KR20090054438A

KR20090054438A - 양전하를 띄는 부분을 포함하는 고분자 컨쥬게이트

Info

Publication number: KR20090054438A
Application number: KR1020097004922A
Authority: KR
Inventors: 홍 쨔오; 프라산나 레디; 이반 호락; 징 시아
Original assignee: 엔존 파마슈티컬즈, 인코포레이티드
Priority date: 2006-09-15
Filing date: 2007-09-15
Publication date: 2009-05-29
Also published as: AU2007296055A1; EP2076257A2; US20090202573A1; WO2008034123A2; IL197160A0; MX2009002856A; BRPI0716823A2; EP2076257A4; CA2662520A1; JP2010503414A; WO2008034123A3

Abstract

본 발명은 양전하를 띄는 부분을 포함하는 고분자 컨쥬게이트, 이를 이용한 고분자 전달 시스템 및 이를 이용한 포유동물의 치료방법에 관한 것이다.

고분자 컨쥬게이트, 피페라진, PEG, 전달 시스템

Description

양전하를 띄는 부분을 포함하는 고분자 컨쥬게이트{POLYMERIC CONJUGATES CONTAINING POSITIVELY-CHARGED MOIETIES}

관련된 출원에 대한 참조

본 출원은, 각 내용이 참조로 본 발명에 포함되는 2006년 9월 15일 제출된 미국 가출원번호 제 60/844,944호, 2006년 9월 15일 제출된 미국 가출원번호 제 60/844,945호, 2006년 11월 27일 제출된 미국 가출원번호 제 60/861,349호, 2006년 11월 27일 제출된 미국 가출원번호 제 60/861,350호, 2007년 4월 13일 제출된 미국 가출원번호 제 60/911,734호, 및 2007년 8월 20일 제출된 미국 가출원번호 제 60/956,814호에 대한 우선권을 주장한다.

지금까지, 고분자 또는 이를 포함하는 컨쥬게이트(conjugate)는 단백질, 펩 티드 등의 생물학적 활성 부분(biologically active moiety)의 전달에 이용되는 경우, 이들의 양전하를 증가시키는 것이 이점이 있는 것으로 판단되어 왔다. 예를 들어, 일반적으로 지정된 미국 특허번호 제 5,730,990호는 단일 2차 또는 3차 아민기(amine group)가 부착된 PEG 및 이와 관련된 폴리알킬렌 옥시드(polyalkylene oxide)를 기재하고 있다. 상기 조합의 목적은 아민 파생 고분자(amine-derived polymer)가 컨쥬게이트에 pI 또는 pH 조절 효과를 주기 위한 것이었다. 따라서, 상기 컨쥬게이트에 포함된 생물 활성 물질의 등전점이 원하는 점으로 조절될 수 있었다. 상기 미국 특허번호 제 5,730,990호는, 최상의 활성이 종종 손실되는 등의 등전점의 변화가 관찰되는 보편적인 활성된 고분자에서 관찰되는 효과를 억제하는 문제를 제기하였다.

수년 동안, 올리고뉴클레오티드를 기초로 하는 치료학은 잠금 핵산(locked nucleic acid) 구조 골격의 이용과 같은 조합적인 설계의 개선 뿐만 아니라, RNA 간섭 및 microRNA의 발견 및 개발에 의해 예시된 여러 진보적인 이점을 가져왔다. 작은 간섭 RNA(Short interfering RNA; siRNA)는 단지 몇 년 내에 임상 실험에 있어서 치료제를 위한 연구 수단으로 발전하였다. 그러나, 올리고뉴클레오티드를 기초로 하는 치료를 위한 치료 가능성을 완전히 실현하기에는 생체내(in vivo) 전달에서 여전히 많은 장애물이 존재한다. 현재, 직접적인 내부-구분 주사(intra-compartmental injection) 후 주입(infusion)은 여전히 투여의 주요한 루트이다. 결과적으로, 약물 전달 기술의 향상은 치료 목적용으로 이용되는 올리고뉴클레오티드의 분야로 보여진다.

올리고뉴클레오티드의 고도의 음전하를 띄는 골격 때문에, 이들이 세포막을 통과하거나 생물학적 활성을 나타내는 것에 종종 어려움을 가진다. 이런 음전하는 올리고뉴클레오티드가 음전하를 띄는 세포막을 접근하는 것을 저해하여 엔도시토시스(endocytosis)를 감소시킨다. 지금까지, 이런 문제를 다루기 위해서 올리고뉴클레오티드는 양전하를 띄는 펩티드, 양이온 지질 또는 양이온 고분자와 접합 또는 합성되어 왔다. 그 결과는 완전히 일치하지 않았다. 따라서, 추가적인 개발이 요구되었다. 본 발명은 이런 요구 등을 다룬다.

