SE417971B - Forfarande for framstellning av 1-(l-(-)-gamma-amino-alfa-hydroxibutyryl)-kanamycin a - Google Patents

Description

7401669-2 Kanamycin A uppvisar fyra primära aminfunktioner i molekylens 1-, 3-, fr- och 3“-ls.~.ä11nigngar. nss har fastställts att 6'- aminfunktionen är den reaktiüaste och att l-aminfunktionen kommer därnäst när det gäller reaktivitet vid behandling med ett elektrofilt medel. Både 3- och 3"-ställningarn gär mind- re reaktiva än_l- eller 6'-aminfunktionerna men reagerar än- 'dock under bildning av de icke önskvärda acylerade produkter- na i lågt utbyte. Ändamålet med föreliggande uppfinning är att åstadkomma ett förbättrat förfarande för selektiv acylering av l-aminfunk- ttionen i kanamycin A. Uppfinningen avser närmare bestämt ett nytt och väsentligt effektivare förfarande för framställning av l-LL-(,-)-' X-amino-of-hydroxibutyryU-kanamycin A med for- meln cfla -Nnz :io s.H° _ f Förfaranüet enligt nppfinningen innebär att man selektivt acy- i lerar 6'-aminofunktionen i kanamycin A på i och 'för sig' känt sätt med N- (bensyloxikarbonyloxi)-succinimid för framställning' wav föreningen med formeln ~_-.. . 1. a. 7401669-2 o H I inför L-(-)- X-amino-Oí -hydroxibutyrylgruppen i den önskade l-ställningen och avlägsnar blockeringsgrupperna,varvid för- farandet utmärks av att man A) behandlar en mol av förening II med 3-6 mol av en aldehyd, som utgörs av 4-nitrobensaldehyd, bensaldehyd, 4-metoxibens- aldehyd eller pivaldehyd, i en (lägre)alkanol, som utgörs av absolut etanol, metanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, sekwbutanol, tert.-butanol eller blandningar därav, vid en temperatur av från 50°C till ungefär systemets återflödes- temperatur under 2-10 timmar för framställning av en förening med formeln 7401669-2 '. t; |_'Å' .Iz .ill , . I _. i I c / \ løcfl; I mer :N-.C-f-Cflszf' _ '.' .lï-ÉL: ' , egvará. Z lltsön en END? med formeln _N_-_ä_®_iw I-:rtwcß @.Mï_ . 1 f ._ g%'gP¿ ~;aq!gr och B) behandlar en mol av förening III med l-1,3 mal L-(-)-X- bensylóxikarbonylamind-of-hydroxismörsyra-N-hydrokisucdinimid- ester i ett lösningsmedel, som utgörs av dimetylformamid, tetrahydrofuran, dimetylacetamid, propylenglykoldimetyleter, etylenglykoldimetyleter eller dioxan, vid en temperatur av från ca lO°C till ca 35°C, därefter avlägsnar lösningsmedlet vi vakuum óch hydrerar återstoaen in situ med väte i närvaro av en metallkatalysator, som utgörs av palladium, platina,f rodium,.Raney-nickel, rutenium eller nickel, i ett system, som utgörs av vatten och ett med vatten blandbart lösnings- medel och som består av vatten och dioxan, tetrahyärofuran, etylenglykoldimetyleter eller propylenglykoldimetyleter, i närvaro av en kátalytisk mängd isättika för framställning av förening IV. ' I Förening IV, egl-/ïl-(fl-X-Éamino-ot -hydroxibutyryy-kanamycin A, luppvisar utmärkt antíbakteriell aktivitet, som visar sig vara 7401669-2 5 överlägsen aktiviteten av kanamycin A. I de två tabellerna nedan åskådliggörs minimuminhiberingskoncentrationerna (MIK) för kanamycin A och förening IV (BB-K8) med avseende på en mångfald grampositiva och gramnegativa bakterier, vilka kon- centrationsvärden har erhållits medelst Steers agar-utspäd- ningsmetod (tabell l) och den tvåfaldiga spädningsmetoden (tabell 2). Mueller-Hintons agarmedium användes vid försöken enligt tabell l och hjärtinfusionmedium användes vid försö- ken enligt tabell 2.

'Tabell l (MIK Eg.¿ml.) Förening IV _ ~ Kanamycin A (BB-K8) Organlsm 5 (6-8198) _gts Nr. 4 1. Alk. faecalis A-9425 16 ' 8 2. " Å " A-eosus ' > 125 >125 5. Ent. cloacae A-0656 5 4 4 .4. " species A-20564 >l25 2 ' 5. " hafniae 1 A-20674 1 1 6. E. w cóli-A-0656 ' 2 1 7. "_ «' H A-zoeeu _ 16 u. 8. " " A-20665 >l25 1 9. ". " Ag-2o5o7 52 2 10". " "_ A-2052O 125 4 ll. " " A-20565 125 1 12. " " A-20684 2 2 15. E " A-20682 ' - >125 2 14. '” A-20685 _. 125 8 15. " " A-20681 125' 2 16. " " A-15119 - 4' 4 17. K. pneumoniae A-0967 4 4 16. " species A 20528 “ >l25 2 2 19. " " _ A-20550 52 52 20. " " .11-20654 >12 5 4 21. " pneumoniae A-20680 >l25 4 22. " " _ _ 11-0077 1 1 25. Pr. mmrabllls A-9900 2 2 24. Pr. morganlm A-15155 2 2 25. " vulgarla A-9555 2 . 1 26. " rettgerl A-9656 0,25 0,25 27- " m}rab1l1s A-20645 4 4 26. " mlrabzlms A-20454 2 2 29. Providencia stuartii A-20615 2 1 50. " _ alkalifaciens A-20676 l l 5l. Es. aernglnosa A-20229 5 2 52. “ " ' A-O945A 125 16 53 . g _ 1-20655 > 125 - 52 54. " speczes A-20601 125, 65 16 55. " " 11-20621 > 125 > 125 56. " maltophilia A-20620 52 >l25 1,~vuo16as+22. sàl., enteiiviais 11-0531 372 1 0.5 as. " 2 derby A-zoos? >125 '1 59. Ser. marcescens A-20019 5 2 4 240 2 2 2:: A~9935 ~4 28 41. A-20460 >125 4,2 42. I' " 5 .A-2o459 L. 16 45.~.Shig. flexneri A-9684 4 4 44 ; Aeromonas sp. A+206?0 2 2 45. 2Arizona sp. A-20671 2 2 1 246. Citrobacter sp. A-20675 24. 4 47. Edwardsiella sp. A-20678 4 4 48. Staph. aureus A-9606 ' 1 1 49. "2 _ F' A-4749 0,5 1 50.- "_ _ " .A-9537 2 2 1 51 "_ ' " 21-20610 >125 »2 52. §taph. auzïeus 11-20240 >125 2 8 55. 5! 5 ' _ .A-15197 ' l j 2 54.5_§tr.2faecfi11s A<9854 65 2 65 55- 2¿ 5 25 5 A-9575 125 >l25 56. u 2pyogenes5A-20200 52, 16 52 57. H '~ : »A-9604 125 125 58. _ 22A-15040 125 _l25 59. " 2“2 A-20065 125 ' 125 60. _D. pneumoniae A-9585 65, 52 65 61. " " 4-20159 125 _>125 Tabell 2 §MIK Eg.¿m1.) 2 Förenin IV Gr a ¿ Kanamïcàn A (šß-šßš u 5 nlsm - - 2sa s r l. D. pneumoniae ï5%íserum A-0585 65 65 _-2.~ Str. pyrogenes.35ß serum A-96042 125 125 5. Staph. aureus Sm1th_Af9557 0,5 0,5 _4. Staph. aureus A-9497 _ 0,5 0,5 _ 5. Staph aureus A-20239 125 4 6. Staph. aureus A-20240 2 2 125, 2 4 47. Enter. qloaçae A-0656 2 22' 8. Enter. speçles A-20564 125 2 ' 9. K. pnagmonlae A~986? V 2 2 4 2 10. E. co11 Kfl2 ML1410~A-20561 2 4 - ll. 2E. col; K-12 ME1630 A-20563 125 2 12. E. co112K~l2 A-9632 2 2 21 15. E. co11 A-20664 2 52 8 14. E. co11 A-26665 125 B 15. Pr. mirabi11s A-9900 2 16 5 16. Pr. morganll A-15155 4 '16 17. Pr. vulgapis A~9456 1 2 18. Ps.2aerug1nosa A~2022?5 4 1 19.2 Ps. speclçs A-20499_ 65 2 4 2 20. Ps. aeruglnosa A-20655 125 4 21. Ps. specmes A~2062l 125 125 22 Ser. marcescens A-20019 2 4 16 16 2Ser.2màrcescens A-20141' 7001669-2 Ovan angivna MIK-data visar att föreningen IV (BB-K8) är överlägsen kanamycin A i aktivitet, speciellt med avseende på kanamycin A-resistenta organismer.

