Kanamycin A ist ein Antibiotikum, welches in Merck Index, 8th Edition, Seiten 597-598 beschrieben ist. Es hat die Formel
EMI1.1
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Abkömmlings des Kanamycins A, nämlich des 1-[L-(-)-y-Amino-a-hydroxybutyryl]-kanamycins A der nachfolgenden Formel
EMI1.2
Kanamycin A besitzt vier primäre Aminogruppen, welche an die 1-, 3-, 6'- und 3"-Stellung des Moleküls gebunden sind. Es hat sich erwiesen, dass die Aminogruppe in der 6' Stellung die am meisten reaktionsfähige und dass die Aminogruppe in 1-Stellung die zweitreaktionswillige ist, wenn die Substanz mit einem elektrophilen Agens behandelt wird. Die beiden Aminogruppen in 3- und 3"-Stellung sind dagegen weniger reaktionsfähig als diejenigen in 1- oder 6'-Stellung.
Indessen reagieren sie bei der Acylierung gleichwohl unter Bildung geringer Anteile unerwünschter Acylierungsprodukte.
Demgemäss setzte sich die vorliegende Erfindung zum Ziel, ein befriedigenderes Herstellungsverfahren zu schaffen, als dies zuvor ausgearbeitet wurde und beschrieben worden ist im US-Patent Nr. 3 781 268, wobei dieses Verfahren in selektiverer Weise darauf gerichtet ist, die Aminogruppe in 1 -Stel- lung zu acylieren als die anderen Aminogruppen im Molekül.
Dieses Ziel wurde erreicht durch das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung der Verbindung mit der Formel
EMI2.1
wobei dieses Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass Kanamycin A in Lösung bei einer Temperatur unter 50 C acyliert wird mit N-(Benzyloxycarbonyloxy)-succinimid im Molverhältnis 1 zu höchstens 1 zur Verbindung der Formel
EMI2.2
worauf die so erhaltene Verbindung II mit einem mindestens dreifach-molaren Anteil 4-Nitrobenzaldehyd, Benzaldehyd, 4-Methoxybenzaldehyd oder Pivaldehyd in einem Niederalkanol während mindestens 2 Stunden umgesetzt wird zu einer Verbindung der Formel
EMI3.1
worin Z
EMI3.2
bedeutet,
wonach die erhaltene Verbindung III mit mindestens einem molaren Anteil L-( )-y-Benzyloxycarbonylamino-a- hydroxybuttersäure-N-hydroxysuccinimidester in einem organischen Lösungsmittel bei einer Temperatur zwischen 0 und 50 C umgesetzt, anschliessend das Lösungsmittel abgetrennt und der Rückstand in einem aus Wasser und einem wasserlöslichen organischen Lösungsmittel bestehenden Gemisch hydriert wird zur Verbindung IV.
Die Acylierung in der ersten Stufe des Verfahrens wird vorzugsweise mit ungefähr einem Mol N-(Benzyloxycarbonyloxy)-succinimid, vorzugsweise in einem Lösungsmittel wie Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Tetrahydrofuran, Dioxan, 1,2-Dimethoxyäthan, Methanol, Äthanol, Wasser, Aceton, Pyridin oder einem N-(Nieder)-alkylpiperidin bzw.
Gemische dieser Solventien, jedoch besonders bevorzugt in Dimethylformamid bei einer bevorzugten Temperatur unterhalb von 25" C vorgenommen. Als Niederalkanol arbeitet man in der zweiten Stufe vorzugsweise in absolutem Äthanol, Methanol, n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol, sek.-Butanol, tert.-Butanol oder Gemischen dieser Solventien bei ungefähr Rückflusstemperatur und während einer Reaktionsdauer von 2 bis 5 Stunden.
In Stufe 3 des Verfahrens arbeitet man vorzugsweise in einem Verhältnis von etwa 1 bis 2 Mol des Esters pro Mol der Verbindung III und insbesondere in einem Molverhältnis von 1,0 bis 1,3 zu 1, verwendet als Lösungsmittel vorzugsweise Dimethylformamid, Tetrahydrofuran, Dimethylacetamid, Propylenglykol, Dimethyläther, Äthylenglykol, Dimethyläther oder Dioxan, jedoch besonders bevorzugt Dimethylformamid, vorzugsweise bei Zimmertemperatur, wobei im allgemeinen eine Reaktionsdauer von mindestens 5 Stunden erforderlich ist. Die anschliessende Hydrierung wird vorzugsweise mit Wasserstoff in Gegenwart eines Metallkatalysators, vorzugsweise Palladium, Platin, Raneynickel, Rhodium, Ruthenium oder Nickel, jedoch insbesondere Palladium bzw.
Palladium auf Aktivkohle, vorgenommen. Dabei arbeitet man in einem Lösungsmittelgemisch aus Wasser mit einem wasserlöslichen organischen Lösungsmittel, wie Dioxan, Tetrahydrofuran, Äthylenglykol, Dimethyläther, Propylenglykol-dimethyläther oder dergleichen, jedoch vorzugsweise in einem Gemisch von Wasser und Dioxan im Verhältnis 1: 1. Vorzugsweise unternimmt man diesen letzten Verfahrensschritt zur Herstellung der Verbindung der Formel IV in Gegenwart einer katalytisch wirkenden Menge von Eisessig.