본 발명의 개요

약물 전달에 관한 상기와 같은 문제를 해결하고 그 기술을 향상시키기 위해서, 양전하를 띄는 골격(positively-charged backbone)을 포함하는 신규한 고분자 약물 시스템(polymeric delivery system)을 제공한다.

본 발명의 한 가지 측면에 있어서, 하기 화학식(Ⅰ)의 화합물을 제공한다:

여기서,

각 Z₁은 독립적으로

이다;

각 Z₂는 독립적으로 선택되는 캡핑기(capping group),

,

이다;

R₁은 실질적 비항원성 고분자(non-antigenic polymer)이다;

R₂ 및 R'₂는 독립적으로 선택되는 양전하를 포함하는 펩티드(positive charge-containing peptide) 또는 질소를 포함하는 고리화 탄화수소 부분(nitrogen-containing cyclohydrocarbon moiety)이다;

R₃ 및 R'₃은 독립적으로 선택되는 표적 물질이다;

R₄는 생물학적 활성 부분이다;

B₁, B'₁ 및 B''₁은 독립적으로 선택되는 분지성 기(branching group)이다;

L₁, L'₁, L''₁, L'''₁ 및 L''''₁은 독립적으로 선택되는 이중기능성 링커(Bifunctional linker)이다;

L₂, L'₂ 및 L''₂는 독립적으로 선택되는 해체가능한 링커(releaseable linker)이다;

(a)는 양의 정수이고, 바람직하게 약 1 내지 31이며, 더 바람직하게 약 3 내지 8이며, 가장 바람직하게 1이다;

(b)는 0이거나 양의 정수이고, 바람직하게 약 0 내지 31이며, 더 바람직하게 약 3 내지 7이다;

(c), (c') 및 (c'')는 독립적으로 0 또는 양의 정수이고, 바람직하게 0, 1, 2 또는 3이며, 더 바람직하게 0 또는 1이다;

(d), (d'), (i), (i') 및 (i'')는 독립적으로 0 또는 양의 정수이고, 바람직하게 0, 1, 2 또는 3이며, 더 바람직하게 0 또는 1이다;

(e)는 양의 정수이고, 바람직하게 1, 2 또는 3이며, 더 바람직하게 1 또는 2이다;

(e') 및 (e'')는 독립적으로 0 또는 양의 정수이고, 바람직하게 0, 1, 2 또는 3이며, 더 바람직하게 0, 1 또는 2이다;

(f) 및 (f')는 독립적으로 0 또는 양의 정수이고, 바람직하게 0, 1 또는 2이며, 더 바람직하게 0 또는 1이다;

(g)는 양의 정수이고, 바람직하게 약 1 내지 5이며, 더 바람직하게 1 또는 2이다;

(g')는 0 또는 양의 정수이고, 바람직하게 0 또는 약 1 내지 5의 정수이며, 더 바람직하게 0, 1 또는 2이다;

(h) 및 (h')는 독립적으로 선택되는 양의 정수이고, 바람직하게 약 1 내지 8의 정수이며, 더 바람직하게 1, 2, 3 또는 4이며, 가장 바람직하게 1 또는 2이다;

(b)가 0이 아니고 모든 Z₂가 캡핑기(capping group),

또는 이들의 조합인 경우, (g')는 양의 정수이다.

상기 고분자 화합물의 한가지 바람직한 측면에 있어서, (a)와 (b)의 합은 약 1 내지 32와 같다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 고분자 화합물은 하기에 기재된 바와 같이 4분지(arm), 8분지, 16분지 및 32분지 고분자를 포함한다. 더 바람직하게, 4분지 고분자는 고분자 분지의 각 말단에 분지성 부분을 가질 수 있다. 상기 4분지를 포함하는 고분자 화합물 및 이의 분지성 부분은 8개의 기능성 부위가 양전하를 띄는 부분 또는 생물학적 활성 부분을 포함하는 것을 결정할 수 있다.

또 다른 바람직한 실시예에 있어서, 본 명세서에 기재된 다분지 고분자 화합물은 생물학적 활성 부분에 결합된 하나의 고분자 말단 및 양전하 포함 부분에 결합된 나머지 고분자 말단 각각을 포함한다.

또 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 고분자 화합물은, 예를 들어 양전하를 띄는 펩티드 및 피페라진(piperazine) 기반 부분을 포함한다. 상기 양전하 포함 부분은 실질적으로 비항원성 고분자에게 부가적인 양전하를 제공할 수 있다.

