LU82567A1 - Nouveaux tetra-ou pentapeptides,leur preparation et les medicaments qui les contiennent - Google Patents

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LU82567A1
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phenyl
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J Bouchaudon
D Farge
C James
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Rhone Poulenc Ind
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Description

La présente invention concerne de nouveaux tétra- ou penta- peptides de formule générale : R - NH - GH - CO - NH - GH - CO - R, (T) ! I 1 CH λ CH.CH„ - CO - NH - CH - R„ J 12. . i 2 (CHj.
i2 3 R3 - NH - CH - R^ éventuellement leurs sels, leur préparation et les médicaments qui les 5 contiennent.
Les parois bactériennes, par exemple les parois de mycobactéries, sont constituées essentiellement d’un peptidoglycane formé d’acide N-acétyl-muramique sur lequel sont fixés des peptides renfermant l’enchaînement L Ala-D Glu-DAP. Par ailleurs, les parois bactériennes sont très riches en lipides 10 dont certains sont libres et extractibles et d’autres sont liés à la structure de la paroi et sont constitués par des acides mycoliques (acides gras géants, α-ramifiés et β-hydroxylés). L’ensemble des constituants de la paroi cellulaire forme une structure covalente composée d’un peptidoglycane et d’un mycolate d’arabinogalactane liés entre eux par des liaisons phosphodiesters.
15 Ces parois bactériennes présentent la plupart des propriétés biologiques des cellules entières lorsqu’elles sont associées à une huile minérale ou végétale et administrées après mise en suspension dans du soluté physiologique.
Dans les brevets belges 821 385, 852 348 et 852 349 sont décrits des peptides, couplés avec l’acide N-acêtylmuramique, qui contiennent l’enchaî-20 nement L Ala-D Glu ou L Ser-D Glu et qui sont efficaces comme adjuvants immunologiques et comme agents antiinfectieux.
Dans le brevet français 75.24440, publié sous le numéro 2 320 107, sont décrits des produits de couplage entre un acide gras et un saccharide heptapeptide isolé à partir d’une mycobactérie contenant une cire ”D” et qui 25 peuvent être représentés par la formule suivante : ' NAG - Np.....NAG - NAM '
Ala Ala i 4
Glu Glu (R C00H)n (II)
DAP _^-*DAP
AÎa--- « 4 m li f f 2 dans laquelle en particulier : NAG = N-acétylglucosamine ; NAM = acide N-acétylmuramique R = radical alcoyle contenant 9 à 17 atomes de carbone.
Ces produits sont des adjuvants immunologiques de la production 5 d’anticorps et de l’hypersensibilité retardée capables d’agir seuls, c’est-à-dire sans qu’il soit nécessaire de les administrer en solution huileuse.
Tous ces produits se caractérisent par la présence d’acide · N-acétylmuramique qui, d’après KASUMOTO et al., Tetrahedron Leiters 49, 4899 (1978), est considéré comme lié à l'activité immunologique.
10 II a maintenant été trouvé que les peptides de formule générale (i) présentent, malgré l’absence d’acide N-acétylmuramique, des propriétés adjuvantes et immunostimulantes remarquables. Par ailleurs ces conposés, qui sont bien définis, peuvent être obtenus aisément avec la pureté suffisante requise pour l'emploi en thérapeutique.
15 Dans la formule générale (i), R représente un atome d'hydrogène ou un reste d'acide gras,
Rg représente un atome d'hydrogène ou un reste d'acide gras ou un reste glycyle ou D alanyle dont la fonction amine est éventuellement substituée par un reste d'acide gras, étant entendu que l'un au moins des symboles 20 R et R^ représente ou contient un reste d'acide gras, R^ représente un radical hydroxy, amino ou alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle, l'un des symboles R£ ou R^ représente un atome d'hydrogène ou un radical carboxy, carbamoyle, alcoyloxycarbonyle dont la partie alcoyle qui contient 25 1 à 4 atomes de carbone est éventuellement substituée par un radical phényle ou nitrophényle, ou un radical N-carbonylglycyle (-CO-NH-Q^-COOH) ou N-carbonyl D alanyle Z"-CO-NH-CH(CH2)-COOH7 éventuellement estérifié par un * radical alcoyle contenant 1 à 4 atomes de carbone (éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle), et l'autre re* :ésente un atome 30 d'hydrogène ou un radical carboxy, carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle dont la partie alcoyle qui contient 1 à 4 atomes de carbone est éventuellement substituée par un radical phényle ou nitrophényle, étant entendu que R- / • f ^ / et ne peuvent pas représenter simultanément un atome d'hydrogène et / 6'J* / ' / 3 étant entendu que l’un au moins des symboles R^, R^ ou R^ représente ou contient un reste glycyle ou D alanyle.
Dans la formule générale (i), l'alanine liée à l'acide > glutamique est sous forme L, l'acide glutamique est sous forme D, la 5 lysine ou ses dérivés, lorsque l'un des symboles R£ ou R^ représente un atome d'hydrogène, est sous forme L, et l'acide diamino-2,6 pimélique ou ses dérivés, lorsque R^ et R^ représentent un radical carboxy ou un dérivé de la fonction acide, est sous forme D,D ; L,L ; DD, LL (racémique) ou D,L (méso).
10 Par reste d'acide gras, il faut entendre un radical alcanoyle contenant 1 à 45 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical hydroxy, phényle ou cyclohexyle, un radical alcénoyle contenant 3 à 30 atomes de carbone et pouvant contenir plus d'une double liaison ou un reste d'acide mycolique tel que rencontré dans la structure de la 15 paroi bactérienne des mycobactéries, de Nocardia ou de corynebactéries.
Selon la présente invention, les nouveaux peptides de formule générale (l) peuvent être obtenus selon les méthodes généralement utilisées en chimie peptidique. Les différentes réactions sont mises en jeu après blocage par des groupements protecteurs convenables des 20 fonctions amine ou acide qui ne doivent pas participer à la réaction et sont suivies éventuellement du déblocage de ces fonctions.
Selon la présente invention,les nouveaux produits de formule générale (l) peuvent être obtenus par action d'un aminoacide de formule générale : 25 R5-NH-CH-C0 R' Λ dans laquelle représente un atome d'hydrogène, un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine tel que le radical ; benzyloxycarbonyle ou t.butyloxycarbonyle, R, représente un atome
O
d’hydrogène ou un radical méthyle étant entendu dans ce cas que l'alanine 30 est sous forme D, et R' représente un radical hydroxy ou un radical alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle sur un tri-ou tétrapeptide de formule générale ; 1 / /Ί / R_-NH-CH-CO-NH-CH-CO-RQ / .·/ 7 | [ ° if CH. CH.CH.-CO-NH-CH-R. (IV) / K»; i R -NH-CH-R, 10 4 4 dans laquelle représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine tel que le radical benzyloxycarbonyle ou t.butyloxycarbonyle, représente un radical hydroxy ou amino ou un radical alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de'carbone éventuellement subs-
5 titué par un radical phényle ou nitrophényle, l'un des symboles R. ou R
H 9 représente un atome d'hydrogène ou un radical carboxy, carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone et est éventuellement substituée par un radical phényle ou nitrophényle ou un reste N-carbonylglycyle ou N^-carbony! D alanyle éventuellement esté-“ 10 rifié par un radical alcoyle contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuel lement substitué par un radical phényle ou nitrophényle et l'autre représente un atome d'hydrogène ou un radical carboxy, carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone et est éventuellement substituée par un radical phényle ou nitrophényle, 15 étant entendu que R^ et R^ ne peuvent pas représenter simultanément un atome d'hydrogène, et R représente un atome d'hydrogène ou un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine tel que le radical benzyloxycarbonyle ou t.butyloxycarbonyle ou un radical glycyle ou D alanyle dont la fonction amine est éventuellement substituée par un i 20 reste d'acide gras ou par un groupement protecteur de la fonction amine tel que le radical benzyloxycarbonyle ou t.butyloxycarbonyle, étant entendu que l'un au moins des radicaux R^ ou R représente ou contient un reste d'acide gras ét que, R^ et Rg étant définis comme précédemment, R10 représente un atome d'hydrogène, et que l'un des symboles R^ ou R^ 25 représentant un radical carboxy, 1<autre représente un atome d'hydrogène ou un radical carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle, représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine, ou un reste glycyle ou D alanyle dont la fonction amine est 30 substituée par un reste d'acide gras ou par un groupement protecteur de la fonction amine, suivie éventuellement du remplacement des radicaux R^> et/ou R (lorsqu'ils représentent ou contiennent un groupement protecteur de la fonction amine) par un atome d'hydrogène et du remplacement ‘des radicaux R* et (lorsqu'ils représentent ou contiennent un radical alcoyloxy 35 contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle) par un radical hydroxy et des radicaux R^ et/ou ,
Rg (lorsqu'ils représentent ou contiennent un radical alcoyloxycarbonyle ,/ contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un 'radicrfj^ phényle ou nitrophényle) par un radical carboxy, Ijfl //.
5 /
Plus particulièrement, les nouveaux peptides de formule générale (i) dans laquelle R, R^ et R^ sont définis comme précédemment et l'un des symboles R^ ou R^ représente un radical N-carbonyl glycyle ou N-carbonyl D alanyle peuvent être obtenus par action d'un aminoacide 5 de formule générale (III), dans laquelle R^ et R* sont définis comme * précédemment et R^ représente un atome d’hydrogène sur un tri- ou téttapeptide de formule générale (IV) dans laquelle R^ est défini comme précédemment, R représente un radical amino ou alcoyloxy contenant
O
1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle 10- ou nitrophényle, l'un des symboles R^ ou R^ représente un radical carboxy et l’autre représente un atome d’hydrogène ou un radical carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle et R représente un reste d’acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine ou 15 un reste glycyle ou D alanyle dont la fonction amine est substituée par un reste d’acide gras ou par un groupement protecteur de fonction amine, étant entendu que l’un au moins des symboles R^ ou R représente ou contient un reste d’acide gras, suivie éventuellement du remplacement du radical R^ ou R^, lorsqu’il représente ou contient un groupement 20 protecteur de la fonction amine, par un atome d'hydrogène, des radicaux Rg et/ou R’ lorsqu'ils représentent un radical alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone (éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle) par un radical hydroxy et du radical R^ ou R^ lorsqu'il représente ou contient un radical alcoyloxy-25 carbonyle contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle, par un radical carboxy.
Généralement, il est nécessaire d'activer la fonction acide libre du peptide de formule générale (iv) préalablement à l’action de 1’aminoacide de formule générale (III). De préférence, le dérivé activé r' 30 du peptide de formule générale (IV) est un anhydride mixte préparé in situ par action d’un halogénoformiate d'alcoyle tel que le chloroformiate d'isobutyle sur le peptide de formule générale (IV). La condensation . du dérivé activé s’effectue dans un solvant organique tel que le dioxanne,/ / //
Lf « / 6 le tétrahydrofuranne, le chloroforme, le toluène ou le diméthylformamide . ou en milieu hydroorganique, en présence d'une base (minérale, telle que la soude, ou organique, telle que la triéthylamine), à une température comprise entre -10 et -t-30°C.
5 Le remplacement éventuel des radicaux protecteurs R^ ou R
par un atome d'hydrogène et des radicaux protecteurs R„ et R' par des
O
radicaux hydroxy et de R^ ou par un radical carboxy peut être effectué selon les méthodes connues, en fonction de la nature de ces groupements· Il est particulièrement avantageux de choisir les radicaux 10 R? ou R10, Rg, R' et R4 ou de telle manière que leur remplacement par un atome d'hydrogène ou par un radical hydroxy ou carboxy puisse s'effectuer en une seule étape. Par exemple, R^ ou R^ peuvent représenter un radical benzyloxycarbonyle et les symboles Rg, R' et R^ ou R^ représenter un radical benzyloxy ou benzyloxycarbonyle, et, dans ces 15 conditions le remplacement de ces radicaux par des atomes d'hydrogène ou par un radical hydroxy ou carboxy selon les cas s'effectue par hydrogénolyse en opérant dans un solvant organique approprié tel que l'acide acétique (éventuellement en mélange avec un autre solvant organique tel que le méthanol) ou dans un solvant hydroorganique, en 20 présence d'un catalyseur tel que le palladium, par exemple le palladium sur noir, à une température voisine de 20°C et sous une pression voisine de 760 mm de mercure. Cependant, il peut être nécessaire d'éliminer un ou plusieurs de ces groupements protecteurs sans toucher aux autres. Dans ce cas les groupements protecteurs des fonctions amines pourront ‘être, 25 par exemple, l'un un radical t.butyloxycarbonyle (éliminable par hydrolyse acide) et l'autre un radical benzyloxycarbonyle (éliminable par hydrogénolyse) et les groupements protecteurs des fonctions acides - pourront être, par exemple, l’un un radical méthyle ou t.butyle (éli minable par hydrolyse acide ou basique) et l'autre un radical benzyle 30 (éliminable par hydrogénolyse).
Plus particulièrement, les nouveaux peptides de formule générale (i) dans laquelle R, R^, R^ et R^ sont définis comme précédemment,, et Rg représente un reste glycyle ou D alanyle dont la fonction amine est éventuellement substituée par un reste d'acide gras, peuvent 35 être obtenus par action d'un aminoacide de formule générale (III) danéj r 7 • laquelle est défini comme précédemment, R,. représente un reste d’acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine et * R' représente un radical hydroxy, sur un tri- ou tétrapeptide de for mule générale (IV) dans laquelle R^, R^, RQ et R^ sont définis comme 5 précédemment et R représente un atome d'hydrogène, étant entendu que l'un au moins des symboles R^ et R^ représente un reste d'acide gras, suivie éventuellement du remplacement du radical ou , lorsqu'il représente un groupement protecteur de la fonction amine, par un atome d'hydrogène et du radical R^, lorsqu'il représente un radical 10 alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone (éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle) par un radical hydroxy et des radicaux R^ et/ou R^, lorsqu'ils représentent ou contiennent un radical alcoyloxycarbonyle contenant 1 à 4 atomes de carbone (éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle)]: r un radical 15 carboxy» Généralement, il est nécessaire d'activer la fonction acide de l'aminoacide de formule générale (ill) préalablement à son action sur le peptide de formule générale (IV). Généralement, le dérivé activé de l'aminoacide de formule générale (III) est un anhydride mixte 20 Préparé in situ par action d'un halogénoformiate d'alcoyle (tel que le chloroformiate d'isobutyle) sur l'aminoacide de formule générale (III). La condensation du dérivé activé s'effectue dans un solvant organique tel que le dioxanne, le tétrahydrofuranne, le chloroforme, le toluène ou le diméthylformamide ou dans un milieu hydroorganique, en présence 25 d'une base (minérale, telle que la soude, ou organique, telle que la triéthylamine), à une température comprise entre -10 et +30°G· . Lorsque l'on utilise l'acide de formule générale (III), la condensation est effectuée généralement en présence d'un agent de condensation tel que le dicyclohexylcarbodiimide en opérant dans un 30 solvant organique tel que le chlorure de méthylène ou le diméthyl- formamide à une température comprise entre -10 et +30°C.
* Le remplacement des radicaux protecteurs ou par un atome d'hydrogène et des radicaux protecteurs Rg et/ou R^ et/ou R^ par un radical hydroxy ou carboxy selon les cas peut être effectuée selon 35 les méthodes connues en fonction de la nature de ces groupements· Il / / est particulièrement avantageux d'effectuer ce remplacement dans ie^i / conditions données précédemment· j /4 / „ 8
Selon la présente invention,les nouveaux peptides de formule , générale (i) peuvent être obtenus par action d'un dipeptide de formule générale : * R -NH-CH-CO-NH-CH-C 0-R_ 7 I ! 8 (v)
CH3 CH2CH2COOH
5 dans laquelle représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine et R représente un radical amino ou o alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle, sur un di- ou tripeptide de formule générale : H0N-CH-Rq 2 i 9 10 ‘jVî (VI) k10hh-ch-r4 dans laquelle l'un des symboles ou représente un atome d'hydrogène ou un radical carboxy, carbamoyle, alcoyloxycarbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone et est éventuellement substituée par un radical phényle ou nitrophényle ou un reste N-carbonyl glycyle 15 ou N-carbonyl D alanyle éventuellement estérifié par un radical alcoyle contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle et l'autre représente un atome d'hydrogène ou un radical carboxy, carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone et est éventuellement substituée 20 par un radical phényle ou nitrophényle, étant entendu que R^ et R^ ne peuvent pas représenter simultanément un atome d'hydrogène et R représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine ou un reste glycyle ou D alanyle (dont la fonction amine est substituée par un reste d'acide gras ou par un groupement protecteur “ 25 de fonction amine), l'un au moins des symboles R, ou R. et R. repré- 4 9 10 c sentant ou contenant un radical glycyle ou D alanyle tel que défini ci-avant et l'un au moins des symboles et R représentant ou contenant un reste d'acide gras, suivie éventuellement du remplacement du radical R^ ou R (lorsqu'il représente ou contient un groupement 30 protecteur de la fonction amine) par un atome d'hydrogène et des radicaux Rg et/ou et/ou (lorsqu'ils représentent selon le ^c^T/ /' 9 un radical alcoyloxy ou alcoyloxycarbonyle contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle) par un radical hydroxy ou carboxy.
. Généralement il est nécessaire d’activer la fonction acide 5 libre du dipeptide de formule générale (v) préalablement à son action sur le peptide de formule générale (VI)· De préférence, le dérivé activé du dipeptide de formule générale (V) est un anhydride mixte, préparé in situ par action d’un halogénoformiate d’alcoyle tel que le chloroformiate „ d'isobutyle. Dans ces conditions la condensation s'effectue comme indiqué 10 ci-dessus pour l’action d'un aminoacide de formule générale (ill) sur un ; tripeptide de formule générale (IV)·
Le remplacement éventuel des radicaux protecteurs R^ ou R
par un atome d’hydrogène et des radicaux protecteurs R0 et/ou R. et/ou R_ o q- 9 par un radical hydroxy ou carboxy selon les cas s'effectue selon les 15 méthodes connues indiquées précédemment.
Selon la présente invention,les nouveaux peptides de formule générale (i) peuvent être obtenus par action d'un dérivé de la L alanine de formule générale :
R-NH-CH-COOH
. 7 I (VII) CH3 20 dans laquelle R^ représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine, sur un tri- ou tétrapeptide de formule générale : H-N-CH-C0-R„ 2 | 8 CHoCH„-C0-NH-CH-Rq (VIII) L i. j 9 (ch,), R -NH-CH-R.
10 4 - dans laquelle l'un des symboles R^ ou représente un atome d'hydrogène 25 ou un radical carboxy, carbamoyle, alcoyloxycarbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone et est éventuellement substituée, / / / .// L>K'
V
/ r 10 par un radical phényle ou nitrophényle ou un reste N-carbonyl glycyle ou N-carbonyl D alanyle éventuellement estérifié par un radical alcoyle contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un ; radical phényle ou nitrophényle et l’autre représente un atome d'hydro- 5 gène ou un radical carboxy, carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone et est éventuellement substituée par un radical phényle ou nitrophényle, étant entendu que et Rg ne peuvent pas représenter simultanément un atome d’hydrogène, • Rg représente un radical hydroxy, amino ou alcoyloxy contenant 1 à 4 10 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle, et R représente un reste d’acide gras, un groupement protecteur de la fonction amine ou un radical glycyle ou D alanyle dont la fonction amine est substituée par un reste d'acide gras ou par un groupement protecteur de fonction amine, l'un au moins des symboles R^ ou 15 Rg et R représentant ou contenant un radical glycyle ou D alanyle tel que défini ci-avant et l'un au moins des symboles R^ et R^Q représentant ou contenant un reste d'acide gras, suivie éventuellement du remplacement du radical R^ ou R (lorsqu’il représente ou contient un groupement protecteur de la fonction amine) par un atome d'hydrogène et des radi-20 eaux Rg et/ou R^ et/ou R^ (lorsqu'ils représentent ou contiennent un radical alcoyloxy ou alcoyloxycarbonyle contenant 1 a 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle) par un radical hydroxy ou carboxy selon les cas, dans les conditions décrites ci-dessus pour l'action d'un aminoacide de formule générale 25 (III) sur un tri- ou tétrapeptide de formule générale (iv)»
Selon la présente invention,les nouveaux peptides de formule générale (i) peuvent être obtenus par action d'un acide de formule générale : R"-CO-OH (IX) 30 (dans laquelle R"-C0- représente un reste d'acide gras tel que défini / ci-avant) sur un têtra- ou pentapeptide de formule générale î -v / / Z /'
iyZ
/.
! 11 R, „ -NH -CH -CO -NH -CH "CO -R0 Il | | 8 CHj CHjOHj-OO-NH-ÇM-Ej (X) (çh2)3 R^-NH-CH-R^ dans laquelle l'un des symboles ou R^ représente un atome d’hydrogène ou un radical carboxy, carbamoyle, alcoyloxycarbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone et est éventuellement substituée 5 par un radical phényle ou nitrophényle ou un reste N-carbonyl glycyle ou N-carbonyl d alanyle éventuellement estérifié par un radical alcoyle contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle et l’autre représente un atome d’hydrogène ou un radical carboxy, carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle dont la partie 10 alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone et est éventuellement substituée par un radical phényle ou nitrophényle, étant entendu que et R^ ne peuvent pas représenter simultanément un atome d’hydrogène,
Rg représente un radical hydroxy, amino ou alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou 15 nitrophényle, R^ représente un atome d’hydrogène, un reste d’acide gras, un groupement protecteur de la fonction amine ou un reste glycyle ou D alanyle dont la fonction amine libre est éventuellement substituée par un reste d’acide gras ou par un groupement protecteur de fonction amine et ‘ représente un atome d’hydrogène, un reste d’acide gras ou un grou- 20 pement protecteur de la fonction amine, étant entendu que l’un au moins des symboles R^ ou et R représente ou contient un reste glycyle ou D alanyle tel que défini ci-avant et que l’un au moins des symboles R10 et R11 rePr^sente un atome d’hydrogène ou, pour R , un radical glycyle ou D alanyle dont la fonction amine est libre, et que lorsque 25 l’un des radicaux R ou R^ représente ou contient un reste d’acide gras celui-ci et le reste R"-C0- sont identiques ou différents, suivis du remplacement du radical R ou R^ (lorsqu’il représente ou contient un groupement protecteur de la fonction amine) par un atome d’hydrogène et des radicaux Rg et/ou et/ou (lorsqu’ils représentent ou 30 contiennent un radical alcoyloxy ou alcoyloxycarbonyle contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou, nitrophényle) par un radical hydroxy ou carboxy selon les cas. /y / y ( 12
Lorsque, dans la formule générale (x), le symbole RQ repré-
O
sente un radical amino ou alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle et l’un s des symboles ou R^ représente un reste N-carbonyl glycyie ou N-carbonyl 5 D alanyle estérifié par un radical alcoyle contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle ou un radical alcoyloxycarbonyle contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle et l’autre représente un atome d’hydrogène ou un radical carbamoyle ou 10 alcoyloxycarbonyle contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle, la condensation de l’acide de formule générale (IX) est effectuée généralement en présence d'un agent de condensation tel que le dicyclohexylcarbodiimide en opérant dans un solvant organique tel que le chlorure de méthylène ou 15 le diméthylformamide, à une température comprise entre -10 et +30°C·
Lorsque, dans la formule générale (X), l’un des symboles R„ 8 représente ou contient un radical hydroxy et et/ou Rg représente ou contient un radical carboxy, il est nécessaire d'activer l’acide de formule générale (IX) préalablement à son action sur le tétra- ou penta-20 peptide de formule générale (X). Comme dérivé activé de l'acide de formule générale (IX) il est particulièrement avantageux d'utiliser un halogénure d'acide ou un anhydride mixte préparé in situ par action d'un halogénoformiate d'alcoyle, tel que le chloroformiate d'isobutyle, en présence d'une base· 25 Lorsque l'on utilise l'acide de formule générale (ix) sous forme d'halogénure d'acide, de préférence le chlorure, la réaction s'effectue dans un solvant organique tel que l'éther diéthylique ou le . chlorure de méthylène, en présence d'une base (minérale, telle que la soude, ou organique, telle que la triéthylamine), à une température · • 30 comprise entre 0 et 30°C.
v/ uf (' 13
Lorsque l'on utilise l'acide de formule générale (IX) sous forme d'un anhydride mixte, la réaction s'effectue dans un solvant organique tel que le dioxanne, le tétrahydrofuranne, le chloroforme, le toluène ou le diméthylformamide ou dans un milieu hydroorganique, en présence d'une base 5 (minérale, telle que la soude, ou organique, telle que la triéthylamine), à une température comprise entre -10 et +30°C.
Le remplacement éventuel des radicaux R^ et/ou R^ par un atome d'hydrogène et des radicaux Rg et/ou R^ et/ou R^ par un radical hydroxy ou carboxy selon lés oaes'effectue selon les méthodes connues indiquées précédemment.
10 Pour obtenir un produit de formule générale (I) dans laquelle R
représente un reste d'acide gras et Rg représente le reste du même acide gras ou un reste glycyle ou D alanyle dont la fonction amine est substituée par le reste du même acide gras, la condensation de l'acide de formule générale (IX) s'effectue sur un produit de formule générale (X) dans laquelle R^q représente 15 un atome d'hydrogène ou un reste glycyle ou D alanyle et R^ représente un atome d'hydrogène ou sur un produit de formule générale (X) dans laquelle représente ou contient un reste d'acide gras identique à celui de l'acide de formule générale (iX) mis en oeuvre et R^ représente un atome d'hydrogène ou bien sur un produit de formule générale (X) dans laquelle R1Q représente un 20 atome d'hydrogène ou un,reste glycyle ou D alanyle et R^ représente un reste d'acide gras identique à celui de l'acide de formule générale (IX) mis en oeuvre, en opérant dans les conditions habituelles.
Pour obtenir un produit de formule générale (i) dans laquelle les symboles R et Rg représentent ou contiennent des restes d'acides gras différents, 25 ü est nécessaire d'effectuer la condensation d'un acide de formule générale (IX) sur un produit de formule générale (X) dans laquelle R^q représente ou contient un reste d'acide gras différent de celui de l'acide de formule générale (IX) mis en oeuvre ou un groupement protecteur de la fonction amine et R^ repré-* sente un atome d'hydrogène ou bien sur un produit de formule générale (X) dans 30 laquelle R^Q représente un atome d'hydrogène ou un reste glycyle ou D alanyle et R^ représente un reste d'acide gras différent de celui de l'acide de formule générale (IX) mis en oeuvre ou un groupement protecteur de la fonction amine, puis, le cas échéant, après élimination de ce groupement protecteur, d'effectuer la condensation d'un autre acide gras de formule générale (IX), en opéranj/ 35 dans les conditions habituelles. / j/ u( i 14 L'aminoacide de formule générale (III) dans laquelle R^ représente un atome d'hydrogène ou un radical méthyle, R' représente un , radical hydroxy ou alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuel lement substitué par un radical phényle ou nitrophényle et R,. représente 5 un reste d'acide gras, peut être obtenu par action d'un acide de formule générale (IX) ou d'un dérivé activé de cet acide sur la glycine ou la D alanine dont la fonction acide est éventuellement protégée sous forme d'ester suivie, le cas échéant, de l'élimination du groupement protecteur de la fonction acide.
10 Que la fonction acide de la glycine ou de la D alanine soit protégée ou non, la condensation s'effectue dans les conditions indiquées précédemment pour la condensation de l'acide de formule générale (IX) sur le tétra- ou pentapeptide de formule générale (X).
Le tri- ou tétrapeptide de formule générale (IV) dans laquelle 15 l'un des symboles R^ et R^ représente un radical carboxy et l'autre représente un atome d'hydrogène ou un radical carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle, R^ représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine, R0 représente un radical amino ou
O
20 alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle et R représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine ou un reste glycyle ou D alanyle substitué par un reste d'acide gras ou par un groupement, protecteur de la fonction amine peut être obtenu par action, dans les 25 conditions habituelles, d'un dipeptide de formule générale (v), dans laquelle R et R sont définis comme ci-dessus, sur un aminoacide ou un 7 o dipeptide de formule générale (VI), dans laquelle R est défini comme ci-dessus et l'un des symboles ou représente un radical carboxy ou un radical alcoyloxycarbonyle contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuel-30 lement substitué par un radical phényle ou nitrophényle et l'autre représente un atome d'hydrogène ou un radical carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle, suivie le cas échéant du remplacement d'un des „ · Ί ' radicaux ou R^, lorsqu'il représente un radical alcoyloxycarbonyley (jr i ' 15 contenant 1 à 4 atomes de carbone (éventuellement substitué par un ‘ radical phényle ou nitrophényle) par un radical carboxy sans toucher au reste de la molécule.
En particulier, lorsque Rg forme avec le groupement carbo- 5 nyle auquel il est lié une fonction ester, et R^ et Rg représentent une
fonction ester, il peut être nécessaire que les radicaux R , R et RQ
o 4 y soient différents et choisis de telle manière que le remplacement d'un des radicaux R^ ou Rg par un radical carboxy s'effectue sans toucher au radical Rg et à l'autre radical ou Rg. Par exemple, l'un des 1 10 radicaux R^ ou Rg peut représenter un radical benzyloxycarbonyle élimi-nable par hydrogénolyse et le radical R et l'autre radical R. ou R0 o ty y un radical méthoxy qui n'est pas sensible à 1'hydrogénolyse·
Le tri- ou tétrapeptide de formule générale (IV) dans laquelle R^ représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur 15 de la fonction amine, Rg représente un radical amino ou alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un , radical phényle ou nitrophényle, l'un des symboles ou Rg représente un atome d'hydrogène ou un radical carboxy,carbamoyle, alcoyloxycarbonyle contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical 20 phényle ou nitrophényle ou N-carbonyl glycyle ou N-carbonyl D alanyle éventuellement estérifié par un radical alcoyle contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle et l'autre représente un atome d'hydrogène ou un radical carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuel-25 lement substitué par un radical phényle ou nitrophényle, R^ et Rg ne pouvant pas représenter simultanément un atome d'hydrogène et R^ représente un atome d'hydrogène peut être obtenu par action, dans les conditions habituelles, d'un dipeptide de formule générale (v) dans laquelle R et R sont définis comme ci-dessus sur un aminoacide ou un I o . 30 dipeptide de formule générale (VI) dans laquelle R^ et Rg sont définis comme ci-dessus et R^ représente un groupement protecteur de la fonction amine, suivie du remplacement de ce groupement protecteur par un atome d'hydrogène, sans toucher au reste de la molécule· En particulier les groupements protecteurs de la fonction amine définis pour R^ et R^Q / 35 doivent être différents et choisis de telle manière que le remplacement, / / / du radical par un atome d'hydrogène s'effectue sans toucher au r^djÿ*·. cal R7· / l/f 7 - 16
Le dipeptide de formule générale (v) peut être obtenu par action d’un dérivé activé de la L alanine de formule générale (VII) dans laquelle représente un reste d’acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine sur un dérivé de l’acide D glutamique de 5 formule générale : H_N-CH-CO-Rq 2 | θα)
CH2CH2-COOH
dans laquelle Rg représente un radical amino ou alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle, dans les conditions décrites ci-dessus pour l’action de 10 l’aminoacide de formule générale (Vil) sur le peptide de formule géné-, raie (VIII).
Le dipeptide de formule générale (V) dans laquelle Ry représente un reste d’acide gras peut aussi être obtenu par action d’un acide de formule générale (IX) sur un dipeptide de formule générale : 15 H0N - CH - GO - NH - GH - GO - R0 2 I 1 8 (xii)
CH3 CH2CH2C00H
dans laquelle Rg représente un radical amino ou alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle, dans les conditions décrites précédemment pour l’action d’un acide de formule générale (IX) sur un tétra- ou pentapeptide de formule générale (X).
20 L’aminoacide de formule générale (VI) dans laquelle R^ représente un radical carbamoyle, Rg représente un radical carboxy et R1Q représente un radical benzyloxycarbonyle sous forme mêso, et plus précisément le D monoamide de l’acide benzyloxycarbonyl-(D)-méso-diamino-2,6 pimélique, peut être préparé selon le procédé décrit dans le brevet belge 821 385.
25 L’aminoacide ou le dipeptide de formule générale (VI) dans laquelle R^ représente un radical carbamoyle, Rg représente un radical carboxy et R^Q représente un reste d’acide gras, un groupement protecteur de la fonction amine ou un reste glycyle ou D alanyle dont la fonction amine est substituée par un reste d’acide gras ou par un groupement protecteur de fonction amine, sous ‘ 30 forme racémique , D,D ou L,L peut être préparé à partir de l’acide diamino-2,6 pimélique correspondant. A cet effet on prépare selon les méthodes connues l’ester dibenzylique de l'acide dibenzyloxycarbonylamino-2,6 pimélique, qui est monosaponifié selon la méthode décrite par A. ARENDT et coll., Roczniki Ghemii Ann. Soc. Ghim. Polonorum, 48, 1305 (1974), [Chem. Abstr·, 82, 31497g r
!/J
i// 17 (1975)] puis transformé par action du méthanol ammoniacal en monoamide de formule générale :
Z - NH - GH - GOOH
(GH2)3 (XIII) Z - NH - GH - CONH2 (dans laquelle Z représente le radical benzyloxycarbonyle) qui, après hydrogéno-5 lyse en présence de palladium sur noir, fournit l’acide diamino-2,6 piméla-mique.
Par action d’un sel de cuivre, tel que le bromure cuivrique ou le carbonate basique de cuivre, sur l’acide diamino-2,6 pimélamique, il se forme un complexe qui peut être représenté par la formule : l0 H2N - GH - C0NH2 (CH,), I 2 3 H2N - GH - COp ; Gu/ (XIV)
dco - CH -'NIL
I 2 (0h2)3 H2N - CO - CH - NH2 dans lequel le reste amino en a du groupement carbamoyle peut être acylé par action d’un dérivé activé d’un acide de formule générale (IX) ou d’un amino -acide de formule générale (III) dans laquelle représente un reste d’acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine et R* représente un 15 radical hydroxy, ou protégé par action d'un halogénoformiate d’alcoyle ou de benzyle. Le complexe ainsi formé est déplacé par action de l’hydrogène sulfuré pour donner 1’aminoacide ou le dipeptide de formule générale (VI) dans laquelle - Rg représente un radical earboxy, R^ représente un radical carbamoyle et R^q est défini comme ci-dessus.
20 Pour obtenir un produit de formule générale (VI) dans laquelle R^ représente un radical earboxy, Rg représente un radical carbamoyle et R^q représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine ou un reste glycyle ou D alanyle dont la fonction amine est substituée par un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la 25 fonction amine, on protège la fonction amine en a du groupement carbamoyle du produit de formule générale (XIV) par action d'un halogénoformiate A / // L//f { ' ίϋ d'alcoyle ou de benzyle. Le complexe ainsi formé est déplacé par action de l'hydrogène sulfuré pour donner 1'aminoacide de formule générale (VI) dans laquelle représente un radical carbamoyle, Rg représente un radical carboxy et R^ représente un groupement protecteur de la fonction amine.
5 Le radical amino en a du groupement carboxy peut être protégé par un groupement protecteur ou acylé par action d'un dérivé activé d'un acide de formule générale (IX) ou d'un aminoacide de formule générale (ill) dans laquelle R^ représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine et R' représente un radical hydroxy. Après 10 remplacement du radical R^ par un atome d'hydrogène par des méthodes qui ne touchent pas au reste de la molécule, on obtient le produit de formule générale (VI) dans laquelle représente un radical carboxy, Rg représente un radical carbamoyle et R^ représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine ou un reste glycyle ou 15 D alanyle dont la fonction amine est substituée par un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine.
L'aminoacide ou le dipeptide de formule générale (VI) dans laquelle représente un radical carbamoyle, Rg représente un radical carboxy et R^ représente un reste d'acide gras ou un groupement protec-20 teur de la fonction amine ou un reste glycyle ou D alanyle dont la fonction amine est substituée par un reste d'acide gras ou par un groupement protecteur de la fonction amine, sous forme méso, dans lequel l'atome de carbone porteur des radicaux R^ et R10 est sous forme D, peut être préparé par action d'un dérivé activé d'un acide de formule générale (IX) ou d'un 25 aminoacide de formule générale (III) dans laquelle R^ représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine ou d'un halogénoformiate d'alcoyle ou de benzyle sur le complexe cuivrique du (D) monoamide de l'acide méso-diamino-2,6 pimélique (obtenu à partir du (D) monoamide de l'acide benzyloxycarbonyl-(D) méso-diamino-2,6 pimélique 30 par hydrogénolyse).
L'aminoacide ou le dipeptide de formule générale (Vl) dans laquelle R^ représente un radical carboxy, Rg représente un radical carbamoyle et R^ représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine ou un reste glycyle ou D alanyle dont la fonction 35 amine est substituée par un reste d'acide gras ou par un groupement ^ protecteur de la fonction amine, sous forme méso, dans lequel l'atome ! / 19 carbone porteur des radicaux et R^ est sous forme L, peut être préparé par action d'un réactif de blocage de la fonction amine ou d'un dérivé activé d'un acide de formule générale (XX) ou d'un aminoacide de formule générale (III) dans laquelle R^ représente un reste d'acide gras ou un 5 groupement protecteur de la fonction amine sur le (D) monoamide de l'acide benzyloxycarbonyl-(D) méso-diamino-2,6 pimélique, suivie du remplacement du radical benzyloxycarbonyle par un atome d'hydrogène sans toucher au reste de la molécule.