Die Verbindung IV, l-[L-(-)-y-Amino-a-hydroxybutyryl]kanamycin A, besitzt hervorragende antibakterielle Wirksamkeit, welche diejenige des Kanamycins A selbst zu übertreffen scheint. Illustrativ hierfür sind die beiden nachstehenden Tabellen, welche die minimalen inhibitorischen Konzentrationen (MIC) von Kanamycin A und der Verbindung IVa (BB-K8) gegenüber einer Vielzahl von grampositiven und gramnegativen Bakterien zeigen, erhalten in Versuchen nach der Agar Verdünnungsmethode von Stear (Tabelle I) und der Zweifach-Verdünnungsmethode (Tabelle II). Ein Agarmedium nach Mueller-Hinton wurde für die Untersuchungen gemäss Tabelle I verwendet und Infusions-Nährlösung nach Heart diente für die Versuche gemäss Tabelle II.
Tabelle I (MIC mg/ml) Organismus Kanamy- Verbin cin A dung IV (6-8198) (BB-K8)
Ansatz
Nr. 4
1. Alk. faecalis A-9423 16 8 2. A A A-20648 > 125 > 125
3. Ent. cloacae A-0656 4 4
4. Ent. species A-20364 > 125 2
5. Ent. hafniae 1 A-20674 1 1
6. E. coli A-0636 2 1
7. E. coli A-20664 16 4
8. E. coli A-20665 > 125 1
9. E. coli A-20507 32 2 10. E. coli A-20520 > 125 4
Tabelle 1 (Fortsetzung) Organismus Kanamy- Verbin cin A dung IV (6-8198) (BB-K8)
Ansatz
Nr. 4 11.E.coliA-20365 > 125 1 12.E.coliA-20684 2 2 13. E. coli A-20682 > 125 2 14. E. coli A-20683 > 125 8 15. E. coli A-20681 > 125 2 16. E. coli A-15119 4 4 17. K. pneumoniae A-0967 4 4 18. K. species A-20328 > 125 2 19. K. species A-20330 32 32 20. K. species A-20634 > 125 4 21. K. pneumoniae A-20680 > 125 4 22. K. pneumoniae A-0077 1 1 23.
Pr. mirabilis A-9900 2 2 24. Pr. morganii A-15153 2 2 25. Pr. vulgaris A-9555 2 1 26. Pr. rettgeri A-9636 0,25 0,25 27. Pr. mirabilis A-20645 4 4 28. Pr. mirabilis A-20454 2 2 29. Providencia stuartii A-20615 2 1 30. Providencia alkalifaciens A-20676 1 1 31. Ps. aeruginosa A-20229 32 2 32. Ps. aeruginosa A-0943A 125 16 33. Ps. aeruginosa A-20653 > 125 32 34. Ps. species A-20601 125, 63 16 35. Ps. species A-20621 > 125 > 125 36. Ps. maltophilia A-20620 32 > 125 37. Sal. enteritidis A-0531 1 0,5 38. Sal. derby A-20087 > 125 1 39. Ser. Marcescens A-20019 2 4 40. Ser. marcescens A-9933 4 8 41. Ser. marcescens A-20460 > 125 4,2 42. Ser. marcescens A-20459 4 16 43. Shig. flexneri A-9684 4 4 44. Aeromonas sp. A-20670 2 2 45. Arizona sp. A-20671 2 1 46. Citrobacter sp. A-20673 4 4 47. Edwardsiella sp. A-20678 4 4 48.
Staph. aureus A-9606 1 1 49. Staph. aureus A-4749 0,5 1 50. Staph. aureus A-9537 2 1 51. Staph. aureus A-20610 > 125 2 52. Staph. aureus A-20240 > 125 8 53. Staph. aureus A-15197 1 2
Müller-Hinton-Medium + 4 % Schafsblut 54. Str. faecalis A-9854 63 63 55. Str. faecalis A-9575 125 > 125 56. Str. pyogenes A-20200 32, 16 32 57. Str. pyogenes A-9604 125 125 58. Str. pyogenes A-15040 125 125 59. Str. pyogenes A-20065 125 125 60. D. pneumoniae A-9585 63, 32 63 61. D. pneumoniae A-20159 125 > 125
Tabelle II (MIC mg/ml) Organismus Kanamy- Verbin cin A dung IV (6-8196) (BB-K8)
Ansatz
Nr. 4
1. D. pneumoniae + 5 % Serum
A-0585 63 63
2. Str. pyrogenes +5% Serum
A-9604 125 125
3. Staph. aureus Smith A-9537 0,5 0,5
4. Staph. aureus A-9497 0,5 0,5
5. Staph. aureus A-20239 125 4
6. Staph. aureus A-20240 125 4
7. Enter.
cloacae A-0656 2 2
8. Enter. species A-20364 125 2
9. K. pneumoniae A-9867 2 4 10. E. coli K-12 ML1410 A-20361 2 4 11. E. coli K-12 ML1630 A-20363 125 2 12. E. coli K-12 A-9632 2 1 13. E. coli A-20664 32 8 14. E. coli A-20665 125 8 15. Pr. mirabilis A-9900 2 16 16. Pr. morganii A-15153 4 16 17. Pr. vulgaris A-9436 1 2 18. Ps. aeruginosa A-20227 4 1 19. Ps.species A-20499 63 4 20. Ps. aeruginosa A-20653 125 4 21. Ps. species A-20621 125 125 22. Ser. marcescens A-20019 2 4 23. Ser. marcescens A-20141 16 16
Die vorstehenden MIC-Daten zeigen, dass die Verbindung IV (BB-K8) dem Kanamycin A in der Wirksamkeit überlegen ist, dies insbesondere gegenüber Organismen, die resistent sind gegen Kanamycin A.