또 다른 실시형태에 있어서, 양전하를 띄는 펩티드는 고분자 화합물이 세포막을 투과하는 것을 도와줄 수 있다. 바람직한 양전하를 띄는 펩티드는, 예를 들어 TAA 등의 세포막 투과성 단백질(cell-membrane penetrating peptide; CPP)이 될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 올리고뉴클레오티드, 잠금 핵산(locked nucleic acid; LNA), 작은 간섭 RNA(short interfering RNA; siRNA), 어댑터(aptamer), 리보자임(ribozyme), DNA 디코이(decoy) 등과 같은 음전하를 띄는 생물학적 활성 분자를 중화시키고 생물학적 활성 부분의 세포질 흡수를 개선시키기 위한 양전하를 띄는 골격(positively-charged backbone)을 포함하는 고분자 컨쥬게이트(polymeric conjugate)를 제공한다.

본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 생물학적 활성 부분은 해체 가능한 링커(releaseable linker)를 통해 본 명세서에 기재된 화합물의 고분자 부분에 접합된다. 상기 해체 가능한 링커는 벤질 제거 기반 링커(benzyl elimination-based linker), 트리알킬 잠금 기반 링커(trialkyl lock-based linker), 바이신 기반 링커(bicine-based linker), 이황화결합(disulfide bond), 하이드라존 포함 링커(hydrazone-containing linker) 및 티오프로피오네이트 포함 링커(thiopropionate-containing linker)가 될 수 있다. 또한, 상기 해체 가능한 링커는 세포내 불안정한 링커(intracellular labile linker), 세포외 링커(extracellular linker) 및 산성 불안정한 링커(acidic labile linker)일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 양전하를 띄는 부분 및 표적 물질은 영구적인 링커 및 해체 가능한 링커를 통해 본 명세서에 기재된 화합물의 고분자 부분에 연결될 수 있다. 바람직하게, 양전하를 띄는 펩티드 및 표적 물질은 영구적인 링커를 통해 연결된다. RGD 펩티드, 폴산(folic acid), 단일 사슬 항체(single chain antibody; SCA) 등과 같은 표적 물질은 본 명세서에 기재된 고분자 화합물이 생체내에서 원하는 조직에 대한 컨쥬게이트를 유도하기 위해 상기 화합물에 접합될 수 있다. 상기 설계는 보다 나은 치료 효능을 위해 생체내에서 올리고뉴클레오티드와 같은 음전하를 띄는 분자의 표적화된 전달에 대한 새로운 접근을 제공하고 이런 분자들의 세포 흡수을 증진시킨다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 양전하를 띄는 펩티드는 NGR, TNFa 및TAT와 같은 표적화되고 영향을 받는 부위에 대해 특이적인 치료 펩티드가 될 수 있다. 당업자는 양전하를 포함하는 다양한 치료 펩티드를 사용할 수 있으며, 표적화 영역에 특이적으로 전달되도록 할 수 있다.

또 다른 실시형태에 있어서, 세포 투과성 펩티드는, 예를 들어 종양 부위에 표적화하는 전달을 위한 TAT, RGD-TAT 및 NGR 등의 다양한 양전하를 띄는 표적화 펩티드들 중 어느 하나로 대체될 수 있다.

양전하를 띄는 골격을 가지는 PEG 링커가 올리고뉴클레오티드와 같은 음전하를 띄는 치료 분자와 결합되는 경우, 상기 올리고뉴클레오티드의 음전하는 중화될 수 있으며, 컨쥬게이트의 순전하는 양성이 될 수 있다. 다분지 PEG가 이용될 때, PEG 컨쥬게이트의 전체 형태는 구형이 될 수 있다. PEG가 수용액에서 고도로 수화되는 특성 때문에, 양전하를 띄는 골격을 가지는 다분지 PEG 컨쥬게이트는 중심에 놓여있는 올리고뉴클레오티드를 가지는 구형의 "작은 나노입자(mini-nanoparticle)"로 나타낸다.

음전하를 띄는 올리고뉴클레오티드를 중화시킬 수 있는 양전하를 띄는 부분은 독성을 감소시킬 수 있고, 이의 세포막 통과를 촉진시켜 올리고뉴클레오티드의 전달을 개선시킬 수 있다. 그 결과로서, 고도로 음전하를 띄는 올리고뉴클레오티드는 독성이 적은 채로 생체내로 전달될 수 있다.

본 발명의 고분자 컨쥬게이트의 한 가지 이점은, 고도로 양전하를 띄는 펩티드 및 TAT 등의 세포 투과성 펩티드를 접합시킴으로써 세포 흡수가 개선되는 것이다. 게다가, 당업자는 표적화 펩티드, 앱타머 및 엽산(folate) 등을 접합시킴으로써 표적화 기능을 달성할 수 있다.