Dessa MIK-data stämmer även väl överens med in vivo-resulta- ten för de tre organismer gentemot vilka kanamycin A och före- ningen IV testades.

Föreningen IV och kanamycin A var lika effektiva vid infek- tioner hos möss, orsakade av kanamycin A-känsliga stammar av E. ggli A-15119 och §§§ph. aureus A-9537. Ehuru CD50-värdena (kurativa dosen hos 50% av letalt infekterade möss) för §t§ph. aureus A-9537 antyder att föreningen IV är något mindreakthrän kanamycin A, är denna lilla skillnad förmodligen icke signi- fikant eftersom dosnivåerna skiljde sig kraftigt åt (utspäd- ning 5 gånger).

Med avseende på den kanamycin-resistenta stammen av E. ggli A-20$20 var kanamycin A såsom väntat icke speciellt aktiv in vivo medan föreningen IV uppvisade en markant skyddsverkan.

Föreningen IV var ungefär 10 gånger aktivare med avseende på denna E. coli-stam vid administrering genom en 4-behandlinga- kur än vid en Z-behandlingskuin Tabell 3 En jämförelse av in vitro- och in vivo-aktiviteterna av före- ning IV och kanamycin A.

Staphylo- Escherichia Escherichia coccus coli coli För- aureus A-15119 A-20520 Förening sök A-9537 a b MIX ggso MIK ggso Mix 51350 Förening IV l l 2,0 x 2 2 2 x 2 2 66 x 2 2 -° - - - - s x 4 Kanamycin A l 2 0,5 x 2 4 4 x 2 l25 200 x 2 2 - - ~ - ~ 200 X 4 ~7uo1e69-2 . 8 i aMIK = minimuminhiberingskoncentration (pg/ml). Försöken ut- fördes såsom beskrives av Chisholm et al. (Antimicrob. Agents e and Chemotherapy-1969, p. 244, 1970) under användning av. 7 Mueller-Hintens agarmedium såsom testmedium. bcoso :Jgurativ dos, 50% (mq/kg/x antal behandlingar). Möss behandlades subkutant en och fyra timmar efter infektion, då två behandlingar utfördes, och 0, 2, 4 och 6 timmar efter in- fektion, då fyra behandlingar utfördes. Andra aspekter av tes- ïtet utfördes enl. Price et al. (J. of Antibiotics 2å:l, 1969). *c_ = ej testad; Förening lv är värdefull såsom ett antibakteriellt medel, så- som näringskomplement i djurfoder, terapeutiskt medel för fjäderfä och djur inklusive människa och är speciellt värde- full vid behandling av infektionssjükdomar, orsakade av gram- positiva och gramnegativa bakterier.

Vid oral administrering är förening IV användbar såsom under- I stödjande behandlingsmedel för preoperativ sterilisering av ~ inâlvorna. Både aerob och anaerob bakterieflora, som är käns- lig gentemot detta ämne, reduceras i tarmarna. Med efterföl- jande adekvat mekanisk rengöring är föreningen användbar vid förberedelse för kolon-kirurgi.

Förening IV är effektiv vid behandling av systemiska bakterie- infektioner hos människa vid parenteral administrering i en' 7 dosering av från ca 250 mg till ca 3000 mg per dygn i avdela- * de doser tre eller fyra gånger per dygn. I allmänhet är före- ningen effektiv vid administrering i en dosering av ca 5,0- 7,5 mg/kg kroppsvikt var tolfte timme. ' ' Vid en föredragen utföringsform av förfarandet enligt uppfin- ningen acylerar man l mol kanamycin A med ca 1 mol N-(bensy- I loxikarbonyloxi)-succinimid i ett lösningsmedel, som utgörs av dimetylformamid, dimetylacetamid, tetrahydrofuran, dioxan, g74o1sa9-2 9 1,2-dimetoxietan, metanol, etanol, vatten, aceton, pyridin, en N-(lägre)alkylpiperidin eller blandningar därav, vid en temperatur under 25°C för framställning av förening II.

En mera föredragen utföringsform av förfarandet enligt upp- finningen för framställning av förening IV innebär att man i tur och ordning A) acylerar l mol kanamycin A med ca l mol N-(bensyloxikarbo- 'nvloxi)succinimid i dimetylformamid vid en temperatur inom intervallet från ca -20°C till ca l0°C för framställning av föreningen II; B) behandlar 1 mol av föreningen II med 3,5-4,5 mol p-nitro- bensaldehyd eller bensaldehyd i absolut etanol, metanol, n- propanol eller isopropanol vid ungefär återflödestemperatur under en tid av ca 2-4 timmar för framställning av förening III, vari Z utgör en grupp med formeln 'V H o H A .

