .. (literature 'states; 194 DEG; 1..6.5. ¹ DEG C.).''from0;;;'·

PMÍkaď2' '0PM2 '' 0

N-hydroxy;5-norbornen-endo-2.3- ' 'N-hydroxy; 5-norbornene-endo-2,3-

-dikarboximid . ·. .·. .. .. ·.··.·:-dicarboximide. ·. . ·. .. .. ·. ··. ·:

Příprava . se provádí podle postupu L. Bauera a S. . V. . Miarky, J. Org. Chem. .24, 1293 . (1959). 115 g (0,7 molu) . výše uvedeného norbornenového anhydridu (XVIII) se přidá do roztoku hydroxylaminu, připraveného přidáním 47,5 g (0,45 mol) uhličitanu sodného do roztoku 60,5 ' g (0,87 mol) hydrochloridu hydroxylaminu . v 140 ml . vody, a reakční směs se zahřívá hodinu na 60 až 70° Celsia, načež se ponechá stát v ledničce přes noc. Krystaly, které . se tím vyloučí, se odsají, promyjí se za použití 120 ml vychlazeného 5 N roztoku kyseliny . chlorovodíko- . vé, a sušením se získá 84,9 g .(70%) ' sloučeniny vzorce XIX, b. t. 172 °C. Matečný louh· . se okyselí na pH 2 a extrahuje se chlorof.or- .Preparation. is carried out according to the procedure of L. Bauer and S.. V.. Miarky, J. Org. Chem. 24, 1293. (1959). 115 g (0.7 mol). of the above norbornene anhydride (XVIII) is added to a hydroxylamine solution prepared by adding 47.5 g (0.45 mol) of sodium carbonate to a solution of 60.5 g (0.87 mol) of hydroxylamine hydrochloride. in 140 ml. water, and the reaction mixture was heated at 60-70 ° C for 1 hour, then allowed to stand in the refrigerator overnight. Crystals that. The precipitate was filtered off with suction, washed with 120 ml of cold 5 N acid solution. hydrochloride-. and dried to give 84.9 g (70%) of the compound of formula XIX, mp 172 ° C. Mother liquor. The mixture was acidified to pH 2 and extracted with chloroform.

mem (deset podílů po 70 ml). Zahuštěním chloroformového extraktu se získá druhý podíl sloučeniny vzorce XIX (7,2 g, 6%), b. t. 170 až 172 °C. .mem (ten 70 ml portions). Concentration of the chloroform extract gave a second crop of compound of Formula XIX (7.2 g, 6%), mp 170-172 ° C. .

P ř í k I a d . '3 ..... .........Example I d. '3 ..... .........

N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dikarboximidový . ester kyseliny L-y-benzyloxykarbonylamino-a-hydroxymáselné (XX)N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide. L-γ-Benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybutyric acid ester (XX)

Za teploty 10 °C se přidá 2,06 5 (0,01 mol) diιcykl·ohexylkarbodnmidu do míchaného roztoku 2,53 g (0,01 mol) kyseliny L-y-benzyloxykarbonylamino-a-hydroxyináselné . a 1,79 g (0,01 mol sloučeniny-vzorce 'XIX v 50 ml suchého 'tetrahydrofuranu. Reakční směs se míchá za teiploty místnosti přes noc, vysrážená dicyklohexylmočovina se odsaje, promyje se tetrahydrofuranem, filtrát . .a ' podíly z promývání se spojí, . a zahuštěním ' ve vakuu se získá 4,5 g olejovitého zbytku,· a z toho na koloně se silikageleh za použití ' ethylesteru kyseliny octové k' eluování se dále získá 4,0 g (96%) aktivního esteru XX ýe formě bezbarvého oleije. infračervené ' spektrum: 3300, 1820, 1780, 1735, '1720, ' 1695 . om¹. NMR-spektrum v CDCI3 + ''1 . kapka DaO: S (v ppm) 1,63 (2 H, q, J = 9 ' Hz), 2,15 (2H, m), 3,40 (6H, m), 4,60 (1H, d-d, J ' = 7 a 5 Hz), 5,13 (2Ή, s), 6,20 (2H, široký pás), 7,40 (5H, s).At 10 ° C, 2.06 5 (0.01 mol) of di-cyclohexylcarbodide is added to a stirred solution of 2.53 g (0.01 mol) of Ly-benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybutyric acid. and 1.79 g (0.01 mol of compound of formula 'XIX') in 50 ml of dry tetrahydrofuran. The reaction mixture is stirred at room temperature overnight, the precipitated dicyclohexylurea is filtered off with suction, washed with tetrahydrofuran, the filtrate and washings. The combined and concentrated in vacuo yielded 4.5 g of an oily residue, of which silica gel was eluted with ethyl acetate to elute to give 4.0 g (96%) of the active ester XX as a colorless solid. Olei. infrared 'spectrum: 3300, 1820, 1780, 1735,' 1720, 'the 1695th om ^{the first} NMR spectrum in CDCl3 +' first drop DAO: S (ppm) 1.63 (2H, q, J = 9 Hz, 2.15 (2H, m), 3.40 (6H, m), 4.60 (1H, dd, J '= 7 and 5 Hz), 5.13 (2 (, s) 6.20 (2H, broad band) 7.40 (5H, s).

Př ík1 a'd ' 4 .·. . - .·' ..·. · j.;Example 1 a'd '4. ·. . -. · J .;

N-bpnzylpχykarbonylóxy-5snorboгnen· ·. ' · . .•+_Í3-dikarboximid'' (XVII) .+ -:·_;·-ίN-benzylpentocarbonyloxy-5-sulfonene · ·. '·. . • + _I 3-dicarboximide '(XVII). + - _·; · -Ί

K ' míchanému roztoku 2,64 g (0,066 mol) hydr oxidu .sodného v .50 mú. .vody. se - přidá za chlazení na 10 . °C .3,58 . g (0,02 'mol) N-hydroxy-5.morb0rnen-ž.2-dlkarbdximiidu.· XIX, . a ' k získanému . roztoku· . se.· přikapává -.během.'. .4.0 minut za .teploty- ..Ó-.-až'.5'°C 6,82 .g .'(0,04 .mol) begz:^Í^.Ójxý^k^a*lbmýic^^<oH.. načež ' se . .·. reakč· mícháá+ďiny za teploty místnosti. Přidáním 20 .ml n-hexanu .se z 'reakční . směsi vysráží pevný podíl, který se odfiltruje .a suší ' na ' vzduchu. . Krystaliza.cí . surového. ' produktu ze směsi benzenu a n-hexanu se získá., 5,1 g. (81 %) bezbarvých prismat látky XVII, b:· t. ' 121' až 122 °C. Infračervené spektrum. (V KBrj: 1810, 1780, 1740, 1630 cm’¹. NMRspektrum (v acetonu-de): 8 (v ppm): 1,66 (2H, široký s), 2,45 (4H, m), 5,37 (2H, s), 6,12 (2H, t, J = 1,5 Hz), 7,48 (5H, s).To a stirred solution of 2.64 g (0.066 mol) of sodium hydride in 50 molar. .water. add - with cooling to 10. ° C, 3.58. g (0.02 mol) of N-hydroxy-5-morpholin-2-ylcarboxime. and 'to the obtained. solution ·. is added dropwise during the process. 6.8 minutes at 0 DEG C. to 6.82 DEG C. (0.04 mol), and the reaction was carried out at 0 DEG C. for 5 minutes. oH .. then. . ·. the reaction is stirred at room temperature. 20 ml of n-hexane were added to the reaction. the solid precipitates, which is filtered off and air-dried. . Krystaliza.cí. raw. The product from a mixture of benzene and n-hexane is obtained, 5.1 g (81%) of colorless prisms of compound XVII, mp: 121-122 ° C. Infrared spectrum. (KBr): 1810, 1780, 1740, 1630 cm @ ^-1 . NMR spectrum (in acetone): .delta. (Ppm): 1.66 (2H, broad s), 2.45 (4H, m), 5, 37 (2H, s), 6.12 (2H, t, J = 1.5Hz), 7.48 (5H, s).

Analysa:Analysis:

pro C17H15NO5 vypočteno:Calcd for C17H15NO5:

·. ' '65,17 <% ' C, ' 4,83' % . H, 4,47 % N ^! nalezeno:' ' .··' .·. 65.17 ° C, 4.83%. H, 4.47% N ^! found: ''. ·· '.

,, .6'5,50 ' % ' .C, 4,73%o H, 4,44% 'NH, 4.73%; H, 4.44%;

Příklad 5Example 5

6‘-N-benzyloxykarbonylkanamycin A (II)6‘-N-Benzyloxycarbonylkanamycin A (II)

K míchanému roztoku 4,84 g (0,01 mol] volné báze kanamycinu A v 50 ml 50% - vodného tetrahydrofuranu se přidává v několika dávkách během hodiny za teploty 7 'C 3,14 g ' (0,01 mol] sloučeniny vzorce XVII. Reakční směs se dále míchá - 4 hodiny, načež se zahuštěním ve vakuu oddestiluje rozpouštědlo, zbylý vodný roztok se zředí přidáním 150 ml vody a vše se extrahuje dvěma dávkami po 10.0 ml butanolu, nasyceného vodou. Vrstva butanolu se promyje za použití 100 ml vody, a zahuštěním ve vakuu se získá 1,78 g poly-6‘-N-benzyloxykarbonylkanamycinu A. Vodný podíl, jakož i podíly z promývání se spojí, a zahuštěním ve vakuu asi na 50 ml se získá vodný roztok, který se pustí kolonou iontoměničové pryskyřice CG-50- (amoniový cyklus, 140 ' ml), a kolona se postupně vyvíjí za použití 200 ml vody, 1,9 litru 0,05 N vodného roztoku amoniaku, 1,9 litru 0,1 N vodného roztoku amoniaku, a posléze litru 0,3 N vodného roztoku amoniaku. Podíly z eluování se jímají ve formě frakcí po- 20 ml, a rozdělí se na 2 části se zřetelem na hodnoty Rf při chromatografování na tenké vrstvě (S-114, 6‘-N-benzylo·xyУka'bonylkanamycin A, Rf 0,23 a kanamycin, Rf 0,07). Každý z těchto dvou sloučených podílů se zahustí ve vakuu, a zbytek se suší rovněž ve vakuu nad kysličníkem fosforečným.To a stirred solution of 4.84 g (0.01 mol) of kanamycin A free base in 50 ml of 50% aqueous tetrahydrofuran was added in several portions over an hour at 7 ° C 3.14 g (0.01 mol) of the compound of formula XVII. The reaction mixture was further stirred for 4 hours, then the solvent was distilled off in vacuo, the residual aqueous solution was diluted with 150 ml of water and extracted with two portions of 10.0 ml of water-saturated butanol each. water, and concentrated in vacuo to give 1.78 g of poly-6'-N-benzyloxycarbonylcanamycin A. The aqueous and washings were combined and concentrated in vacuo to about 50 mL to give an aqueous solution which was passed through the column. ion exchange resins CG-50- (ammonium cycle, 140 ml), and the column is progressively developed using 200 ml of water, 1.9 liters of 0.05 N aqueous ammonia, 1.9 liters of 0.1 N aqueous ammonia, and then a liter of 0.3 N aqueous ammonia solution Fractions of elution are collected in fractions of 20 ml each and are divided into 2 parts with respect to the Rf values in thin layer chromatography (S-114, 6'-N-benzyloxycarbonylkanamycin A, Rf0, 23 and kanamycin, Rf 0.07). Each of the two combined portions was concentrated in vacuo, and the residue was dried in vacuo over phosphorus pentoxide.

Frakce celková Total fraction Dílčí frakce ve zkumavce č. Sub-fraction in tube no. eluováno eluted množství g quantity g Totožnost Identity 1 1 106-144 106-144 0,1 N vodný NHs 0.1 N aqueous NH 3 3,44 (56 %) 3.44 (56%) 6‘-N-benzyloxykarbonylkanamycin A 6‘-N-Benzyloxycarbonylkanamycin A 2 2 203-212 203-212 0,3 N vodný NHó 0.3 N aqueous NH 6 0,54 (11 %) 0.54 (11%) regenerovaný kanamycin . regenerated kanamycin.

Takto připravený 6‘-N-benzyloxykarbonylkanamycin A (II) je velmi čistý a homogenní, jak bylo zjištěno chromatografováním na tenké vrstvě sillkagelu. - B. t. 217 až 219 °C. Fysikálně-chemické vlastnosti jsou totožné s- vlastnostmi autentického vzorku.The 6‘-N-benzyloxycarbonylkanamycin A (II) thus prepared is very pure and homogeneous as determined by thin layer chromatography on sillkagel. Mp 217-219 ° C. The physico-chemical properties are identical to those of the authentic sample.