L1aminoacide, di- ou tripeptide de formule générale (Vl), dans 10 laquelle R^ représente un radical carbamoyle, Rg représente un radical alcoyloxycarbonyle contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle ou un reste N-carbonyl-glycyle ou N-carbonyl-D alanyle éventuellement estérifié par un radical alcoyle contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un 15 radical phényle ou nitrophényle et représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de fonction amine ou un reste glycyle ou D alanyle dont la fonction amine est substituée par un reste d'acide gras ou par un groupement protecteur de fonction amine, peut être obtenu par action dans les conditions habituelles d'un aminoacide de 20 formule générale (III) dans laquelle R,. représente un atome d'hydrogène, ou d'un aminoester correspondant, ou d'un alcool aliphatique contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle ou de ses dérivés, sur un aminoacide ou un dipeptide de formule générale :
Y - NH - CH - C00H
25 <f2)3 (W> R ~ m ~ CH - COHHj dans laquelle R^ est défini comme ci-dessus et Y représente un groupement protecteur de fonction amine, en opérant dans les conditions habituelles suivie du remplacement du groupement protecteur Y par un atome d'hydrogène et éventuellement du groupement ester (porté par le reste glycyle ou - 30 D alanyle) par un radical hydroxy, sans toucher au reste de la molécule.
En particulier lorsque RlQ représente ou contient un groupement protecteur de fonction amine, il importe de choisir Y de telle manière que son / remplacement par un atome d'hydrogène s'effectue sans toucher au / / radical R_„. / // 10 / // \S</j i 20
Le di- ou tripeptide de formule générale (VI) dans laquelle R^ représente un radical carbamoyle, RQ représente un radical alcoyloxy- y carbonyle contenant 1 à 4 atomes de carbone et éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle ou un reste N-carbonylglycyle ou 5 N-carbonyl D alanyle éventuellement estérifié et représente un reste d'acide gras ou un reste glycyle ou D alanyle dont la fonction amine est substituée par un reste d'acide gras ou par un groupement protecteur de fonction amine peut être obtenu par action dans les conditions habituelles d'un dérivé activé d'un acide de formule générale (IX) ou d'un aminoacide 10 de formule générale (ill), dans laquelle R^ représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine et R' représente un radical hydroxy sur un produit de formule générale : Y - NH - CH - RQ ( y (CH2)3 (XVI) NH2 - CH - C0NH2 dans laquelle R^ est défini comme ci-dessus et Y représente un groupement 15 protecteur de la fonction amine, en opérant dans les conditions habituelles, suivie du remplacement du groupement Y par un atome d'hydrogène sans toucher au reste de la molécule.
L'aminoacide, di- ou tripeptide de formule générale (VI) dans laquelle R? représente un radical carbamoyle, R^ représente un radical 20 alcoyloxycarbonyle contenant 1 à 4 atomes de carbone ou un reste N-carbonyl glycyle ou N-carbonyl D alanyle éventuellement estérifié par un radical alcoyle contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle et R représente un reste d’acide gras > ou un groupement protecteur de la fonction amine ou un reste glycyle ou 25 D alanyle dont la fonction amine est substituée par un reste d’acide gras ou par un groupement protecteur de la fonction amine peut être obtenu par action dans les conditions habituelles d'un aminoacide de formule générale (ïll) dans laquelle R^ représente un atome d'hydrogène et R' représente un radical hydroxy, ou d'un aminoester correspondant, ou d'un alcool 30 aliphatique contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle ou de ses dérivés, sur un amino-acide ou un dipeptide de formule générale : / / - U; !- i 21
Y-NH-CH-CONH
i 2 (pH (XVa)
R10-NH-CH-COOH
dans laquelle R est défini comme ci-dessus et y représente un groupement 1 protecteur de la fonction amine, en opérant dans les conditions habituelles suivie du remplacement du groupement protecteur Y par un atome d'hydro- 5 gène et éventuellement du groupement ester (porté par le reste glycyle ou D alanyle) par un radical hydroxy, sans toucher au reste de la molécule. En particulier lorsque R représente ou contient un groupement . protecteur de la fonction amine, il importe de choisir Y de telle manière que son remplacement par un atome d'hydrogène s'effectue sans toucher 10 au radical R^Q.
Lorsque l'on fait réagir l'aminoacide de formule générale (III) éventuellement estérifié sur l'aminoacide de formule générale (XVa) on opère dans les conditions connues qui permettent la création d'une liaison peptidique sans toucher au reste de la molécule. Lorsque l'ori 15 fait réagir un alcool aliphatique contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle, on opère dans des conditions douces d'estérification afin de ne pas toucher aux groupements protecteurs Y et R^Q et plus particulièrement selon la méthode de V. Bocchi, Synthesis i p.961 (1979).
20 Le di- ou tripeptide de formule générale (vi) dans laquelle Rç représente un radical carbamoyle, R^ représente un radical alcoyloxy-carbonyle ou un reste ’N-carbonyl glycyle ou N-carbonyl D alanyle éven- · tuellement estérifié et R^Q représente un reste d'acide gras ou un reste glycyle ou D alanyle dont la fonction amine est substituée par un reste 25 d'acide gras ou par un groupement protecteur de la fonction amine peut être obtenu par action dans les conditions habituelles d'un dérivé activé d'un acide de formule générale (IX) ou d'un aminoacide de formule générale (III), dans laquelle représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine et R' représente un radical ^ 30 hydroxy sur un aminoacide ou un dipeptide de formule générale :
Y-NH “CH “C0NHo / A
I 2 (XVIa) ,/
Li
h2n-ch-r4 A
22 dans laquelle R^ est défini comme ci-dessus et Y représente un groupement protecteur de la fonction amine, en opérant dans les conditions habituelles, suivie du remplacement du groupement Y par un atome d'hydrogène.
Les produits de formules générales (XVI) et (XVIa) peuvent être 5 obtenus selon les méthodes habituelles utilisées en chimie peptidique pour l'introduction d'un groupement protecteur de la fonction amine à partir d'un aminoacide ou d'un dipeptide de formule générale (VI) dans laquelle l'un des radicaux ou Rg représente un radical carbamoyle, et l'autre * représente un radical alcoyloxycarbonyle dont la partie alcoyle contient 10 1 à 4 atomes de carbone et est éventuellement substituée par un radical phényle ou nitrophényle ou un reste N-carbonyl glycyle, ou N-carbonyl D alanyle éventuellement estérifié et R^Q représente un groupement protecteur de la fonction amine, suivies du remplacement du groupement protecteur par un atome d'hydrogène sans toucher au reste de la molécule. En 15 particulier les groupements protecteurs des fonctions amines de l'acide diaraino-2,6 piraélamique seront différents et choisis de telle manière que le remplacement de R^^ n'entraîne pas le remplacement de Y.
Le di- ou tripeptide de formule générale (VI) dans* laquelle l'un des radicaux R^ ou représente un atome d'hydrogène et l'autre 20 représente un reste glycyle ou D alanyle et représente un reste d'acide gras ou un reste glycyle ou D alanyle dont la fonction amine est substituée par un reste d'acide gras ou par un groupement protecteur de la fonction amine peut être obtenu à partir de la L lysine en appliquant les méthodes utilisées pour la préparation du di- ou tripeptide de formule générale (VI) 25 dans laquelle Rg représente un radical carbamoyle et R^ et R^Q ont les définitions correspondantes.
L'aminoacide de formule générale (VII) dans laquelle R^ représente un reste d’acide gras peut être obtenu par action d’un acide de formule générale (IX) ou d’un dérivé activé de cet acide sur la L alanine 30 dont la fonction acide est éventuellement protégée sous forme d'ester, - suivie éventuellement du remplacement de la fonction ester par .la fonction carboxy, en opérant dans les conditions indiquées ci-dessus pour l’action de l'acide de formule générale (IX) sur le tétra- ou penta-peptide de formule générale (X)· 35 Le tri- ou tétrapeptide de formule générale (VIII) peut être obtenu par action, dans les conditions habituelles, d'un dérivé de l'acide / D glutamique de formule générale (XI) dont la fonction amine est protégée// et, dans laquelle Ra représente un radical'amino ou alcoyloxy contenant/ Jf U/i 23 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle, sur un di- ou tripeptide de formule générale (VI) dans i laquelle l’un des symboles R^ ou R^ représente un atome d’hydrogène ou un radical carboxy, carbamoyleou alcoyloxycarbonyle contenant 1 à 4 5 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle ou un reste N-carbonyl glycyle ou N- carbonyl D alanyle éventuellement estérifié par un radical alcoyle contenant 1 à 4 * atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle et l’autre représente un atome d’hydrogène ou un radical 10 carboxy, carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone- et est éventuellement substituée par un radical phényle ou nitrophényle, étant entendu que et R^ ne peuvent pas représenter simultanément un atome d’hydrogène et R représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de fonction amine ou un 15 reste glycyle ou D alanyle dont la fonction amine est substituée par un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de fonction amine (l'un au moins des symboles R^ ou R^ et R représentant un radical glycyle ou D alanyle tel que défini précédemment), suivie du remplacement éventuel du radical Rg et/ou R^ et/ou R^ (lorsqu'ils représentent ou contiennent 20 un radical alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle) par un radical hydroxy ou carboxy selon les cas^ sans toucher au reste de la molécule. Toutefois, lorsque Rg forme avec le groupement carbonyle auquel il est lié une fonction ester, et R et/ou RQ représentent une fonction ester, il peut être 25 nécessaire que les radicaux R et R et/ou Rn soient différents et choisis de telle manière que le remplacement d'un des radicaux R^ ou par un radical carboxy s'effectue sans toucher au radical RQ et à
O
l’autre radical R^ ou R^. Par exemple l’un des radicaux R^ ou R^ peut représenter un radical benzyloxycarbonyle, éliminable par hydrogénolyse ; 30 et le radical Rg un radical alcoxy et l’autre radical R^ ou R^ un ra dical alcoyloxycarbonyle qui ne sont pas sensibles à 1'hydrogénolyse.
Le tetra- ou pentapeptide de formule générale (X) peut être obtenu, dans les conditions habituelles, par action d'un dérivé activé de la L alanine de formule générale (Vil) dans laquelle R^ représente 35 un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction araire/ ih î# / ~ / 24 ‘ sur un tri- ou tétrapeptide de formule générale (VIII) dans laquelle
Rg représente un radical hydroxy, amino ou alcoyloxy contenant 1 à 4 - atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle, l'un des symboles ou représente un atome d'hydro-5 gène ou un radical carboxy, carbamoyle, alcoyloxycarbonyle contenant i à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle ou un reste N-carbonyl glycyle ou N-carbonyl D alanyle. éventuellement estérifié par un radical alcoyle contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitro-10 phényle et l'autre représente un atome d'hydrogène ou un radical carboxy, carbamoyle, alcoyloxycarbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone et est éventuellement substituée par un radical phényle ou nitrophényle, étant entendu que et R^ ne peuvent pas représenter simultanément un atome d'hydrogène, et R^ représente un 15 reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine ou un reste glycyle ou D alanyle dont la fonction amine est substituée par un reste d'acide gras ou par un groupement protecteur de fonction amine, étant entendu que l'un au moins des radicaux ou R^ et R^ représente un reste glycyle ou D alanyle tel que défini ci-avant et que l'un des 20 radicaux R^ ou R représente ou contient un groupement protecteur de fonction amine, suivie du remplacement du radical R^ et/ou R^Q (lorsqu'ils représentent ou contiennent un groupement protecteur de la fonction amine) par un atome d'hydrogène et du remplacement éventuel des radicaux R^ et/ou R^ et/ou R^ (lorsqu'ils représentent ou contiennent 25 un radical alcoyloxy ou alcoyloxycarbonyle contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle) r par un radical hydroxy ou carboxy se ..on les cas sans toucher au reste de la molécule. Lorsque les symboles R^ et R^q représentent ou contiennent des groupements protecteurs de fonction amine, il est possible de 30 choisir des groupements protecteurs différents et choisis de telle manière que le remplacement d'un de ces groupements s'effectue sans toucher à l'autre.
Lorsque R^, R^ et R^ forment une fonction ester, il est possible que les radicaux R , R et Rn soient différents et choisis de / 0 4· V / 35 telle manière que le remplacement d'un des radicaux R. ou R par un/
Hr y / / '
Uf / / - 25 „ radical carboxy s'effectue sans toucher au radical R0 et à l'autre
O
radical ou R^. Par exemple, l'un des radicaux ou R^ peut représenter un radical benzyloxycarbonyle éliminable par hydrogénolyse et le radical Rg un radical méthoxy et l'autre radical ou R^ un 5 radical alcoyloxycarbonyle qui ne sont pas sensibles à 1'hydrogénolyse.
Le tétra- ou pentapeptide de formule générale (X) peut être obtenu par action, dans les conditions habituelles, d'un dipeptide de formule générale (v) sur le di- ou tripeptide de formule générale (VI) dans les conditions données précédemment pour préparer le tri- ou tétra-10 peptide de formule générale (IV), suivie de l'élimination des groupements protecteurs R_ et/ou R„^ dans les conditions données ci-dessus.
La présente invention concerne également un procédé de préparation des produits de formule générale (I) par synthèse peptidique de Merrifield en phase solide.
15 Le procédé consiste essentiellement à fixer sur un support approprié un di- ou tripeptide de formule générale : R, „-NH-CH-Rn u j y (ch ) (XVII) R12-NH-CH-R4 dans laquelle l'un des symboles R^ et représente un radical carboxy ou N-carbonyl glycyle ou N-carbonyl D alanyle et l'autre représente un 20 atome d'hydrogène ou un radical carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone et est éventuellement ; substituée par un radical phényle ou nitrophényle, R^ représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine ou un radical glycyle ou D alanyle dont la fonction amine est substituée 25 Pa^ un reste d'acide gras ou par un groupement protecteur de la fonction amine et R ^ représente un groupement protecteur de la fonction amine, étant entendu que, lorsque et représentent ou contiennent j chacun un groupement protecteur de la fonction / / / / η.
4 26 amine, ces groupements protecteurs sont différents, puis, après déblocage de la fonction amine protégée par R^, à condenser : . - soit l’acide D glutamique dont les fonctions amine et α-carboxy sont convenablement protégées, c'est-à-dire le produit de formule générale :
R,--NH-CH-CO-RQ
5 13 j 8 (XVIII) ch2ch2-cooh dans laquelle R est défini comme ci-dessus et RQ représente un radical amino ou un radical alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle, puis, après déblocage de la fonction amine protégée par le radical R^» 10 - soit un dérivé de la L alanine de formule générale :
R. ,“NH”CH~C00H
| (XIX) CH3 dans laquelle est défini comme précédemment, puis après déblocage des fonctions amines protégées par et/ou R^> éventuellement l'acide gras de formule générale (IX), 15 - soit un dérivé de la L alanine de formule générale :
R-NH-CH-COOH
| (XX) CH3 dans laquelle R représente un reste d'acide gras, - soit le dipeptide de formule générale :
R, . -NH -CH -CO -NH -CH -CO -RQ
14 [ I <m)
CH3 CH2CH2-COOH
20 dans laquelle Rg est défini comme précédemment et R ^ représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine étant entendu que, lorsque R^ représente un groupement protecteur de la fonction amine, celui-ci peut être différent du groupement protecteur R^2 du peptide de formule générale (XVÏI) et que, on fait ensuite éventuellement réagir 25 l'acide de formule générale (IX) après déblocage des fonctions amines protégées par les radicaux R et/ou R , puis à séparer le produit obtenu ln1 /* de son support et à éliminer si nécessaire les groupements protecteurs <^èsyj fonctions amines et carboxy. i/f/ / / ' « 27 - Selon une variante du procédé, il est possible de fixer sur un support approprié le peptide de formule générale : . # R, c-NH-CH-CO-R0 15 | 8 CH.CH--CO-NH-CH-R.
22 | 9 OKU) γ2)3 R. .-NH-CH-R, 12 4 dans laquelle R^, Rg, R^ et R sont définis comme ci-dessus et R^ 5 représente un groupement protecteur de la fonction amine, étant entendu que lorsque R et Rj^ représentent ou contiennent chacun un groupement protecteur de la fonction amine, ces groupements protecteurs sont différents, puis, après déblocage de la fonction amine protégea par R^, de condenser : 10 - soit un dérivé de la L alanine de formule générale (XIX), puis, après déblocage des fonctions amines protégées par R^ et/ou R^, éventuellement l’acide gras de formule générale (IX), - soit un dérivé de la L alanine de formule générale (XX), puis à séparer le produit obtenu de son support et à éliminer, si nécessaire, les 15 groupements protecteurs des fonctions amines et carboxy·
Selon une autre variante du procédé, il est possible de fixer sur un support approprié le peptide de formule générale : R.,-NH-CH-GO-NH-CH-CO-R„ 16 | | 8 CH- CH-CH -CO-NH-CH-R.
3 2 2 I 9 (OH,), (Xml) I 2 3 .
ï R,--NH-CH-R, 12 4 dans laquelle R^, Rg, R^ et R^ sont définis comme ci-dessus et R^^ 20 représente un groupement protecteur de la fonction amine, étant entendu que, lorsque R et R^g représentent ou contiennent chacun un groupement protecteur de la fonction amine, ces groupements peuvent être différents, puis, après déblocage des fonctions amines protégées par et/ou R , de condenser l’acide de formule générale (IX), puis de séparer le produit / / 25 obtenu de son support et d'éliminer, si nécessaire, les groupements / j protecteurs des fonctions amines et carboxy.
28
La synthèse peptidique de Merrifield peut aussi être mise en oeuvre en fixant sur un support approprié un produit de formule géné-; raie (XVIII) ou (XXI) dans lesquelles R représente un radical hydroxy
O
et les symboles R^ et sont respectivement définis comme précédemment 5 et le radical γ-carboxy est protégé, puis, après déblocage du groupement protecteur puis activation de la fonction acide, en faisant réagir le di- ou tripeptide de formule générale (XVII) dont les fonctions amine et carboxy sont convenablement protégées, puis, le cas échéant, un acide de formule générale (IX)· 10 Lorsque dans la formule générale (i) l'un des symboles ou R^ représente un radical N-carbonyl glycyle ou N-carbonyl D alanyle et l’autre représente un atome d'hydrogène ou un radical carboxy, carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone et est substituée par un radical phényle ou nitrophényle, il 15 est possible de fixer sur un support convenable la glycine ou la D alanine dont la fonction amine est protégée, puis après déblocage de la fonction amine, de condenser un aminoacide ou un peptide de formule générale : R1 _ -NH -CH -Rn î / j y (j)H2)3 (XXIV) r12-Nh-ch-r4 20 dans laquelle R^ est défini comme précédemment et l'un des symboles R^ ou Rg représente un radical carboxy et l’autre représente un atome d’hydrogène ou un radical carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone et est éventuellement substituée par un radical phényle ou nitrophényle, et R représente un groupement 25 protecteur de la fonction amine ou un reste d'un D aminoacide de formule générale : R.«-NH-CH-CO-R0 18 I 8 (xxv)
CH2CH2-COOH
(- « 29 dans laquelle RQ est défini comme précédemment et R représente un ο 1 o groupement protecteur de la fonction amine ou un reste d'un L amino-acide de formule générale :
Rq-NH-CH-GOOH
19 I omn) ch3 5 dans laquelle représente un groupement protecteur de la fonction amine ou un reste d'acide gras défini précédemment, étant entendu que lorsque R^, R^g ou R^g représentent un groupement protecteur de la fonction amine» ce groupement est différent de R lorsque celui-ci X ù représente ou contient un groupement protecteur de la fonction amine» 10 R12 pouvant cependant être identique à R^, etï - lorsque R^ représente un groupement protecteur de la fonction amine» d'éliminer ce groupement protecteur» puis de condenser : - soit un dérivé de l'acide D glutamique de formule générale (XXV) dans laquelle R représente un groupement protecteur de la lo 15 fonction amine, puis, après élimination de R.0, de condenser un dérivé « lo de la L alanine de formule générale (XXVI) dans laquelle R^ est défini comme précédemment et,lorsque R Q et/ou R représente un groupement protecteur de la fonction amine, d'éliminer les radicaux R Q et/ou R , puis de condenser l'acide de formule générale (IX), 20 - soit un dérivé de l'acide D glutamique de formule géné rale (XXV) dans laquelle R^g représente un reste d'un L aminoacide de formule générale (XXVI) dans laquelle R^g est défini comme précédemment, et, lorsque R^g et/ou R représentent ou contiennent un groupement protecteur de la fonction amine, d'éliminer les radicaux R^g et/ou R^» 25 puis de condenser l'acide gras de formule générale (IX), - lorsque R^ représente un reste d'un aminoacide de formule générale (XXV) dans laquelle R représente un groupement protecteur de la lo fonction amine, d'éliminer ce groupement protecteur, puis de condenser un dérivé de la L alanine de formule générale (XXVI) dans laquelle R^g 30 est défini comme précédemment et, lorsque R^g et/ou représentent ou contiennent un groupement protecteur de la fonction amine, d'éliminer^ les radicaux R^g et/ou R , puis de condenser l'acide gras de formuly générale (IX), et Ak 7 « 30 - lorsque R représente un reste d’un aminoacide de formule générale (XXV) dans laquelle R représente un reste d’un L aminoacide de formule 1 o 1 générale (XXVI)* dans laquelle R _ représente un groupement protecteur iy de la fonction amine, d’éliminer les radicaux R^^ et/ou Pu*s 5 condenser l’acide gras de formule générale (IX).
Lorsque dans la formule générale (I), R^ représente un radical glycyle ou D alanyle dont la fonction amine est éventuellement substituée par un reste d'acide gras, l’introduction d’un tel radical peut être effectuée à n’importe quel stade de la synthèse Merrifield".
10 Par exemple, il est possible de fixer sur un support approprié le produit de formule générale (XVII) dans laquelle représente un groupement protecteur de la fonction amine différent de R^» puis d’éliminer R.0 sans loucher à R., et de condenser un dérivé de la glycine ou de la D alanine dont la fonction amine est substituée par un groupement 15 protecteur de la fonction amine ou un reste d’acide gras, puis, après élimination de R de condenser le produit de formule générale (XVIII) ou (XXI) dans les conditions indiquées précédemment, ou bien il est possible de fixer sur un support approprié le produit de formule générale (XVII) dans laquelle R représente un groupement protecteur de la 20 fonction amine, puis de condenser un produit de formule générale (XVIIl) ou (XXI) dans les conditions indiquées précédemment, puis, après élimination de R , de condenser la glycine ou la D alanine dont la fonction amine est substituée par un groupement protecteur de la fonction amine ou un reste d’acide gras· 25 Les supports qui conviennent particulièrement bien sont les copolymères styrène-divinylbenzène chlorométhylés ou hydroxyméthylés.
De préférence lef '.opolymère styrène-divinylbenzène (98-2 ou 99-1) chlorométhylé est utilisé.
La fixation des peptides de formule générale (XVII), 30 (XVIIl), (XXl),(XXIl) ou (XXIIl) sur le support chlorométhylé s'effectue selon les méthodes habituelles, en particulier, en faisant réagir le peptide de formule générale (XVII), (XVIIl), (XXI), (XXII) ou (XXIIl) en solution dans un solvant organique tel que l'éthanol et en présence d'un accepteur d'acide tel que la triéthylamine· Il est particulièrement 35 avantageux de chauffer le mélange réactionnel jusqu’à une température / voisine de la température d’ébullition du solvant. j,j'/ l· 31
Les groupements protecteurs des fonctions amines des peptides de formule générale (XVII), (XVÏIl), (XXI), (XXII) ou (XXIIl) doivent être choisis de telle manière que leur ^élimination s'effectue sans toucher à la liaison peptide support. En particulier les radicaux R^, 5 R^, R-J5 et doivent être différents du radical R^ lorsque ce dernier représente ou contient un groupement protecteur de la fonction amine et être tels que leur élimination s'effectue sans toucher au groupement protecteur R^ et à la liaison peptide-support.
Généralement les fonctions esters représentées par R^, Rg ou 10 sont choisies de telle manière que, lors de la coupure de la liaison peptide-support, les radicaux R , R ou R0 peuvent être soit conservés, H Ö 7 soit transformés en radicaux carboxy ou carbamoyle selon que la coupure sera une hydrolyse acide, un alcoolyse ou une ammonolyse.
Plus particulièrement, la liaison peptide-support, qui est 15 de nature benzylique, est coupée par traitement au moyen d'un mélange acide bromhydrique-acide trifluoroacétique en régénérant une fonction acide.
Les nouveaux tétra- ou pentapeptides de formule générale (II) peuvent être éventuellement purifiés par des méthodes physiques (telles 20 que la cristallisation ou la chromatographie) ou chimiques (telles que formation d'un sel, cristallisation de celui-ci puis décomposition).
Les nouveaux produits selon l'invention peuvent être transformés en sels d'addition avec les acides ou en sels métalliques ou en sels d'addition avec les bases organiques selon la nature des 25 substituants.
Les sels d'addition avec les acides peuvent être obtenus par action des nouveaux produits sur des acides dans un solvant approprié.
r Généralement on solubilise le produit dans l'eau par addition de la quantité théorique d'acide puis on lyophilise la solution obtenue. / / // /:/ r /1 32
Les sels métalliques ou les sels d'addition avec les bases organiques peuvent être obtenus par action des nouveaux composés sur ' des bases minérales ou organiques dans un solvant approprié. Généra lement on solubilise le produit dans l'eau par addition de la quantité 5 théorique de base puis on lyophilise la solution obtenue.
Les nouveaux composés selon la présente invention sont des adjuvants et des stimulants de l'immunité : ils augmentent les réactions d'hypersensibilité et/ou la production d'anticorps circulants vis-à-vis des antigènes avec lesquels ils sont administrés et ils 10 stimulent de manière non spécifique des réactions de défense contre certaines infections (par exemple l'infection de la souris par la bactérie intracellulaire Listeria monocytogenes)·
In vitro, ils sont actifs « des concentrations molaires ^ ' «3 “8 généralement comprises entre 10 et 10 , en particulier dans les tests 15 suivants ; - stimulation de la synthèse de l'ADN (pouvoir mitogène) selon la technique de G. MARCHAL, Ann. Immunol. (Inst. Pasteur), 125 C, 519 (1974).
- stimulation de la réaction allogénique (réaction d’histo-incompatibilité) selon la technique de R.W. DUTION, J. exp. Med., 122, 759 (1966) et 20 Α·Β· PEGK et F «H. BACH, J· Immunol. Methods, 3, 147 (1973) - stimulation de la production d'anticorps selon la technique de P.H. KLESIUS, Proc. Soc. exp. Biol. Med. (N.Y.), 135, 155 (1970) et H. VAN DIJK et N. BLOKSMA, J. Immunol. Methods, 14, 325 (1977) - augmentation du nombre de macrophages phagocytaires selon la technique 25 de J. MICHL et coli., J. exp. Med., 144, 1465 (1976) - stimulation de l'activité phosphatase acide et N-acétylglucosamidinase (enzymes lysosomiales des macrophages) ei l'absence d'une augmentation de la deshydrogénase lactique selon la technique de P. DAVIES et coll., J. exp. Med., 139, 1262 (1974).
30 In vivo, chez la souris, à des doses comprises entre 1 et 30 mg/kg, ils augmentent l'hypersensibilité retardée et la production d'anticorps en particulier selon la technique de T.E. MILLER et coll., J. Nath. Cancer Inst·, 51., 1669 (1973).
Chez le cobaye, ils augmentent la réaction d'hypersensibilité 35 et de production d'anticorps contre la gammaglobuline bovine couplée avec f l'haptène dinitrophéno 1 selon la technique de F. FLOC'H et coll., Immuno,!·/ Communie., 7, 41 (1978). /// 4 33
Chez la souris, ils stimulent les réactions de défense contre l'infection de la souris à Listeria monocytogenes à des doses comprises entre 1 et 100 mg/kg selon la technique de R.M. FAUVE et B. HEVIN, C.Rc Acad. Sei. (D), 285, 1589 (1977).
5 Chez la souris, ils stimulent le pouvoir d'élimination du carbone colloïdal par le système réticulo-endothélial suivant la technique de B.N. HALPERN et coll., Ann. Institut Pasteur, 80, 582 (1951).
Chez le lapin, à des doses généralement comprises entre 0,1 et 3 mg/kg, ils stimulent la formation d’anticorps sériques antivirus 10 grippal selon la technique de G.H. WERNER et coll., Biomedicine, 22, 4«) (1975).
D'un intérêt tout particulier sont les produits de formule générale (I) dans laquelle R représente un radical alcanoyle contenant 8 à 16 atomes de carbone, R^ représente un radical hydroxy, Rg 15 représente un radical carboxy ou alcoyloxycarbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone ou un reste N-carbonylglycyle ou N-carbonyl D alanyle, R^ représente un atome d'hydrogène ou un radical carbamoyle et représente un atome d'hydrogène ou un reste glycyle ou D alanyle.
20 Les exemples suivants, donnés à titre non limitatif, illustrent la présente invention.
Les produits selon la présente invention peuvent former des complexes avec les métaux alcalins ou alcalino-terreux ; il en résulte que les résultats de l'analyse élémentaire des produits peuvent 25 sensiblement s'écarter des valeurs théoriques. Cependant la structure des produits est confirmée par le rapport C/N qui est en accord avec la théorie, par la teneur en acides aminés, et par leur homogénéité en chromatographie sur couche mince de silicagel. /'/ / // ij/ * 34 EXEMPLE 1 -
On ajoute 0,27 cm3 de chloroformiate d’isobutyle à une solution, maintenue à -5°C, de 363 mg de N-t.butyloxycarbonylglÿcine dans 40 cm3 de tétrahydrofuranne et 0,29 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 5 20 minutes à -5°G, puis on ajoute une solution, refroidie à 5°G, de 1,26 g 2 de chlorhydrate décide N -(N-lauroyl L alanyl-y-D glutamyl) DD,LL diamino-2,6 pimélamique dans un mélange de 14,5 cm3 d’eau et de 6,2 cm3 de soude IN. Le mélange réactionnel est agité pendant 20 heures à une température vosine de 20°G· On évapore le tétrahydrofuranne par concentration sous pression réduite 10 (20 mm de mercure) à 40°G j le concentrât est refroidi vers 10°G, acidifié à pH 2 par addition d’acide chlorhydrique IN, puis extrait 4 fois par 400 cm3 au total d’acétate d’éthyle· Les phases organiques réunies sont lavées par 20 cm3 d’eau, séchées sur sulfate de magnésium et concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45°C· Le résidu ainsi obtenu est trituré 15 dans 50 cm3 d’éther jusqu’à pulvérisation totale· Après filtration et séchage sous pression réduite (20 mm de mercure), on obtient 1,11 g d’une poudre à laquelle on ajoute 440 mg d’un produit préparé dans les mêmes conditions et on chromatographie sur 77 g de gel de silice neutre (0,0635-0,20 mm) contenus dans une colonne de 2,3 cm de diamètre· On élue successivement par 120 cm3 20 d’acétate d’éthyle, 210 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-méthanol (9-1 en volumes), 120 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-méthanol (85-15 en volumes), 120 cm3 d’un mélange acétate d'éthyle-méthanol (8-2 en volumes), 90 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-méthanol (7-3 en volumes), 240 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-méthanol (6-4 en volumes) et 150 cm3 d'un mélange acétate 25 d’éthyle-méthanol (1-1 en volumes) en recueillant des fractions de 30 cm3. Les fractions 15 à 34 sont réunies, concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 40°G· Le résidu obtenu est trituré dans 50 cm3 d’éther, séparé r , 2
par filtration et séché· On obtient ainsi 1,12 g d'acide N -(N-lauroyl L
alanyl-y-D glutamyl)N-(N-t.butyloxycarbonylglycyl) DD,LL diamino-2,6 30 pimélamique.
Rf = 0,56 Csilicagel j n.butanol-pyridine-acide acétique-eau ^ (50-20-6-24 en volumes)].
2 6 On dissout 1,12 g d'acide N -(N-lauroyl L alanyl-y-D glutamyl)N - (N-t«butyloxycarbonylglycyl) DD,LL diamino-2,6 pimélamique dans 5 cm3 d’une 35 solution anhydre d’acide chlorhydrique 1,65 N dans l'acide acétique. On agite ß . a pendant 4 heures à une température voisine de 20°G puis on ajoute le milieu réctionnel à 100 cm3 d’éther anhydre. Le précipité blanc obtenu est sê^ûjfé par i Jf 35 filtration, lavé par 20 cm3 d'éther et séché sous pression réduite (20 mm de mercure)· On obtient ainsi 1,05 g d'une poudre blanche que l'on chromatographie sur une colonne de SephadeX G 15 (diamètre : 2 cm ; hauteur : 2 m). On élue ·' par de l'eau en recueillant des fractions de 14 cm3· Les fractions 26 à 29 5 sont réunies et lyophilisées. On obtient ainsi 0,5 g de chlorhydrate d'acide 2 6 N -(N-lauroyl L alanyl-y-D glutamyl) N -glycyl DD,LL diamino-2j6 pimélamique.
Rf = 0,29 Csilicagel J n.butanol-pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volumes)].
Analyse : Gale. % G 52,36 H 8,03 N 12, 63 10 Tr. 52,5 7,0 12,4
Après hydrolyse totale, l'analyse sur autoanalyseur Technicon révèle la présence des acides aminés suivants :
Ala 1,10 (théorie = l)
Dap 1,01 (théorie = 1) 15 Glu 1,12 (théorie = 1)
Gly 1,00 (théorie = l) L'acide N -(N-lauroyl L alanyl-y-D glutamyl) DD,LL diamino-2,6 pimélamique peut être préparé de la façon suivante : 0 1
On dissout 4,07 g d'acide N -Co -benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D
g 20 glutamyl] N -benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique dans 200 cm3 d’acide acétique. On ajoute 4 g de palladium sur noir (à 3 7. de palladium) et on fait passer un léger courant d'hydrogène pendant 7 heures. Après filtration et concentration à sec du filtrat sous pression réduite (20 mm de mercure) à 60°C, la meringue obtenue est reprise par 45 cm3 au total de méthylcyclohexane 25 et amenée chaque fois à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 60°C.
La poudre ainsi obtenue est séchée sous pression réduite (0,3 mm de mercure)
à 50°C. On obtient 2,76 g d'acide N2-(N-lauroyl L alanyl-y-D glutamyl) DD,LL
diamino-2,6 pimélamique.
Rf = 0,49 (silioagel ; aoide aoétique) 30 Analyse Calo $ C 5^,72 118,64 N 12,25
Tr 53,4 ô»5 10,9
Après hydrolyse totale, l'analyse sur autoanalyseur Technicon révèle la présence des acides aminés suivants :
Ala 1,00 (théorie = 1)
Dap 0,99 (théorie = 1)
Glu 1,05 (théorie = l). y L'acide N2-[o1-benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] N^- /y benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique peut être préparé de la fa^erf/ 36
On ajoute 3,17 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue vers 10°C, de 11,96 g de N-lauroyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle dans un mélange de 490 cm3 de dioxanne et de 3,43 cm3 de triéthylamine· La solution est agitée pendant 20 minutes vers 10°G, puis on ajoute une solution 6 5 de 8,87 g d’acide N -benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique à 88,8 % (dosage perchlorique) dans un mélange de 219 cm3 d’eau et de 24,4 cm3 de soude lN*Le mélange réactionnel est agité pendant 2 heures à une température voisine de 10°G puis pendant 15 heures à une température voisine de 20°G î il est ensuite filtré. Au filtrat, on ajoute 360 cm3 d’eau et on sépare par fil-10 tration un léger insoluble formé. Le filtrat est acidifié à pH 2 par addition de 49 cm3 d'acide chlorhydrique IN. Le précipité formé est séparé par filtration, lavé 3 fois par 750 cm3 au total d’eau et séché. On obtient ainsi 16,3 g d’une poudre blanche que l’on chromatographie sur 800 g de gel de silice neutre (0,0635-0,20 mm) contenus dans une colonne de 6 cm de diamètre. Pour 15 cela on dissout les 16,3 g de poudre dans 800 cm3 de raéthanol et à la solution obtenue, on ajoute 160 g de sable de Fontainebleau. On évapore à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure) à 60°C et le résidu ainsi obtenu est chargé sur la colonne de silice. On élue successivement avec 1 litre d’acétate d’éthyle, 4 litres d'un mélange acétate d’éthyle-méthanol (9-1 en volumes), 20 7 litres d’un mélange acétate d’éthyle-méthanol (85-15 en volumes) et 4 litres d’un mélange acétate d'éthyle-méthanol (1-1 en volumes) en recueillant des fractions de 250 cm3. Les fractions 45 à 60 sont réunies et concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 60°C» On obtient ainsi 9,4 g 2 1 6 d'acide N -Eo -benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] N -benzyloxycarbo- 25 nyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique.
Rf = 0,83 Esilicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volumes)].