'TN-çflflcâ eller ' -N-'C-Q och C) behandlar l mol av föreningen III med från ca l,l till ca . l , 3 mol L- (-) '- b' -bensyloxi-karbonylamino- OC-hydroxismörsyra- N-hydroxisuccinimidester i dimetylformamid vid ungefär rums- temperatur under minst 5 timmar, därefter avlägsnar lösnings- medlet i vakuum och hydrerar återstoden in situ med väte i närvaro av palladium på träkol i en 1:1-blandning av dioxan och vatten i närvaro av en katalytisk mängd isättika för fram- ställning av föreningen IV.

Den mest föredragna utföringsformen av förfarandet enligt upp- finningen för framställning av föreningen IV innebär att man i tur och ordning A) acylerar l mol kanamycin A med ca 1 mol N-(bensyloxikarbo- =1uo1669+2r 10 'nyloxU-succinimid i dimetylformamid vid en temperatur inom intervallet från ca ~2_0°C tillca l0°C för framställning avi förening II; fB) behandlar l mol av förening II med ca 4 mol p-nitrobensal- Kdehyd i absolut etanol vid ungefär återflödestemperatur under *een tid av ca 2-4 timmar för framställning av förening III, vari Z utgör gruppen : _.H_.U. _ .i ø íxøC-öfNOzt ; och C) behandlar l mol av förening III med ca 1,2 mol L-(-%-X- bensyloxikarbonylamino-of-hydroxismörsyra-N-hydroxisuccinimíd- T ester i dimetylformamid vid ungefär rumstemperatur under minst .5 timmar, därefter avlägsnar lösningsmedlet i vakuum och hyd-W rerar återstoden in situ med väte i närvaro av palladium på träkol i en l:l-blandning av dioxan och vatten i närvaro av en katalytisk mängd isättika för framställning av förening IV.

I föreliggande sammanhang avses med uttrycket “(lägre)alkvl“en rak eller grenad alkylgrupp med l-6 kolatomer. Med uttrycket "(lägre)alkanol" avses en rak eller grenad, mättad alkohol med l-6 kolatomer och innehållande en OH-funktion.

I Uppfinningen âskådliggörs närmare medelst följande exempel, ~vari temperaturerna avser Celsiusgrader, ExemEel,l Erams tällning av L- (-) - b' -bensyloxikarbonylamino- OC -hydroxi- smörsyra e (VI) i t a _L-f(-)--X-amino--OCF-hydroxismörsyra (7,4 g; 0,062 mol) sattes till~en-lösning av 5,2 g {0,l3 mol) natriumhydroxid i 50 ml vatten. Till den omrörda lösningen sattes droppvis vid O-39 ag under en tidsperiod av 0,5 timar ll,7 g (0,068 mol) karbo- 7401669-2 ll I U H bensoxiklorid och omröringen fortsattes under ytterligare 1 timme vid samma temperatur. Reaktionsblandningen tvättades med 50 ml eter, inställdes på pH 2 med utspädd klorvätesyra och extraherades med fyra 80-ml-portioner eter. Eterextrak- ten kombinerades, tvättades med en liten mängd mättad nat- riumkloridlösning, torkades över vattenfritt natriumsulfat och filtrerades. Filtratet indunstades i vakuum och den er- hållna återstoden kristalliserades ur bensen, varvid man er- höll ll,6 g (74%) färglösa plattor med smp. 78,5-79,50; ¿É{]b= 4,s° (e=2, cn3on), IR (Rang e=o 1740, 1690 amd; man (ace- ton-d6) (i ppm ur TMS) 2,0 (2H,m), 3,29 (2H,d-d, J=6,7 och 12 Hz), 4,16 (lH,d-d, J=4,5 och 8 Hz), 4,99 (2H,s) 6,2 (2H, bred), 7,21 (5H,s).

Analys: Beräknat för Cl2Hl5NO5: C 56,91 H 5,97 N 5,53% rummet: c' 56,66 H 5,97 N 5,47% Exempel 2 N-hydroxisuccinimidester av L- (-) - X -bensyloxikarbonylamino- OC- hydroxismörsyra (VII) En lösning av 10,6 g (0,042 mol) av förening VI och 4,8 g (0,042 mol) N-hydroxisuccinimidl i 200 ml etylacetat kyldes ti11 o° och därefter tiileattee 8,6 g (o,o42 mel), aieykle- hexylkarbodiimid. Blandningen förvarades över natten i kylskåp.

Den utfällda dicyklohexylkarbamiden avfiltrerades och filtra- tet koncentrerades till ca 50 ml under reducerat tryck, var- vid man erhöll färglösa kristaller av förening VII, vilka till- varatogs genom filtrering; 6,4 g; smp. 121-l22,5°. Filtratet indunstades till torrhet i vakuum och den kristallina återsto- den tvättades med 20 ml av en bensen-n-hexan-blandning för er- hållande av en ytterligare mängd av förening VII. Det totala utbytet ver 13,4 g (92%), [v47 1,s° (c=2, cac13); IR (rang =.o 1e1o, 17ss, 1740, 1680 em' ; NMa-(eeetom-aóß (i ppm ur ms) 2,0 (2H, m), 2,83 (4H, s), 3,37 (2H, d-d, J=6,5 och 12,5 Hz), 12 4,56 (ln, m), 4,99 (za, S), 6,3 (2H, bred), 7,23 (sn, S).

Analys: Beräknat för cl6H18N2o7= c 54,85 H 5,10' N 8,00% runner: g 9 c 54,79 H 5,21 -N9s,14 ' ' 2 54,70 5,20 -8,12% 1. srw. Anderson et al., J. Am. cnem¿ soc., gg, 1839 (1964).