Příklad 6Example 6

1-N- [ L- (—) -ý-amino-ca-hydr oxybutyryl ] kanamycin A (BB-K8, IV); příprava přes Schiffovu bázi s benzaldehydem1-N- [L- (-) -. Alpha.-amino-.alpha.-hydroxybutyryl] kanamycin A (BB-K8, IV); preparation via Schiff base with benzaldehyde

K - míchanému roztoku 6,19 g (0,01 mol] 6‘-N-benzyloxykarbonylkanamycinu . A (II) ' v 50 ml ' 50% vodného- tetrahydrofuranu . se přidají 3 ml (0,03 mol) benzaldehydu, reakční směs se míchá 3 hodiny za teploty místnosti, ochladí se na 5°C, - a přidá se k ní roztok 4 g (0,01 m-ol) sloučeniny vzorce XX v 50 ml tetrahydrofuranu, načež se reakční směs míchá hodinu při 5 °C, její pH se upraví přidáním 6 N roztoku kyseliny Chlorovodíkové na hodnotu 2, reakční směs se -míchá další hodinu za teploty místnosti, načež se organické rozpouštědlo oddestilu je za sníženého tlaku. Získaný vodný roztok se protřepá dvěma podíly po 20 ml methylenchloridu, pH se upraví přidáním 10% vodného roztoku amoniaku na - hodnotu 4, a po přidání 1,25 g 10% palladia na uhlí se roztok hydrogenuje přes noc za atmosférického - tlaku a -za teploty místnosti. Katalyzátor se odfiltruje, promyje se za použití 20 ml vody, filtrát se spojí s podíly z promývání,' - hodnota pH se upraví na 8 přidáním 10% vodného roztoku amoniaku, a roztok se prolije kolonou pryskyřice CG-50 (amoniový cyklus, 200 ml) načež se kolona - eluuje za použití 400 ml vody, 1,2 litrů 0,1 N roztoku amoniaku, 2,06 litrů 0,3 N roztoku amoniaku, 0,92 litru 0,5 - N roztoku amoniaku a posléze 1,2 litru 1,0 N roztoku amoniaku. Podíly z eluování se jímají po 20 ml, a spojí se podle hodnot Rf při chromatografování na tenké vrstvě silikagelu (S-110, vyvolávání ninhydrinem), a testy na - Petriho miskách za použití B. s-ubtilis PCI 219 a P. aeruginosa A 9343. Každá ze sloučených frakcí se zahustí ve vakuu a suší se dále lyofilizováním.To a stirred solution of 6.19 g (0.01 mol) of 6'-N-benzyloxycarbonylkanamycin A (II) in 50 ml of 50% aqueous tetrahydrofuran was added 3 ml (0.03 mol) of benzaldehyde, reaction mixture. A solution of 4 g (0.01 m-ol) of the compound of formula XX in 50 ml of tetrahydrofuran was added thereto, followed by stirring at 5 ° C for 1 hour. The reaction mixture was stirred at room temperature for an additional hour, then the organic solvent was distilled off under reduced pressure, and the resulting aqueous solution was shaken with two 20 ml portions of methylene chloride. The solution is adjusted to 4 with 10% aqueous ammonia solution and, after addition of 1.25 g of 10% palladium on carbon, the solution is hydrogenated overnight at atmospheric pressure and at room temperature. , the filtrate is combined with the fractions of wash, adjust the pH to 8 by adding 10% aqueous ammonia solution, and pour the solution through a CG-50 resin column (ammonium cycle, 200 mL), then elute the column using 400 mL of water, 1.2 L, 1 N ammonia solution, 2.06 liters of 0.3 N ammonia solution, 0.92 liters of 0.5 N ammonia solution and then 1.2 liters of 1.0 N ammonia solution. Elution aliquots were collected in 20 ml portions and pooled according to Rf values on silica gel thin layer chromatography (S-110, ninhydrin induction), and Petri dishes using B. s-ubtilis PCI 219 and P. aeruginosa A 9343. Each of the combined fractions was concentrated in vacuo and further freeze dried.

Frakce Fractions Zkumavka č. Test tube no. Koncentrace NH3 při eluování NH 3 concentration when eluting váha/výtěžek weight / yield bio-výtěžek bio-yield identifikace identification 1 1 90-99 90-99 0,3 N 0.3 N 1603 mg (33 · %') 1603 mg (33 ·% ') 1490 mg (30.0/0)1 1490 mg (30.0 / 0) regenerovaný kanamycin regenerated kanamycin 2 2 152-161 152-161 0,3 N 0.3 N 483 mg (8%) 482 mg (8%) BB-K29 BB-K29 3 3 162-169 162-169 0,3 N 0.3 N 376 mg (6 %) 376 mg (6%) 196 mg (3 %')2 196 mg (3% ') 2 BB-K29 + BB-K8 BB-K29 + BB-K8 4 4 170-197 170-197 0,3-6,5 N 0.3-6.5 N 1877 mg (30 ·%) 1877 mg (30 ·%) 1350 mg (23 %)2 1350 mg (23%) BB-K8 2 BB-K11 BB-K8 2 5 5 198-203 198-203 0,5 N 0.5 N 100 mg (2 %) 100 mg (1%) BB-K11 BB-K11 6 6 238-257 238-257 1,0 N 1.0 N 146 mg (2 %) 145 mg (2%) diacylovaná sloučenina a diacylated compound

pozn.:note:

¹ testováno na B. subtilis PCI 219 testováno na K. pneumoniae A 20680, sensitivní na BB-K8 s vysokou resistencí na kana- mycin, BB-K11 a BB-K29. · ¹ tested for B. subtilis PCI 219 tested for K. pneumoniae A 20680, BB-K8 sensitive with high resistance to canamycin, BB-K11 and BB-K29. ·

Frakce 4 (1,877 g) se rozpustí v 10 ml iontů zbavené vody, pH tohoto roztoku se upraví na hodnotu 6 přidáním 10% roztoku chlorovodíku, roztok se adsorbuje na koloně iontoměniče CG-50 (amoniový cyklus, 15 ml), jež se eluuje za použití 100 ml X X 0,3 N roztoku amoniaku a 200 ml 0,5 N roztoku amoniaku. Eluát se jímá ve formě frakcí po 20 ml,, přičemž zkumavky 6, a dále 8 až 17 dávají positivní reakci s ninhydrinem. Obsah zkumavek 8 až 17 se spojí, a celek se zahustí ve Vakuu na objem asi 1 mililitr, ke koncentrátu se přidají 3 ml me thylalkoholu, a po filtraci se filtr promyje za použití 0,5 , ml 75% vodného msthanolu. Filtrát a podíly ' z promývání se spojí a po zředění přidáním 10 ml methylalkoholu se· reakční směs ponechá stát přes noc za teploty místnosti. Amorfní sraženina, jež se vyloučí, · se odfiltruje, filtrát se očkuje, a získají se tím bezbarvé krystaly látky IV, jež je totožná s autentickým vzorkem. Zahuštěním filtrátu ve vakuu se · získá zbytek, který se lyofilizuje, přičemž výtěžky a testy, provedené u každého podílu, jsou uvedeny v následující tabulce.Fraction 4 (1.877 g) was dissolved in 10 ml of deionized ions, the pH of this solution was adjusted to 6 by addition of 10% hydrogen chloride solution, and the solution was adsorbed on a CG-50 ion exchange column (ammonium cycle, 15 ml). use 100 ml XX 0.3 N ammonia solution and 200 ml 0.5 N ammonia solution. The eluate was collected as 20 ml fractions, with tubes 6, and 8 to 17 giving a positive reaction with ninhydrin. The contents of tubes 8-17 are combined, and the whole is concentrated in vacuo to a volume of about 1 mL, 3 mL of methyl alcohol is added to the concentrate, and after filtration the filter is washed with 0.5 mL of 75% aqueous methanol. The filtrate and washings were combined and, after dilution with 10 ml of methanol, allowed to stand overnight at room temperature. The amorphous precipitate that precipitates is filtered off, the filtrate is seeded to give colorless crystals of compound IV, which is identical to the authentic sample. Concentration of the filtrate in vacuo afforded a residue which was lyophilized, the yields and tests for each run being shown in the following table.

MnožstvíAmount

Test .Test.

IVIV

B. subtilis B. subtilis K. pneumoniae TO. pneumoniae B. , subtilis B., subtilis K. pneumoniae TO. pneumoniae amorfní prášek amorphous powder 70 mg 70 mg 737 μ/mg 737 μ / mg 927 μ/mg. 927 μ / mg. 0,9 % 0.9% 1,1 % 1.1% krystaly crystals 1093 mg 1093 mg 1163 μ/mg 1163 μ / mg 1087 μ/mg 1087 μ / mg 19 % 19% 19 % 19% lyofilizovaný prášek lyophilized powder 180 mg 180 mg 6018 μ/mg 6018 μ / mg 504 μ/mg 504 μ / mg 1,9 % 1.9% 1,6% 1,6%

Příklad 7Example 7

Příprava L-(—)-y-benzyloxykarbonylamino-α-hydroxymáselné kyseliny (VI)Preparation of L - (-) - γ-benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybutyric acid (VI)

Do roztoku 5,2 g (0,13 mol) hydroxidu sodného v 50 mí vody se přidá 7,4 g (0,062 mol) kyseliny L-( — j-y-amino-a-hydroxymáselné, a do tako připraveného roztoku se za míchání přikapává během 30 minut za chlazení na 0 až 5 °C 11,7 g (0,068 mol) karbobenzoxychloridu, načež se reakční směs za téže teploty míchá ještě hodinu. Dále se reakční směs protřepe s etherem (50 ml), její pH se upraví na hodnotu 2 přidáním zředěného roztoku kyseliny chlorovodíkové, a vše se extrahuje čtyřmi dávkami po 80 ml etheru. Roztoky v etheru se spojí, promyjí se malým množstvím nasyceného roztoku chloridu sodného, a po vysušení bezvodým síranem sodným a filtraci se filtrát zahustí ve vakuu. Získaný zbytek se krystaluje z benzenu; získá se tím 11,6 g (74%) bezbarvých destiček o b. t. 78,5 až 79,5 ‘C, []d — 4,5° (c = 2, methanol). Infračervené sipekkrum (v KBr): u/C—O 1740, 1690 cm’¹. NMR-spektrum (aceton-de) 5 (v ppm na tetramethylsilan): 2,0 (2H, m), 3,29 (2H, d-d, J = 6,7, a 12 Hz), 4,16 (1H, d-d, J = 4,5 a 8 Hz), 4,99 (2H, s), 6,2 (2H, široký pás), 7,21 (5H, s)To a solution of 5.2 g (0.13 mol) of sodium hydroxide in 50 ml of water was added 7.4 g (0.062 mol) of L- (γ-amino-α-hydroxybutyric acid), and dropwise added to such a solution under stirring. 11.7 g (0.068 mol) of carbobenzoxychloride are added over 30 minutes while cooling to 0-5 [deg.] C., then the reaction mixture is stirred for an hour at the same temperature, and the reaction mixture is shaken with ether (50 ml) and adjusted to pH. The mixture was extracted with four portions of 80 ml of ether each time, the ether solutions were combined, washed with a small amount of saturated sodium chloride solution, dried over anhydrous sodium sulfate and filtered, and the filtrate was concentrated in vacuo. Crystallized from benzene to give 11.6 g (74%) of colorless plates, mp 78.5-79.5 ° C, [α] D-4.5 ° (c = 2, methanol). ): u / C 1740, 1690 ^cm-first NMR (acetone-de) 5 (ppm on tetramethylsila n): 2.0 (2H, m), 3.29 (2H, dd, J = 6.7, and 12 Hz), 4.16 (1H, dd, J = 4.5 and 8 Hz), 4 99 (2H, s), 6.2 (2H, broad band), 7.21 (5H, s)

Analysa:Analysis:

pro C12H15NO5 vypočteno:Calcd for C12H15NO5:

56,91 % C, 5,97 % H, 5,53 % N nalezeno:H, 5.97; N, 5.53. Found:

56^,66 ·%' C 5^,97 % ^H 5^,47 % N ^56, 66 ·% 'C ⁵ ^H 5% ^97, 47% N

Příklad 8Example 8

N-hydroxysukcinimidoester kyseliny L- (—) -y-benzyloxykarbonylamino-a-hydroxymáselné (VII)L- (-) - γ-Benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybutyric acid N-hydroxysuccinimidoester (VII)