Die MIC-Daten stimmen ferner gut überein mit den Ergebnissen von in vivo-Verfahren für alle drei Organismen, welche mit Kanamycin A und der Verbindung IV getestet werden. Die Verbindung IV und Kanamycin A erwiesen sich gleichfalls wirksam gegenüber der Infektion von Mäusen, verursacht durch Kanamycin A-sensitive Stämme von E. coli A-15119 und Staph. aureus A-9537. Obgleich die CHs0-Werte (Heilungsdosis bei 50% tödlich infizierter Mäuse) gegenüber Staph. aureus A-9537 zeigen, dass die Verbindung IV geringfügig weniger wirksam ist als Kanamycin A, ist dieser geringfügige Unterschied vermutlich nicht signifikant, da die Dosismengen weit auseinander lagen (5fache Verdünnung).
Gegenüber einem kanamycinresistenten Stamm von E. coli A-20520 erwies sich Kanamycin A erwartungsgemäss nicht als sehr wirksam in vivo, wogegen die Verbindung IV eine ausgesprochene Schutzwirkung ausübte. Die Verbindung IVa war ungefähr zehnmal wirksamer gegenüber diesem Stamm von E. coli, wenn sie in 4facher Verabfolgung gegeben wurde anstelle einer zweifachen Verabfolgung.
Tabelle III
Vergleich der In Vivo- und In Vitro-Wirksamkeit von Verbindung IV und Kanamycin A Verbindung Versuch Staphylococcus aureus Escherichia coli Escberichia coli
Nr. A-9537 A-15119 A-20520
MIC" CDsob MIC CD50 MIC CDso VerbindungIV 1 1 2,0 x 2 2 2 x 2 2 66 x 2 2 c - - 5x4 Kanamycin A 1 2 0,5 x 2 4 4 > < x 2 125 200 x 2
2 - - - - - 200 x 4 MIC = minimale inhibitorische Konzentration (vg/ml). Versuchsdurchführung gemäss Chisholm et al.
(Antimicrob. Agents and Chemotherapy - 1969, p. 244, 1970) unter Verwendung von Müller-Hinten
Agar als Testmedium.
CDs0 = Dosis für 50% Heilung (mg/kg x Anzahl der Gaben). Mäuse wurden subcutan 1 und 4 Stunden nach dem
Infekt behandelt, falls zweifache Verabfolgung erfolgte und 0, 2, 4 und 6 Stunden nach dem
Infekt, falls vierfache Verabfolgung erfolgte. Andere Aspekte dieses Testes wurden ausgeführt wie beschrieben von Price et al. (Journal of Antibiotics 22:1, 1969).
= ¯ = nicht geprüft.
Die Verbindung IV ist ein wertvolles antibakterielles Agens, ein Zusatzmittel für Viehfutter und ein therapeutisches Mittel für Federvieh und Säugetiere sowie für den Menschen und erweist sich als insbesondere wertvoll bei der Behandlung infektiöser Erkrankungen, welche durch grampositive und gramnegative Bakterien verursacht sind.
Oral verabreicht, ist die Verbindung IV ein wirksames Mittel für die präoperative Sterilisation der Eingeweide. Sowohl die aerobe als auch die anaerobe Flora sprechen auf die Droge an und werden im Verdauungstrakt reduziert. Begleitet von einer geeigneten mechanischen Reinigung, ist die Droge nützlich zur Vorbereitung der Dickdarmchirurgie.
Die Verbindung IV erweist sich wirksam in der Behandlung bakterieller Infektionen des Menschen bei parenteraler Verabfolgung im Dosierungsbereich von 250 bis 3000 mg pro Tag in unterteilten Dosen 3- bis 4mal pro Tag. In der Regel erweist sich die Substanz wirksam, wenn sie verabfolgt wird in einer Dosierung von ungefähr 5,0 bis 7,5 mg/kg Körpergewicht alle 12 Stunden.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemässen Herstellungsverfahrens der Verbindung IV umfasst die nachfolgenden Verfahrensschritte:
A. Acylierung eines Mols Kanamycin A mit ungefähr einem Mol N-(Benzyloxycarbonyloxy)-succinimid in Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Tetrahydrofuran, Dioxan, 1,2-Dimethoxyäthan, Methanol, Wasser, Aceton, Pyridin oder einem N-(Nieder)alkylpiperidin bzw. von Gemischen dieser Solventien als Lösungsmittel bei einer Temperatur unterhalb 250 C. Dabei entsteht die Verbindung II.
B. Behandlung eines Mols der Verbindung II mit 3 bis 6 Molen 4-Nitrobenzaldehyd, Benzaldehyd, 4-Methoxybenzaldehyd oder Pivalaldehyd, in einem Niederalkanol, wie Äthanol, Methanol, n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol, sek. Butanol, tert.-Butanol oder Gemischen dieser Solventien, bei einer Temperatur im Bereich von 50 C bis zur Rückflusstemperatur des verwendeten Lösungsmittels während einer Dauer von 2 bis 10 Stunden. Dabei entsteht die Verbindung III, worin Z ein Rest der Formeln
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C.
Behandlung eines Mols der Verbindung III mit 1 bis 1,3 Mol L-(- )-y-Benzyloxycarbonylamino-a-hydroxybutter- säure-N-hydroxysuccinimidester in einem Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, Tetrahydrofuran, Dimethylacetamid, Propylenglykol-dimethyläther, Äthylenglykol-dimethyläther oder Dioxan, bei einer Temperatur im Bereich von 10 bis 35 C.
