JPH03505097A - 二官能性カップリング剤およびそれから調製される放射性核種標識組成物 - Google Patents

二官能性カップリング剤およびそれから調製される放射性核種標識組成物

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JPH03505097A JP1507528A JP50752889A JPH03505097A JP H03505097 A JPH03505097 A JP H03505097A JP 1507528 A JP1507528 A JP 1507528A JP 50752889 A JP50752889 A JP 50752889A JP H03505097 A JPH03505097 A JP H03505097A
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ボーティン，レイモンド・エイチ
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 二官能性力、プリング剤およびそれから調製される放射性核種標識組成物発明の 背景 性金属を用いた抗体およびそのフラグメントの標識法に関する。
な進歩とし℃認められＣ℃・る。モノクローナル抗体の使用により非常に特異的 な新しい診断薬が理想的に提供される。ガンマ線乞放射するシンチグラフィー剤 とじ又テクネチウム−９９ｍ　を選択することは、短い半減期とともに放射光子 検出の容易性に起因し１好ましいと考えられる。テクネチウムを抗体に付着させ る現在の諸方法は、調製の簡便さ、免疫反応性の保持、標的器官への迅速な分布 、迅速な浄化および標的以外の部位にあまり局在しないことといった目標には達 していない。
蛋白質の放射標識には一般的に二つの方法がとられる。第一の方法は、放射性金 属が蛋白質分子自身に結合する直接標識法である。第二の方法は、二官能性試薬 を蛋白質に連結させ、放射性金Ａ’に二官能性試薬を経℃蛋白質に付着させる間 接標識法である。抗体を放射性金属によって標識する種々の試みが、間接法によ つ又なされ又いる。こうした一つの方法においては、ジエチレントリアミンベン 夕酢酸（ＤＴＰＡ）のよ５なキレート化剤を蛋白質に結合させ、次に蛋白質分子 に付着したキレート化剤に金属イオンを標識する。例えば、Ｋｂ　ａ　ｗらＣ３ ｃｉｅｎｃｅ正：２９５−２９７（１９８０））は、ＤＴＰＡ　を経℃インジウ ム−１１１で標識した心臓ミオシンに対する抗体および標識抗体の心筋梗塞像へ の使用乞開示する。また、Ｋｒｅｊｃａｒｅｋ　らＣＢ　ｉｏ−ｃｈｅｍ、　史 ユ但よりＲｅ　ｓ　、Ｃｏｒｒｍｕｎ　、　ｌｌ　：　５８１−５８５（１９７ ７））およびＣｈｉｌｄｓ、Ｒ，Ｌ、　とＨｎａｔｏｗｉｃｈ、Ｄ、ＪＪＪ、Ｎ ｕｃｌ、Ｍｅｄ、２６：２９３（１９８５）：ｌの文献も参照のこと。さらに最 近の方法としｔＦｒｉｔｚｂｅｒｇらはキレート化剤とし℃特殊なジアミドジチ オール基およびジアミノジチオール基の使用を記載し又いろ（Ｆｒ　ｉ　ｔｚｂ ｅｒｇら、Ｊ、Ｎｕｃｌ、Ｍｅ生、２７：９５７（１９８６））。
米国特許第４．６５９，８３９号は、抗体Ｆａｂ・フラグメントを含む生物学的 に胃用な分子類に放射性核種金属イオンを結合させる二官能性力、プリング４］ 乞開示する。このカップリング剤はマレイミド部位および常磁性もしくは放射性 核種キレート化部分を有する。マレイミドは遊離のスルフヒドリル基またはアミ ン基と選択的に結合するといわれ℃いる。米国特許第４，６７１．９５８号は、 抗体上の特殊な部位にリンカ−基を付着させる方法を開示する。抗体への付着は Ｆａｂ’のスルフヒドリル基またはＦｃ領域の酸化された糖質を通じ１行われる と記載されｉｔ・る。
ヨーロ、バ出願公開第’１８８．２５６号は、インビボでの使用のためのキレー ト化した金属放射性核穐？リジンのアミン基に結合した蛋白質類を開示する。金 属キレート化化合物はジチオ−ジアミノもしくは−ジアミドカルボン酸類あるい はアミン類あるいはそれらの誘導体である。ヨーク、パ出願公開第’１７３，６ ２９号は、抗体あるいは抗体フラグメントに共有結合した適合するキレータ−に 配位結合する金属イオン放荷する抗体−金属イオン複合体を開示する。スルフヒ ドリル付着に適したキレート化剤は反応性アルキルハロ基、ｐ〜メルクリ安息香 酸基およびミカエル（Ｍｉｃｈａｅｌ）タイプ付加反応の可能な基ン宵するキレ ート化剤放射むといわれ又℃・る。
間接標識法は櫨々の程度で成功馨収め℃いろ。しかしながら、標識生成物はしば しば調製困難であり、免疫反応性が低下し、かつインビボにおい℃不安定である 。さらに、使用前に標識生成物を精製する技術をしばしば要する。％Ｋ　Ｔ　ｃ 　−９９ｒｒｌ用いた放射性免疫診断過程および放射性免疫治療過程のための安 定した標識蛋白質の改良法の必要性は高い。
発明の要約 本発明は、スルフヒドリル含有蛋白質またはペプチドと金属放射性シ種を結合さ せる二官能性力、プリング剤を提供する。この力、プリング剤は、スルフヒドリ ル選択的な求電子試薬、少なくとも一つのチオール放射むキレート化剤および前 述の求電子試薬と前述のキレート化剤との結合χ助ける有機結合基から成る。
本発明はさらに、抗体または抗体フラグメント群および抗体または抗体フラグメ ント上のスルフヒドリル基に結合した上記の二官能性カップリング剤？含む放射 性診断薬前駆体乞提供する。不発明はさらに、放射性診断薬前駆体および前駆体 のチオール基に結合する金属放射性核種を含む放射性診断薬を提供する。
本発明はまた、少なくとも一つのスルフヒドリル基を胃する蛋白質またはベプチ ドヲ放射標識する方法を提供する。この方法は、二官能性力、プリング剤を蛋白 質またはペプチドに接触させて放射性診断薬前駆体を形成することより成る。
チオール保護基馨放射性診断薬前駆体から分離し１、次に前駆体を放射性金属と 接触させる。
発明の詳細な記述 このスルフヒドリル特有二宮能性力、プリング剤は、安定した状態で蛋白質に放 射性核種を付着する方法を提供する。抗体または抗体フラグメントの放射標識ン 冥施する場合の重力、ブリング剤の一つの利点は、配位子付着が抗体またはフラ グメントの抗ぶ結合領域から離れ又いることである。力、プリング剤のスルフヒ ドリル選択的求電子試薬成分は、緩和な条件下での蛋白質の部位選択的な修飾を 可能とする。
通常、二官能性力、プリング刺止のチオール含有キレート化部分はスルフヒドリ ル選択的求電子試薬に不適合である。重力、グリング剤のキレート化部位は求電 子試薬が蛋白質基質に付着する間に求電子試薬との反応から適宜に保護されうろ ことが示されている。キレート化部分は続いて脱保護化され℃放射性核種結合の ためのキレート化機能が出現しつる。
本発明の二官能性カップリング剤は一般弐Ｅ−Ｌ−Ｃで表示されつる（式中、Ｅ はスルフヒドリル選択的求電子試薬、Ｌは有機結合基、セしてＣは少な（とも一 つのチオールを含むキレート化剤である）。この中で使用し℃いたように、“保 護チオール”という表現はチオール保護基でおおわれたチオールキレート化剤乞 さす。