또 다른 이점은, 전구약물(prodrug) 유래 음전하를 띄는 분자의 분비율 또는 분비 부위가 변형될 수 있는 것이다. 본 명세서에 기재된 고분자 화합물에 접합된 약물은 변형된 비율로 분비될 수 있으며, 따라서 당업자가 치료 펩티드 및 올리고뉴클레오티드의 원하는 생물학적 활성을 달성하는 것을 가능하게 한다. 또한, 음전하를 띄는 치료 물질의 분비 부위가, 세포의 다른 부위에서 분비되는 것과 같이 변형될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 고분자 전달 시스템은 충분한 양의 음전하를 띄는 치료 물질을 원하는 마크로피노좀(macropinosome) 또는 엔도좀(endosome)과 같은 표적 부위에서 선택적으로 이용가능하도록 하는 것을 가능하게 한다. 치료 물질의 분지의 시간적 및 공간적인 변형의 단독 또는 조합은 질환의 치료를 위해서 유리할 수 있다.

양전하 골격을 가지는 고분자 화합물은, 완충 조건 하에서 안정적이고 올리고뉴클레오티드 또는 다른 치료 물질이 체내로부터 조기적으로 분비되지 않는다.

본 발명의 추가적인 이점은, 본 명세서에 기재된 컨쥬게이트가 상당히 개선된 세포 흡수를 가능하게 하며, 형질감염제(transfection agent)의 부재시에 암세포에서 특이적으로 mRNA의 발현 감소를 가능하게 한다. 이런 기술은 올리고뉴클레오티드의 생체내 투여로 이용될 수 있다. 예를 들어, 형질감염제 없이 인간 폐암 세포에 의한, 본 명세서에 기재된 안티센스 Bc12 올리고뉴클레오티드, Bcl2 siRNA 또는 항 설비빈(Survivin) LNA를 포함하는 PEG 올리고뉴클레오티드의 세포 흡수는 천연 안티센스 Bc12 올리고뉴클레오티드 또는 Bc12 siRNA의 세포 흡수 보다 높아졌다. 게다가, 본 명세서에 기재된 컨쥬게이트는 형질감염제의 부재시 세포 흡수가 형질감염제의 촉진에 의한 세포 흡수에 비해 더 높아지게 하였다.

또 다른 이점은 하기 기재된 것으로부터 명확해 질 것이다.

본 발명의 목적을 위해, 용어 "잔기(residue)"는 다른 화합물과 치환 반응을 진행된 후 잔존하는 PEG, 올리고뉴클레오티드 등으로 나타내는, 화합물의 부분을 의미하는 것으로 이해될 수 있다.

본 발명의 목적을 위해, 용어 "고분자 잔기(polymeric residue)" 또는 "PEG 잔기"는 다른 화합물과 반응을 진행된 후 잔존하는 고분자 또는 PXG의 일부, 즉 부분을 의미하는 것으로 이해될 수 있다.

본 발명의 목적을 위해, 용어 "알킬(alkyl)"은 측쇄, 분쇄, 치환된, 예를 들어 할로(halo)-, 알콕시(alkoxy)-, 니트로(nitro)-, C_1-12, 바람직하게는 C_1-4 알킬(alkyl), C_3-8 사이클로알킬(cycloalkyl) 또는 치환된 사이클로알킬 등을 포함하는 것으로 이해될 수 있다.

본 발명의 목적을 위해, 용어 "치환된"은 하나 이상의 다른 원자를 가지는 기능기(functional group) 또는 화합물 내에 포함되는 하나 이상의 원자를 부가 또는 치환하는 것을 포함하는 것으로 이해될 수 있다.

본 발명의 목적을 위해, 치환된 알킬은 카르복시알킬(carboxyalkyl), 아미노알킬(aminoalkyl), 디알킬아미노(dialkylamino), 하이드록시알킬(hydroxyalkyl) 및 멀캅토알킬(mercaptoalkyl)을 포함한다; 치환된 알케닐(alkenyl)은 카르복시알케닐(carboxyalkenyl), 아미노알케닐(aminoalkenyl), 디알케닐아미노(dialkenylamino), 하이드록시알케닐(hydroxyalkenyl) 및 멀캅토알케닐(mercaptoalkenyl)을 포함한다; 치환된 알키닐(alkynyl)은 카르복시알키닐(carboxyalkynyl), 아미노알키닐(aminoalkynyl), 디알키닐아미노(dialkynylamino), 하이드록시알키닐(hydroxyalkynyl) 및 멀캅토알키닐(mercaptoalkynyl)을 포함한다; 치환된 사이클로알킬(cycloalkyl)은 4-클로로사이클로헥실(4-chlorocyclohexyl)과 같은 부분을 포함한다; 아릴(aryl)은 나프틸(napthyl)과 같은 부분을 포함한다; 치환된 아릴은 3-브로모 페닐(3-bromo phenyl)과 같은 부분을 포함한다; 아랄킬(aralkyl)은 톨릴(tolyl)과 같은 부분을 포함한다; 헤테로알킬(heteroalkyl)은 에틸티오펜(ethylthiophene)과 같은 부분을 포함한다; 치환된 헤테로알킬은 3-메톡시-티오펜(3-methoxy-thiophene)과 같은 부분을 포함한다; 알콕시는 메톡시(methoxy)와 같은 부분을 포함한다; 및 페녹시(phenoxy)는 3-니트로페녹시(3-nitrophenoxy)와 같은 부분을 포함한다. 할로(Halo)는 플루오로(fluoro), 클로로(chloro), 아이오도(iodo) 및 브로모(bromo)를 포함하는 것으로 이해될 수 있다.