Roztok 10,6 g (0,042 mol) látky VI a 4,8 g (0,042 mol) N-hydroxysukcinimidu, jehož přípravu popisuje G. W. Anderson a spol., J. Am. cheim. Soc. 86, 1839 (1964), v 200 ml ethylesteru kyseliny octové se ochladí na 0°C, přidá se 8,6 g (0,042 mol) dicyklohexylkarbodiimidu, a reakční směs se nechá v ledničce přes noc. Vyloučená dicyklohexylmočovina se odfiltruje, filtrát se zahustí asi na 50 ml za sníženého tlaku, čímž se získají bezbarvé krystalky látky VII, které se odfiltrují. Ve výtěžku 6,4 g se získá sloučenina o b. t. 121 až 122,5 °C. Zahuštěním filtrátu ve vakuu do sucha, a promytím zbytku za použití 20 ml směsi benzenu a n-hexanu se získá další podíl látky VII. Celkový výtěžek činí 13,4 g (9'2%), [<r]_D 1,5° (c = 2, СНС1з). Infračervené spektrum (v KBr) v/C=O 1810, 1755, 1740, 1680 cm“¹, NMRspektrum (aceton-de) δ (v ppm, přepočteno na tetramethylsilan): 2,0 (2H, m), 2,83 (4H, s), 3,37 (2H, d-d, J = 6,4 a 12,5 Hz), 4,56 (1H, m), 4,99 (2H, s), 6,3 (2Ή, široký signál), 7,23 (5H, s).A solution of 10.6 g (0.042 mol) of VI and 4.8 g (0.042 mol) of N-hydroxysuccinimide prepared by GW Anderson et al., J. Am. cheim. Soc. 86, 1839 (1964), in 200 mL of ethyl acetate was cooled to 0 ° C, 8.6 g (0.042 mol) of dicyclohexylcarbodiimide was added, and the reaction mixture was left in the refrigerator overnight. The precipitated dicyclohexylurea is filtered off, the filtrate is concentrated to about 50 ml under reduced pressure to give colorless crystals of compound VII which are filtered off. Yield: 6.4 g (mp 121-122.5 ° C). Concentration of the filtrate in vacuo to dryness and washing of the residue with 20 ml of a mixture of benzene and n-hexane gave an additional crop of VII. The total yield was 13.4 g (9.2%), [α] _D 1.5 ° (c = 2, 2%). Infrared spectrum (in KBr) v / C = O 1810, 1755, 1740, 1680 cm ^-1 , NMR spectrum (acetone-de) δ (ppm, calculated on tetramethylsilane): 2.0 (2H, m), 2.83 (4H, s), 3.37 (2H, dd, J = 6.4 and 12.5 Hz), 4.56 (1H, m), 4.99 (2H, s), 6.3 (2Ή, broad signal), 7.23 (5H, s).

Analysa:Analysis:

pro C16H18N2O7 vypočteno:Calcd for C16H18N2O7:

54,85 0/0 C, 5,18 % H, 8,00 % NH, 5.18; N, 8.00

54,79 % C, 5,21% H, 8,14 %| N 54,70% C, 5,20% H, 8,12% N% C, 54.79;% H, 5.21; N, 54.70; H, 5.20; N, 8.12

Příklad 9Example 9

Příprava N- (benzyloxykarbonyloxy) sukcinimiduPreparation of N- (benzyloxycarbonyloxy) succinimide

V roztoku 9 g (0,22 mol) hydroxidu sodného v 200 ml vody se rozpustí 23 g (0,2 mol) N-hydroxysukcinimldu, a do získaného roztoku se za míchání přikapává 34 g (0,2 mol) karbobenzoxychloridu za neustálého chlazení vodou, načež se reakční směs míchá přes noc za teploty místnosti, čímž se vyloučí karbobenzoxyderivát, který se odfiltruje, promyje se vodou a suší se na vzduchu, výtěžek 41,1 g (82%). Překrystalováním z benzenu a n-hexanu (10 :1) se získají bezbarvá prismata o b. t. 78 až 79 °C.23 g (0.2 mol) of N-hydroxysuccinimide are dissolved in a solution of 9 g (0.22 mol) of sodium hydroxide in 200 ml of water, and 34 g (0.2 mol) of carbobenzoxy chloride are added dropwise to the obtained solution while stirring. The reaction mixture was stirred overnight at room temperature to precipitate the carbobenzoxy derivative, which was filtered off, washed with water and air dried, yielding 41.1 g (82%). Recrystallization from benzene and n-hexane (10: 1) gave colorless prisms, mp 78-79 ° C.

Příklad 10Example 10

Příprava 6‘-karbobenz€xykan:amycinu А ‘(II)Preparation of 6‘-carbobenzoxycane: amycin A (II)

Roztok 42,5 g (90 mmol) volné báze kanamycinu A v 450 ml vody a 500 ml dimethylformamidu se ochladí pod 9 °C, a za energického míchání se přikapává během doby asi 2 hodin roztok 22,4 g (90 mmol) N-(benzyloxykarbonyloxy) sukcinimidu v 500 ml dimethylformamidu. Reakční směs se míchá za chlazení na —10° až 0 °C přes noc, načež se míchá za teploty místnosti 1 den, dále se reakční směs zahustí za sníženého tlaku a za teploty pod 50 °C, olejovitý zbytek se rozpustí ve směsi 50Ό ml vody a 500 ml butylalkoholu, filtrací reakční směsi se odstraní nerozpustné podíly, filtrát se rozdělí na 2 vrstvy, načež se butanolová vrstva i vodná vrstva zpracují za použití v tom kterém případě 500 ml butanolu, nasyceného vodou (dvakrát 500 ml) a vody, nasycené butanolem (dvakrát 500 ml), to za použití postupu, který je obdobný protiproudnému vytřepávání. Tři vodné vrstvy se spojí a po zahuštění do sucha za sníženého tlaku se získá olejovitý zbytek, jehož část krystaluje stáním za teploty místnosti. Ke zbytku, obsahujícímu krystaly, se přidá přibližně 100 ml methylalkoholu, jímž se rozpustí olei, který se dá takto oddělit od krystalů, a po přidání 300 ml ethanolu se reakční směs uchovává za teploty místnosti pres noc; získá se tím krystalická hmota, ze které se krystaly odfiltrují, a tento produkt o váze 44 g obsahuje malé množství kanamycinu A, jak je to patrné z chromatografie na tenké vrstvě za použití soustavy n-propylalkohol-pyridin-kyselina octová-voda (15:10: : 3:12) к vyvíjení a ninhydrinu jako testovacího činidla při postřiku.A solution of 42.5 g (90 mmol) of kanamycin A free base in 450 ml of water and 500 ml of dimethylformamide is cooled to below 9 ° C, and a solution of 22.4 g (90 mmol) of N- is added dropwise over about 2 hours with vigorous stirring. (benzyloxycarbonyloxy) succinimide in 500 ml dimethylformamide. The reaction mixture was stirred with cooling at -10 to 0 ° C overnight, then stirred at room temperature for 1 day, further concentrated under reduced pressure and below 50 ° C, the oily residue dissolved in 50 se ml water and 500 ml of butyl alcohol, the insoluble matter was removed by filtration of the reaction mixture, the filtrate was separated into 2 layers, after which the butanol layer and the aqueous layer were treated using 500 ml of butanol saturated with water (twice 500 ml) and saturated water. butanol (twice 500 ml) using a procedure similar to countercurrent shaking. The three aqueous layers were combined and concentrated to dryness under reduced pressure to give an oily residue, some of which crystallized on standing at room temperature. About 100 ml of methanol was added to the crystal-containing residue to dissolve the oil, which could be separated from the crystals, and after adding 300 ml of ethanol, the reaction mixture was kept at room temperature overnight; This gives a crystalline mass from which the crystals are filtered off, and this 44 g product contains a small amount of kanamycin A as shown by thin layer chromatography using the n-propyl alcohol-pyridine-acetic acid-water system (15: 10: 3:12) for the development of ninhydrin as a test agent for spraying.

Surový produkt se rozpustí v 300 ml vody, a roztok se chromatografuje na koloně iontoměničOvé pryskyřice CG-50 (průměr 30 milimetrů, amoniový cyklus, 500 ml). Kolona se vymývá 0,1 N roztokem amoniaku za jímání frakcí po 10 ml. Očekávaný produkt je obsažen ve zkumavkách číslo 10 až 100, zatím co kanamycin A byl regenerován z pomaleji se pohybujících frakcí, a polohový isomer, případně polohové isomery produktu jsou, jak se zdá, obsaženy v rychleji se pohybujících frakcích. Frakce 10 až 110 se spojí, a zahuštěním do sucha za sníženého tlaku se získá 24,6 g (45 %i) bezbarvého produktu, tj. 6-karbobenzoxykanamycinu A (II), který počíná tát a zbarvovat se při 204° Celsia s rozkladem za teploty 212 !C, kdy se též z tajícího vzorku vyvíjí plyn. [«]_D +106° (c = 2, H2O).The crude product was dissolved in 300 mL of water, and the solution was chromatographed on a CG-50 ion exchange resin column (30 mm diameter, ammonium cycle, 500 mL). Elute the column with 0.1 N ammonia solution, collecting 10 ml fractions. The expected product is contained in tubes number 10 to 100, while kanamycin A has been regenerated from the slower moving fractions, and the positional isomer or positional isomers of the product appear to be contained in the faster moving fractions. Fractions 10 to 110 are combined, and concentrated to dryness under reduced pressure to give 24.6 g (45%) of a colorless product, i.e. 6-carbobenzoxycanamycin A (II), which begins to melt and color at 204 ° C with decomposition at a temperature of 212 ° C, which also evolves gas from the melting sample. [Α] _D + 106 ° (c = 2, H 2 O).

Chromatografie na tenké vrstvě silikagelu F 254 za detekování ninhydrinem:Thin layer chromatography of silica gel F 254 with ninhydrin detection:

Použitá soustava rozpouštědel n-propylalkohol-pyridin-kyselina octová-voda (15 : 10 : 3 : 12] aceton-kyselina octová-voda [20:6:74) chlorofoťm-meťhylalkohol-koncentrovaný vodný roztok amon'iaku-voda (1:4 : 2 : 1) methylester kyseliny octové-n-pr-oipyl'alko!hol-koncentrovaný vodný ' amoniak (45:105:60)Used solvent system n-propyl alcohol-pyridine-acetic acid-water (15: 10: 3: 12) acetone-acetic acid-water [20: 6: 74] chloroform-methyl alcohol-concentrated aqueous ammonia-water solution (1: 4: 2: 1) acetic acid n-pr-oipyl-alcohol-concentrated aqueous ammonia (45: 105: 60)

Hodnoty Rf Rf values 6‘-karbobenzoxykanamycin A 6‘-Carbobenzoxycanamycin A kanamycin A kanamycin A 0,42 0,33 (hlavní) ' ' [menší) 0.42 0.33 (major) '' [minor] 0,15 0,04 0.15 0.04 0,24 0.24 0,14 0.14 0,76 0.76 0,50 0.50 0,22+ 0.22+ 0,04+ 0,04+

+ Detekce anthořonem a kyselinou sírovou.+ Anthohoron and sulfuric acid detection.

Bylo . zjištěno, že konečný produkt je doprovázen dvěma složkami, obsaženým! latnže v podstatně menším množství, to za použití . chromatografie na tenké vrstvě á Jedné ze soustav pro vyvíjení. Avšak konečný produkt byl . . použit bez jakéhokoli čištění .pro přípravu BB-K8 (IV).It was. It has been found that the final product is accompanied by two components, contained in! but in substantially smaller amounts, using. thin layer chromatography á One of the developing systems. However, the final product was. . used without any purification to prepare BB-K8 (IV).

P ř í k 1 a d 11Example 1 a d 11

Příprava kyselinyAcid preparation

L- (—) -y-amino-a-hy droxymáselné z ambutyrosinu A nebo B, či jejich směsíL- (-) -y-amino-α-hydroxybutyric acid from ambutyrosine A or B, or mixtures thereof

Reakční směs 5,0 g ambutyrosinu A, viz americký patentový spis 3 541078, 17. XI. 1970, a 160 ml 0,5 N roztoku hydroxidu' sodného se zahřívá hodinu k varu pod zpětným chladičem. Hydrolysát se neutralisuje . přidáním 6 N roztoku kyseliny chlorovodíkové, načež se provede chromatografie na koloně CG-50 (amoniový cyklus). Potřebná kyselina L-( — J-y-amino-a-hydroxymáselná ' se isoluje vyvoláním kolony vodou s následujícím .odstraněním vody lyofilisováním. Kyselina L-( — j-y-amino-a-hydroxymáselná je charakterisována jako krystalická látka o b. t. 212,5 až 214,5 °C (viz sloupec 2, ř. 31 až 38 amerického patentového ' spisu 3 541 078).For a reaction mixture of 5.0 g of ambutyrosine A, see U.S. Patent 3,510,778, 17. XI. 1970, and 160 ml of 0.5 N sodium hydroxide solution were heated under reflux for 1 hour. The hydrolyzate is neutralized. by addition of 6 N hydrochloric acid solution, followed by chromatography on a CG-50 column (ammonium cycle). The desired L - (-. Alpha.-amino-.alpha.-hydroxybutyric acid) is isolated by developing the column with water followed by water removal by lyophilization. 5 ° C (see column 2, lines 31-38 of U.S. Pat. No. 3,541,078).