スルフ　ヒ）’　ＩＪ　ル選択性求を子に薬ハノ・ロアルキル、スルフォン酸エ ステル、マレイミドおよびアジリジンを含むグループから選択されることが好ま しく、ＢｒＧ（２ＣＯＮＨ−’　、　ＣＩＣＨ２Ｃ０ＮＨ−、ＩＣＨ２Ｃ０ＮＨ −およびＮ−置換？Ｌ／イミドを含むグループから選択されることが最も好まし い。有機結合基は少な（とも２価であることが望ましい。好ましい有機結合基は 、直鎖または分岐釧アルキル、アリルおよび置換アリル、複素芳香族および置換 複素芳香族、そし℃炭素に異原子置換を含む直鎖または分岐釦アルキルからなる グループから選択され、そして随意にアルキル、置換アルキルおよび異厚子分岐 基を含む。最も好ましい有機結合基は−ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２−、−（？Ｈ２Ｃ ６Ｈ４−、−ＮＢＣＨ２Ｃ１（２−ある（・は−ＣＯＭ（Ｑ（（ＣＯ２Ｈ）ＣＨ ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−”’Ｑある。適しタキＬ／−ト化剤ハ少な（とも一つの 保護チオール基を胃し、かつ金属複合体を安定化することの知られ’Ｑ・る他の 置換基を随意に有する。こうした基および置換基は直線状または分岐状に配置さ れる。
本発明の放射性核種標識化合物の詞段を実施する場合には、キレート化部分のチ オール基は、蛋白質の活性を本質的に変化させることなしに、蛋白質の存在下遊 離のチオールを再生する緩和な条件で容易に除去できる有機あるいは無機の保護 基によっておおわれる。キレート化剤はまた、アミン類、アミド類、カルボン酸 塩類、スルホン酸塩類およびリン酸塩類を含みつる。本発明の好適な実施態様で は、チオール保護基はチオールエステル類、ジスシフイー類およびマイケル付加 生成物からなる基から選択される。保護基がチオールエステルであることが最も 好ましい。キレート化剤は下記の式に示される基から選択されることが最も好ま しい：ｏｏｏ　　　　　　　　　ｏ。
（式中、ａは１かも５までの整数で、３が最も好適であり；ｂは１か６３までの 整数で、１が最も好適であり；Ｒは水素、メチル、低級アルキル、ヒドロキシア ルキル、置換アルキル、官能基で置換さｎたアルキル、アリールもしくは置換ア リールで、Ｒがメチルもしくはフェニルが最も好適であり；各Ｒ］は個別に水素 、メチル、低級アルキル、ヒドロキシアルキル、置換アルキル、官能基で置換さ れたアルキル、アリールもしくは置換アリールで、水素が最も好適である）。
本発明の好適な二官能性力、プリング剤は下記の式で示さｎる：Ｒ”Ｓ＋ＣＨ２ ）−６ＣＯＮＨ４：ＣＨ２）　（Ｃおよびｆは個別に１．２もしくは６であり； ｄおよびｅは個別に１から５までの整数であり；Ｘは塩素、臭素、またはヨウ素 であり；Ｒ２は水素、メチル、アルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシアル キル、アリール、直換アリール、置換アルキルまたは官能基で置換されたアルキ ルであり；Ｒ３は−ＣＯＲ４もしくは−ＳＲ４であって、Ｒ４は水素、メチル、 アルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシアルキル、アリール、カルボキシア リール、置換アリール、置換アルキルまたは官能基で置換されたアルキルであり 、各Ｒ５は個別に水素、メチル、アルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシア ルキル、アリール、刀ルポキシアリール、置換アリール、または置換アルキルで あり；Ｒ６はアルキル、置換アルキル、ｇがＯから５までの整数であルー　（Ｃ Ｈ２ＣＨ２０）　ｇ−ＣＨ２ＣＨ２−、アリール、マタハ置換アリールテあり； そＩ、　″ｃＺ　ハＣＩ　ＣＴ（２Ｃ０ＮＨ、Ｂ　ｒ　ＣＨ２Ｃ０ＮＩ（、Ｉ　 Ｑ（２Ｃ０ＮＨ一本発明の二官能性力、プリング剤は、Ｔｃ、Ｒｅ、Ｐｂおよび Ｃｕの放射性核種といったチオール類に親和性ＹＩＷする放射性金属の抗体への 結合に■用であり℃、式Ａｂ−５−Ｅ−Ｌ−Ｃ−Ｍ（式中、Ａｂは抗体またはそ れから派生するフラグメントであり、Ｓはスルフヒドリルであり、Ｍはチオール 類に親和性を有する放射性金属であり、かつＥ、Ｌ、およびＣは前に定義した通 りである）の放射性核種標識組成物を調製しうろことが示されている。
前に述べたように、二官能性カップリング剤は蛋白質上のスｌレフヒドリル含有 基に放射性核種を選択的に付Ｎする赴めに使用しつる。蛋白質上のスルフヒドリ ルはシスティ／残基の存在に起因する。蛋白質の他のアミノ酸および機能は修飾 ？受けずに保たｎ５と。抗体のような生物学的に機能放荷する蛋白質にとつ又、 遊離のスルフヒドリルの修飾は通常抗原結合部位から離れ１いる。
遊離のスルクヒドリル基乞含有する蛋白質は二官能性力、プリング剤と直接結合 しうる。多くの蛋白質はスルフヒビリル基を有していないが、アミノ酸シスチン ｔつなぐジスルフィド結合を有する。このジスルフィド結合は緩和な還匁剤によ り遊離のシスティンに還元さｎうる。ジチオスレイトール、ジチオエリスリトー ル、システィン、メルカプトエタノールまたは種々の他の還元剤が適した還元剤 である。本発明の最適な使用は還元蛋白質の精製放射む。この精製は標体的な方 法、通常はゲル濾過クロマトグラフィーによって達成しつる。典型的な還元は、 ｐＨ７から８の緩衝液中の１−１０ｍｇ／ｍＬ蛋白質溶液に対し−（２−２０ｍ Ｍ濃度を与える充分量のジチオスレイトール添加によつ℃実施さｎうる。約１時 間後に、蛋白質は二官能性カップリング剤との反応に適した緩衝液中でゲルー過 カラムを通過させる。
好適な実施態様では、二官能性力、プリング剤が抗体分子またはフラグメントと 放射性核種を結合するために使用される。無傷の抗体は普通遊離のシスティ／は 有し℃いないがシスチンジスルフィド放荷する。したがつ℃無傷σ〕抗体は前述 のように還元後二官能性力、プリング剤と結合しうろ。無傷の抗体はまた、ペプ シンのような蛋白分解酵素で処理し℃抗原結合フラグメントＦ（ａｂ’）２と別 σ〕フラグメン）Ｆｃ’Ｙ得ることができる。Ｆ（ａｂ’）２は緩和な還元によ り二つσ）Ｆａｂ’フラダメントに開裂しつる。このＦａｂ’は抗体結合部位な らびに遊離システインチオール基を含む。抗原結合部位を含む蛋白質部分は二官 能性試薬と反応しなし・ので、Ｆａｂ’の抗原結合性は変わらない。
二官能性カップリング剤は、遊離スルフヒドリル数に比べ℃過剰に蛋白質溶液に 加える。典型的には、ｐＨ７から８（ｐＨ７，０が好ましい〕の緩衝液中σ）１ −２ｍ　ｇ　７ｍ　Ｌ　　蛋白質溶液に二官能性カップリング剤ぞ必要な場合に はジメチルスフオキシド はスルフヒビリル基の数に対しｉ５−１５モル比となる。試薬の溶解に補助溶剤 が必要な場合には、補助溶剤の濃度は１から１５％ｖ　／　ｖの間、通常は５％ に保つ。