Exemäel 3 Framställning av N-(bensyloxikarbonyloxi)succinimid N-hydroxisuccinimidl (23 g; 0,2 mol) upnlöstes i en blandning' av 9 g (O,22 mol) natriumhydroxid i 200 ml vatten. Till den _ omrörda lösningen sattes droppvis 34ag (0,2 mol) karbobensoxi- klorid under Vattenkylning och därefter omrördes,blandningena -vid rumstemperatur över natten för avskiljande av karboben- soxiderivatet, som tillvaratogs genom filtrering, tvättadesn ".med_vatten och lufttorkades. Utbyte 41,1 g (82%). Omkristal- lisation ur bensen-nFhexan (l0:l) gav färglösa prismor med en smältpunkt av 78-790.' i 7 ' all G.W. Anderson et al@, J. Am; Chem. Soc., §§, 1839 (1964)., Exemgel 4 Framställning av 6'-karbobensoxikanamycin A En lösning av 42,5 g (90 mmol) kanamycin A i form av den fria ebasen i 450 ml vatten och 500 ml dimetylformamid (DMF) kyl- des till en temperatur av under Oo och omrördes kraftigt. 7 Till lösningen sattes droppvis under en tidsperiod av ca 2 timmar en lösning av 22,4 g (90 mmol) N-(bensyloxikarbonyloxi)- succinimid i 500 ml. DMF; Blandningen omrördes vid en tempera- tur av från -100 till Oo över natten och därefter vid rumstem- peratur under l dag. Reaktionsblandningen indunstades under reducerat tryck och vid en temperatur under ca 500- Den oljiga 74Û1659"2 13 återstoden upplöstes i en blandning av 500 ml vatten och 500 ml butanol och blandningen filtrerades för avlägsnande av olösligt material och separerades i två skikt. Butanol- och vattenskikten behandlades med butanolmättat vatten (500 ml x 2) respektive vattenmättad butanol (500 ml x 2) under använd- ning av en teknik, som liknar motströmsfördelningstekniken.

De tre vattenskikten kombinerades och indunstades till torr- het under reducerat tryck, varvid man erhöll en oljig åter- stod, varav en del kristalliserade vid rumstemperatur. Till återstoden inklusive kristallerna sattes ca 100 ml metanol, som upplöste oljan och separerade den från kristallerna. Ef- ter tillsats av ca 300 ml etanol förvarades blandningen vid rumstemperatur över natten för erhållande av en kristallin massa, som tillvaratogs genom filtrering. Den vägde 44 g.

Frodukten innehöll en liten mängd kanamycin A, vilket kunde påvisas genom tunnskiktskromatografi under användning av n-propanol-pyridin-ättiksyra-vatten (l5:l0:3:l2) såsom lös- ningsmedelssystem och ninhydrin såsom sprayreagens.

Den råa produkten upplöstes i 300 ml vatten och kromatografe- rades på en kolonn (30 mm diameter) av CG-50 jonbytarharts (NH4+-typ, 500 ml). Kolonnen eluerades med 0,1 N ammonium- hydroxidlösning och eluatet tillvaratogs i 10 ml fraktioner.

Den önskade produkten erhölls i rören 10-100, medan kanamycin A utvanns ur senare fraktioner och positionsisomeren (isome- rerna) av produkten syntes vara närvarande i de tidigare frak- tionerna. Fraktionerna 10-ll0 tillvaratogs och indunstades till torrhet under reducerat tryck, varvid man erhöll 24,6 g (45%) av den färglösa produkten 6-karbobensoxikanamycin A (II) [E'-Cbz-kanamycin AI, som började smälta och färgas vid 204° och sönderdelades vid 2l2° under gasutveckling; Zïifn = +l06° (c=2 H20). ' Tunnskiktskromatografi (silikagel F254; ninhydrin); 1u016s9+2 14 40 Rf-värde Lösningsmedelssystem 'g 6'-Cbz-kanamycin A Kanamycin A n-Pron-pyriain-AcoH-Hzo 0,42 0,33 0,15 0,04 (15:l0:3:l2) huvud- mindre andel 0 0 _ mängd Aceton-AaoH-Hzo i 0 , 24 0 , 14 (2_0=_a=74) g cnclfmeon-:LNH 4021-1020 i ' 0,76 0,50' (l:4:2:l) ' AcoMe-n-ProH-acnqn oH _ i i 0,22* i 0,04* (45:l05:60) K Påvisades med antron-svavelsyra.

Slutprodukten visade sig ledsagas av två mindre.komponenter vid ett-av de för tunnskiktskromatografi använda lösningsmef delssystemen. Slutprodukten användes emellertid utan vtterli- gare rening för framställning av förening BB-K8 (I).

Exemgel 5 *Framställning av L*(-%-X-amino-OC-hydroxismörsyra utgående från ambutyrosin A eller B eller blandningar därav.

Ambutyrosin A (5,0 9) (amerikanska patentet 3 541 078) åter- loppskokades med 160 ml 0,5 N natriumhydroxid under l timme. ldfiydrolysatet neutraliserades med 6N HCl och kromatograferades på en kolonn av CG-50 (NH4+-typ). Den önskade L-(-%-K-amino- UC-hydroxismörsyran isolerades genom eluering av kolonnen med vatten och avlägsnande av vattnet genom frystorkning. L-(-)- 3'-amino-OC-hydroxismörsyra_karakteriserades såsom ett kris- tallint material med en-smältpunkt av 212,5-214,50 (se den amerikanska patentskriften 3 541 078, spalt 2, raderna 3lf38).0 740166942 15 Exemgel 6 Framställning av L-(-)-X~amino-(X-hydroxismörsyra utgående från.DL-CC-hydroxi-)(-ftalimidosmörsyra A) Dehydroabietylammonium-L-Cß-hydroxi-få-ftalimidobutyrat: Till en lösning av 25 g (0,1 mol) 2-hydroxi-X-ftalimidosmör- syral i 200 ml etanol sattes en lösning av 29 g (0,1 mol) dehydroabietylamin i 130 ml etanol. Lösningen skakades kraf- tigt under l minut och fick stå vid rumstemperatur under 5 timmar, varvid fina nålar utkristalliserade. Kristallerna tillvaratogs genom filtrering, tvättades med 50 ml etanol och lufttorkades för erhållande av 30,1 g (56%) av en diastereo- mer av dehydroabietylaminsaltet. Smp. 93-940. [ïx_72â +i5° (c. 2,5, Me0H). Omkristallisation ur 300 ml etanol gav 23,2 g (43%) av den rena produkten. Smp. 94-950. ¿R1]š4 +l0,8° (c. 2,5, Me0H). Ytterligare omkristallisation förändrade icke smältpunkten eller den optiska vridningen.

Analys: Beräknat för C32H42N2O5'H20: C 69,54 >H 8,02 N 5,07% nunnan ' c 69,58 n 8,08 N 5,07% 1. Y. Saito et al., Tetrahedron Letters, 1970, 4863.

B) L- (-) - X -amino-OC -hydroxismörsyraz Till en lösning av 1,5 g (0,0l4 mol) natriumkarbonat i 40 ml vatten sattes 5,3 g (0,0l mol) dehydroabietylammonium-L-(X- hydroxi-X-ftalimidobutyrat och 60 ml eter. Blandningen skaka- des kraftigt till dess allt fast material hade upplösts. Eter- skiktet avskildes. Vattenlösningen tvättades 2 gånger med 20 ml portioner av eter och indunstades till 15 ml under redu- cerat tryck. Till koncentratet sattes 10 ml koncentrerad klor- vätesyra och blandningen återloppskokades under 10 timmar.

