SE417971B

SE417971B - PROCEDURE FOR PREPARING 1- (L - (-) - GAMMA-AMINO-ALFA-HYDROXIBUTYRYL) -CANAMYCINE A

Info

Publication number: SE417971B
Application number: SE7401669A
Authority: SE
Inventors: R H Schreiber; J G Keil
Original assignee: Bristol Myers Co
Priority date: 1973-02-07
Filing date: 1974-02-07
Publication date: 1981-04-27
Also published as: CH593994A5; YU30674A; CA1021329A; DK141910C; NL182962B; JPS49102644A; DK141910B; SU667142A3; HU170378B; FI58134B; NL7401517A; NL182962C; FI58134C; JPS575797B2

Description

7401669-2 Kanamycin A uppvisar fyra primära aminfunktioner i molekylens 1-, 3-, fr- och 3“-ls.~.ä11nigngar. nss har fastställts att 6'- aminfunktionen är den reaktiüaste och att l-aminfunktionen kommer därnäst när det gäller reaktivitet vid behandling med ett elektrofilt medel. Både 3- och 3"-ställningarn gär mind- re reaktiva än_l- eller 6'-aminfunktionerna men reagerar än- 'dock under bildning av de icke önskvärda acylerade produkter- na i lågt utbyte. Ändamålet med föreliggande uppfinning är att åstadkomma ett förbättrat förfarande för selektiv acylering av l-aminfunk- ttionen i kanamycin A. Uppfinningen avser närmare bestämt ett nytt och väsentligt effektivare förfarande för framställning av l-LL-(,-)-' X-amino-of-hydroxibutyryU-kanamycin A med for- meln cﬂa -Nnz :io s.H° _ f Förfaranüet enligt nppfinningen innebär att man selektivt acy- i lerar 6'-aminofunktionen i kanamycin A på i och 'för sig' känt sätt med N- (bensyloxikarbonyloxi)-succinimid för framställning' wav föreningen med formeln ~_-.. . 1. a. 7401669-2 o H I inför L-(-)- X-amino-Oí -hydroxibutyrylgruppen i den önskade l-ställningen och avlägsnar blockeringsgrupperna,varvid för- farandet utmärks av att man A) behandlar en mol av förening II med 3-6 mol av en aldehyd, som utgörs av 4-nitrobensaldehyd, bensaldehyd, 4-metoxibens- aldehyd eller pivaldehyd, i en (lägre)alkanol, som utgörs av absolut etanol, metanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, sekwbutanol, tert.-butanol eller blandningar därav, vid en temperatur av från 50°C till ungefär systemets återflödes- temperatur under 2-10 timmar för framställning av en förening med formeln 7401669-2 '. t; |_'Å' .Iz .ill , . I _. i I c / \ løcﬂ; I mer :N-.C-f-Cﬂszf' _ '.' .lï-ÉL: ' , egvará. Z lltsön en END? med formeln _N_-_ä_®_iw I-:rtwcß @.Mï_ . 1 f ._ g%'gP¿ ~;aq!gr och B) behandlar en mol av förening III med l-1,3 mal L-(-)-X- bensylóxikarbonylamind-of-hydroxismörsyra-N-hydrokisucdinimid- ester i ett lösningsmedel, som utgörs av dimetylformamid, tetrahydrofuran, dimetylacetamid, propylenglykoldimetyleter, etylenglykoldimetyleter eller dioxan, vid en temperatur av från ca lO°C till ca 35°C, därefter avlägsnar lösningsmedlet vi vakuum óch hydrerar återstoaen in situ med väte i närvaro av en metallkatalysator, som utgörs av palladium, platina,f rodium,.Raney-nickel, rutenium eller nickel, i ett system, som utgörs av vatten och ett med vatten blandbart lösnings- medel och som består av vatten och dioxan, tetrahyärofuran, etylenglykoldimetyleter eller propylenglykoldimetyleter, i närvaro av en kátalytisk mängd isättika för framställning av förening IV. ' I Förening IV, egl-/ïl-(ﬂ-X-Éamino-ot -hydroxibutyryy-kanamycin A, luppvisar utmärkt antíbakteriell aktivitet, som visar sig vara 7401669-2 5 överlägsen aktiviteten av kanamycin A. I de två tabellerna nedan åskådliggörs minimuminhiberingskoncentrationerna (MIK) för kanamycin A och förening IV (BB-K8) med avseende på en mångfald grampositiva och gramnegativa bakterier, vilka kon- centrationsvärden har erhållits medelst Steers agar-utspäd- ningsmetod (tabell l) och den tvåfaldiga spädningsmetoden (tabell 2). Mueller-Hintons agarmedium användes vid försöken enligt tabell l och hjärtinfusionmedium användes vid försö- ken enligt tabell 2. 7401669-2 Kanamycin A exhibits four primary amine functions in the molecules 1-, 3-, fr- and 3 "-ls. ~ .Ä11nigngar. nss has been determined that the 6'-amine function is the most reactive and that the 1-amine function comes next in terms of reactivity when treated with an electrophilic agent. Both the 3- and 3 "-positions are less reactive than the 1- or 6'-amine functions but still react to form the undesirable acylated products in low yield. The object of the present invention is to provide an improved process More particularly, for the selective acylation of the 1-amine function in kanamycin A. The invention relates to a new and substantially more efficient process for the preparation of 1-LL - (, -) - 'X-amino-of-hydroxybutyryl-kanamycin A of the formula The process according to the invention involves selectively acylating the 6 'amino function of kanamycin A in a manner known per se with N- (benzyloxycarbonyloxy) -succinimide for the preparation of the compound with the formula ~ _- ... 1. a. 7401669-2 o HI introduces the L - (-) - X-amino-O 1 -hydroxybutryl group in the desired 1-position and removes the blocking groups, the process being characterized in that A) treats one mole of compound II with 3-6 moles of an aldehyde consisting of 4-nitrobenzene ldehyde, benzaldehyde, 4-methoxybenzaldehyde or pivaldehyde, in a (lower) alkanol consisting of absolute ethanol, methanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, sec-butanol, tert-butanol or mixtures thereof, at a temperature of from 50 ° C to approximately the reflux temperature of the system for 2-10 hours to prepare a compound of formula 7401669-2 '. t; | _'Å '.Iz .ill,. I _. i I c / \ løc ﬂ; I mer: N-.C-f-C ﬂ szf '_'. ' .lï-ÉL: ', egvará. Z lltsön and END? with the formula _N _-_ ä_®_iw I-: rtwcß @ .Mï_. And b) treat one mole of Compound III with 1- 1.3 moles of L - (-) - X-benzyloxycarbonylamine-or-hydroxybutyric acid N-hydroxy-succinimide ester in a solvent consisting of dimethylformamide, tetrahydrofuran, dimethylacetamide, propylene glycol dimethyl ether, ethylene glycol dimethyl ether or dioxane, at a temperature of from about 10 ° C to about 35 ° C, then removes the solvent in vacuo and hydrates the residue in situ with a metal catalyst in the presence of , consisting of palladium, platinum, rhodium, Raney nickel, ruthenium or nickel, in a system consisting of water and a water-miscible solvent and consisting of water and dioxane, tetrahyrofuran, ethylene glycol dimethyl ether or propylene glycol dimethyl ether, in the presence of a catalytic amount of glacial acetic acid to prepare compound IV. In Compound IV, egl / β- (ﬂ-X-Amino-α-hydroxybutyryl-kanamycin A, has excellent antibacterial activity, which is found to be superior to the activity of kanamycin A. The two tables below illustrate the minimum inhibitory concentrations. (MIK) for kanamycin A and compound IV (BB-K8) with respect to a variety of gram-positive and gram-negative bacteria, which concentration values have been obtained by the Steers agar dilution method (Table 1) and the two-fold dilution method (Table 2). Mueller-Hinton's agar medium was used in the experiments of Table 1 and cardiac infusion medium was used in the experiments of Table 2.