１から２時間の反応時間が存在する全スルフヒドリルを反応させるのに充分であ り、これより長い反応時間は最適ではない。つぎに余分σ〕二官能性カッブリ／ グ剤？除去する。通常こｎはゲル濾過クロマトグラフィー？用い″Ｃ実施される 。
つぎに蛋白質に付着し１こ二官能性力，プリング剤からチオール保護基を除去す る。ジスルフィドで保護されたチオールの場合には、この操作は蛋白質ジスルフ ィドを還元するために使用された同一の条件で達成でき、前に述べられている。
逆ミカエル反応で除去されつる保護基のみ溶媒のｐＨを増加させる必要がある。
チオールエステル類は、中性水溶液中で求電子性であることが一般的に知られ又 いる試薬に暴露ｊることにより除去されつる。これは、水酸化物、イミダゾール 、ヒト５ラジンと置換ヒドラジン類およびヒドロキシルアミンと置換ヒドロキシ ルミン類である。チオールエステル除去の典型的手順では、１容量の０．５−１ ．０Ｍヒト蛋白質はつぎにゲル濾過クロマトグラフィーで精製しうろ。
二官能性カップリング剤蛋白質結合体の脱保護化は、金属特に放射性核種の結合 のためのチオール含有キレート化機能を提供する。脱保護化された金属に対する キレート化部分の親和性は一般的に充分高℃・ので、この結合は中性ｐＨ付近の 水溶液中周囲温度もしくはその近辺で達成しつる。５−８のｐＨ範囲および４− ３７℃の温度？使用しつる。
ある糧の放射性核種は二官能性カップリング剤との複合化に先立つ℃酸化状態の 変化を必要とする。酸化状態の変化は別の容器中または二官能性カップリング剤 蛋白質結合体の存在下で達成しつる。放射性核種の性質、および複合体形成の相 対速度によっ℃は、トランスファー配位子が必要となるであろう。このトランス ファー配位子は、還元状態において放射性核種を弱（複合化することの可能な分 子または混合物である。このトランスファー配位子は別の比較的不安定な中間体 を一過的に安定化することのみ乞意図し′″Ｃ（・る。テクネチウムと二官能性 カツプリング剤との複合体は、トランスファー配位子としてＤ−グルカン酸を用 いた方法で調製しつる。テクネチウム−９９ｍ発生器からの溶出液を、０．２Ｎ 炭酸水素塩中の２０から３０ｍｇ／ｍＬのＤ−グルカン酸−カリウムの等容量と 混合する。パーテクネテー）　（ｐｅｒｔｅｃｈｎｅｔａｔｅ）が還元し、トラ ンスファー複合体が形成されるのに適した長さの時間乞待った後に、混合ｔＬを 脱保護化した二官能性力，プリング剤蛋白質結合体と混合する。蛋白質結合体は 通常ｐＨ７から８の緩衝溶液中である。混合液は、９０％以上（通常は９５％以 上）のテクネチウムが蛋白質に付Ｎする丁で、周囲温度ｆたはその近辺に保つ。
こｔは、ゲル濾過ＨＰＬＣおよび薄層クロマトグラフィー技術を含む種々の定量 法および定性法によって確認しつる。
本発明の最も好適な二官能性力，プリング剤の例乞下記に示す。
化合物Ｉ 化合物■ 化合物Ｉは下記の概要に従つ℃容易に訓製しうる。
化合物Ｉ 化合物■は下記の概要に従り℃容易に調製しうる：Ｏ ＣＨ３Ｃ３Ｈ＋ＢｒＣＨ２Ｃ０２Ｈ凪 ・２ＨＣ１ 化合物■は下記の概要に従っ℃容易に調製し５ろ：本発明はさらに下記の実施例 に記載され℃おり、実施例中特に記載のない場合には丁べての部および百分率は 重量で、度はセ氏で表示されている。
冥施例Ｉ：８．１０−ビス（２−ベンゾイルチオアセトアミド）−１−ブロモ− ６，６−ジアザ−２，７−シオキソデカン（化合物Ｉ）のｍＷ上記に同定された 化合物は、Ｒ，Ｆ、　５ｃｈｎｅｉｄｅｒらＣＪ、　Ｎｕｃｌ、　Ｍｅｄ。
２５．２２３−２９（１９８４））によって記載された文献の方法によりｄｌ− ２，４−ジアミノブロバノイ、クアシドから調製した。生成物はアセトニトリル ／水から再結晶した。ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−δ５）δ１．７８（ｍ、ＩＨ）、１． ９４（ｍ、ＩＨ）、３．１６（ｍ、２Ｈ）、３．８１　（ｓ、２Ｈ）、３．８９ （ｓ、２Ｈ）、４．２６（ｍ、ＩＨ）、７．３６（ｍ。
４Ｈ）、７．６９（ｔ、２Ｈ）、７．９４（ｍ、４Ｈ）−８，２２（ｂｒ　　ｔ 、ＩＨ，ＮＨ）。
８．５５　（ｂｒ　ｄ　、　ＩＨ，ＮＨ）。
ｂ）スクシニミジル２．４−ビス（２−ベンゾイルチオアセトアミド　ブタノエ 二上ヱ１り監 上記に調製した酸５．０，９　（１０，５４ミリモル）に１５０１のＴＨＦを加 えた。混合液を透明な溶液が得られるように徐々に温め、つぎに周囲温度まで冷 却した。
Ｎ−ヒドロキシスクシニイミド（ｉ、２５Ｌ　１０．８６ミリモル、１００モル ％）およびジシクロへキシルカルポジイミ）’（２，２ＯＬ　１０．６６ミリモ ル、１００モル％）を加え、溶液馨室温で１６時間攪拌した。沈澱したジシクロ へキシルウレアをｒ遇し、Ｆ液をロータリーエバポレーターで濃縮して白色固体 を得た。６００ｍＬａ）２−プロパツールからの再結晶により白色細粉状のスク シニミジルエステルか得られた。
１．３Ｌ２．２７ミリモ／Ｌ’、２２％。ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ　６）δ１．９ ７　（ｍ、　Ｉ　Ｈ）　。
２．１１　（ｍ、　１Ｈ，）、２．８２（ｓ、４Ｈ）、３．３２（ｍ、２Ｈ）、 ５．８２（ｓ、２Ｈ）、３．９２（ｓ、２Ｈ）、４．７８（ｍ、ＩＨ）、７．５ ７（ｍ、４Ｈ）、７．７１　（ｍ、２Ｈ）、７．９６（ｍ。
４Ｈ）、８．３６（ｂｒ　　ｔ、ＩＨ，ＮＨ）、９．０１　（ｂｒ　ｄ、＋Ｈ， ＮＨ）。
ｃ）２−（ｔ−ブチルオキシカルボニルアミノ）エチルアミンジノ調製７、５　 ＆のアミノアでトニトリル塩酸（８１，０５ミリモル、１５０モル％）と１０． ０９０）ＮａＨＣＯ３（１１９ミリモル、２２０モル％）の＋５０ｍＬ水浴数に 、１１．９ｇのジーｔ−プチルジカルボネート（５４，４ミリモル）を加えた。
不均一な混合液χ室温で１６時間激しく攪拌した。ｐＨは２Ｎ塩酸で５．ＯＫ調 整した。溶液を酢酸エチル（２Ｘ　７５ｍＬ　）で抽出し、抽出液Ｙ　Ｎａ　２ 　ＳＯ４で乾燥した。−過して溶媒をロータリーエバポレーターで除去すると褐 色油状物が得られた。クーゲルロール（Ｋｕｇｅｌｒｏｈｒ）蒸留によっ”Ｃ低 融解性の白色面体画分（沸点９５℃、０．１０□　）が得らｔた。ＴＬＣ（Ｅｔ ＯＡｃ）　Ｒｆ　Ｏ，７４、（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン１　：　１　）Ｒｆｏ、６ １゜８．２ＯＬ５２．５ミリモル、９６％。上記の保護ニトリル２．０ｇおよび 氷酢酸７５ｍＬをバー（Ｐａｒｒ）耐圧びんに入れた。保護ニトリルを溶解させ た後に、５％Ｐｄ／ＣＯ，２０ｇを加えて混合液を２時間４５ｐｓｉｇＨ２で水 素添加した。混合液を酸洗浄セライトで濾過し℃、ロータリーエバポレーター（ ３０℃、真空ポンプ）で酢酸を除去し℃黄褐色の油状物乞得た。