Hernach wird das Lösungsmittel im Vakuum abgetrieben und der Rückstand in situ mit Wasserstoff in Gegenwart eines Metallkatalysators, wie Palladium, Platin, Rhodium, Raneynickel, Ruthenium oder Nickel, hydriert, wobei man in einem Gemisch aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie Dioxan, Tetrahydrofuran, Äthylenglykol, Dimethyläther oder Propylenglykol-dimethyläther, arbeitet und in Gegenwart einer katalytisch wirksamen Menge Eisessig reagieren lässt, wobei die Verbindung IV entsteht.
Bei einer weiteren bevorzugten Durchführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens nimmt man die Umsetzung des Kanamycins A mit N-(Benzyloxycarbonyloxy)-succinimid in molarem Verhältnis in Dimethylformamid bei einer Temperatur im Bereich von 200 C und +10 C vor. Die erhaltene Verbindung II behandelt man im Verhältnis von 1:3,5 bis 4,5 Molen mit Paranitrobenzaldehyd oder Benzaldehyd in absolutem Methanol, Äthanol, n-Propanol oder Isopropanol bei ungefähr Rückflusstemperatur während 2 bis 4 Stunden, wobei die Verbindung III entsteht, worin Z einen Rest der Formeln
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bedeutet.
Nachfolgend schliesst sich die Umsetzung der Verbindung III in einem Verhältnis von einem Mol zu 1,1 bis 1,3 Mol L-(- )-y-Benzyloxycarbonylamino-a-hydroxybutter- säure-N-hydroxysuccinimidester an, wobei man in Dimethylformamid als Lösungsmittel bei ungefähr Zimmertemperatur während mindestens 5 Stunden reagieren lässt. Hernach erfolgt die Abtrennung des Lösungsmittels im Vakuum und die Hydrierung des Rückstandes in situ mit Wasserstoff in Gegenwart von Palladium auf Aktivkohle in einem Gemisch von Dioxan und Wasser im Verhältnis 1:1 in Gegenwart einer katalytischen Menge Eisessig.
Die am meisten bevorzugte Durchführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens umfasst die folgenden Verfahrensschritte:
A. Acylierung eines Mols Kanamycin A mit einem Mol N (Benzyloxycarbonyl)-succinimid in Dimethylformamid bei einer Temperatur im Bereich von -20 bis +10 C.
B. Behandlung eines Mols der dabei erhaltenen Verbindung II mit ungefähr 4 Molen p-Nitrobenzaldehyd in absolutem Äthanol bei Rückflusstemperatur während zwei bis vier Stunden, wobei eine Verbindung III entsteht, worin Z ist, und
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C. Behandlung eines Mols der Verbindung III mit ungefähr 1,2 Mol L- (- )-y-Benzyloxycarbonylamino-a-hydroxy- buttersäure-N-hydroxysuccinimidester in Dimethylforrnamid bei ungefähr Zimmertemperatur während mindestens 5 Stunden, Abtreiben des Lösungsmittels im Vakuum und Hydrierung des Rückstandes in situ mit Wasserstoff in Gegenwart von Palladium auf Aktivkohle in einem Gemisch Dioxan und Wasser im Verhältnis 1:1 in Gegenwart einer katalytisch wirkenden Menge Eisessig. Dabei entsteht die Verbindung IV.
In der vorstehenden Beschreibung bedeutet der Ausdruck Niederalkyl einen Alkylrest, geradlinig oder verzweigt, mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen. Niederalkanol ist ein gesättigter Alkohol mit gerader oder verzweigter Kette und mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.
Beispiel 1
Herstellung von L-(- )-v-Benzyloxycarbonylamino-o:- hydroxybuttersäure (VI)
7,4 g = 0,062 Mol L-(-)-y-Amino-a-hydroxybuttersäure wurden hinzugefügt zu einer Lösung von 5,2 g = 0,13 Mol Natriumhydroxid in 50 ml Wasser. Zu der gerührten Lösung wurden tropfenweise bei 0 bis 5" C im Verlauf von einer halben Stunde 11,7 g = 0,068 Mol Carbobenzoxychlorid hinzugefügt, worauf eine weitere Stunde bei der gleichen Temperatur gerührt wurde. Das Reaktionsgemenge wurde gewaschen mit 50 ml Äther, sein pH-Wert auf 2 eingestellt mit verdünnter Salzsäure, wonach viermal mit je 80 ml Äther extrahiert wurde. Die Ätherextrakte wurden vereinigt, gewaschen mit einem geringen Anteil gesättigter Kochsalzlösung, getrocknet mit wasserfreiem Natriumsulfat und filtriert.
Das Filtrat wurde im Vakuum eingedampft und der erhaltene Rückstand auskristallisiert aus Benzol. Dabei wurden 11,6 g (74%) farbloser Plättchen erhalten. Schmelzpunkt 78,5 bis 79,5" C. [a] =4,5" (c= 2, CH3OH). Die IR-Analyse (KBr) zeigte: vCO = 1740, 1690 cm-l. Die NMR-Analyse (Aceton-d6) Ï (in ppm aus TMS) ergab: 2,0 (2 H, m), 3,29 (2 H, d-d, J = 6,7 und 12 Hz), 4,16 (1 H, d-d, J=4,5 und 8 Hz), 4,99 (2 H, s), 6,2 (2 H, breit), 7,21 (5 H, s).