본 발명의 목적을 위해, 용어 "핵산", "뉴클레오티드" 또는 "올리고뉴클레오티드"는, 명세서에 다른 기입이 없으면 단일 가닥 또는 이중 가닥의 디옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA) 및 이들의 화학적 변형을 포함하는 것으로 이해될 수 있다.

본 발명의 목적을 위해, 용어 "양의 정수"는 당업자에 의한 적당한 범위 이내에서 당업자에 의해 이해될 수 있는 정수를 포함하는 것으로 이해될 수 있다.

본 발명의 목적을 위해, 용어 "유효한 양" 및 "충분한 양"은 원하는 효과 또는 치료적 효과가 당업자에 의해 이해될 수 있는 효과에 달성하는 양을 의미하는 것으로 이해될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

A. 개요

본 발명의 일실시형태에 있어서, 하기 화학식(Ⅰ)의 화합물을 제공한다:

여기서,

각 Z₁은 독립적으로

이다;

각 Z₂는 독립적으로 선택되는 캡핑기(capping group),

,

이다;

R₁은 실질적 비항원성 고분자(non-antigenic polymer)이다;

R₃ 및 R'₃은 독립적으로 선택되는 표적 물질이다;

R₄는 생물학적 활성 부분이다;

(b)가 0이 아니고 모든 Z₂가 캡핑기(capping group),

또는 이들의 조합인 경우, (g')는 양의 정수이다.

본 발명의 목적을 위해, 괄호에 인접한 반복되는 단위인 (a) 및 (b)는, U-PEG 또는 (PEG)₂-Lys 유형 PEG들이 본 명세서에 기재된 고분자 화합물의 일부로서 이용될 때를 제외하고는, 괄호에 기재된 기(group)에 결합된 고분자 분지의 총 수를 나타낼 수 있다. (a) 및 (b)의 합은 적용되는 U-PEG가 2개의 고분자 분지가 있음에도 불구하고 U-PEG에 대해 1 또는 3이 될 수 있다. 본 명세서에 기재된 고분자 화합물은 (a)가 1이고 (b)가 0일 때 mPEG를 포함할 수 있다. mPEG의 고분자 말단은 양전하를 띄는 부분 및 생물학적 활성 물질 모두에 연결될 수 있다. bisPEG가 본 명세서에 기재된 고분자 화합물로 적용될 때, (a) 및 (b)의 합은 2이고, (b)가 1일 때 Z₂는 캡핑기(capping group) 또는

이 아니다.

본 발명의 바람직한 일실시형태에 있어서, (a) 및 (b)의 합이 1 내지 32와 같으며, 따라서 고분자 화합물은 바람직하게 1, 2, 3, 4, 8, 16 또는 32개와 같이 32개까지의 고분자 분지를 포함할 수 있다. 이런 실시예에서, 상기 고분자 화합물은 바람직하게 1 내지 8개의 고분자 분지를 포함할 수 있으며, 여기서 (a) 및 (b)의 합은 1 내지 8이 될 수 있다. 더 바람직하게, 고분자 부분은 4개의 고분자 분지를 포함하며, 여기서 (a) 및 (b)의 합은 4이다.

또 다른 바람직한 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 고분자 화합물은 생물학적 활성 부분에 결합되는 하나의 고분자 말단 및 양전하 포함 부분 및 표적 물질에 결합되는 각 나머지 고분자 말단을 포함한다. 또한, 상기 고분자 부분의 고분자 분지는 생물학적 활성 부분 보다 양전하를 띄는 부분에 더 연결된다. 이런 특징은 올리고뉴클레오티드와 같은 생물학적 활성 부분의 음전하를 중화하기 위해 충분한 양전하를 제공할 수 있다.

본 발명의 목적을 위해, 분지성 기(branching group)가 본 명세서에 기재된 화합물 내에 존재하는 경우, 각 고분자 분지의 말단부까지의 분지성 부분 뒤에 존재하는 부분들은 분지 정도가 배, 즉 ×2가 된다. (h) 및 (h')는 분지성에 따라 만들어진 말단의 수를 나타낸다. 한 개의 실시예에 있어서, (h) 및 (h')는 각각 2가 될 수 있으며, 여기서 아스파르트산(aspartic acid)과 같은 분지성 기가 이용될 수 있다. 하나 이상의 분지성 기를 포함하는 다른 실시예에 있어서, (h) 및 (h')는 2, 3, 4, 6, 8, 12, 16, 18, 32 또는 그 이상이 될 수 있다. 분지성 부분은 적어도 3개의 기능기(functional group)를 포함할 수 있다. 아스파르트산과 같은 기능기를 3개 가지는 분지성 부분이 고분자 분지의 말단에 연결되는 경우, 각 고분자 분지는 고분자 분지의 수에 비해 적어도 2배의 기능성 부위를 제공할 수 있다. 다분지성 부분은 본 명세서에 기재된 화합물로 고려될 수 있다. 또 다른 실시예에 있어서, (h) 및 (h')는, 분지성 기가 없는 경우 1이 될 수 있다.