Efter kylning avlägsnades utfälld ftalsyra genom filtrering.

Filtratet indunstades under reducerat tryck. Återstoden upp- 7401669-2 l6 löstes i 10 ml vatten och lösningen indunstades till torr- het. Denna operation upprepades tvâ gånger för avlägsnande av överskottet klorvätesyra. Den återstående sirapsliknande produkten upplöstes i l0_ml vatten och filtrerades för av- lägsnande av en liten mängd olöslig ftalsyra, Filtratet ab- sorberades på en kolonnn av IR-120 (H+, 1 cm xf35 cm) och "kolonnen tvättades med 300 ml vatten och eluerades med l N ammoniumhvdroxidlösning. Eluatet tillvaratogs i l5 ml frak- tioner. De ninhydrinpositiva fraktionerna 10-16 kombinerades och indunstades under reducerat tryck, varvid man erhöll en sirapsliknande produkt, som gradvis kristalliserade. Kristal- lerna triturerades med etanol, filtrerades och torkades i en vakuumeksickator för erhållande av 0,78 g (66%) L-(-)-3'- aminø-«z-hyarøxismörsyra. smp. 206-2o7°. ¿t¿7š4 -z9° (C 2,s,- H¿O). IR-spektrumet var identiskt med ett autentiskt prov, som erhölls utgående från ambutyrosin. a Exemgel 7 _Framställning av 6'-karbobensoxi-1,3,3'*tri-p-nitrobensal- kanamycin A ¶III) 6'-karbobensoxikanamycin A (9,0 g; 14,5 mmol) suspenderades i 500 ml absolut etanol vid 240 och.8;7945 g (58,2 mmol) p-nitrobensaldehyd tillsattes. Élandningen upphettades till återflöde. Därvid förvandlades blandningen till en klar, gul lösning men vid återflödeskokning började ett vitt, fast ma- terial snabbt att bildas. Blandningen unphettades under åter- flödestemperatur under 3 timmar och kyldes därefter och pro- dukten tillvaratogs genom filtrering och tvättades med en liten mängd absolut etanol. Utbytet var 14,0 g (94,5%) av ett vitt, kristallint fast material med smältpunkten 233-2340 (okorrigerat), vilket material utgjorde den i rubriken angiv- na föreningen (III).

Ana1ys= Beräknat för c47H5lN7ol9= c 55,46 en s,os N 9,63% » runner: ' c 55,39' H 5,08 “N 9,60% 7401669-2 17 Exempel 8 Framställning av l-¿I-(-)- X-amino-ci-hydroxibutyryl]-kana- mvcin A (IV) 6'-karbobensoxi-1,3,3'=tri-p-nitrobensalkanamycin A (5,0 g; 4,91 mmol) upplöstes i 50 ml dimetylformamid (DMF) vid 240.

L-(-)-fä-bensyloxikarbonylamino-06-hydroxismörsyra-N-hydroxi- succinimidester (2,064 g; 5,895 mmol) upplöstes i 20 ml DMF vid 240 och sattes långsamt under kraftig omröring till lös- ningen av den Schiffska basen (III) under 75 minuter. Lös- ningen omrördes vid 240 över natten. Genom att använda ång- strålevakuum vakuumtorkades lösningen vid ca 400. Den behand- lades därefter upprepade gånger med metanol (100 ml) för er- hållande av en viskös olja. Oljan upplöstes i 100 ml av en blandning av dioxan och vatten (l:l) och 10 ml isättika till- sattes. Lösningen infördes i en 500 ml Parr-flaska jämte 2,5 g 5%-ig Pd/C (Engelhard) och reducerades vid 45 psi H2 under 4 timmar vid 240. Det totala tryckfallet under denna tid (sluten flaska) var 87 psi innefattande periodiska trycksteg- ringar. Blandningen filtrerades genom en kudde av diatomace= jord, som därefter tvättades med 3 x 50 ml av en 50%-ig vat- tenlösning av dioxan. De kombinerade filtraten torkades genom avdrivning under azeotropbildning med n-butanol (100 m1) och torkades slutligen upprepade gånger genom avdrivning med meta- nol, varvidman erhöll en viskös olja. Denna upplöstes i 30 ml metanol och hällaes långsamt i 1ooo m1 kan eter under kraftig omröring. Efter omröring av den erhållna _ suspensionen under en halv timme i isbad tillvaratogs preci- pitatet genom filtrering och torkades omedelbart i en vakuum- exsickator över P2O5. Produktblandningen vägde 4,962O g. Tunn- skiktskromatografi visade att den i huvudsak utgjordes av förening IV, kanamycin A och spår av di- och trisubstituerat kanamycin A och även 4-amino-2-hydroxismörsyra.

De olika fraktionerna separerades under användning av en 40 x 100 mm glaskolonn, som var fylld med Amberlite G9 (varunamn 5 Funnet: 7401669-2,2. 18 för jonbytarhartser tillverkade av Rohm & Haas Co. Se The Condensed Chemical Dictionary, 8:e uppl., Van Nostrand Reinnold Company, s. 39) IRC-40 (NH4+-form, typ I, 100/200 mesh) för erhållande av en hartsbädd med en höjd av ca 980 mm. Kolonnen försattes med 4,600 g av den orena blandningen, upplöst i 15 ml vatten. Kolonnen eluerades genom gradientelu- ering från H20-till 2 N NH4OH, varvid eluatet tillvaratogs i '15 ml fraktioner. 295 fraktioner tillvaratogs och därefter tvättades kolonnen med 1,5 l 3 N NH4OH; Fraktionerna uppsam- lades på basis av optisk vridning och det fasta materialet isolerades därur genom lyofilisering.

Korrigering till vikten Fraktion Före- Vikt i av hela râma- 5 Bioakti- % -'nr ning ' 2 gram terialet, gram vitet » futbyte 120-150 _ kana A 1,1ss4Ü 11,257 ' B09 542,6 201-224 _ BB-K29“*“ 0,40 0,43 - 228-241 BB-Ks 0,652: o,7036 vseïloi* 19,2¥“ X Genomsnitt av 4 plattanalyser f standardavvikelse. x¥Öm.hänsyn tas till återvunnet kana A, blir omvandl. till' BB*K8 (IV) 33,5%. - xä33-N5/1-(-)-X-amino-cfiehydroxibutyrylfkanamycin A. via dessa försök var förhållandet BB-Ka/kana A 0,45.