Le N-lauroyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle peut être préparé « selon l’une des deux méthodes suivantes : 30 a) A une solution de 12,75 g de chlorhydrate de L alanyl-a-D gluta mate de benzyle dans 75 cm3 de soude ΙΝ,οη ajoute simultanément en 37 minutes, 8 g de chlorure de lauroyle dissous dans 75 cm3 d'éther et 37,4 cm3 de soude IN de façon à maintenir le pH du mélange réactionnel compris entre 8 et 9· Le mélange est agité pendant 1 heure 20 minutes. Après décantation, la phase 35 aqueuse est acidifiée à pH 2 par addition d’acide chlorhydrique IN (60 cm3) et extraite 3 fois par 300 cm3 au total d'acétate d'éthyle. Les extraits organiques /1 / ' 37 réunis sont lavés par 25 cm3 d’eau, séchés sur du sulfate de sodium anhydre et concentrés à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45°G· On obtient ainsi 7,4 g d’un solide blanc que l’on chromatographie sur 80 g de gel de silice neutre contenus dans une colonne de 2 cm de diamètre. On élue • 5 successivement par 100 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-méthanol (8-2 en volumes) et 200 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-méthanol (1-1 en volumes), en recueillant des fractions de 50 cm3. La fraction 1 est concentrée à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45°C. On obtient ainsi 2 g de N-lauroyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle fondant à 130°G. Les fractions 2 10 à 4 sont de même concentrées à sec et chromatographiées sur 100 g de gel de contenus silice neutre (o,063-0,20 mm)/dans une colonne de 2 cm de diamètre. On élue par 250 cm3 d’acétone en recueillant des fractions de 25 cm3. Les fractions 1 et 2 sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45°C. On obtient ainsi 4,07 g de N-lauroyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle 15 fondant à 130°G dont les caractéristiques sont les suivantes :
Rf = 0,9 Esilicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volumes)]
Analyse Cale. % G 66,10 H 8,63 N 5,71 Tr. 66,3 8,8 5,6 20 b) On ajoute 31 cm3 de chloroformiate d’isobutyle à une solution, maintenue à une température voisine de 10°C, de 47,75 g d’acide laurique dans 3 litres de dioxanne et 33,3 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à 10°G, puis on ajoute en 10 minutes une solution, refroidie à 10°G, de 88,95 g de chlorhydrate de L alanyl-a-D glutamate de benzyle, dans un 25 mélange de 1 litre de dioxanne, de 476 cm3 d’eau et de 476 cm3 de soude IN*
Le mélange réactionnel est agité pendant 1 heure à 10°C, puis pendant 18 heures à une température voisine de 20°G 5 il est ensuite dilué par addition de 4 litres d’eau, acidifié à pH 2 par addition d'acide chlorhydrique IN (environ 475 cm3) et conservé pendant 2 heures à 0°C. Le précipité obtenu est séparé 30 par filtration, lavé successivement par 500 cm3 d'eau et 500 cm3 d’éther, puis séché sous pression réduite (20 mm de mercure) à 20°C. Le produit est mis en suspension dans 800 cm3 d’éther, agité pendant 1 heure, séparé par filtration et lavé 2 fois par 200 cm3 au total d'éther. Après séchage sous pression réduite (20 mm de mercure) à 20°C, on obtient 71,79 g de N-lauroyl L alanyl-a-D 35 glutamate de benzyle fondant à 130°G. /
Rf = 0,77 Esilicagel J acétate d'éthyle-méthanol (4-1 en volumes).-]jt
/J
ψ / ' 38
Le chlorhydrate de L alanyl-a-D glutamate de benzyle peut être préparé de la façon suivante : ; On dissout 97,16 g de N-t.butyloxycarbonyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle dans 970 cm3 d’une solution anhydre d’acide chlorhydrique 1,7 N dans 5 l’acide acétique. On agite pendant 2 heures, puis on ajoute rapidement 3,8 litres d’éther anhydre et on laisse reposer pendant 2 heures à 0°C. Le précipité huileux qui s’est formé, séparé du surnageant par décantation, est dissous dans 500 cm3 d’acétone ; la solution ainsi obtenue est concentrée à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. On obtient ainsi 88,9 g de 10 chlorhydrate de L alanyl-a-D glutamate de benzyle.
Le N-t.butyloxycarbonyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle peut être préparé selon la méthode de E. BRICAS et coli·, Biochemistry 9, 823 (1970)· £ L'acide N -benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique peut être préparé de la façon suivante : 15 t A une solution de 9,7 g de dichlorhydrate de l’acide DD,LL diamino-2,6 pimélamique dans 63 cm3 d’eau amenée à pH 10 par addition de 37 cm3 de soude IN, on ajoute 4,35 g de bromure cuivrique dissous dans 44 cm3 d’eau. On agite le mélange réactionnel pendant 2 heures à 20°G environ. On sépare par filtration un léger insoluble, puis on refroidit le filtrat à une température comprise 20 entre -3°C et 0°G. On ajoute 9,2 g de bicarbonate de sodium et ensuite, goutte à goutte en 30 minutes, 7,9 cm3 de chloroformiate de benzyle.Le mélange réactionnel est agité pendant 18 heures à une température voisine de 20°C· Le * précipité bleu formé est séparé par filtration,lavé par 15 cm3 d'eau, 2 fois par 30 cm3 au total d'éthanol et 15 cm3 d’éther. Après séchage sous pression 25 réduite (20 mm de mercure) à 50°C, on obtient 9,6 g de complexe cuivrique de l’acide N -benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique que l’on ajoute à 60 cm3 d'acide chlorhydrique IN. On agite pendant 1 heure à une température voisine de 20°G. Un insoluble est séparé par filtration. Au filtrat, on ajoute 30 cm3 de méthanol puis on fait passer un courant d'hydrogène sulfuré 30 pendant 1 heure 1/2. On laisse reposer pendant 16 heures. La bouillie noire obtenue est filtrée, lavée 4 fois par 160 cm3 au total d’eau. Les filtrats réunis sont concentrés jusqu'à un volume de 30 cm3 sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°G, amenés à pH 9 par addition de 7,5 cm3 de triéthyl-amine, dilués par addition de 20 cm3 d'eau et amenés à pH 6 par addition de 35 5,5 cm3 d’acide chlorhydrique IN. La bouillie blanche ainsi obtenue est conservée à 0°C pendant 2 heures. Le produit qui se sépare par filtration est 1/ ( ' i 39 lavé successivement par 20 cm3 d’eau et 20 cm3 d’éthanol et séché sous près-sion réduite. On obtient ainsi 5,8 g d’acide N -benzyloxycarbony1 DD,LL diamino-2,6 pimélamique à 96 % (dosage perchlorique)·
Le dichlorhydrate de l’acide DD,LL diamino-2,6 pimélamique peut être 5 préparé de la façon suivante :
On dissout 83 g d’acide DD,LL dibenzyloxycarbonylamino-2,6 pimélamique dans un mélange de 1,6 litre de méthanol et de 14,6 cm3 d’acide chlorhydrique concentré (d = 1,19)· On ajoute 83 g de palladium sur noir (à 3 % de palladium) et on fait passer un courant d’hydrogène pendant 10 heures. Après filtration 10 et concentration à sec du filtrat sous pression réduite (20 mm de mercure) à 60°C, on obtient 40,5 g de dichlorhydrate de l’acide DD,LL diamino-2,6 pimélamique sous forme de meringue.
L'acide DD,LL dibenzyloxycarbonylamino-2,6 pimélamique peut être préparé de la façon suivante : 15 On dissout 168 g d’ester monobenzylique de l’acide DD,LL dibenzyloxy carbonylamino-2,6 pimélamique dans 1,68 litre de méthanol. On refroidit cette solution vers 0°G et on la sature d’ammoniac. Dès qu’elle est saturée, on la transvase dans 3 autoclaves de 1 litre. Après avoir fermé ces autoclaves, on les conserve pendant 40 heures à 20°C environ. Après dégazage, la solution 20 ainsi obtenue est concentrée sous pression réduite (20 mm de mercure) à 60°C.
Le résidu est dissous dans 2 litres d’eau et la solution obtenue est amenée à pH 2 par addition d’acide chlorhydrique 4N. Il se forme un précipité gommeux qu’on isole par décantation, triture avec 2 litres d’éther, sépare par filtration, lave 2 fois par 400 cm3 au total d’éther et 2 fois par 400 cm3 au total d’eau.
25 Après séchage, on obtient 83,5 g d’acide DD,LL dibenzyloxycarbonylamino-2,6 pimélamique fondant à 145-150°G.
Rf = 0,69 [silicagel ; n.butanol-éthanol-eau-ammoniaque concentrée (4-4-1-1 en volumes)].
Le monoester benzylique de l’acide DD,LL dibenzyloxycarbonylamino-2,6 - 30 pimélique peut être préparé selon la méthode de A.ARENDT et coll., Roczniki
Chemii Ann. Soc. Chim. Polonorum 48, 1305 (1974) [chem.Abstr., 82, 31497 g (1975)D< EXEMPLE 2 -
On ajoute 0,42 cm3 de chloroformiate d’isobutyle à une solution, maintenue à 0°C, de 557 mg de N-t.butyloxycarbonylglycîne dans un mélange de 35 60 cm3 de tétrahydrofuranne et de 0,45 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à 0°C, puis on ajoute une solution, refroidie à 0°C,.
/ ίί 40 de 1,68 g de N a-[N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] L lysine dans un mélange de 14 cm3 d’eau et de 6»36 cm3 de soude IN. Le mélange réactionnel est agité pendant 10 minutes à 0°C, puis pendant 18 heures à 20°G environ·
Il est ensuite concentré à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 5 40°C* Le résidu est repris par 60 cm3 d’eau amenée à pH 2 par addition d’acide chlorhydrique IN (7 cm3)· La phase aqueuse ainsi obtenue contenant un précipité huileux est extraite 4 fois par 200 cm3 au total d’acétate d’éthyle· Les phases organiques réunies sont lavées par 25 cm3 d’eau et séchées sur du sulfate de magnésium anhydre. Après concentration à sec sous pression réduite 10 (20 mm de mercure) à 40°C, on obtient 2,9 g d’un produit que l’on chromatographie sur une colonne de 2 cm de diamètre contenant 60 g de gel de silice neutre· On élue successivement par 150 cm3 d’acétate d’éthyle, 200 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-méthanol (95-5 en volumes), 50 cm3 d’un mélange acétate d'éthyle-méthanol (9-1 en volumes) et 300 cm3 d’un mélange acétate 15 d’éthyle-méthanol (8-2 en volumes) en recueillant des fractions de 50 cm3.
Les fractions 9 à 15 sont réunies, concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 40°G. On obtient ainsi 1,44 g de N a-[N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] N e-(t*butyloxycarbonylglycyl) L lysine·
Rf = 0,55 Csilicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau 20 (50-20-6-24 en volumes)]·
On dissout 1,44 g de N a-[N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] N q-(t.butyloxycarbonylglycyl) L lysine dans 22 cm3 d’une solution anhydre d’acide chlorhydrique 1,7 N dans l’acide acétique· On agite pendant 2 heures, puis on ajoute 220 cm3 d’éther anhydre· Le précipité obtenu est séparé par filtration, 25 lavé par 20 cm3 d’éther anhydre et séché sous pression réduite (0,15 mm de mercure) à 20°C* On obtient ainsi 1,31 g d’une poudre blanche que l’on dissout dans 5 cm3 d’eau et chromatographie sur Sephadex G 10 (colonne de 2,5 cm de diamètre et 2 m de hauteur). On élue par 400 cm3 d’eau en recueillant des fractions de 14 cm3· Les fractions 23 à 28 sont réunies et lyophilisées. Le 30 lyophilisât est dissous dans 50 cm3 d’eau et 1,5 cm3 d’acide chlorhydrique IN à nouveau lyophilisé· On obtient ainsi 710 mg de chlorhydrate de N a-[N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] N e-glycyl L lysine·
Rf = 0,25 [silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volumes)]· 35 Analyse Cale. % G 54,05 H 8,42 Cl 5,70 N 11,26 r
Tr. 54,0 7,9 5,4 11,2 / / / !/ Λ 41
Après hydrolyse totale, l'analyse sur autoanalyseur Technicon révèle la présence des acides aminés suivants :
Ala 0,99 (théorie =1) • , Glu 1,04 (théorie = l) 5 Gly 1,00 (théorie = 1) . Lys 0,97 (théorie = 1)
Le N cc-[N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] L lysine peut être préparé selon l’une des méthodes suivantes :
a) On dissout 1,77 g de N α-Εθ -benzyl N-(N-läuroyl L alanyl)-y-D
10 glutamyl] N g-benzyloxycarbonyl L lysine dans 177 cm3 de méthanol. On ajoute 1,77 g de palladium sur noir (à 3 % de palladium) puis on fait passer un léger courant d’hydrogène pendant 4 heures. Après filtration, concentraction à sec du filtrat, l’huile résiduelle est reprise par 20 cm3 d’acétone. On obtient ainsi 1,06 g d’un solide blanc que l’on recristallise dans un mélange d’éthanol 15 (12 cm3) et d’acétone (24 cm3). On obtient ainsi 0,9 g de N <x-[N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] L lysine fondant à 180-186°C (fusion pâteuse).
Rf = 0,29 Esilicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volumes)].
Analyse Cale. % C 59,07 H 9,15 N 10,60 20 Tr. 58,4 8,8 10,0 b) On dissout 2,65 g de N α-Εθ -benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] N g-benzyloxycarbonyl L lysinate de benzyle dans 265 cm3 d’acide acétique. On ajoute 2,65 g de palladium sur noir (à 3 % de palladium) et on fait passer un léger courant d’hydrogène pendant 3 heures. Après filtration et 25 concentration à sec du filtrat sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°G, on obtient 1,81 g de N a-EN-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] L lysine identique au produit obtenu sous a).
; Le N α-Εθ -benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] N e-benzyloxy- carbonyl L lysine peut être préparé de la façon suivante : 30 On ajoute 1,88 cm3 de chloroformiate d’isobutyle à une solution,
maintenue à 10°G, de 7,03 g de N-lauroyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle dans un mélange de 280 cm3 de dioxanne et 2,0 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à 10°G puis on ajoute une solution de 4,04 g de N g-benzyloxycarbonyl L lysine dans un mélange de 30 cm3 de dioxanne et de 35 14,4 cm3 de soude IN. Le mélangeréactionnel est agité pendant 20 heures à 18°G
environ. L’insoluble formé est dissous par addition de 280 cm3 d’eau. Lp.j / l· il j X.
42 solution obtenue est agitée encore pendant 1 heure, puis acidifiée à pH 3 par addition de 20 cm3 décide chlorhydrique IN.L’insoluble formé est séparé par filtration, lavé par 20 cm3 d’eau et séché sous pression réduite (0,3 mm de mercure) à 20°C· On obtient ainsi 7,72 g d’un solide blanc que l’on chromato--- 5 graphie sur une colonne de 3,5 cm de diamètre contenant 230 g de gel de silice neutre. On élue successivement par 700 cm3 d'un mélange acétone-cyclohexane (9-1 en volumes), 1,1 litre d’acétone et 1,7 litre de méthanol en recueillant des fractions de 100 cm3. Les fractions 22 à 35 sont réunies, concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45°C· On obtient ainsi 5,97 g de
«J
10 N a-Ü0 -benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] N s-benzyloxycarbonyl ' L lysine.
Rf = 0,84 [Silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volumes)].
La N e-benzyloxycarbonyl L lysine peut être préparée selon la méthode 15 de A. Neuberger et coli., Biochem. J., 37, 515 (1943).
Le N a-[N-(0 -benzyl N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] N g-benzyl-©xycarbonyl L lysinate de benzyle peut être préparé de la façon suivante :
On ajoute 0,65 cm3 de chloroformiate d’isobutyle à une solution, maintenue à -10°G, de 2,45 g de N-lauroyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle 20 dans un mélange de 80 cm3 de tétrahydrofuranne et 0,70 cm3 de triéthylamine.
Le mélange est agité pendant 20 minutes à -10°G puis on ajoute une solution, refroidie à -10°C, de 2,24 g de chlorhydrate de N e-benzyloxycarbonyl L lysinate de benzyle dans un mélange de 40 cm3 de tétrahydrofuranne et 0,77 cm3 de triéthylamine. Le mélange réactionnel est agité pendant 2 heures à -10°G, puis 25 pendant 2 jours à 20°C environ. On concentre ensuite le mélange réactionnel à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 40°C. Le solide blanc obtenu est repris dans 100 cm3 d'acétate d'éthyle à 40°G, trituré jusqu'à pulvérisation, séparé par filtration, trituré à nouveau dans 50 cm3 d’acide chlorhydrique 0,1 N, séparé par filtration et séché sous pression réduite (0,3 mm de •j 30 mercure). On obtient ainsi 2,69 g de N <x-Cn-(0 -benzyl N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] N e“benzyloxycarbonyl L lysinate de benzyle.
- Rf = 0,80 [silicagel ; acétate d'éthyle-méthanol (9-1 en volumes)].
Le N e-benzyloxycarbonyl L lysinate de benzyle peut être préparé selon la méthode de T. Shiba et coll·, Bull. Chem. Soc. Japan, 33, 1721 (I960). 35 EXEMPLE 3 -
On ajoute 0,48 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue vers -10°G, de 1,82 g de N-lauroyl L alanyl-a-D glutamate de benzylja / dans un mélange de 90 cm3 de tétrahydrofuranne et de 0,52 cm3 de triéthylajsine.
(9 43
Le mélange est agité pendant 20 minutes à -10°C, puis on ajoute une solution, refroidie à -10°C, de 1,74 g de N e-(benzyloxycarbonylglycyl) L lysinate de ; benzyle dans 90 cm3 de tétrahydrofuranne. Le mélange réactionnel est agité pendant 2 heures à une température comprise entre -10°C et 0°C, puis pendant 5 18 heures à 20°G environ. On obtient une masse réactionnelle d'aspect gélatineux que l'on concentre à sec sous pression réduite (20 ma de mercure) à 40°G· On reprend le résidu par un mélange de 50 cm3 d'acétate d'éthyle et de 50 cm3 d'eau, on agite, on sépare l'insoluble par filtration et le lave successivement 2 fois par 50 cm3 au total de soude N/lO et par 25 cm3 d'eau. Après séchage, l'insolu-10 ble est lavé 4 fois par 100 cm3 au total d'acétate d'éthyle à 20°G et puis par 25 cm3 d'acétate d'éthyle à 75°G et enfin séché. On obtient ainsi 1,51 g de N α-to -benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)-γ-D glutamyl] N e-benzyloxycarbonylglycyl) L lysinate de benzyle.
La phase acétate d'éthyle de lavage (125 cm3) est chargée sur une 15 colonne de 3 cm de diamètre contenant 150 g de gel de silice neutre. On élue par 835 cm3 d'acétate d'éthyle, 320 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (95-5 en volumes) et 400 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (90-10 en volumes) en recueillant des fractions de 40 cm3. Les fractions 34 à 38 sont réunies et concentrées à sec sous pression réduite (20 mm 20 de mercure) à 45°G. On obtient ainsi 0,42 g de N ct-[0 -benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)-γ-D glutamyl] N g-benzyloxycarbonylglycyl) L lysinate de benzyle.
Rf = 0,84 Esilicagel ; acétate d'éthyle-méthanol (8-2 en volumes)].
On dissout 1,93 g de N α-Co -benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)-γ-D glutamyl] N g-(benzyloxycarbonylglycyl) L lysinate de benzyle dans 100 cm3 25 d'acide acétique. On ajoute 1,93 g de palladium sur noir (à 3 % de palladium) et on fait passer un léger courant d'hydrogène pendant 2 heures. Après filtration et concentration à sec du filtrat sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°G, l'huile résiduelle est triturée dans 50 cm3 d'éther. On obtient un » précipité qui est séparé par filtration et est dissous dans 15 cm3 d'acide 30 acétique. Cette solution est filtrée, puis on ajoute au filtrat 100 cm3 d'éther. Après 30 minutes d'agitation le précipité obtenu est séparé par filtration.
Après séchage sous pression réduite (0,15 mm de mercure) à 20°C, on obtient 1,16 g de N a-[N-(N-lauroyl L alanyl)-γ-D glutamyl] N e-glycyl L lysine fondant à 140-142°G (fusion pâteuse). f / 35 Rf = 0,31 Esilicagel ; n.butanol-pyridine-acide acêtique-eau ^ (50-20-6-24 en volumes)]. t'f / * 44
Analyse Cale. 7= C 57,41 H 8,78 N .11,96 Tr. 55,3 8,6 11,2
Après hydrolyse totale, 1*analyse sur autoanalyseur Technïcon révèle la présence des acides aminés suivants : ^ 5 AÎa 1,00 (théorie = 1)
Glu 1,11 (théorie = 1)
Gly 1,00 (théorie = l)
Lys 0,95 (théorie = l).
Le N e-(N-benzyloxycarbonylglycyl) L lysinate de benzyle peut être 10 préparé selon la méthode de M. KHOSLA et coli·, J. Sei. Ind.Res. (India) 21 B, 318 (1962).
EXEMPLE 4 -
On ajoute 0,13 cm3 de chloroformiate d’isobutyle à une solution, maintenue à -10°C, de 491 mg de N-lauroyl L alanyl-ct-D glutamate de benzyle 15 dans un mélange de 25 cm3 de tétrahydrofuranne et de 0,14 cm3 de triéthylamine.
Le mélange est agité pendant 10 minutes à -10°G puis on ajoute une solution, refroidie à 0°C, de 337 mg de N e-(benzyloxycarbonylglycyl) L lysine dans 25 cm3 de tétrahydrofuranne et 1 cm3 de soude IN.Le milieu réactionnel est agité pendant 2 heures à l0°G, puis pendant 20 heures à une température voisine 20 de 20°C. Il est ensuite acidifié à pH 1 par addition de 2 cm3 d'acide chlorhydrique IN.On évapore le tétrahydrofuranne sous pression réduite (20 mm de mercure) a 40°C. La solution aqueuse restante est extraite par 50 cm3 d’acétate d’éthyle, la phase organique est lavée 2 fois par 20 cm3 au total d’acide chlorhydrique 0,1 N et 10 cm3 d’une solution saturée de chlorure de sodium et séchée sur 25 sulfate de magnésium anhydre. Après concentration à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 40°C on obtient 600 mg d’un solide blanc qui est chromato-? graphié sur une colonne de 2 cm de diamètre contenant 30 g de gel de silice neutre. On élue successivement par 60 cm3 d’acétate d’éthyle, 100 cm3 d’un - mélange acétate d’éthyle-méthanol (9-1 en volumes), 60 cm3 d’un mélange acétate 30 d’éthyle-méthanol (8-2 en volumes) et 80 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle- méthanol (1-1 en volumes) en recueillant des fractions de 20 cm3. Les fractions 10 à 13 réunies sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45°C. On obtient ainsi 430 mg de N a-[0 -benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] N g-(benzyloxycarbonylglycyl) L lysine. / 35 Rf = 0,77 Esilicagel ; n.butanol-acide acétique-eau (7-1-2 en/y/ volumes)]. /// / i/r 45
J
On dissout 420 mg de N α-Co -benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] N e-(benzyloxycarbonylglycyl) L lysine dans 25 cm3 de méthanol. On ajoute 420 mg de palladium sur noir (à 3 7= de palladium) et on fait passer un léger courant d’hydrogène pendant 3 heures· Après filtration et concentration 5 à sec du filtrat, on obtient 270 mg de N a-ÜN-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] N e-glycyl L lysine.
Le N g-(benzyloxycarbonylglycyl) L lysine peut être préparé selon la méthode de D. THEODOEOPOULOS J. Org. Chem, 23, 140 (1958).
EXEMPLE 5 - 10 On ajoute 1,2 cm3 de chloroformiate d’isobutyle à une solution, maintenue à 10°C, de 4*42 g de N-lauroyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle dans un mélange de 180 cm3 de dioxanne et de 1,3 cm3 de triéthylamine. La solution est agitée pendant 20 minutes à une température voisine de 10°C, puis on ajoute une solution, refroidie à 10°G» de 4,09 g de chlorhydrate de 15 N e-benzyloxycarbonyl L lysyl-D alaninate de benzyle dans un mélange de 30 cm3 de dioxanne, de 5 cm3 d’eau et de 1,3 cm3 de triéthylamine. Le mélange réactionnel est agité pendant 20 heures à une température voisine de 20°C. On ajoute ensuite 500 cm3 d’eau et on refroidit le mélange à 0°G. Après 2 heures à 0°G, l’insoluble est séparé par filtration, lavé par 100 cm3 d’eau et séché. On 20 obtient ainsi 7,86 g de N α-Co -benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] N g-benzyloxycarbonyl L lysyl-D alaninate de benzyle.
Rf =0,92 Lsilicagel ; acétate d’éthyle-méthanol (4-1 ën volumes)]·
On dissout 7»80 g de N α-Co*-benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] N g-benzyloxycarbonyl L lysyl-D alaninate de benzyle dans un mélange 25 de 250 cm3 de méthanol et de 530 cm3 de dioxanne. On ajoute 7,80 g de palladium sur noir (à 3 % de palladium) et on fait passer un léger courant d’hydrogène pendant 5 heures. On observe une cristallisation sur le palladium sur noir.
Le catalyseur est séparé par filtration, lavé par 100 cm3 d’un mélange méthanol-- dioxanne (1-2 en volumes) puis par 5 fois 500 cm3 au total de méthanol entraînant 30 ainsi le produit cristallisé. La phase méthanolique est concentrée à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. On obtient 1,5 g d’une poudre qui est chromatographiée sur une colonne de Sephadex LH 20 (diamètre : 2 cm ; hauteur î 2 m). On élue avec du méthanol en recueillant des fractions de 5 cm3. Les fractions 41 à 69 sont réunies et concentrées à see sous pression réduite 35 (20 mm de mercure) à 50°C. On dissout le résidu dans 50 cm3 de méthanol bouillant / /
(J
l v 46 puis on ajoute 120 cm3 de dioxanne. On laisse revenir à une température voisine de 20°C· Après 5 jours de repos, le précipité apparu est séparé par filtration, lavé par 10 cm3 de dioxanne puis séché sous pression réduite (o,2 mm de mercure) à 60°C· On obtient ainsi 1,37 g de N a-[N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] - 5 L lysyl-D alanine„fondant à 170°G (fusion pâteuse).
Rf = 0,26 [silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volumes)!.
Analyse Cale. % C 58,07 H 8,91 N 11,68 Tr. 57,4 8,9 11,4 10 Après hydrolyse totale, l’analyse sur autoanalyseur Technicon révèle la présence des acides aminés suivants :
Ala 2,00 (théorie = 2)
Glu 1,04 (théorie =1)
Lys 1,01 (théorie = l).
15 Le chlorhydrate de N e-benzyloxycarbony1 L lysyl-D axaninate de benzyle peut être préparé selon la méthode de S. KUSIMOTO et coll·, Bull. chem. Soc. Japan, 49, 533 (1976).
EXEMPLE 6 -
On ajoute 1,3 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une.solution, 20 maintenue à 10°C, de 4,91 g de N-lauroyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle dans un mélange de 200.cm3 de dioxanne et de 1,4 cm3 de triéthylamine. La solution est agitée pendant 20 minutes à une température voisine de 10°C, puis on ajoute une solution de 4,64 g de chlorhydrate de N g-benzyloxycarbony1 L lysyl-glyci-nate de benzyle dans un mélange de 30 cm3 de dioxanne, de 5 cm3 d’eau et de 25 1,4 cm3 de triéthylamine.Le mélange réactionnel est agité pendant 20 heures à 20°C environ. On verse ensuite le mélange réactionnel dans 500 cm3 d'eau. L’insoluble formé est séparé par filtration, lavé par 50 cm3 d'eau puis séché. On obtient ainsi 8,94 g d'une poudre blanche qui est dissoute d?ns 500 cm3 de diméthylformamide à 60°C. On ajoute 500 cm3 d’eau. Après refroidissement à 0°C 30 l’insoluble est séparé par filtration, essoré, lavé avec 100 cm3 d’eau puis séché. On obtient ainsi 6,26 g de N α-Lo -benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] N s-benzyloxycarbony1 L lysyl-glycinate de benzyle.
Rf =0,89 [silicagel ; acétate d'éthyle-méthanol (5-1 en volumes)]^/ i// UΊ 7 47
On dissout 6,20 g-de N ct-Eo^-benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)-y~D glutamyl] N e~benzyloxycarbonyl L lysyl-glycinate de benzyïe dans un mélange à 60°G de 425 cm3 de dioxanne et de 125 cm3 de méthanol. On refroidit la solution à 40°C, on ajoute 6,20 g de palladium sur noir (à 3 % de palladium) 5 puis on fait passer un courant d’hydrogène pendant 4 heures. Après filtration et concentration à sec du filtrat sous pression réduite (20 mm de mercure) à ' 50°C, on obtient 5,44 g d’un mélange contenant encore du produit de départ. Le résidu est dissous dans un mélange à 60°C de 1 litre de méthanol et de 200 cm3 de dioxanne. On refroidit la solution à 30°G, on ajoute 5,44 g de palladium 10 sur noir (à 3 % de palladium) et on fait passer un courant d’hydrogène pendant 4 heures. On filtre le mélange réactionnel, on lave le filtre 2 fois par 200 cm3 au total de méthanol et 4 fois par 800 cm3 au total de méthanol bouillant. La phase de lavage obtenue avec le méthanol bouillant est concentrée à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 40°C. Le résidu obtenu est trituré dans 15 100 cm3 d’éther jusqu’à pulvérisation. Après séparation de la poudre par filtration et séchage, on obtient 1,74 g de N a-CN-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] L lysyl-glycine fondant à 165-170°C (fusion pâteuse).
Rf = 0,39 [silicagel ; méthanol]
Analyse Gale. % G 57,41 H 8,78 N 11,96 20 Tr. 57,4 9,1 11,8
Après hydrolyse totale, l’analyse sur autoanalyseur Technicon révèle la présence des acides aminés suivants :
Ala 1,00 (théorie = l)
Glu 1,01 (théorie = l) 25 Gly 1,01 (théorie = 1)
Lys 0,84 (théorie = 1)
Le chlorhydrate de N e-benzyloxycarbonyl L lysyl-glycinate de benzyle peut être préparé selon la méthode de V. Bondar et coll·, Dokl. Akad.
Nauk. Tadzh. SSR 13 14 (1970), (Chem. Abstr. 73., 66884 e).
30 EXEMPLE 7 -
On ajoute 0,85 cm3 de chloroformiate d’isobutyle à une solution, maintenue à -4°C, de 1,67 g de N-lauroyl glycine dans 150 cm3 de tétrahydro-furanne et 0,91 cm3 de triéthylamine. La solution est agitée pendant 20 minutes à -4°C puis on ajoute une solution, refroidie à 2°C, de 3,74 g de N a-[N-(N-t.
35 butyloxycarbonyl L alanyl)-γ-D glutamyl] L lysine dans un mélange de 50 cm3 de tétrahydrofuranne et de 13 cm3 de soude IN. Le mélange réactionnel est agité pendant 1 heure à 0°C, puis pendant 18 heures à 20°C environ. On évapore ensuite le tétrahydrofuranne par concentration sous pression réduite (20 mm ne mercure) à 40°G ? le concentrât est dilué par addition de 50 cm3 d’eau, acidifié
F
48 à pH 2 par addition d’acide chlorhydrique IN. L’insoluble est séparé par filtration, lavé par 50 cm3 d’eau puis séché. On obtient ainsi 5,8 g d’une poudre qui est chromatographiée sur une colonne de 12 mm de diamètre contenant 50 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue successivement par 220 cm3 / 5 d’acétate d’éthyle, 120 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-methanol (95-5 en volumes), 80 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-méthanol (9-1 en volumes), 180 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-méthanol (8-2 en volumes), 100 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-méthanol (7-3 en volumes) et 60 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-méthanol (l-l en volumes) en recueillant des fractions de 10 20 cm3 · Les fractions 21 à 38 réunies sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. On obtient ainsi 780 mg d’une poudre à laquelle on ajoute 270 mg d’un produit préparé dans les memes conditions et on dissout l’ensemble dans 25 cm3 de méthanol contenant 5 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm)* On concentre à sec le mélange et on charge l’ensemble 15 sur une colonne de 12 mm de diamètre contenant 50 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue successivement par 200 cm3 d’acétate d’éthyle, 200 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-méthanol (98-2 en volumes), 560 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-méthanol (96-4 en volumes), 680 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-méthanol (9-1 en volumes) et 280 cm3 de méthanol en recueillant des 20 fractions de 40 cm3* Les fractions 43 et 44 réunies sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. On obtient ainsi 850 mg de N a-ÜN-(N-t.butyloxycarbonyl L alanyl)-γ-D glutamyl] N g-(N-lauroyl glycine) L lysine*
Rf = 0,50 [Silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volumes)].
25 On dissout 830 mg de N a-CN-(N-t.butyloxycarbonyl L alanyl) -γ-D
glutamyl] N e-(N-lauroyl glycyl) L lysine dans 20 cm3 d’une solution anhydre d’acide chlorhydrique 1,7 N dans l’acide acétique* On agite pendant 2 heures, on ajoute ensuite 100 cm3 d’éther. Le précipité obtenu est séparé par filtration, r lavé par 50 cm3 d’éther et séché sous pression réduite (0,2 mm de mercure) à 30 50°G* On obtient ainsi 790 mg de chlorhydrate de N α-ÜN-L alanyl-γ-D glutamyl] N g-(N-lauroyl glycyl) L lysine.
Rf = 0,34 Csilicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volumes)].
49
Après hydrolyse totale, l’analyse sur autoanalyseur Technicon révèle la présence des acides aminés suivants :
Ala 1,04 (théorie = 1)
Glu 1,02 (théorie = 1) 5 Gly 1,00 (théorie = 1)
Lys 1,00 (théorie = 1)
Le N a-[N-(N-t.butyloxycarbonyl L alanyl)-y- D glutamyl] L lysine peut être préparé de la façon suivante : i
On dissout 4,95 g de N «-(0 -benzyl N-t .butyloxycarbonyl L alanyl)-10 γ-D glutamyl] N e benzyloxycarbonyl L lysinate de benzyle dans 250 cm3 d’acide acétique. On ajoute 4,95 g de palladium sur noir (à 3 % de palladium) et on fait passer un léger courant d’hydrogène pendant 2 heures. Après filtration et concentration à Sec du filtrat sous pression réduite (0,2 mm de mercure), on obtient 3,74 g de N a-[N-(N-t.butyloxycarbonyl L alanyl)-y-D glutamyl L lysine.
15 Rf = 0,20 [silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volumes)]
Le N a-[0*- benzyl N-(N-t.butyloxycarbonyl L alanyl)-y-D glutamyl] N g-benzyloxycarbonyl L lysinate de benzyle peut être préparé de la façon suivante: On ajoute 1,95 cm3 de chloroformiate d’isobutyle à une solution, 20 maintenue à -10°C, de 6,13 g de t.butyloxycarbonyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle dans 200 cm3 de tétrahydrofuranne et 2,1 cm3 de triêthylamine. La solution est agitée pendant 20 minutes à -10°G puis on ajoute une solution de 6,71 g de chlorhydrate de N g-benzyloxycarbonyl L lysinate de benzyle dans 100 cm3 de tétrahydrofuranne et 2,3 cm3 de triêthylamine. Le mélange réactionnel est 25 agité pendant 30 minutes à -5°C, puis pendant 66 heures à 20°G environ. Le mélange réactionnel est ensuite concentré à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 30°G. On obtient ainsi 15,95 g d’une huile qui est chromatographiée sur une colonne de 3 cm de diamètre contenant 150 g de gel de silice neutre (0,063-0,20 mm). On élue successivement par 400 cm3 d’un mélange acétate _ 30 d*éthyle-cyclohexane (4-6 en volumes), 240 cm3 d’un mélange acétate d’êthyle-cyclohexane (6-4 en volumes) et 560 cm3 d’acétate d’éthyle en recueillant des fractions de 40 cm3. Les fractions 15 à 23 réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 40°C, On obtient ainsi 9,25 g d’une huile cristallisant partiellement qui est dissoute dans 40 cm3 d’acétate d’éthyle ji 35 45°C. On ajoute 100 cm3 de cyclohexane. On laisse revenir à une température/ | 50 voisine de 20°C. L’insoluble est séparé par filtration, lavé par 25 cm3 d’un mélange acétate d'éthyle - cyclohexane (4-6 en volumes) puis séché. On obtient ainsi 4,99 g de N ct-[0 -benzyl N-(N-t.butyloxycarbonyl L alanyl)-γ-D glutamyl] N e~benzyloxycarbonyl L lysinate de benzyle.
5 Ef =0,80 [silicagel ; acétate d'éthyle-méthanol (9-1 en volumes)]
Spectrométrie de masse : M = 760 (théorie = 760)
Exemple 8 -
On ajoute 0,41 cm3 de chloroformiate d’isobutyle dans une solution, maintenue à -5°C, de 808 mg de N-lauroyl glycine dans 50 cm3 de tétrahydro-10 furanne et 0,44 cm3 de triéthylamine. La solution est agitée pendant 20 minutes à -5°C, puis on ajoute une solution, refroidie à 0°C, de 1,81 g de N a-[N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] L lysine dans un mélange de 20 cm3 de tétra-hydrofuranne et de 6,3 cm3 de soude 1 N. Le mélange réactionnel est agité pendant 1 heure vers -5°C, puis pendant 18 heures à 20°G environ. On acidifie ensuite le 15 mélange réactionnel vers pH 1 par addition de 10 cm3 d'acide chlorhydrique 1 N, on évapore le tétrahydrofuranne par concentration sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45°G, puis on ajoute au concentrât 50 cm3 d'acétate d’éthyle et 30 cm3 d'eau. L’insoluble est séparé par filtration, lavé par 20 cm3 d’acétate d’éthyle et 10 cm3 d’eau et séché sous pression réduite (20 mm de mercure).
20 On obtient ainsi 1,18 g d'une poudre qui est chromâtographiêe sur une colonne de 12 mm de diamètre contenant 50 g de gel de silice neutre (0,063-0,20 mm). On élue successivement par 80 cm3 d'un mélange acétate d’éthyle-méthanol (75-25 en volumes), 320 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-méthanol (1-1 enwolumes) et 120 cm3 de méthanol en recueillant des fractions de 40 cm3. Les fractions 4 à 8 25 réunies sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°G. Le résidu obtenu est trituré dans 50 cm3 d’éther, séparé par filtration et séché. On obtient 0,88 g d’une poudre qui est chromatographiée sur une colonne de 12 mm de diamètre contenant 20 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue successivement par 180 cm3 d’acétate d’éthyle, 60 cm3 d’un mélange acétate , 30 d'éthyle-méthanol (99-1 en volumes), 100 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-méthanol (98-2 en volumes), 260 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-méthanol (95-5 en volumes), 120 cm3 d’un mélange acétate d'éthyle-méthanol (9-1 en volumes), 60 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-méthanol (85-15 en volumes), 280 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-méthanol (8-2 en volumes), 35 40 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-méthanol (7-3 en volumes), 40 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-méthanol (6-4 en volumes) et 60 cm3 d’un mélange / acétate d’éthyle-méthanol (1-1 en volumes) en recueillant des fractions de * /* ' 20 cm3. Les fractions 41 à 60 reunies sont concentrées à sec sous pressio^i-h Z // i// 51 réduite (20 mm de mercure) à 50°G. On obtient ainsi 740 mg de N cr[N-(N-lauroyl , L alanyl)-y-D glutamyl] N e-(N-lauroyl glycyl) L lysine fondant à 167-171°G (fusion pâteuse).