Analyse für C12H15NO5: berechnet: C 56,91 H 5,97 N 5,53 gefunden: C 56,66 H 5,97 N 5,47
Beispiel 2
N-Hydroxysuccinimidester von L-(- )-y-Benzyloxy- carbonylamino-a-hydroxybuttersäure (VII)
Eine Lösung von 10,6 g= 0,042 Mol der Substanz VI und 4,8 g= 0,042 Mol N-Hydroxysuccinimid1) in 200 ml Äthylacetat wurde abgekühlt auf 0 C, wonach 8,6 g 0,042 Mol Di1) G. W. Anderson et al., Journal of American Chemical Society, 86, 1839 (1964).
cyclohexylcarbodiimid hinzugefügt wurden. Das Gemisch wurde über Nacht in einem Kühlschrank aufbewahrt. Hernach wurde der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das Filtrat auf ungefähr 50 ml unter vermindertem Druck eingeengt. Dabei entstanden farblose Kristalle der Substanz VII.
Sie wurden abfiltriert und ergaben 6,4 g; Schmelzpunkt 121 bis 122,5" C. Das Filtrat wurde im Vakuum zur Trockne eingedampft und der kristalline Rückstand gewaschen mit 20 ml Benzol-n-hexan, wobei eine weitere Menge der Substanz VII entstand. Die totale Ausbeute betrug 13,4 g (92%). [a] = 1,5 (c= 2, CHCl3). IR (KBr)vco=1810, 1755, 1740, 1680 cm-1.
NMR (Aceton-d6) (3 (in ppm aus TMS) 2,0 (2 H, m), 2,83 (4 H, s), 3,37 (2 H, d-d, J= 6,5 und 12,5 Hz), 4,56 (1 H, m), 4,99 (2 H, s), 6,3 (2 H, breit), 7,23 (5 H, s).
Analyse für C16H18N207: berechnet: C 54,85 H 5,18 N 8,00 gefunden: C 54,79 H 5,21 N 8,14 C 54,70 H 5,20 N 8,12
Beispiel 3
Herstellung von N-(Benzyloxycarbonyloxy)-succinimid
23 g= 0,2 Mol N-Hydroxysuccinimid wurden gelöst in einer Lösung von 9 g= 0,22 Mol Natriumhydroxid in 200 ml Wasser. Zu der gerührten Lösung wurden tropfenweise 34 g= 0,2 Mol Carbobenzoxychlorid unter Wasserkühlung hinzugefügt, wonach das Gemisch bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt wurde zwecks Ausscheidung des Carbobenzoxyderivates, welches nachfolgend abfiltriert, mit Wasser gewaschen und an Luft getrocknet wurde. Ausbeute 41,1 g (82%). Umkristallisieren aus Benzol-n-hexan (10:1) ergab farblose Prismen mit dem Schmelzpunkt 78 bis 79" C.
Beispiel 4
Herstellung von 6'-Carbobenzoxykanamycin A
Eine Lösung von 42,5 g= 90 mMol Kanamycin A in Form der freien Base in 450 ml Wasser und 500 ml Dimethylformamid wurde auf unter 0 C abgekühlt und kräftig gerührt. Zu dieser Lösung wurde tropfenweise im Verlauf von ungefähr zwei Stunden eine Lösung von 22,4 g= 90 mMol N-(Benzyloxycarbonyloxy)-succinimid in 500 ml Dimethylformamid hinzugegeben. Das Gemisch wurde bei -10 bis 0 C über Nacht gerührt und hernach weiter gerührt bei Zimmertemperatur während eines Tages. Das Reaktionsgemenge wurde unter vermindertem Druck und unterhalb 50 C eingedampft.
Der ölige Rückstand wurde aufgelöst in einem Gemisch von 500 ml Wasser und 500 ml Butanol, wonach das Gemenge filtriert wurde zwecks Entfernung unlöslicher Anteile und anschliessend in zwei Schichten trennengelassen wurde. Die Butanolschicht und die wässrigen Schichten wurden behandelt mit butanolgesättigtem Wasser (2 x 500 ml) und mit wassergesättigtem Butanol (2 x 500 ml) unter Verwendung einer Technik ähnlich derjenigen der Gegenstromverteilung. Die drei wässrigen Schichten wurden vereinigt und zur Trockne unter vermindertem Druck eingedampft. Sie hinterliessen einen öligen Rückstand, von welchem ein Teil beim Stehen bei Zimmertemperatur kristallisierte. Zu diesem Rückstand, zusammen mit den Kristallen, wurden ungefähr 100 ml Methanol hinzugefügt, welcher das Öl auflöste und von den Kristallen abtrennte.
Nach Zugabe von ungefähr 300 ml Äthanol wurde das Gemisch bei Zimmertemperatur über Nach stehengelassen und ergab eine kristalline Masse, welche abfiltriert wurde. Sie wog 44 g. Das Produkt enthielt einen geringen Anteil Kanamycin A, nachgewiesen vermittels Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von n-Propanol-Pyridin Essigsäure-Wasser (15 :10:3 :12) als Lösungsmittelsystem sowie von Ninhydrin als Sprühreagens.