또 다른 바람직한 실시형태에 있어서, 4분지 고분자는 고분자 분지의 각 말단에서 분지성 부분에 연결될 수 있다. 4분지 및 아스파르트산과 같은 상기 분지의 분지성 부분을 포함하는 고분자 화합물은 양전하를 띄는 부분 또는 생물학적 활성 부분을 포함하는 8개의 기능성 부위를 가질 수 있다.

캡핑기는 H, NH₂, OH, CO₂H, C_1-6 알콕시 및 C_1-6 알킬 중에서 선택될 수 있다. 바람직하게는, mPEG와 같은 선형 고분자가 본 명세서에 기재된 화합물로 이용되는 경우, 상기 캡핑기는 메톡시를 포함할 수 있다. (b)가 0이 아니고 모든 Z₂ 부분이 캡핑기,

또는 이의 조합인 경우, (g')는 양전하를 띄는 부분 및 생물학적 활성 부분이 동일한 고분자 분지에 이용될 수 있기 위해서 적어도 1이 될 수 있다.

본 발명의 한 가지 바람직한 실시형태에 있어서, (b)가 0이 아닌 경우, 각 Z₂는

를 포함하고 따라서 본 명세서에 기재된 화합물은 화학식(Ⅱ)를 가진다:

모든 고분자 말단은 캡핑기 또는

를 포함하는 것 보다 활성화될 수 있고 양전하를 띄는 부분, 표적화 물질 또는 생물학적 활성 부분에 연결될 수 있다. 이런 실시형태로 고려되는 고분자로는 bis-PEGs, U-PEG 및 다분지 PEG를 포함할 수 있다.

또 다른 바람직한 실시형태에 있어서, (a)는 1이다. (a) 및 (b)의 합은 1 내지 31, 바람직하게 1 내지 7, 및 가장 바람직하게 4(4분지 고분자)의 양의 정수가 될 수 있다. 또 다른 바람직한 실시형태에 있어서, 고분자 말단이 올리고뉴클레오티드와 같은 생물학적 활성 부분의 음전하를 충분히 중화시키기 위해 상기 생물학적 활성 부분 보다 양전하 부분을 더 많이 가질 수 있도록 (b)가 (a) 보다 높을 수 있다.

본 발명의 목적을 위해, 이중기능성 링커, 분지성 기, 해체가능한 링커, 양전하를 포함하는 부분 및 표적화 물질에 대한 수치가 2 또는 그 이상인 양의 정수인 경우, 동일하거나 상이한 부분이 이용될 수 있다. 2 또는 그 이상의 해체가능한 링커를 포함하는 한개의 실시예에 있어서, (e)는 2 또는 그 이상이고, 해체가능한 링커는 이와 동일하거나 상이하다. 특정 실시예에 있어서, 벤질제거 기반 링커는 본 명세서에 기재된 화합물에서 하이드라존 포함 링커에 인접하여 존재한다. 또 다른 실시예에 있어서, 동일하거나 상이한 양전하를 띄는 펩티드는 동일한 고분자 말단에 이용될 수 있다.

한 개의 바람직한 실시예에 있어서, 본 명세서에 기재된 화합물은 하기 화학식을 가진다:

(Ⅲb),

(Ⅲc),

(Ⅲd), 및

(Ⅲe)

여기서

(n)은 약 10 내지 2300의 양의 정수이고, 상기 고분자의 총 분자량은 약 2,000 내지 100,000 달톤(dalton)이다;

각 Z는 Z₁ 또는 Z₂이다;

여기서

각 Z₁은 독립적으로

이다;

각 Z₂는 독립적으로 선택되는 캡핑기,

,

이다;

L₂, L'₂ 및 L''₂는 독립적으로 이황화물(disulfide), 하이드라존 포함 링커, 티오프로피오네이트 포함 링커, 벤질 제거 기반 링커, 트리알킬 잠금 기반 링커 및 바이신 기반 링커, 리소좀으로 절단가능한 펩티드 및 캡텝신 B(capthepsin B)로 절단가능한 펩티드 중 선택되는 해체가능한 링커이다;

(c), (c') 및 (c'')는 독립적으로 0 또는 양의 정수이다;