» : Rf = 0,58 [silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau 5 (50-20-6-24 en volumes)]
Analyse : Cale. % = G 62,55 H 9,58 N. 9,12
Tr, (corrigé) = 62,5 9,6 9,3
Après hydrolyse totale, l’analyse sur autoanalyseur Technicon révèle la présence des acides aminés suivants : 10 Ala 1,01 (théorie = 1)
Glu 0,95 (théorie = 1)
Gly 1,00 (théorie = 1)
Lys 0,97 (théorie = 1)
Exemple 9 - 15 On ajoute 0,5 cm3 de chloroformiate d’isobutyle à une solution, maintenue à 12°G, de 1,89 g de N-lauroyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle dans 75 cm3 de dioxanne et 0,54 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à 12°C, puis on ajoute une solution refroidie à 10°C, de 1,95 g g de chlorhydrate de N -benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamoyl-glycinate 20 de benzyle dans un mélange- de 20 cm3 de dioxanne, de 1,5 cm3 d’eau et de 0,54 cm3 de triéthylamine. Le mélange réactionnel est agité pendant 18 heures à une température voisine de 20°G, puis dilué par addition de 150 cm3 d’eau et acidifié à pH 1 par addition de 5 cm3 d’acide chlorhydrique IN. Le précipité ainsi obtenu est séparé par filtration, lavé 3 fois par 75 cm3 au total d’eau et séché. On 25 obtient 3,36 g d’un produit blanc qui est chromatographié sur une colonne de 2,5 cm de diamètre contenant 60 g de gel de silice neutre (0,04- 0,063 mm).
Pour cela, le produit est dissous dans 30 cm3 d’acide acétique. A la solution obtenue, on ajoute 20 g de silice puis on concentre à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45°G, Le résidu ainsi obtenu est chargé sur la colonne et 30·!· on élue successivement par 160 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-acide acétique (95-5 en volumes), 1040 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-acide acétique (9-1 en volumes), 360 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-acide acétique (8-2 en volumes) et 360 cm3 d’acide acétique en recueillant des fractions de 40 cm3.
Les fractions 10 à 16 réunies sont concentrées à sec sous pression réduite 35 (20 mm de mercure) à 45°C. On obtient ainsi 1,09 g de N -[0 -benzyl N-(N-lajUroyl L alanyl)-y-D glutamyl -benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimêlamoylr;/ / >
U
52 glycinate de benzyle fondant à 204-206°C. Les fractions 17 à 48 sont réunies et concentrées à sec. Le résidu est chromatographie sur une colonne de 2 cm de diamètre contenant 40 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue par 280 cm3 d'un mélange acétate d*éthyle-acide acétique (1-1 en volumes) en 5 recueillant des fractions de 20 cm3. Les fractions 4 et 5 réunies sont concentrées à sec. Le résidu est triturédans 20 cm3 d'éther, séparé par filtration 2 1 et séché. On obtient ainsi 0,7 g de N -[0 -benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D- g glutamyl] N -benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamoyl-glycinate de benzyle fondant à 204-206°G.
10 Ef = 0,83 [silicagel ; acétate d'éthyle-acide acétique (3-1 en volumes)] 2 1
On dissout 1,74 g de N -[0 -benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D gluta- g myl] N -benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamoyl-glycinate de benzyle dans 50 cm3 d'acide acétique. On ajoute 1,74 g de palladium sur noir (à 3 % de 15 palladium) puis on fait passer un lent courant d'hydrogène pendant 2 heures.
Après filtration, on ajoute 200 cm3 d'éther au filtrat. Après 1 heure de repos à 20°G, le précipité formé est séparé par filtration, lavé par 25 cm3 d'éther et séché sous pression réduite (0,2 mm de mercure) à 50°C. On obtient ainsi 1,09 g de N -[N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] DD,LL diamino-2,6 pimélamoyl- < 20 glycine fondant à 180-182°C(fusion pâteuse) et contenant 1,4 7. d'eau (méthode de Fischer).
Rf = 0,30 [silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volumes)]
Analyse : Gale. % — G 55,40 H 8,34 N 13,36 25 Tr. = 53,4 8,5 12,4
Cendres sulfuriques % = 0,8
Après hydrolyse totale, l'analyse sur autoanalyseur Technicon révèle la présence des acides aminés suivants :
Ala = 1,02 (théorie = 1) “ 30 Glu = 1,01 (théorie = 1)
Gly = 1,00 (théorie = 1)
Dap = 0,98 (théorie = 1) 6
Le chlorhydrate de N -benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamoyl- glycinate de benzyle peut être préparé de la façon suivante : 2 0 35 On dissout 2,48 g de N -t.butyloxycarbonyl N -benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamoyl-glycinate de benzyle dans 12,5 cm3 d'une solution anhydre d'acide chlorhydrique 1,7 N dans l’acide acétique. On agite pendant, / I - 53 2 heures, puis on ajoute- 200 cm3 d’éther. le précipité pâteux qui sfest formé, séparé du surnageant par décantation, est dissous dans 150 cm3 d’acétone chaud. Après refroidissement, on ajoute 150 cm3 d’éther. Les cristaux formés sont séparés par filtration, lavés 2 fois par 40 cm3 au total dféther et séchés 5 sous pression réduite (0,2 mm de mercure) à 20°C. On obtient ainsi 1,95 g de chlorhydrate de N -benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamoyl-glycinate de benzyle.
Rf =0,61 [silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volumes)] 2 6 10 Le N -t.butyloxycarbonyl N -benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamoyl-glycinate de benzyle peut être préparé de la façon suivante :
On ajoute 1,17 cm3 de chloroformiate d’isobutyle dans une solution, 2 0 maintenue à -1°G, de 3,81 g d’acide N -t.butyloxycarbonyl N -benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique dans 90 cm3 de tétrahydrofuranne et 1,26 cm3 15 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à -1°C, puis on ajoute une solution, refroidie à -1°G, de 3,028 g de p.toluènesulfonate de glycinate de benzyle dans 90 cm3 de tétrahydrofuranne et 1,3 cm3 de triéthylamine. Le mélange réactionnel est agité pendant 2 heures à -1°C, puis pendant 70 heures à 20CC environ. Il est ensuite concentré à sec sous pression réduite (20 mm de 20 mercure) à 35°C. On reprend le résidu par 100 cm3 d’acétate d*éthyle. La solution obtenue est lavée successivement par 20 cm3 d’eau, 3 fois par 60 cm3 au total d’une solution à 5 % de bicarbonate de sodium, 3 fois par 60 cm3 au total d’une solution saturée d’acide citrique puis par 10 cm3 d’une solution saturée de chlorure de sodium. La phase organique est séchée sur du sulfate de 25 magnésium anhydre et concentrée à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45°C. On obtient ainsi 4,8 g d’une meringue crème qui est chromâtographiée sur une colonne de 2 cm de diamètre contenant 100 g de gel de silice neutre (0,04- » 0,063 mm). On élue successivement par 320 cm3 d’un mélange cyclohexane-acétate d’éthyle (1-1 en volumes), 360 cm3 d’un mélange cyclohexane-acétate d’éthyle 30 (1-3 en volumes) et 640 cm3 d’acétate d’éthyle,, en recueillant des fractions de 40 cm3. Les fractions 13 à 23 réunies sont concentrées à sec sous pression 2 réduite (20 mm de mercure) à 45°G. On obtient ainsi 2,29 g de N -t.butyloxy- 0 carbonyl N -benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamoyl-glycinate de benzyle. Rf = 0,26 [silicagel j acétate d’éthyle] i/ii Γ 54 2 ^ L’acide N -t.butyloxycarbonyl N -benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimêlamique peut être préparé de la façon suivante ï g
* A une suspension de 8,08 g d’acide N -benzyloxycarbonyl DD,LL
diamino-2,6 pimêlamique et de 2,65 g de carbonate de sodium dans un mélange de 5 50 cm3 d’eau et de 150 cm3 de dioxanne, on ajoute 6 g de dicarbonate de di t.butyle en solution dans 50 cm3 de dioxanne. Le mélange réactionnel est agité pendant 16 heures à une température voisine de 20°C. L’insoluble est séparé par filtration et le filtrat est concentré à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45°G. Le résidu est repris par 50 cm3 d’eau et 50 cm3 10 d*acétate d’éthyle, La phase aqueuse est acidifiée à pH 3 par addition de 20 cm3 d’une solution saturée d’acide citrique. La phase organique est séparée par décantation puis la phase aqueuse est extraite 2 fois par 50 cm3 au total d’acétate d’éthyle. Les phases organiques sont réunies, lavées par 20 cm3 d’une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur du sulfate de magné- 15 sium anhydre et concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 2. 6 45°G. On obtient ainsi 7,47 g d’acide N -t.butyloxycarbonyl N -benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimêlamique sous forme d’une meringue blanche.
Rf =0,62 [Silicagel ; acétate d’éthyle-méthanol (1-1 en volumes)]
Exemple 10 - 20 On ajoute 0,30 cm3 de chloroformiate d’isobutyle à une solution, maintenue à -5°G, de 484 mg de N-benzyloxycarbonyl glycine dans 50 cm3 de.têtra-hydrofuranne et 0,323 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à -5°G, puis on ajoute 1,32 g d’acide N -[N-(N-lauroyl L alanyl)-D isoglutaminy1] DD,LL diamino-2,6 pimêlamique en solution dans un mélange 25 refroidi à 2°C de 50 cm3 d’eau, 25 cm3 de tétrahydrofuranne et 2,31 cm3 de soude 1 N. Le mélange est agité pendant 1 heure à 5°G et 18 heures à 20°C environ. Ensuite, on évapore le tétrahydrofuranne sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°G et on acidifie â pH 1 le concentrât par addition de 10 cm3 d’acide chlorhydrique 1 N. Le précipité formé est séparé par filtration, lavé 30 3 fois par 30 cm3 au total d’eau et séché. On obtient ainsi 1,57 g de poudre beige que l’on chromatographie sur 30 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm) contenus dans une colonne de 15 mm de diamètre. On élue successivement par 60 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-méthanol (9-1 en volumes), 60 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-méthanol (8-2 en volumes), 60 cm3 d’un mélange acçtate / 35 d’éthyle-méthanol (7-3 en volumes), 60 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-/ méthanol (6-4 en volumes), 60 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle- /'/.
/ 55 méthanol (1-3 en volumes) en recueillant des fractions de 20 cm3. Les fractions 11 à 17 sont réunies et concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. L’huile résiduelle est triturée dans 50 cm3 d’éther.
Après filtration et séchage, on obtient 1,02 g d’acide N^-[N-(N- lauroyl L 5 alanyl)-D isoglutaminyl] N^-benzyloxycarbonyl glycyl) DD,LL diamino-2,6 piméla-mique sous forme d’un solide blanc fondant à 115-120°C (fusion pâteuse).
Rf =0,41 [silicagel; acétate d’éthyle-acide acétique (1-1 en volumes)] 2
On dissout 1 g d’acide N -[N-(N-lauroyl L alanyl)-D isoglutaminyl] 10 N -(benzyloxycarbonylglycyl) DD,LL-diamino-2,6 pimélamique dans 25 cm3 d’acide acétique. On ajoute 1 g de palladium sur noir (à 3 % de palladium) puis on fait passer un léger courant d’hydrogène pendant 3 heures. Après filtration et concentration à sec du filtrat sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C, le résidu obtenu est trituré dans 30 cm3 d’éther, séparé par filtration, lavé 15 par 10 cm3 d’éther et séché sous pression réduite (0,2 mm de mercure) à 50°C.
2
On obtient ainsi 790 mg d’acide N -[N-(N-lauroyl L alanyl)-D isoglutaminyl] g N -(glycyl) DD,LL diamino-2,6 pimélamique fondant à 170-174°G (fusion pâteuse).
Rf = 0,34 [silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volumes)] 20 Analyse : Gale. % = G 55,48 H 8,51 N 15,62
Tr. = 54,25 8,31 14,82
Cendres sulfuriques % = 3,7
Après hydrolyse totale, l’analyse sur autoanalyseur Technicon révèle la présence des acides aminés suivants : 25 Ala 1,02 (théorie = 1)
Dap 0,98 (théorie = 1)
Glu 1,05 (théorie = 1)
Gly 1,00 (théorie = 1) 2 L’acide N -[N-(N-lauroyl L alanyl)-D isoglutaminyl] DD,LL diamino-2,6 o 30 pimélamique peut être préparé de la façon suivante : " 2
On dissout 1,76 g d’acide N -[N-(N-lauroyl L alanyl)-D isogluta- g minyl] N -benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique dans 80 cm3 d’acide acétique» On ajoute 1,76 g de palladium sur noir (à 3 % de palladium) puis on fait passer un courant d’hydrogène pendant 2 heures et demie. Après filtration, 35 le filtrat est concentré à 5 cm3 environ et dilué par addition de 100 cm3 d’éther. Le précipité formé est séparé par filtration, lavé 2 fois par 40 cm3 au total 56 d’éther et séché. On obtient ainsi 1,37 g d’acide ^-[N-ÎN-lauroyl L alanyl)-D isoglutaminyl) DD,LL diamino-2,6 pimélamique.
Ef = 0,40 [silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volumes)] 5 L’acide N^-[N-(N-lauroyl L alanyl)-D isoglutaminyl] N^-benzyloxy- carbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique peut être préparé de la façon suivante : On ajoute 0,81 cm3 de chloroformiate d,isobutyle dans une solution, maintenue à -5°C, de 2,5 g de N-lauroyl L alanyl-D isoglutamine dans 155 cm3 de diméthylformamide et 0,87 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 10 20 minutes à -5°C, puis on ajoute une solution, refroidie à + 2°C, de 2,02 g g diacide N -benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique dans un mélange de 62,5 cm3 d’eau et 6,25 cm3 de soude 1 N» Le mélange réactionnel est agité pendant 1 heure à 0°G puis pendant 18 heures à 20°G environ, et est ensuite filtré. Le filtrat, dilué par addition de 300 cm3 d’eau, est acidifié à pH 1 par addi-15 tion de 15 cm3 d’acide chlorhydrique 1 N. Le précipité apparu est séparé par filtration, lavé 3 fois par 30 cm3 au total d’eau puis séché. On obtient ainsi 2,03 g d’un solide blanc auquel on ajoute 680 mg d’un produit obtenu dans des conditions analogues. Le mélange est dissous dans 30 cm3 d’acide acétique contenant 5 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On concentre à sec puis 20 on dépose le résidu star une colonne de 2 cm de diamètre contenant 60 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue successivement par 40C cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-acide acétique (9-1 en volumes), 360 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-acide acétique (8-2 en volumes), 240 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-acide acétique (7-3 en volumes), 160 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-25 acide acétique (1-1 en volumes) et 480 cm3 d’acide acétique en recueillant des fractions de 40 cm3. Les fractions 17 à 49, sont réunies et concentrées à sec.
2
On obtient ainsi 1,78 g d’acide N -[N-(N-lauroyl L alanyl)-D isoglutaminyl] ~ 6 * ß N -benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique
Rf = 0,65 [silicagel ; acétate d’éthyle-acide acétique (3-1 en 30 volumes)]
Le N-lauroyl L alanyl-D isoglutamine peut être préparé de la façon suivante :
On dissout 6,6 g de N-lauroyl L alanyl-D isoglutaminate de benzyle dans 330 cm3 d’acide acétique. On ajoute 6,6 g de palladium sur noir (à 3.% de 35 palladium) puis on fait passer un lent courant d’hydrogène pendant 2 heures.
Après filtration du mélange réactionnel, on verse le filtrat dans 3 litres d’ea^i. Après 2 heures de repos à 0°C, le précipité apparu est séparé par filtration, / Λ 57 lavé 2 fois par 80 cm3 au total d’eau, puis séché. On obtient ainsi 5,16 g de produit auquel on ajoute 0,5 g d’un produit obtenu dans des conditions analogues. Ce mélange est dissous dans 90 cm3 de méthanol bouillant et à la solution obtenue on ajoute 45 cm3 d’eau. Après 2 heures de repos à une température 5 voisine de 20°C, les cristaux apparus sont séparés par filtration, lavés 2 fois par 60 cm3 au total d’eau et séchés sous pression réduite (20 mm de mercure). On obtient ainsi 5,1 g de N-lauroyl L alanyl-D isoglutamine fondant à 163°C.
Rf =0,18 [Silicagel $ acétate d’éthyle-méthanol (4-1 en volumes)] 10 Analyse : Cale. %= C 60,12 H 9,33 N 10,52
Tr. = 60,2 9,5 10,9
Le N-lauroyl L alanyl-D isoglutaminate de benzyle peut être préparé de la façon suivante :
On ajoute 2,54 cm3 de chloroformiate d’isobutyle dans une solution, 15 maintenue à 0°C, de 3,9 g d’acide laurique dans 156 cm3 de toluène anhydre et 2,7 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à 0°C, puis on ajoute une solution, refroidie à 0°C, de 6,7 g de chlorhydrate de L alanyl-D isoglutaminate de benzyle dans 52 cm3 d'eau et 2,7 cm3 de triéthylamine. Le mélange réactionnel est agité pendant 65 heures à une température 20 voisine de 20°C. On obtient une masse réactionnelle d’aspect gélatineux à laquelle on ajoute 150 cm3 d’acétate d'éthyle. Le précipité est séparé par filtration, lavé par 30 cm3 d'eau puis séché. On obtient 7,6 g de N-lauroyl L alanyl-D isoglutaminate de benzyle sous forme d'une poudre blanche. La phase aqueuse du filtrat précédent est extraite 2 fois par 100 cm3 au total d'acétate d’éthyle, 25 cette phase acétate d’éthyle est réunie avec la phase organique du filtrat, lavée par 125 cm3 d'acide chlorhydrique 0,1 N, 120 cm3 d'eau, séchée sur sulfate de magnésium puis concentrée à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à * 50°C. On obtient à nouveau 1,5 g de N-lauroyl L alanyl-D isoglutaminate de benzyle. Le produit (7,6 g et 1,5 g) est recristallisé dans 120 cm3 de méthanol.
30 On obtient ainsi 6,6 g de N-lauroyl L alanyl-D isoglutaminate de benzyle fondant à 169°C.
Rf =0,13 [Silicagel ; acétate d'éthyle]
Le chlorhydrate de L alanyl-D isoglutaminate de benzyle peut être préparé selon le procédé de S. KUSUMOTO, Bull. Chem. Soc. Japon 49, 533 (1976).
/i 58
Exemple 11 -
On ajoute 0,44 cm3 de chloroformiate d’isobutyle dans une solution maintenue à -5°C de 710 mg de N-benzyloxycarbonyl glycine dans 67 cm3 de tétra-hydrofuranne et 0,475 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à -5CC, puis on ajoute 1,75 g d’acide N^-£N-(N-octanoyl L alanyl)-y-D 5 glutamyl] DD,LL diamino-2,6 pimélamique en solution dans un mélange refroidi à 2°G de 6,7 cm3 d’eau et 6,78 cm3 de soude 1 N. Le mélange réactionnel est agité pendant 1/2 heure à 0°G et 18 heures à 20°G environ. Ensuite, on évapore le tetra-hydrofuranne sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45°C ; la phase aqueuse restante est diluée par 50 cm3 d’eau et acidifiée à pH 1 par addition de 10 cm3 10 d’acide chlorhydrique 1 N. Le précipité formé est séparé par filtration , lavé 3 fois par 30 cm3 au total d’eau et séché. On obtient ainsi 1,65 g de poudre blanchâtre que l’on chromatographie sur 33 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm) contenus dans une colonne de 22 mm de diamètre. Pour cela, on la dissout dans 20 cm3 d’acide acétique, on ajoute 5 g de silice et on concentre 15 à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. Le résidu ainsi obtenu est chargé sur la colonne et on élue successivement par 280 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-acide acétique (9-1 en volumes), 160 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-acide acétique (85-15 en volumes), 560 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-acide acétique (8-2 en volumes), en recueillant des fractions de 20 40 cm3. Les fractions 11 à 24 sont réunies et concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°G. L’huile résiduelle est triturée dans 40 cm3 d’éther. Après filtration et séchage, on obtient 1,37 g d’acide n2-[N-(N-octanoyl L alanyl)-y-D glutamyl] N^-(benzyloxycarbonyl glycyl) DD,LL diamino-2,6 pimélamique sous forme d’un solide blanc fondant vers 100°G (fusion pâteuse).
25 Rf = 0,47 [silicagel ; acétate d’éthyle-acide acétique (1-1 en volumes)] 2
On dissout 1,35 g d’acide N -[N-(N-octanoyl L alanyl)-y-D glutamyl] N^-(benzyloxycarbonyl glycyl) DD,LL diamino-2,6 pimélamique dans 30 cm3 d’acide acétique. On ajoute 1,35 g de palladium sur noir (à 3 % de palladium) et on fait 30 passer un léger courant d’hydrogène pendant 3 heures. Après filtration et concentration à sec du filtrat sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°G, le résidu obtenu est trituré dans 50 cm3 d’éther, séparé par filtration, lavé par 10 cm3 d’éther et séché sous pression réduite (0,2 mm de mercure) à 50°G.
On obtient ainsi 1,05 g d’acide N -[N-(N-octanoyl L alanyl)-y-D glutamyl] 35 N^-(glycyl) DD,LL diamino-2,6 pimélamique fondant à 170-174°C (fusion pâteus^).
/
Rf =0,24 [silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau e ' (50-20-6-24 en volumes)] //,
Uf 7- 59
Analyse : Cale. % = C 52,44 H 7,74 N 14,68 Tr. 51,29 7,96 14,00
Cendres sulfuriques % “ 4
Après hydrolyse totale, l'analyse sur autoanalyseur Technicon révèle “ 5 la présence des acides aminés suivants :
Ala 1,01 (théorie = 1)
Dap 0,98 (théorie = 1)
Glu 1,03 (théorie = 1)
Gly 1,00 (théorie = 1) 2 10 L'acide N -[N-(N-octanoyl L alanyl)-y-D glutamyl] DD,LL diamino-2,6 pimêlamique peut être préparé de la façon suivante : 2 1
On dissout 2,82 g d'acide N -[0 -benzyl N-(N-octanoyl L alanyl)-y-D
g glutamyl] N -benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimêlamique dans 80 cm3 d'acide acétique. On ajoute 2,82 g de palladium sur noir (à 3 % de palladium) puis on 15 fait passer un courant d'hydrogène pendant 2 heures 1/2. Après filtration, le filtrat est concentré à 5 cm3 environ sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C et dilué par addition de 100 cm3 d’éther. On obtient un précipité qui est séparé par filtration, lavé par 20 cm3 d'éther puis séché. On obtient ainsi 2,0 g d'acide N -[N-(N-octanoyl L alanyl)-y-D glutamyl] DD,LL diamino-2,6 pime- 20 lamique fondant à 160-164°C (fusion pâteuse).
Rf = 0,30 [Silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volumes)]
Analyse : Gale. % = 53,58 H 8,02 N 13,58 .
Tr. = 53,05 8,17 13,06 25 Cendres sulfuriques % = 1,8
Après hydrolyse totale, l'analyse sur autoanalyseur Technicon révèle . 1a présence des acides aminés suivants :
Ala 1,00 (théorie = 1) » Dap 0,95 (théorie = 1) ' 30 Glu 1,02 (théorie = 1) 2 1 6 L'acide N -[0 -benzyl N-(N-octanoyl L alanyl)-y-D glutamyl] N -benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimêlamique peut être préparé de la façon suivante: On ajoute 0,91 cm3 de chloroformiate d'isobutyle dans une solution, maintenue à 0°C, de 3,04 g de N-octanoyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle 35 dans 150 cm3 de tétrahydrofuranne et 0,98 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agite pendant 20 minutes à 0°C, puis on ajoute une solution, refroidie à 2°C, 6 / de 2,26 g d'acide N -benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimêlamique dans un / mélange de 70 cm3 d'eau et de 7 cm3 de soude 1 N. Le mélange réactionnel esji\f / !ff
/ IJ
! yj 60 agité pendant 1 heure à 0°G, puis pendant 20 heures à une température voisine de 20°G. Le tétrahydrofuranne est ensuite évaporé sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. Le concentrât est dilué par addition de 50 cm3 d’eau et acidifié à pH i par addition de 10 cm3 d’acide chlorhydrique 1 N. Le précipité • 5 blanc obtenu est séparé par filtration, lavé 3 fois par 75 cm3 au total d’eau puis séché. On obtient ainsi 4,73 g d’un solide blanc qui est chromatographié sur une colonne de 2,2 cm de diamètre contenant 100 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). Pour cela, le produit est dissous dans 20 cm3 d’acide acétique.
A la solution obtenue, on ajoute 10 g de gel de silice neutre et concentre à 10 sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°G. Le résidu ainsi obtenu est chargé sur la colonne et on élue successivement par 280 cm3 d’acétate d’éthyle, 360 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-acide acétique (9-1 en volumes), 200 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-acide acétique (8-2 en volumes), 160 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-acide acétique (1-1 en volumes) en recueillant des 15 fractions de 40 cm3. Les fractions 13 à 23 réunies sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. On obtient une huile qui se solidifie dans l'éther. Après séparation par filtration et séchage, on obtient 2,84 g 2 1 6 d’acide N -fO -benzyl N-(N-octanoyl L alanyl)y-D glutamyl] N -benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique.
20 Rf = 0,68 [silicagel ; acétate d’éthyle-acide acétique (3-1 en volumes)]
Le N-octanoyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle peut être préparé de la façon suivante :
On ajoute 3,6 cm3 de chloroformiate d’isobutyle dans une solution, 25 maintenue à -1°C, de 3,95 g d’acide octanofque dans 140 cm3 de tétrahydrofuranne et 3,8 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à -1°C, puis on ajoute une solution, refroidie à 0°G, de 9,45 g de chlorhydrate de L alanyl-a-D glutamate de benzyle dans un mélange de 54,8 cm.3 de soude 1 N et r 30 cm3 d’eau. Le mélange réactionnel est agité pendant 1 heure à -1°G puis pen- 30 dant 20 heures à 20°C environ. Il est ensuite acidifié à pH 1 par addition d’acide chlorhydrique 1 N. Le tétrahydrofuranne est évaporé sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45°G, puis le concentrât est extrait par 100 cm3 d’acétate d’éthyle. La phase organique ainsi obtenue est lavée 2 fois par 50 cm3 au total d’acide chlorhydrique 1 N et par 25 cm3 d’une solution saturée de chlorure de 35 sodium et concentrée à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45°C. -
On obtient ainsi 10 g d’une huile jaune pâle qui est chromatographiée sur une / ' 61 colonne de 2,5 cm de diamètre contenant 200 g de gel de silice neutre (0,063-0,20 mm). On élue avec de l’acétate d’éthyle en recueillant des fractions de 100 cm3. Les fractions 7 à 9 réunies sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45°G. Le résidu obtenu est trituré dans 100 cm3 5 d’un mélange éther-éther de pétrole (P.E. = 35-60°G) (1-4 en volumes), séparé par filtration et séché. On obtient ainsi 3,27 g de N-octanoyl L alanyl-ct-D glutamate de benzyle sous forme cîune poudre blanche.
Rf =0,56 [Silicagel ; acétate d’éthyle-met hanol (8-2 en volumes)]
Exemple 12 - 10 On ajoute 0,32 cm3 de chloroformiate d’isobutyle dans une solution maintenue à -5°G de 512 mg de N-benzyloxycarbonyl glycine dans 25 cm3 de têtra-hydrofuranne et 0,35 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité 20 minutes à -5°G, puis on ajoute 1,54 g d’acide N^-[N-(N-palmitoyl L alarylJ-y-D glutamyl] DD,LL diamino-2,6 pimélamique en solution dans un mélange refroidi à 2°G de 5 cm3 d’eau, 15 et 4,9 cm3 de soude 1 N. Le mélange réactionnel est agité 1 heure à -5°G et 18 heures à 20°C environ. Ensuite, on évapore le tétrahydrofuranne sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°G. La phase aqueuse restante est diluée par 50 cm3 d’eau et acidifiée à pH 1 par addition de 10 cm3 d’acide chlorhydrique 1 N.
Le précipité formé est séparé par filtration, lavé 3 fois par 30 cm3 au 20 total d’eau et séché. On obtient ainsi 1,80 g de poudre beige que l’on chromatographie sur 36 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 rom) contenus dans une colonne de 22 mm de diamètre. Pour cela, on le dissout dans 20 cm3 d’acide acé* tique, on ajoute 5 g de silice et on concentre à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. Le résidu ainsi obtenu est chargé sur la colonne et 25 élue successivement par 120 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle - acide =· acétique (9-1 en volumes), 60 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle - acide acétique (8-2 en volumes), 60 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle - acide acétique (7-3 en volumes), 60 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle - acide acétique (1-1 en volumes) et 80 cm3 d’acide acétique, en recueillant des fractions 30 de 20 cm3. Les fractions 10 à 16 sont réunies et concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. L’huile résiduelle est triturée dans 50 cm3 d’éther . Après filtration et séchage, on obtient 0,83 g d’acide N^-[N-(N-palmitoyl L alanyl)-y-D glutamyl] N^-(benzyloxycarbonyl glycyl) DD,LL diamino-2,6 pimélamique fondant à 124-128°C (fusion pâteuse).
./
35 Rf = 0,50 [silicagel ; acétate d’éthyle-acide acétique (1-1 eij/V
/ U / volumes)] / If 7 2 62
On dissout 1,14 g d’acide N -[N-(N-palmitoyl L alanyl)-y-D glutamyl] g N -(benzyloxycarbonyl glycyl) DD,LL diamino-2,6 pimélamique dans 30 cm3 d’acide acétique. On ajoute 1,14 g de palladium sur noir (à 3 % de palladium) s 5 et on fait passer un léger courant d’hydrogène pendant 3 heures. Ensuite, on chauffe le milieu réactionnel vers 65°C, le filtre et le concentre à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°G ; le résidu obtenu est trituré dans 50 cm3 d’éther, séparé par filtration, lavé par 10 cm3 d’éther et séché sous pression réduite (0,2 mm de mercure) à 50°G. On obtient ainsi 880 mg d’acide o 6 10 N-[N-(N-palmitoyl L alanyl)-Y~D glutamyl] N -(glycyl) DD,LL diamino-2,6 pimélamique fondant à 198-200°C (fusion pâteuse)·
Rf =0,28 [silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volumes)]
Analyse : Gale. % = G 57,87 H 8,83 N 12,27 15 Tr, 54,64 8,67 10,98
Cendres sulfuriques % = 4,7
Après hydrolyse totale, l’analyse sur autoanalyseur Technicon révèle la présence des acides aminés suivants :
Ala 1,00 (théorie = 1) 20 Dap 1,02 (théorie = 1)
Glu 1,05 (théorie = 1)
Gly 1,00 (théorie = 1) 2 L’acide N -[N-(N-palmitoyl L alanyl)y-D glutamyl] DD,LL diamino-2,6 pimélamique peut être préparé de la façon suivante : 2 1 25 On dissout 2,14 g d’acide N -[0 -benzyl N(N-palmitoyl L alanyl)-Y- g D glutamyl] N -benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique dans 80 cm3 d’acide acétique. On ajoute 2,14 g de palladium sur noir (à 3 % de palladium) puis on fait passer un lent courant d’hydrogène pendant 2 heures 1/2. Après r ·' filtration, le filtrat est concentré à 5 cm3 environ sous pression réduite 30 (20 mm de mercure) à 50°C puis est dilué par addition de 100 cm3 d’éther. On obtient un précipité qui est séparé par filtration, lavé 2 fois par 20 cm3 au total d’éther et séché. On obtient ainsi 1,58 g d’acide N -[N-(N-palmitoyl L alanyl)y-D glutamyl] DD,LL diamino-2,6 pimélamique.
Rf =0,30 [silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau 35 (50-20-6-24 en volumes)].
2 1 L’acide N -[0 -benzyl N-(N-palmitoyl L alanyl)-Y~D glutamyl] 6 ^ / N -benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique peut être préparé de la-/ façon suivante : / // s ! .
63
On ajoute 0,70 cm3 de chloroformiate dfisobutyle dans une solution, maintenue à 2°C, de 2,91 g de N-palmitoyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle i dans 120 cm3 de tétrahydrofuranne et 0,75 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à 2°C, puis on ajoute une solution, refroidie à 2°G, de 5 1,726 g d’acide N -benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique dans un mélange de 53,4 cm3 d’eau et de 5,34 cm3 de soude 1 N. Le mélange réactionnel est agité pendant 1 heure à 2°C, puis pendant 18 heures à une température voisine de 20°G. Le tétrahydrofuranne est évaporé sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°G. Le concentrât est dilué par addition de 50 cm3 d’eau et 10 acidifié à pH 1 par addition de 10 cm3 d’acide chlorhydrique 1 N. Le précipité blanc obtenu est séparé par filtration, lavé 3 fois par 75 cm3 au total d’eau et séché. On obtient ainsi 4,15 g d’un solide blanc qui est chromatographie sur une colonne de 3 cm de diamètre contenant 85 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). Pour cèla, le produit est dissous dans de l’acide acétique à 15 60°C. A la solution obtenue on ajoute 10 g de gel de silice neutre puis on concentre à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°G. Le résidu ainsi obtenu est chargé sur la colonne et on élue successivement par 320 cm3 d’acétate d’éthyle, 360 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-acide acétique (9-1 en volumes), 320 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-acide acétique (8-2 en volumes) en recueil-20 lant des fractions de 40 cm3. Les fractions 14 à 22 réunies sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°G.
>
Le résidu obtenu est trituré dans 50 cm3 d’éther, séparé par 2 1 filtration, et séché. On obtient ainsi 2,20 g d’acide N -[0 -benzyl N-(N- g palmitoyl L alanyl)-y-D glutamyl] N -benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimê-25 lamique.
Rf =0,75 [silicagel ; acétate d’éthyle-acide acétique (3-1 en volumes)]
Le N-palmitoyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle peut être préparé de la façon suivante : 30 On ajoute 3,6 cm3 de chloroformiate d’isobutyle dans une solution, maintenue à 0°G de 7,03 g d’acide palmitique dans 140 cm3 de tétrahydrofuranne et 3,8 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à 0°C, puis on ajoute une solution, refroidie à 0°C, de 9,45 g de chlorhydrate de L alanyl-a-D glutamate de benzyle dans un mélange de 54,8 cm3 de soude 1 N et / 35 de 30 cm3 d’eau. Le mélange réactionnel est agité pendant 1 heure à 0°G, pui£
J
64 pendant 18 heures à 20°C environ ; il est ensuite acidifié à pH 1 par addition de 70 cm3 d’acide chlorhydrique 1 N. Le précipité formé est séparé par filtration, lavé 5 fois par 200 cm3 au total d’eau et séché. On obtient ainsi 12,11 g d’une poudre blanche qui est chromatographise star une colonne de 2,5 cm de diamètre 5 contenant 200 g de gel de silice neutre (0,063-0,20 mm). On élue successivement par 200 cm3 d’acétate d’éthyle, 300 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-méthanol (9-1 en volumes), 1,6 litre d’un mélange acétate d’êthyle-mêthanol (8-2 en volumes), 400 cm3 d’un mélange acétate d*éthyle-mêthanol (6-4 en volumes) en recueillant des fractions de 100 cm3. Les fractions 5 à 23 réunies sont concen-10 trêes à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45°G. On obtient ainsi 5,18 g d’un solide que l’on triture dans 50 cm3 d’éther bouillant pendant 1/2 heure Après refroidissement à une température voisine de 20°C, l’insoluble est séparé par filtration, lavé 3 fois par 75 cm3 au total d’éther puis séché. On obtient ainsi 2,94 g de N-palmitoyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle.
15 Rf = 0,77 [silicagel ; acétate d’éthyle]
Exemple 13 -
On ajoute 0,46 cm3 de chloroformiate d’isobutyle à une solution, maintenue à -7°C, de 738 mg de N-benzyloxycarbonyl glycine dans 65 cm3 de tétrahydrofuranne et 0,494 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 20 minutes à -7°G, puis on ajoute une solution, refroidie à 2°C, de 2,02 g d’acide N -[N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] DD,LL diamino-2,6 pimêlamique dans 10 cm3 d’eau et 7,06 cm3 de soude 1 N. Le mélange réactionnel est agité pendant 1 heure vers -5°C et pendant 18 heures à 20°G environ. Ensuite, on évapore le tétrahydrofuranne sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C.
25 La phase aqueuse restante est diluée par addition de 50 cm3 d’eau et acidifiée à pH 1 par addition de 10 cm3 d’acide chlorhydrique 1 N. Le précipité formé est séparé par filtration, lavé par 25 cm3 d’eau et séché. Le résidu obtenu est dissous dans 5 cm3 d’acide acétique. On ajoute 10 g de silice puis on concentre - à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°G. Le résidu obtenu est 30 chargé sur une colonne de 35 mm de diamètre, contenant 100 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue successivement par 160 cm3 d’acétate d’éthyle, 200 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-acide acétique (9-1 en volumes), 360 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-acide acétique (8-2 en volumes), 200 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-acide acétique (7-3 en volumes), 240 cm3 d’un mélange 35 acétate d’éthyle-acide acétique (6-4 en volumes) et 440 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-acide acétique (1-1 en volumes) en recueillant des fractions de 40 <^3.
7 / /' 65
Les fractions 23 à 32 sont réunies et concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. L’huile résiduelle est triturée dans 50 cm3 d’éther jusqu’à pulvérisation totale du produit· Le produit est séparé par filtration et séché. On obtient ainsi, sous forme d’une poudre blanche 1,7 g d’acide 5 ÿj -[N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] N -(benzyloxycarbonyl glycyl) DD, LL diamino-2,6 pimélamique fondant à 134-136°C (fusion pâteuse)·
Rf = 0,76 [silicagel ; acétate d’éthyle-acide acétique (1-1 en volumes)]
Analyse : Cale. % = C 58,25 H 7,66 N 11,02 10 Tr. = 55,7 7,6 10,2
Après hydrolyse totale, l'analyse sur aütoanalyseur Technicon révèle la présence des acides aminés suivants :
Ala 1,00 (théorie =1) Glu 1,02 (théorie =1)
Dap 0,93 (théorie =1) Gly 1,00 (théorie =1) 2 15 On dissout 1,7 g d’acide N -[N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] g N -(benzyloxycarbonyl glycyl) DD,LL diamino-2,6 pimélamique dans 45 cm3 d’acide acétique· On ajoute 1,7 g de palladium sur noir (à 3 % de palladium) et on fait passer un léger courant d’hydrogène pendant 3 heures. Après filtration et concentration à sec du filtrat sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°G, 20 le résidu obtenu est trituré dans 50 cm3 d’éther, séparé par filtration, lavé par/ d’éther et séché sous pression réduite (0,2 mm de mercure) à 50°C. On obtient
2 6 ainsi 1,32 g d’acide N -[N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] N -(glycyl) DD,LL
diamino-2,6 pimélamique fondant à 180-184°G (fusion pâteuse).