Den vid detta förfarande utvunna föreningen IV var identisk med den antentiska produkt, som erhölls genom den metod, som beskrivs i den amerikanska patentskriften 3 781 268. Smp. 194? (sönd.) ¿Bç7šle+85°,(c=2; H20). Relativ potens gentemot' B. subtilis (agarplatta)=960Apg/mg (standard: kanamycin A fri bas). 2 Analys Beräknat för C22H43N50l3~2H2C03: C 40,62 H 6,68 N 9,87% C 40,21, 39,79 VH 6,96, H 6,87 N 9,37, 9,49% 1401669-2 19 Exempel 9 Framställning av monosulfatsaltet av l-[L-(-)- X-amino-d- hydroxibutyryl7kanamycin A 1 mol l-[L-(-)- X-amino-d -hydroxibutyryUkanamycin A upp- löstes-i l-3 liter vatten. Lösningen filtrerades för avlägs- nande av eventuellt olöst fast material. Till den kylda om- rörda lösningen sattes l mol svavelsyra, upplöst i 500 ml ; vatten. Blandningen omrördes under 30 minuter, varefter kall etanol sattes till blandningen till dess utfällning skedde.

Det fasta materialet tillvaratogs genom filtrering och visa- de sig vara det önskade monosulfatsaltet.

Exempel 10 Framställning av disulfatsaltet av l-[ï-(-)-}¶-amino-oC- hydroxibutyryl7kanamycin A (BB-K8.2H2S0,) 35 g' l-jfL-(fl- K-amino-OC-hydroxibutyryljkanamycin A (såsom monobikarbonattrihydratet)i upplöstes i 125 ml avjoniserat vatten. Ett pH-värde av ca 9,0 kunde konstateras. pH-värdet sänktes till 7-7,5 med 50%-ig svavelsyra. 8,5 g Darco G-60 (varunamn för aktivt träkol tillverkat av Atlas Company Industries Inc. Se The Condensed Chemical Dictionary 8:e uppl, Van Nostrand Reinhold Company, s. 260) g tillsattes och blandningen uppslammades vid omgivande rums- temperatur under 0,5 timmar. Kolet avlägsnades genom lämplig filtrering och tvättades med 40 ml vatten. Vattentvättvätskan sattes till filtratet.

Den kombinerade blandningen av filtrat och tvättvätska inställ- des på pH 2-2,6 med 50%~ig svavelsyra. En stor mängd koldioxid utvecklades. Lösningen fick stå i vakuum under omröring under 20 minuter för avdrivande av ytterligare koldioxid. 8,5 g Darco G-60 sattes till den avgasade lösningen. Bland- ,?4o1669-2 20 ningen uppslammades under 0,5 timmar vid rumstemperatur.

Kolet avlägsnades genom lämplig filtrering och tvättades med 35 ml avjonïserat vatten. Vattnet sattes till filtratet.

Den kombinerade blandningen av filtrat och tvättvätska in- ställdes på pH l-1,3 med 50%-ig svavelsyra. Denna lösning sattes under snabb omröring en tid av 10 minuter till 600- 800 ml metanol (3-4 volymer metanol). Blandningen omrördes § under 5 minuter vid pH l-1,3 och_fick därefter passera genom en 100 mesh sikt, omrördes under 2 minuter och fick stå under 5 minuter. Det mesta av den överliggande vätskan dekan- terades. Den återstâende uppslamningen filtrerades på lämp- ligt sätt, tvättades med 200 ml metanol och vakuumtorkades 2 vid 50° under 24_t.Utbytet av amorf UB-K8, (divätesulfat)g var 32-34 g; ¿z¿7š2 a2o= +14,7s; söndefdelninq vid 220-zsöc.

Elementaranalys (på torr basisx) Funnet Beräknat % C 32,7, 33,5, 32,3 33,5 % N -s,7s,,s,7, a,2, 8,8 3 3 8,973 % S 8,75, 8,9,-7,8, 8,85 . 8,2 % askan noll '~o - 2 H- dig Karl Fisher-vattenhalt: 2,33, 1,79, 2,87% (beräknat värde för monohydrat är 2,25% vatten).

*Detta salt är hygroskopiskt men flyter icke ut. Efter lagring av en alikvot i luft vid rumstemperatur under 18 timmar ökade 2 vattenhalten till 9,55, 9,89% (beräknat värde för pentahydrat är 1o,s3% vatten). ' ~ ' Exemgel ll -Framställning av l-ÅI-(-)àïfïamino-oi-hydroxibutyryl7kana- mycin A (BB-K8) utgående från 6'- N-karbobensoxifl,3,3"- tribensal-kanamycin A (dvs. tri (Schiffs bensaldehyd-bas). 74Û1669"2 21 4,0 g (4,53l mmol) 6'-N-karbobensoxi-1,3,3"-tribensal-kana- mycin A upplöstes i 50 ml dimetylformamid under omröring vid 24°. En lösning av 1,43 g (4,072 mmol) L-(-)-¶1bensyloxikar- bonylamino-CZ-hydroxismörsyra-N-hydroxisuccinimidester i 15 ml DMF tillsattes droppvis under en tidsperiod av 30 minuter.

Omröringen fortsattes 16 timmar vid 240, varefter reaktions- lösningen späddes med en lika stor volym vatten och induns- taaes i vakuum (4o°) till en »fiskas olja. Denna återuppiöstes i 100 ml av en 50%-ig vattenlösning av dioxan plus 10 ml is- ättika och hydrerades därefter med 1,0 g 5% palladium på kol under 3 timmar. Efter avlägsnandet av katalysatorn koncentre- rades lösningen i vakuum (450) till en återstod, som därefter återupplöstes i 75 ml metylalkohol och utfälldes ur 1000 ml etyleter för erhållande efter filtrering av ett fast material, som efter fullständig torkning i en vakuumexsickator över PZOS gav 3,67 g fast material.

Tunnskiktskromatografianalys utfördes på silikagelplattor under användning av systemet CHCl3/CH30H/NH4OH/H20 i förhål- landet l:4:2:1 och bioautografanalys utfördes med B. subtilis på agarplattor med pH 8.

Differentialbioanalysdata för ovannämnda fasta material med avseen- de på B. subtilis och E. coli antydde att det fasta materia- let innehöll 33,9l% oreagerat kanamycin A och l5,89% av före- ningen BB-K8.