Das Rohprodukt wurde aufgelöst in 300 ml Wasser und chromatographiert an einer Säule (300 mm Durchmesser) von CG-50 Ionenaustauschharz (NH4+-Typ, 500 ml). Die Säule wurde perkoliert mit 0,1n Ammoniumhydroxid-Lösung und das Eluat gesammelt in Fraktionen von je 10 ml. Das erwünschte Produkt war enthalten in den Fraktionen 10 bis 100, wogegen Kanamycin A in den langsamer laufenden Fraktionen und das oder die Isomeren des Produktes in den schneller laufenden Fraktionen zugegen zu sein schien. Die Fraktionen 10 bis 110 wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft.
Erhalten wurden daraus 24,6 g (45 Wo) farbloses 6-Carbobenzoxykanamycin A (II) (6'-Cbz Kanamycin A), welches bei 204 C zu schmelzen und sich zu verfärben begann und sich bei 212 C unter Gasentwicklung zersetzte. [a]D =f106" (c = 2, H2O).
Dünnschichtchromatographie auf Silicagel F 254 , Ninhydrin Lösungsmittelsystem Rf-Wert
6'-Cbz-Kanamycin A Kanamycin A n-PrOH-Pyridin-AcOH-H2O (15:10:3:12) 0,42 0,33 0,15 0,04 (Hauptanteil) (Nebenanteil) Aceton-AcOH-H2O (20:6:74) 0,24 0,14 CHCl3-MeOH-CNH4OH-H2O (1:4:2:1) 0,76 0,50 AcOMe-n-PrOH-C-NH4OH (45:105:60) 0,22: 0,04 * nachgewiesen mit Anthron-Schwefelsäure.
Das Endprodukt enthielt gemäss der dünnschichtchromatographischen Prüfung mit einem der Lösungsmittelsysteme zwei Komponenten in geringeren Anteilen. Es wurde indessen ohne weitere Reinigung für die Herstellung von BB-K8 (I) benutzt.
Beispiel 5
Herstellung von L-(- )-y-Amino-a-hydroxybuttersäure aus Ambutyrosin A oder B bzw. aus Gemischen davon
5,0 g Ambutyrosin A (US-Patent Nr. 3 541 078, veröffentlicht 17. November 1970) wurde am Rückfluss eine Stunde lang mit 160 ml 0,5n Natriumhydroxid gekocht. Das Hydrolysat wurde neutralisiert mit 6n HCl und chromatographiert an einer Säule von CG-50 (NH4+-Typ). Die erwünschte L-(-)-y-Amino-a-hydroxybuttersäure wurde isoliert durch Entwickeln der Kolonne mit Wasser und Abtrennung des Wassers vermittels Gefriertrocknung. Die L-(-)-y-Amino-ahydroxybuttersäure ist ein kristallines Produkt mit einem Schmelzpunkt von 212,5 bis 214,5 C (Kolonne 2, Zeilen 31 bis 38, US-Patent Nr. 3 541 078).
Beispiel 6
Herstellung von L-(-)-y-Amino-a-hydroxybuttersäure aus DL-a-Hydroxy-i-phthalimidobuttersäure
A. Dehydroabietylammonium-L-a-hydroxy-y- phthalimidobutyrat
Zu einer Lösung von 25 g = 0,1 Mol 2-Hydroxy-y-phthal imidobuttersäure1) in 200 ml Äthanol wurde eine Lösung von 29 g=0,1 Mol Dehydroabietylamin in 130 ml Äthanol hinzugefügt. Die Lösung wurde kräftig geschüttelt während einer Minute und dann 5 Stunden lang bei Zimmertemperatur stehengelassen, während welcher Zeit keine Nadeln auskristallisierten. Die Kristalle wurden abfiltriert, gewaschen mit 50 ml Äthanol und an Luft getrocknet. Erhalten wurden 30,1 g (56 %) eines Diastereomeren des Dehydroabietylaminsalzes.
Schmelzpunkt 93 bis 94" C. [a]D24 = + 150 (c. 2,5, MeOH).
Umkristallisieren aus 300 ml Äthanol ergab 23,2 g (43 Wo des reinen Produktes). Schmelzpunkt 94 bis 95 " C [a]D24 = + 10,8 (c. 2,5, MeOH). Weitere Umkristallisationen änderten den Schmelzpunkt und die spezifische Drehung nicht.
Analyse für C32H42N2O5 H2O: berechnet: C 69,54 H 8,02 N 5,07 gefunden: C 69,58 H 8,08 N 5,07 y. Saito et al., Tetrahedron Letters, 1970, 4863.
B. L-(- )-y-Amino-a-hydroxybuttersäure
Zu einer Lösung von 1,5 g= 0,014 Mol Natriumcarbonat in 40 ml Wasser wurden 5,3 g= 0,01 Mol Dehydroabietylam monium-l-a-hydroxy-y-phthalimidob utyrat und 60 ml Äther hinzugefügt. Das Gemisch wurde kräftig geschüttelt, bis sich alle feste Substanz gelöst hatte. Die Ätherschicht wurde abgetrennt. Die wässrige Lösung wurde zweimal mit 20 ml Äther gewaschen und eingedampft auf 15 ml unter vermindertem Druck. Zu diesem Konzentrat wurden 10 ml konzentrierte Salzsäure hinzugefügt und das Gemenge am Rückfluss 10 Stunden lang gekocht. Nach dem Abkühlen wurde die abgeschiedene Phthalsäure abfiltriert. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde aufgelöst in 10 ml Wasser und die Lösung zur Trockne eingedampft.
Diese Operation wurde zweimal wiederholt, um überschüssige Salzsäure abzutrennen. Der zurückgebliebene Sirup wurde aufgelöst in 10 ml Wasser und die Lösung filtriert zur Entfernung einer geringen Menge unlöslicher Phthalsäure. Das Filtrat wurde absorbiert an einer Säule von IR-120 (H+, 1 x 35 cm).