'Tabell l (MIK Eg.¿ml.) Förening IV _ ~ Kanamycin A (BB-K8) Organlsm 5 (6-8198) _gts Nr. 4 1. Alk. faecalis A-9425 16 ' 8 2. " Å " A-eosus ' > 125 >125 5. Ent. cloacae A-0656 5 4 4 .4. " species A-20564 >l25 2 ' 5. " hafniae 1 A-20674 1 1 6. E. w cóli-A-0656 ' 2 1 7. "_ «' H A-zoeeu _ 16 u. 8. " " A-20665 >l25 1 9. ". " Ag-2o5o7 52 2 10". " "_ A-2052O 125 4 ll. " " A-20565 125 1 12. " " A-20684 2 2 15. E " A-20682 ' - >125 2 14. '” A-20685 _. 125 8 15. " " A-20681 125' 2 16. " " A-15119 - 4' 4 17. K. pneumoniae A-0967 4 4 16. " species A 20528 “ >l25 2 2 19. " " _ A-20550 52 52 20. " " .11-20654 >12 5 4 21. " pneumoniae A-20680 >l25 4 22. " " _ _ 11-0077 1 1 25. Pr. mmrabllls A-9900 2 2 24. Pr. morganlm A-15155 2 2 25. " vulgarla A-9555 2 . 1 26. " rettgerl A-9656 0,25 0,25 27- " m}rab1l1s A-20645 4 4 26. " mlrabzlms A-20454 2 2 29. Providencia stuartii A-20615 2 1 50. " _ alkalifaciens A-20676 l l 5l. Es. aernglnosa A-20229 5 2 52. “ " ' A-O945A 125 16 53 . g _ 1-20655 > 125 - 52 54. " speczes A-20601 125, 65 16 55. " " 11-20621 > 125 > 125 56. " maltophilia A-20620 52 >l25 1,~vuo16as+22. sàl., enteiiviais 11-0531 372 1 0.5 as. " 2 derby A-zoos? >125 '1 59. Ser. marcescens A-20019 5 2 4 240 2 2 2:: A~9935 ~4 28 41. A-20460 >125 4,2 42. I' " 5 .A-2o459 L. 16 45.~.Shig. flexneri A-9684 4 4 44 ; Aeromonas sp. A+206?0 2 2 45. 2Arizona sp. A-20671 2 2 1 246. Citrobacter sp. A-20675 24. 4 47. Edwardsiella sp. A-20678 4 4 48. Staph. aureus A-9606 ' 1 1 49. "2 _ F' A-4749 0,5 1 50.- "_ _ " .A-9537 2 2 1 51 "_ ' " 21-20610 >125 »2 52. §taph. auzïeus 11-20240 >125 2 8 55. 5! 5 ' _ .A-15197 ' l j 2 54.5_§tr.2faecﬁ11s A<9854 65 2 65 55- 2¿ 5 25 5 A-9575 125 >l25 56. u 2pyogenes5A-20200 52, 16 52 57. H '~ : »A-9604 125 125 58. _ 22A-15040 125 _l25 59. " 2“2 A-20065 125 ' 125 60. _D. pneumoniae A-9585 65, 52 65 61. " " 4-20159 125 _>125 Tabell 2 §MIK Eg.¿m1.) 2 Förenin IV Gr a ¿ Kanamïcàn A (šß-šßš u 5 nlsm - - 2sa s r l. D. pneumoniae ï5%íserum A-0585 65 65 _-2.~ Str. pyrogenes.35ß serum A-96042 125 125 5. Staph. aureus Sm1th_Af9557 0,5 0,5 _4. Staph. aureus A-9497 _ 0,5 0,5 _ 5. Staph aureus A-20239 125 4 6. Staph. aureus A-20240 2 2 125, 2 4 47. Enter. qloaçae A-0656 2 22' 8. Enter. speçles A-20564 125 2 ' 9. K. pnagmonlae A~986? V 2 2 4 2 10. E. co11 Kfl2 ML1410~A-20561 2 4 - ll. 2E. col; K-12 ME1630 A-20563 125 2 12. E. co112K~l2 A-9632 2 2 21 15. E. co11 A-20664 2 52 8 14. E. co11 A-26665 125 B 15. Pr. mirabi11s A-9900 2 16 5 16. Pr. morganll A-15155 4 '16 17. Pr. vulgapis A~9456 1 2 18. Ps.2aerug1nosa A~2022?5 4 1 19.2 Ps. speclçs A-20499_ 65 2 4 2 20. Ps. aeruglnosa A-20655 125 4 21. Ps. specmes A~2062l 125 125 22 Ser. marcescens A-20019 2 4 16 16 2Ser.2màrcescens A-20141' 7001669-2 Ovan angivna MIK-data visar att föreningen IV (BB-K8) är överlägsen kanamycin A i aktivitet, speciellt med avseende på kanamycin A-resistenta organismer.'Table l (MIK Eg.¿ml.) Compound IV _ ~ Kanamycin A (BB-K8) Organlsm 5 (6-8198) _gts Nr. 4 1. Alk. faecalis A-9425 16 '8 2. "Å" A-eosus'> 125> 125 5. Ent. cloacae A-0656 5 4 4 .4. "species A-20564> l25 2 '5." hafniae 1 A-20674 1 1 6. E. w cóli-A-0656' 2 1 7. "_« 'H A-zoeeu _ 16 u. 8. "" A-20665> l25 1 9. ". "Ag-2o5o7 52 2 10". "" _ A-2052O 125 4 ll. "" A-20565 125 1 12. "" A-20684 2 2 15. E "A-20682 '-> 125 2 14.'” A-20685 _. 125 8 15. "" A-20681 125 '2 16 . "" A-15119 - 4 '4 17. K. pneumoniae A-0967 4 4 16. "species A 20528"> l25 2 2 19. "" _ A-20550 52 52 20. "" .11-20654> 12 5 4 21. "pneumoniae A-20680> l25 4 22." "_ _ 11-0077 1 1 25. Pr. Mmrabllls A-9900 2 2 24. Pr. Morganlm A-15155 2 2 25." vulgarla A- 9555 2. 1 26. "rettgerl A-9656 0,25 0,25 27-" m} rab1l1s A-20645 4 4 26. "mlrabzlms A-20454 2 2 29. Providencia stuartii A-20615 2 1 50." _ alkalifaciens A- 20676 ll 5l. Es. aernglnosa A-20229 5 2 52. "" 'A-O945A 125 16 53. g _ 1-20655> 125 - 52 54. "speczes A-20601 125, 65 16 55." "11-20621> 125> 125 56 . "maltophilia A-20620 52> l25 1, ~ vuo16as + 22. sàl., enteiiviais 11-0531 372 1 0.5 as." 2 derby A-zoos? > 125 '1 59. Ser. marcescens A-20019 5 2 4 240 2 2 2 :: A ~ 9935 ~ 4 28 41. A-20460> 125 4,2 42. I '"5 .A-2o459 L. 16 45. ~ .Shig. flexneri A -9684 4 4 44; Aeromonas sp. A + 206? 0 2 2 45. 2Arizona sp. A-20671 2 2 1 246. Citrobacter sp. A-20675 24. 4 47. Edwardsiella sp. A-20678 4 4 48. Staph. Aureus A-9606 '1 1 49. "2 _ F' A-4749 0,5 1 50.-" _ _ ".A-9537 2 2 1 51" _ '"21-20610> 125» 2 52 §Taph. auzïeus 11-20240> 125 2 8 55. 5! 5 '_ .A-15197' lj 2 54.5_§tr.2faec ﬁ11 s A <9854 65 2 65 55- 2¿ 5 25 5 A-9575 125> l25 56. u 2pyogenes5A-20200 52, 16 52 57. H '~ : »A-9604 125 125 58. _ 22A-15040 125 _l25 59." 2 “2 A-20065 125 '125 60. _D. Pneumoniae A-9585 65, 52 65 61." "4-20159 125 _> 125 Table 2 §MIK Eg.¿m1.) 2 Förenin IV Gr a ¿Kanamïcàn A (šß-šßš u 5 nlsm - - 2sa sr l. D. pneumoniae ï5% íserum A-0585 65 65 _-2. ~ Str. Pyrogenes .35ß serum A-96042 125 125 5. Staph aureus Sm1th_Af9557 0.5 0,5 _4 Staph aureus A-9497 _ 0,5 0,5 _ 5. Staph aureus A-20239 125 4 6. Staph aureus A-20240 2 2 125, 2 4 47. Enter. Qloaçae A-0656 2 22 '8. Enter. Speçles A-20564 125 2' 9. K. pnagmonlae A ~ 986? V 2 2 4 2 10. E. co11 Kfl2 ML1410 ~ A-20561 2 4 - ll. 2E. Col; K-12 ME1630 A-20563 125 2 12. E. co112K ~ l2 A-9632 2 2 21 15. E. co11 A-20664 2 52 8 14. E. co11 A-26665 125 B 15. Pr. Mirabi11s A-9900 2 16 5 16. Pr. Morganll A-15155 4 '16 17. Pr. Vulgapis A ~ 9456 1 2 18. Ps.2aerug1nosa A ~ 2022? 5 4 1 19.2 Ps. Speclçs A-20499_ 65 2 4 2 20. Ps. aeruglnosa A-20655 125 4 21. Ps. specmes A ~ 2062l 125 125 22 Ser. marcescens A-20019 2 4 16 16 2Ser.2màrcescens A-20141 '7001669-2 The above MIK data show that compound IV (BB-K8) is superior to kanamycin A in activity, especially with respect to kanamycin A-resistant organisms.

Dessa MIK-data stämmer även väl överens med in vivo-resulta- ten för de tre organismer gentemot vilka kanamycin A och före- ningen IV testades.These MIK data are also in good agreement with the in vivo results of the three organisms against which kanamycin A and compound IV were tested.

Föreningen IV och kanamycin A var lika effektiva vid infek- tioner hos möss, orsakade av kanamycin A-känsliga stammar av E. ggli A-15119 och §§§ph. aureus A-9537. Ehuru CD50-värdena (kurativa dosen hos 50% av letalt infekterade möss) för §t§ph. aureus A-9537 antyder att föreningen IV är något mindreakthrän kanamycin A, är denna lilla skillnad förmodligen icke signi- fikant eftersom dosnivåerna skiljde sig kraftigt åt (utspäd- ning 5 gånger).Compound IV and kanamycin A were equally effective in infections in mice, caused by kanamycin A-susceptible strains of E. ggli A-15119 and §§§ph. aureus A-9537. Although the CD50 values (curative dose in 50% of lethally infected mice) for §t§ph. aureus A-9537 suggests that compound IV is slightly inferior to kanamycin A, this small difference is probably not significant as the dose levels differed greatly (dilution 5-fold).

Med avseende på den kanamycin-resistenta stammen av E. ggli A-20$20 var kanamycin A såsom väntat icke speciellt aktiv in vivo medan föreningen IV uppvisade en markant skyddsverkan.With respect to the kanamycin-resistant strain of E. ggli A-20 $ 20, kanamycin A was not particularly active in vivo as expected, while compound IV showed a marked protective effect.

Föreningen IV var ungefär 10 gånger aktivare med avseende på denna E. coli-stam vid administrering genom en 4-behandlinga- kur än vid en Z-behandlingskuin Tabell 3 En jämförelse av in vitro- och in vivo-aktiviteterna av före- ning IV och kanamycin A.Compound IV was approximately 10-fold more active with respect to this E. coli strain when administered by a 4-treatment regimen than with a Z-treatment cow. Table 3 A comparison of the in vitro and in vivo activities of compound IV and kanamycin A.

Staphylo- Escherichia Escherichia coccus coli coli För- aureus A-15119 A-20520 Förening sök A-9537 a b MIX ggso MIK ggso Mix 51350 Förening IV l l 2,0 x 2 2 2 x 2 2 66 x 2 2 -° - - - - s x 4 Kanamycin A l 2 0,5 x 2 4 4 x 2 l25 200 x 2 2 - - ~ - ~ 200 X 4 ~7uo1e69-2 . 8 i aMIK = minimuminhiberingskoncentration (pg/ml). Försöken ut- fördes såsom beskrives av Chisholm et al. (Antimicrob. Agents e and Chemotherapy-1969, p. 244, 1970) under användning av. 7 Mueller-Hintens agarmedium såsom testmedium. bcoso :Jgurativ dos, 50% (mq/kg/x antal behandlingar). Möss behandlades subkutant en och fyra timmar efter infektion, då två behandlingar utfördes, och 0, 2, 4 och 6 timmar efter in- fektion, då fyra behandlingar utfördes. Andra aspekter av tes- ïtet utfördes enl. Price et al. (J. of Antibiotics 2å:l, 1969). *c_ = ej testad; Förening lv är värdefull såsom ett antibakteriellt medel, så- som näringskomplement i djurfoder, terapeutiskt medel för fjäderfä och djur inklusive människa och är speciellt värde- full vid behandling av infektionssjükdomar, orsakade av gram- positiva och gramnegativa bakterier.Staphylo- Escherichia Escherichia coccus coli coli För- aureus A-15119 A-20520 Compound search A-9537 ab MIX ggso MIK ggso Mix 51350 Compound IV ll 2.0 x 2 2 2 x 2 2 66 x 2 2 - ° - - - - sx 4 Kanamycin A l 2 0,5 x 2 4 4 x 2 l25 200 x 2 2 - - ~ - ~ 200 X 4 ~ 7uo1e69-2. 8 in aMIK = minimum inhibitory concentration (pg / ml). The experiments were performed as described by Chisholm et al. (Antimicrob. Agents e and Chemotherapy-1969, p. 244, 1970) using. 7 Mueller-Hintens agar medium as test medium. bcoso: Jgurative dose, 50% (mq / kg / x number of treatments). Mice were treated subcutaneously one and four hours after infection, when two treatments were performed, and 0, 2, 4 and 6 hours after infection, when four treatments were performed. Other aspects of the test were performed according to Price et al. (J. of Antibiotics 2: 1, 1969). * c_ = not tested; Compound lv is valuable as an antibacterial agent, as a nutritional supplement in animal feed, therapeutic agent for poultry and animals including humans and is especially valuable in the treatment of infectious diseases, caused by gram-positive and gram-negative bacteria.

Vid oral administrering är förening IV användbar såsom under- I stödjande behandlingsmedel för preoperativ sterilisering av ~ inâlvorna. Både aerob och anaerob bakterieflora, som är käns- lig gentemot detta ämne, reduceras i tarmarna. Med efterföl- jande adekvat mekanisk rengöring är föreningen användbar vid förberedelse för kolon-kirurgi.For oral administration, Compound IV is useful as a supportive treatment agent for preoperative sterilization of the intestines. Both aerobic and anaerobic bacterial flora, which are sensitive to this substance, are reduced in the intestines. With subsequent adequate mechanical cleaning, the compound is useful in preparation for colon surgery.