上記のスクシニミジル２．４−ビス（２−ベンゾイルチオアセトアミド）ブタノ ニー）　（２，４１Ｌ４．２２ミリモル）放水４０ｍＬ　　に懸濁した。この懸 濁液に４０ｍＬ　ＴＨＦ中の粗２−（ｔ−ブチルオキシカルボニルアミノ）エチ ルアミン（上記のように１．３２ｇのｔ−ブチルオキシカルボニルアミノアセト ニトリルかう調製した、１００モル％）馨加えた。この混合液に５ｍＬの飽和Ｎ ａＨＣＯ３水溶液を加えた。不均一な混合液を室温で６時間攪拌した。さらに２ ０ｍ１ノの飽和ＮａＨＯＯ３を追加し、混合液！ＥｔＯＡｃ　（２Ｘ　１００ｍ Ｔ、）で抽出した。抽出液はＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し℃溶媒をロータリー エバポレーターで除去して黄色油状物を得た。
これＹｌｏｍＬの酢酸エチルで摩砕しＩ濾過した。Ｐｉを４０Ｊ９のシリカゲル で酢酸エチルで浴出して精製した。７００ｍ１ｉ　、０．１６ミリモル、４％。
ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ）Ｒｆ　Ｏ，１０゜ＮＭＲ（ＭｅＯＨ−ｄ　４）δ１．４０ （ｓ、９Ｈ）、１．８６（ｍ。
ＩＨ）、２．０８（ｍ、ＩＨ）、５．１８（ｍ、４Ｈ）、３．８０（Ｓ、２Ｈ） 、３．８６（ｓ、２Ｈ）。
４．３８（ｍ、ＩＨ）、７．４９（ｍ、４Ｈ）、７．６５（ｍ、２Ｈ）、７．９ ６（ｍ、４Ｈ）。
２つのプロトン（Ｃ−７）が溶媒で隠された。
ｅ）辷ゴゴニｉ≦上ヱ王り肚ゴヱ／土ビ２１土ΣＬ」及±二１２二１−ヘゲタン アミントリフルオロアセテートの調製上記の３−アザ−５，７−ビス（２−ベン ゾイルチオアセトアミトリー４−オキソ−１−（ｔ−ブチルオキシカルボニルア ミノ）へブタ７＜６０ｍｇ、０．０９７ミリモル）乞５ｍＬのトリフルオロ酢酸 に溶解し周囲温度で１時間攪拌することにより脱保護化した。トリフルオロ酢酸 の除去（ロータリーエバポレーター、続い℃真翌下１６時間乾燥）により淡黄色 ガラス状物が得られた。ＮＭＲ（ＭｅＯＨ−ｄ　４）δ１．９１　（ｍ、ＩＨ） 、２．１２（ｍ、ＩＨ）、３．１０＜ｍ、２Ｈ）、３．５３（ｍ、２Ｈ）、３． ６１　（ｍ、２Ｈ）、５．８６（ｓ、２Ｈ）、３．９３（ｓ、２Ｈ）、４．３４ （ｍ。
１Ｈ）、７．４９（ｍ、４Ｈ）、７．７２（ｍ、２Ｈ）、７．９５（ｍ、４Ｈ） 。
上記のトリフルオロ酢酸アミン＜６０ｍｇ、０．１０ミリモル）を水５ｍｌ、に 溶か丁。
この溶液に５０ｍ！ｉのＮａＨＣＯ３（０，６０ミリモル、６００モル％）およ び２０　ｕＬのプロモアセチルブロミ）”（０，２２ミリモル、２３０モル％） を加えた。淡褐色の混合液を周囲温度で１時間攪拌した。水（１０ｍＬ）および 飽和ＮａＨｃｏ　３　（１０ｍＬ　）　Ｙ加え℃、混合液をクロロホルム（２Ｘ ５０ｍＬ）で抽出した。抽出液はＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、溶媒をロータ リーエバポレーターで除去し℃黄色油状物を得た。
これＹＸ空下で乾燥させて凝固させた。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ２）δ１．９１　（ｍ 、　ＩＨ）　。
ｔ９８（ｍ、ＩＨ）、５．４１　（ｍ、４Ｈ）、３．５９（ｍ、２Ｈ）、３．７ ４（ｓ、２Ｈ）、３．７８（ｓ、２Ｈ）、３．８０（ｓ、２Ｈ）、４．４８（ｍ 、　１Ｈ）、７．１９（ｂｒ　ｍ、ＩＨ，ＮＨ）。
７．３１　（ｂｒ　ｍ、ＩＨ，ＮＫ）、７．４２（ｂｒ　ｍ、ｉＨ，ＮＨ）、７ ．４７＜ｍ、４Ｈ）　。
７．６１　（ｍ、２Ｈ）、７．９５（ｍ、４Ｈ）。
実ｍ例２：８．１０−ビス（２−ベンゾイルチオアセトアミ）パ）−１−ブロモ ・〜５．６−ジアザ−２，７−シオキンデカン（化合物Ｉ　とアンチミオｐ　Ｈ ７，０の０．１０Ｍトリス緩衝液中のアンチミオシンＦ（ａｂ”）２（セ／トコ −５口、ト番号０１０５７．０．４０ｍＴ、、１０ｍｇ／ｍＬ）ＹｐＨ７，０の ｏ、ｔｏＭリン酸中の９、２６ｍｇ／ｍＬ　　ジチオスレイトール（ＤＴＴ）８ ０ｕＬに加えた。混合液を穏やかに混ぜ、室温で１時間放置した。Ｆａｂ’Ｙ、 セフアゾ、クスＧ−２５（中粒）りＯ’？トゲラフ４−（ＩＸ１８ｃＩｎ）で１ ｍＭＩシＤＴＡ　’に含むｐ　Ｈ７，０の０゜１０Ｍリン酸で溶出して精製した 。画分（１，０ｍＬ）を集め、蛋白質濃度をＥｏ・１％；１．４により分析した 。各画分のアリコツト（，１００ｕＬ）ＹとってｐＨ８，０の０．１０Ｍリン酸 で１．０ｍＬ　に希釈した。これらの希釈液にｐＨ８，０の０．１０ＭＩＪン酸 中の５ｍｇ／ｒｎＬ５　、５°−ジチオビス（２−−４１：’安息香酸）（ＤＴ ＮＢ、ｘ＃？７試薬）５０　ｕＬを加えた。ＤＴＮＢ＠液？混ぜ、１５分後にＡ ４】２を測定した。スルフヒドリルの当量は、４１２ｎｍ　　でのモル吸光係数 １５．８００と蛋白質の分子量５０．０００から求めた。実測値：画分５．０． ５７　ｍｇ／ｍｌ−、２，２スルフヒドリル１モル；画分６．１．５６ｍｙ／ｍ Ｌ、２．７スルフヒト９リル１モル；画分７．１．３７ｍｇ／社、２．８スルフ ヒドリル１モル。画分５−７ン合わせ一’Ｃ，ＤＭＦ中の２．４ｍｇ／ｍＬの化 合物ＩＯ，３５ｍＬで処理した。この溶液は蛋白質上のスルフヒドリル５、Ｉ　 Ｘ　１０−５Ｍ、化合物Ｉ　５．ＯＸ　１０−４ＭかつＤＭＦ１５％ｖ／ｖであ ツタ。濁った溶液を穏やかに混ぜ、室温で１時間放置した。反応液はセン）　Ｉ Ｊコ／（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）　濾過装置（分子量１０．０００力、トオフ）で ７５分間５０００ｒｐｌにより濃縮し、０．８ｍＬの溶液を得た。これを、セフ ァデックスＧ−２５（中粒）りＯ？トグラフィ（ＩＸ１４ｃｍ）　　で１　ｍＭ ＥＤＴＡ　’（含むｐ　Ｈ６，５の０．１０Ｍリン酸で溶出し℃精製した。画分 （１，０ｍＬ）を集め、Ａ２８０で蛋白質濃度乞分析した。発色団が蛋白質に加 えられ℃いるので、Ａ２８０の値は単に定性的な情報を与えたにすぎない。各画 分のアリコツト（１００ｕＬ）ＹｐＨ８，０の０．１０Ｍリン酸で１．０ｍＬに 希釈し１上記のようにＤＴＮＢで処理した。Ａ４□２が０．００５以上の画分け なかった。画分６はＡ２８ｏ＝１．９６だった。
化合物Ｉ−アンチミオシン結合体の画分６　（０，５０ｍＬ　）に対＋、、ｐＨ ７，５の０．５ＭＨＥＰＥＳＣ５０％ＮａＯＨで調整するン中の１．０ＭＮＩ（ ２α（ＨＣＩ　　０．５０ｍＬを加えた。溶液を穏やかに混ぜ、室温に５分間放 置した。この溶液をセファデックスＧ−２５Ｃ中粒）クロマトグラフ４−　（Ｉ 　Ｘ　１４ｃＩｒＬ）で１ｍＭ　ＥＤＴＡ、’ｒ：含むｐ　Ｈ６，５σＪ０．１ ０Ｍ’Ｊン酸で溶出して精製した。画分（１，０ｍＬ　）　ｌ：集め、蛋白質濃 度をＥｏ・１％＝１，４により分析した。各面分のアリコツ）（１００ｕＬ）￥ ｐＨ８，０の０．１０Ｍ！ｊン酸で１．０　ｍＬに希釈し℃上記のようにＤＴＮ Ｂで処理した。実測値：画分５．０．１７１／′ｍｌ７．２．５スノげヒドリル １モル；画分６．０．２８　ｍ９／′ｍＬ　、　　２．４スルフヒドリル１モル 。