Příklad 12Example 12

Příprava kyselinyAcid preparation

L- ( — ) -y-amino-a-hydr oxymáselné z kyseliny DL-«-hydroxy-y-ftalimidomáselné .....L- (-) - γ-amino-α-hydroxybutyric acid from DL -? - hydroxy-γ-phthalimidobutyric acid

A) Sůl kyseliny L-a-hydroxy-y-ftalimldomáselné s dehydroabietylaminem:A) L-α-hydroxy-γ-phthalimidobutyric acid salt with dehydroabietylamine:

K roztoku 25 g (0,1 mol) kyseliny 2-hydroxy-y-Halimidomáselné, viz Y. Saito a spol., Tetrahedron Letters 1970, 4863, v 200 ml ethylalkoiholu se přidá roztok 29 g (0,1 . mol) dehydrodbietylaminu. v 130 ml ethylalkoholu. Roztok se energicky ' protřepává minutu, nechá se stát . 5 hodin za teploty místnosti, a během té doby se vyloučí jemné krystalky. Ty se' odfiltrují, promyjí se za použití 50 mililitrů ethylalkoholu, a sušením na vzduchu se získá 30,1 g (56 %) diastereoisomeru soli s' dehydroabietylaminem, b. t. 93 až 94° Celsia, [a]_D24 = +15° (c = 2,5, methylalkohol). Krystalisací z 300 ml ethylalkoholu se získá 23,2 g (43 %) . čistého produktu o b. t. 94 až 95 °C, [a)_D« +10,8° (c = 2,5, methylalkohol). Další krystalisací se již hodnota bodu tání ani specifické rotace nemění.To a solution of 25 g (0.1 mol) of 2-hydroxy-γ-halimidobutyric acid, see Y. Saito et al., Tetrahedron Letters 1970, 4863, in 200 ml of ethyl alcohol is added a solution of 29 g (0.1 mol) of dehydrodietylamine . in 130 ml of ethyl alcohol. The solution was vigorously shaken for one minute, allowed to stand. 5 hours at room temperature, during which time fine crystals precipitated. These were filtered off, washed with 50 ml of ethyl alcohol, and air-dried to give 30.1 g (56%) of the diastereoisomer of the dehydroabietylamine salt, mp 93-94 ° C, [α] _D 24 = + 15 ° ( c = 2.5, methanol). Crystallization from 300 ml of ethanol gave 23.2 g (43%). 94 DEG-95 DEG C., [ _.alpha. ] _D @ 10 +10.8 DEG (c = 2.5, methanol). Further crystallization does not change the melting point value or the specific rotation.

Analysa:Analysis:

pro C32H42N2O5 . H2O vypočteno:for C32H42N2O5. H2O calculated:

69,54 % C, 8,02 % H, 5,07 % N nal ezeno :69.54% C, 8.02% H, 5.07% N found:

69,58 % C, 7,08 H, 5,07% N% H, 7.08;% N, 5.07

B) Kyselina L-( — )-y-amino-a-hydroxymáselnáB) L- (-) - γ-amino-α-hydroxybutyric acid

K roztoku 1,5 g (0,014 mol) uhličitanu sodného v 40 ml vody ' se přidá 5,3 g (0,01 mol) soli kyseliny L-ia-hydroxy-y-ftalimidojnáselné .s dehydroabietylaminem a. 60' . ml . etheru, ' reakčrií' směs ' se energicky ' míchá, až zmizí veškeré ' pevné podíly, vrstva . etheru se oddělí, vodný podíl se promyje za použití dvou dávek etheru po' 20 ml, načež se vodný podíl zahustí ve vakuu na 15 ml. Ké koncentrátu se přidá 10 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové, a reakční směs se' zahřívá 10 hodin.do., varu,.pod.zpětným chladičem; po 'očhlažéhí 'se ' odfiltruje kyselina' fialová, filtrát se zahustí za sníženého tlaku, zbytek se rozpustí v 10 ml vody, a získaný roztok se zahustí do sucha. Tento postup se opakuje dvakrát, čímž se odstraní nadbytek . kyseliny chlorovodíkové, zbylý sirup se rozpustí v 10 ml vody, a filtrováním se odstraní malé podíly nerozpustné kyseliny ftalové. Filtrát · se absorbuje na koloně IR-120 (ve vodíkovém cyklu, rozměry 1 cm na 35 cm], kolona .se promyje za použití 300 mililitrů vody, a eluuje se 1 N roztokem amoniaku. Eluát se jímá formou frakcí po 15 mililitrech. Frakce, positivní na ninhydrin, tj. 10 až 16, se spojí, a zahuštěním za sníženého tlaku se získá sirup, který postupně krystaluje. Krystaly se triturují s ethanolem, potom se odsají a sušením ve vakuu v eksikátoru se· získá 0,78 g (66 °/oj kyseliny L-( —)-y-amino-a-hydroxymáselní, b. t. 206 až 207 T, kb²⁴ —29° (c = 2,5, HO). Infračervené spektrum připravené látky je totožné s autentickým vzorkem, připraveným z ambutyroslnu.To a solution of 1.5 g (0.014 mol) of sodium carbonate in 40 ml of water was added 5.3 g (0.01 mol) of the salt of L-1-hydroxy-γ-phthalimidobutyric acid with dehydroabietylamine and 60 '. ml. of ether, the 'reaction' mixture 'is stirred vigorously until all the' solids disappear, the layer. The aqueous layer was washed with two portions of ether (20 ml) and concentrated in vacuo to 15 ml. Concentrated hydrochloric acid (10 ml) was added to the concentrate, and the reaction mixture was heated to reflux for 10 hours. the phosporic acid is filtered off, the filtrate is concentrated under reduced pressure, the residue is dissolved in 10 ml of water, and the solution is concentrated to dryness. This procedure was repeated twice to remove excess. hydrochloric acid, the remaining syrup was dissolved in 10 ml of water, and filtered to remove small amounts of insoluble phthalic acid. The filtrate is absorbed on an IR-120 column (hydrogen cycle, 1 cm by 35 cm), the column is washed with 300 ml of water and eluted with 1 N ammonia. The eluate is collected in fractions of 15 ml each. ninhydrin-positive, i.e., 10-16, are combined and concentrated under reduced pressure to give a syrup which gradually crystallizes, crystals are triturated with ethanol, then suctioned off and vacuum dried in a dessicator to give 0.78 g ( 66 ° / .alpha. Of L- (-) - .gamma.-amino-.alpha.-hydroxybutyric acid, mp 206 DEG -207 DEG C., ²⁴ DEG -29 DEG (c = 2.5, HO). prepared from ambutyrosine.

Příklad 13Example 13

Příprava 6‘-karbobenzoxy-l,3,3“-tri-p-nitrobenzalkanamycinu A (III-c)Preparation of 6‘-carbobenzoxy-1,3,3'-tri-p-nitrobenzalkanamycin A (III-c)

Za teploty 24 °C se suspenduje v 500 ml absolutního· ethanolu 9,0 g (14,5 mmol) 6‘-karbobenzoxykanamycinu A, a k suspensi se přidá 8,7945 g (58,2 mmol) p-nitrobenzaidehydu. Reakční směs se zahřívá do varu pod zpětným. chladičem, a během té doby se mění vzezření směsi za vzniku čirého, žlutého roztoku, ale dalším varem pod zpětným- chladičem se začne rychle vylučovat bílá pevná hmota. Reakční směs se zahřívá k varu pod zpětným .chladičem celkem 3 hodiny, potom se ochladí, vyloučený produkt se .odsaje, promyje se malým množstvím absolutního ethanolu, a ve výtěžku 14,0 g (94,5%) se získá bílá, krystalická látka o b. t. 233 — 234° (nekor.), což je produkt IIIc, jehož složení je uvedeno v názvu.At 24 [deg.] C., 9.0 g (14.5 mmol) of 6 ' -carbobenzoxycanamycin A is suspended in 500 ml of absolute ethanol, and 8.7945 g (58.2 mmol) of p-nitrobenzaidehyde are added. The reaction mixture is heated to reflux. condenser, and during this time the appearance of the mixture changes to form a clear, yellow solution, but a further white solid begins to precipitate rapidly by further refluxing. The reaction mixture was heated to reflux for a total of 3 hours, then cooled, the precipitated product was filtered off with suction, washed with a small amount of absolute ethanol, and a white, crystalline solid was obtained in a yield of 14.0 g (94.5%). mp 233-234 ° (uncorrected), which is the product IIIc, whose composition is indicated in the title.

Analysa:Analysis:

pro C47H51N7O19 vypočteno:Calcd for C47H51N7O19:

55,46 % C, 5,05 % H, 9,63 % N nalezeno:% C, 55.46;% H, 5.05;% N, 9.63.

55,39 %! C, 5,08 % H, 9,60 % N55,39%! H, 5.08; N, 9.60

Příklad 14Example 14

Příprava 1-N- [ L- ( — ) -y-amino-a-hydroxybutyrylj-kanamycinu A (IV)Preparation of 1-N- [L- (-) -y-amino-α-hydroxybutyryl]-kanamycin A (IV)

5,0 g (4,91 mmolu) 6‘-karbobenzoxy-l,3,3“-t-i-p-nitrobenzal.kanamycinu A se rozpustí v 50 ml dimethylfcrmamidu za teploty 24 °C. Odděleně se za stejné teploty rozpustí v 20 ml ďimethylformamidu 2,064 g (5,895 mmolu) N-hydroxysukcinimidoesteru kyseliny L- (—) -y-benzyloxykarbonylamino-α-hydroxymáselné, a tento roztok se přidává za energického míchání během 75 minut do roztoku Schiffovy báze IIIc. Vzniklá reakční směs se míchá přes noc za teploty 24 °C, načež se za použití parního ejektoru odpaří roztok prudce do sucha za . teploiv asi 40 QC. Dále pak opakovaným prudkým odpařením s 100 ml methylalkoholu se takto získá vazký olej, který se rozpustí v 100 mililitrech směsi dioxanu a vody 1: 1, přidá se 10 ml ledové kyseliny octové, roztok se přelije do Parrovy baňky objemu 500 ml, přidá se palladium na uhlí (2,5 g, koncentrace Pd 5%), a redukce se provádí 4 hodiny za teploty 24 °C a za tlaku 3,1 atm. Celkový pokles tlaku v této době (uzavřená nádobka) činí 6 atm, počítaje v to občasné znovunatlačení vodíku. Reakční směs se potom filtruje vrstvou infusoriové hlinky, ta se promyje třemi podíly po 50 ml 50·% vodného dioxanu, spojené filtráty .se prudce odpaří do sucha, zbytek se azeotropně oddestiluje s 100 ml n-butylalkoholu, a posléze se ještě dvojím prudkým oddestilováním s methylalkoholem získá vazký olej, který se rozpustí v 30 ml methylalkoholu, a získaný roztok se pomalu vlije do 1000 m.l studeného (5 až 10°C) .diethyletheru za . energického míchání. Reakční směs se dále míchá jako suspense 30 minut v ledové lázni, vyloučená sraženina se odsaje a bezprostředně vysuší ve vakuovém exslkátoru nad kysličníkem fosforečným. Produkt se získá ve výtěžku 4,9620 g. Podle chromatografie na tenké vrstvě je patrné, že v produktu je hlavně obsažena sloučenina vzorce IV, tj. kanamycin A, nějaké stopy disubstituovaného a trisubstituovaného kanamycinu A, počítaje v to určitý podíl kyseliny 4-aminO'-2-hyd-oxymáselné.5.0 g (4.91 mmol) of 6'-carbobenzoxy-1,3,3'-t-i-p-nitrobenzalkanamycin A are dissolved in 50 ml of dimethylformamide at 24 ° C. Separately, 2.064 g (5.895 mmol) of L- (-) -? -Benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybutyric acid N-hydroxysuccinimidoester were dissolved in 20 ml of dimethylformamide, and this solution was added to the Schiff base IIIc solution with vigorous stirring over 75 minutes. . The resulting reaction mixture was stirred overnight at 24 ° C and the solution was evaporated vigorously to dryness using a steam ejector. 40 ° C. Further vigorous evaporation with 100 ml of methanol yields a viscous oil which is dissolved in 100 ml of 1: 1 dioxane / water, 10 ml of glacial acetic acid is added, the solution is poured into a 500 ml Parr flask, palladium is added. on carbon (2.5 g, Pd concentration 5%), and the reduction is carried out at 24 ° C and 3.1 atm for 4 hours. The total pressure drop at this time (closed vessel) is 6 atm, including occasional hydrogen repressure. The reaction mixture is then filtered through a pad of diatomaceous earth, washed with three 50 ml portions of 50% aqueous dioxane, the combined filtrates are vigorously evaporated to dryness, the residue is azeotroped with 100 ml n-butyl alcohol, and then distilled twice more. The solvent is removed in vacuo to give a viscous oil which is dissolved in 30 ml of methanol and poured slowly into 1000 ml of cold (5-10 ° C) diethyl ether. of vigorous stirring. The reaction mixture is further stirred as a slurry in an ice bath for 30 minutes, the precipitate formed is filtered off with suction and immediately dried in a vacuum desiccator over phosphorus pentoxide. The product is obtained in a yield of 4.9620 g. Thin layer chromatography shows that the product mainly contains the compound of formula IV, i.e. kanamycin A, some traces of disubstituted and trisubstituted kanamycin A, including some 4-amino acid. -2-hydroxybutyrate.