Förening IV är effektiv vid behandling av systemiska bakterie- infektioner hos människa vid parenteral administrering i en' 7 dosering av från ca 250 mg till ca 3000 mg per dygn i avdela- * de doser tre eller fyra gånger per dygn. I allmänhet är före- ningen effektiv vid administrering i en dosering av ca 5,0- 7,5 mg/kg kroppsvikt var tolfte timme. ' ' Vid en föredragen utföringsform av förfarandet enligt uppfin- ningen acylerar man l mol kanamycin A med ca 1 mol N-(bensy- I loxikarbonyloxi)-succinimid i ett lösningsmedel, som utgörs av dimetylformamid, dimetylacetamid, tetrahydrofuran, dioxan, g74o1sa9-2 9 1,2-dimetoxietan, metanol, etanol, vatten, aceton, pyridin, en N-(lägre)alkylpiperidin eller blandningar därav, vid en temperatur under 25°C för framställning av förening II.Compound IV is effective in treating systemic bacterial infections in humans by parenteral administration in a dosage of from about 250 mg to about 3000 mg per day in divided doses three or four times per day. In general, the compound is effective when administered at a dosage of about 5.0-7.5 mg / kg body weight every twelve hours. In a preferred embodiment of the process according to the invention, 1 mole of kanamycin A is acylated with about 1 mole of N- (benzyloxycarbonyloxy) -succinimide in a solvent consisting of dimethylformamide, dimethylacetamide, tetrahydrofuran, dioxane, g74o1sa9 1,2-dimethoxyethane, methanol, ethanol, water, acetone, pyridine, an N- (lower) alkylpiperidine or mixtures thereof, at a temperature below 25 ° C to prepare compound II.

En mera föredragen utföringsform av förfarandet enligt upp- finningen för framställning av förening IV innebär att man i tur och ordning A) acylerar l mol kanamycin A med ca l mol N-(bensyloxikarbo- 'nvloxi)succinimid i dimetylformamid vid en temperatur inom intervallet från ca -20°C till ca l0°C för framställning av föreningen II; B) behandlar 1 mol av föreningen II med 3,5-4,5 mol p-nitro- bensaldehyd eller bensaldehyd i absolut etanol, metanol, n- propanol eller isopropanol vid ungefär återflödestemperatur under en tid av ca 2-4 timmar för framställning av förening III, vari Z utgör en grupp med formeln 'V H o H A .A more preferred embodiment of the process according to the invention for the preparation of compound IV means that in turn A) acylates 1 mole of kanamycin A with about 1 mole of N- (benzyloxycarbonobyloxy) succinimide in dimethylformamide at a temperature in the range from about -20 ° C to about 10 ° C to prepare Compound II; B) treating 1 mole of compound II with 3.5-4.5 moles of p-nitrobenzaldehyde or benzaldehyde in absolute ethanol, methanol, n-propanol or isopropanol at about reflux temperature for a period of about 2-4 hours to prepare compound III, wherein Z is a group of the formula 'VH o HA.

'TN-çﬂﬂcâ eller ' -N-'C-Q och C) behandlar l mol av föreningen III med från ca l,l till ca . l , 3 mol L- (-) '- b' -bensyloxi-karbonylamino- OC-hydroxismörsyra- N-hydroxisuccinimidester i dimetylformamid vid ungefär rums- temperatur under minst 5 timmar, därefter avlägsnar lösnings- medlet i vakuum och hydrerar återstoden in situ med väte i närvaro av palladium på träkol i en 1:1-blandning av dioxan och vatten i närvaro av en katalytisk mängd isättika för fram- ställning av föreningen IV.'TN-ç ﬂﬂ câ or' -N-'C-Q and C) treat 1 mol of compound III with from about 1.1 to approx. 1.3 moles of L- (-) '- b' -benzyloxy-carbonylamino-OC-hydroxybutyric acid N-hydroxysuccinimide ester in dimethylformamide at about room temperature for at least 5 hours, then remove the solvent in vacuo and hydrogenate the residue in situ with hydrogen in the presence of palladium on charcoal in a 1: 1 mixture of dioxane and water in the presence of a catalytic amount of glacial acetic acid to produce compound IV.

Den mest föredragna utföringsformen av förfarandet enligt upp- finningen för framställning av föreningen IV innebär att man i tur och ordning A) acylerar l mol kanamycin A med ca 1 mol N-(bensyloxikarbo- =1uo1669+2r 10 'nyloxU-succinimid i dimetylformamid vid en temperatur inom intervallet från ca ~2_0°C tillca l0°C för framställning avi förening II; fB) behandlar l mol av förening II med ca 4 mol p-nitrobensal- Kdehyd i absolut etanol vid ungefär återflödestemperatur under *een tid av ca 2-4 timmar för framställning av förening III, vari Z utgör gruppen : _.H_.U. _ .i ø íxøC-öfNOzt ; och C) behandlar l mol av förening III med ca 1,2 mol L-(-%-X- bensyloxikarbonylamino-of-hydroxismörsyra-N-hydroxisuccinimíd- T ester i dimetylformamid vid ungefär rumstemperatur under minst .5 timmar, därefter avlägsnar lösningsmedlet i vakuum och hyd-W rerar återstoden in situ med väte i närvaro av palladium på träkol i en l:l-blandning av dioxan och vatten i närvaro av en katalytisk mängd isättika för framställning av förening IV.The most preferred embodiment of the process according to the invention for the preparation of compound IV means that in turn A) acylates 1 mole of kanamycin A with about 1 mole of N- (benzyloxycarbo- = 1uo1669 + 2r 10 'nyloxU-succinimide in dimethylformamide at a temperature in the range of from about ~ 2_0 ° C to about 10 ° C for the preparation of compound II; fB) treats 1 mole of compound II with about 4 moles of p-nitrobenzalkyldehyde in absolute ethanol at about reflux temperature for * a time of about 2 -4 hours for the preparation of compound III, wherein Z is the group: _.H_.U. _ .i ø íxøC-öfNOzt; and C) treating 1 mole of compound III with about 1.2 moles of L - (-% - X-benzyloxycarbonylamino-of-hydroxybutyric acid N-hydroxysuccinimide ester in dimethylformamide at about room temperature for at least 5 hours, then removing the solvent in vacuum and hydrates the residue in situ with hydrogen in the presence of palladium on charcoal in a 1: 1 mixture of dioxane and water in the presence of a catalytic amount of glacial acetic acid to prepare compound IV.

I föreliggande sammanhang avses med uttrycket “(lägre)alkvl“en rak eller grenad alkylgrupp med l-6 kolatomer. Med uttrycket "(lägre)alkanol" avses en rak eller grenad, mättad alkohol med l-6 kolatomer och innehållande en OH-funktion.In the present context, the term "(lower) alkyl" refers to a straight or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. By the term "(lower) alkanol" is meant a straight or branched chain saturated alcohol having 1 to 6 carbon atoms and containing an OH function.

I Uppfinningen âskådliggörs närmare medelst följande exempel, ~vari temperaturerna avser Celsiusgrader, ExemEel,l Erams tällning av L- (-) - b' -bensyloxikarbonylamino- OC -hydroxi- smörsyra e (VI) i t a _L-f(-)--X-amino--OCF-hydroxismörsyra (7,4 g; 0,062 mol) sattes till~en-lösning av 5,2 g {0,l3 mol) natriumhydroxid i 50 ml vatten. Till den omrörda lösningen sattes droppvis vid O-39 ag under en tidsperiod av 0,5 timar ll,7 g (0,068 mol) karbo- 7401669-2 ll I U H bensoxiklorid och omröringen fortsattes under ytterligare 1 timme vid samma temperatur. Reaktionsblandningen tvättades med 50 ml eter, inställdes på pH 2 med utspädd klorvätesyra och extraherades med fyra 80-ml-portioner eter. Eterextrak- ten kombinerades, tvättades med en liten mängd mättad nat- riumkloridlösning, torkades över vattenfritt natriumsulfat och filtrerades. Filtratet indunstades i vakuum och den er- hållna återstoden kristalliserades ur bensen, varvid man er- höll ll,6 g (74%) färglösa plattor med smp. 78,5-79,50; ¿É{]b= 4,s° (e=2, cn3on), IR (Rang e=o 1740, 1690 amd; man (ace- ton-d6) (i ppm ur TMS) 2,0 (2H,m), 3,29 (2H,d-d, J=6,7 och 12 Hz), 4,16 (lH,d-d, J=4,5 och 8 Hz), 4,99 (2H,s) 6,2 (2H, bred), 7,21 (5H,s).The invention is further illustrated by the following examples, in which the temperatures refer to degrees Celsius, ExemEel, l Erams count of L- (-) - b '-benzyloxycarbonylamino- OC -hydroxybutyric acid e (VI) ita _L-f (-) - X -amino-OCF-hydroxybutyric acid (7.4 g; 0.062 mol) was added to a solution of 5.2 g (0.3 mol) of sodium hydroxide in 50 ml of water. To the stirred solution was added dropwise at 0 DEG-39 DEG C. over a period of 0.5 hours 11.7 g (0.068 moles) of carboxyl chloride and stirring was continued for a further 1 hour at the same temperature. The reaction mixture was washed with 50 ml of ether, adjusted to pH 2 with dilute hydrochloric acid and extracted with four 80 ml portions of ether. The ether extracts were combined, washed with a small amount of saturated sodium chloride solution, dried over anhydrous sodium sulfate and filtered. The filtrate was evaporated in vacuo and the resulting residue was crystallized from benzene to give 1.6 g (74%) of colorless plates, m.p. 78.5-79.50; ¿É {] b = 4, s ° (e = 2, cn3on), IR (Rang e = o 1740, 1690 amd; man (acetone-d6) (in ppm ur TMS) 2.0 (2H, m ), 3.29 (2H, dd, J = 6.7 and 12 Hz), 4.16 (1H, dd, J = 4.5 and 8 Hz), 4.99 (2H, s) 6.2 ( 2H, broad), 7.21 (5H, s).

Analys: Beräknat för Cl2Hl5NO5: C 56,91 H 5,97 N 5,53% rummet: c' 56,66 H 5,97 N 5,47% Exempel 2 N-hydroxisuccinimidester av L- (-) - X -bensyloxikarbonylamino- OC- hydroxismörsyra (VII) En lösning av 10,6 g (0,042 mol) av förening VI och 4,8 g (0,042 mol) N-hydroxisuccinimidl i 200 ml etylacetat kyldes ti11 o° och därefter tiileattee 8,6 g (o,o42 mel), aieykle- hexylkarbodiimid. Blandningen förvarades över natten i kylskåp.Analysis: Calculated for C 12 H 15 NO 5: C 56.91 H 5.97 N 5.53% room: c '56.66 H 5.97 N 5.47% Example 2 N-hydroxysuccinimide ester of L- (-) - X -benzyloxycarbonylamino OC-hydroxybutyric acid (VII) A solution of 10.6 g (0.042 mol) of compound VI and 4.8 g (0.042 mol) of N-hydroxysuccinimide in 200 ml of ethyl acetate was cooled to 11 ° C and then to 8.8 g (o , o42 mel), alkylhexylcarbodiimide. The mixture was stored overnight in a refrigerator.