実施例６：化合物Ｉで修飾したアンチミオシンのテクネチウム標識Ｍｏ−９９／ 　Ｔｃ−９９ｍ　　発生器からの（Ｔｃ−９９ｍ：ｌパーテクネテートナトリウ ム溶液を生理食塩水で４．０ｍＣ１／ｍＬに希釈した。この溶液０．５ｍＬに対 し、０．２　ＮＮａＨＣＯ３中の２６　ｍｇ／ｍＬ　Ｄ−グルカン酸−カリウム 塩０．５ｍＬＹ加え、つぎに０．２Ｎ酢酸中の５　ｍｇ／／ｍＬＳｎＣｌ　２２ ０　ｕＬを加えた。溶液を混ぜ、室温に５分間放置した。脱保護化されたアンチ ミオシン−化合物Ｉ結合体（上記の画分６．０．０２８ｙｎｙ蛋白質）のアリコ ツト（１００ｕＬ）に（Ｔｃ−９９ｍ：ｌテクネチウム−グルカン酸浴液１００ 　ｕＬ　を加えた。これを穏やかに混ぜ℃室温に１時間放置した。
アセトニトリル／水６０／４０で溶出したワ、トマン３ＭＭＰ紙クロマトグラフ ィーでは原点に単一のピークが示された。生理食塩水中のＩ　ＴＬＣ（Ｇｅ　１ ｍａｎ　）ではプレートの下半分に放射活性の９８％が示され；生理食塩水中の ＩＬＴＣではＴｃ−グルカン酸は上半分に９９％が示された。ＨＰＬＣではＲｔ 　９．９６ＣＦ（ａｂ’）２：］にＺ３％の、Ｒｔ　１１．０５（Ｆ（ａｂｏ） ）に９１．６％の放射活性が示された。アフィニティークロマトグラフィーカラ ムのために標識蛋白質４．５ｕＬＹリン酸緩衝溶液／牛血清アルブミ７（ＰＢＳ ／ＢＳＡ）で１．０　ｍＬに希釈して、１００ｕＬ　をカラムにのせた。１０１ ０Ｘ１のＰＢＳ／ＢＳＡで溶出させた放射活性乞集めガンマカウンターで測定し た（非結合画分）。つぎにｐＨ２，５の０．１Ｍグリシン１０×ｉｍＬで溶出さ せこの画分を測定した（結合画分）。笑測値：非結合１７，７２５ｃ■弓結合９ ６３．５９４ｃｐｍ；　９８．２％免疫反応性。
実施例４：放射性標識された抗ミオシンー化合物■結合体の生体分布と安定性放 射性標識さｎた抗ミオシンＦａｂ’の生体分布はマウスにおい℃決定された。
この標識されたタンパク質溶液の既知少量Ｙ　１　ｍＣｉ　／ｍｔに希釈し、０ ．２μｍのメンブレン・フィルター馨通した後ｏ、ｉｏｍｇｖそれぞれのマウス に注射し一様々な時点でマウス（ｎ＝３）’、ｒ殺し、臓器をカウントした。そ のデータは表１に示されている。
この標識された夕／バクの既知少量を等量の新鮮ヒト血清と混和し、３７℃でイ ンキュベートした。様々な時点で一部を採り、ゲルフィルトレージｓ　７　ＨＰ ＬＣで分析した。その結果は表６に示され１いる。
血液　　　８．０　　１．６　　０．５心臓　　　２．５　　０．７　　０．２ 肺　　　　　　　　　３．９　　　　　　０．９　　　　　　０．４肝朦　　　 ３．８’　　　２．２　　１．２腎臓　　６９．４　　４２．５　　２３．２チ オール酢酸（ｔｈｉｏｌａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ）（７，２１Ｌｅ、０．１ｍｏ ｌ）とに２ＣＯ３（４１ｇ。
０．３ｍｏｊ）のアセトン（３５（ｌｌ＋＋Ａ’）混合液にブ０モ酢酸（１３， ８Ｆ　、　０．１　ｍｏｌ　）　’に加えた。この混合液は室温で２日間攪拌さ れた。溶媒χ減圧下でとり除き、残渣を水（１００［）の中にとり、濃Ｈ（Ｊ　 　で酸性化した。この混合液を酢酸エチルで３回抽出し、葡機抽出液を集めて塩 水（ｂｒｉｎｅ）で洗い、乾燥させた（Ｎａ２ＳＯ４）。
減圧下で溶媒？除去するとオイルが生じ、こｎ５クーゲルロール蒸留することに よりて目的の酸が生成された。（９，２Ｌ６９％）　　５ｓ＋ｍＨｇでの沸点は １１０−１３０℃であり、ＮＭＲは（ＣＤＣｌ２）δ２．４１（３Ｈ，ｓ）、３ ．７５（２Ｈ，ｓ）でありた。
ト”（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）（８，６ｇ、　０．０７５ ｍｏｌ　）の酢酸エチル溶液（２５０ｍｔ）Ｋジシクロへキシルカルボジイミド ”（ｄｉｃｙｃｌｏ　ｈｅｘｙｌｃａｒｂｏ　−ｄｉｉｍｉｄｅ）（１５，７ｇ 、　０．０７６ｍｏｌ）の酢酸エチル溶液（５０Ｍ）’ａ−滴下した。
室温で１．５時間攪拌した後、この混合液を４℃で一晩静置した。沈澱した尿素 乞フィルターに通して除去し、そのｆ′液を減圧下で濃縮した。粗生放物乞酢酸 エチルで再紹晶し、サクシンイミジルエステル（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　　 ｅｓｔｅｒ）乞得ｔら（９，４Ｌ６０％）　　ｍｐ：９３−９５°、ＮＭＲは（ ＣＤ０ｇ３）δ２．４２（３Ｈ，ｓ）。
２．８３（４Ｈ，ｓ）、３．９８（２Ｈ，ｓ）であツタ。
ｃ）１−（４−ニトロフェニルメチル）−１，２−ビス（２−アセチルチオアセ トアセトアミビ）エタン（１−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ）　 −１ｔ２−ｂｉｓ（２−ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｍｉｄｏ）ｅｔｈａｎ ｅ）の調製１−ｐ−ニドｏべ／ジルエチレンジアミン塩酸塩（１−ｐ−ｎｊｔｒ ｏｂｅｎｚｙｌ　−ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ　ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏ ｒｉｄｅ）　　（ガンソウ（Ｇａｎｓｏｗ）、　ＯらＩｎｏｒｇ、Ｃｈｅｍ、２ ５．２７７２（１９８６））（２，７ｇ、０．０１ｍｏｌ）とトリエチルアミン （ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）（２，２９，０，０２２ｍｏｌ）　のジメトキ シエタン（ｄｉ−ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈａｎｅ）混合液（５０［）に上記のサク シンイミジＡ／　工、Ｘチル（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　　ｅｓｔｅｒ）（５ ，１ｇ、０．０２２１ｕ）　Ｙ加えた。−晩攪拌した後、この混合液乞水中（１ ５０ｍ／）にそそぎ、２０分攪拌後生成物をフィルタレ−ジョンによっ℃集め、 メタノールから再結晶し℃生成物乞得た（３．ＩＬ７３％）。
ｍｐ　１６９−１７１°、ＮＭＲは（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ２．２８　（３Ｈ，Ｓ 　）　、　２．３１　（３Ｈ−。
ｓ）、２．７７（２Ｈ，ｍ）、３．１１（２Ｈ，ｍ）、３．４６（２Ｈ，ｓ）、 ３．５７（２Ｈ，ｓ）。
３．９８（ＩＨ，ｍ）、７．４１　（２Ｈ，ｄ）、７．９８（１Ｈ，ｄ）、８． １０（２Ｈ，ｄ）、８．１３（ＩＨ，ｔ）であった。