Za použití skleněné kolony 40 na 100 mm s náplní Amberlite ARC-50 (amoniový cyklus, typ I, 100/200 mesh) s ložem objemu asi 980 mm se produkt dělí na různé frakce, přičemž se na koloně dělí 4,600 g surového produktu jako směsi za rozpuštění této v 1 ml vody. Kolona se eluuje gradientem vody proti 2 N roztoku amoniaku, přičemž eluát se odebírá ve frakcích objemu 15 ml. Jímá se celkem 295 frakcí, kolona se potom promyje 1,5 litrem 3 N roztoku amoniaku. Odpovídající frakce · se spojí na základě hodnot optických rotací, a lyofilisováním se odtud získá pevný produkt.Using a 40 per 100 mm glass column packed with Amberlite ARC-50 (Ammonium Cycle, Type I, 100/200 mesh) with a bed volume of about 980 mm, the product is separated into different fractions, with a column of 4.600 g of crude product as a mixture. to dissolve this in 1 ml of water. The column was eluted with a gradient of water over 2 N ammonia solution, the eluate being collected in fractions of 15 ml. A total of 295 fractions were collected, and the column was then washed with 1.5 L of 3 N ammonia solution. The corresponding fractions were combined on the basis of optical rotation values, and freeze-dried to give a solid product.

Frakce č. Fraction no. Složení Ingredients Váha, g Weight, g Korekce na váhu celku, v sur. g Total weight correction, in sur. G Bio-test Bio-test % výtěžek % yield 120-150 120-150 kanamycin A kanamycin A 1,1654 1,1654 1,257 1,257 809 809 42,6 42.6 201-224 201-224 BB-K29 BB-K29 0,40 0.40 0,43 0.43 — - 228-241 228-241 BB-K8 BB-K8 0,6523 0.6523 0,7036 0.7036 786 +101+ 786 +101+ ' 19,2+ + '19.2+ +

ροζη.:ροζη .:

+ průměr čtyř testů na Petriho misce, + standardní -odchylka ++ vezme-li se zřetel na regenerovaný kanamycin A, pak konverse na BB-K8 (látku IV) odpovídá 33,5 %.+ mean of four tests on a Petri dish, + standard deviation ++ taking into account regenerated kanamycin A, the conversion to BB-K8 (compound IV) corresponds to 33.5%.

Při tomto pokuse činil poměr BB-K8/kanamycin A 0,45.In this experiment, the BB-K8 / kanamycin A ratio was 0.45.

Sloučenina vzorce IV, jak se získá při tomto postupu, je totožná s autentickým vzorkem, jak se týž získá postupem podle související přihlášky č. 221 378. Látka má b. t. 194 °C (za rozkl)., [·α+²¹ = +85° (c ==2, H2O). Relativní účinnosti proti B. subtilis (akarová destička) = 960 mog/mg (standard: kanamycin A jako volná báze). Analysa:The compound of formula IV, as obtained in this procedure, is identical to an authentic sample as obtained by the procedure of related application no. 221 378. The substance has a mp of 194 ° C (decomposition)., [· Α + ²¹ = +85 ° (c = 2, H 2 O). Relative efficacy against B. subtilis (acar plate) = 960 mog / mg (standard: kanamycin A free base). Analysis:

pro C22H43N5O13. 2H2CO3 vypočteno:for C22H43N5O13. 2H2CO3 calculated:

40,62 % C, 6,68 % H, 9,87 %( N n q 1 O Tiř* n f! *% C, 40.62;% H, 6.68;% N, 9.77%.

40,21 % C, 6,96 % H, 9,37 % N 39,79 % C, 6,87 -%' H, 9,4 % NH, 6.97; N, 9.37. C, 39.79. H, 6.87.%, N, 9.4.

Příklad 15Example 15

Příprava soli l-N-[L-( — )-y-a.mino-a-hy-droxybutyryljkanamycinu A s ekvivalentem kyseliny sírové mol l-N-[L-( — )-y^<amino-a-hydroxybutyryljkanamycinu A se rozpustí v 1 až 3 litrech vody, a z roztoku se filtrací oddělí různé nerozpustné pevné podíly, načež se po ochlazení za míchání přidá roztok 1 molu kyseliny sírové- v 500 ml vody, a reakční směs se míchá 30 minut. Po přidání vychlazeného ethanolu se reakční směs míchá, až dojde k vysrážení, načež se pevné podíly odsají. Podle provedených zjištění je to odpovídající monosulfát, tedy sůl s ekvivalentem kyseliny sírové.Preparation of the salt of N- [L- (-) - amino-α-hydroxybutyryl] -canamycin A with sulfuric acid equivalent of mole of N- [L- (-) -. The solution was filtered and the various insoluble solids were separated by filtration, after cooling with stirring a solution of 1 mole of sulfuric acid in 500 ml of water was added, and the reaction mixture was stirred for 30 minutes. After addition of chilled ethanol, the reaction mixture was stirred until precipitation occurred and the solids were filtered off with suction. According to the findings, it is the corresponding monosulfate, i.e. a salt with an equivalent of sulfuric acid.

Příklad 16Example 16

Příprava soli l-N-[-(—)-y-amino-a-hydr-oxybutyryljkanamycinu A se dvěma ekvivalenty kyseliny sírové (tedy disulfát, BB-K8.2H2SO4)Preparation of 1-N - [- (-) - γ-amino-α-hydroxybutyryl] -canamycin A salt with two equivalents of sulfuric acid (ie disulfate, BB-K8.2H2SO4)

Ve 125 ml vody, zbavené iontů, se rozpustí 35 g l-N-[L-(—)-y-amino-a-hydroxybutyryljkanamycinu A; hodnota pH činí podle zjištění přibližně 9,0, a sníží se na 7 až 7.5 přidáním 50% (objemově) kyseliny sírové.Dissolve 35 g of 1-N- [L - (-) - γ-amino-α-hydroxybutyryl] -canamycin A in 125 ml of deionized water; the pH is found to be approximately 9.0, and is reduced to 7 to 7.5 by adding 50% (v / v) sulfuric acid.

Přidá se dále 8,5 g aktivního uhlí Darco G-60, a reakční směs se míchá za teplory místnosti po 30- minut. Vhodnou filtrací se odstraní aktivní uhlí, jež se promyje za použití 40 ml vody; vodný podíl z promývání se přidá k filtrátu.8.5 g of Darco G-60 activated carbon were added, and the reaction mixture was stirred at room temperature for 30 minutes. Appropriate filtration removes the charcoal, which is washed with 40 ml of water; the aqueous wash was added to the filtrate.

Spojené podíly z filtrace a promývání se okyselí -přidáním 50% kyseliny sírové (objemově) na pH 2 až 2,6, což je doprovázeno vývojem velkého množství kysličníku uhličitého. Roztok se evakuuje za míchání po 20 minut, -aby se tím- odstranily poslední podíly kysličníku uhličitého.The combined filtration and washings were acidified by the addition of 50% sulfuric acid (v / v) to a pH of 2 to 2.6, which was accompanied by the development of large amounts of carbon dioxide. The solution was evacuated with stirring for 20 minutes to remove the last portions of carbon dioxide.

K odplyněnému roztoku se přidá 8,5 g aktivního uhlí Darco G-60, a reakční - směs - se míchá 30 minut za teploty místnosti; potom se aktivní uhlí odfiltruje vhodnou filtrací, promyje se za použití 35 ml vody, zbavené iontů, načež se vodný podíl z promývání přidá k filtrátu.To the degassed solution was added 8.5 g of Darco G-60 activated carbon, and the reaction mixture was stirred at room temperature for 30 minutes; the activated carbon is then filtered off by suitable filtration, washed with 35 ml of deionized water, and the aqueous wash is added to the filtrate.

U spojeného podílu z filtrátu a promývání se přidáním 50'% roztoku kyseliny sírové (objemově) upraví hodnota pH na 1 až 1,3, a získaný roztok se vlije za prudkého míchání během 10 minut do 600 -až 800 ml methanolu (3 až 4 . -objemy methanolu), reakční směs se míchá 5 minut za hodnoty pH 1 až 1,3, prolije se sítem s oky 100- mesh, míchá se po 2 minuty, a nechá se usadit 5 minut. Největší podíl kapaliny nad sedlinou se oddekantuje, zbývající suspense vhodným zařízením filtruje, pevný podíl se- promyje za použití 200 -ml methanolu, a suší se ve vakuu 24 hodin při 50 °C. Výtěžek amorfního NN-K8 ve formě soli se dvěma ekvivalenty kyseliny sírové činí 32 až 34%, [«Jd²⁸ — =- -(-74,75° (H2O), látka se rozkládá za teploty 220 až 223 °C.For the combined filtrate and washings, adjust the pH to 1 to 1.3 by adding 50% sulfuric acid solution (v / v), and pour the solution into 600-800 ml of methanol (3-4) with vigorous stirring over 10 minutes. The mixture was stirred for 5 minutes at pH 1 to 1.3, passed through a 100-mesh sieve, stirred for 2 minutes, and allowed to settle for 5 minutes. The bulk of the supernatant was decanted off, the remaining suspension was filtered with a suitable apparatus, the solid was washed with 200 ml of methanol, and dried under vacuum at 50 ° C for 24 hours. The yield of amorphous NN-K8 in the form of a salt with two equivalents of sulfuric acid was 32-34%, [.alpha.] D @ ²⁸ = -74 DEG (H2 O), decomposing at 220 DEG-223 DEG.

Elementární analysa (přepočteno na sušinu) ⁺ Elemental analysis (calculated on dry basis) ⁺

%C %C 32,7 32.7 33,5 33.5 32,3 32.3 33,5 33.5 %:n %: n 8,78 8.78 8,7 8.7 8,2 8.2 8,8 8.8 8,97 8.97 %s %with 8,75 8.75 8,9 8.9 7,8 7.8 8,85 8.85 82, 82,

⁺ obsah vody dle K. Fischera: 2,33, 1,79, 2,87 % (teorie pro monohydrát: 2,25 % НЮ). Tato sůl je hygroskopická, ale nerozplývá se. Po skladování alikvotní části na vzduchu za teploty místnosti po 18 hodin se zvýší obsah vody na 9,55, 9,89 % (teorie pro pentahydrát 10,33 % HžO). ⁺ K. Fischer water content: 2.33, 1.79, 2.87% (theory for monohydrate: 2.25% δ). This salt is hygroscopic but does not melt. After storing the aliquot in air at room temperature for 18 hours, the water content is increased to 9.55, 9.89% (theory for pentahydrate 10.33% H2O).

Příklad 17Example 17

1-N- [ L-(—) -χ-amino-a-hydr oxybuty ry 1 ] kanamycin A (tj. látka vzorce IV) postupem bez Schiffovy báze jako meziproduktu1-N- [L - (-) -. Alpha.-amino-.alpha.-hydroxybutyl] kanamycin A (i.e., compound of formula IV) by an intermediate without Schiff base as an intermediate

К míchanému roztoku 1,36 g (2,2 mrnol; 6‘-N-karbobenzoxykánamycinu (II) : v 60 ml 50% vodného roztoku tetrahydrofuranu se přikapává 930 mg (2 mrnol) aktivního esteru vzorce XX v 10 ml tetrahydrofuranu během 30 minut na teploty místnosti. Reakční směs se míchá přes noc, načež se hydrogenuje za přítomnosti 1,0 g 10°/o‘< palladia na uhlí za atmosférického tlaku a za teploiv místnosti. Po skončené hydrogenaci se katalyzátor odfiltruje a promyje vodou, filtrát a podíly z promývání se spojí, načež se oddestiluje ve vakuu organické rozpouštědlu. Získaný vodný roztok še prolije kolonou 70 mililitrů iontoměniče CG-50 (amoniový cyklus), a sloupec kolony se postupně promývá za použití 400 ml vody, 500 ml 0,1 N roztoku amoniaku, 500 ml 0,3 N roztoku amoniaku, litru 0,5 N roztoku amoniaku a posléze 500 ml 1 N roztoku amoniaku, Eluát sé jímá formou frakcí po 20 ml,'a rozdělí se ha odpovídající podíly na podkladě hodnot Rf na destičkách sé siíikagéleťň (S-110,. détekce ninhydrinem), a těstováním na destičkách s agarem proti B. subtilis PCI a K. pneuthoniae typ 22 3030 A 20680. Každý podíl sloučených frakcí se zahustí ve vakuu a lyofllisuje.To a stirred solution of 1.36 g (2.2 moles; 6'-N-carbobenzoxycanamycin (II)): in 60 ml of a 50% aqueous tetrahydrofuran solution, 930 mg (2 moles) of the active ester of formula XX in 10 ml of tetrahydrofuran is added dropwise over 30 minutes The reaction mixture was stirred overnight, then hydrogenated in the presence of 1.0 g of 10% palladium on carbon at atmospheric pressure and at room temperature. After completion of the hydrogenation, the catalyst was filtered off and washed with water, filtrate and aliquots. The aqueous solution obtained is passed through a column of 70 ml of CG-50 ion exchange resin (ammonium cycle), and the column is washed successively with 400 ml of water, 500 ml of 0.1 N ammonia solution. 500 ml of 0.3 N ammonia solution, 1 liter of 0.5 N ammonia solution and then 500 ml of 1 N ammonia solution. The eluate is collected in fractions of 20 ml each, and the corresponding fractions are distributed on the basis of the Rf values on the Silica gel gel (S-110, ninhydrin), and agaration on agar plates against B. subtilis PCI and K. pneuthoniae type 22 3030 and 20680. Each fraction of the combined fractions was concentrated in vacuo and lyophilized.