Den utfällda dicyklohexylkarbamiden avfiltrerades och filtra- tet koncentrerades till ca 50 ml under reducerat tryck, var- vid man erhöll färglösa kristaller av förening VII, vilka till- varatogs genom filtrering; 6,4 g; smp. 121-l22,5°. Filtratet indunstades till torrhet i vakuum och den kristallina återsto- den tvättades med 20 ml av en bensen-n-hexan-blandning för er- hållande av en ytterligare mängd av förening VII. Det totala utbytet ver 13,4 g (92%), [v47 1,s° (c=2, cac13); IR (rang =.o 1e1o, 17ss, 1740, 1680 em' ; NMa-(eeetom-aóß (i ppm ur ms) 2,0 (2H, m), 2,83 (4H, s), 3,37 (2H, d-d, J=6,5 och 12,5 Hz), 12 4,56 (ln, m), 4,99 (za, S), 6,3 (2H, bred), 7,23 (sn, S).The precipitated dicyclohexylurea was filtered off and the filtrate was concentrated to about 50 ml under reduced pressure to give colorless crystals of compound VII, which were collected by filtration; 6.4 g; m.p. 121-122.5 °. The filtrate was evaporated to dryness in vacuo and the crystalline residue was washed with 20 ml of a benzene-n-hexane mixture to give an additional amount of compound VII. The total yield is 13.4 g (92%), [v47 1, s ° (c = 2, cac13); IR (rang = .o 1e10, 17ss, 1740, 1680 cm -1; NMa- (eeetom-αos (in ppm ur ms) 2.0 (2H, m), 2.83 (4H, s), 3.37 ( 2H, dd, J = 6.5 and 12.5 Hz), 12 4.56 (ln, m), 4.99 (za, S), 6.3 (2H, broad), 7.23 (sn, S).

Analys: Beräknat för cl6H18N2o7= c 54,85 H 5,10' N 8,00% runner: g 9 c 54,79 H 5,21 -N9s,14 ' ' 2 54,70 5,20 -8,12% 1. srw. Anderson et al., J. Am. cnem¿ soc., gg, 1839 (1964).Analysis: Calculated for C 16 H 18 N 2 O 7 = c 54.85 H 5.10 'N 8.00% runner: g 9 c 54.79 H 5.21 -N9s, 14' '2 54.70 5.20 -8.12% 1. srw. Anderson et al., J. Am. cnem¿ soc., gg, 1839 (1964).

Exemäel 3 Framställning av N-(bensyloxikarbonyloxi)succinimid N-hydroxisuccinimidl (23 g; 0,2 mol) upnlöstes i en blandning' av 9 g (O,22 mol) natriumhydroxid i 200 ml vatten. Till den _ omrörda lösningen sattes droppvis 34ag (0,2 mol) karbobensoxi- klorid under Vattenkylning och därefter omrördes,blandningena -vid rumstemperatur över natten för avskiljande av karboben- soxiderivatet, som tillvaratogs genom filtrering, tvättadesn ".med_vatten och lufttorkades. Utbyte 41,1 g (82%). Omkristal- lisation ur bensen-nFhexan (l0:l) gav färglösa prismor med en smältpunkt av 78-790.' i 7 ' all G.W. Anderson et al@, J. Am; Chem. Soc., §§, 1839 (1964)., Exemgel 4 Framställning av 6'-karbobensoxikanamycin A En lösning av 42,5 g (90 mmol) kanamycin A i form av den fria ebasen i 450 ml vatten och 500 ml dimetylformamid (DMF) kyl- des till en temperatur av under Oo och omrördes kraftigt. 7 Till lösningen sattes droppvis under en tidsperiod av ca 2 timmar en lösning av 22,4 g (90 mmol) N-(bensyloxikarbonyloxi)- succinimid i 500 ml. DMF; Blandningen omrördes vid en tempera- tur av från -100 till Oo över natten och därefter vid rumstem- peratur under l dag. Reaktionsblandningen indunstades under reducerat tryck och vid en temperatur under ca 500- Den oljiga 74Û1659"2 13 återstoden upplöstes i en blandning av 500 ml vatten och 500 ml butanol och blandningen filtrerades för avlägsnande av olösligt material och separerades i två skikt. Butanol- och vattenskikten behandlades med butanolmättat vatten (500 ml x 2) respektive vattenmättad butanol (500 ml x 2) under använd- ning av en teknik, som liknar motströmsfördelningstekniken.Example 3 Preparation of N- (benzyloxycarbonyloxy) succinimide N-hydroxysuccinimide 1 (23 g; 0.2 mol) was dissolved in a mixture of 9 g (0.22 mol) of sodium hydroxide in 200 ml of water. To the stirred solution was added dropwise 34ag (0.2 mol) of carbobenzoxy chloride under water cooling, and then the mixtures were stirred at room temperature overnight to separate the carbobenzoxide derivative, which was collected by filtration, washed with water and air dried. 1 g (82%). Recrystallization from benzene-n-hexane (10: 1) gave colorless prisms with a melting point of 78-790. in 7 'all GW Anderson et al., J. Am; Chem. Soc., §§, 1839 (1964)., Example 4 Preparation of 6'-carbobenzoxanamycin A A solution of 42.5 g (90 mmol) of kanamycin A in the form of the free ebase in 450 ml of water and 500 ml of dimethylformamide (DMF) were cooled to a temperature of below 0 ° C and stirred vigorously.7 To the solution was added dropwise over a period of about 2 hours a solution of 22.4 g ( 90 mmol) N- (benzyloxycarbonyloxy) -sucinimide in 500 ml DMF The mixture was stirred at a temperature of from -100 to 100 DEG C. overnight and then at room temperature for 1 day.The reaction mixture was evaporated under reduced pressure and at a temperature for about 500- The oily residue was dissolved in a mixture of 500 ml of water and 500 ml of butanol and the mixture was filtered to remove insoluble matter and separated into two layers. The butanol and water layers were treated with butanol-saturated water (500 ml x 2) and water-saturated butanol (500 ml x 2), respectively, using a technique similar to the countercurrent distribution technique.

De tre vattenskikten kombinerades och indunstades till torr- het under reducerat tryck, varvid man erhöll en oljig åter- stod, varav en del kristalliserade vid rumstemperatur. Till återstoden inklusive kristallerna sattes ca 100 ml metanol, som upplöste oljan och separerade den från kristallerna. Ef- ter tillsats av ca 300 ml etanol förvarades blandningen vid rumstemperatur över natten för erhållande av en kristallin massa, som tillvaratogs genom filtrering. Den vägde 44 g.The three water layers were combined and evaporated to dryness under reduced pressure to give an oily residue, some of which crystallized at room temperature. To the residue, including the crystals, was added about 100 ml of methanol, which dissolved the oil and separated it from the crystals. After adding about 300 ml of ethanol, the mixture was stored at room temperature overnight to obtain a crystalline mass, which was collected by filtration. It weighed 44 g.

Frodukten innehöll en liten mängd kanamycin A, vilket kunde påvisas genom tunnskiktskromatografi under användning av n-propanol-pyridin-ättiksyra-vatten (l5:l0:3:l2) såsom lös- ningsmedelssystem och ninhydrin såsom sprayreagens.The product contained a small amount of kanamycin A, which could be detected by thin layer chromatography using n-propanol-pyridine-acetic acid-water (15: 10: 3: 12) as the solvent system and ninhydrin as the spray reagent.

Den råa produkten upplöstes i 300 ml vatten och kromatografe- rades på en kolonn (30 mm diameter) av CG-50 jonbytarharts (NH4+-typ, 500 ml). Kolonnen eluerades med 0,1 N ammonium- hydroxidlösning och eluatet tillvaratogs i 10 ml fraktioner.The crude product was dissolved in 300 ml of water and chromatographed on a column (30 mm diameter) of CG-50 ion exchange resin (NH 4 + type, 500 ml). The column was eluted with 0.1 N ammonium hydroxide solution and the eluate was collected in 10 ml fractions.

Den önskade produkten erhölls i rören 10-100, medan kanamycin A utvanns ur senare fraktioner och positionsisomeren (isome- rerna) av produkten syntes vara närvarande i de tidigare frak- tionerna. Fraktionerna 10-ll0 tillvaratogs och indunstades till torrhet under reducerat tryck, varvid man erhöll 24,6 g (45%) av den färglösa produkten 6-karbobensoxikanamycin A (II) [E'-Cbz-kanamycin AI, som började smälta och färgas vid 204° och sönderdelades vid 2l2° under gasutveckling; Zïifn = +l06° (c=2 H20). ' Tunnskiktskromatografi (silikagel F254; ninhydrin); 1u016s9+2 14 40 Rf-värde Lösningsmedelssystem 'g 6'-Cbz-kanamycin A Kanamycin A n-Pron-pyriain-AcoH-Hzo 0,42 0,33 0,15 0,04 (15:l0:3:l2) huvud- mindre andel 0 0 _ mängd Aceton-AaoH-Hzo i 0 , 24 0 , 14 (2_0=_a=74) g cnclfmeon-:LNH 4021-1020 i ' 0,76 0,50' (l:4:2:l) ' AcoMe-n-ProH-acnqn oH _ i i 0,22* i 0,04* (45:l05:60) K Påvisades med antron-svavelsyra.The desired product was obtained in tubes 10-100, while kanamycin A was recovered from later fractions and the positional isomer (s) of the product appeared to be present in the earlier fractions. Fractions 10-110 were collected and evaporated to dryness under reduced pressure to give 24.6 g (45%) of the colorless product 6-carbobenzoxycannamycin A (II) [E'-Cbz-kanamycin AI, which began to melt and stain at 204 ° and decomposed at 212 ° during gas evolution; Zifn = + 106 ° (c = 2 H 2 O). Thin layer chromatography (silica gel F254; ninhydrin); 1u016s9 + 2 14 40 Rf value Solvent system 'g 6'-Cbz-kanamycin A Kanamycin A n-Pron-pyrimane-AcoH-Hzo 0.42 0.33 0.15 0.04 (15: 10: 3: 12) major- minor proportion 0 0 _ amount of Acetone-AaoH-Hzo in 0, 24 0, 14 (2_0 = _a = 74) g cnclfmeon-: LNH 4021-1020 in '0.76 0.50' (1: 4: 2 : 1) 'AcoMe-n-ProH-acnqn oH _ ii 0.22 * i 0.04 * (45: 105: 60) K Detected with anthra-sulfuric acid.

Slutprodukten visade sig ledsagas av två mindre.komponenter vid ett-av de för tunnskiktskromatografi använda lösningsmef delssystemen. Slutprodukten användes emellertid utan vtterli- gare rening för framställning av förening BB-K8 (I).The final product was found to be accompanied by two minor components in one of the solvent systems used for thin layer chromatography. However, the final product was used without further purification to produce compound BB-K8 (I).

Exemgel 5 *Framställning av L*(-%-X-amino-OC-hydroxismörsyra utgående från ambutyrosin A eller B eller blandningar därav.Example gel 5 * Preparation of L * (-% - X-amino-OC-hydroxybutyric acid starting from ambutyrosine A or B or mixtures thereof.