ｄ）１−（４−アミノフェニルメチル）−１，２−ビス（２−アセチルチオアセ トアミビ）エタ７　（１−（４−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ）　−１ 、２−ｂｉｓ（２−ａｃｅｔｙｌ　ｔｈｉｏａｃｅｔａｍｉｄｏ）ｅｔｈａｎｅ ）　　の訓製上Ｌ”’Ｃ：’Ｕ＠Ｈ３ｒｕｓ　ｐ　−＝　）　ｏベンゼｙ　（ｐ −ｎ１ｔｒｏｂｅｎｚｙｌ）化合物（１，５６ｇ。
３．６　ｒｒｒｎｏ　ｌ　ｅ　ｓ　）をメタノール（１５０α）中で、暖めなが ら溶解した。冷却した溶液を硫化Ｐｄ／Ｃ−５％（５０％含湿）（イ／グＬ／／ −−ト（Ｅｎｇｌｅｈａｒｔ）０．７０ｇ）で処理し、パーの装置に”（５Ｑｐ ｓｉのＮ２で水素化した。４時間後反応はＴＬＣ（Ｓｉ０２．１０％　Ｇ（３０ Ｈ／ＣＨ（Ｊ３）Ｋ！ッｉ完了サすなかった。追加の触媒（０，３ｇ）を加え、 水酸化を更に２匙　時間続けたところ反応開始時の原料はすべ℃消費された。こ の混合液をＮ２下で一晩保存した。セライトｃｅｌ　ｉｔｅ　　にょる濾過で触 媒乞除去し、溶媒を減圧によっ℃除いた。得らｎた油状物質はフラ、シュクロマ トクラフィニカげらｎり（Ｓ　ｉ０２　、　ＣＨＣｌ１３−３％ＣＨ３０Ｈ／Ｃ Ｉ（Ｃｇ　３　クラジエント）。純粋な生成物乞含むフラクシ、ン？合わせ又蒸 発させ、油状物とし℃アニリン乞得た（　０．７７．９　、５３％）。ＮＭＲは （ＣＤ（Ｊ！３）δ２．５１（３Ｈ，ｓ）。
２．５５（３Ｈ，ｓ）、２．８１　（２Ｈ，ｍ）、５．４２（２Ｈ，ｍ）、３． ６３（２Ｈ，ｄ）、３．６７（２Ｈ，ｓ）、３．８５（２Ｈ，ｓ）、４．２４（ ＩＨ，ｍ）、６．６７（ＩＨ，ｄ）、６．７５（２Ｈ。
ｄ）、６．８２（１Ｈ，ｔ）、７．０８（２Ｈ，ｄン　であった。
上記において調製されたアニリンの（０，２，９、０，５ｒｒｍｏ　Ｉｅ）　Ｃ Ｈ（Ｊ３溶液（２＋１１？）。
ＮａＨＣＯ３（０，１７＆　、　２ｒｒｒｎｏｌｅ）の水溶液（４ｎｅ）、ブロ モアセチルブロマイド（０，２，９，１ｒｒｍｏｌｅ）のＣＨＣｅ　３溶液（２ 眠）を調製し、水浴で冷却した。酸臭化物ｔＮａＨＣＯ３溶液に加え、その後ア ニリンを滴下して加えた。３０分後この混合液を水で希釈し、ａ（Ｃ４３と有機 層に分けて水と塩水（ｂｒｉｎｅ）で洗浄し、乾燥した（ト）ａｓＯ４）。減圧 下で溶媒を除去しガラス状物とし℃のブロモアセチル誘導体■を得た（０．１７ Ｌ６５％）。ＮＭＲは（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ２．４６（３Ｈ，ｓ）、２．４８（ ３Ｈ，ｓ）、２．７３（２Ｈ，ｍ）、３．２２（２Ｈ，ｍ）、３．６２（２Ｈ， ｓ）、３゜７０（２Ｈ。
ｓ）、４．０４（ＩＨ，ｍ）、４．１４（２Ｈ，Ｓ）、７．２４（２Ｈ，ｄ）、 ７．５８（２Ｈ，ｄ）。
８．０５（ＩＨ，ｄ）、８．２３（ｔＨ，ｔ）、１０．３２（１Ｈ，ｓ）であっ た。
実施例６：■と抗ミオシンＦａｂ’との結合抗ミオシｙＦａｂ’（０，９５０ｍ ｔ、　２．２ｍｇ／ｍ？；　ｘルーｒ７　（Ｅｌ　１ｍａｎ）のアッセイではＦ ａｂ’　１つにつき２．７のチオール基）をｐ−ブロモアセトアミド（ｐ−ｂｒ ｏｍｏ−ａｃｅｔａｍｉｄｏ）リガンド１１（５，７Ｘ１０”−、！９　の４０ ｕｌｌ　ＤＭＦ溶液？４．３μｅ）で処理した。１時間後このタンパクはセフア ゾ、クス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ−２５クロマトグラフ４（ＩＸｌｏｃｍ）　 　におい１５０ｍＭリン酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７， ５バ、ファーで精製され、１ｎｅのフラノン、／が集められた。リガンドの芳香 族核の存在が２８０　ｎｍ　での吸光乞妨げるので、正確なタンパク濃度を測定 することはできなかった。エルマンのアッセイではチオール基は検出されなかっ た。
抗ミオシンー化合物■結合体（約１．９ｍｇ／ｒｎｅ）のサンプル０．５μをヒ ドロオキシルアミン塩化水素（ｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ　ｈｙｄｒｏ　ｃｈ ｌｏｒｉｌｅ）　（０，５ＭＨＥＰＥＳ。
ｐ　Ｈ７，５中で１Ｍ１．５ｍｌで処理した。５分後この溶液はセフアゾ、クス Ｇ−２５りＯ？トゲラフ４　（Ｉ　Ｘｉ　Ｏｃｍ）に１５０ｍＭリン酸、１ｍＭ 　ＥＤＴＡ、ｐＨ６５バツフアーを用い℃精Ｍ！され、１ｒｎｔのフラクション が集められた。エルマ／のア、セイによっ℃フラクション５　（０，６ｍｇｌｍ ｔ）がＦａｂ’あたり２．３個のチオール基放射むことが判明した。
実施例７：抗ミオシンー化合物■結合体のテクネチウム−９９ｍ標識（Ｔｃ−９ ９ｍ）バーテクネチウム酸（ｐｅｒｔｅｃｈｎｅｔａｔｅ）溶液（Ｑ、５ｒｎｅ 　、　２　ｍＣｉ　）をカリウムグル力Ｖ−）　（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　ｇｌｕ ｃａｒａｔｅ）（０，２ＭＮａＨＣＯ３１ｍ中に２６ｍｆ／　Ｙｏ、５ｒｒｔｌ ）で、更にそれに続いて４ＣＪａｌＪの５ｎ（Ｊ２（０，ＩＭ　酢酸３、５　ｍ ｅ中に８．８ｍｇ）で処理した。５分後、結果とし℃得られた（Ｔｃ−９９ｍ） Ｔｃ−グルコレート溶液０．５　ｍｅ　ｗ上記の脱保護した抗ミオシンー化合物 ■結合体（０，５ｒｎｌ）　　と混和した。この結果得た溶液は０．２５　ｍｇ ／ｒｎｔのタンパク質を含み、ｉ　ｍＣｉ廓（４ｍＣ１／ｒｒｇ　）であった。
６０分後のペーパークロマトグラフィー（６０／４０　、　ＣＨ３ｃＮ／Ｈ２０ ）　　は放射性物質の９７％はタンパク質に結合していることを示した。このこ とはＨＰＬＣで確認された。
上記溶液の一部（０，８ｍ１）？：塩水（ｓａｌ　１ｎｅ）で４ｎｅに希釈し、 ０．２２μｍのフィルターに通した。これはネズミ（ｍｏｕｓｅ）の生体分布に 用いられた。ネズミ当りの投与量は０．１α（ネズミ当り５μｙ、２０ｍｃｉ） であった。結果は表２に示され又いる。
０．２２μｍフィルターを通したヒト血清（５０μｅ）ヲ上記のように調製した Ｔｃ−９９ｍ抗体結合体（５０μｅ）で処理し、血清の安定性を決定した。対照 は塩水（５０μｅ）と標識され１こ抗体（５０μｅ）から調製した。サンプルヲ ３７°でインキニベートし、１時間後と２４時間後にＨＰＬＣによる分析を行っ た。結果は表４に示されている。
血液　　１８．９（３，５）　　６．７（，０，９）　　０．８（０，１）心臓 　　　３．７（０，６）　　１．７（０，２）　　０．４（０，１）肺　　　　 　　　　　５．８（１，０）　　　　２．９（０，６）　　　　０．６（０，２ ）肝臓　　　７．４（１，４）　　５．６（０，９）　　２．６（０，３）肺臓 　　　２．９（０，４）　　１．７（０，２）　　０．９（０，３）腎臓　　３ １．０（４，４）　　２７．０（４，７）　　１１．３（１，５）胃　　　　　 　　　　　　　１．２（０，２）　　　　　１．２（０，２）　　　　　０．り （０，１）Ｇ、１．　　　　　　２．１（０，４）　　　　３．０（０，５）　 　　　０．５（０，１）筋肉　　　０．７（０，３）　　０．４（０，１）　　 ０．２（０，１）血液　　３７２（７，１）　　１２．８（１，４）　　１．４ （０，１）心臓　　　０．５（Ｏｊ）　　０．２（０，０）　　０．１（０，０ ２）肺　　　　　　　　　１．２（０，３）　　　　０．５（０，Ｔ）　　　　 ０ｊ（０，０）肝臓　　＋０．８（０，９）　　７１（０，６）　　４．０（０ ，３）肺臓　　　０．３（０，１）　　０．１（０，０４）　　０．４（０，０ ）腎臓　　ｕ、９（１，４）　　１０．５（１，７）　　４．１（０，４）胃　 　　　　　　　　　　　０．３（０，１）　　　　　０．３（０，１）　　　　 　０．１（０，０）Ｇ、１．　　　　　　６．６（０，６）　　　　８．０（１ ，１）　　　　１．５（０，３）筋肉　　　８．９（４，１）　　５．３（０， ６）　　２．５（０，５）標準偏差を力、コ内に示し１こ。