Die Säule wurde gewaschen mit 300 ml Wasser und eluiert mit 1n Ammoniumhydroxidlösung. Das Eluat wurde unterteilt und gesammelt in Fraktionen von je 15 ml. Die Ninhydrinpositiven Fraktionen 10 bis 15 wurden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Zurück blieb ein Sirup, welcher allmählich kristallisierte. Die Kristalle wurden zerrieben mit Methanol, filtriert und getrocknet in einem Vakuumexsikkator und ergaben 0,78 g (66 9wo) L-(-)-y-Amino-a-hy- droxybuttersäure. Schmelzpunkt 206 bis 207 C. [a]D24 = -29" (c. 2,5, H20). Das IR-Spektrum erwies sich identisch mit denjenigen einer authentischen Probe, die erhalten worden war aus Ambutyrosin.
Beispiel 7
Herstellung von 6'-Carbobenzoxy-1,3,3"-tri-p nitrobenzalkanamycin A (III)
9,0 g = 14,5 mMol 6'-Carbobenzoxykanamycin A wurden suspendiert in 500 ml absolutem Äthanol bei 24 C, worauf 8,7945 g = 58,2 mMol p-Nitrobenzaldehyd hinzugefügt wurden.
Das Gemenge wurde am Rückfluss erhitzt. Dabei veränderte sich das Gemisch zu einer klaren gelben Lösung, jedoch begann bei Rückflusstemperatur sich rasch eine weisse feste Substanz zu bilden. Das Gemisch wurde am Rückfluss drei Stunden lang siedengelassen, hernach abgekühlt und die ausgefallene Substanz abfiltriert. Sie wurde gewaschen mit ein wenig absolutem Äthanol. Die Ausbeute betrug 14,0 g (94,5 %) einer weissen kristallinen festen Substanz. Schmelzpunkt 233 bis 234 C (unkorrigiert). Es handelt sich um das im Titel genannte Produkt III.
Analyse für C47H51N7O19: berechnet: C 55,46 H 5,05 N 9,63 gefunden: C 55,39 H 5,08 N 9,60
Beispiel 8
Herstellung von 1 -[L- (-)-y-Amino-o-hydroxybutyryl]- kanamycin A (IV)
5,0 g = 4,91 mMol 6'-Carbobenzoxy-1,3,3"-tri-p-nitro- benzalkanamycin A wurden gelöst in 50 ml Dimethylformamid bei 24" C. Nun wurden 2,064 g=5,895 mMol L-(-)-y- Benzyloxycarbonylamino-a -hydroxybuttersäure-N-hydroxysuccinimidester aufgelöst in 20 ml Dimethylformamid bei 24 0C und die Lösung langsam unter kräftigem Rühren hinzugefügt zur Lösung der Schiffschen Base III im Verlauf von 75 Minuten. Die Lösung wurde bei 24 C über Nacht gerührt.
Unter Verwendung eines Dampfstrahlvakuums wurde die Lösung bei ungefähr 40 C zur Trockne gebracht. Weiterhin wurde wiederholt getrocknet durch Behandlung mit 100 ml Methanol, wobei ein viskoses Öl entstand. Das Öl wurde aufgelöst in 100 ml Dioxan-Wasser (1:1), wonach 10 ml Eisessig hinzugegeben wurden. Die Lösung wurde eingebracht in einen Parr-Kolben zusammen mit 2,5 g 5 %igem Palladium auf Aktivkohle und reduziert bei 3,1 kp/cm2 während 4 Stunden bei 24 C. Der gesamte Druckabfall in dieser Zeit (geschlossener Kolben) betrug 6,1 kp/cm2 unter Einschluss der periodischen Druckerneuerungen. Das Gemisch wurde filtriert durch ein Bett von Diatomeenerde, die nachher gewaschen wurde mit 3mal je 50 ml 50 XOigem wässrigem Dioxan.
Die vereinigten Filtrate wurden zur Trockne gebracht und azeotrop destilliert mit 100 ml n-Butanol. Schliesslich wurde wiederholt mit Methanol behandelt, wobei ein viskoses Öl entstand. Es wurde aufgelöst in 30 ml Methanol und langsam eingegossen in 1000 ml kaltem (5-10 ) Diäthyläther unter kräftigem Rühren. Nachdem die erhaltene Suspension-eine halbe Stunde lang in einem Eisbad gerührt worden war, wurde die Fällung abfiltriert und unmittelbar in einem Vakuumexsikkator über P2Os getrocknet. Das erhaltene Gemenge wog 4,9620 g.
Dünnschichtchromatographie erwies, dass es zur Hauptsache aus der Verbindung IV, Kanamycin A und einigen Spuren diund trisubstituertem Kanamycin A bestand, unter Einschluss von 4-Amino-2-hydroxybuttersäure.
Die verschiedenen Fraktionen wurden getrennt unter Verwendung einer Glaskolonne 40 x 100 mm, gefüllt mit Amberlite IRC-40 (NH4+-Form, Typ I 0,15-0,075 mm).
Die Säuie wurde beladen mit 4,600 g des Rohgemisches, aufgelöst in 15 ml Wasser. Danach wurde die Säule eluiert mit wässriger Ammoniaklösung, deren Konzentration von 0- bis 2n anstieg. Die Eluate wurden gesammelt in Fraktionen von je 15 ml. Gesammelt wurden 295 Fraktionen, wonach die Säule gewaschen wurde mit 1,5 Liter 3n NH40H. Die Fraktionen wurden vereinigt auf der Basis ihrer optischen Drehungen. Die festen Anteile daraus wurden isoliert durch Lyophylisation.