Ambutyrosin A (5,0 9) (amerikanska patentet 3 541 078) åter- loppskokades med 160 ml 0,5 N natriumhydroxid under l timme. ldﬁydrolysatet neutraliserades med 6N HCl och kromatograferades på en kolonn av CG-50 (NH4+-typ). Den önskade L-(-%-K-amino- UC-hydroxismörsyran isolerades genom eluering av kolonnen med vatten och avlägsnande av vattnet genom frystorkning. L-(-)- 3'-amino-OC-hydroxismörsyra_karakteriserades såsom ett kris- tallint material med en-smältpunkt av 212,5-214,50 (se den amerikanska patentskriften 3 541 078, spalt 2, raderna 3lf38).0 740166942 15 Exemgel 6 Framställning av L-(-)-X~amino-(X-hydroxismörsyra utgående från.DL-CC-hydroxi-)(-ftalimidosmörsyra A) Dehydroabietylammonium-L-Cß-hydroxi-få-ftalimidobutyrat: Till en lösning av 25 g (0,1 mol) 2-hydroxi-X-ftalimidosmör- syral i 200 ml etanol sattes en lösning av 29 g (0,1 mol) dehydroabietylamin i 130 ml etanol. Lösningen skakades kraf- tigt under l minut och fick stå vid rumstemperatur under 5 timmar, varvid fina nålar utkristalliserade. Kristallerna tillvaratogs genom filtrering, tvättades med 50 ml etanol och lufttorkades för erhållande av 30,1 g (56%) av en diastereo- mer av dehydroabietylaminsaltet. Smp. 93-940. [ïx_72â +i5° (c. 2,5, Me0H). Omkristallisation ur 300 ml etanol gav 23,2 g (43%) av den rena produkten. Smp. 94-950. ¿R1]š4 +l0,8° (c. 2,5, Me0H). Ytterligare omkristallisation förändrade icke smältpunkten eller den optiska vridningen.Ambutyrosine A (5.09) (U.S. Patent 3,541,078) was refluxed with 160 ml of 0.5 N sodium hydroxide for 1 hour. The hydrogen hydrolyzate was neutralized with 6N HCl and chromatographed on a CG-50 column (NH 4 + type). The desired L - (-% - K-amino-UC-hydroxybutyric acid was isolated by eluting the column with water and removing the water by freeze-drying. L - (-) - 3'-amino-OC-hydroxybutyric acid was characterized as a crystalline material with melting point of 212.5-214.50 (see U.S. Pat. No. 3,541,078, column 2, lines 3lf38). Example 7 Preparation of L - (-) - X-amino- (X-hydroxybutyric acid starting from .DL-CC-hydroxy -) (- phthalimidobutyric acid A) Dehydroabietylammonium-L-C A solution of 29 g (0.1 mol) of dehydroabietylamine in 130 ml of ethanol was added, the solution was shaken vigorously for 1 minute and allowed to stand at room temperature for 5 hours, during which fine needles crystallized out, the crystals were collected by filtration, washed with 50 ml of ethanol and air dried to give 30.1 g (56%) of a diastereomer of the dehydroabietylamine salt, mp 93-940. , 5, MeOH). Recrystallization from 300 ml of ethanol gave 23.2 g (43%) of the pure product. M.p. 94-950. ¿R1] š4 + 10.8 ° (c. 2.5, MeOH). Further recrystallization did not change the melting point or the optical rotation.

Analys: Beräknat för C32H42N2O5'H20: C 69,54 >H 8,02 N 5,07% nunnan ' c 69,58 n 8,08 N 5,07% 1. Y. Saito et al., Tetrahedron Letters, 1970, 4863.Analysis: Calculated for C 32 H 42 N 2 O 5 · H 2 O: C 69.54> H 8.02 N 5.07% nunnan 'c 69.58 n 8.08 N 5.07% 1. Y. Saito et al., Tetrahedron Letters, 1970 , 4863.

B) L- (-) - X -amino-OC -hydroxismörsyraz Till en lösning av 1,5 g (0,0l4 mol) natriumkarbonat i 40 ml vatten sattes 5,3 g (0,0l mol) dehydroabietylammonium-L-(X- hydroxi-X-ftalimidobutyrat och 60 ml eter. Blandningen skaka- des kraftigt till dess allt fast material hade upplösts. Eter- skiktet avskildes. Vattenlösningen tvättades 2 gånger med 20 ml portioner av eter och indunstades till 15 ml under redu- cerat tryck. Till koncentratet sattes 10 ml koncentrerad klor- vätesyra och blandningen återloppskokades under 10 timmar.B) L- (-) - X -amino-OC -hydroxybutyric acid Za To a solution of 1.5 g (0.0l4 mol) of sodium carbonate in 40 ml of water was added 5.3 g (0.0l mol) of dehydroabietylammonium-L- ( X-hydroxy-X-phthalimidobutyrate and 60 ml of ether. The mixture was shaken vigorously until all solids had dissolved. The ether layer was separated. The aqueous solution was washed twice with 20 ml portions of ether and evaporated to 15 ml under reduced pressure. To the concentrate was added 10 ml of concentrated hydrochloric acid and the mixture was refluxed for 10 hours.

Efter kylning avlägsnades utfälld ftalsyra genom filtrering.After cooling, precipitated phthalic acid was removed by filtration.

Filtratet indunstades under reducerat tryck. Återstoden upp- 7401669-2 l6 löstes i 10 ml vatten och lösningen indunstades till torr- het. Denna operation upprepades tvâ gånger för avlägsnande av överskottet klorvätesyra. Den återstående sirapsliknande produkten upplöstes i l0_ml vatten och filtrerades för av- lägsnande av en liten mängd olöslig ftalsyra, Filtratet ab- sorberades på en kolonnn av IR-120 (H+, 1 cm xf35 cm) och "kolonnen tvättades med 300 ml vatten och eluerades med l N ammoniumhvdroxidlösning. Eluatet tillvaratogs i l5 ml frak- tioner. De ninhydrinpositiva fraktionerna 10-16 kombinerades och indunstades under reducerat tryck, varvid man erhöll en sirapsliknande produkt, som gradvis kristalliserade. Kristal- lerna triturerades med etanol, filtrerades och torkades i en vakuumeksickator för erhållande av 0,78 g (66%) L-(-)-3'- aminø-«z-hyarøxismörsyra. smp. 206-2o7°. ¿t¿7š4 -z9° (C 2,s,- H¿O). IR-spektrumet var identiskt med ett autentiskt prov, som erhölls utgående från ambutyrosin. a Exemgel 7 _Framställning av 6'-karbobensoxi-1,3,3'*tri-p-nitrobensal- kanamycin A ¶III) 6'-karbobensoxikanamycin A (9,0 g; 14,5 mmol) suspenderades i 500 ml absolut etanol vid 240 och.8;7945 g (58,2 mmol) p-nitrobensaldehyd tillsattes. Élandningen upphettades till återflöde. Därvid förvandlades blandningen till en klar, gul lösning men vid återflödeskokning började ett vitt, fast ma- terial snabbt att bildas. Blandningen unphettades under åter- flödestemperatur under 3 timmar och kyldes därefter och pro- dukten tillvaratogs genom filtrering och tvättades med en liten mängd absolut etanol. Utbytet var 14,0 g (94,5%) av ett vitt, kristallint fast material med smältpunkten 233-2340 (okorrigerat), vilket material utgjorde den i rubriken angiv- na föreningen (III).The filtrate was evaporated under reduced pressure. The residue was dissolved in 10 ml of water and the solution was evaporated to dryness. This operation was repeated twice to remove excess hydrochloric acid. The remaining syrup-like product was dissolved in 10 ml of water and filtered to remove a small amount of insoluble phthalic acid. The filtrate was absorbed on a column of IR-120 (H +, 1 cm xf35 cm) and the column was washed with 300 ml of water and eluted. with 1 N ammonium hydroxide solution, the eluate was collected in 15 ml fractions, the ninhydrin-positive fractions 10-16 were combined and evaporated under reduced pressure to give a syrup-like product which gradually crystallized, the crystals were triturated with ethanol, filtered and dried in a vacuum desiccator to give 0.78 g (66%) of L - (-) - 3'-amino- «z-hyaroxybutyric acid, mp 206-27 °, ¿t¿7š4 -z9 ° (C2, s, - H The IR spectrum was identical to an authentic sample obtained from ambutyrosine. Example 7 Preparation of 6'-carbobenzoxy-1,3,3 '* tri-p-nitrobenzalkanamycin A -carbobenzoxycannamycin A (9.0 g; 14.5 mmol) was suspended in 500 ml of absolute ethanol at 240 and 8; 7945 g (58.2 mmol) pn itrobenzaldehyde was added. The landing was heated to reflux. The mixture was then transformed into a clear, yellow solution, but at reflux boiling a white, solid material quickly began to form. The mixture was deheated under reflux temperature for 3 hours and then cooled and the product was collected by filtration and washed with a small amount of absolute ethanol. The yield was 14.0 g (94.5%) of a white, crystalline solid, m.p. 233-2340 (uncorrected), which was the title compound (III).

Ana1ys= Beräknat för c47H5lN7ol9= c 55,46 en s,os N 9,63% » runner: ' c 55,39' H 5,08 “N 9,60% 7401669-2 17 Exempel 8 Framställning av l-¿I-(-)- X-amino-ci-hydroxibutyryl]-kana- mvcin A (IV) 6'-karbobensoxi-1,3,3'=tri-p-nitrobensalkanamycin A (5,0 g; 4,91 mmol) upplöstes i 50 ml dimetylformamid (DMF) vid 240.Analysis = Calculated for c47H5NN7ol9 = c 55.46 en s, os N 9.63% »runner: 'c 55.39' H 5.08„ N 9.60% 7401669-2 17 Example 8 Preparation of l-¿I - (-) - X-amino-ci-hydroxybutyl] -cannamicin A (IV) 6'-carbobenzoxy-1,3,3 '= tri-p-nitrobenzalkanamycin A (5.0 g; 4.91 mmol) was dissolved in 50 ml of dimethylformamide (DMF) at 240.

L-(-)-fä-bensyloxikarbonylamino-06-hydroxismörsyra-N-hydroxi- succinimidester (2,064 g; 5,895 mmol) upplöstes i 20 ml DMF vid 240 och sattes långsamt under kraftig omröring till lös- ningen av den Schiffska basen (III) under 75 minuter. Lös- ningen omrördes vid 240 över natten. Genom att använda ång- strålevakuum vakuumtorkades lösningen vid ca 400. Den behand- lades därefter upprepade gånger med metanol (100 ml) för er- hållande av en viskös olja. Oljan upplöstes i 100 ml av en blandning av dioxan och vatten (l:l) och 10 ml isättika till- sattes. Lösningen infördes i en 500 ml Parr-flaska jämte 2,5 g 5%-ig Pd/C (Engelhard) och reducerades vid 45 psi H2 under 4 timmar vid 240. Det totala tryckfallet under denna tid (sluten flaska) var 87 psi innefattande periodiska trycksteg- ringar. Blandningen filtrerades genom en kudde av diatomace= jord, som därefter tvättades med 3 x 50 ml av en 50%-ig vat- tenlösning av dioxan. De kombinerade filtraten torkades genom avdrivning under azeotropbildning med n-butanol (100 m1) och torkades slutligen upprepade gånger genom avdrivning med meta- nol, varvidman erhöll en viskös olja. Denna upplöstes i 30 ml metanol och hällaes långsamt i 1ooo m1 kan eter under kraftig omröring. Efter omröring av den erhållna _ suspensionen under en halv timme i isbad tillvaratogs preci- pitatet genom filtrering och torkades omedelbart i en vakuum- exsickator över P2O5. Produktblandningen vägde 4,962O g. Tunn- skiktskromatografi visade att den i huvudsak utgjordes av förening IV, kanamycin A och spår av di- och trisubstituerat kanamycin A och även 4-amino-2-hydroxismörsyra.L - (-) - Fa-benzyloxycarbonylamino-06-hydroxybutyric acid N-hydroxysuccinimide ester (2.064 g; 5.895 mmol) was dissolved in 20 ml of DMF at 240 and slowly added with vigorous stirring to the solution of Schiff's base (III) for 75 minutes. The solution was stirred at 240 overnight. Using a steam jet vacuum, the solution was vacuum dried at about 400. It was then repeatedly treated with methanol (100 ml) to give a viscous oil. The oil was dissolved in 100 ml of a mixture of dioxane and water (1: 1) and 10 ml of glacial acetic acid was added. The solution was placed in a 500 ml Parr flask with 2.5 g of 5% Pd / C (Engelhard) and reduced at 45 psi H 2 for 4 hours at 240. The total pressure drop during this time (closed flask) was 87 psi including periodic pressure rises. The mixture was filtered through a pad of diatomaceous earth, which was then washed with 3 x 50 ml of a 50% aqueous solution of dioxane. The combined filtrates were dried by evaporation under azeotrope with n-butanol (100 ml) and finally dried repeatedly by evaporation with methanol to give a viscous oil. This was dissolved in 30 ml of methanol and slowly poured into 1000 ml of ether with vigorous stirring. After stirring the resulting suspension for half an hour in an ice bath, the precipitate was collected by filtration and immediately dried in a vacuum desiccator over P 2 O 5. The product mixture weighed 4.962 g. Thin layer chromatography showed that it consisted mainly of compound IV, kanamycin A and traces of di- and trisubstituted kanamycin A and also 4-amino-2-hydroxybutyric acid.