(d), (d'), (i), (i') 및 (i'')는 독립적으로 0 또는 양의 정수, 바람직하게 0, 1 또는 2이다;

(e)는 양의 정수, 바람직하게 1 또는 2이다;

(e') 및 (e'')는 독립적으로 0 또는 양의 정수, 바람직하게 0, 1 또는 2이다;

(f) 및 (f')는 독립적으로 0 또는 양의 정수, 바람직하게 0, 1 또는 2이다;

(g)는 양의 정수, 바람직하게 1 또는 2, 더 바람직하게 1이다;

(g')은 0 또는 양의 정수, 바람직하게 0, 1 또는 2이다;

(h) 및 (h')은 독립적으로 양의 정수, 바람직하게 약 1 내지 8, 더 바람직하게 1, 2, 3 또는 4, 가장 바람직하게 1 또는 2이다; 및

모든 그 외의 변이체들은 이미 정의된 바와 같다,

모든 Z₂가 캡핑기,

또는 이들의 조합인 경우, (g')는 양의 정수이다. 4개의 고분자 분지를 가지는 고분자 화합물인 경우, (n)은 약 4 내지 455가 될 수 있다. 당업자는 다른 다분지 고분자에 대한 선택적 (n) 값을 평가할 수 있다. 바람직하게는, 모든 Z₂ 부분은

이다.

분지성 부분을 포함하는 활성화된 4분지 고분자는 하기 화학식(Ⅲc')로 기재된다:

(Ⅲc').

본 발명의 한 개의 바람직한 실시예에 있어서, 다분지 고분자 컨쥬게이트는 생물학적 활성 부분에 접합되는 한 개의 고분자 분지 말단과 양전하 포함기에 결합되는 다른 고분자 분지 각각을 포함한다.

본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 다분지 고분자 컨쥬게이트는 생물학적 활성 부분에 결합되는 한 개의 고분자 분지 말단과 양전하 포함기 및 표적 물질에 결합되는 다른 고분자 분지 각각을 포함한다.

B. 실질적 비항원성 고분자(SUBSTANTIALLY NON-ANTIGENICE POLYMERS)

본 명세서에 기재된 화합물에 이용되는 고분자는 수용성 고분자 및 폴리알킬렌 옥시드(polyalkylene oxide; PAO)와 같은 실질적 비항원성 고분자인 것이 바람직하다.

본 발명의 일실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 화합물은 선형, 말단 분지성 또는 다분지성 폴리알킬렌 옥시드를 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 상기 폴리알킬렌 옥시드는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol; PEG) 및 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol)을 포함한다.

폴리알킬렌 옥시드는 약 2,000 내지 100,000 달톤(dalton), 바람직하게 약 2,000 내지 60,000 달톤의 평균 분자량을 가진다. 상기 폴리알킬렌 옥시드는, 단백질 또는 올리고뉴클레오티드가 접합되는 경우 약 5,000 내지 25,000, 바람직하게 약 12,000 내지 20,000 달톤, 또는 약학적 활성 화합물(1,500 달톤 이항의 평균 분자량을 가지는 작은 분자)이 본 명세서에 기재된 화합물로 이용되는 경우, 약 20,000 내지 45,000 달톤, 바람직하게 약 30,000 내지 40,000 달톤이 될 수 있다.

폴리알킬렌 옥시드는 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜을 포함한다. 더 바람직하게, 상기 폴리알킬렌 옥시드는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)를 포함한다. PEG는 일반적으로 하기의 구조에 의해 나타내어진다:

-O-(CH₂CH₂O)_n-

여기서 (n)은 약 10 내지 2,300의 정수이고, 다분지 고분자가 이용되는 경우 고분자 분지의 수에 의존한다. 또한, 본 발명의 폴리에틸렌글리콜(PEG) 잔기 부분은 하기의 구조에 의해 나타내어질 수 있다:

-Y₇₁-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂Y₇₁- ,

-Y₇₁-(CH₂CH₂O)_n-CH₂C(=Y₂₂)-Y₇₁- ,

-Y₇₁-C(=Y₇₂)-(CH₂)_a2-Y₇₃-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-Y₇₃-(CH₂)_a2-C(=Y₇₂)-Y₇₁- and

-Y₇₁-(CR₇₁R₇₂)_a2-Y₇₃-(CH₂)_b2-O-(CH₂CH₂O)_n-(CH₂)_b2-Y₇₃-(CR₇₁R₇₂)_a2-Y₇₁- ,

여기서:

Y₇₁ 및 Y₇₃은 독립적으로 O, S, SO, SO₂, NR₇₃ 또는 결합(bond)이다;

Y₇₂는 O, S 또는 NR₇₄이다;