Fraktion Zusammensetzung Gewicht Korrektion auf Biotest % Ausbeute Nr. Gramm Gesamtgewicht
Rohgewicht g 120-150 kana A 1,1654 1,257 809 42,6 201-224 BB-K29 0,4000 0,430 228-241 BB-K8 0,6523 0,7036 786 + 101 ' 19,2 Mittel von 4 Plattentests, 5: Standardabweichung.
Falls das zurückgewonnene Kanamycin A berücksichtigt wird, beträgt die Umwandlung in BB-K8 (IV) 33,5 %.
In diesem Durchlauf betrug das Verhältnis von BB-K8 zu Kana A 0,45.
Die nach diesem Verfahren gewonnene Verbindung IV ist identisch mit dem authentischen Produkt, erhalten gemäss der Methode, die in der US-Patentschrift Nr. 3 781 268 beschrieben ist. Schmelzpunkt 194" C (Zersetzung). [a]D21 = +850 (c = 2, H2O). Die relative Wirksamkeit gegenüber B. subtilis (Agar-Plattentest) 960 mcg/mg. Standard: Kanamycin A als freie Base.
Analyse für C22H43N5O13 - 2 H2CO3: berechnet: C 40,62 H 6,68 N 9,87 gefunden: C 40,21 H 6,96 N 9,37
C 39,79 H 6,87 N 9,49
Beispiel 9
Herstellung des Monosulfats von 1-[L-(-)-y-Amino-a- hydroxybutyryl]-kanamycin A
1 Mol 1 -[L-(- )-y-Amino-a-hydroxybutyryl]-kanamycin A wird aufgelöst in 1 bis 3 Litern Wasser. Die Lösung wird filtriert zwecks Abtrennung unlöslicher fester Anteile. Zu der gekühlten und gerührten Lösung wird 1 Mol Schwefelsäure, gelöst in 500 ml Wasser, hinzugefügt. Das Gemisch wird 30 Minuten lang gerührt, wonach kaltes Äthanol hinzugefügt wird, bis sich eine Fällung zu bilden beginnt. Die festen Substanzen werden abgetrennt und erweisen sich als das erwünschte Monosulfat.
Beispiel 10
Herstellung des Disulfats von 1-[L-(-)-y-Amino-a- hydroxybutyryl]-kanamycin A (BB-K8 - 2 H2SO4)
35 g 1-[L-(-)-y-Amino-a-hydroxybutyryl]-kanamycin A (als Monobicarbonat-trihydrat) wurden aufgelöst in 125 ml entionisiertem Wasser. Dabei ergab sich ein pH-Wert von ungefähr 9,0. Der pH-Wert wurde gesenkt durch Zugabe von 50%iger Schwefelsäure auf 7 bis 7,5.
Zum Gemisch wurden 8,5 g Darco G-60 (Aktivkohle) hinzugefügt und die Aufschlämmung bei Zimmertemperatur eine halbe Stunde lang durchgeschüttelt. Die Kohle wurde in geeigneter Weise abfiltriert und gewaschen mit 40 ml Wasser.
Die Waschlösung wurde zum Filtrat zugefügt.
Die vereinigten Lösungen wurden auf den pH-Wert 2 bis 2,6 eingestellt mit 50%iger Schwefelsäure. Ein grosser Anteil Kohlendioxid entwickelte sich dabei. Die Lösung wurde am Vakuum unter Rühren während 20 Minuten stehengelassen zwecks Entfernung weiteren Kohlendioxids.
Zur entgasten Lösung wurden 8,5 g Darco G-60 hinzugefügt. Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur eine halbe Stunde lang durchgeschüttelt. Anschliessend wurde die Kohle in geeigneter Weise abfiltriert und gewaschen mit 35 ml entionisiertem Wasser. Das Wasser wurde zum Filtrat hinzugegeben.
Die vereinigten Lösungen wurden mit 50 %iger Schwefelsäure auf den pH-Wert 1 bis 1,3 eingestellt. Diese Lösung wurde hernach unter raschem Rühren im Verlauf von 10 Minuten zu 600 bis 800 ml Methanol (3- bis 4faches Volumen an Methanol) hinzugegeben. Das Gemisch wurde 5 Minuten lang beim pH-Wert 1 bis 1,3 gerührt und hernach passierengelassen durch ein Sieb mit 0,15 mm Maschenweite. Anschliessend wurde 2 Minuten gerührt und 5 Minuten absitzengelassen. Der Hauptanteil der überstehenden Flüssigkeit wurde dekantiert. Die verbliebene Aufschlämmung wurde filtriert, der Rückstand gewaschen mit 200 ml Methanol und am Vakuum bei 50 C während 24 Stunden getrocknet.
Die Ausbeute an amorphem BB-K8 (Dihydrogensulfat)2 betrug 32 bis 34 g [a]D22 in H20 = +74,75", Zersetzung bei 220 bis 223" C.
Analyse (bezogen auf Trockensubstanz') gefunden theoretisch 32,70; 33,50; 32,30; 33,50 Yo N 8,78; 8,70; 8,20; 8,80; 8,97 % 5 8,75; 8,90; 7,80; 8,85; 8,20 ',tc Asche nil