Rf =0,23 [silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau 25 (50-20-6-24 en volumes)]
Analyse : Cale· %— C 55,40 H 8,74 N 13,36
Tr· = 54,31 7,96 12,55
Après hydrolyse totale, l’analyse sur autoanalyseur Technicon révèle la présence des acides aminés suivants : 30 Ala 0,99 (théorie = 1)
Dap 0,96 (théorie = 1)
Glu 1,01 (théorie = 1)
Gly 1,00 (théorie = 1)
Exemple 14 - 35 On ajoute 0,52 cm3 de chloroformiate d’isobutyle dans une solution, maintenue à 12eG, de 1,96 g de N-lauroyl L alanyl-ct-D glutamate de benzyle dans 80 cm3 de dioxanne et 0,56 cm3 de triéthylamine. La solution est agitée pendant 20 minutes à 12°G, puis on ajoute une solution, refroidie à 5°G, de 1,78 g de chlorhydrate de N e-benzyloxycarbonyl glycyl L lysyl-D alanine dans un mélange/de r. / 40 10 cm3 d’eau et de 8 cm3 de soude 1 N. Le mélange réactionnel est agité pefldqnt ....... ..... ... .../'/ 66 réactionnel à pH 2 par addition de 10 cm3 d’acide chlorhydrique 1 N et on ajoute 150 cm3 d’eau. L’insoluble est séparé par filtrationetlavé par 100 cm3 d’eau. Après séchage, on obtient 3,14 g d’une poudre blanche qui est recristallisée dans tin mélange bouillant de 500 cm3 d’acétate d’éthyle et de 60 cm3 de 5 mêthanol. Après 18 heures de repos à 5°G, les cristaux apparus sont séparés = par filtration et séchés. On obtient ainsi 2,26 g de N a-[0 -benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)«Y“D glutamyl] N e-benzyloxycarbonyl glycyl L lysyl-D alanine fondant à 193-196°C.
Rf = 0,76 [silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau 10 (50-20-6-24 en volumes)]
On dissout 2,23 g de N«-[0*-benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] Ne-benzyloxycarbonyl glycyl L lysyl-D alanine dans 250 cm3 de méthanôl à 60°C On refroidit la solution à 40°C, puis on ajoute 2,23 g de palladium sur noir (à 3 % de palladium) et on fait passer un lent courant d’hydrogène pendant 15 5 heures. On filtre le mélange réactionnel, on lave le palladium sur noir 5 fois par 300 cm3 au total de mêthanol bouillant. Les filtrats réunis sont concentrés à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. Le résidu obtenu est trituré dans 100 cm3 d’éther. Après filtration, lavage par 100 cm3 d’éther et séchage, on obtient 1,31 g de Na-[N-(N-lauroyl L alanyl-y-D glutamyl] 20 Ne-glycyl L lysyl-D alanine fondant à 155-158°G.
Rf = 0, 48 [silicagel ; mêthanol]
Analyse : Gale. % = C 56,69 H 8,59 N 12,80
Tr. = 57,0 9, 1 13,1
Après hydrolyse totale, l’analyse sur autoanalyseur Technicon 25 révèle la présence des acides aminés suivants :
Ala 1,98 (théorie = 2)
Glu 1,06 (théorie = 1)
Gly 1,00 (théorie = 1)
Lys 1,00 (théorie = 1) . 30 Le chlorhydrate de Ne-benzyloxycarbonyl glycyl L lysyl-D alanine peut être préparé de la façon suivante :
On dissout 3,20 g de Να-t.butyloxycarbonyl Ne-benzyloxycarbonyl glycyl L lysyl-D alanine dans 15 cm3 d’une solution anhydre d’acide chlorhydrique 1,7 N dans l’acide acétique. Après 5 minutes d’agitation du mélange 35 réactionnel, il se forme un précipité. Après 2 heures de repos, on ajoute 50 cm3 d’éther, on sépare le précipité par filtration, le lave 2 fois par 50 cm3 au total d’éther puis le sèche. On obtient ainsi 2,73 g de chlorhydrate de Ne-benzyloxycarbonyl glycyl L lysyl-D alanine. f
Rf = 0,40 [silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-ea^f'/ 40 (50-20-6-24 en volumes)] /Jf 67
Le Να-t.butyloxycarbonyl Ng-benzyloxycarbonyl glycyl-L lysyl-D alanine peut être préparé de la façon suivante :
On ajoute 2,60 cm3 de chloroformiate d’isobutyle dans une solution * maintenue à 10°G de 3,54 g de N-benzyloxycarbonyl glycine dans 200 cm3 de 5 dioxanne et 2,8 cm3 de triéthylamine. La solution est agitée pendant 20 minutes vers 10°C, puis on ajoute une solution, refroidie à 10°C, de 6,35 g de Να-t.butyloxycarbonyl L lysyl-D alanine dans un mélange de 40 cm3 d’eau et de 20 cm3 de soude 1 N· Le mélange réactionnel est agité pendant 20 heures à 20°G environ. Il est ensuite acidifié jusqu’à pH 3 par addition d’acide chlorhydrique 10 1 N. On évapore le dioxanne par concentration sous pression réduite (20 mm de mer cure) à 45°C. On extrait le concentrât 3 fois par 300 cm3 au total d’acétate d’éthyle ; la phase organique est lavée 2 fois par 100 cm3 au total d’une solution saturée d'acide citrique et par 20 cm3 d’une solution saturée de chlorure de sodium puis concentrée à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) 15 à 45°G. On obtient 12,89 g d’une huile qui est chromatographiêe sur colonne de 3 cm de diamètre contenant 200 g de gel de silice neutre (0,063-0,2 mm). On élue par de l’acétone en recueillant des fractions de 100 cm3. Les fractions 5 et 6 réunies sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45°G.
On obtient 10,15 g d’une huile qui est chromatographiêe sur une colonne de 3(cm 20 de diamètre contenant 200 g de gel de silice neutre (0,063-0,2 îâm)· On élue successivement par 100 cm3 d’un mélange cyclohexane-acétone (9-1 en volumes), 500 cm3 d’un mélange cyclohexane-acétone (8-2 en volumes), 500 cm3 d’un mélange cyclohexane-acétone (7-3 en volumes), 400 cm3 d’un mélange cyclohexane-acétone (6-4 en volumes), 500 cm3 d’un mélange cyclohexane-acétone (1-1 en volumes), 25 1 litre d’un mélange cyclohexane-acétone (4-6 en volumes) et 200 cm3 d’acétone
en recueillant des fractions de 100 cm3. Les fractions 25 à 32 réunies sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45°C. On obtient : ainsi 3,21 g de Na-t.butyloxycarbonyl Ne-benzyloxycarbonyl glycyl-L lysyl-D
alanine.
30 Rf =0,69 [silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volumes)]
Le Να-t.butyloxycarbonyl L lysyl-D alanine peut être préparé de la façon suivante î
On dissout 16,23 g de Να-t.butyloxycarbonyl Ne-benzyloxycarbonyl 35 L lysyl-D alaninate de benzyle dans 200 cm3 de méthanol. On ajoute 16,23 g de y palladium sur noir (à 3 % de palladium) puis on fait passer un lent courant i\/ r
A
68 d’hydrogène pendant 4 heures. On filtre le mélangé réactionnel, puis on lave le palladium sur noir 3 fois par 60 cm3 au total de méthanol. Les filtrats réunis sont concentrés à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45°G. On obtient ainsi 8,87 g de Να-t.butyloxycarbonyl L lysyl-D alanine sous forme de meringue.
5 Rf = 0,08 [Silicagel ; acétate d’éthyle - méthanol (4-1 en volumes)]
Exemple 1 5 -
On ajoute 0,5 cm3 de chloroformiate d’isobutyle dans une solution, maintenue à 13°G, de 1,91 g de N-(N-lauroyl L alanyl)-a-D glutamate de benzyle dans 80 cm3 de dioxanne et 0,55 cm3 de triêthylamine. Le mélange est agité 10 pendant 20 minutes à 13°C, puis on ajoute une solution refroidie â 4°G, de 1,90 g g de chlorhydrate de N -(benzyloxycarbonyl glycyl) DD,LL diamino-2,6 pimélamoyl-D alanine dans 7,8 cm3 de soude 1 N. Le mélange réactionnel est agité.pendant 18 heures à 20°G environ, puis acidifié à pH 1 par addition de 10 cm3 d’acide chlorhydrique 1 N et dilué par addition de 120 cm3 d’eau. Le précipité formé est 15 séparé par filtration, lavé par 20 cm3 d’eau et séché. On obtient ainsi 3,21 g d’une poudre blanche qui est chromatographiée sur une colonne de 3 cm de diamètre contenant 60 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue avec 40 cm3 d’acide acétique et 240 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-acide acétique (1-1 en volumes) en recueillant des fractions de 20 cm3. Les fractions 5 à 10 réunies 20 sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45°C. On obtient ainsi 2,88 g d’une poudre blanche qui est 'chromatographiée sur une colonne de 3 cm de diamètre contenant 60 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue successivement par 180 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-acide acétique (9-1 en volumes), 180 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-acide acétique (8-2 en 25 volumes) et 100 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-acide acétique (6-4 en volumes) en recueillant des fractions de 20 cm3. Les fractions 4 à 17 réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45°C. Le résidu obtenu est dissous dans 25 cm3 d’acide acétique bouillant et la solution obtenue, additionnée de 0,2 g de noir décolorant, est filtrée â chaud ; le 30 filtrat est dilué par addition de 100 cm3 d'acétate d’éthyle. Après. 1 heure de repos à 20°C environ, les cristaux apparus sont séparés par filtration, lavés 2 fois par 10 cm3 au total d’acétate d’éthyle et séchés. On obtient ainsi.1,53 g 2 1 6 de N -[0 -benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)y-D glutamyl] N-(benzyloxycarbonyl glycyl) DDjLL diamino-2,6 pimélamoyl-D alanine fondant à 225-227°C.
35 Rf = 0,71 [Silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eayr'/’ / / (50-20-6-24 en volumes)J j h
V
Λ 2 1 69
On dissout 1,51 g de N -[O -benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)y-D gluta- £ royl] N -(benzyloxycarbonyl glycyl) DD,LL diamino-2,6 pimélamoyl-D alanine dans 75 cm3 d’acide acétique. On ajoute 1,51 g de palladium sur noir (à 3 % de palladium) puis on fait passer un lent courant d’hydrogène pendant 2 heures, 5 Après filtration, on ajoute 500 cm3 d’éther au filtrat. Le précipité formé est séparé par filtration, lavé par 50 cm3 d'éther et séché sous pression réduite 2 (0,2 mm de mercure) à 20°G. On obtient ainsi 710 mg de N -[N-(N-lauroyl 6 L alanyl)y-D glutamyl] N -glycyl DD,LL diamino-2,6 pimélamoyl-D alanine contenant 0,4 % d’eau (méthode de Fischer).
10 Rf = 0,32 [Silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acêtique-eau (50-20-6-24 en volumes)]
Analyse : Gale. %= G 54,92 H 8,21 N 14,01
Tr. = 52,6 8,0 12,3
Cendres sulfuriques % = 1,1 15 Après hydrolyse totale, l'analyse sur autoanalyseur Technicon révèle la présence des acides aminés suivants :
Ala 2,00 (théorie = 2)
Dap 0,98 (théorie = 1)
Glu 1,05 (théorie = 1) 20 Gly 0,95 (théorie = 1)
Le chlorhydrate de N^-(benzyloxycarbonyl glycyl) DD,LL diamino-2,6 pimélamoyl-D alanine peut être préparé de la façon suivante : 2 6
On dissout 2,21 g de N -t.butyloxycarbonyl N -(benzyloxycarbonyl glycyl) DD,LL diamino-2,6 pimélamoyl-D alanine dans 20 cm3 d'une solution anhydre 25 d’acide chlorhydrique 1,7 N dans l’acide acétique. On agite pendant 2 heures à 20°G environ, puis on ajoute 250 cm3 d'éther. Le précipité formé est séparé par décantation, et trituré dans 100 cm3 d’acétone. Après filtration, lavage par 6 25 cm3 d’éther et séchage, on obtient 1,96 g de chlorhydrate de N -(benzyloxycarbonyl glycyl) DD,LL diamino-2,6 pimélamoyl-D alanine.
30 Rf =0,46 [silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volumes)] 2 6
Le N -t.butyloxycarbonyl N -(benzyloxycarbonyl glycyl) DD,LL diamino-2,6 pimélamoyl-D alanine peut être préparé de la façon suivante :
On ajoute 0,89 cm3 de chloroformiate d’isobutyle à une solution, 35 maintenue à 1°G, de 1,20 g de N-benzyloxycarbonyl glycine dans 68 cm3 de têtra-hydrofuranne et 0,95 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à 1°C, puis on ajoute une solution, refroidie à 2°C, de 2,45 g de* 2 70 N -t.butyloxycarbonyl DD,LL pimélamoyl-D alanine dans 13,6 cm3 de soude 0,5 N.
Le mélangé réactionnel est agité pendant 4 heures vers 5°G. On évapore ensuite le tétrahydrofuranne par concentration sous pression réduite (20 mm de mercure) . à 45°C ; la phase aqueuse restante est diluée par addition de 50 cm3 d’eau, 5 acidifiée à pH 3 par addition d’une solution saturée dfacide citrique et extraite 5 fois par 125 cm3 au total d’acétate d’éthyle. Les phases organiques réunies sont lavées par 10 cm3 d’une Solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur du sulfate de magnésium anhydre et concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45°G. On obtient une meringue blanche qui est 10 chrômatographiée sur une colonne de 2 cm de diamètre contenant 90 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue successivement par 800 cm3 d’acétate d’éthyle, 200 cm3 d’un mélange acétate d*éthyle-méthanol (9-1 en volumes), 400 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-méthanol (1-1 en volumes) en recueillant des fractions de 40 cm3. Les fractions 25 à 28 réunies sont concentrées à sec 15 sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45°G. On obtient ainsi 2,4 g de 2 6 N -t.butyloxycarbonyl N -(benzyloxycarbonyl glycyl) DD,LL diamino-2,6 pimé-lamoyl-D alanine.
Rf =0,67 [silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volumes)] 2 20 Le N -t.butyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamoyl-D alanine peut être préparé de la façon suivante ; 2 6
On dissout 4,52 g de N -t.butyloxycarbonyl N -benzyloxycarbonyl DD,LL
diamino-2,6 pimélamoyl-D alaninate de benzyle dans 45 cm3 d’acide acétique.
On ajoute 4,52 g de palladium sur noir (à 3 % de palladium) puis on fait passer 25 un lent courant d’hydrogène pendant 3 heures. Après filtration, on verse le filtrat dans 800 cm3 d’éther ; après 30 minutes d’agitation, on sépare le précipité formé par filtration, le lave par 100 cm3 d’éther et le sèche. On 2 obtient ainsi 2,5 g de N -t.butyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamoyl-D alanine.
30 Rf = 0,37 [silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volumes)] 2 6
Le N -t.butyloxycarbonyl N -benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamoyl-D alaninate de benzyle peut être préparé de la façon suivante :
On ajoute 1,53 cm3 de chloroformiate d’isobutyle à une solution, 2 6 35 maintenue à -1°C, de 5 g d’acide N -t.butyloxycarbonyl N -benzyloxycarbonyl/DD,LL diamino-2,6 pimêlamique dans 120 cm3 de tétrahydrofuranne et 1,65 cm3 de-* / 71 triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à -1°C, puis on ajoute une solution, refroidie à 0°C, de 4,15 g de p.toluènesulfonate de D alaninate de benzyle dans 120 cm3 de tétrahydrofuranne et 1,65 cm3 de triéthylamine.
Le mélange réactionnel est agité pendant 1 heure à -1°C, puis pendant 18 heures 5 à 20°C environ. Il est ensuite concentré sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45°G.· On reprend le résidu par 100 cm3 d’acétate d’éthyle. La solution obtenue est lavée successivement par 25 cm3 d’eau, 4 fois par 80 cm3 au total d’une solution saturée de bicarbonate de sodium, 4 fois par 80 cm3 au total d’une solution saturée d’acide citrique et 10 cm3 d’une solution 10 saturée de chlorure de sodium, séchée sur du sulfate de magnésium anhydre puis concentrée à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45°G. On obtient ainsi 6,64 g d’une meringue rosée qui est chromatographiée sur une colonne de 2 cm de diamètre contenant 120 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue successivement par 40 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-cyclohexane 15 (1-1 en volumes), 80 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-cyclohexane (3-1 en volumes), 1,16 litre d’acétate d’éthyle et 520 cm3 d’acétone en recueillant des fractions de 40 cm3. Les fractions 10 à 39 réunies sont concentrées à sec sous 2 pression réduite (20 mm de mercure)à 45°C. On obtient ainsi 4,52 g de N -t.butyl- g oxycarbonyl N -benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamoyl-D alaninate de 20 benzyle.
Rf = 0,37 [Silicagel j acétate d’éthyle]
Exemple 16 -
On ajoute 0,52 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue à 10°C, de 2,52 g de N-docosanoyl L alanyl-ar D glutamate de 25 benzyle dans un mélange de 120 cm3 de tétrahydrofuranne et de 0,56 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à 6°C, puis on ajoute une solution, refroidie à 6°C, de 1,484 g de N ε-benzylxoycarbonyl-c glycyl L lysine dans un mélange de 4,4 cm3 de soude IN et de 4,4 cm3 d'eau.
; Le mélange réactionnel est agité pendant quelques minutes à 6°C, puis 30 pendant 2 jours à 20°C environ. On évapore ensuite le tétrahydrofuranne sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45°C ; le concentrât est acidifié par 10 cm3 d'acide chlorhydrique IN. L'insoluble obtenu après 1 heure d'agitation, est séparé par filtration, lavé 5 fois par 50 cm3 au total d'acide chlorhydrique 0,1N et par 10 cm3 d'eau, puis séché sous pression réduite (20 mm Z' 35 de mercure) à 20°C. On obtient ainsi 5,46 g d'une poudre qui est dissout^.' / 72 dans 40 cm3 d'acide acétique contenant 20 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On concentre à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C et on charge l'ensemble sur une colonne de 38 mm de diamètre contenant 200 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue 5 successivement par 600 cm3 d'acétate d'éthyle, 440 cm3 d'un mélange/d^ethyle- acide acétique (9-1 en volumes), 360 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle- acide acétique (8-2 en volumes), 360 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle- acide acétique (7-3 en volumes), 360 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle- acide acétique (6-4 en volumes) et 240 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-10 acide acétique (1-1 en volumes) en recueillant des fractions de 40 cm3.
Les fractions 26 à 57 réunies sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45°C. Le concentrât est trituré dans 50 cm3 d'éther, séparé par filtration et séché.- On obtient ainsi 1,71 g de 2 1 6 N -fO -benzyl N-(N-docosanoyl L alanyl)-y-D glutamyU N -benzyloxycarbonyl- 15 glycyl L lysine,
Rf = 0,76 /silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique- eau 50-20-6-24 en volumes).7.
2 1
On dissout 2,17 g d'acide N -£jb -benzyl N-(N-docosanoyl L alanyl)-y ß -D glutamylj N -benzyloxycarbonylglycyl L lysine dans 80 cm3 d'acide 20 acétique tiédi à 30°C. On ajoute 2,17 g de palladium sur noir ( à 3 % de palladium) et on fait passer un léger courant d'hydrogène pendant 2 heures 1/2. On chauffe ensuite le milieu réactionnel à 50°C, le filtre, lave 3 fois l'insoluble par 30 cm3 au total d'acide acétique chauffé à 50°C. Les filtrats sont réunis et concentrés à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 25 50°C. On obtient ainsi 1,74 g d'une poudre qui est chromatographiée sur une colonne de 2,5 cm de diamètre contenant 35 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue par de l'acide acétique en recueillant des fractions de 20 cm3. Les fractions 23 à 41, réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. Le solide obtenu est repris dans 50 cm3 30 d'éther, trituré jusqu'à pulvérisation, séparé par filtration et séché sous " 2 pression réduite (0,3 mm de mercure). On obtient ainsi 410 mg de N -/N- (N-docosanoyl L alanyl)-y-D glutamyU N -glycyl L lysine.
Rf = 0,30 /silicagel ; acide acétique7 J
Analyse = Cale. % C 62,87 H 9,86 N 9,64 y· ji 35 Tr. 61,5 9,3 9,2 //
(J
/ 73
Cendres sulfuriques = 0,5 %
Après hydrolyse totale, l'analyse sur autoanalyseur Technicon révèle la présence des acides aminés suivants :
Ala 1,00 (théorie =1) > 5 Glu 0,95 (théorie = 1)
Gly 1,03 (théorie =1)
Lyo 1,00 (théorie = 1)
Le N-docosanoyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle peut être préparé de la façon suivante : 10 On ajoute 1,95 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue à 25°C, de 5,19 g d'acide docosanoxque dans un mélange de 150 cm3 de tétrahydrofuranne et de 2,1 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à 25°C, puis on ajoute une solution de 5,69 g de chlorhydrate de L alanyl-a-D glutamate de benzyle dans un mélange de 33 cm3 15 de soude IN et 17 cra3 d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant 30 minutes vers 30°C , puis pendant 18 heures vers 20°C environ. On ajoute alors 100 cm3 d'eau et on acidifie à pH 1. On obtient un précipité que l'on sépare par filtration, lave 3 fois par 75 cm3 au total d'eau et sèche sous pression réduite (0,3 mm de mercure) à 20°C. On obtient ainsi 6,53 g d'une 20 poudre blanche. On en dissout 6 g dans 50 cm3 de tétrahydrofuranne contenant 20 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On concentre à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C et on charge l'ensemble sur une colonne de 3,5 cm de diamètre contenant 180 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue successivement par : 25 1300 cm3 d'un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (1-1 en volumes) 600 cm3 d'acétate d'éthyle 500 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-tétrahydrofuranne (95-5 en volumes) 900 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-tétrahydrofuranne 30 (9-1 en volumes) 800 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-tétrahydrofuranne (8-2 en volumes) 1000 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-tétrahydrofuranne (6-4 en volumes) j 35 900 cm3 d' un mélange acétate d'éthyle-tétrahydrofuranne / / j L· (4-6 en volumes) / ff t r 74 500 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-tétrahydrofuranne (2-8 en volumes) et 600 cm3 de tétrahydrofuranne en recueillant des fractions de 100 cm3.
; 5 Les fractions 17 à 68 réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. On obtient ainsi 3,31 g de N-docosanoyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle.
Rf = 0,54 /silicagel ; acétate d'éthyle - tétrahydrofuranne (8-2 en volumes 17 10 Exemple 17 -
On ajoute 0,94 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue à -2°C, de 3,23 g de N-(cyclohexyl-3 propionyl) L alanyl-a-D glutamate de benzyle dans un mélange de 200 cm3 de tétrahydrofuranne et 1 cm3 de triéthylamine, Le mélange est agité pendant 20 minutes à 2°C, 15 puis on ajoute une solution refroidie à 2°C, de 2,44 g de N ε-benzyloxy-carbonylglycyl L lysine dans un mélange de 7,23 cm3 de soude IN et 7 cm3 d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant 15 minutes à -2°C, puis pendant 20 heures à 20°C environ. Ensuite, il est acidifié à pH 1 par addition de 20 cm3 d'acide chlorhydrique lN.On évapore le tétrahydrofuranne 20 par concentration sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45°C. Dans le concentrât, apparaît un précipité qui est séparé par filtration, lavé 5 fois par 50 cm3 au total d'eau et séché sous pression réduite (0,3 mm de mercure) à 20°C. Le produit ainsi obtenu (5,3 g) est dissous dans 50 cm3 d'acide acétique contenant 10 g de gel de silice neutre (O,04-0,063 mm).
25 On concentre à sec le mélange et on charge l'ensemble sur une colonne de 2,2 cm de diamètre contenant 100 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm).
: On élue successivement par 100 cm3 d'acétate d'éthyle, 700 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (1-1 en volumes) et 1,2 litre d'aci e acétique en recueillant des fractions de 100 cm3 .
30 Les fractions 5 à 13 réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45°C. Le concentrât est trituré dans 50 cm3 d'éther, séparé par filtration et séché. On obtient ainsi 4,21 g de 2 1 6 N -{ 0 -benzyl N-£N-(cyclohexyl-3 propionyl) L alanylJ-a-D glutamyl}N-
N
benzyloxycarbonylglycyl L lysine. / r* . . ... . / 35 Rf = 0,84 Lsilicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eatj.;/ (50-20-6-24 en volumes)/ / ίψ ί 2 1 75
On dissout 2 g de N -{0 -benzyl N-/N-(cyclohexyl-3 propionyl) L
6 alanyl7-y-D glutamyl} N benzyloxycarbonylglycyl L lysine dans 50 cra3 d'acide acétique. On ajoute 2 g de palladium sur noir (à 3 % de palladium) et on fait passer un léger courant d'hydrogène pendant 2 heures. Le - 5 catalyseur est séparé par filtration, lavé 3 fois par 15 cm3 au total d'acide acétique ; les filtrats, réunis, sont concentrés à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°G. On obtient 1,42 g d'une poudre qui est chromato— graphiée sur une colonne de 2,3 cm de diamètre contenant 28 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue successivement par 560 cm3 d'acide 10 acétique et 120 cm3 d'un mélange n.butanol-pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volumes) en recueillant des fractions de 20 cm3. Les fractions 8 à 32 réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. Le résidu ainsi obtenu (990 mg) est dissous dans 30 cm3 d'acide acétique contenant 5 g de gel de silice neutre (0,04-15 0,063 mm). On concentre à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C et on charge l'ensemble sur une colonne de 2,3 cm de diamètre contenant 20 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue successivement par 880 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (3-1 en volumes), 320 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique 20 (1-1 en volumes), 240 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (1-3 en volumes) et 440 cm3 d'acide acétique en recueillant des fractions de 40 cm3. 'Les fractions 35 à 46, réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. Le concentrât est trituré jusqu'à pulvérisation dans 40 cm3 d'éther, séparé par filtration et séché.
25 On obtient ainsi 840 mg de N ^{N-^N-(cyclohexyl-3 propionyl) L alanyl/ g -γ-D glutamyl}N -glycyl L lysine fondant vers 147-150°C (point de fusion pâteux).
Rf = 0,23 /isilicagel ; n.butane!-pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volumes )J.
30 Analyse = Cale, % C 55,44 H 8,00 N 12,93
Tr. 53,8 7,4 11,8
Cendres sulfuriques = 1,6 %
Après hydrolyse totale, l'analyse sur autoanalyseur Technicon / révèle la présence des acides aminés suivants : 35 Ala 1,00 (théorie = 1) , / /
Glu 0,97 (théorie = 1)
Gly 1,00 (théorie =1) ( '
Lys 0,98 (théorie = 1) 76
Le N-(cyclohexyl-3 propionyl) L alanyl -α-D glutamate de benzyle peut être préparé de la façon suivante i
On ajoute 3 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue à -5°C, de 3,605 g d'acide cyclohexane-3 propionique dans un s 5 mélange de 100 cm3 de tétrahydrofuranne et 3,23 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à -5°C, puis on ajoute une solution, refroidie à 5°C, de 7,96 g de chlorhydrate de L alanyl-ct-D glutamate de benzyle dans un mélange de 46,2 cm3 de soude IN et 13,8 cm3 d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant 10 minutes à 0°C, puis pendant 10 2 jours à 20°C environ. On évapore ensuite le tétrahydrofuranne sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. Le concentrât est extrait 2 fois par 80 cm3 au total d'éther, acidifié à pH 1 par addition de 50 cm3 d'acide chlorhydrique IN. L'huile qui décante du milieu réactionnel est extraite 4 fois par 200 cm3 au total d'acétate d'éthyle. Les phases acétate 15 d'éthyle réunies sont lavées par 25 cm3 d'une solution saturée de chlorure de sodium et séchées sur sulfate de magnésium anhydre. Après concentration à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C, on obtient une huile qui cristallise spontanément. Ces cristaux (7,3 g) sont dissous dans 40 cm3 d'acide acétique contenant 20 g de gel de silice neutre (0,04- 20 0,063 mm). On concentre à sec le mélange et on charge l'ensemble sur une colonne de 2,5 cm de diamètre contenant 50 g de gel de silice neutre (0,04- 0,063 mm). On élue par de l'acétate d'éthyle en recueillant des fractions de 100 cm3. La quatrième fraction est concentrée à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45°C. On obtient ainsi 1,86 g de N-(cyclohexyl-3 25 propionyl) L alanyl-a-D glutamate de benzyle fondant à 126-128°C. Les fractions 3 et 5 sont réunies et concentrées à sec. Le solide amorphe est chromatographié sur une colonne de 2,5 cm de diamètre contenant 68 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue successivement par 520 cm3 d'un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (1-1 en volumes) et 520 cm3 - 30 d'acétate d'éthyle en recueillant des fractions de 40 cm3. Les fractions 11 à 28, réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de
mercure) à 45°C. On obtient ainsi 1,37 g de N-(cyclohexyl-3 propionyl) L
alanyl-a-D glutamate de benzyle fondant à 128-130°C. /V
_ /
Rf = 0,14 Lsilicagel ; acétate d'éthyle/ , Λ l 77
Exemple 18 - - On ajoute 0,468 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue à -3°C, de 753 mg de N-benzyloxycarbonylglycine dans un mélange de 36 cm3 de tétrahydrofuranne et de 0,5 cm3 de triéthylamine. Le mélange 5 est agité pendant 20 minutes à -3°C, puis on ajoute une solution refroidie à 0°C 2,07 g d'acide N^-{N£N-(triméthyl-3,5,5 hexanoyl) L alanylJ-y-D glutamyl}DD,LI diamino-2,6 pimélamique dans un mélange de 7,2 cm3 de soude IN et 30 cm3 d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant 1 heure vers 0°C, puis pendant 20 heures vers 20°C environ. Ensuite, on l'acidifie à pH 1 par 10 addition de 12 cm3 d'acide chlorhydrique IN. On évapore le tétrahydrofuranne par concentration sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. Le concentrât est extrait 4 fois par 100 cm3 au total d'acétate d'éthyle, Les phases acétate d'éthyle réunies, sont lavées par 25 cm3 d'acide chlorhydrique 0,1N et séchées sur sulfate de sodium. Après filtration et concentration à sec 15 sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C, on obtient 2,13 g de solide amorphe que l'on dissout dans 20 cm3 d'acide acétique contenant 5 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On concentre à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C et on charge l'ensemble sur une colonne de 2 cm de diamètre contenant 40 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm).
20 On élue successivement par 400 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (9-1 en volumes), 160 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (8-2 en volumes), 200 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (7-3 en volumes), 200 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (1-1 en volumes) en recueillant des fractions de 40 cm3. Les 25 fractions 9 à 19 réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite = (20 mm de mercure) à 50°C. Le solide amorphe obtenu est repris par 40 cm3 d'éther, trituré jusqu'à pulvérisation totale, séparé par filtration et séché sous pression réduite (0,3 mm de mercure). On obtient ainsi 1,49 g - 2 d'acide N -{N-/$î-(triméthyl-3,5,5 hexanoyl) L alanyU-y-D glutamyl} 30 N^-benzyloxycarbonylglycyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique.
Rf β 0,70 /Tsilicagel ; acide acétiquq7
Rf =0,53 £silicagel ; acétate d'éthyle-acide acétique (1-1 en volumes )J.
2-
On dissout 1,45 g d'acide N -{N-Æl-(triméthyl-3,5,5 hexanoyl) g 35 L alanyU-y-D glutamyl} N -benzyloxycarbonylglycyl DD,LL diamino-2,6 / pimélamique dans 40 cm3 d'acide acétique. On ajoute 1,45 g de palladium sur/ 78 ! noir (à 3 % de palladium) et on fait passer un léger courant d'hydrogène pendant 1 heure 1/2. Après filtration et concentration à sec du filtrat . sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C, le solide amorphe est trituré dans 50 cm3 d'éther. On obtient ainsi 1,18 g de solide que l'on met 1 5 en suspension dans 150 cm3 d'eau. Après 68 heures d'agitation, on obtient une solution limpide que l'on charge sur une colonne de 2,3 cm de diamètre contenant 250 g de Sephadex G-10. On élue par de l'eau en recueillant des fractions de 100 cm3. Les fractions 2 et 3 réunies, sont lyophilisées et séchées sous vide (0,3 mm de mercure). On obtient ainsi 930 mg d'acide 2 6 10 N -{N-/N-(triméthyl-3,5,5 hexanoyl) L alanylJ-y-D glutamyl}N -glycyl DD, LL diamino-2,6 pimélamique.
Rf = 0,23 £*silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volumes )J.
Analyse - Cale. % C 53,23 H 7,90 N 14,33 15 Tr. 49,9 6,5 13,3
Cendres sulfuriques = 12,4 %
Après hydrolyse totale, l'analyse sur autoanalyseur Technicon révèle la présence des acides aminés suivants :
Ala 1,01 (théorie =1) 20 Dap 0,95 (théorie =1)
Glu 1,00 (théorie =1)
Gly 1,00 (théorie =1) 2 L'acide N -{N-/}î-(triméthyl-3,5,5 hexanoyl) L alanylJ-y-D glutamyl}DD, LL diamino-2,6 pimélamique peut être préparé de la façon 25 suivante :
On dissout 2,76 g d'acide N^-{0^-benzoyl N-ZN-(triméthyl-3,5,5 g hexanoyl) L alanylJ-y-D glutamyl}N -benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique dans 100 cm3 d'acide acétique. On ajoute 2,76 g de palladium sur noir (à 3 % de palladium) et on fait passer un léger courant d'hydrogène 30 pendant 2 heures 1/2. Après filtration et concentration à sec du filtrat sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C, l'huile est triturée dans 50 cm3 d'éther. On obtient un précipité qui est séparé par filtration et séché sous pression réduite (0,3 mm de mercure) à 20°C. On obtient ainsi 2,07 g d'acide N^-{N-/N-(triméthyl-3,5,5 hexanoyl) L alanyU-y-D glutamyl}DD,LL 35 diamino-2,6 pimélamique.
Rf = 0,32 /silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau / (50-20-6-24 en volumes)J
79 ί ·
Rf = Οj31 ^silicagel ; acide acétique^.
21' L'acide N -{0 -benzyl N-£N-(triméthyl-3,5,5 hexanoyl) L alanylj- g ; γ-D glutamyl}N -benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique peut être préparé de la façon suivante : 5 On ajoute 0,91 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue à 0°C de 3,14 g de N-(triméthyl-3,5,5 hexanoyl) L alanyl-ct-D glutamate de benzyle dans un mélange de 150 cm3 de tétrahydrofuranne et de 0,98 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à 0°C, g puis on ajoute une solution refroidie à 0°C de 2,263 g d'acide N-benzyloxy-10 carbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique dans un mélange de 7 cm3 de soude IN et 70 cm3 d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant 1 heure vers 0°C, puis pendant 20 heures vers 22°C environ. Ensuite, on élimine un léger insoluble par filtration, on acidifie à pH 1 par addition de 12 cm3 d'acide chlorhydrique IN. On évapore le tétrahydrofuranne sous pression réduite 15 (20 mm de mercure) à 50°C. Le concentrât est extrait 3 fois par 150 cm3 au total d'acétate d'éthyle. Les phases acétate d'éthyle, réunies, sont lavées par 20 cm3 d'acide chlorhydrique 0,1N, séchées sur sulfate de sodium. Après concentration à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C, t on obtient 5,14 g de solide amorphe que l'on dissout dans 60 cm3 d'un 20 mélange acétate d'éthyle-acide acétique (1-1 en volumes) contenant 10 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On concentre à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C et on charge l'ensemble sur une colonne de 3 cm de diamètre contenant 100 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue successivement par 400 cm3 d'acétate d'éthyle, 200 cm3 25 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (9-1 en volumes), 200 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (8-2 en volumes), 160 cm3 , d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (6-4 en volumes), 240 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (1-1 en volumes) en recueillant r des fractions de 40 cm3. Les fractions 15 à 25, réunies, sont concentrées 30 à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. L'huile obtenue est reprise par 50 cm3 d'éther, triturée jusqu'à pulvérisation, séparée par filtration et séchée sous pression réduite (0,3 mm de mercure). On obtient 2,85 g d'acide N -{O -benzyl N-/jî-(triméthyl-3,5,5 hexanoyl) L alanylj-γ-D glutamyl}N -benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique.
35 Rf = 0,82 £silicagel ; acétate d'éthyle-acide acétique / (3-1 en volûmes )J.
j 80
Le N-Ctriméthyl-S,5,5 hexanoyl) L alanyl-a-D glutamate de benzyle peut être préparé de la façon suivante :
On ajoute 4,3 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue à -6°C, de 7*59 6 de N-(triméthyl-3,5,5 hexanoyl) L alanine . 5 dans un mélange de 400 cm3 de tétrahydrofuranne et 4,63 cm3 de triéthyl-araine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à -6eC, puis on ajoute une solution refroidie à 3°C de S,06 g de chlorhydrate de α-D glutamate de benzyle dans un mélange de 66,2 cm3 de soude IN et i4 cm3 d'eau.