Exemgel 12 Framställning av 1-11-(-)-B'-amino-O¿-hydroxibutyry17kana- mycin A (BB-K8) utgående från 6'-N-karbobensoxi-l,3,3"-tri- (Schiffs pivalaldehydbas)-kanamycin A 0,5 g (0,5468 mmol) 6'~N-karbobensoxi-1,3,3"-tri(Schiffs pival- aldehydbas)-kanamycin A upplöstes i 10 ml tetrahydrofuran och 1,0 ml vid 24°. En lösning av 0,2299 g (0,6562 mmol) L-(-)-¶f- bensyloxikarbonylamino-Cl-hydroxismörsyra-N-hydroxisuccinimid- ester i 3,0 ml THF tillsattes under ca 1 minut under omröring -vuo1s69-2 n. 2:2 vid 240. Efter 16 timmar indunstades lösningen till torrhet i vakuum (400) och den på-så sätt erhållna återstoden åter-* . upplöstes i 50 ml av en 50%-ig vattenlösning av dioxan inne- hållande 2,0 ml isättika. Blandningen behandlades med 100 mg av en katalysator av 5% palladium på träkol och-hydrerades 2 timmar vid 230. Efter filtrering för avlägsnande av kata- lysatorn koncentrerades lösningen i vakuum (45°) till en ~âterstod, som återupplöstes i 10 ml metylalkohol och utfäll- des ur 500 ml etyleter för erhållande efter filtrering av ett fast material, som torkades fullständigt i en vakuum- f exsickator över P2O5 för erhållande av 0,490 g fast material.

Analys skedde såsom i enempel ll, dvs. medelst tunnskikts- kromatografi, bioautografi och differentialbioanalysdata. Sist- nämnda analys antydde en 9,64% omvandling till föreningen HBBFKB och 27,38% oreagerat kanamycin A.

Exemgel 13 Framställning av l-Å1-(-)-ñ”-amino-0¿-hydroxibutyryl7kana- mycin A (BB-K8) utgående från 6'4N4karbobensoxi-lf3,3"- tri- (Schiffs p-metoxibensalbas)-kanamycin A 0 0 0,5 g (0,5l39 mmol) 6'-N-karbobensoxi-l,3,3"-tri(p-metoxi- bensal)-kanamycin A upplöstes i en blandning av 20 ml tetra-_ hydrofuran och 2,0 ml vatten vid 240. En lösning av 0,216 g (0,6l67 mmol) L-(-)-jfebensyloxikarbonylamino-flß-hydroxismör- syra-N-hydroxisuccinimidester i 6,0 ml THE tillsattes lång- samt under omröring vid 240 under ca l minuter. Efter omrö- ring vid 240 under 16 timmar koncentrerades lösningen i vakuum (40°l till en återstod, som återupplöstes i 50 ml av en 50%f ig vattenlösning av dioxan innehållande 2,0 ml isättika. 100 mg av en katalysator av 5% palladium på träkol tillsattes och hydrering_utfördes vid 240 under 2 timmar. Blandningen dfiltrerades för avlägsnande av katalysatorn och koncentrera- des i vakuum (45°) till en återstod. Återstoden återupplöstese i 10, m1 metgyialkohoi och fast material utfallaes-mea soo m1 7l+01669-2 23 _ etyleter vid 240. Efter fullständig torkning i en vakuum- exsickator över P2O5 erhölls 0,440? g fast material.

Analys utfördes såsom i exempel ll, nämligen medelst tunn- skiktskromatografi, bioautografi och differentiell bioanalys.

Sistnämnda analysmetod visade 23,89% oreagerat kanamycin A och en l7,43%-ig omvandling till föreningen BB-K8.

TEKNISKT FRAMSTEG JÄMFÖRT MED TEKNIKENS STÅNDPUNKT Föreliggande uppfinning avser ett förhättrat förfarande för framställning av ett känt derivat av föreningen kanamycin A, nämligen föreningen l-[IÉ- (-) - X -amino- d -hydroxibutyrylf-ka- namycin A, som i föreliggande sammanhang benämns BB-K8. Den- na förening är känd genom svenska patentet 72.092ll-7 och upp- visar en utmärkt antihakteriell aktivitet, som har visat sig vara överlägsen aktiviteten av moderföreningen kanamycin A.

Moderföreningen kanamycin A uppvisar fyra primära aminfunk- tioner i molekyiens 1-, 3-, er- och sfistäilningar. Det har visat sig att 6'-aminfunktionen är den reaktivaste och att 1- -aminfunktionen kommer därnäst när det gäller reaktivitet vid behandling med ett elektrofilt medel. Det är därför känt genom svenska patentet 72.092ll-7 att för framställning av förening- en BB-K8 först blockera aminogruppen i 6'-ställningen av ka- namycin A, t.ex. genom selektiv acylering med N-(bensyloxi- karbonyloxi)-succinimid, därefter införa den önskade L-(~)~X- .~amino-(2-hydroxibutyrylgruppen i 1-ställning och slutligen avlägsna den aminoskyddande gruppen i 6'-ställningen för fram- ställningen av det önskade derivatet.

Förfarandet enligt föreliggande uppfinning för framställning av den kända föreningen BB-K8 innebär även att man först se- lektivt acylerar 6'-aminofunktionen i kanamycin A på i och för sig känt sätt med N-(bensyloxikarbonyloxi)-succinimid för fram- ställning av föreningen med den i kravet 1 angivna formeln II, inför L-(-)-K-amino-d-hydroxibutyrylgruppen i den önskade 1- 7401669-2 24 -ställningen och slutligen avlägsnar blockerinqsgrupperna.

Föreliggande uppfinning baserar sig på den upptäckten, att ehuru både 3- och 3"-ställningarna i kanamycin A är mindre reaktiva än 1- eller 6'-aminofunktionerna, de ändock reage- rar under bildning av icke önskvärda acylerade produkter i lågt utbyte vid det genom svenska patentet 72.092ll-7 kända förfarandet. I enlighet med föreliggande uppfinning åstad- kommer man ett förbättrat förfarande för selektiv acylering- av l-aminfunktionen i kanamycin A och detta förfarande utmärks av de i huvudkravet angivna särdragen under A) och B).

Vi hänvisar nu till exempel 8 i föreliggande patent ooh när- mare bestämt till tabellen i detta exempel; Såsom framgâr.av å.den tabellen erhålls föreningen BB-K8 vid utnyttjandet av för- farandet enligt uppfinningen i ett utbyte av 19,2 % och med en relativ potens av 960 pg/mg (detta representerar en ren- het av 96%).

Vi hänvisar även till exempel 4 i svenska patentet 72.092ll-7, av vilket framgår att föreningen BB-K8 vid det kända förfa- randet erhålls i en mängd av 552 mg (representerande ett ut- byte av 22%). Emellertid hade den enligt exempel Ä erhållna produkten en relativ potens av endast 560 ng/mg, vilket mot- svarar en renhet av endast 56%. Enligt exempel 4 renades den- na produkt därefter, varvid man erhöll 98 mg av en produkt 7 med en relativ potens av 960 P9/mg (96% renhet). Enkel mate- _ matik ger vid handen att, eftersom 552 mg representerar ett utbyte av 22%, 98 mg måste representera ett utbyte av endast 3,85%.