Příklad 18Example 18

6‘-karbobenzoxy-l,3,3“-trisalicylalkanamycin A6‘-Carbobenzoxy-1,3,3'-trisalicylalkanamycin A

V 500 ml absolutního ethanolu se suspenduje při 24 °G 9,0 g (14,5 mmol) 6‘-karbobenzoxykanamycinu A, a přidá se 58,2 mmol salicylaldehydu. Reakční směs se zahřívá к varu pód zpětným chladičem, a během té doby se suspense mění na čirý, žlutý roztok, ale během varu se rychle začne vylučovat bílá, pevná hmota. Reakční směs se zahřívá к varu pod zpětným chladičem po 3 hodiny, potom se ochladí, produkt se odfiltruje a promytje malým množstvím absolutního ethanolu. Bod tání · po překrystalování ze směsi tetrahydrofuranu-methylalkoholu a heptanu 4:1:5 činí po vysušení 196 až 198° Celsia.In 500 ml of absolute ethanol, 9.0 g (14.5 mmol) of 6ob-carbobenzoxycanamycin A is suspended at 24 DEG C., and 58.2 mmol of salicylaldehyde are added. The reaction mixture was heated to reflux, during which time the suspension turned into a clear, yellow solution, but a white, solid mass began to precipitate rapidly during boiling. The reaction mixture was heated to reflux for 3 hours, then cooled, the product was filtered off and washed with a small amount of absolute ethanol. After recrystallization from tetrahydrofuran-methanol-heptane 4: 1: 5, the melting point was 196-198 ° C.

Analysa:Analysis:

pro C47H54N4O16 vypočteno:Calcd for C47H54N4O16:

60,62 % C, 4,86% H, 6,02% N nalezeno:% C, 60.62;% H, 4.86;% N, 6.02.

58,67 %’ C, 5,73 % H, 5,98 % N58.67% ’C, 5.73% H, 5.98% N

Obsah vody dle K. Fischera: 2,45Water content according to K. Fischer: 2.45

Analysa s korekcí na vodu:Analysis with water correction:

nalezeno:found:

60,14 % C, 5,60 % H, 6,13 % NH, 5.60; N, 6.13

Příklad 19Example 19

Příprava l-N-[L-( —)-y-amino-a-hydroxybutyrylj-kanamycinu A postupem in sítuPreparation of 1-N- [L- (-) - γ-amino-α-hydroxybutyryl]-kanamycin A by in-line procedure

Ve vhodném zařízení se rozmíchá 1000 g (1,074 molu] 6‘-karbobenzoxy-l,3,3“-trisalicylal-kanamycinu A v 11 400 ml tetrahydrofuranu za teploty 22 až 25 °C, přidá se za míchání 600- ml vody, během 10 minut se suspense rozpustí, načež se do roztoku přidá v pevné formě 181,5 g (0,716 molu) kyseliny ' 4-benzyloxykarbonylamino-2-hydroxymáselné á 0,12 molu N-hýdroxý-5-norbornen-2,3-dikarboximidu; hodnota pH je v rozmezí 5,5 až 6,0. Za udržování teploty v rozmezí 22 až 25 °C se přidá 162,3 g (0,787 molů) dicyklohexylkarbodiimidu, rozpuštěného v 3000 ml suchého tetrahydrofuranu, suspense se míchá 24 hodin při 22 až 25 °C, načež se ochlazením na 0 až 5 °C získá ve dvou hodinách krystalická dlcyklohexylmočovina.In a suitable apparatus, mix 1000 g (1.074 mol) of 6'-carbobenzoxy-1,3,3'-trisalicylalkanamycin A in 11 400 ml of tetrahydrofuran at 22 to 25 ° C, add with stirring 600 ml of water, while stirring. The suspension is dissolved for 10 minutes and 181.5 g (0.716 mol) of 4-benzyloxycarbonylamino-2-hydroxybutyric acid and 0.12 mol of N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide are added in solid form; the pH is between 5.5 and 6.0 While maintaining the temperature between 22 and 25 ° C, 162.3 g (0.787 moles) of dicyclohexylcarbodiimide dissolved in 3000 ml of dry tetrahydrofuran are added, the suspension is stirred for 24 hours at 22 to 25 ° C. 25 ° C, then crystalline di-cyclohexylurea is obtained in two hours by cooling to 0-5 ° C.

Pevný vyloučený podíl se odfiltruje, podíl na filtru se promyje za použití 800 m^;l směsi tetrahydrofuranu a vody 95/5, podíly z filtrátu a promývání se spojí, celkový objem se zahuštěním ve vakuu sníží na 3000 ml, přidá se 4Ό00 ml methanolu, a opět se zahuštěním ve vakuu sníží objem na 3000 ml.The solid precipitate was filtered off, and the filter was washed using 800 m ^; 1 liter of tetrahydrofuran / water 95/5, the filtrate and the washings are combined, the total volume is reduced to 3000 ml by concentration in vacuo, 4 to 100 ml of methanol are added, and the volume is again reduced to 3000 ml by concentration in vacuo.

К takto získanému roztoku se přidá 2000 mililitrů absolutního methanolu teploty 40° Celsia, načež se roztok očkuje přidáním 6‘-karbobenzoxy-l,3,3“-tri3alicylal-kanamycinu A, a po ochlazení se nechá krystalovat 0,5 až 1 hodinu. Přidá se 2000 ml vody během 30 minut za dobrého míchání, což trvá za teploty 22 až 25 °C 2 hodiny. Teplota se dále sníží na hodinu na 0 až 5 °C.2000 ml of absolute methanol at 40 DEG C. are added to the solution thus obtained, and the solution is seeded with 6‘-carbobenzoxy-1,3,3'-trialicylalkanamycin A and allowed to crystallize after cooling for 0.5 to 1 hour. 2000 ml of water is added over 30 minutes with good stirring, which takes 2 hours at 22-25 ° C. The temperature was further reduced to 0-5 ° C for 1 hour.

Pevné podíly se odfiltrují, promyjí se za použití 900 ml vychlazené směsi methanolu a vody 2 :1, dále za použití 800 ml methanolu, a uchovají se filtráty i podíly z promývání. Jako pevný podíl se získá v podstatě regenerovaný 6‘-karbobenzoxy-l,3,3“-trisallcylalkanamycln A.The solids were filtered off, washed with 900 ml of cold 2: 1 methanol / water, then with 800 ml of methanol, and the filtrates and washings were stored. Substantially regenerated 6‘-carbobenzoxy-1,3,3'-trisallcylalkanamycin A is obtained as a solid.

Výše uvedené podíly z filtrace se zředí přidáním 1000 ml vody, ke zředěnému roztoku se přidá 2000 ml methylenchloridu, a za teploty 25 °C se sníží pH na 1,8 až 2,0 přidáním 6 N roztoku kyseliny chlorovodíkové, a na této hodnotě pH se udržuje reakční směs 30 minut.The above filtration portions were diluted by adding 1000 mL of water, 2000 mL of methylene chloride was added to the diluted solution, and the pH was lowered to a temperature of 1.8-2.0 at 25 ° C by adding 6 N hydrochloric acid at this pH. The reaction mixture was maintained for 30 minutes.

Vrstva methylenchloridu se oddělí, vodný podíl se promyje další dávkou 2000 ml methylenchloridu, spojené organické fáze se uchovají pro případné regenerování salicylaldehydu.The methylene chloride layer was separated, the aqueous portion was washed with another portion of 2000 ml of methylene chloride, and the combined organic phases were retained for possible recovery of salicylaldehyde.

Hodnota pH vodného podílu se zvýší лаThe pH of the aqueous portion is increased ла

3,5 až 4,0 přidáním koncentrovaného vodného roztoku amoniaku, a získaný roztok se hydrogenuje za teploty místnosti za tlaku vodíku 0,35 MPa za přítomnosti 5% palladia na uhlí. Βίο-výtěžek očekávaného produktu v roztoku činí 30 až 45% teorie.3.5 to 4.0 by addition of concentrated aqueous ammonia solution, and the resulting solution is hydrogenated at room temperature under 50 psi hydrogen in the presence of 5% palladium on carbon. The yield of the expected product in solution is 30 to 45% of theory.

Příklad 20Example 20

Příprava sloučeniny vzorce IV za použití různých mol-% N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dlkarboximidu za udržování dalších mol-ⁱ%i obsahů stejnýchPreparation of the compound of Formula IV with various mol% of N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dlkarboximidu maintaining additional mol% ^and content of the same and

Při postupu podle příkladu 20 se nahradí 0,12 mol N-hydroxy-5-norbornen;2,3-dikarboximidu, tamže použitého, dále uvedenými různými mol-'%, to za vzniku dále uvedených výtěžků (v %) sloučeniny vzorce IVIn the procedure of Example 20, 0.12 mol of N-hydroxy-5-norbornene, 2,3-dicarboximide, where used, was replaced with the following moles% to give the following yields (in%) of the compound of formula IV

Pokus mol% N-hydroxy-5-norbornen- Výtěžek (%) sloučeniny IVExperiment mol% N-hydroxy-5-norbornene- Yield (%) of compound IV

-2,3-dikarboxlmidu-2,3-dicarboxamide

09,3309.33

220,07220.07

1031,721031.72

5036,525036,52

10036,0110036.01

Z výše uvedených výsledků je patrné, že pří reakci vzniká sloučenina vzorce IV i tehdy, provádí-li se reakce vůbec bez N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dikarboximidu_i Avšak rovněž je zřejmé, že nejlepších výtěžků sloučeniny vzorce IV se dosahuje za použití mol-% N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dikarboxlmldu od 10 až do 50 % z použitého molárního množství kyseliny 4-benzyloxykarbonylamino-2-hydroxymáselné, jak se tato použije při acylační reakci, Přesný mechanismus, jak probíhá асуlování blokovaného, kanamyclnu A, není znám. Avšak bylo pozorováno, že za přítomnosti N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dlkarboximidu se dosahují· lepší výtěžky, než jak byly dosahovány dříve. Příklad 21From the above results it is apparent that in the reaction of producing the compound of formula IV, even if performed at all of the reaction without the N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide _I, but it is also evident that the best yields of the compounds of formula IV achieves from 10 to 50% of the molar amount of 4-benzyloxycarbonylamino-2-hydroxybutyric acid used, as used in the acylation reaction, using a mole% of N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboxylic acid of 10 to 50%; is in progress, blocking, kanamyclnu A, is not known. However, it has been observed that in the presence of N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dlcarboximide, better yields are achieved than previously achieved. Example 21

Příprava l-N-JL-J — )-y-amino-a-hydroxybutyryljkanamycinu A [látka vzc-rce IV)Preparation of 1-N-JL-J-1-y-amino-α-hydroxybutyryljkanamycin A [compound of formula IV)