Ls mélange réactionnel est agité pendant 15 minutes vers -5°C, puis 10 pendant 66 heures vers 18°C environ; il est ensuite acidifié à pH 1 par addition de 75 cm3 d'acide chlorhydrique iN. On évapore le tétrahydrofuranne sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50eC. Le concentrât est extrait 5 fois par 200 cm3 au total d'acétate d'éthyle.
Les phases acétate d'éthyle, rémies, sont lavées par 40 cm3 d'acide 15 chlorhydrique 0,1N et séchées sur sulfate de magnésium. Après filtration et concentration à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C, on obtient l4,8 g d'huile que l'on dissout dans 50 cm3 d'acétate d'éthyle contenant JO g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On concentre à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C et on 20 charge l'ensemble sur une colonne de 2,8 cm de diamètre contenant 280 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue successivement par 2 1 de cyclohexane, 1 1 d'un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (95/5 en volumes), i,5 1 d'un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (90/10 en volumes), 5 1 d'un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (80/20 en volu-25 mes), 1,5 1 d'un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (70/50 en volumes) et 3,5 1 d'un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (50/50 en volumes) en recueillant des fractions de 500 cm3. Les fractions 23 à 29 sont réunies et concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50eC-. On obtient ainsi 10,86 g de N-(triméthyl-3,5,5 hexanoyl) L alanyl-30 cr-D glutamate de benzyle sous forme d'huile qui cristallise.
Rf = 0,37 [silicagel; acétate d'éthyle]
La N-(triméthyl-3,5,5 hexanoyl) L alanine peut être préparée de la façon suivante .
On ajoute 6,5 cm3 de chloroformiate d’isobutyle à une solution, 35 maintenue à -*5°C, de 7*912 g d'acide triméthyl-3*5*5 hexanoique dans my / 81 mélange de 125 cm3 de tétrahydrofuranne et de 7 cin3 de triéthylamine. le mélange est agité pendant 20 minutes à -5°C, puis on ajoute une solution, refroidie à 5°C, de 4,495 g de L alanine dans 50 cmj5 de soude IN. Le mélange réactionnel est agité pendant 10 minutes vers 0°C, puis pendant . 5 iß heures à 25°C environ. On évapore ensuite le tétrahydrofuranne sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. Le concentrât est extrait 2 fois par 40 cm3 au total d'éther, acidifié à pH 1 par addition de 55 cm3 d'acide chlorhydrique iN. Le précipité huileux qui se forme est extrait 5 fois par 250 cm3 au total d'acétate d'éthyle. Les phases acétate d'éthy-10 le sont réunies, lavées par 25 cm3 d'une solution saturée de chlorure de sodium et séchées sur sulfate de magnésium. Après filtration et concentration à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50eC, on obtient ii,79 g d’huile que l'on dissout dans 40 cm3 d'acétate d'éthyle contenant 20 g de gel de silice neutre (0,063-0,20 mm). On concentre à sec le •15 mélange sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50eC et on charge l'ensemble sur me colonne de 3 cra de diamètre contenant 120 g de gel de silice neutre (0,063-0,20 mm). On élue successivement par 600 cra3 de cyclohexane, 300 cm3 d'un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (95/5 volumes), 300 cm3 d’un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (90/10 en 20 volumes), 300 cm3 d'un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (80/20 en volumes), 700 cm3 d'un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (50/50 en volumes), 300 cm3 d'acétate d'éthyle et 300 cra3 d'un mélange acétate d’éthyle-méthanol (90/10 en volumes) en recueillant des fractions de 100 cm3. les fractions 17 à 28 réunies, sont concentrées à sec sous 25 pression réduite (20 mm de mercure) à 45 °C. On obtient ainsi 10,16 g d'huile que l'on dissout dans 25 cm3 d'éther. Par addition de 150 cmp - d'éther de pétrole, on obtient une huile que l'on sépare par décantation. Après séchage sous vide (0,2 mm de mercure), on obtient 7*59 g de - g N-(triméthyl-3,5,5 hexanoyl) L alanine. ^ f 30 Rf « 0,43 [silieagel; acétate d'éthyle) / / / w Ψ / ? ( ' 82
Exemple 19 -
On ajoute 0,91 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue à 0°C, de 3,14 g de N-(triméthyl-3,5,5 hexanoyl) L alanyl-ot-D glutamate de benzyle dans un mélange de 150 cm3 de tétrahydrofuranne et 5 de 0,98 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à -2°C, puis on ajoute une solution refroidie à 2°G de 2,36 g de N ε-benzyl-oxycarbonylglycyl L lysine dans un mélange de 7 cm3 de soude IN et 20 cm3 d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant 1 heure vers 0°C, puis pendant 20 heures vers 20°C environ. On l'acidifie ensuite à pH 1 par 10 addition de 12 cm3 d'acide chlorhydrique IN. On évapore le tétrahydrofuranne sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. Le concentrât est extrait 5 fois par 125 cm3 au total d'acétate d'éthyle. Les phases acétate d'éthyle réunies, sont lavées par 25 cm3 d'acide chlorhydrique 0,1N et séchées sur sulfate de sodium. Après filtration et concentration à sec sous pression 15 réduite (20 mm de mercure) à 50°C, on obtient 4,41 g de solide amorphe que l'on dissout dans 50 cm3 d'acétate d'éthyle contenant 15 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On concentre à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure) à 20°C et on charge l'ensemble sur une colonne de 3,5 cm de diamètre contenant 100 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). 20 On élue successivement par 480 cm3 d'acétate d'éthyle, 160 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (95-5 en volumes), 440 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (9-1 en volumes) en recueillant des fractions de 40 cm3. Les fractions 16 à 46 réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. On obtient ainsi 4,38 g de 25 N α-{θ -benzyl N-^N-(triméthyl-3,5,5 hexanoyl) L alanylJ-y-D glutamyl} N ε-benzyloxycarbonylglycyl L lysine sous forme d'huile.
Rf = 0,84 ^silicagel ; acétate d'éthyle-acide acétique (3-1 en volumes 17.
On dissout 2,14 g de N cr-{01-benzyl N-0-(triméthyl-3,5,5 hexanoyl) 30 L alanyl—y-D glutamyl}N g-benzyloxycarbonylglycyl L lysine dans 100 cm3 d'acide acétique. On ajoute 2,14 g de palladium sur noir (à 3 % de palladium) et on fait passer un léger courant d'hydrogène pendant 1 heure 40 minutes. Après filtration et concentration à sec du filtrat sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C, le solide amorphe est trituré dans 35 50 cm3 d'éther. On obtient un précipité qui est séparé par filtration et / 7/ uf / l ! 83 séché sous pression réduite (0,3 mm de mercure) à 20°C. On obtient ainsi 1,11 g de N a-{N-/N-(triméthyl-3,5,5 hexanoyl) L alanyl7-y-D glutamyl} , N e-glycyl L lysine.
Rf = 0,37 £silicagel ; acide acétiquej •'5 Rf = 0,28 Silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volumes )J.
Analyse = Cale. % C 55,23 H 8,35 N 12,88
Tr. 52,2 7,7 11,9
Cendres sulfuriques = 2 % 10 Après hydrolyse totale, l'analyse sur autoanalyseur Technicon révèle la présence des acides aminés suivants :
Ala 1,00 (théorie =1)
Glu 0,94 (théorie = 1)
Gly 1,02 (théorie = 1) 15 Lys 1,02 (théorie =1)
Exemple 20 -
On ajoute 1,26 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue à 10°C, de 1,52 g d'acide nonanoique dans un mélange de 120 cm3 de dioxanne et de 1,35 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 20 minutes à 10°C, puis on ajoute une solution refroidie à 10°C de 3,5 g de chlorhydrate de N α-ZÔ^-benzyl N-L alanyl-γ-ϋ glutamyU N e-(benzyloxy-carbonylglycyl) L lysine dans un mélange de 9,6 cm3 de soude IN et 10 cm3 d'eau. Le’ mélange réactionnel est agité pendant quelques minutes vers 10°C puis pendant 15 minutes vers 20°C environ. On concentre ensuite le milieu 25 réactionnel sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45°C. Au concentrât, on ajoute 160 cm3 d'eau et on acidifie à pH 2 par addition de 5 cm3 d'acide chlorhydrique IN. On extrait 3 fois par 150 cm3 au total d'acétate d'éthyle. Les phases acétate d'éthyle, réunies, sont lavées par 100 cm3 d’une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de magnésium 30 et concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45°C. La masse gélatineuse ainsi obtenue est reprise par 100 cm3 d'éther, triturée jusqu'à pulvérisation totale, séparée par filtration, lavée 4 fois par 200 cm3 au total d'éther et séchée à l'air libre. On obtient 2,2 g de poudre blanche que l'on dissout dans 30 cm3 d'acide acétique contenant 4 g 35 de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On concentre à sec le mélange sous pression réduite) à 50°C et on charge l'ensemble sur une colonne de 3 ,/7 / .
Z# j 84 de diamètre contenant 100 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue par un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (9-1 en volumes) en recueillant des fractions de 50 cm3. Les fractions 8 à 22 réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. L'huile 5 obtenue est reprise par 100 cm3 d'éther, triturée jusqu'à pulvérisation totale, séparée par filtration et séchée sous pression réduite (0,3 mm de mercure) à 50°C. On obtient ainsi 1,3 g de N ot-£f) -benzyl N-(N-nonanoyl L alanyl)-y-D glutamylj N e-(benzyloxycarbonylglycyl) L lysine.
Rf = 0,74 £silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau 10 (50-20-6-24 en volumes )J.
Dans une solution de 1,2 g de Na-/jÖ*-benzyl N-(N-nonanoyl L alanyl)-y-D glutamylj N e-(benzyloxycarbonylglycyl) L lysine dans 100 cm3 d'acide trifluoracétique, on fait barboter de l'acide bromhydrique pendant 90 minutes. Ensuite, on concentre à sec la solution sous pression réduite 15 (20 mm de mercure) à 50°C, On obtient une huile que l'on reprend par 50 cm3 d'acétate d'éthyle, triture jusqu'à pulvérisation totale, sépare par filtration, lave 3 fois par 150 cm3 au total d'éther et sèche sous pression réduite (0,3 mm de mercure) à 20°C. On obtient ainsi 0,9 g de poudre que l'on chromatographie sur une colonne de 2,5 cm de diamètre 20 contenant 50 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue par un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (l-l en volumes) en recueillant des fractions de 50 cm3 , Les fractions 21 à 57 réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. On obtient une huile que l'on reprend par 50 cm3 d'acétate d'éthyle, triture jusqu'à 25 pulvérisation totale, sépare par filtration, lave 2 fois par 60 cm3 au total d'éther et sèche sous pression réduite (0,3 mm de mercure) à 20°C.
On obtient ainsi 0,49 g de bromhydrate de N a-/N-(N-nonanoyl L alanyl)-Ύ-D glutamylj N ε-glycyl L lysine.
Rf = 0,30 £silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau 30 (50-20-6-24 en volumes)J.
Analyse = Cale. % C 48,07 H 7,42 N 11,21
Tr. 45,3 7,3 10,5
Cendres sulfuriques =5,1%
Après hydrolyse totale, l'analyse sur autoanalyseur Technicon / 35 révèle la présence des acides aminés suivants : , / jr 85
Ala 1,00 (théorie = 1)
Glu 1,03 (théorie =1) « Gly 1,00 (théorie = 1)
Lys 1,04 (théorie =1) 5 5 Le chlorhydrate de N α-^Ο^-benzyl N- L alanyl-y-D glutamylj N ε- (benzyloxycarbonylglycyl) L lysine peut être préparé de la façon suivante : On dissout 3,5 g de N α-ΖΓθ^-benzyl N-t.butyloxycarbonyl L alanyl-γ-D glutamylJ N s-(benzyloxycarbonylglycyl) L lysine dans 20 cm3 d'une solution saturée anhydre d'acide acétique chlorhydrique. On.laisse en 10 contact pendant 1 heure à 20°C, ensuite on coule la solution dans 1 litre d'éther. On obtient un précipité que l'on sépare par filtration, lave 2 fois par 200 cm3 au total d'éther et sèche sous pression réduite (20 mm de mercure) à 20°C. On obtient ainsi 3,5 g de chlorhydrate de N a-ZÔ^-benzyl N- L alanyl-y-D glutamylj N s-(benzyloxycarbonylglycyl) L lysine.
15 Exemple 21 -
On ajoute 0,27 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue à -4°C, de 425 mg de N-benzyloxycarbonyl glycine dans un mélange de 40 cm3 de tétrahydrofuranne et de 0,28 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à -4°C, puis on ajoute une solution refroidie 20 à 0°C de 1,16 g d'acide N^-^S-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamylj LL
diamino-2,6 pimélamique dans un mélange de 4 cm3 de soude IN et 6 cm3 d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant 15 minutes vers -5°C, puis pendant 20 heures vers 20°C environ. Ensuite, on élimine un léger trouble par filtration, on concentre le filtrat sous pression réduite (20 mm de 25 mercure) à 45°C ; au concentrât, on ajoute 30 çm3 d'eau. Un précipité se forme lentement. On le sépare par filtration, le lave par 20 cm3 d'eau et le sèche à l'air libre. On obtient ainsi 1,38 g de poudre crème que l'on chromatographie sur 70 g de gel de silice neutre (O,04-0,063 mm) contenus dans une colonne de 2,8 cm de diamètre.On élue successivement 30 par 250 cm3 d'acétate d'éthyle, 950 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (95-5 en volumes), 800 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (9-1 en volumes), 800 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle- acide acétique (8-2 en volumes), 350 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle- acide acétique (7-3 en volumes) en recueillant des fractions de 50 cm3.
35 Les fractions 38 à 62, réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. L'huile obtenue est reprise par 100 cœÔ / 86 d'éther, triturée jusqu'à pulvérisation totale, séparée par filtration et séchée sous pression réduite (0,3 mm de mercure) à 40°C. On obtient ainsi 2 6 4 1,03 g d'acide N -/N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamylj N -benzyloxycarbonyl- glycyl LL diamino-2,6 pimélamique.
; 5' Rf = 0,54 Zsilicagel ; acétate d'éthyle-acide acétique (1-1 en volumes )J.
2
On dissout 1,18 g d'acide N -/îï-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl7 g N -benzyloxycarbonylglycyl LL diamino-2,6 pimélamique dans 32 cm3 d'acide acétique. On ajoute 1,18 g de palladium sur noir (à 3 % de palladium) et 10 on fait passer un léger courant d'hydrogène pendant 5 heures. Après filtration et concentration à sec du filtrat sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C, le produit amorphe obtenu est trituré dans 30 cm3 d'acétate d'éthyle, séparé par filtration, lavé 2 fois par 40 cm3 au total d'acétate d'éthyle et 20 cm3 d'éther. On obtient ainsi 0,88 g de poudre 15 crème que l'on dissout dans 20 cm3 d'acide acétique contenant 1,6 g de gel de silice neutre (O,04-0,063 mm). On concentre à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C et on charge l'ensemble sur une colonne de 1,8 cm de diamètre contenant 16 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue successivement par 650 cm3 d'un mélange acétate 20 d'éthyle-acide acétique (1-1 en volumes) et 1,4 litre d'un mélange . acétate d'éthyle-acide acétique (1-3 en volumes) en recueillant des fractions de 50 cm3. Les fractions 15 à 30, réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. Le produit amorphe ainsi obtenu est repris par 50 cm3 d'acétate d'éthyle, séparé par filtration, 25 lavé 2 fois par 40 cm3 au total d'acétate d'éthyle, puis par 30 cm3 d'éther. Après séchage sous pression réduite (0,3 mm de mercure) à 40°C, on , obtient 0,44 g d'acide N ZN-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamylj N -glycyl LL diamino-2,6 pimélamique. r
Rf = 0,30 /silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau 30 (50-20-6-24 en volumes )J.
Analyse = Cale. % C 55,40 H 8,34 N 13,36
Tr. 53,0 8,3 12,6
Cendres sulfuriques = 3,2 %
Après hydrolyse totale, l'analyse sur autoanalyseur Technicon 35 révèle la présence des acides aminés suivants : y/
Ala 1,04 (théorie = 1) 87
Dap 0,98 (théorie =1)
Glu 1,00 (théorie =1)
Gly 1,00 (théorie =1) L’acide î^-[N-(N-lauroyl L alanyl)-ï-D glutamyl] LL diamino-2,6 - 5 pimélamique peut être préparé de la façon suivante :
On dissout 1,36 g d'acide -[o^-benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)-ï-D glutamyl] N^-benzyloxycarbonyl LL diamino-2,6 pimélamique dans 40 cm3 d'acide acétique. On ajoute 1,4 g de palladium sur noir (à 3 % de palladium) et on fait passer un léger courant d'hydrogène pendant 4 heures.
10 Après filtration et concentration à sec du filtrat sous pression réduite (20 mm de mercure) à 55°C, l'huile obtenue est reprise par 100 cm3 d'éther, triturée jusqu'à pulvérisation totale, séparée par filtration et séchée à l'air. On obtient ainsi 0,96 g d'acide N^-[N-(N-lauroyl L ala-nyl)-Y-D glutamyl]LL diamino-2,6 pimélamique 15 Rf = 0,38 jsilicagel; n-butanol-pyridine-acide acétique-eau (50/20/6/24 en volumes )"].
2 1 L'acide N -£θ -benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)-y- D glutamyl7 g N -benzyloxycarbonyl L,L diamino-2,6 pimélamique peut être préparé de la façon suivante : 20 On ajoute 0,69 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue à -5°C, de 2,57 g de N-lauroyl L alanyl-^-D glutamate de benzyle dans un mélange de 120 cm3 de tétrahydrofuranne et de 0,74 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à -5°C, puis on ajoute une solution refroidie à 0°C de 1,7 g d'acide N -benzyloxy-25 carbonyl LL diamino-2,6 pimélamique dans un mélange de 5*25 cnrj de soude IN et 35 cm3 d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant 20 minutes vers -3°C, puis pendant 22 heures vers 20°C environ. Ensuite, on l'acidifie à pH 2 par addition de 20 cm3 d'acide chlorhydrique IN. le précipité formé est séparé par filtration, lavé 3 fois par 60 cm3 30 au total d'acide chlorhydrique 0,1 N et 3 fois par 60 cmp au total d'eau. Après séchage à l'air libre, on obtient 3*97 S de poudre blanche que l'on chromatographie sur 200 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm) contenus dans une colonne de 3*8 cm de diamètre.
On élue successivement par : 35 600 cm3 d'acétate d'éthyle, 500 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (95/5 en volumes), /
T
88 800 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (9/1 en volumes) en recueillant des fractions de 50 cm3. Les fractions 24 à réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. L'huile obtenue est reprise par 100 cm3 d'éther, triturée jusqu'à - 5 pulvérisation totale, séparée par filtration et séchée sous pression réduite (0,3 mm de mercure). On obtient ainsi 1,24 g d'acide Ν^-(θ^-benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)-Y-D glutamylj N^-benzyloxycarbonyl LL dia-mino-2,6 pimélamique
Rf = 0,85 [silicagelj n-butanol-pyridine-acide acétique-eau 10 (50/20/6/24 en volumes )j
Rf = 0,76 /silicagel ; acétate d'éthyle-acide acétique (3/1 en volumes ).7 .
L'acide N^-benzyloxycarbonyl I^L diamino-2,6 pimélamique peut être préparé de la façon suivante : 15 A une solution de 5 S de dichlorhydrate de l'acide LL diami no-2,6 pimélamique dans 15 cm3 d'eau amenée à pH 10 par addition de 45 cm3 de soude IN, on ajoute 2,l4 g de bromure cuivrique dissous dans 20 cm3 d'eau. On agite le mélange réactionnel pendant 2 heures à 20°C environ. On sépare par filtration un. léger insoluble, puis on refroidit 20 le filtrat à une température comprise entre -3°C et 0eC. On ajoute 4,8 g de bicarbonate de sodium et ensuite, goutte à goutte en 30 minutes, 4,1 cm3 de chloroformiate de benzyle. Le mélange réactionnel est agité pendant 18 heures à une température voisine de 20°C. Le précipité bleu formé est séparé par filtration, lavé 3 fois par 90 cra3 au total d'eau, 25 3 fois par 90 cm3 au total d’éthanol et 3 fois par 90 cm3 au total d'éther. Aores séchage sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C, g on obtient 4,18 S de complexe cuivrique de l'acide N -benzyloxycarbonyl LL-diamino-2,6 pimélamique que l'on ajoute à 28 cm3 d'acide chlorhydrique IN. On agite pendant 1 heure à une température voisine de 20°C. Un inso-30 lubie est séparé par filtration. Au filtrat, on ajoute l4 cm3 de méthanol puis on fait passer un courant d'hydrogène sulfuré pendant 6 heures.
On laisse reposer pendant 16 heures. La bouillie noire obtenue est filtrée, lavée 3 fois par 15 cm3 au total d'eau. Les filtrats réunis sont concentrés jusqu'à un volume de 10 cm3 sous pression réduite (20 ram / 89 de mercure) à 50°C, amenés à pH 7 par addition de 5 0^3 de triéthylamine, et amenés à pH 6,8 par addition de 5 cm3 d'acide chlorhydrique IN. La bouillie blanche ainsi obtenue est conservée à 0°C pendant 2 heures. le produit qui se sépare par filtration est lavé successivement 3 fois 5 par 30 cm3 au total d'eau, 3 fois par 30 cm3 au total d'éthanol et 3 fois par 30 cm3 au total d'éther. Après séchage à 60°C sous pression réduite (0,3 mm de mercure), on obtient 1,78 g d'acide N-benzyloxycarbonyl L,L diamino-2,6 pimélamique JVj2D°e - +11° (8 = 1, HCl IN) 10 Rf = 0,^5 [silicagel; n-butanol-pyridine-acide acétique-eau (50/20/6/24 en volumes)].
Le dichlorhydrate de l’acide L,L diamino-2,6 pimélamique peut être préparé de la façon suivante :
On dissout 17 g d'acide L,L dibenzyloxycarbonylamino-2,6 15 pimélamique dans un mélange de 300 cm3 de méthanol et de 5,9 om3 d'acide chlorhydrique concentré (d = 1,19). On ajoute 17 g de palladium sur noir (à 3 de palladium) et on fait passer un courant d'hydrogène pendant 4 heures. Après filtration et concentration à sec du filtrat sous pression réduite (20 mm de mercure) à 55°C, on obtient 8,8 g de 20 dichlorhydrate de l'acide L,L diamino-2,6 pimélamique sous forme de meringue.
L'acide L,L dibenzyloxycarbonylamino-2,6 pimélamique peut être préparé de la façon suivante :
On dissout 19 g de L,L N^P-dibenzyloxycarbonyl diamino-2,6 25 pimélate acide de benzyle dans 190 cm3 de méthanol. On refroidit cette solution vers 0°C et on la sature d'ammoniac. Dès qu'elle est saturée, on la transvase dans un autoclave de 1 litre. Après avoir fermé cet autoclave, on 1¾ conserve pendant 6 jours à 20eC environ. Après dégazage, la solution ainsi obtenue est concentrée sous pression réduite (20 mm 3° de mercure) à 50°C. Le résidu est dissous dans 250 cm3 d'eau et la solution obtenue est amenée à pH 2 par addition de 30 cm3 d'acide chlorhydrique 4N, extraite 3 fois par 300 cm3 au total d'acétate d'éthyle; cette phase organique est lavée par ICO cm3 d'une solution saturée de chlorure de sodium, séchée sur sulfate de sodium et concentrée 35 à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. On obtient ainsi λ 17 g d'acide L,L dibenzyloxycarbonylamino-2,6 pimélamique sous former,/ i ' 90 d’huile.
Rf = 0,68 [silicagelj n-butanol—pyridine-acide acétique-eau * (50/20/6/24 en volumes)].
Le L,L ΐ^,Ν^-dibenzyloxycarbonyl diamino-2,6 pimélate acide 5 de benzyle peut être préparé de'la façon suivante· :
On dissout 55 S de L,L Ν^,Ν^-dibenzyloxycarbonyl diamino-2,6 pimélate de benzyle dans 400 cmj d’alcool benzylique tiédi à 40°C.
Ensuite, on coule sur cette solution maintenue à 40eC pendant l heure environ, une solution de 4,8 g de potasse en pastilles à 86 % dans 10 400 cm3 d'alcool benzylique en 6 heures 1/2. On continue d'agiter le milieu réactionnel à 20°C environ pendant l6 heures, ensuite on concentre à sec sous pression réduite (0,5 mm de mercure) à 90°C. On obtient ainsi une huile que l'on dissout dans 1 litre d'eau, extrait 5 fois par 900 cm3 au total d'acétate d'éthyle. La phase aqueuse ainsi extraite 15 est acidifiée à pH 2 par addition de 45 cmj5 d'acide chlorhydrique 4n, extraite 3 fois par 1,5 1 au total d'acétate d'éthyle. La phase acétate d'éthyle ainsi obtenue est lavée avec 500 cm3 d'une solution saturée de chlorure de sodium et séchée sur sulfate de sodium anhydre. Après séparation par filtration du sulfate de sodium, on ajoute 17 em3 de 20 dicyclohexylamine et on concentre à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 4o°C. On obtient une huile jaune que l'on dissout dans 100 cm3 d éthanol auquel on ajoute 100 cm3 d eau. Après 20 h de repos à 0°C on obtient un solide blanc que l’on sépare par filtration, lave 2 fois par 100 cm3 au total d'eau et reprend dans un mélange de 200 cm3 25 d'acétate d'éthyle et 200 cm3 d'eau. On acidifie la phase aqueuse par addition de 40 cm3 d'une solution normale d'acide méthanesulfonique.
Après décantation, la phase organique est lavée 2 fois par 100 cm3 au total d'eau, séchée sur sulfate de sodium anhydre et concentrée à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. On obtient ainsi 15 g '30 de L,L N^,N^-dibenzyloxycarbonyl diamino-2,6 pimélate acide de benzyle sous forme d'huile.
Rf =0,76 [silicagal, n-butanol-pyridine-acide acétique-eau (50/20/6/24 en volumes )] .
Le L,L Ν^,Ν^-dibenzyloxycarbonyl diamino-2,6 pimélate de diben-,/ 35 zyle peut etre préparé de la façon suivante : j 91
Dans un tricol de 500 cm3, muni d'une agitation centrale et d'un appareil Dean Stark, on ajoute un mélange de 44,7 S d'acide L,L N2, N^-dibenzyloxycarbonyl diamino-2,6 pimélique, 3 £ d'acide p-toluène-sulfonique, 30 cm3 d'alcool benzylique et 300 cm3 de toluène. On porte 5 le milieu réactionnel au reflux pendant 5 heures. Ensuite, après 16 heures d'agitation à 20°C, on sépare l'insoluble blanc par filtration, le lave 2 fois par 400 cm3 au total d'une solution à 5 % de carbonate de sodium et 2 fois par 400 cra3 au total d'eau. Après séchage à l'air libre, on obtient 55,4 g de L,L N^N^-dibenzyloxycarbonyl diamino-2,6 10 pimélate de dibenzyle fondant à ll8°C.
Rf = 0,53 [silicagel; acide acétique-acétate d'éthyle (8/2 en volumes)].
L'acide L,L N^,N^-dibenzyloxycarbonyl diamino-2,6 pimélique peut être préparé selon la méthode de A. ARENDT et coll,, Roczniki 15 Chemii Ann. Soc. Chim. Polonorum 48, 635 (1974).
Exemple 22 -
On ajoute 0,45 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue à -5°C, de 410 mg de N-acétylglycine dans un mélange de 70 cm3 de tétrahydrofuranne et de 0,49 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité 20 pendant 20 minutes à -5°C, puis on ajoute une solution refroidie à 5°C de 2 g d'acide N -/N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl7 DD,LL diamino-2,6 pimélamique dans un mélange de 7 cm3 de soude IN et 10 cm3 d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant quelques minutes vers 0°C, puis pendant 20 heures vers 20°C. On l'acidifie ensuite à pH 1 par addition 25 de 10 cm3 d'acide chlorhydrique IN. On concentre à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. On reprend le solide amorphe par 20 cm3 d'acide acétique contenant 5 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm).
On concentre à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C et on charge l'ensemble sur une colonne de 3 cm de diamètre contenant 30 70 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue successivement par 280 cm3 d'acétate d'éthyle, 160 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (9-1 en volumes), 440 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (75-25 en volumes), 240 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (1-1 en volumes), 920 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide 35 acétique (1-4 en volumes) en recueillant des fractions de 40 cm3. . / ί 92
Les fractions 33 à 41, réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 tnm de mercure) à 50°C. Le solide amorphe obtenu est repris par 50 cm3 „ d'éther, trituré jusqu'à pulvérisation totale, séparé par filtration et séché sous pression réduite (0,3 mm de mercure). On obtient ainsi 920 mg ’ * 5 de poudre blanche que l'on chromatographie sur une colonne de 2 cm de diamètre contenant 25 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue successivement par 50 cm3 d'acétate d'éthyle, 100 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (9-1 en volumes), 100 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (3-1 en volumes), 200 cm3 d'un mélange acétate 10 d'éthyle-acide acétique (1-1 en volumes), 200 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (1-3 en volumes) et 75 cm3 d'acide acétique en recueillant des fractions de 25 cm3. Les fractions 17 à 27, réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. Le solide amorphe obtenu est repris par 50 cm3 d'éther, trituré jusqu'à 15 pulvérisation totale, séparé par filtration et séché sous pression réduite (0,3 mm de mercure) à 60°C. On obtient ainsi 720 mg d'acide N £N-(N- g lauroyl L alanyl-y-D glutamyU N -(N-acétylglycyl) DD,LL diamino-2,6 pimélamique fondant à partir de 135°C (point de fusion pâteux).
Rf = 0,45 £silicagel ; acide acétique7 20 Analyse = Cale, % C 55,51 H 8,11 N 12,53
Tr. 54,3 8,0 12,3
Cendres sulfuriques = 4,36 %
Après hydrolyse totale, l'analyse sur autoanalyseur Technicon révèle la présence des acides aminés suivants : 25 Ala 1,04 (théorie = 1)
Dap 0,97 (théorie = 1)
Glu 1,02 (théorie = 1)
Gly 1,00 (théorie =1)
Exemple 23 - 30 On ajoute 0,45 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue à -5°C, de 781 mg de N-benzyloxycarbonyl D alanine dans un mélange de 70 cm3 de tétrahydrofuranne et de 0,49 cm3 de triéthylamine.
Le mélange est agité pendant 20 minutes à -5°C, puis on ajoute une solution refroidie à 5°C de 2 g d'acide N -/N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D 35 glutamyiy DD,LL diamino-2,6 pimélamique dans un mélange de 7 cm3 de soude ljï ,/
Y
93 et 10 cm3 d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant quelques minutes vers 0°C, puis pendant 20 heures vers 20°C environ. On l'acidifie ensuite à pH 1 par addition de 10 cm3 d'acide chlorhydrique IN. On évapore le tétrahydrofuranne»par concentration sous pression réduite (20 mm de mercure) i 5 à 50°C. Le concentrât est extrait 3 fois par 180 cm3 au total d'acétate d'éthyle. Les phases acétate d'éthyle réunies, sont lavées par 20 cm3 d'acide chlorhydrique 0,1 N, 20 cm3 d'eau, séchées sur sulfate de sodium. Après concentration à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C, on obtient 3 g de poudre que l'on dissout dans 60 cm3 d'acide acétique 10 contenant 6 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On concentre à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure) à 20°C et on charge l'ensemble sur une colonne de 3 cm de diamètre contenant 82 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue successivement par 250 cm3 d'acétate d'éthyle, 250 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (95-5 15 en volumes), 250 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (9-1 en volumes), 300 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (85-15 en volumes),750 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (8-2 en volumes), 250 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (7-3 en volumes) en recueillant des fractions de 50 cm3. Les fractions 23 à 20 34, réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. Le solide amorphe ainsi obtenu est repris par 100 cm3 d'éther, trituré jusqu'à pulvérisation totale, séparé par filtration et séché sous pression réduite (0,3 mm de mercure). On obtient 1,15 g 2 6 d'acide N -/N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamylj N -(N-benzyloxycarbonyl 25 D alanyl) DD,LL diamino-2,6 pimélamique sous forme de poudre blanche,
Rf = 0,68 /silicagel ; acétate d'éthyle-acide acétique (1-1 en volumes )J.
2
On dissout 1,09 g d'acide N -/N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D
6 ; glutamylj N -(N-benzyloxycarbonyl D alanyl) DD,LL diamino-2,6 pimélamique 30 dans 26 cm3 d'acide acétique. On ajoute 1,09 g de palladium sur noir (à 3 % de palladium) et on fait passer un léger courant d'hydrogène pendant 2 heures. Le catalyseur est séparé par filtration, le filtrat est concentré à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. L'huile ainsi obtenue est reprise par 40 cm3 d'éther, triturée jusqu'à pulvérisation 35 totale, séparée par filtration, lavée 2 fois par 20 cm3 au total d'éther et séchée sous pression réduite (20 mm de mercure) à 20°C. On obtient ainsi' . ~ / / Λ l/ 94 820 mg de poudre que l'on chromatographie sur une colonne de 2 cm de diamètre contenant 25 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue successivement par 120 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (9-1 en volumes), 240 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique " 5 (75-25 en volumes), 240 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (1-1 en volumes), 720 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (1-3 en volumes) en recueillant des fractions de 50 cm3. Les fractions 18 à 33, réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. L'huile obtenue est reprise par 40 cm3 d'éther, 10 triturée jusqu'à pulvérisation totale, séparée par filtration et séchée sous pression réduite (0,3 mm de mercure) à 60°C. On obtient ainsi 480 mg d'acide N -/N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamylj N -D alanyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique.
Rf = 0,14 Æsilicagel ; acide acétiquej 15 Analyse = Cale. % C 56,06 H 8,47 N 13,07
Tr. 52,5 8,0 12,5
Cendres sulfuriques = 5,3 %
Après hydrolyse totale, l'analyse sur autoanalyseur Technicon révèle la présence des acides aminés suivants : 20 Ala 2,01 (théorie = 2)
Dap 1,00 (théorie = 1)
Glu 1,10 (théorie =1)
Exemple 24 -
On ajoute 0,42 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, 25 maintenue à -5°C, de 670 mg de N-benzyloxycarbonyl glycine dans un mélange de 60 cm3 de tétrahydrofuranne et de 0,45 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à -5°C, puis on ajoute une solution refroidie à 5°C de 1,87 g d'acide N -£tï-(N-undécanoyl L alanyl)-y-D glutamyiy LL,DD diamino-2,6 pimélamique dans un mélange de 6,4 cm3 de soude IN et 10 cm3 30 d'eau, Le mélange réactionnel est agité pendant quelques minutes vers 0°C, puis pendant 18 heures vers 20°C environ. On l'acidifie ensuite à pH 1 par addition.de 10 cm3 d'acide chlorhydrique IN. On évapore le tétrahydrofuranne par concentration sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. Le concentrât est extrait par 100 cm3 d'acétate d'éthyle. La phase acétate 35 d'éthyle est lavée par 50 cm3 d'acide chlorhydrique 0,1 N, séchée sur /’
//J
7 / \ 95 sulfate de sodium. Après concentration à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C, on obtient 2,3 g de solide que l'on dissout dans 4 20 cm3 d'acide acétique contenant 5 g de gel de silice neutre (0,04- 0,063 mm). On concentre à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de 5 mercure) à 50°C et on charge l'ensemble sur une colonne de 2,3 cm de diamètre contenant 50 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue successivement par 140 cm3 d'acétate d'éthyle, 80 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (95—5 en volumes), 80 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (9-1 en volumes), 160 cm3 d'un mélange acétate 10 d'éthyle-acide acétique (85-15 en volumes), 240 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (8-2 en volumes), 320 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (7-3 en volumes) en recueillant des fractions de 20 cm3. Les fractions 29 à 46, réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. L'huile obtenue est reprise par 60 cm3 15 d'éther, triturée jusqu'à pulvérisation totale, séparée par filtration et séchée sous pression réduite (0,3 mm de mercure). On obtient ainsi 2 _ g 1,32 g d'acide N -£N-(N-undécanoyl L alanyl)-y-D glutamyl/ N (benzyloxy- carbonylglycyl) LL,DD diamino-2,6 pimélamique.
Rf = 0,85 Zsilicagel ; acide acétique7 20 Rf - 0,68 £silicagel ; acétate d'éthyle-acide acétique (1-1 en volumes )_7 .
2
On dissout 1,32 g d'acide N -/Jf-(N-undécanoyl L alanyl)-y-D
g glutamyl7 N -(benzyloxycarbonylglycyl) LL,DD diamino-2,6 pimélamique dans 18 cm3 d'acide acétique. On ajoute 1,32 g de palladium sur noir (à 3 % 25 de palladium) et on fait passer un léger courant d'hydrogène pendant 3 heures. Après filtration et concentration à sec du filtrat sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C, l'huile obtenue est triturée dans 50 cm3 d'éther jusqu'à pulvérisation totale, séparée par filtration et séchée sous pression réduite (0,3 mm de mercure) à 20°C. On obtient 30 1,16 g de poudre que l'on chromatographie sur une colonne de 1,8 cm de diamètre contenant 25 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue par de l'acide acétique en recueillant des fractions de 20 cm3. Les fractions 5 à 19, réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. Le solide obtenu est repris par 40 cm3 d'éther, 35 séparé par filtration et séché sous pression réduite (0,3 mm de mercure) 2 à 60°C. On obtient ainsi 580 mg d'acide N -^î-(N-undécanoyl L alanyl) i 6 / -Y-D glutamylj N -glycyl LL,DD diamino-2,6 pimélamique, 96
Rf = 0,24 jfsilicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volûmes )J.