Slutsatsen blir således att man vid det kända förfarandet en- ligt svenska patentet 72.092ll-7 erhåller föreningen BB-K8 i en renhet av 96% men endast i ett utbyte av 3,85% medan man vid förfarandet enligt uppfinningen erhåller samma förening fortfarande i en renhet av 96% men i ett väsentligt stegrat utbyte av 22%, vilket innebär en 5-6-faldig utbytesstegring.

Claims (4)

1. 25 7k01669~2 Patentkrav l. Förfarande för framställning av l-[L-(-)-2f-amino-a- -hydroxibutyry17-kanamycin A med formeln CH NH2 ' N Ü4'f "å$}jU“,ï1'*-«R¶v'“ R, -J. 2 "_'{;¿»'Lr , ~'"~» “ -o r=W f . _' . ._ ' ¿.. .'.' ~ '|'|'4_w- genpm att man selektivt acylerar 6'-aminofunktionen i kanamycin A på 1 och för sig känt sätt med N~(bensyloxikarbonyloxi)-succinimid för framställning av föreningen med formeln ~ H nä _ I I _ . Ho ._ ca2-N-c-9-GH2'°<.“s ' .' ' 7401669-2 26 ?- inför L-(-)-3»-amina-«-hyarøxibueyryigruppen 1 ae&=önskaae 1-e:ë11- -ningen och avlägsnar blockeríngsgrupperna, k ä n n e t e c k n a t därav, att man e _ A) behandlar en mol av-förening II med 5-6 mol av en aldehyd, som utgöres-av 4-nitrobensaldehyd, bensaldehyd, 4-metoxibensaldehyd eller pivaldehyd, i en (lägre)alkanol, som utgöres av absolut etan- iol, metanol, n-propanol, ieopropanol, n-butanol, sek.-butanol, tert.-butanol eller blandningar därav, vid en temperatur av.från 50°0 till ungefär systemets återflödestemperatur under 2-10 timmar för framställning av en förening med formeln fceflsfs cflz-N- ao-eg: vari Z utgör en grupp med formeln _N¿â_<::>_h°2'.,N.ç-<::> , ' -'-' ' - - CH -- _ -' H _ H | 3- ' ' . . han-Q-<:;>.0cH3 eller fN¶C-?-C83; I ooh f f." .íï'aeÜ ; ' . CH3 ' 7 ti! I B) behandlar en mol av förening III med 1-1,5 mol L-(-)-2f- -bensyloxikarbonylamino-a-hydroxismörsyra-N-hydrbxisuccinimidester i ett lösningsmedel, som utgöres av dimetylformamid, tetrahydrofuran, dimetylacetamid, propylenglykoldímetyleter, etylenglykoldimetyl- eter eller dioxan,vid en temperatur av från ca l0°G till ca 35°C, 'n därefter avlägsnar-lösningemedlet i vakuum och hydrerar återstoden in situ med väte i närvaro av en metallkatalyeator, som utgöres av palladium, platina, rodium, Raney-nickel, rutenium eller nickel, i I F e@ n KQR Qëwfiïßrïlfy 7401669-2 27 ett system, som utgöres av vatten och ett med vatten blandbart lös- ningsmedel och som består av vatten och dioxan, tetrahydrofuran, etylenglykoldimetyleter eller propylenglykoldimetyleter, i närvaro av en katalytisk mängd isättika för framställning av förening IV. '

2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att man acylerar en mol kanamycin A med ca en mol N-(bensyloxikarbo- nyloxi)succinimid i ett lösningsmedel,som utgöres av dimetylformamid, dimetylacetamid, tetrahydrofuran, dioxan, l,2-dimetoxietan, metanol, etanol, vatten, aceton, pyridin, en N-(lägre)alky1piperidin eller blandningar därav, vid en temperatur under 25°G för framställning av ' förening II.

3. Förfarande enligt krav l och 2, k ä n n e t e c k n a t därav, att man i tur och ordning ' ' A A) acylerar en mol kanamycin A med ca en mol N-(bensyloxikar- bonyloxi)succinimid i dimetylformamid vid en temperatur av från ca -20°G till ca lO°C för framställning av förening II, B) behandlar en mol av förening II med 3,5-4,5 mol p-nitro- bensaldehyd eller bensaldehyd i absolut etanol, metanol, n-propanol eller isopropanol vid ungefär återflödestemperatur'under en tidsperiod av 2-4 timmar för framställning av förening III, vari Z är en grupp med formeln ' l \ ~ ll Q 01161' IINIIC I' OCh C) behandlar en mol av förening III med från ca l,l till ca 1,3 mol L-(-)-Qy-bensyloxikarbonylamino-a-hydroxismörsyra-N-hydroxi- succinimideeter i dimetylformamid vid ungefär rumstemperatur under minst 5 timmar, därefter avlägsnar lösningsmedlet i vakuum och hydre- rar återstoden in situ med väte i närvaro av palladium på träkol i en 1:1-blandning av dioxan och vatten i närvaro av en katalytisk mängd isättika för framställning av förening IV. >

4. Förfarande enligt krav l och 2, k ä n n e t e c k n a t därav, att man i tur och ordning A) acylerar en mol kanamycin A med ca en mol N-(bensyloxikar- bonyloxi)-succinimid i dimetylformamid vid en temperatur av från ca -2000 till ca lO°C för framställning av förening II, B) behandlar en mol av förening II med ca 4 mol p-nitrobens- aldehyd i absolut etanol vid ungefär âterflödestemperatur under en tid av ca 2-4 timmar för framställning av förening III, vari Z utgör en grupp med formeln 140166942 28 _) -N-.q-Q-Noz-í f' _.°,°h G) behandlar en mol av förening; III med ca 1,2 mol L-(-)-4 -y -ben syloxikarbonylamino-a -hydróxi smörsyra-N-hydroxisucc iními de é- ter i -dimetylformamid vid ungefär rumstemperatur under minst 5 tim- mar, därefter avlä gntar lösningsmedlet i vakuum och hydrerar åter- stoden in tsitu med väte i närvaro av palladium pà träkel i en 1:1- -blandninge av dioxanz och vatten i närvaro av en katalytisk mängd is- ättika för* framställning av förening IV. t t t . ANFÖRDA PUBLIKATIONER: *Sverige putentonsökan _9 211/72 7 U5 3_ 647 779 ~ ' 7