表　　　６ テクネチウムー９９ｍ標識されたＦａｂ’断片の３７°における血清安定住１　 時間　　　　　　　　　　７２．３　　　　　　　　　　　　９３２４時間　　 　　　　　　　５４．９　　　　　　　　　　　　７５実施例８： ａ）　　５−アザ−１，３−ビス（２−ベンゾイルチオアセトアミド）−１０− （１−ブチルオキシカルボニルアミノ　−６−カルボキシ−４−オキソデカ７　 ５−ａｚａ−１，３−ｂｉｓ（２−ｂｅｎｚｏｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｍｉｄｏ ）−１０−（ｔ−＋ｕｂｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌａｍｉｎｏ）−６−ｃａｒ ｂｏｘｙ−４−ｏｘｏｄｅｃａｎｅ）　（化合物１１１）７Ｊ調裂スクシンイミ ジル２．４−ビス（２−ベンゾイルチオアセトアミＩ−”　）ベンゾエート（ｓ ｕｅｃｉｎｉｍｉｄｙ１２．４−ｂｉｓ（２−ｂｅｎｚｏｙｌｔｒｉｉｏａｃｅ ｔａｍｉｄｏ）ｂｅｎｚｏａｔｅ）　（３，６５９、６，３５ｒｒｍｏｌｅ）を ＴＨＦ　２９ｒｎｉに懸濁した。ここに水２５ｍｇ、　ＮａＨＣＯ３乞１６０＆ 　（１９，０５ｒｒｍｏｌｅ　、　３００ｍｏ１％）、Ｎ’−ｔＢＯｃ−Ｌ−リ ジン１５６９（６，３３ｒｒｍｏｌｅ、１００ｍｏ１％）を加えた。この不均質 な混合液？６時間室温で攪拌した。反応液をＥｔＯＡｃ（２Ｘ　７５ｍ１）　　 で抽出し、抽出液は捨てられた。水層乞０°まで冷却し、ｐＨを２Ｎ　ＨＣＩＩ で６．０に調節した。この酸性化された溶液？Ｅ＋ＯＡｃ　（２Ｘ　１００ｍＩ Ｖ）で抽出し、抽出液ｆ　Ｎａ　２　Ｓｏ　４　で乾燥させた。ｒ過と溶媒の除 去とにより黄色油状物乞得た。これをシリカゲル１ｏｏｇのクロマトグラフィに おいてクロロホルム／２−プロパツール１９：１で溶出し、精ｉｖ行ツタ。１． ０ｇ、１．４２ｍｍｏｌｅ、２２％。ＮＭＲは（Ｍｅ　ＯＨ−ｄ　４　）δ１． ４２（ｓ）＋１．５０（ｍ）（１５８，１３のはずである）　、　１．９９　（ ｍ、　４Ｈ）　、　３．８０　（ｓ　。
２Ｈ）、３．９０（、ｓ）、４．４０−４．６０（３つの分離したｍ、総計２Ｈ ）、７．５０（ｍ。
２Ｈ）、７．６５（ｍ、２Ｈ）、７．８５（ｍ、２Ｈ）、７．９７（ｍ、４Ｈ） であツタ。２Ｈは溶媒の信号によって不明瞭であった。
ｂ）　　５−アザ−１，３−ビス（２−ベンゾイルチオアセトアミ）’）−６− カル上記で調製したリジン誘導体（０，５４Ｌ０．７７ｍｍｏｌｅ）ｙトリフル オロ酢酸ＩＱｍｅで１時間処理し、このトリフルオロ酢酸乞真空で除いた。
ｃ）ｉ、３−ビス（２−ベンゾイルチオアセトアミ＋−’）１３−ブロモ−５゜ １１−ジアザ−４，１２−ジオキソ−６−カルボキシトリデカン（１、３−ｂｉ ｓ　（２−ｂｅｎｚｏｙｌ　ｔｈｉｏａｃｅｔａｍｉｄｏ）　−１３−ｂｒｏｍ ｏ−５、１１−ｄｉａｚａ−４、１２−ｄｉｏｘｏ−ｔ５−ｃａｒｂｏｘｙｔｒ ｉｄｅｃａｎｅ）の調製上記で調製した粗アミントリフ／Ｉ／オロ酢酸塩（ａｍ ｉｎｅ　　ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ）（０，７７ｍｍｏｌｅ）’２３ ＱｖＶの水に懸濁し、更にジメチルホルムアミド’　（ｄｉｍｅｔｂｙｌｆｏｒ ｍａｍｉｄｅ）　１０ｒｎｔを加えてこのゲル状液のほとんどｔ溶解させた。こ の混合液にＮａＨＣＯ３Ｙ２６ｇ（３，１０ｍｍｏｌｅ、４００ｍｏ１％）とプ ロモアセチルブＯ？イっだ。反応液を室温で１時間、攪拌した。水（６０１Ｍ） を加えｐＨＹ４．０に合わせ１こ。この酸性化された溶液ｙＥｔＯＡｃ（２ｘ７ ５ｍｔ′）で抽出した。抽出液を合わせて’＋　ＭＮａＨ２ＰＯ４（４ｘ　５０ ｍ→で洗い、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。ろ過と、回転式エバポレーターによる 溶媒の除去により黄色のオイル乞得た。こσ〕オイルを１６Ｆｆ？８Ｆ間真仝下 において乾燥させ、０．２０！ｊを得た（理論値σつ６６％）。
１＋＋ｗ＋ｍ＋＋＋ｗ＋＾―−ｋｗｍａＭｐ（τ／ＵＳ８９１０２６３４国際調 査報告

Claims (35)

    【特許請求の範囲】
  1. １．チオール基含有のタンパク質またはペブチドと金属性放射性核種を結合する ための二官能性カップリング剤であって、チオール基の選択的求電子試薬、少な くとも１つの保護されたチオールを含むキレート化剤、及び前記求電子試薬と前 記キレート化剤とを結合する役目の有機結合基から成るカップリンク剤。
  2. ２．請求項１で述べられた二官能性カップリング剤で、チオール基選択性求電子 試薬、ハロアルキル、サルホン酸エステル、マレインイミドアジリジンから成る 群から選択される、カップリング剤。
  3. ３．請求項２で述べられている二官能性カップリング剤で、チオール基選択性求 電子試薬がＢｒＣＨ２ＣＯＮＨ−，ＣｌＨ２ＣＯＮＨ−，ＩＣＨ２ＣＯＮＨ．Ｎ −置換マレインイミドからなる群から選択される、カップリング剤。
  4. ４．請求項１で述べられている二官能性カップリング剤で、有機結合基が直鎖状 または枝分かれしたアルキル、官能基基で置換されたアルキル、アリール及び置 換アリール、ヘテロ芳香族及び置換ヘテロ芳香族、炭素が異種の原子で置換され ていても良い線状または枝分かれしたアルキルからなる群から選択される、カッ プリング剤。
  5. ５．請求項４で述べられている二官能性カップリング剤で、有機結合基が−ＣＯ ＮＨＣＨ２ＣＨ２−，ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯ２Ｈ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−， −ＣＨ２Ｃ６Ｈ４，またはＮＨＣＨ２ＣＨ２−である、カップリング剤。
  6. ６．請求項１で述べた二官能性カップリング剤で、キレート剤成分を▲数式、化 学式、表等があります▼または▲数式、化学式、表等があります▼から成る群か ら選択するカップリング剤。ただしここでａは１から５を含む整数である；ｂは １から３を含む整数である；Ｒは水素、メチル、低アルキル、水酸化アルキル、 置換アルキル、アリール、又は置換フリールであり；Ｒ１は独立に水素、メチル 、低アルキル、水酸化アルキル、置換されたアルキル、アリールまたは置換アリ ールである。