, Analyse - Cale. % C 54,71 H 8,20 N 13,67
Tr. 53,2 8,2 13,6 ‘ 5 Cendres sulfuriques = 1,7 %
Après hydrolyse totale, l'analyse sur autoanalyseur Technicon révèle la présence des acides aminés suivants :
Ala 1,01 (théorie = 1)
Dap 0,94 (théorie =1) 10 Glu 1,00 (théorie =1)
Gly 1,00 (théorie =1) 2 L'acide N -/Jl-(N-undécanoyl L alanyl)-Y~D glutamylj LL,DD diamino-2,6 pimélamique peut être préparé de la façon suivante :
On dissout 2,55 S d'acide [o^-benzyl N-(N-undécanoyl L alanyl)-15 Y-D glutamylj N^-benzyloxycarbonyl LL,DD diamino-2,6 pimélamique dans 55 cm5 d'acide acétique. On ajoute 2,55 g de palladium sur noir (à yfo de palladium) et on fait passer un léger courant d'hydrogêne pendant 2 heures 1/2. Le catalyseur est séparé par filtration et lavé 5 fois par 50 cra3 au total d'acide acétique. Le filtrat est concentré à sec sous pression 20 réduite (20 mm de mercure) à 50eC. Le solide amorphe est repris par 50 cm3 d'éther, filtré et séché sous pression réduite (20 mm de mercure) à 20°C. On obtient ainsi 1,87 S d'acide [n-(N-undécanoy1 L alanyl)-γ- D glutamyljLL,DD diamino-2,6 pimélamique.
Rf = 0,75 (silicagel; acide acétique).
2 1 * 25 L'acide N -β) -benzyl N-(N-undécanoyl L alanyl)-y-D glutamyl7 g N -benzyloxycarbonyl LL,DD diamino-2,6 pimélamique peut être préparé de / 5 la façon suivante : /1/ ί / .
97
On ajoute 0,65 cnC5 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue à -5°C, de 2,585 S de N-undécanoyl L alanyl-a-D glutamate de · benzyle dans un mélange de 100 cm3 de tétrahydrofuranne et de 0,7 cm3 de ' 5 triéthylamine, Le mélange est agité pendant 30 minutes à -5°C, puis on ajoute une solution refroidie à 0°C 1,617 gid'aeide N^-benzyloxycarbonyl E^DD diamino-2,6 pimélamique dans un mélange de 5 cra5 de soude IN et 50 cm3 d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant quelques minutes vers 0eC, puis pendant 40 heures vers 20eC environ. Le mélange réactionnel 10 est acidifié ensuite à pH 1 par addition de 10 cm3 d'acide chlorhydrique IN. On évapore le tétrahydrofuranne sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. Dans le concentrât, on a un précipité que l'on sépare par filtration, lave 3 fois par 60 cm3 au total d'acide chlorhydrique N/lO et 20 cm3 d'eau. Après séchage sous pression réduite (0,3 mm de 15 mercure) à 20°C, on obtient 3*66 g de solide blanc que l'on dissout dans 20 cm3 d'acide acétique contenant 10 g de gel de silice neutre (0,0^-0,063 mm). On concentre à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C et on charge l'ensemble sur une colonne de 3,5 cm de diamètre contenant 75 S de gel de silice neutre (0,04- 0,063 mm).
20 On élue successivement par : 600 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-cyclohexane (l/l en volumes), 600 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-cyclohexane (3/1 en volumes), 400 cm3 d'acétate d'éthyle, 600 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (95/5 en volumes), 25 5OO cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (9/l en volumes), 1200 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (85/15 en volumes), en recueillant des fractions de 100 cm3. Les fractions 22 à 32, réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C.
Le solide amorphe obtenu est repris par 80 cm3 d'éther, trituré jusqu'à Γ 30 '' pulvérisation totale, séparé par filtration et séché sous pression réduite (0,3 mm de mercure). On obtient ainsi 2,58 g d'acide N^-[o^-ben- 6 syl N-(N-undécanoyl L alanyl)-Y-D glutamyl] N -benzyloxycarbonyl LL,DD-diamino-2,6 pimélamique
Rf = 0,62 Jjsilicagel; acétate d'éthyle-acide acétique / 35 (9/1 en volumes)].
Ψ / * / 98
Le N-undécanoyl L alanyl-oC-D glutamate de benzyle peut etre préparé de la façon suivante :
On ajoute 3,56 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à me solution, maintenue à -5°C, de 5,1 g d'acide undécanoTque dans m mélange de l40 cm3 , 5 de tétrahydrofuranne et de 3,84 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à -5°C, puis on ajoute me solution refroidie à 0°C de 9,45 g de chlorhydrate de L alanyl-a-D glutamate de benzyle dans m mélange de 54,8 cm3 de soude IN et 30 CTtO d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant 10 minutes vers -5°C, puis pendant 20 heures 10 vers 20°C environ. Le mélange réactionnel est acidifié ensuite à pH 1 par addition de 60 cm3 d'acide chlorhydrique IN. On évapore le tétrahydrofuranne par concentration sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. Le concentrât est extrait 2 fois par 80 cm3 au total d'acétate d ' éthyle. Les phases acétate d ' éthyle, rémies, sont lavées par 40 cm3 15 d'eau et séchées sur du sulfate de sodium. Après filtration et concentration à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C, on obtient 11,89 g d'huile que l'on chromatographie sur me colonne de 4,5 cm de diamètre contenant 250 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm)· On élue par de l'acétate d'éthyle en recueillant des fractions de 100 cm3· 20 Les fractions 3 à 5, rémies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 20°C. On obtient ainsi 5,85 S d'un solide pâteux que l'on chromatographie sur me colonne de 3,2 cm de diamètre contenant 115 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue successivement par 1 1 d'm mélange acétate d'éthyle-cyclohexane (i/1 en volumes), 1,7 1 25 d'acétate d'éthyle et 600 cm3 d'm mélange acétate d'éthyle-acide acétique (99/1 en volumes) en recueillant des fractions de 100 cm3.
Les fractions 11 à 30, rémies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 ram de mercure) à 50°C. On obtient ainsi 2,47 S de N-undéca-noyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle sous forme d'm solide blanc.
’ 30 Rf = 0,71 [silicagel; acétate d'éthyle-acide acétique / (9/1 en volumes)] . .· / ·* ;/ ( y w/ J * / 99
Exemple 25 -
On ajoute 1,14 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue à- -5°C, de 1,83 g de N-benzyloxycarbonylglycine dans un mélange de 165 cm3 de tétrahydrofuranne et de 1,22 cin3 de triéthylamine. Le mélange 5 est agité pendant 20 minutes à -5°C, puis on ajoute une solution refroidie à 5°C de 5 g d'acide N -/Jî-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamylj méso diamino-2(L), 6(d) pimélamique dans un mélange de 17,5 cm3 de soude IN et 25 cm3 d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant 10 minutes vers 0°C, puis pendant 70 heures vers 20°C environ. On évapore le tétrahydrofuranne par 10 concentration sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. Le concentrât, acidifié à pH 1 par addition de 21 cm3 d'acide chlorhydrique IN, donne un précipité blanc que l'on sépare par filtration, lave par 200 cm3 d'eau et sèche à l'air libre. On obtient ainsi 5,97 g de poudre que l'on dissout dans 100 cm3 d'acide acétique contenant 12 g de gel de silice neutre (0,04-15 0,063 mm). On concentre à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C et on charge l'ensemble sur une colonne de 4 cm de diamètre contenant 280 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue successivement par 1360 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (9-1 en volumes), 320 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique 20 (85-15 en volumes), 3840 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (8-2 en volumes) en recueillant des fractions de 80 cm3. Les fractions 41 à 68, réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. L'huile obtenue est reprise par 150 cm3 d'éther, triturée jusqu'à pulvérisation totale, séparée par filtration et séchée sous 25 pression réduite (0,3 mm de mercure) à 60°C. On obtient ainsi 2,37 g 2 6 d'acide N /N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamylJ N -(benzyloxycarbonyl- glycyl) méso diamino-2(L), 6(D) pimélamique.
Rf = 0,47 /silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volumes U
30 Rf = 0,55 /jsilicagel ; acétate d'éthyle-acide acétique (1-1 en volumes XJ.
2
On dissout 2,35 g d'acide K £N-(N-lauroyl L alanyl)-y*-D glutamy|7 N^-(benzyloxycarbonylglycyl) méso diamino-2(L), 6(D) pimélamique dans 70 cm3 d'acide acétique. On ajoute 2,4 g de palladium sur noir (à 3 % / 35 de palladium) et on fait passer un léger courant d'hydrogène pendan^ / À / 100 4 heures. Après filtration ét concentration à sec du filtrat sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C, l'huile obtenue est triturée dans 100 cm3 d'éther jusqu'à pulvérisation totale, séparée par filtration, lavée , f 2 fois par 100 cm3 au total d'éther et séchée sous pression réduite 5 (0,3 mm de mercure) à 55°C. On obtient 1,91 g de poudre beige que l'on dissout dans 30 cm3 d'acide acétique et filtre sur une colonne de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm) de 2 cm de diamètre et 2 cm de hauteur. Le filtrat est concentré à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. L'huile obtenue est triturée dans 100 cm3 d'éther jusqu'à pulvérisa- 10 tion totale, séparée par filtration et séchéç sous pression réduite (0,3 mm 2 de mercure) à 58°C, On obtient ainsi 1,62 g d'acide N ^î-(N-lauroyl L alanyl)“Y_D glutamy^,7 N^-glycyl méso diamino-2(L), 6(D) pimélamique.
Rf B 0,28 /silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volumes)J
15 Analyse a Cale. % C 55,40 H 8,34 N 13,36
Tr. 52,0 7,7 12,1
Cendres sulfuriques % = 9,1
Après hydrolyse totale, l'analyse sur autoanalyseur Technicon révèle la présence des acides aminés suivants : 20 Ala 1,05 (théorie =1)
Dap 0,98 (théorie 85 1)
Glu 1,00 (théorie =1)
Gly 0,96 (théorie = 1) L'acide N2-[N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] meso diamino-2 (L), 25 6 (D) pimélamique peut être préparé de la manière suivante s
On ajoute 1,6 cm) de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue à -5°C, de 6,07 g de N-lauroyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle dans un mélange de 280 cm) de tétrahydrofuranne et de 1,74 cm) de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à -5°Cj puis 30 on ajoute une solution refroidie à )°C de 4 g d'acide N^-benzyloxy- j oarbonyl méso diamlno-2(LV5(l)) pimélamique dan3 un mélange de 12*4 cm) de soude IN et 124 cm) d'eau, le mélange réactionnel est agité pendant 10 minutes vers 0°C, puis pendant 70 heures vers 20eC environ. Le mélange réactionnel est acidifié ensuite à pH 1 par addition de 20 cm) d'acide )5 ohlorhydrique IN. On évapore le tétrahydrofuranne par concentration sous pression réduite (20 mm de mercure) A 50°C. Dans le concentrât, on a un préoiplté blanc que l'on sépare par filtration, lave ) fois par / 150 cm) au total d'acide chlorhydrique 0,1 N et ) fols par 150 cm) au /)/ 101
On obtient ainsi 9*15 S de poudre blanche que l'on dissout dans 100 cmj d'acide acétique contenant 20 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 nun), j On concentre à sec le mélange et on charge l'ensemble sur une oolonne de 5 cm de diamètre contenant **00 g de gel de silioe neutre (0,04-0,063 mm). On élue successivement par : 1,6 1 d'acétate d'éthyle, 900 cm) d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (97,5/5,5 en volumes) 1200 em3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (95/¾ en volumes) 900 cm) d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (92,5/7,5 en volumes) 10 900 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (90/10 en volumes) 300 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (85/15 en volumes) 3200 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-aoide acétique (80/20 en volumes) en recueillant des fractions de 100 cm). Les fractions 6l à 90,réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 509C, ^ Is solide blanc obtenu est lavé 2 fois avec 100 cm3 au total d'éther et séché sous pression réduite (0,3 mm de mercure) à 60°C. On obtient ainsi 6,3 g d'aoide ^-[o^-benzyl-N-ÎN-lauroyl L alanyl) -ΊΓ-D glutaïqyl} N -benzyloxycarbonyl méso diamino-2(L), 0(D) pimélamique.
Rf = 0,77 jsilioagel; acétate d'éthyle-acide acétique 20 (3/1 en volumes)]
On dissout 8,2 g d'acide N2- [û^-benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)· Y-D glutamyl] N^-benzyloxycarbonyl méso diamino-2(L),6(D) pimélamique dans 225 οη>3 d'acide acétique. On ajoute 8,2 g de palladium sûr noir (à 3# de palladium) et on fait passer un léger courant d'hydrogène • gç . pendant 3 heures 1/2. Après filtration et concentration à sec du filtrat sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C, l'huile obtenue est triturée dans 100 cm3 d'éther Jusqu'à pulvérisation totale, séparée par filtration et séchée sous pression réduite (0,3 mm de mercure) à 50eC, On obtient ainsi 5,9 g de poudre. 0,9 g de cette poudre est mis tjq en solution dans de l'acide acétique et filtré sur une colonne de gel de silice neutre (0,0*1-0,063 mm) de 2 cm de diamètre et de 2 cm de hauteur. Le filtrat est concentré à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50®C. Le résidu obtenu est repris par 50 cm3 d'éther, séparé par filtration et séché sous pression réduite (0,3 mm de mercure) à 55*C, On / 35 obtient ainsi 0,75 g d'acide 1^-[N-(N-lauroyl L alanyl)-Y-D glutamyl^ / méso dlamino-2(L),6(D) pimélamique.
102 i
Rf « 0,58 ^Silicagel; n-butano1- pyridlne - acide acétique-eau (50/20/6/24 en volumes)]
Analyse Cale. # « C * 56,72 H » 8,64 N - 12,25 Tr, - 52,8 8*1 11*6 5 Cendres sulfuriques » 6,9 % i
Après hydrolyse totale, l'analyse sur autoanalyseur Teohnioon » révèle la présence des acides aminés suivants :
Ala » 1,02 (théorie « l)
Dflp « 0,96 (théorie * l) ^0 Glu « 1,00 (théorie » l) L'acide )È*-benzyloxycarbonyl méso diamino-2(L),6(D) plmélamique peut être préparé selon le prooédé décrit dans le brevet belge 821 285·
Exemple 26 -
On ajoute 0,433 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une 15 solution, maintenue à -5°C, de 698 mg de N-benzyloxycarbonylglycine dans un mélange de 63 cm3 de tétrahydrofuranne et de 0,467 cm3 de triéthylamine· Le mélange est agité pendant 20 minutes à -5°c, puis on ajoute une solution refroidie a 0°G de 1,81 g de Na-[N-(N-lauroyl L ala-nyl)-y-D glutamyl] L lysinate de méthyle dans un mélange de 3,33 cm3 de 20 soude 1 N et 10 cm3 d'eau· Le mélange réactionnel est agité pendant 4o minutes vers -5°C puis pendant 36 heures vers 19°G environ, puis est acidifié à pH 1 par addition de 6 cm3 d'acide chlorhydrique IN· On évapore le tétrahydrofuranne sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C· Le concentrât est extrait 5 fois par 150 cm3 au total d'acétate 25 d'éthyle· Les phases acétate d'éthyle réunies sont lavées par 30 cm3 d'acide chlorhydrique 0,1 N, séchées sur sulfate de sodium· Après concentration à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°G, on obtient / 103 2,53 g d'huile que l'on dissout dans 100 cm3 d'acétate d'éthyle contenant 6 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 nun). On concentre à sec le mélange et on charge l'ensemble sur^une colonne de 3 cm de * diamètre contenant 50 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm).
5 On élue successivement par 80 cm3 d'acétate d'éthyle, 280 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (95-5 en volumes) ' en recueillant des fractions de 40 cm3. Les fractions 4 à 8, réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C·
On obtient 2,33 g d’huile qui est à nouveau chromatographiée· 10 On dissout cette huile dans 60 cm3 d'acide acétique contenant 5 g de gel de silice neutre (0,'04-0,063 mm). On concentre à sec le mélange et on charge l'ensemble sur une colonne de 3 cm de diamètre contenant 100 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm).
On élue successivement par 680 cm3 d'acétate d'éthyle, 15 360 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle acide acétique (97,5-2,5'en volumes) 360 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (95-5 en volumes) 360 cm3 d'un mélange acétate d’éthyle-acide acétique (90-10 en volumes) 240 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (80-20 en volumes) en recueillant des fractions de 40 cm3.Les fractions 32 à 41 réunies, 20 sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C·
On obtient ainsi 1,35 g de Na-tN-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] Ne-(benzyloxycarbonyl glycyl) L lysinate de méthyle sous forme d’huile.
Rf as 0,47 Csilicagel ; acétate d’éthyle-acide acétique 25 (1-1 en volumes)].
On dissout 1,3 g de Na-[N-(N-lauroyl L alanyi)-y-D glutamyl] Ng-(benzyloxycarbonyl glycyl) L lysinate de méthyle dans 35 cm3 d’acide acétique. On ajoute 1,3 g de palladium sur noir (à 3 % de palladium) et on fait passer un léger courant d’hydrogène pendant 2 heures et demie.
30 Après filtration et concentration à sec du filtrat sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C, on obtient un résidu huileux que l'on triture jusqu'à pulvérisation dans 50 cm3 d'éther. On sépare la poudre par filtration, la sèche à l’air.« On obtient ainsi 910 mg de produit brut que l'on chromatographie sur une colonne de 2 cm de diamètre contenant 35 40 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue successivement par/ // 104 160 cm3 d'acétate d'éthyle, 80 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-» acide acétique (50-50 en volumes) et 420 cm3 d'acide acétique en recueillant des fractions de 20 cm3. Les fractions 14 à 20, réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°G.
5 Le résidu obtenu est trituré dans 40 ctrQ d'éther* Après filtration et séchage à l'air, on obtient 370 mg de Noc-[N-(N-iauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] Ne-glycyl L lysinate de méthyle sous forme de poudre crème·
Rf « 0,50 [ silicagel î n.butanol-pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volumes)] !0 Rf = 0,27 [silicagel ; acide acétique)
Analyse Cale 7. * C 58,07 H 8,91 N 11,68 Tr. 57,0 8,6 11,1
Cendres sulfuriques î 22 7*
Après hydrolyse totale, l'analyse sur autoanalyseur Technicon 15 révèle la présence des acides aminés suivants :
Ala 1,00 (théorie = l)
Glu 1,01 (théorie = 1)
Gly 0,98 (théorie = l)
Lys 0,96 (théorie - l) 20 Le Na-[N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] L lysinate de méthyle peut être préparé de la façon suivante :
On ajoute 1,3 cin3 de chloroforiniate d'isobutyle à une solution, maintenue à -5eC, de 4,ÿl g de N-luurnyl L alanyl-a-D glutamate de ben-zyle dans un mélange de 250 cm} de tétrahydroî'uranne et de 1,4 cm} de 25 triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à -5°C, puis on ajoute une solution refroidie à OôC3,32 g de chlorhydrate de N £ -benzyloj carbonyl L lysinate de méthyle dans un mélange de 10 cm} de soude IN et 10 cm} d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant 10 minutes vers -5eC, puis pendant 4 Jours à une température voisine de 20eC. Ensuite, 30 le, mélange réactionnel est acidifié à pH 1 par addition de 20 cm} d'acide chlorhydrique IN. On évapore le tétrahydrofuranne par concentration sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45°C. Le concentrât est extrait 5 fois par 150 cnij au total de chloroforme. Les phases chloroformiques, réunies, sont lavées par 40 cm} d'acide chlorhydrique Q^^et^/ 105 séchées sur sulfate de sodium. Après concentration à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C, on obtient une huile Jaune pâle que i'on dissout dans t>0 cm} de chloroforme contenant 15 g de gel de silice neutre (0,υ;»-0,0υ} mm). On concentre à sec le mélange et on charge 5 l'ensemble sur une colonne de } orn de diamètre contenant 150 g de gel de silice neutre (0.04-0,06} mm). On élue successivement par 2,5 1 d'acétate d'éthyle et 400 cm} d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (95/5 en volumes) en recueillant des fractions de 100 cm3. Les fractions 6 à 27, réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de 10 mercure) à 50°C. On obtient ainsi },47 g de N *<-[p^-benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)-Y-D g-lutamyi] N £ -benzyloxycarbonyl L lysinate de méthyle sous forme de poudre blanche.
Kf « 0,70 Jsilieagei; acétate d'éthyle-acide acétique (93/5 volumes)] 15 Rf « 0,40 Jsilieagei; acétate d'éthylej
On dissout 3*^3 g de N a- (p^-benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)-r-D glutamyl]N £-benzyloxycarbonyl L lysinate de méthyle dans 70 cm3 d'acide acétique. On ajoute 3ι*Κ5 ß de palladium sur noir (à 3 # de palladium) puis on fait passer un léger courant d'hydrogène pendant 2 heures. 20 Le catalyseur est séparé par filtration, lavé 2 fois par 20 cm3 au total d'acide acétique, les filtrats réunis sont concentrés à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. Le résidu est trituré dans 50 cm3 d’éther* On obtient ainsi une poudre que l'on sépare par filtration et que l’on sèche à l'air* On obtient ainsi 1,89 g de 25 Na-[N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] L lysinate de méthyle.
Rf — 0,50 [silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volumes)]
Rf = 0,29 [silicagel ? acide acétique]·
Exemple 27 - 30 On ajoute 1,07 cm3 de chloroformiate d'ieobutyle à une solution, maintenue à -5°C, de 4,026 g de N-lauroyl L alanyl-a-D gluta~ mate de benzyle dans un mélange de 135 cm3 de tétrahydrofuranne et de 1,15 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à -7eC, puis on ajoute une solution refroidie à 4°C de chlorhydrate de , 35 N a-(benzyloxycarbonylglycyl) L lysinamide dans un mélange de 8,2 cm3 / (f 106 de soude 1 N et 22 cm3 d’eau. Le mélange réactionnel est agité pendant 10 minutes vers -5°C> puis pendant 65 heures vers 20°G environ, puis est acidifié à pH 1 par addition de 11 cm3 d'acide chlorhydrique 1 N.
On évapore le tétrahydrofuranne sous pression réduite (20 mm de mercure) 5 à 45°C. Le concentrât est dilué par addition de 50 cm3 d'eau. Le précipité formé dans le concentrât est séparé par filtration, lavé 3 fois par 75 cm3 au total d'eau et séché· On obtient ainsi 5)58 g de sollce blanc que l'on dissout dans 70 cm3 d'acide acétique contenant 12 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On concentre à sec le mélange et on 10 charge l'ensemble sur une colonne de 3 cm de diamètre contenant 100 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm).
On élue successivement par 350 cm3 d'acétate d'éthyle t 250 cm3 d'un mélange acétate d*éthyle-acide acétique (95-5 en volumes) 850 cm3 d'un mélange acétate d’éthyle-acide acétique (9-1 en volumes) 15 450 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (75-25 en volumes) 350 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (1-1 en volumes) en recueillant des fractions de 50 cm3. Les fractions 34 à 39, réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C.
La meringue obtenue est reprise par 50 cm3 d'éther, triturée jusqu'à 20 pulvérisation totale, séparée par filtration et séchée sous pression réduite (0,3 mm de mercure). On obtient ainsi 1,43 g de Na-(benzyloxy-carbonyl glycyl) Ng-Co^benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] L lysinamide.
Rf 558 0,88 [silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau 25 (50-20-6-24 en volumes)] * Rf = 0,37 tsilicagel ; acétate d'éthyle-acide acétique (3-1 en volumes)] fv Λ
On dissout 1,43 g de Na-(benzyloxycarbonylglycyl) Ne-Co -ben-zyl N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] L lysinamide dans 85 cm3 d'acide 30 acétique. On ajoute 1,43 g de palladium sur noir (à 3 7. de palladium) et on fait passer un léger courant d'hydrogène pendant 2 heures.
Le catalyseur est séparé par filtration, lavé 2 fois par 20 cm3 au total d'acide acétique, les filtrats réunis sont concentrés à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C· Le résidu huileux ainsi 35 obtenu est trituré dans 75 cm3 d'éther et donne un solide que l'on / 107 sépare par filtration. On obtient ainsi 990 mg de solide blanc auquel on joint 490 mg d’un produit analogue obtenu de la même façon, et que l'on chromatographie sur une colonne de 2 cm de diamètre contenant 29 g de gel de silice neutre (0}04-0,063 mm). On élue avec de l'acide 5 acétique en recueillant des fractions de 40 cm3· Les fractions 13 a 32, réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C· On obtient ainsi 510 mg de Να-glycyl Ne-tN-(N-lauroyl L alanyl)-γ-D glutamyl] L lysinamide.
Rf = 0,42 [silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau 10 (50-20-6-24 en volumes)]
Analyse Cale % = C 57,51 H 8,97 N 14,37 Tr. 54,9 8,6 13,3
Cendres sulfuriques ; 1,6%
Après hydrolyse totale, l'analyse sur autoanalyseur Technicon * 15 révèle la présence des acides aminés suivants :
Ala 1,04 (théorie = l)
Glu 0,99 (théorie =1)
Gly 1,00 (théorie = l)
Lys 0,95 (théorie = l) 20 Le chlorhydrate de Na-(benzyloxycarbonyl glycyl) L lysinamide peut être préparé de la façon suivante : • *
On dissout 4,18 g de Na-(benzyloxycarbonyl glycyl) Ne-t.butyl- oxycarbonyl L lysinamide dans 80 cm3 d'une solution anhydre d'acide chlorhydrique 1,7 N dans l'acide acétique. On agite pendant 2 heures 25 à une température voisine de 20°C, puis on ajoute le milieu réactionnel à 400 cm3 d'éther anhydre. Un précipité huileux est séparé par décantation, lavé par 200 cm3 d'éther et séché sous pression réduite (0,3 ram de mercure). On obtient ainsi 3,16 g de chlorhydrate de Na-(benzyloxy-carbonylglycyl) L lysinamide sous forme d'une pâte.
30 Ri = 0,48 [silicagel ï n.butanol-pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volumes)].
Le Na-(benzyloxycarbonyl glycyl) Ne-t.butyloxycarbonyl L lysinamide peut être préparé de la façon suivante :
On ajoute 1,267 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une 35 solution, maintenue à -1°C, de 2,397 g de N-benzyloxycarbonyl glycine / 108 dans un mélange de 35 Cin3 de tétrahydrofuranne et de 1,365 cm3 de , , triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à -3°C, puis on ajoute une solution refroidie à 5°C de 3,25 g de Ng-t.butyloxycarbo-“ nyl L lysinamide dans 50 cm3 de tétrahydrofuranne. Le mélange réactionnel 5 est agité pendant 15 minutes vers -5°G, puis pendant 20 heures vers 2û°C environ. On sépare l'insoluble par filtration, puis on évapore le tétrahydrofuranne sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45°C.
Le concentrât est dilué par addition de 150 cm3 d'eau, extrait 3 fois par 225 Cm3 au total d1acétate d'éthyle. Les phases acétate d'éthyle, 10 réunies, sont lavées successivement par 60 cm3 d'acide chlorhydrique glacé 0,1 N, 60 cm3 d'une solution à 10 % de carbonate de sodium et 2 fois par 120 cm3 au total d'une solution saturée de chlorure de sodium et séchées sur sulfate de sodium· Après concentration à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45°G, on obtient 4,18 g de Na-(benzyl-15 oxycarbonyl glycyl) Ne"t«butyloxycarbonyl L lysinamide sous forme d'huile.
Rf —0,77 Csilicagel ; acétate d'éthyle-acide acétique (3-1 en volumes)]
Le Ns-t.butyloxycarbonyl L lysinamide peut être préparé de 20 la façon suivante :
On ajoute 1,3 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution maintenue à -5°C de 3,8 g de Να-benzyloxycarbonyl Ng-t.butyl- oxycarbonyl L lysine dans un mélange de 38 cm3 de chloroforme et de 1,4 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à 25 -5°C, puis on envoie un léger courant d'ammoniac pendant 3 heures.
Ensuite, le milieu réactionnel est dilué par addition de 100 cra3 de 2 fois chloroforme, lavé/par 100 cm3 au total d'une solution à lo % de carbonate de sodium, 5 fois par 250 cm3 au total d'eau et séché sur sulfate de sodium. Après concentration à sec sous pression réduite (20 mm de 30 mercure) à 50°G, on obtient 3,76 g de Να-benzyloxycarbonyl Ne-t.butyl-oxycarbonyl L lysinamide fondant à 142-144°C. s·/
Rf * 0*52 Csilicagel J acétate d'éthyle] / // f » 109
On dissout 3»7 g de Na-benzyloxycarbonyl Ne-t.butyloxycarbonyl L lysinamide dans 130 cm3 d'acide acétique. On ajoute 3,7 g de palladium sur noir (à 3 % de palladium) et on fait passer un léger courant d'hydro-, gène pendant 2 heures. Le catalyseur est séparé par filtration, lavé 5 2 fois par 20 cm3 au total d'acide acétique ; les filtrats réunia sont concentrés à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°G.
Le résidu huileux est trituré dans 200 cm3 d'éther· Après décantation et séchage, on obtient 3,25 g de Ne-t.butyloxycarbonyl L lysinamide.
Rf = 0,60 Csilicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau 10 (50-20-6-24 en volumes)]
Exemple 28 -*
On ajoute 0,31 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue à -11°G, de 506 mg de N-benzyloxycarbonyl glycine dans un mélange de 40 cm3 de tétrahydrofuranne et de 0*34 cm3 de 15 triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à -ll°C,.puis on ajoute une solution refroidie à 5°C de 1,69 g de chlorhydrate de 6 1 l'acide N -Co -benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] DD,LL diami-no-2,6 pimélamique dans un mélange de 4,84 cm3 de soude IN et 40 cm3 d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant quelques minutes vers 20 “10°G, puis pendant 65 heures vers 20°C environ. Ensuite, on l'acidifie à pH 1 par addition de 10 cm3 d'acide chlorhydrique 1 N. On évapore le tétrahydrofuranne par concentration sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°G· Le précipité blanc apparu dans le concentrât est séparé par filtration, lavé 4 fois par 80 cm3 au total d'eau et séché à 25 l'air libre. On obtient 1,74 g de produit brut que l'on dissout dans 30 cm3 d'acide acétique contenant 5 g de gel de· silice neutre (0,04-0,063 mm). On concentre à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°G et on charge l'ensemble sur une colonne de 30 mm de diamètre contenant 60 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm).
30 On élue successivement par 160 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (9-1 en volumes) 560 cm3 d’un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (8-2 en volumes) en recueillant des fractions de 20 cm3. Les fractions 16 à 25 réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. / 110
Le solide amorphe obtenu est repris par 30 cm3 d'éther, trituré jusqu'à pulvérisation totale, séparé par filtration et séché sous pression réduite (o,3 nun de mercure)· On obtient ainsi 320 mg d'acide ~ 6 1 ο 5 N -0 -benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] N -benzyloxycarbonyl glycyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique.
6 1
On dissout 320 mg d'acide N -Cq1 -benzyl N-(N-lauroyl L ala-2 nyl)-y-D glutamyl] N -benzyloxycarbonyl glycyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique dans 25 cm3 d'acide acétique· On ajoute 320 mg de palladium sur 10 noir (à 3 7. de palladium) et on fait passer un léger courant d'hydrogène pendant 2 heures 1/4· Après filtration et concentration à sec du filtrat sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°G, on obtient 290 mg de solide que l'on chromatographie sur une colonne de l cm de diamètre contenant 6 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm)· 15 On élue par de l'acide acétique en recueillant des fractions de 5 cm3*
Les fractions 25 à 32 réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°G· Le solide amorphe obtenu est repris, par 20 cm3 d'éther, séparé par filtration et séché sous pression réduite (0,3 mm de mercure) à 20°G· On obtient ainsi 30 mg d'acide N^-[N-(N-lau- 2 20 royl L alanyl)-y-D glutamyl] N -glycyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique·
Rf =0,22 Csilicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volumes)]
Après hydrolyse totale, l'analyse sur autoanalyseur Technicon révèle la présence des acides aminés suivants : 25 Ala 0,95 (théorie = l)
Glu 1,04 (théorie = 1>
Gly 1,00 (théorie =1)
Dap 1,00 (théorie = l)
Le chlorhydrate de l'acide N -Co -benzyl-N-(N-lauroyl 30 L alanyl)-y-D glutamyl] LL,DD diamino-2,6 pimélamique peut être préparé de la façon suivante :
On ajoute 0,56 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue à -5°G, de 2,L2 g de N-lauroyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle dans un mélange de 86 cm3 de tétrahydrofuranne et de 0,6 cm3 i 35 de triéthylamine* Le mélange est agité pendant 30 minutes à -5°G, ,*-/
T
111 puis on ajoute une solution refroidie à 2°C de 1,25 g d’acide N^-t»butyl-oxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique dans un mélange de 4,32 cm3 de soude IN et 43 cm3 d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant quelques minutes vers -5°C, puis pendant 18 heures vers 20°C environ» 5 Ensuite, on l'acidifie par addition de 50 cm3 d'une solution saturée d'acide citrique. On évapore le tétrahydrofuranne par concentration sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°G· Le concentrât est extrait 5 fois par 200 cm3 au total d'acétate d'éthyle. Les phases acétate d’éthyle réunies, sont-lavées par 25 cm3 d’eau, séchées sur sulfate de 10 sodium., Après concentration à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C, on obtient une huile que l'on dissout dans un mélange de 50 cm3 d'acétate d'éthyle et 10 cm3 d'acide acétique contenant 10 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm)· on concentre à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°G et on charge l'ensemble sur une 15 colonne de 2 cm de ‘.diamètre contenant 50 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm).
On élue successivement par 200 cm3 d’acétate d’éthyle, 280 Cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (95-5 en volumes) 320 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (9-1 en volumes) 20 en recueillant des fractions de 40 cm3. Les fractions 5 à 13 réunies, sont concentrées a sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C* 6 1
On obtient ainsi 2,23 g d'acide N -Eo -benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)-y-2 D glutamyl] N -t.butyloxycarbonyl LL,DD diamino-2,6 pimélamique sous forme d'huile» 25 Rf = 0,39 Csilicagel ; acétate d'éthyle-acide acétique (9-1 en volumes)] 6 1
On dissout 2,19 g d’acide N -Eo -benzyl N-(N-laurcvl L alanyl)-2 Y-D glutamyl] N -t.butyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique dans 22 cm3 d'une solution saturée anhydre d'acide acétique chlorhydrique. On 30 laisse en contact pendant 3 heures à 20°C, ensuite on concentre à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. On obtient ainsi 1,74 g 6 1 de chlorhydrate de l’acide N -Eo -benzyl N-(N-lauroyl h alanyl)-y-D glutamyl] DD,LL diamino-2,6 pimélamique sous forme d'huile partiellement cristallisée» / 35 Rf — 0,47 [silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau/ (50-20-6-24 en volumes)] /}/
Rf = 0,26 [silicagel ; acide acétique] /p' 112 ο L'acide N -t.butyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimelamique ‘ peut être préparé de la façon suivante : * 2 6
On dissout 4 g d'acide N -t.butyloxycarbonyl N -benayloxy- carbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique dans 100 cm3 d'acide acétique.
5 On ajoute 4 g de palladium sur noir (à 3 7. de palladium) et on fait passer un léger courant d'hydrogène pendant 3 heures. Le catalyseur est séparé par filtration, lavé par 10 cm3 d'acide acétique, les filtrats réunis sont concentrés à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°G. Le résidu huileux ainsi obtenu est trituré dans 50 cm3 d'éther 10 jusqu'à pulvérisation totale. On obtient ainsi après filtration et séchage 3 g d'acide N -t.butyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique.
Rf = 0,34 Csilicagel ; acide acétique]
Exemple 29 - A une solution de 7,87 g de Na-t.butyloxycarbonyl Ne**(benzyl~ 15 oxycarbonyl glycyl)-lysine dans 70 cm3 d'éthanol, on ajoute 15 g de copolymè.re styrène-divinylbenzène (98-2) chlorométhylé contenant 1,2 milli-équivalent de chlore par gramme. On agite le milieu réactionnel pendant 10 minutes à 20°G, ensuite on ajoute 2,25 cm3 de triéthylamine puis on poursuit l'agitation pendant 65 heures à 78°G. Le polymère est filtré, 20 lavé successivement par 3 fois 300 cm3 au total d'éthanol et 3 fois 300 cm3 au total de chlorure de méthylène, puis séché sous pression réduite (0,3 mm de mercure) à 20°C. On obtient ainsi le Na-t.butyloxycarbonyl Ne-(benzyloxycarbonyl glycyl) L lysyl-polymère.
Après hydrolyse totale, l'analyse sur autoanalyseur Technicon 25 révèle la présence des acides aminés suivants :
Gly 0,35 mmole par gramme de polymère
Lys 0,33 mmole par gramme de polymère L'acide D glutamique est accroché sur le dipeptide bloqué-polymère en effectuant la suite d'opérations suivantes dans un réacteur 30 muni d'un agitateur et, à sa base, d'un filtre en verre fritté : / l 113 1) On effectue 3 lavages'successifs du dipeptide bloqué-polymère par 100 cm3 de chlorure de méthylène à chaque fois. Chaque addition de solvant est suivie d'une agitation de 3 minutes, puis d'un essorage.
2) Le groupement protecteur t.butyloxycarbonyle est ensuite éliminé 5 par addition de 100 cm3 d'un mélange acide trifluoroacétique-chlorure de méthylène (1-1-en volumes), agitation pendant 20 minutes puis essorage.
3) La résine est alors lavée successivement par i a/ 3 fois 100 cm3 de chlorure de méthylène 10 W 3 fois 100 cm3 de méthanol c/ 3 fois 100 cm3 de chlorure de méthylène en agitant pendant 3 minutes après chaque addition de solvant et en essorant à chaque fois.
4) On neutralise alors le dipeptide-polymère par addition de 100 cm3 d'un 15 mélange chlorure de méthylène-triéthylamine (9-1 en volumes) agitation pendant 10 minutes puis essorage.
5) La résine est lavée ensuite par s 3 fois 100 cm3 de chlorure de méthylène en agitant pendant 3 minutes après chaque addition de solvant et en, 20 essorant à chaque fois 1 5 6) On ajoute 5,2 g d'acide N-t.butyloxycarbonyl 0 -benzyl 0 -succinimido D glutamique en solution dans 100 cm3 de chlorure de méthylène et on agite pendant 18 heures et essore.