Za teploty 45 °C se rozpustí v 55 ml dimethylformamidu 18,6 g (20,0 mmol) 6‘-karbobenzoxy-l,3,3“-trisalicylalkanamycinu А, а к získanému roztoku se přidá 7,3 ml vody a 10i2 ml acetonu. Roztok se ochladí na 25 ^VC, načež se najednou přidá 50 ml roztoku 9,9 mmol esteru N-hydroxysukcinlmidu a kyseliny L- (—) -/-benzyloxykarbonylamlno-«-hydroxymáselné acetonu. Reakční směs se míchá 40 hodin přibližně za teploty 25 °C, dále se přidá 150 ml vody a několik málo krystalků 6‘-karbobenzoxy-l,3,3“-trlsallcylalkanamycinu A, a reakční směs se míchá hodinu při 25 °C a dále ještě 3 hodiny při 0 až 5°C. Nadbytek, jakož i nezreagovaná Schíffova báze salicylaldehydu vykrystalují a zachytí se filtrací na filtru. Podíl na filtru se promyje za použití 60 ml 50\%! vodného acetonu, načež se tento podíl vysuší a získá se tím 9,4 g regenerované Schiffovy báze o b. t. [surová látka) 170 až 185 °C,18.6 g (20.0 mmol) of 6'-carbobenzoxy-1,3,3'-trisalicylalkanamycin A are dissolved in 55 ml of dimethylformamide at 45 DEG C. and 7.3 ml of water and 10.12 ml of water are added to the obtained solution. acetone. The solution was cooled to 25 ^V C, then added in one portion 50 ml solution of 9.9 mmol of N-hydroxysukcinlmidu acid L- (-) - / - benzyloxykarbonylamlno - «- hydroxybutyric acetone. The reaction mixture is stirred at approximately 25 ° C for 40 hours, 150 ml of water and a few crystals of 6'-carbobenzoxy-1,3,3'-trlsallcylalkanamycin A are added, and the reaction mixture is stirred at 25 ° C for 1 hour and 3 hours at 0-5 ° C. Excess as well as unreacted Schiff's salicylaldehyde base crystallized and collected by filtration on a filter. The filter was washed with 60 ml of 50% water. aqueous acetone and dried to give 9.4 g of regenerated Schiff base, mp 170-185 ° C,

Filtrát z výše uvedené reakce se smíchá s 40 ml methylenchloridu, hodnota pH se upraví z 6:2 na 2,0, a tím se odstraní další výchozí materiál. Vrstvy se oddělí, a vodný podíl se extrahuje dvěma podíly po 40 ml methylenchloridu, potom, se pH vodné vrstvy upraví na 3,7, a malý podíl acetonu i methylenchloridu se odstraní destilací ve vakuu. Vodný roztok se hydrogenuje za přítomnosti 3,0 g 5% palladia na uhlí jako katalyzátoru 24 hodin za teploty 15 °C a za tlaku 0,35 MPa vodíku, načež se reakční směs filtruje vrstvou infusoriové hlinky, čímž se odstraní katalyzátor, objem filtrátu se upraví na 100 ml, a odebere se z tohoto podílu vzorek 1 ml к testování na Petriho misce a papírovém kotoučku. Podle prvého testu činí obsah látky vzorce IV 1936 mcg/ml, podle druhého testu 2325 mcg/ml, což odpovídá výtěžku 33,4% konečného produktu.The filtrate from the above reaction was mixed with 40 mL of methylene chloride, the pH was adjusted from 6: 2 to 2.0 to remove additional starting material. The layers were separated, and the aqueous portion was extracted with two 40 mL portions of methylene chloride, then the pH of the aqueous layer was adjusted to 3.7, and a small portion of both acetone and methylene chloride was removed by distillation in vacuo. The aqueous solution was hydrogenated in the presence of 3.0 g of 5% palladium on carbon catalyst for 24 hours at 15 ° C and 50 psi hydrogen, then the reaction mixture was filtered through a pad of diatomaceous earth to remove the catalyst and the filtrate volume was removed. make up to 100 ml, and take a 1 ml sample for testing on a petri dish and paper disc. In the first test, the content of the compound of formula IV is 1936 mcg / ml, in the second test 2325 mcg / ml, which corresponds to a yield of 33.4% of the final product.

Zbývajících 99 ml roztoku se zahustí na objem asi 30 ml, a provede se chromatografie na koloně, jak to zde bylo dříve již popsáno, například v příkladu 14. Spojené frakce, obsahující látku vzorce IV, o celkovém objemu 500 ml se zahustí na objem asi 20 ml, к tomuto koncentrátu se přidá 45 ml methylalkoholu a potom po kapkách asi 25 mililitrů isopropylalkoholu k vyvolání krystalisace produktu. Krystalický materiál se zachytí na filtru, promyje se směsí methylalkoholu a isopropylalkoholu 50 : 50, a sušením se dále získá 2,31 g BB-K8, tedy látky vzorce IV. Podle testu na Petriho misce lze zjistit obsah 836 mcg/mg, což -odpovídá čistotě 83,6 % a skutečnému výtěžku čisté látky vzorce IV 33,3 %, přepočteno na 9,9 mmolu výchozí látky.The remaining 99 ml of the solution is concentrated to a volume of about 30 ml, and column chromatography is carried out as previously described herein, for example in Example 14. The combined fractions containing the compound of formula IV with a total volume of 500 ml are concentrated to a volume of about 20 ml, to this concentrate was added 45 ml of methanol and then dropwise about 25 ml of isopropyl alcohol to induce crystallization of the product. The crystalline material was collected on a filter, washed with a 50:50 mixture of methanol and isopropyl alcohol, and further dried to give 2.31 g of BB-K8, a compound of formula IV. The Petri dish test showed a content of 836 mcg / mg, corresponding to a purity of 83.6% and an actual yield of pure IV of 33.3%, calculated on 9.9 mmol of starting material.

Tabulka ITable I

Srovnání akutních toxicit aminoglykosidůComparison of acute aminoglycoside toxicities

Zvíře Způsob LDso (mg/báze/kg)Animal Method LD 50 (mg / base / kg)

podávání administration BB-K8 BB-K8 Kanamycin citace Kanamycin quotes Gentamycin cit. 2 Gentamycin cit. 2 Tobramycin cit. 3 Tobramycin cit. 3 Neomyclii cit. 2 Neomyclii cit. 2 bis-hydrogensíran bis-hydrogen sulfate síran sulfate 1 1 2 2 myš mouse i.v. i.v. 232 232 225 225 262 262 225 225 75 75 56 56 40 40 i.p. i.p. 1470 1470 1750 1750 1394 1394 1125 1125 430 430 — - 225 225 subk. subk. 1838 1838 1850 1850 1368 1368 1350 1350 485 485 367 367 275 275 per os per os — - >8000 > 8000 >8300 > 8300 >8000 > 8000 >9050 > 9050 >8000 > 8000 >8000 > 8000 krysa rat i.v. i.v. — - 175 175 — - — - — - 133 133 — - subk. subk. >2205 > 2205 2700 2700 — - — - — - 973 973 — - per os per os — - >8000 > 8000 — - — - — - >7000 > 7000 — - pes dog i.v. i.v. — - 287 287 — - — - — - — - — - i.m. i.m. — - >500 > 500 — - — - — - — - — - králík rabbit i.v. i.v. — - 186 186 — - — - — - — - — - i.m. i.m. >735 > 735 — - — - — - — - — - — - opice monkey i.m. i.m. >735 > 735 >1000 > 1000 — - — - — - — -

Biologická účinnost sloučeniny vzorce IV, jež je označována jako amikacin, byla sledována celou řadou, autorů v četných sděleních. Z nejzávažnějších lze citovat: G. D. Overturf, J. Wilkinsová a R. Ressler, J. ' Infect. Diseases 129, 353 (1974) testovali 9 antibiotik na 114 kmenů Providencia (alcalifaciens, stuartii atd); zjistili, že uvedené mikroorganismy jsou často resistentní, zvláště na tetracyklin a chloramfenikol, přičemž streptomycin a ampicilin se vyznačují také nižší a nedostačující účinností. Karbenicilin a kanamycin má v některých případech 100 procentní účinnost, jindy nulovou a jedinou látkou z testovaných antibiotik, jež je suverénně 100% účinná, je amikacin. Dále J. Clarke, R. Libke, C. Regamey a W. Kirby popisují v Clin. Pharmacology and Therapeutics 15, 610 (1974), že se amikacin vyznačuje ve srovnání s kanamycinem podstatně větší účinností proti kmenům Pseudomonas, produkujícím enzymy, desaktivující gentamycin, tobramycin a kanamycin. Farmakokineticky parametry amikacinu a kanamycinu jsou jinak prakticky totožné. Japonští autoři S. Mitsuhashi, H. Kawabe, S. Iyobe, T. Tanaka a M. Inoue, Japan. J. Antibiotics 27, 189 (1974) sledovali antibakterielní učinnost amikacinu ve srovnání s dalšími , an tibiotiky; zjistili vysokou účinnost sledované látky na Staphylokoky a gram-negativní bacily s tím, že amikacin je účinnější než kanamycin A, zvláště proti Pseudomonas aeruginosa; vyznačuje se v tomto případě účinností i proti kmenům, resistentním na gentamycin. Jinak jsou účinnosti amikacinu a gentamicinu přibližně shodné. K podobným výsledkům došli další japonští autoři ve sděleních z téhož časopisu, 27, -str. 193, 202, 212, 218, 223, 226, 234, 238, 337, 343, 377, 343, 366, 382, 389, 392, 401, 354, 370, 328.The biological activity of the compound of formula IV, which is referred to as amikacin, has been studied by a number of authors in numerous reports. The most serious of these are: G. D. Overturf, J. Wilkins and R. Ressler, J. 'Infect. Diseases 129, 353 (1974) tested 9 antibiotics on 114 Providencia strains (alcalifaciens, stuartii etc); have found that said microorganisms are often resistant, especially to tetracycline and chloramphenicol, while streptomycin and ampicillin are also characterized by lower and insufficient efficacy. In some cases, carbenicillin and kanamycin have 100% efficacy, at other times zero and the only substance of the tested antibiotics that is 100% efficiently is amikacin. Further, J. Clarke, R. Libke, C. Regamey, and W. Kirby are described in Clin. Pharmacology and Therapeutics 15, 610 (1974), that amikacin exhibits substantially greater potency against gentamycin, tobramycin and kanamycin inactivating strains of Pseudomonas strains. The pharmacokinetic parameters of amikacin and kanamycin are otherwise practically identical. Japanese authors S. Mitsuhashi, H. Kawabe, S. Iyobe, T. Tanaka, and M. Inoue, Japan. J. Antibiotics 27, 189 (1974) studied the antibacterial activity of amikacin as compared to other antibiotic; found high efficacy of the compound of interest on Staphylococci and gram-negative bacilli, with amikacin being more potent than kanamycin A, particularly against Pseudomonas aeruginosa; in this case it is also effective against gentamycin-resistant strains. Otherwise, the efficacy of amikacin and gentamicin are approximately equal. Similar results were reached by other Japanese authors in reports from the same magazine, 27, -p. 193, 202, 212, 218, 223, 226, 234, 238, 337, 343, 377, 343, 366, 382, 389, 392, 401, 354,370,328.

J. P. Buyniski a Μ. E. .Bierwagen, Res. Comm. in Chem. Pathology and Pharmacology zjistili, že při intravenosní infusi kanamycinu nebo amikacinu v dávkách 30 mg/kg není ovlivněn krevní tlak v aortě, srdeční rychlost ani charakter kardiogramu.J. P. Buyniski and Μ. E. Bierwagen, Res. Comm. in Chem. Pathology and Pharmacology found that intravenous infusion of kanamycin or amikacin at doses of 30 mg / kg did not affect aortic blood pressure, heart rate or cardiogram character.

Výsledky klinických zkoušek jsou patrné ze sdělení, které publikovali G. j R. Manotas, H. S. Trujillo a R. G. Londono, P. A. Uribe, E. L. de Vidal a N. J. Agudelo v J. Intern. Med. Res. 3, 223, (1975); 15 kojenců ve· stá. ří 2 až 21 dnů bylo léčeno při projevu infence (E. coli) amikacinem v denních dávkách od 126 do 350 mg podle hmotnosti dítěte. 14 dětí bylo vyléčeno; nebyly pozorovány ani systemické, ani lokální projevy léčby.The results of the clinical trials are evident from reports published by G.J. Manotas, H. S. Trujillo and R. G. Londono, P. A. Uribe, E. L. de Vidal and N. J. Agudelo in J. Intern. Copper. Res. 3, 223 (1975); 15 infants in size. Two to 21 days were treated with amikacin for infections (E. coli) at daily doses of 126 to 350 mg, depending on the weight of the child. 14 children were cured; neither systemic nor local manifestations of treatment were observed.

Claims

1. A process for the preparation of 1- [L-a-Amino-α-hydroxybutyryl]-kanamycin A of formula IV (IV), characterized in that 6'-N-benzyloxycarbonylkanamycin A of formula IV is treated in the first step of the process. II with an aldehyde from the group consisting of benzaldehyde, salicylaldehyde, p-nitrobenzaldehyde, p-methoxybenzaldehyde and pivaldehyde in a molar ratio of 1 mole of 6'-N-benzyloxycarbonylkanamycin A of formula II to 3 moles of aldehyde in absolute ethanol, methanol, n-propanol , 2-propanol, n-butanol, sec-butanol, tert-butyl alcohol, tetrahydrofuran, - dloxane, dimethylformamide or acetone or mixtures thereof or mixtures of the abovementioned solvents with water at a temperature ranging from 5 ° C to reflux from 30 minutes to 5 hours to give 6'-carbobenzoxy-1,3,3 '- trialdehydocannamycin A of formula III, and in the second step, 6'-carbobenzoxy-1,3,3' - tri The aldehyde-kanamycin A of formula (III) immediately be from the isolation of N-hydroxy-6-norbornene-2,3-dicarboximide ester with L-ybenzyloxycarbonylamino-α-hydroxybutyric acid of formula XX in a ratio of 1 mole of 5-mol of N-hydroxy-6-norbornene-2,3-dlcarboxl ester of Ly-benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybutyrate of formula XX at a temperature ranging from -10 ° C to +35 for one hour in the same solvents mentioned in the first step, after which the organic solvent is removed and the residue is immediately hydrogenated with hydrogen in the presence of a metal catalyst from the group consisting of palladium, platinum, Raney nickel, rhodium, ruthenium and nickel in water or a water-miscible solvent of water; dioxane, tetrahydrofuran, ethylene glycol dimethyl ether and propylene glycol dimethyl ether at pH 3-5 to give 1- [L- (-) -? -amino-. alpha.-hydroxybutyryl]-kanamycin A of formula IV.