De olika fraktionerna separerades under användning av en 40 x 100 mm glaskolonn, som var fylld med Amberlite G9 (varunamn 5 Funnet: 7401669-2,2. 18 för jonbytarhartser tillverkade av Rohm & Haas Co. Se The Condensed Chemical Dictionary, 8:e uppl., Van Nostrand Reinnold Company, s. 39) IRC-40 (NH4+-form, typ I, 100/200 mesh) för erhållande av en hartsbädd med en höjd av ca 980 mm. Kolonnen försattes med 4,600 g av den orena blandningen, upplöst i 15 ml vatten. Kolonnen eluerades genom gradientelu- ering från H20-till 2 N NH4OH, varvid eluatet tillvaratogs i '15 ml fraktioner. 295 fraktioner tillvaratogs och därefter tvättades kolonnen med 1,5 l 3 N NH4OH; Fraktionerna uppsam- lades på basis av optisk vridning och det fasta materialet isolerades därur genom lyofilisering.The different fractions were separated using a 40 x 100 mm glass column filled with Amberlite G9 (trade name 5 Found: 7401669-2.2. 18 for ion exchange resins made by Rohm & Haas Co. See The Condensed Chemical Dictionary, 8th). uppl., Van Nostrand Reinnold Company, p. 39) IRC-40 (NH4 + form, type I, 100/200 mesh) to obtain a resin bed with a height of about 980 mm. The column was charged with 4.600 g of the crude mixture, dissolved in 15 ml of water. The column was eluted by gradient elution from H 2 O to 2 N NH 4 OH, eluting the eluate in '15 ml fractions. 295 fractions were collected and then the column was washed with 1.5 L of 3 N NH 4 OH; The fractions were collected on the basis of optical rotation and the solid material was isolated therefrom by lyophilization.

Korrigering till vikten Fraktion Före- Vikt i av hela râma- 5 Bioakti- % -'nr ning ' 2 gram terialet, gram vitet » futbyte 120-150 _ kana A 1,1ss4Ü 11,257 ' B09 542,6 201-224 _ BB-K29“*“ 0,40 0,43 - 228-241 BB-Ks 0,652: o,7036 vseïloi* 19,2¥“ X Genomsnitt av 4 plattanalyser f standardavvikelse. x¥Öm.hänsyn tas till återvunnet kana A, blir omvandl. till' BB*K8 (IV) 33,5%. - xä33-N5/1-(-)-X-amino-cﬁehydroxibutyrylfkanamycin A. via dessa försök var förhållandet BB-Ka/kana A 0,45.Correction to weight Fraction Pre- Weight i of whole frame- 5 Bioacti-% -'nr ning '2 grams of material, grams of white »futbyte 120-150 _ kana A 1,1ss4Ü 11,257' B09 542,6 201-224 _ BB- K29 “*“ 0.40 0.43 - 228-241 BB-Ks 0.652: o, 7036 vseïloi * 19.2 ¥ “X Average of 4 plate analyzes for standard deviation. x ¥ Care is taken of recycled kana A, is converted. to BB * K8 (IV) 33.5%. - x-33-N5 / 1 - (-) - X-amino-c-hydroxybutyrylphanamycin A. via these experiments the ratio BB-Ka / kana A was 0.45.

Den vid detta förfarande utvunna föreningen IV var identisk med den antentiska produkt, som erhölls genom den metod, som beskrivs i den amerikanska patentskriften 3 781 268. Smp. 194? (sönd.) ¿Bç7šle+85°,(c=2; H20). Relativ potens gentemot' B. subtilis (agarplatta)=960Apg/mg (standard: kanamycin A fri bas). 2 Analys Beräknat för C22H43N50l3~2H2C03: C 40,62 H 6,68 N 9,87% C 40,21, 39,79 VH 6,96, H 6,87 N 9,37, 9,49% 1401669-2 19 Exempel 9 Framställning av monosulfatsaltet av l-[L-(-)- X-amino-d- hydroxibutyryl7kanamycin A 1 mol l-[L-(-)- X-amino-d -hydroxibutyryUkanamycin A upp- löstes-i l-3 liter vatten. Lösningen filtrerades för avlägs- nande av eventuellt olöst fast material. Till den kylda om- rörda lösningen sattes l mol svavelsyra, upplöst i 500 ml ; vatten. Blandningen omrördes under 30 minuter, varefter kall etanol sattes till blandningen till dess utfällning skedde.The compound IV obtained in this process was identical to the authentic product obtained by the method described in U.S. Pat. No. 3,781,268. 194? (Sun.) ¿Bç7šle + 85 °, (c = 2; H20). Relative potency against 'B. subtilis (agar plate) = 960Apg / mg (standard: kanamycin A free base). Analysis Calculated for C 22 H 43 N 5 O 13 · 2H 2 CO 3: C 40.62 H 6.68 N 9.87% C 40.21, 39.79 VH 6.96, H 6.87 N 9.37, 9.49% 1401669-2 Example 9 Preparation of the monosulfate salt of 1- [L - (-) - X-amino-d-hydroxybutyl] kanamycin A 1 mole of 1- [L - (-) - X-amino-d-hydroxybutyrylcanamycin A was dissolved in 1- 3 liters of water. The solution was filtered to remove any undissolved solid. To the cooled stirred solution was added 1 mole of sulfuric acid, dissolved in 500 ml; water. The mixture was stirred for 30 minutes, after which cold ethanol was added to the mixture until it precipitated.

Det fasta materialet tillvaratogs genom filtrering och visa- de sig vara det önskade monosulfatsaltet.The solid was collected by filtration and found to be the desired monosulfate salt.

Exempel 10 Framställning av disulfatsaltet av l-[ï-(-)-}¶-amino-oC- hydroxibutyryl7kanamycin A (BB-K8.2H2S0,) 35 g' l-jfL-(ﬂ- K-amino-OC-hydroxibutyryljkanamycin A (såsom monobikarbonattrihydratet)i upplöstes i 125 ml avjoniserat vatten. Ett pH-värde av ca 9,0 kunde konstateras. pH-värdet sänktes till 7-7,5 med 50%-ig svavelsyra. 8,5 g Darco G-60 (varunamn för aktivt träkol tillverkat av Atlas Company Industries Inc. Se The Condensed Chemical Dictionary 8:e uppl, Van Nostrand Reinhold Company, s. 260) g tillsattes och blandningen uppslammades vid omgivande rums- temperatur under 0,5 timmar. Kolet avlägsnades genom lämplig filtrering och tvättades med 40 ml vatten. Vattentvättvätskan sattes till filtratet.Example 10 Preparation of the disulfate salt of 1- [1 - - (-) -} δ-amino-oC-hydroxybutyl] kanamycin A (BB-K8.2H2SO (such as the monobicarbonate trihydrate) was dissolved in 125 ml of deionized water, a pH of about 9.0 was observed, the pH was lowered to 7-7.5 with 50% sulfuric acid, 8.5 g of Darco G-60 ( Product name for activated charcoal manufactured by Atlas Company Industries Inc. See The Condensed Chemical Dictionary 8th ed., Van Nostrand Reinhold Company, p. 260) g was added and the mixture was slurried at ambient room temperature for 0.5 hours. filtration and washed with 40 ml of water.The water wash was added to the filtrate.

Den kombinerade blandningen av filtrat och tvättvätska inställ- des på pH 2-2,6 med 50%~ig svavelsyra. En stor mängd koldioxid utvecklades. Lösningen fick stå i vakuum under omröring under 20 minuter för avdrivande av ytterligare koldioxid. 8,5 g Darco G-60 sattes till den avgasade lösningen. Bland- ,?4o1669-2 20 ningen uppslammades under 0,5 timmar vid rumstemperatur.The combined mixture of filtrate and washings was adjusted to pH 2-2.6 with 50% sulfuric acid. A large amount of carbon dioxide was evolved. The solution was allowed to stand in vacuo with stirring for 20 minutes to evaporate additional carbon dioxide. 8.5 g of Darco G-60 was added to the degassed solution. The mixture was slurried for 0.5 hours at room temperature.

Kolet avlägsnades genom lämplig filtrering och tvättades med 35 ml avjonïserat vatten. Vattnet sattes till filtratet.The carbon was removed by appropriate filtration and washed with 35 ml of deionized water. The water was added to the filtrate.

Den kombinerade blandningen av filtrat och tvättvätska in- ställdes på pH l-1,3 med 50%-ig svavelsyra. Denna lösning sattes under snabb omröring en tid av 10 minuter till 600- 800 ml metanol (3-4 volymer metanol). Blandningen omrördes § under 5 minuter vid pH l-1,3 och_fick därefter passera genom en 100 mesh sikt, omrördes under 2 minuter och fick stå under 5 minuter. Det mesta av den överliggande vätskan dekan- terades. Den återstâende uppslamningen filtrerades på lämp- ligt sätt, tvättades med 200 ml metanol och vakuumtorkades 2 vid 50° under 24_t.Utbytet av amorf UB-K8, (divätesulfat)g var 32-34 g; ¿z¿7š2 a2o= +14,7s; söndefdelninq vid 220-zsöc.The combined mixture of filtrate and washings was adjusted to pH 1.3 with 50% sulfuric acid. This solution was added with rapid stirring for a period of 10 minutes to 600-800 ml of methanol (3-4 volumes of methanol). The mixture was stirred for 5 minutes at pH 1-3 and then passed through a 100 mesh screen, stirred for 2 minutes and allowed to stand for 5 minutes. Most of the supernatant was decanted. The remaining slurry was suitably filtered, washed with 200 ml of methanol and vacuum dried at 50 ° for 24 hours. The yield of amorphous UB-K8, (dihydrogen sulphate) g was 32-34 g; ¿Z¿7š2 a2o = + 14.7s; decomposition at 220 ° C.

Elementaranalys (på torr basisx) Funnet Beräknat % C 32,7, 33,5, 32,3 33,5 % N -s,7s,,s,7, a,2, 8,8 3 3 8,973 % S 8,75, 8,9,-7,8, 8,85 . 8,2 % askan noll '~o - 2 H- dig Karl Fisher-vattenhalt: 2,33, 1,79, 2,87% (beräknat värde för monohydrat är 2,25% vatten).Elemental analysis (on a dry basisx) Found Calculated% C 32.7, 33.5, 32.3 33.5% N -s, 7s ,,s, 7, a, 2, 8.8 3 3 8.973% S 8, 75, 8.9, -7.8, 8.85. 8.2% ash zero '~ o - 2 H- dig Karl Fisher water content: 2.33, 1.79, 2.87% (calculated value for monohydrate is 2.25% water).