7) On lave la résine successivement par : 25 a/ 3 fois 100 cm3 de chlorure de méthylène b/ 3 fois 100 cm3 d'acide acétique c/ 3 fois 100 cm3 de chlorure de méthylène en agitant pendant 3 minutes après chaque addition de solvant et en essorant à chaque fois.
1 5 30 8) On ajoute 5,2 g d'acide N-t.butyloxycarbonyl 0 -benzyl 0 -succinimido D glutamique en solution dans 100 cm3 de chlorure de méthylène et on agite pendant 18 heures et essore.
9) On lave la résine successivement par : a/ 3 fois 100 cm3 de chlorure de méthylène 35 b/ 3 fois 100 cm3 d'acide acétique c/ 3 fois 100 cm3 de chlorure de méthylène en agitant pendant 3 minutes après chaque addition de solvant et ej*'?
/ / S
essorant à chaque fois. , / Π 4
J
On obtient ainsi le Not-(0 -benzyl N-t.butyloxycarbonyl » i D glutamyl) Né-(benzyloxycarbonyl glycyl) L 1ysy1-polymère· ; La L alanine est accrochée sur le tripeptide bloque-polymère en répétant les opérations précédentes n° 1, 2, 3, 4, 5» 6 et 9» '5 L'opération n° 6 est modifiée comme suit î
On ajoute successivement : a/ 4j7 g de N-t«butyloxycarbonyl L alanine en solution dans 100 cm3 de chlorure de méthylène et on agite pendant 10 minutes b/ 5»16 g de dicyclohexylcarbodiimide et on agite pendant 16 heures et 10 essore·
On obtient ainsi le Na -Co^-benzyl N-(t.butyloxycarbonyl L alanyl)-y-D glutamyl] Ne-(benzyloxycarbonyl glycyl) L lysyl-polymère· L'acide octanoîque est accroché sur le tétrapeptide bloqué-polymère en répétant les opérations précédentes n° 1, 2, 3, 4» 5» 6 et 9· 15 L'opération n° 6 est modifiée comme suit i
On ajoute successivement : a/ 1,64 g d'acide octanoîque en solution dans 100 cm3 de chlorure de méthylène et on agite pendant 10 minutes b/ 2,35 g de dicyclohexylcarbodiimide et on agite pendant 16 heures et 20 essore·
On obtient ainsi le Να-Co -benzyl N-(N-octanoyl L alanyl)-y-D glutamyl Ne-(benzyloxycarbonyl glycyl) L lysyl-polymère·
Ce polymère est mis en suspension dans 100 cm3 d'acide trifluor-acétique contenu dans un réacteur muni d'un agitateur et, à sa base, d'un 25 filtre en verre fritté· Dans cette suspension, on fait passer un courant d'acide bromhydrique pendant 90 minutes· Ensuite, on essore la résine et on la lave 3 fois par 300 cm3 au total d'acide acétique en agitant pendant 3 minutes après chaque addition de l'acide acétique et en essorant à chaque fois· Les filtrats sont réunis et concentrés à sec sous 30 pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C· Le résidu huileux obtenu est repris 2 fois par 50 cm3 au total de méthanol et concentré à sec chaque fois sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C· On obtient ainsi environ 2 g d'huile que l'on chromatographie sur une colonne de 1,6 cm de diamètre contenant 15 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 rom)· / / 115
On élue successivement par : 300 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (3-1 en volumes) 250 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (1-1 en volumes) * 250 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (1*3 en volumes) 5 et 350 cm3 d'acide acétique en recueillant des fractions de 50 cm3.
Les fractions 8 à 23 réunies sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C· On obtient ainsi 0,94 g d'une poudre crème qui est chromatographiée à nouveau sur une colonne de I, 5 cm de diamètre contenant 10 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm).
10 On élue successivement par 100 cm3 d'acétate d'éthyle et 500 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-méthanol (9-L en volumes) en recueillant des fractions de 50 cm3· Les fractions 6 à 10 réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°G. On obtient ainsi 390 mg de bromhydrate de Να-Lo -méthyl N-(N-octanoyl L alanyl)-y-D glutamyl] 15 Ne-glycyi L lysinate de méthyle.
Rf « o,69 CSilicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volumes)]
Rf = 0,75 [silicagel ; alcool isoamylique-pyridine-eau (35-35-30 en volumes)] 20 Analyse Gale 7. = G 48,90 H 7,58 N 10,97
Tr. 45,3 6,8 10,1
Cendres sulfuriques : 5,21.7*
Après hydrolyse totale, l'analyse sur autoanalyseur Technicon révèle la présence des acides aminés suivants ; 25 Ala 1,00 (théorie = l)
Glu 0,90 (théorie = 1)
Gly 1,16 (théorie = 1)
Lys 1,10 (théorie « l)
Le Να-t.butyloxycarbonyl Ne-(benzyloxycarbonyl glycyl) 30 L lysine peut être préparé selon la méthode de H· KHOSLA et coli·, Indian J. Chem. 5, 237 (1967).
iiÜ
Exemple 30 - A une solution de 10 g do ΝΛ- (p^-benssyl N-(t.-butyloxy-cârbonyl L alanyl)-y-D glutamyl] M£-(benzyloxycarbonyl glycyl) L lysine dans 50 ctn3 d'éthanol, on ajoute 15 g do copolymère styrènç-divinyl-* 5 benzène (98-2) chlorométhylé contenant 1,2 milliéquivalent de chlore par gramme. On agite le milieu réactionnel pendant 10 minutes à 20 °C,. ensuite, on ajoute 1,92 cm3 de triéthylamine et on agite le milieu réactionnel pendant 65 heures à 78°C. Le polymère est filtré, lavé successivement par 3 fois 300 cmj au total d'éthanol et 3 fois 300 cm3 au total de chlorure de méthylène, puis séché sous pression réduite (0,3 mm de mercure) à 2Q°C. On obtient ainsi 18*8 g de ^-[û^-benzyl-N-(t.-butyloxycarbonyl L alanyl)-y-D glutamyl] Né-(benzyloxycarbonyl glycyl) L lysyl-polymère.
Apres hydrolyse totale, l'analyse sur autoanalyseur Technicon révèle la présence des acides aminés suivants :
Ala « 0,19 mmole par gramme de polymère
Glu ·= 0,l8 mmole par gramme de polymère
Gly = 0,18 mmole par gramme de polymère lys = 0,17 mmole par gramme de polymère 20 L'acide hexanoîque est accroché sur le tétrapept-ide bloqué-polymère en effectuant la suite d'opérations suivante dans un réacteur muni d'un agitateur et à sa base d'un filtre en verre fritté s 1) On effectue 3 lavages successifs du tétrapeptide bloqué- 25 polymère par 100 cm3 de chlorure de méthylène à chaque fois. Chaque addition de solvant est suivie d'une agitation de 3 minutes, puis d'un essorage.
2) Le groupement protecteur t.-butyloxycarbonyle de l'alanine est ensuite éliminé par addition de l00 om3 d'un mélange acide 30 trifluoroacétique-chlorure de méthylène (l/l en volumes), agitation pendant 20 minutes puis essorage.
3) la résine est .alors lavée successivement par : a) 3 fois 100 cm3 de chlorure de méthylène b) 3 fois 100 cm3 de méthanol 35 0)3 fuis 100 cm3 de chlorure de méthylène y7 en agitant pendant 3 minutes après chaque addition de solvant et eaf/ 77/ / w i Jl / essorant à chaque fols.
J|) On neutralise alm-s le tétrapeptide-polymère par addition * cie 100 cm3 d'un mélange chlorure de mdthylène-M-:néthylmorpho 1 ine (9/1 en volumes), agitation pendant 10 minutes puis essorage.
* 5 5) La résine est lavée ensuite par : 3 fois 100 cmj de chlorure de méthylène en agitant pendant 3 minutes après chaque addition de solvant et ai i essorant à chaque fois.
6) On ajoute alors successivement : i 10 a) l,l6 g d'acide hexanoique en solution dans 100 cm3 de chlorure de méthylène et on agite pendant 10 minutes h) 2,06 g de dicyclohexylcarbodiimide et on agite pendant 20 heures et essore.
7) On lave la résine successivement par : 15 a) 3 fois 100 cm3 de chlorure de méthylène b) 3 fois 100 cm3 d'acide acétique c ) 3 fois 100 cm3 de chlorure de méthylène en agitant pendant 3 minutes après chaque addition de solvant et en essorant à chaque fois.
20 8) On ajoute alors successivement : a) l,l6 g d'acide hexanoique et on agite pendant 10 minutes b) 2,06 g de dicyclohexylcarbodiimide et on agite pendant 20 heures et essore, 25 9) On lave la résine successivement par : a) 3 fois 100 cm3 de chlorure de méthylène b) 3 fois 100 cm3 d'acide acétique c) 3 fois 100 cm3 de chlorure de méthylène en agitant pendant 3 minutes après chaque addition de solvant et en 3O essorant à chaque fois.
On obtient ainsi le N*- [01-benzyl N-(N-hexanoyl L alanyl)-ï'-D glutamylj N£-(benzyloxycarbonyl glyoyl) L lysyl-polymère. Ce polymère est mis en suspension dans 100 cm3 d'acide trifluoroacétlque contenu dans un réacteur muni d'un agitateur et, à sa base, d'un 35 filtre en verre fritté. Dans cette suspension, on fait passer un . courant d'acide bromhydrique pendant 90 minutes. Ensuite, on essor*? / 118 la résine et on la lave 3 fois pur >30 cm' au total d'aciae acétique en agitant pendant 5 minutes après chaque addition de l'acide acétique , et en essorant à chaque fois. Les filtrats sont réunis et concentrés à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 55 °0· Le résidu * 5 huileux ainsi obtenu est trituré dans 50 cmj> d'acétate d'éthyle
Jusqu'à pulvérisation totale, séparé par filtration et lavé 3 fois par 90 cmj} au total d'&her. On obtient ainsi 1,15 g de poudre beige que l'on chromatographie sur une colonne de 1,8 cm de diamètre contenant 15 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue par un mélange 10 d'acétate d'éthyle-acide acétique (l/l en volumes) en recueillant des fractions de 20 emjj. les fractions 15 à 24 réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C; le résidu obtenu est dissous dans 5 om3 d'acide acétique et précipité par addition de 300 cm3 d'éther. Après séparation par filtration et 15 séchage, on obtient 470 mg de bromhydrate de Nu*- ^N-(N-hexanoy 1 L alanyl)-ï-D glutamyl] Ni-glycyl L lysine.
Rf « 0,26 (silieagel; n-butanol-pyridine-acide acétique-eau (50/20/6/24 en volumes )]
Analyse cale. $ - C “ 45,36 H = 6,92 N ** 12,02 20 tr. - 42,3 7,0 11,2
Après hydrolyse totale, l'analyse sur autoanalyseur Technicon révèle la présence des acides aminés suivants :
Ala 1,05 (théorie = l) ·
Glu 0,95 (théorie = l) 25 Gly 1,00 (théorie - l)
Lys 0,97 (théorie = l)
La N“-[o^-benzyl N-(t.-butyloxycarbonyl L alanyl)-V-D glu-tamylj n£-(benzyloxycarbonyl glyeyl) L lysine peut être préparé de la façon suivante :
On ajoute 4,57 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solu-30 tion, maintenue à -8°C, de l4,3 g de N-t.-butyloxycarbonyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle dans un mélange de 420 cm3 de tétrahydrofu-ranne et de 4,92 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à -8°C, puis on ajoute une solution refroidie à 5°C de 11,8 S de Nfc-(benzyloxycarbonylßlycyl) L lysine dans un mélange de 35 35 cm3 de soude IN et 35 cm3 d'eau. Le mélange réactionnel est agité' / pendant 10 minutes vers 0°C, puis pendant ΐβ heures vers 20°C environ^// 119
Ensuite, on évapore le tétrahydrofuranne par concentration sous pression réduite (20 rnm de mercure) à 50V, On acidifie le concentrât refroidi à 0°C à pH 2 par addition de 70 cm3 d'acide chlorhydrique IN, extrait 3 fois par 600 crnj5 au total d'acétate d'éthyle. Les phases , 5 acétate d'éthyle réunies sont lavées par 100 cmj5 d'eau et 100 cm3 d'une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de sodium et concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. On obtient ainsi 24,3 g de meringue que l'on chromatographie sur une colonne de 4,8 cm de diamètre, contenant 450 g de gel de 10 silice neutre (0,04-0,065 mm). Ch élue successivement par 520 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-cyclohexane (l/i en volumes), 360 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-cyclohexane (3/l an volumes), 480 cm3 d'acétate d'éthyle, 520 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (95/5 en volumes) 15 1040 cm3 d'un mélange acétate d’éthyle-acide acétique (90/10 en volumes) 520 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (80/20 en volumes) 1080 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (70/30 en volumes) en recueillant des fractions de 40 enfj. Les fractions 57 à 101 réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. 20 Le produit ainsi obtenu est recristallisé dans l'acétate d'éthyle.
On obtient ainsi 13,9 S de Nu-[θ^-benzyl N-(t.-butyloxy-oarbonyi L alanyl)-Y-D glutamyl] Nt~(benzyloxycarbonyl glycyl) L lysine fondant vers 90°C (point de fusion pâteuse ).
Rf = 0,55 Jsilicagel; acétate d'éthyle-acide acétique 25 (3/i en volumes )3 .
Après hydrolyse totale, l'analyse sur autoanalyseur Technicon révèle la présence des acides aminés suivants î
Ala 1,00 (théorie = l)
Glu 1,03 (théorie « l) j 30 Gly 1,00 (théorie “ l) A /
Lys 0,94 (théorie « l) j \lf

Claims (20)

1. Un nouveau tétr’a- ou pentapeptide caractérisé en ce qu'il répond à la formule générale : 120 R-NH-CH-CO-NH-CH-CO-R., I J 1 CH3 CH2CH2-CO-NH-CH-R2 (<p2)3 R_ -NH-CH-R. 3 4 dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou un reste d'acide gras,
5 R^ représenté un radical hydroxy, amino ou alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle, l'un des symboles R2 ou R^ représente un atome d'hydrogène ou un radical carboxy, carbamoyle, alcoyloxycarbonyle dont la partie alcoyle qui contient 1 à 4 atomes de carbone est éventuellement substituée par un 10 radical phényle ou nitrophényle, ou un radical N-carbonyl glycyle ou N-carbonyl D alanyle éventuellement estérifié par un radical alcoyle contenant 1 à 4 atomes de carbone (éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle) et l'autre représente un atome d'hydrogène ou un radical carboxy, carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle dont la partie alcoyle 15 qui contient 1 à 4 atomes de carbone est éventuellement substituée par un radical phényle ou nitrophényle, R^ représente un atome d'hydrogène ou un reste d'acide gras ou un reste glycyle ou D alanyle dont la fonction amine est éventuellement substituée par un reste d'acide gras, étant entendu que les symboles R2 et R^ ne peuvent pas représenter simultanément 20 un atome d'hydrogène, et étant entendu que l'un des symboles R2, R^ et R^ représente ou contient un reste glycyle ou D alanyle et que l'un au moins des symboles R et R^ représente ou contient un reste d'acide gras, et étant entendu que l'alanine liée à l'acide glutamique est'sous forme L, l'acide glutamique ou ses dérivés est sous forme D, la lysine ou ses 25 dérivés, lorsque l'un des symboles R2 ou R^ représente un atome d'hydrogène est sous forme L et l'acide diamino-2,6 pimélamique ou ses dérivés, lorsque R2 et R^ représentent un radical carboxy ou un dérivé de la fonction acide est sous forme D,D ; L,L ; DD,LL (racémique) ou D,L méso, / ainsi que ses sels. /?/ ' / 12X
2. Un nouveau tétra- ou pentapeptide selon la revendication 1, caracté- ; risé en ce que le reste d'acide gras est un radical alcanoyle contenant 1 à 45 atomes de carbone, éventuellement substitué par un radical * hydroxy, phényle ou cyclohexyle, un radical alcénoyle contenant 3 à 30 5 atomes de carbone et pouvant contenir plus d'une double liaison, ou un reste d'acide mycolique.
3. Procédé de préparation d'un produit selon les revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que l'on fait agir un aminoacide de formule générale : R.-NH-CH-COR' 5 10 dans laquelle R^ représente un atome d'hydrogène ou un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine, Rg représente un atome d'hydrogène ou le radical méthyle, étant entendu que dans ce cas l'alanine est sous forme D et R' représente un radical hydroxy ou un radical alcoyl-oxy contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un 15 radical phényle ou nitrophényle sur un tri- ou tétrapeptide de formule générale : R,-NH-CH-C0-NH-CH-C0-Ro 7 | I 8 ch3 ch2ch2-co-nh-ch-r9 R, -NH-CH-R, 10 4 dans laquelle R^ représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine, Rg représente un radical hydroxy, amino ou 20 alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle, l'un des symboles R^ ou R^ représente un atome d'hydrogène ou un radical carboxy, carbamoyle ou alcoyloxycar-bonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone et est éventuellement substituée par un radical phényle ou nitrophényle ou un reste 25 N-carbonyle glycyle ou N-carbonyl D alanyle éventuellement estérifié par un radical alcoyle contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle et l'autre représente un atome d'hydrogène ou un radical carboxy, carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone et est éventuellement / 122 substituée par un radical phényle ou nitrophényle, étant entendu que R^ et ' Rg ne peuvent pas représenter simultanément un atome d'hydrogène, et représente un atome d'hydrogène ou un reste d’acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine ou un radical glycyle ou D alanyle dont 5 la fonction amine est éventuellement substituée par un reste d'acide gras ou par un groupement protecteur de la fonction amine, étant entendu que l'un au moins des radicaux Ry ou R^ représente ou contient un reste d'acide gras et que, R^ ou R^ étant définis comme, précédemment, R10 représente un atome d'hydrogène et que, l'un des symboles R^ ou R^ 10 représentant un radical carboxy, l'autre représentant un atome d'hydrogène ou un radical carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle, Rjß représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine ou un reste glycyle ou D alanyle dont la 15 fonction amine est substituée par un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine puis remplace éventuellement des radicaux R,., R^ et/ou R^ (lorsqu'ils représentent ou contiennent un groupement protecteur de la fonction amine) par un atome d'hydrogène et les radicaux R*et Rg (lorsqu'ils représentent un radical alcoyloxy 20 contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle) par un radical hydroxy et des radicaux R^ et/ou Rg (lorsqu'ils représentent ou contiennent un radical alcoyloxycarbonyle contenant 1 à.4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle) par un radical carboxy, et isole le produit 25 obtenu éventuellement sous forme de sel.
4. Un procédé selon la revendication 3 pour la préparation d'un produit selon la revendication 1 ou 2 dans la formule duquel R^ ou R^ représente un radical N-carbonyl glycyle ou N-carbonyl D alanyle caractérisé en ce que l'on fait agir un aminoacide de formule générale :
30 NI^-jjH-COR' R6 dans laquelle R' représente un radical hydroxy ou alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou / 123 nitrophényle et Rg représente un atome d'hydrogène ou le radical méthyle, sur un tri- ou tétrapeptide de formule générale : R_-NH-GH-CONH-CH-CO-R0
7. I 8 « ch3 ch2ch2-co-nr-ch-r9 (k>3 IL -HHhJh-R, dans laquelle R^ représente un reste d'acide gras ou un groupement pro-5 tecteur de la fonction amine, Rg représente un radical amino ou alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle, l'un des symboles R^ ou R^ représente un radical carboxy et l'autre représente un atome d'hydrogène ou un radical carba-moyle ou alcoyloxycarbonyle contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuelle) lement substitué par un radical phényle ou nitrophényle et R^ représente « un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine ou un reste glycyle ou D alanyle dont la fonction amine est substituée par un reste d'acide gras ou par un groupement protecteur de la fonction amine, étant entendu que l'un au moins des symboles R^ ou R^Q représente 15 un reste d'acide gras, puis remplace éventuellement le radical R^ ou R^, lorsqu'il représente ou contient un groupement protecteur de la fonction amine par un atome d'hydrogène, les radicaux R' et/ou Rg, lorsqu'ils | représentent un radical alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone, éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle, par 20 un radical hydroxy et le radical R^ ou R^, lorsqu'il représente ou contient un radical alcoyloxycarbonyle contenant 1 à 4 atomes de carbone et éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle, par un radical carboxy, et isole le produit obtenu éventuellement sous forme d'un sel, 25 5 - Un procédé selon la revendication 3 pour la préparation d'un produit selon la revendication 1 ou 2 dans la formule duquel Rg représente un reste glycyle ou D alanyle dont la fonction amine est éventuellement substituée par un reste d'acide gras, caractérisé en ce que l'on fait / réagir un aminoacide de formule générale : /}/ 30 r5-nh-ch-cooh /JY ^6 J- 124 dans laquelle représente un reste d'acide gras ou un groupement pro- « tecteur de la fonction amine et R, représente un atome d'hydrogène ou le 6 radical méthyle, sur un tri- ou tétrapeptide de formule générale : X R_-NH-CH-CO-NH-ÇH-CO-RQ 7. r 8 GH3 CH2CH2-CO-NH-(JH-Rg NH2-CH-R4 5 dans laquelle R^ représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine, R_ représente un radical hydroxy, amino ou O alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle, l'un des symboles R^ ou Rg représente un atome d'hydrogène ou un radical carboxy, carbamoyle, alcoyloxycarbonyle 10 dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone et est éventuellement substituée par un radical phényle ou nitrophényle, N-carbonyl glycyle ou N-carbonyl D alanyle dont la fonction acide est éventuellement protégée, et l'autre représente un atome d'hydrogène ou un radical carboxy, carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 15 atomes de carbone et est éventuellement substituée par un radical phényle ou nitrophényle, étant entendu que R^ et Rg ne peuvent pas représenter simultanément un atome d'hydrogène, et étant entendu que l'un au moins des symboles Rj. et représente un reste d'acide gras, puis éventuellement remplace le radical R^ ou R^, lorsqu'il représente un groupement pro-20 tecteur de la fonction amine, par un atome d'hydrogène, le radical Rg lorsqu'il représente un radical alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle, par un radical hydroxy et des radicaux R^ et/ou Rg, lorsqu'ils représentent ou contiennent un radical alcoyloxycarbonyle contenant 1 à 4 atomes 25 de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophé* » nyle, par un radical carboxy et isole le produit obtenu éventuellement sous forme de sel,
6. Un procédé de préparation d'un produit selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que l'on fait réagir un dipeptide de formule ~ / 30 générale : / jf 125 R -M-CH-C0-M-CH-C0-Ro
7. I 8 CH3 GH2CH2-C00H dans laquelle R_ représente un reste d'acide gras ou un groupement pro-tecteur de la fonction amine et Rg représente un radical amino ou alcoyl-oxy contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un 5 radical phényle ou nitrophényle, sur un di- ou tripeptide de formule » générale ; H9N-CH-RQ 2 i 9 <™2>3 R^SH-CH-R* dans laquelle l'un des symboles R^ ou R^ représente un atome d'hydrogène ou un radical carboxy, carbamoyle, alcoyloxycarbonyle dont la partie 10 alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone et est éventuellement substituée par un radical phényle ou nitrophényle ou un resté N-carbonyl glycyle ou N-carbonyl D alanyle éventuellement estérifié par un radical alcoyle contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle et l'autre représente un atome d'hydro-15 gène ou un radical carboxy, carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone et est éventuellement substituée par un radical phényle ou nitrophényle, étant entendu que R^ et Rg ne peuvent pas représenter simultanément un atome d'hydrogène, et R10 représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la 20 fonction amine ou un reste glycyle ou D alanyle dont la fonction amine est substituée par un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine, l'un au moins des symboles R^ ou Rg et R^Q représentant ou contenant un radical glycyle ou D alanyle et l'un au moins des symboles R^ et R1Q représentant ou contenant un reste d'acide gras, puis 25 éventuellement remplace le radical R^ ou R^q lorsqu'il représente ou contient un groupement protecteur de la fonction amine, par un atome d'hydrogène et des radicaux Rg et/ou R^ et/ou Rg lorsqu'ils représentent selon le cas un radical alcoyloxy ou un radical alcoyloxycarbonyle contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical 30 phényle ou nitrophényle, par un radical hydroxy ou carboxy, „ / et isole le produit obtenu éventuellement sous forme de sel. 126
7. Un procédé de préparation d'un produit selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on fait réagir un dérivé de la L alanine de formule générale s R_-NH-CH-C00H * 7 | ch3 5 dans laquelle R^ représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine, sur un tri- ou tétrapeptide de formule générale : H0N-CH-CO-RQ 2 1 8 CH2CH2-CO-NH-CÏÏ-R9 (CHJ. R..-NH-CH-R. 10 4 dans laquelle Rg représente un radical hydroxy, amino ou alcoylôxy con-10 tenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle, l'un des symboles R^ ou R^ représente un atome d'hydrogène ou un radical carboxy, carbamoyle, alcoyloxycarbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone et est éventuellement substituée par un radical phényle ou nitrophényle ou un reste N-carbonyl 15 glycyle ou N-carbonyl D alanyle éventuellement estérifié par un radical alcoyle contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle et l'autre représente un atome d'hydrogène ou un radical carboxy, carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone et est éventuellement 20 substitué par un vaiical phényle ou nitrophényle, étant entendu que R^ et Rg ne peuvent pas représenter simultanément un atome d'hydrogène,et R10 représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine ou un radical glycyle ou D alanyle dont la fonction amine est substituée par un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de 25 la fonction amine, l'un au moins des symboles R^ ou R^ et R1Q représentant ou contenant un reste glycyle ou D alanyle et l'un au moins des symboles R^ et R^ représentant ou cqntenant un reste d'acide gras, puis éventuellement remplace le radical Ry ou R^, lorsqu'il représente ou contient un groupement protecteur de la fonction amine par un atome / f 127 d'hydrogène, et les radicaux Rg et/ou R^ et/ou R^, lorsqu'ils représentent ou contiennent un radical alcoyloxy ou alcoyloxycarbonyle contenant 1 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle par un radical hydroxy ou carboxy selon le cas, et isole > " 5 le produit obtenu éventuellement sous forme de sel.
8. Un procédé de préparation d'un produit selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on fait réagir un acide de formule générale : R"-CO-OH dans laquelle R"-CO- représente un reste d'acide gras, ou un dérivé 10 activé de cet acide, sur un tétra- ou pentapeptide de formule générale : Rn.-NH-CH-C0-NH-CH-C0-Ro 11 | | 8 CH- CH„CH„-CO-NH-CH-R. 3 2 2 | 9 (ch2)3 R, -NR-Ah-R. 10 4 dans laquelle l'un des symboles R^ ou R^ représente un atome d'hydrogène ou un radical carboxy, carbamoyle, alcoyloxycarbonyle dont la partie , alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone et est éventuellement substituée 15 par un radical phényle ou nitrophényle ou un reste N-carbonyl glycyle ou N-carbonyl D alanyle éventuellement estérifiê par un radical alcoyle contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical i phényle ou nitrophényle et l'autre représente un atome d'hydrogène ou un radical carboxy, carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle dont la partie alcoyle 20 contient 1 à 4 atomes de carbone et est éventuellement substituée par un radical phényle ou nitrophényle, étant entendu que R^ et Rg ne peuvent pas représenter simultanément un atome d'hydrogène, R_ représente un radical O hydroxy, amino ou alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle et R^ repré-25 sente un atome d'hydrogène, un reste d'acide gras, un groupement protecteur de la fonction amine ou un reste glycyle ou D alanyle dont la fonction amine est éventuellement substituée par un reste d'acide gras ; . ou un groupement protecteur de la fonction amine, R^ représente un atome d'hydrogène, un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la 30 fonction amine, étant entendu que l'un au moins des symboles R^ ou Rg et R^0 représente ou contient un reste glycyle ou D alanyle et que l*un au moins des symboles R^q et R^ représente un atome d'hydrogène ou, pour / /7 of 128 R^Qt un radical glycyle· ou D alanyle dont la fonction amine est libre et que lorsque l'un des radicaux R^q ou R^ représente ou contient un reste d'acide gras celui-ci et le reste R"-CO- sont identiques ou différents, puis, éventuellement remplace le radical R^q ou R^, 5 lorsqu'il représente ou contient un groupement protecteur de la fonction amine, par un atome d'hydrogène et les radicaux Rg et/ou R^ et/ou Rg, lorsqu'ils représentent ou contiennent un radical alcoyloxy ou alcoyloxycarbonyle contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle par un radical hydroxy 10 ou carboxy selon le cas, et isole le produit obtenu éventuellement sous forme de sel.
9. Procédé de préparation d'un produit selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on fixe sur un support approprié un di- ou tripeptide de formule générale :
15 R1 ,-NH-CH-R 13 1 9 (éïO, R12-NH-CH-R4 dans laquelle l'un des symboles R^ ou R^ représente un radical carboxy, N-carbonyl glycyle ou N-carbonyl D alanyle et l'autre un atome d'hydrogène ou un radical carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone et est éventuellement substituée pat; un 20 radical phényle ou nitrophényle, R^ représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine ou un radical glycyle ou D alanyle dont la fonction amine est substituée par un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine et R^ représente un groupement protecteur de la fonction amine, étant entendu que lorsque 25 R^2 et représentent ou contiennent un groupement protecteur de la fonction amine, ces groupements protecteurs sont différents, puis, après déblocage de la fonction amine protégée par R^, on condense : - soit l'acide D glutamique dont les fonctions amine et α-carboxy sont convenablement protégées, c'est-à-dire le produit de formule générale : .. /
30 Rjj-SH-ÇH-CO-Rg / CH2CH2-COOH /// ( /// y 129 dans laquelle R., est défini comme ci-dessus et R. représente un radical l-i o - amino ou un radical alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone éven tuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle, puis, après * déblocage de la fonction amine protégée par R^3, 5. soit un dérivé de la L alanine de formule générale : R -NH-CH-COOH
13. I CH3 dans laquelle R^3 est défini comme ci-dessus, puis, après déblocage des fonctions amines protégées par R^3 et/ou R^, éventuellement l'acide gras de formule générale :
10 R" -C00H - soit un dérivé de la L alanine de formule générale : R-NH-CH-COOH ca3 dans laquelle R représente un reste d'acide gras, - soit le dipeptide de formule générale :
15 R,,-NH-CH-CO-NH-CH-CO-R_
14 I , 'S ch3 cïï2ch2-cooh dans laquelle Rg est défini comme ci-dessus et R ^ représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine, étant entendu que, lorsque R^" représente un groupement protecteur de la fonction amine, celui-ci est différent du groupement protecteur défini 20 ci-dessus puis éventuellement, après déblocage des fonctions amines protégées par le radical R^ et/ou R^2, l'acide de formule générale R'-COOH, puis sépare le produit obtenu de son support, <>.t élimine, si nécessaire, les groupements protecteurs des fonctions amines et carboxy, et isole le produit obtenu éventuellement sous forme de sel. 25 10 - Procédé de préparation d'un produit selon les revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on fixe sur un support approprié le peptide de formule générale : R.--NH-CH-C0-R- 15 jo j C^CI^-CO-NH-ÇH-Rç (CH,)- / 1 2 3 R -NH-CH-R. I / 130 dans laquelle l'un des symboles R^ ou R^ représente un radical carboxy, N-carbonyl glycyle ou N-carbonyl D alanyle et l'autre un atome d'hydrogène ou un radical carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle dont la partie alccyle contient 1 à 4 atomes de carbone et est éventuellement substituée par 5 un radical phényle ou nitrophényle, R^ représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine ou un radical glycyle ou D alanyle dont la fonction amine est substituée par un reste 1 d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine, et Rg représente un radical amino ou alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de 10 carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle, représente un groupement protecteur de la fonction amine, étant entendu que lorsque R^ et R^ représentent ou contiennent un groupement protecteur de la fonction amine, ces groupements protecteurs sont différents, puis, après déblocage de la fonction amine protégée par R^, 15 on condense : - soit un dérivé de la L alanine de formule générale : R,--NH-CH-C00H 15. ch3 dans laquelle R^,. est défini comme précédemment, puis éventuellement, après déblocage des fonctions amines protégées par R^5 et/ou Rl2 l'acide 20 de formule générale R"-C00H, - soit un dérivé de la L alanine de formule générale : R-NH-CH-COOH dans laquelle R représente un reste d'acide gras, puis sépare le produit obtenu de son support, puis élimine, si nécessaire, les groupement pro-25 tecteurs des fonctions amines et carboxy et isole le produit obtenu éventuellement sous forme de sel.
11. Procédé de préparation d'un produit selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on fixe sur un support approprié le peptide de formule générale :
30 R16-NH-CH-CO-NH-ÇH-CO-Rg CH, CH, -CH, -CO-NH-ÇH-Bg «jV3 // r12-nh-ch-r4 ψ /' 131 .dans laquelle l'un des symboles ou R^ représente un radical carboxy, - N-carbonyl glycyle ou N-carbonyl D alanyle et l'autre un atome d'hydrogène ou un radical carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle dont la partie alcoyle * contient 1 à 4 atomes de carbone et est éventuellement substituée par 5 un radical phényle ou nitrophényle, R^ représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine ou un radical glycyle ou D alanyle dont la fonction amine est substituée par un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine et Rg représente un radical amino ou alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone éven-10 tuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle, représente un groupement protecteur de. la fonction amine, étant entendu que lorsque et R-^g représentent ou contiennent un groupement protecteur de la fonction amine, ces groupements protecteurs peuvent être différents, puis, après déblocage des fonctions amines protégées par R^g 15 et/ou R^, on condense l'acide de formule générale R"C0-0H dans laquelle R"-CO représente un reste d'acide gras, puis sépare le produit obtenu de son support, élimine, si nécessaire les groupements protecteurs des fonctions amines et carboxy, et isole le produit obtenu éventuellement sous forme de sel. 20 12 - Un procédé de préparation d'un produit tel que défini dans la reven dication 1 pour lequel, l'un des symboles Rj ou R^ représente un radical N-carbonyl glycyle ou N-carbonyl D alanyle et l'autre réprésente un atome d'hydrogène ou un radical carboxy, carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone et est 25 éventuellement substituée par un radical phényle ou nitrophényle, caractérisé en ce que l'on fixe sur un support convenable la glycine ou la D alanine dont la fonction amine est protégée, puis, après déblocage de la fonction amine, condense un aminoacide ou un peptide de formule générale : R, _-NH-CH-RQ 17 | .9 30 (0¾ >3 r12-nh-ch-r4 dans laquelle l'un des symboles R^ ou R^ représente un radical carboxy et l'autre représente un atome d'hydrogène ou un radical carbamoyle ou., alcoyloxycarbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de /Y U/ 132 carbone est éventuellement substituée par un radical phényle ou nitro-phényle, R^ représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur , de la fonction amine ou un radical glycyle ou D alanyle dont la fonction amine est substituée par un reste d'acide gras ou un groupement protec-5 teur de la fonction amine et R^ représente un groupement protecteur de la fonction amine ou un reste d'un D aminoacide de formule générale : r'o-NH-CH-C0-Ro 18 I o CI^CI^-COOH dans laquelle Rg représente un radical amino ou alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou 10 nitrophényle et R^g représente un groupement protecteur de la fonction amine ou un reste d'un L aminoacide de formule générale : R -NH-CH-COOH CHg dans laquelle R Q représente un groupement protecteur de la fonction amine ou un reste d'acide gras définis précédemment, étant entendu que 15 lorsque R^, R^g ou R^ représentant chacun un groupement protecteur de la fonction amine, ces groupements sont différents de R^ lorsque celui-ci représente ou contient un groupement protecteur de la fonction amine, R^2 pouvant cependant être identique à R-^g, et : - lorsque R^ représente un groupement protecteur de la fonction amine, 20 élimine ce groupement protecteur, puis condense : - soit un dérivé de l'acide D glutamique défini ci-dessus pour lequel R^g représente un groupement protecteur de la fonction amine, puis, après élimination de R^g, condense un dérivé de la L alanine defini ci- ' dessus pour lequel R^g est défini comme précédemment et, lorsque R^g et/ 25 ou R^ représentent un groupement protecteur de la fonction amine, élimine les radicaux R1Q et/ou R „, puis condense l'acide de formule générale »'CO-OH, - soit un dérivé de l'acide D glutamique defini ci-dessus pour lequel R^g représente un reste d'un L aminoacide défini ci-dessus pour 30 lequel R^ est défini comme précédemment, et, lorsque R^ et/ou R12 représentent ou contiennent un groupement protecteur de la fonction amine, élimine les radicaux Riq et/ou R puis condense l'acide gras de /'/ ί 133 formule générale R"C0-0H, - lorsque représente un reste de l'acide D glutamique défini ci-dessus pour lequel R^g représente un groupement protecteur de la fonction amine, élimine ce groupement protecteur, puis condense un dérivé de la I L alanine défini ci-dessus pour lequel R^ est défini comme précédemment 5 et, lorsque R^ et/ou R^ représentent ou contiennent un groupement protecteur de la fonction amine, élimine les radicaux R^ et/ou R^> puis condense l'acide gras de formule générale R?'CO-OH, et - lorsque R17 représente un reste d'acide D glutamique défini ci-dessus pour lequel R^g représente un reste d'un L aminoacide défini ci-dessus 10 pour lequel R^ représente un groupement protecteur de la fonction amine, élimine les radicaux R^ et/ou R^> puis condense l'acide gras de formule générale R"C0-0H puis sépare le produit obtenu de son support, élimine, si nécessaire les groupements protecteurs des fonctions amine et carboxy, et isole le produit obtenu éventuellement sous forme de sel» 15 13 - Médicament caractérisé en ce qu'il est constitué par le produit selon la revendication 1 à l'état pur ou en présence d'un ou plusieurs diluants ou adjuvants compatibles et pharmaceutiquement acceptables. Dessins : ........pktnchss ..JH- r.-v ,r. Ί .......λ. nr-n do nards J/1¾. p . ί d·:. description .......' iwcndicaiior ......S...........uü^criptif Lux®nibeurrj |7 198® ^ Charles München /
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