  7. ７．請求項６で述べられた二官能性カップリング剤で、ａが３、ｂが１、Ｒがメ チルまたはフェニル、Ｒ１が水素であるもの。
  8. ８．公式が▲数式、化学式、表等があります▼である二官能性カップリング剤で 、ｃとｆが独立して１，２，または３である；ｄとｅが独立して１から５を含む 整数であり；ＸがＣｌ，Ｂｒ，またはＩ；Ｒ２が水素、メチル、カルボキシル、 官能基で置換されたアルキル、アルキル、水酸化アルキル、カルボキシアルキル 、アリール及び置換アリール、又は置換アルキルであり；Ｒ３が−ＣＯＲ４また は−ＳＲ４であり、Ｒ４は水素、メチル、アルキル、水酸化アルキル、カルボキ シアルキル、アリール、カルボキシアリール、置換されたアリール、官能基で置 換されたアルキル、または置換アルキルであるもの。
  9. ９．請求項８の二官能性カップリング剤で、式が▲数式、化学式、表等がありま す▼化合物Ｉであるもの。
  10. １０．請求項８の二官能性カップリング剤で、式が▲数式、化学式、表等があり ます▼化合物ＩＩＩであるもの。
  11. １１． ▲数式、化学式、表等があります▼ の式で表わされる二官能性カップリング剤で、ｃとｆが独立して１，２または３ であり；ｄが独立して１から５を含む整数であり；ＸがＣｌ，Ｂｒ，またはＩで ；Ｒ３が−ＣＯＲ４または−ＳＲ４でＲ４がハロゲン、メチル、アルキル、水酸 化アルキル、カルボキシアルキル、アリール、カルボキシアリール、置換された アリール、置換されたアルキルまたは官能基で置換されたアルキルであるもの。
  12. １２．式 ▲数式、化学式、表等があります▼化合物ＩＩで表わされる請求項１１の二官能 性カップリング剤。
  13. １３．▲数式、化学式、表等があります▼の式を持つ二官能性カップリング剤で 、ｃが独立して１，２または３であり；ｄが独立して１から５の整数であり；Ｒ ３が−ＣＯＲ４または−ＳＲ４で、Ｒ４は水素、メチル、アルキル、水酸化アル キル、カルボキシアルキル、アリール、カルボキシアリール、置換されたアリー ル、または置換されたアルキルであり；それぞれＲ５は独立して水素、メチル、 アルキル、水酸化アルキル、カルボキシアルキル、アリール、カルボキシアリー ル、置換されたアリール、置換されたアルキルまたは官能基で置換されたアルキ ルで、Ｒ６はアルキル、置換されたアルキル、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｇ−ＣＨ２ ＣＨ２−（ｇがＯから５を含む整数である）、アリール、または置換されたアリ ールであり；ＺがＣｌＣＨ２ＣＯＮＨ−，ＢｒＣＨ２ＣＯＮＨ，ＩＣＨ２ＣＯＮ Ｈ−または ▲数式、化学式、表等があります▼ であるもの。
  14. １４．抗体または抗体断片を含む放射性診断用前駆体と、抗体または抗体断片の チォール基（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ　ｇｒｏｕｐ）に結合している請求項１の二 官能性カップリング剤。
  15. １５．抗体または抗体断片を含む放射性診断用前駆体と、抗体または抗体断片の チオール基に結合している請求項３の二官能性カップリング剤。
  16. １６．抗体または抗体断片を含む放射性診断用前駆体と、抗体または抗体断片の チオール基に結合している請求項５の二官能性カップリング剤。
  17. １７．抗体または抗体断片を含む放射性診断用前駆体と、抗体または抗体断片の チオール基に結合している請求項６の二官能性カップリング剤。
  18. １８．抗体または抗体断片を含む放射性診断用前駆体と、抗体または抗体断片の チォール基に結合している請求項８の二官能性カップリング剤。
  19. １９．抗体または抗体断片を含む放射性診断用前駆体と、抗体または抗体断片の チオール基に結合している請求項１１の二官能性カップリング剤。
  20. ２０．抗体または抗体断片を含む放射性診断用前駆体と、抗体または抗体断片の チオール基に結合している請求項１３の二官能性カップリング剤。
  21. ２１．放射性診断用前駆体で、請求項１４の放射性診断用前駆体からのチオール 保護グルーブの脱離によってチオール基を生成させて調製したもの。
  22. ２２．放射性診断用前駆体で、請求項１５の放射性診断用前駆体からのチオール 保護グルーブ脱離によってチオール基を生成させて調製したもの。
  23. ２３．放射性診断用前駆体で、請求項１６の放射性診断用前駆体からのチオール 保護グルーブ脱離によってチオール基を生成させて調製したもの。
  24. ２４．放射性診断用前駆体で、請求項１７の放射性診断用前駆体からのチオール 保護グルーブ脱離によってチオール基を生成させて調製したもの。
  25. ２５．放射性診断用前駆体で、請求項１８の放射性診断用前駆体からのチオール 保護グルーブ脱離によってチオール基を生成させて調製したもの。
  26. ２６．放射性診断用前駆体で、請求項１９の放射性診断用前駆体からのチオール 保護グルーブ脱離によってチオール基を生成させて調製したもの。
  27. ２７．放射性診断用前駆体で、請求項２０の放射性診断用前駆体からのチオール 保護グループ脱離によってチオール基を生成させて調製したもの。
  28. ２８．請求項２１の放射性診断用前駆体を含む放射性診断剤とその前駆体のチオ ールに結合する金属性放射性核種。
  29. ２９．請求項２２の放射性診断用前駆体を含む放射性診断剤とその前駆体のチオ ールに結合する金属性放射性核種。
  30. ３０．請求項２３の放射性診断用前駆体を含む放射性診断剤とその前駆体のチオ ールに結合する金属性放射性核種。
  31. ３１．請求項２４の放射性診断用前駆体を含む放射性診断剤とその前駆体のチオ ールに結合する金属性放射性核種。
  32. ３２．請求項２５の放射性診断用前駆体を含む放射性診断剤とその前駆体のチオ ールに結合する金属性放射性核種。
  33. ３３．請求項２６の放射性診断用前駆体を含む放射性診断剤とその前駆体のチオ ールに結合する金属性放射性核種。
  34. ３４．請求項２７の放射性診断用前駆体を含む放射性診断剤とその前駆体のチオ ールに結合する金属性放射性核種。
  35. ３５．少なくとも１つのチオール基を持つタンパク質またはペブチドを放射性標 識する方法で、以下の工程： ａ）請求項１の二官能性カップリング剤を供給する；ｂ）二官能性カップリング 剤をタンパク質またはペブチドに作用させ放射性診断用前駆体を形成させる； ｃ）放射性診断用前駆体からチオール保護基を脱離させる；及びｄ）結果として 得られた放射性診断用前駆体に放射性金属を作用させる；から成る方法。
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