*Detta salt är hygroskopiskt men flyter icke ut. Efter lagring av en alikvot i luft vid rumstemperatur under 18 timmar ökade 2 vattenhalten till 9,55, 9,89% (beräknat värde för pentahydrat är 1o,s3% vatten). ' ~ ' Exemgel ll -Framställning av l-ÅI-(-)àïfïamino-oi-hydroxibutyryl7kana- mycin A (BB-K8) utgående från 6'- N-karbobensoxifl,3,3"- tribensal-kanamycin A (dvs. tri (Schiffs bensaldehyd-bas). 74Û1669"2 21 4,0 g (4,53l mmol) 6'-N-karbobensoxi-1,3,3"-tribensal-kana- mycin A upplöstes i 50 ml dimetylformamid under omröring vid 24°. En lösning av 1,43 g (4,072 mmol) L-(-)-¶1bensyloxikar- bonylamino-CZ-hydroxismörsyra-N-hydroxisuccinimidester i 15 ml DMF tillsattes droppvis under en tidsperiod av 30 minuter.* This salt is hygroscopic but does not flow out. After storing an aliquot in air at room temperature for 18 hours, the water content increased to 9.55, 9.89% (calculated value for pentahydrate is 10.3% water). Example 11 Preparation of 1-Al 2 - (-) Alipinoamino-hydroxybutyl] cannamycin A (BB-K8) starting from 6'-N-carbobenzoxyphyl, 3,3 "-tribensal-kanamycin A (ie tri (Schiff's benzaldehyde base). 4,416 g (4.531 mmol) of 6'-N-carbobenzoxy-1,3,3 "-tribensal-kanamycin A were dissolved in 50 ml of dimethylformamide with stirring at 24 g. A solution of 1.43 g (4.072 mmol) of L - (-) - β-benzyloxycarbonylamino-C2-hydroxybutyric acid N-hydroxysuccinimide ester in 15 ml of DMF was added dropwise over a period of 30 minutes.

Omröringen fortsattes 16 timmar vid 240, varefter reaktions- lösningen späddes med en lika stor volym vatten och induns- taaes i vakuum (4o°) till en »fiskas olja. Denna återuppiöstes i 100 ml av en 50%-ig vattenlösning av dioxan plus 10 ml is- ättika och hydrerades därefter med 1,0 g 5% palladium på kol under 3 timmar. Efter avlägsnandet av katalysatorn koncentre- rades lösningen i vakuum (450) till en återstod, som därefter återupplöstes i 75 ml metylalkohol och utfälldes ur 1000 ml etyleter för erhållande efter filtrering av ett fast material, som efter fullständig torkning i en vakuumexsickator över PZOS gav 3,67 g fast material.Stirring was continued for 16 hours at 240 DEG C., after which the reaction solution was diluted with an equal volume of water and evaporated in vacuo (40 DEG C.) to a fish oil. This was redissolved in 100 ml of a 50% aqueous solution of dioxane plus 10 ml of glacial acetic acid and then hydrogenated with 1.0 g of 5% palladium on carbon for 3 hours. After removal of the catalyst, the solution was concentrated in vacuo (450) to a residue, which was then redissolved in 75 ml of methyl alcohol and precipitated from 1000 ml of ethyl ether to obtain, after filtration, a solid which, after complete drying in a vacuum desiccator over PZOS, gave 3 , 67 g solids.

Tunnskiktskromatografianalys utfördes på silikagelplattor under användning av systemet CHCl3/CH30H/NH4OH/H20 i förhål- landet l:4:2:1 och bioautografanalys utfördes med B. subtilis på agarplattor med pH 8.Thin layer chromatography analysis was performed on silica gel plates using the CHCl 3 / CH 3 OH / NH 4 OH / H 2 O ratio in the ratio 1: 4: 2: 1 and bioautographic analysis was performed with B. subtilis on pH 8 agar plates.

Differentialbioanalysdata för ovannämnda fasta material med avseen- de på B. subtilis och E. coli antydde att det fasta materia- let innehöll 33,9l% oreagerat kanamycin A och l5,89% av före- ningen BB-K8.Differential bioassay data for the above B. subtilis and E. coli solids indicated that the solid contained 33.91% unreacted kanamycin A and 155.89% of the compound BB-K8.

Exemgel 12 Framställning av 1-11-(-)-B'-amino-O¿-hydroxibutyry17kana- mycin A (BB-K8) utgående från 6'-N-karbobensoxi-l,3,3"-tri- (Schiffs pivalaldehydbas)-kanamycin A 0,5 g (0,5468 mmol) 6'~N-karbobensoxi-1,3,3"-tri(Schiffs pival- aldehydbas)-kanamycin A upplöstes i 10 ml tetrahydrofuran och 1,0 ml vid 24°. En lösning av 0,2299 g (0,6562 mmol) L-(-)-¶f- bensyloxikarbonylamino-Cl-hydroxismörsyra-N-hydroxisuccinimid- ester i 3,0 ml THF tillsattes under ca 1 minut under omröring -vuo1s69-2 n. 2:2 vid 240. Efter 16 timmar indunstades lösningen till torrhet i vakuum (400) och den på-så sätt erhållna återstoden åter-* . upplöstes i 50 ml av en 50%-ig vattenlösning av dioxan inne- hållande 2,0 ml isättika. Blandningen behandlades med 100 mg av en katalysator av 5% palladium på träkol och-hydrerades 2 timmar vid 230. Efter filtrering för avlägsnande av kata- lysatorn koncentrerades lösningen i vakuum (45°) till en ~âterstod, som återupplöstes i 10 ml metylalkohol och utfäll- des ur 500 ml etyleter för erhållande efter filtrering av ett fast material, som torkades fullständigt i en vakuum- f exsickator över P2O5 för erhållande av 0,490 g fast material.Example Gel 12 Preparation of 1-11 - (-) - β'-amino-β-hydroxybutyryl cannamycin A (BB-K8) starting from 6'-N-carbobenzoxy-1,3,3 "-tri- (Schiff's pivalaldehyde base ) -kanamycin A 0.5 g (0.5468 mmol) of 6'-N-carbobenzoxy-1,3,3 "-tri (Schiff's pivalaldehyde base) -kanamycin A was dissolved in 10 ml of tetrahydrofuran and 1.0 ml at 24 ml. °. A solution of 0.2299 g (0.6562 mmol) of L - (-) - β-benzyloxycarbonylamino-C1-hydroxybutyric acid-N-hydroxysuccinimide ester in 3.0 ml of THF was added over about 1 minute with stirring. n. 2: 2 at 240. After 16 hours, the solution was evaporated to dryness in vacuo (400) and the residue thus obtained was again evaporated. was dissolved in 50 ml of a 50% aqueous solution of dioxane containing 2.0 ml of glacial acetic acid. The mixture was treated with 100 mg of a 5% palladium catalyst on charcoal and hydrogenated for 2 hours at 230. After filtration to remove the catalyst, the solution was concentrated in vacuo (45 °) to a residue, which was redissolved in 10 ml of methyl alcohol and precipitated from 500 ml of ethyl ether to obtain, after filtration, a solid which was completely dried in a vacuum desiccator over P2O5 to give 0.490 g of solid.

Analys skedde såsom i enempel ll, dvs. medelst tunnskikts- kromatografi, bioautografi och differentialbioanalysdata. Sist- nämnda analys antydde en 9,64% omvandling till föreningen HBBFKB och 27,38% oreagerat kanamycin A.Analysis was performed as in Example 11, i.e. by means of thin layer chromatography, bioautography and differential bioassay data. The latter analysis indicated a 9.64% conversion to the compound HBBFKB and 27.38% unreacted kanamycin A.

Exemgel 13 Framställning av l-Å1-(-)-ñ”-amino-0¿-hydroxibutyryl7kana- mycin A (BB-K8) utgående från 6'4N4karbobensoxi-lf3,3"- tri- (Schiffs p-metoxibensalbas)-kanamycin A 0 0 0,5 g (0,5l39 mmol) 6'-N-karbobensoxi-l,3,3"-tri(p-metoxi- bensal)-kanamycin A upplöstes i en blandning av 20 ml tetra-_ hydrofuran och 2,0 ml vatten vid 240. En lösning av 0,216 g (0,6l67 mmol) L-(-)-jfebensyloxikarbonylamino-ﬂß-hydroxismör- syra-N-hydroxisuccinimidester i 6,0 ml THE tillsattes lång- samt under omröring vid 240 under ca l minuter. Efter omrö- ring vid 240 under 16 timmar koncentrerades lösningen i vakuum (40°l till en återstod, som återupplöstes i 50 ml av en 50%f ig vattenlösning av dioxan innehållande 2,0 ml isättika. 100 mg av en katalysator av 5% palladium på träkol tillsattes och hydrering_utfördes vid 240 under 2 timmar. Blandningen dfiltrerades för avlägsnande av katalysatorn och koncentrera- des i vakuum (45°) till en återstod. Återstoden återupplöstese i 10, m1 metgyialkohoi och fast material utfallaes-mea soo m1 7l+01669-2 23 _ etyleter vid 240. Efter fullständig torkning i en vakuum- exsickator över P2O5 erhölls 0,440? g fast material.Example 13 Preparation of 1-Å1 - (-) - ñ "-amino-β-hydroxybutyl] cannamycin A (BB-K8) starting from 6'4N4carbobenzoxy-lf3,3" 0.5 g (0.5l39 mmol) of 6'-N-carbobenzoxy-1,3,3 "-tri (p-methoxybenzal) -kanamycin A was dissolved in a mixture of 20 ml of tetrahydrofuran and 2.0 ml of water at 240. A solution of 0.216 g (0.6l67 mmol) of L - (-) - β-benzyloxycarbonylamino-β-hydroxybutyric acid N-hydroxysuccinimide ester in 6.0 ml of THE was slowly added with stirring at 240 for about 1 minute. After stirring at 240 for 16 hours, the solution was concentrated in vacuo (40 ° L to a residue, which was redissolved in 50 ml of a 50% aqueous solution of dioxane containing 2.0 ml of glacial acetic acid. 100 mg of a catalyst of 5% Palladium on charcoal was added and hydrogenation was carried out at 240 for 2 hours, the mixture was filtered to remove the catalyst and concentrated in vacuo (45 °) to a residue, the residue being redissolved in 10 ml of methyl alcohol and solids precipitated in ml + 716 + 01669. -2 23 - ethyl ether at 240. After complete drying in a vacuum desiccator over P2O5, 0.440 g of solid were obtained.

Analys utfördes såsom i exempel ll, nämligen medelst tunn- skiktskromatografi, bioautografi och differentiell bioanalys.Analysis was performed as in Example 11, namely by thin layer chromatography, bioautography and differential bioassay.

Sistnämnda analysmetod visade 23,89% oreagerat kanamycin A och en l7,43%-ig omvandling till föreningen BB-K8.The latter analysis method showed 23.89% unreacted kanamycin A and a 17.43% conversion to the compound BB-K8.