2. A process according to claim 1, wherein in the first step of the process, 6 ' -N-benzyloxycarbonylcanamycin A of formula II is treated with an aldehyde selected from the group consisting of benzaldehyde, salicylaldehyde, p-nitrobenzaldehyde and p-methoxybenzaldehyde -N-benzyloxycarbonylkanamycin A of formula II per 3 moles of aldehyde in an environment of absolute ethyl alcohol, methyl alcohol, n-propyl alcohol, isopropyl alcohol, methylene chloride, n-butyl alcohol, sec-butyl alcohol, tert-butyl alcohol, tetrahydrofuran, dioxane, dimethylformamide or dimethylformamide from 5 ° C to 40 ° C for 30 minutes to 5 hours to give 6'-carbobenzoxy-1,3,3'-trialdehyde-canamycin A of formula III, wherein Z is-N = CH ¹ j or

OCH 3 and in the second step, the 6'-carbobenzoxy-1,3,3'-tri-aldehyde-canamycin A of formula III is reacted immediately in the reaction mixture or after isolation of the N-hydroxy-6-norbornene-2,3-dicarboximide ester with Ly- of benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybutyrate of formula XX in a ratio of 1 mole of 6'-carbobenzoxy-1,3,3'-trialdehyde-canamycin A of formula III to 0.5 to 1 mole of N-hydroxy-6-norbornene-2,3-dicarboximide ester L-χ-benzyloxycarbonylamino-ε-hydroxybutyric formula XX in the temperature range from +5 ° C to +35 C for one hour to 3 hours in the solvent system as mentioned in the first step, after which the solvent is distilled off and the residue is hydrogenated immediately hydrogen in the presence of a metal catalyst from the group consisting of palladium, platinum, Raney nickel, rhodium, ruthenium and nickel in water or in a water-miscible solvent environment such as water and dioxane, tetrahydrofuran, ethylene glycol dimethyl ether and propyl dimethyl ether of lenglycol at a pH of 3 to 5 to give 1- [L- (-) - N-amino-α-hydroxybutyryl]-kanamycin A of formula IV.

3. Process according to claim 1 or 2, characterized in that, in a first step, 6'-N-benzyloxycarbonylkanamycin A of formula II is treated with an aldehyde selected from benzaldehyde, salicylaldehyde and p-nitrobenzaldehyde in a ratio of 1 mol of 6'-N. -benzyloxycarbonylcanamycin A of formula II to about 3 moles of aldehyde in an environment of absolute ethyl alcohol, methyl alcohol, n-propyl alcohol, isopropyl alcohol, n-butyl alcohol, sec-butyl alcohol, tert-butyl alcohol, tetrahydrofuran, dioxane, methylene chloride or dimethylformamide; or mixtures thereof with water at a temperature in the range of 5 ° C to 40 ° C for 30 minutes to 5 hours to give 6'-carbobenzoxy-1,3,3'-trialdehyde-canamycin A of formula III, wherein Z is means the remainder of the formula followed by treatment in the second step with 6'-carbabenzoxy-1,3,3'-tri-aldehyde-canamycin A of formula III immediately in the reaction mixture or after isolation with N-hydroxy-6-norbornene-2,3-dicarboximide ester Ly -benzyloxycarbonylamino -α-hydroxybutyric formula XX in a ratio of 1 mole of 6'-carbobenzoxy-1,3,3 '-trialdehyde-canamycin A of formula III per 0.5 mole to 1 mole of N-hydroxy-6-norbornene-2,3-dicarboximide ester Ly- benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybutyrate of formula XX in the temperature range from + 5 ° C to + 35 ° C for one hour to 3 hours in the solvent system as mentioned in the first step, after which the solvent is distilled off and the residue hydrogenated immediately with hydrogen in the presence of a metal catalyst from the group consisting of palladium, platinum,

Raney nickel, rhodium, ruthenium and nickel, in water or a water miscible solvent such as water and dioxane, tetrahydrofuran, ethylene glycol dimethyl ether and propylene glycol dimethyl ether at a pH of from about 4 to form 1- [L- (-) - γ-amino-α-hydroxybutyryl-kanamycin A of formula IV.

4. A process as claimed in any one of claims 1 to 3 ' in which, in a first step, 6'-N-benzyloxyl-4-carbonylcarbamycin A of formula II is treated with benzaldehyde in a ratio of 1 mole of 6'-N-benzyloxycarbonylanamycin A of formula II. to 3 moles of benzaldehyde in a 1: 1 mixture of water and tetrahydrofuran at 20 ° C to 30 ° C for 2 'to 4 hours at pH 10 to give 6'-carbobenzoxy-1,3,3'-trisaiycilalkanamycin A of formula IIIa and the 6'-carbobenzoxy-1,3,3 '-trisalycilalkanamycin A of formula IIIa is treated immediately after preparation or isolation of N-hydroxy-6-norbornene-2,3-dicarboximide ester with L-benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybutyric acid of formula XX in a ratio of 1 mol of 6'-carbobenzoxy-1,3,3'-trisalicylalkanamycin 'A of formula IIIa per 0.6 to 0.75 mol of N-hydroxy-6-norbornene-2,3-dicarboximide ester of Ly-benzyloxycarbonylamino- α-hydroxybutyrate of formula XX at a temperature ranging from 20 ° C to 30 ° C for 1 hour to 3 hours in solvents as previously described in methylene chloride / methanol / water or dimethylformamide / acetone / water, the solvent is distilled off in vacuo, the pH is adjusted to 4 by addition of aqueous ammonia and the residue is immediately hydrogenated with hydrogen under normal pressure in the presence of hydrogen. palladium on carbon to give 1- [L- (-) -y-amino-α-hydroxybutyryl] -canamycin A of formula IV.

5. A process according to any one of claims 1 to 3, wherein in the first step, 6'-N-benzyloxycarbonyananycin A of formula II is treated with salicylaldehyde in a ratio of 1 mole of 6'-N-benzyloxycarbonylkanamycin A of formula II to 3 moles of salicylaldehyde in water. and tetrahydrofuran 1: 1 at 20 ° C to 30 ° C for 2 to 4 hours at pH 8 to give 6'-carbobenzoxy-1,3,3'-tri-o-hydroxybenzalkanamycin A of formula IIIb

21275 5

CH, OH

O (III b) and 6'-carbobenzoxy-1,3,3'-tri-o-hydroxybenzalkanamycin A of formula IIIb are treated immediately after preparation or after isolation of N-hydroxy-6-norbornene-2,3-dicarboximide ester with Ly acid -benzyloxycarbonylamino-hydroxybutyric formula XXX in a ratio of 1 mol of 6'-carbobenzoxy-1,3,3 '-tri-o-hydroxybenzalkanamycin A of formula IIIb to 0.6 to 0.75 mol of N-hydroxy-6-norbornene-2, L-Ybenzyloxycarbonylamino-α-hydroxybutyric acid 3-dicarboximide ester of formula XX at a temperature ranging from 20 ° C to 30 ° C for 1 hour to 3 hours in the solvents described in the first step or in a mixture of dimethylformamide, acetone and water. the solvent is distilled off in vacuo, the pH is adjusted to 4 by addition of aqueous ammonia solution and the residue is hydrogenated immediately with hydrogen under normal pressure and in the presence of palladium on carbon to give 1- [L- (- (y-amino-α-hydroxybutyryl) -canamycin A) of formula IV.

6. Method according to points. 1 to 3, characterized in that, in the second step of the process, 6'-carbobenzoxy-1,3,3'-trialdehyde-canamycin A of the formula III is treated in situ or for isolation with L - 1 '- benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybutyric acid of formula VI and N-hydroxy-5-norbornene-endo-2,3-dicarboximide of formula XIX

H-O-CO-CH-CH2-CH2-OH-NH-COO-CH2-OeH5 (VI) (XX) followed by 1 mole of 6'-carbobenzoxy-1,3,3'-trialdehyde diocanamycin in dicyclohexylcarbodiimide A of formula III to 0.5 to 1.0 mol of L-benzylcarbonylamino-α-hydroxybutyric acid of formula VI and dicyclohexylcarbodiimide, and 0.005 to 0.25 mol of N-hydroxy-5-norbornene-endo-2,3-dicarboximide of formula XIX in the temperature range of. - 10 ° C to + 35 ° C for 10 hours in solvents as described in the first step, after which the organic solvent is distilled off and the residue is hydrogenated immediately as described in points 1 to 3 to give 1- [L- (-) - γ-amino-α-hydroxyxybutyryl] -canamycin A of formula IV.

7. A process according to claim 6, wherein 6'-carbobenzoxy-1,3,3'-trialdehyde-kanamycin A of formula III is treated immediately or after isolation with Ly-benzyloxycarbonylamino-.alpha.-hydroxybutyric acid of formula VI and N-hydroxy. - S-norbornene-endo-4-dicyclo: • Boximide of formula XIX followed by addition of dicyclohexylcarbodiimide in a ratio of 1 mole of 6'-Carbobenzoxyl-1,3,3'-trialdehyde-canamycin A of formula III to 0.5 to 0.85 mol L ---- benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybutyric formula VI and dicyclohexylcarbodiimide and 0.05 to 0.425 moles of N-hydroxy-5-norbornene-endo-2,3-dicarboximide XIX in the temperature range from +5 ° C to 25 ^€ C for 1 hour to 3 hours at. solvents as described in the first step.

8. A process as claimed in claim 6, characterized in that in the second step, 6'-carboben ^, zoxy-1,3,3'-1H-aldehyde-kanamycin A of the formula III is reacted immediately after the reaction with Ly-benzyloxycarbamonic acid. The compound of formula VI and N-hydroxy-5-norbornene-endo-2,3-dicarboximide of formula XIX followed by the addition of dicyclohexylcarbodiimide in a ratio of 1 mole of 6'-carbobenzoxy-1,3,3'-trialdehyde-canamycin A of formula. III from 0.5 to 0.8 mole benzyloxykarbonvlamino Ly-α-hydroxybutyric acid of formula VI and dicvklohexylkarbodiimidu and 0.05 to 0.425 mol of N ^{τ-hydroxy-5-norbornene-Encl-2,3-dicarboximide} of the formula XIX in the temperature roz212755 between + 15 ° C and + 30 ° C for 15 to 25 hours.

9. A process according to claim 4, characterized in that in the second step, 6'-carbobenzoxy-1,3,3'-trisalicylalkane-4-mycin A of formula IIIa is treated in situ or after isolation with 1,1'-benzyloxycarbonylamino. -hydroxy-butyric acid of formula VI and N-hydroxy-5-norbornene-endo-2,3-dicarboximide of formula XIX with stirring followed by addition of 1 mole of 6'-carbobenzoxy-1,3,3'-trisalicylalka ^: namycin A of formula IIIa to 0.6 to 0.75 mol of Ly-benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybutyric acid of formula VI and dicyclohexylcarbodiimide and 0.06 to 0.375 mol of N-hydroxy-5-norbornene-endo-2,3-dlcarboximide of formula XIX in the temperature range -j -25 ° C to +35 C, ^Q 'for 15 to 25 hours in a mixture of tetrahydrofuran and water in a ratio of 1: 1st

10. A process according to claim 5, wherein in the second step, 6 ' -carbobenzoxy-1,3,3 ' -tri-o-hydroxybenzalkanamycin A of formula IIIb is treated in situ or after tosylation with L-.gamma.-benzyloxycarbonylamino-K-.

-hydroxy-butyric acid of formula VI and N-hydroxy-5-norbornene-endo-2,3-dicarboximide of formula XIX with stirring followed by the addition of 1-dicyclohexylcarbodiimide in a ratio of 1 mole of 6'-carbobenzoxy-1,3,3'-tri-o-hydroxyxybenzalkanamycin A of formula IIIb to 0.6 to 0.75 mol of Ly-benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybutyric acid of formula VI and dicyclohexylcarbodiimide and 0.06 to 0.375 mol of N-hydroxy-5-norbornene-endo-2,3-dicarboximide of formula XIX in the temperature range + 20 ° C to 30 ° C for 15 to 25 hours in a 9: 1 mixture of tetrathydrofuran and water.