TEKNISKT FRAMSTEG JÄMFÖRT MED TEKNIKENS STÅNDPUNKT Föreliggande uppfinning avser ett förhättrat förfarande för framställning av ett känt derivat av föreningen kanamycin A, nämligen föreningen l-[IÉ- (-) - X -amino- d -hydroxibutyrylf-ka- namycin A, som i föreliggande sammanhang benämns BB-K8. Den- na förening är känd genom svenska patentet 72.092ll-7 och upp- visar en utmärkt antihakteriell aktivitet, som har visat sig vara överlägsen aktiviteten av moderföreningen kanamycin A.TECHNICAL PROGRESS COMPARED TO THE PRIOR ART The present invention relates to an enhanced process for the preparation of a known derivative of the compound kanamycin A, namely the compound 1- [1E- (-) - X -amino-d-hydroxybutyrylphanamycin A, context is called BB-K8. This compound is known from Swedish patent 72,09211-7 and exhibits an excellent antihacterial activity, which has been found to be superior to the activity of the parent compound kanamycin A.

Moderföreningen kanamycin A uppvisar fyra primära aminfunk- tioner i molekyiens 1-, 3-, er- och sﬁstäilningar. Det har visat sig att 6'-aminfunktionen är den reaktivaste och att 1- -aminfunktionen kommer därnäst när det gäller reaktivitet vid behandling med ett elektrofilt medel. Det är därför känt genom svenska patentet 72.092ll-7 att för framställning av förening- en BB-K8 först blockera aminogruppen i 6'-ställningen av ka- namycin A, t.ex. genom selektiv acylering med N-(bensyloxi- karbonyloxi)-succinimid, därefter införa den önskade L-(~)~X- .~amino-(2-hydroxibutyrylgruppen i 1-ställning och slutligen avlägsna den aminoskyddande gruppen i 6'-ställningen för fram- ställningen av det önskade derivatet.The parent compound kanamycin A exhibits four primary amine functions in the molecules 1, 3, er and s il positions. It has been found that the 6'-amine function is the most reactive and that the 1-amine function comes next in terms of reactivity when treated with an electrophilic agent. It is therefore known from Swedish patent 72,09211-7 to first block the amino group in the 6 'position of kanamycin A for the preparation of the compound BB-K8, e.g. by selective acylation with N- (benzyloxycarbonyloxy) -succinimide, then introduce the desired L- (~) -X- .- amino- (2-hydroxybutryl group in the 1-position and finally remove the amino-protecting group in the 6 'position for the preparation of the desired derivative.

Förfarandet enligt föreliggande uppfinning för framställning av den kända föreningen BB-K8 innebär även att man först se- lektivt acylerar 6'-aminofunktionen i kanamycin A på i och för sig känt sätt med N-(bensyloxikarbonyloxi)-succinimid för fram- ställning av föreningen med den i kravet 1 angivna formeln II, inför L-(-)-K-amino-d-hydroxibutyrylgruppen i den önskade 1- 7401669-2 24 -ställningen och slutligen avlägsnar blockerinqsgrupperna.The process of the present invention for the preparation of the known compound BB-K8 also involves first selectively acylating the 6 'amino function of kanamycin A in a manner known per se with N- (benzyloxycarbonyloxy) -succinimide for the preparation of the compound with the formula II set forth in claim 1, introduces the L - (-) - K-amino-d-hydroxybutryl group in the desired position and finally removes the blocking groups.

Föreliggande uppfinning baserar sig på den upptäckten, att ehuru både 3- och 3"-ställningarna i kanamycin A är mindre reaktiva än 1- eller 6'-aminofunktionerna, de ändock reage- rar under bildning av icke önskvärda acylerade produkter i lågt utbyte vid det genom svenska patentet 72.092ll-7 kända förfarandet. I enlighet med föreliggande uppfinning åstad- kommer man ett förbättrat förfarande för selektiv acylering- av l-aminfunktionen i kanamycin A och detta förfarande utmärks av de i huvudkravet angivna särdragen under A) och B).The present invention is based on the discovery that although both the 3- and 3 "positions of kanamycin A are less reactive than the 1- or 6'-amino functions, they nevertheless react to form undesirable acylated products in low yield at the In accordance with the present invention, there is provided an improved process for the selective acylation of the 1-amine function in kanamycin A and this process is characterized by the features set forth in the main claim under A) and B).

Vi hänvisar nu till exempel 8 i föreliggande patent ooh när- mare bestämt till tabellen i detta exempel; Såsom framgâr.av å.den tabellen erhålls föreningen BB-K8 vid utnyttjandet av för- farandet enligt uppfinningen i ett utbyte av 19,2 % och med en relativ potens av 960 pg/mg (detta representerar en ren- het av 96%).We now refer to Example 8 of the present patent and more particularly to the table in this example; As can be seen from the table, the compound BB-K8 is obtained in the use of the process according to the invention in a yield of 19.2% and with a relative potency of 960 pg / mg (this represents a purity of 96%). .

Vi hänvisar även till exempel 4 i svenska patentet 72.092ll-7, av vilket framgår att föreningen BB-K8 vid det kända förfa- randet erhålls i en mängd av 552 mg (representerande ett ut- byte av 22%). Emellertid hade den enligt exempel Ä erhållna produkten en relativ potens av endast 560 ng/mg, vilket mot- svarar en renhet av endast 56%. Enligt exempel 4 renades den- na produkt därefter, varvid man erhöll 98 mg av en produkt 7 med en relativ potens av 960 P9/mg (96% renhet). Enkel mate- _ matik ger vid handen att, eftersom 552 mg representerar ett utbyte av 22%, 98 mg måste representera ett utbyte av endast 3,85%.We also refer to example 4 in Swedish patent 72,09211-7, from which it appears that the compound BB-K8 in the known process is obtained in an amount of 552 mg (representing a yield of 22%). However, the product obtained according to Example Ä had a relative potency of only 560 ng / mg, which corresponds to a purity of only 56%. According to Example 4, this product was then purified to give 98 mg of a product 7 having a relative potency of 960 P9 / mg (96% purity). Simple mathematics suggests that, since 552 mg represents a yield of 22%, 98 mg must represent a yield of only 3.85%.

Slutsatsen blir således att man vid det kända förfarandet en- ligt svenska patentet 72.092ll-7 erhåller föreningen BB-K8 i en renhet av 96% men endast i ett utbyte av 3,85% medan man vid förfarandet enligt uppfinningen erhåller samma förening fortfarande i en renhet av 96% men i ett väsentligt stegrat utbyte av 22%, vilket innebär en 5-6-faldig utbytesstegring.The conclusion is thus that in the known process according to Swedish patent 72,09211-7 the compound BB-K8 is obtained in a purity of 96% but only in a yield of 3.85% while in the process according to the invention the same compound is still obtained in a purity of 96% but in a significantly increased yield of 22%, which means a 5-6-fold increase in yield.

Claims

7. A process for the preparation of 1- [L - (-) - 2f-amino-α- -hydroxybutyryl] -anamycin A of the formula CH NH 2 'N 4 4'f "å $} jU", ï1 '* - «R¶v'“ R, -J. 2 "_ '{; ¿»' Lr, ~ '"~» “-or = W f. _'. ._ '¿...'. ' ~ '|' | '4_w- genpm by selectively acylating the 6'-amino function of kanamycin A in a manner known per se with N ~ (benzyloxycarbonyloxy) -succinimide to prepare the compound of the formula ~ H nä _ II _. Ho. _ ca2-Nc-9-GH2 '° <. “s'.' '7401669-2 26? - before L - (-) - 3 »-amina -« - hyarøxibueyryi group 1 ae & = desired 1-e: ë11- -ningen and removes the blocking groups, characterized by the fact that e _ A) is treated one mole of compound II with 5-6 moles of an aldehyde, consisting of 4-nitrobenzaldehyde, benzaldehyde, 4-methoxybenzaldehyde or pivaldehyde, in a (lower) alkanol, consisting of absolute ethanol, methanol, n- propanol, ieopropanol, n-butanol, sec.-butanol, tert-butanol or mixtures thereof, at a temperature of from 50 ° 0 to approximately the reflux temperature of the system for 2-10 hours to prepare a compound of the formula fce ﬂ sfs c ﬂ z-N - ao-eg: wherein Z is a group of the formula _N¿â _ <::> _ h ° 2 '., N.ç - <::>,' -'- '' - - CH - _ - 'H _ H | 3- ''.. Han-Q - <:;>. 0cH3 eller fN¶C -? - C83; I ooh f f. " .íï'aeÜ; '. CH3 '7 ti! IB) treats one mole of compound III with 1-1.5 moles of L - (-) - 2H-benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybutyric acid N-hydroxysuccinimide ester in a solvent consisting of dimethylformamide, tetrahydrofuran, dimethylacetamide, propylene glycol dimethylimethyl ether, ethylethylene dimethyl ether ether or dioxane, at a temperature of from about 10 ° C to about 35 ° C, then removes the solvent in vacuo and hydrates the residue in situ with hydrogen in the presence of a metal catalyst consisting of palladium, platinum, rhodium, Raney nickel, ruthenium or nickel, in a system consisting of water and a water-miscible solvent and consisting of water and dioxane, tetrahydrofuran, ethylene glycol dimethyl ether or propylene glycol dimethyl ether, in the presence of a catalytic amount of glacial acetic acid to produce compound IV. '

Process according to Claim 1, characterized in that one mole of kanamycin A is acylated with about one mole of N- (benzyloxycarbonylloxy) succinimide in a solvent consisting of dimethylformamide, dimethylacetamide, tetrahydrofuran, dioxane, 1,2- dimethoxyethane, methanol, ethanol, water, acetone, pyridine, an N- (lower) alkylpiperidine or mixtures thereof, at a temperature below 25 ° C to prepare compound II.

3. A process according to claims 1 and 2, characterized in that in turn AA is acylated one mole of kanamycin A with about one mole of N- (benzyloxycarbonyloxy) succinimide in dimethylformamide at a temperature of from about - 20 ° G to about 10 ° C for the preparation of compound II, B) treating one mole of compound II with 3.5-4.5 moles of p-nitrobenzaldehyde or benzaldehyde in absolute ethanol, methanol, n-propanol or isopropanol at approximately reflux temperature for a period of 2-4 hours to prepare Compound III, wherein Z is a group of the formula (III), a mole of Compound III with from about 1.1 to about 1.3 moles of L - (-) - Qy-benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybutyric acid-N-hydroxysuccinimide ether in dimethylformamide at about room temperature for at least 5 hours, then remove the solvent in vacuo and hydrate the residue in situ with hydrogen in presence of palladium on charcoal in a 1: 1 mixture of dioxane and water in the presence of a catalytic amount of ice ttika for the preparation of compound IV. >

4. A process according to claims 1 and 2, characterized in that in turn A) one mole of kanamycin A is acylated with about one mole of N- (benzyloxycarbonyloxy) -succinimide in dimethylformamide at a temperature of from about -2000 to about 10 ° C for the preparation of compound II, B) treating one mole of compound II with about 4 moles of p-nitrobenzaldehyde in absolute ethanol at about reflux temperature for a period of about 2-4 hours to prepare compound III, wherein Z is a group of the formula 140) -N-.qQ-Noz-í f '_. °, ° h G) treats one mole of compound; III with about 1.2 moles of L - (-) - 4-y -ben syloxycarbonylamino-α -hydroxybutyric acid-N-hydroxysuccinimi de ether in -dimethylformamide at about room temperature for at least 5 hours, then remove the solvent in vacuo and hydrogenates the residue in situ with hydrogen in the presence of palladium on wood in a 1: 1 mixture of dioxane and water in the presence of a catalytic amount of glacial acetic acid to prepare compound IV. t t t. PROMISED PUBLICATIONS: * Sweden putentonsökan _9 211/72 7 U5 3_ 647 779 ~ '7