R_71-74는 독립적으로 수소, C_1-6알킬, C_2-6 알케닐, C_2-6알키닐, C_3-19 분지성 알킬, C_3-8싸이클로알킬, C_1-6치환된 알킬, C_2-6치환된 알케닐, C_2-6치환된 알키닐, C_3-8치환된 사이클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, C_1-6 헤테로알킬, 치환된 C_1-6헤테로알킬, C_1-6알콕시, 아릴옥시, C_1-6헤테로알콕시, 헤테로아릴옥시, C_2-6 알카노일, 아릴카르보닐, C_2-6 알콕시카르보닐, 아릴옥시카르보닐, C_2-6 알카노일옥시, 아릴카르보닐옥시, C_2-6 치환된 알카노일, 치환된 아릴카르보닐, C_2-6 치환된 알카노일옥시, 치환된 아릴옥시카르보닐, C_2-6 치환된 알카노일옥시 및 치환된 아릴카르보닐옥시 중 선택되는 것이다;

(a2) 및 (b2)는 독립적으로 0 또는 양의 정수, 바람직하게 0 또는 약 1 내지 6의 양의 정수, 더 바람직하게 1이다; 및

(n)은 약 10 내지 2300의 양의 정수이다.

분지성 또는 U-PEG 유도체는 미국 특허번호 제 5,643,575호, 제 5,919,455호, 제 6,113,906호 및 제 6,566,506호에 기재되어 있고, 이들은 본 명세서에 참조로 통합된다. 이런 고분자는 하기의 구조를 가지는 고분자 시스템 (i) 내지 (vii)에 상응하나 이에 한정되지 않는다:

여기서;

Y_61-62는 독립적으로 O, S 또는 NR₆₁이다;

Y₆₃는 O, NR₆₂, S, SO 또는 SO₂이다;

(w62), (w63) 및 (w64)는 독립적으로 0 또는 양의 정수, 바람직하게 약 1 내지 3이다;

(w61)는 0 또는 1이다;

mPEG는 메톡시 PEG이다,

여기서 PEG는 이전에 정의된 바와 같고 고분자 부분의 총 분자량이 약 2,000 내지 100,000 달톤이다; 및

R₆₁ 및 R₆₂는 독립적으로 R₇₃로 이용될 수 있는 동일한 부분이다.

또 다른 실시형태에 있어서, 고분자는 NOF Corp에 기재된 것들과 같은 다분지 PEG-OH 또는 "star-PEG" 산물을 포함한다. 이를 기재한 Drug Delivery System catalog, Ver. 8, April 2006는 참조로 본 명세서에 통합된다. 다분지 고분자 컨쥬게이트는 4개 이상의 고분자 분지, 바람직하게 4 또는 8개의 고분자 분지를 포함한다.

본 발명의 목적을 위해, 다분지 폴리에틸렌글리콜(PEG) 잔기는 하기의 구조일 수 있으나 이에 한정되지 아노는다:

여기서:

(x)는 0, 및 약 0 내지 28의 양의 정수이다; 및

(n)은 중합(polymerization)의 정도이다.

본 발명의 한 개의 특정 실시예에 있어서, 다분지 PEG는 하기의 구조를 가진다:

여기서 (n)은 양의 정수이다. 본 발명의 바람직한 한개의 실시예 있어서, 고분자는 약 5,000 Da 내지 60,000 Da, 바람직하게 약 12,000 Da 내지 40,000 Da의 총 분자량을 가진다.

또 다른 바람직한 실시예에 있어서, 다분지 PEG는 하기의 구조를 가진다:

여기서 (n)은 양의 정수이다. 본 발명의 한 개의 바람직한 실시예에 있어서, 다분지 고분자에 대한 중합의 정도(n)는 약 5,000 내지 60,000 Da의 총 분자량을 가지는 고분자를 제공하기 위해 약 28 내지 350이고, 바람직하게 약 12,000 내지 45,000 Da의 총 분자량을 가지는 고분자를 제공하기 위해 약 65 내지 270이다. 이는 고분자 사슬에서 반복되는 단위의 수를 나타내며, 상기 고분자의 분자량에 의존한다.

상기 고분자는, 미국 특허번호 제 5,122,614호 또는 제 5,808,096호에 기재된 활성화 기술을 이용하여, 적절하게 활성된 고분자로 변형될 수 있다. 구체적으로, 이런 PEG는 하기의 화학식이 될 수 있다:

여기서:

(u')는 약 4 내지 455의 정수이다; 및 상기 잔기의 3 말단부까지는 메틸 또는 다른 더 낮은 알킬로 캡핑(capping)되어 있다.

일부 바람직한 실시예에 있어서, 4개의 PEG 분지 모두가 방향족기(aromatic group)에 대한 접합을 촉진시키기 위해 적절한 활성화기(activating group)로 변형될 수 있다. 이런 변형 전 화합물은 하기를 포함한다:

본 명세서에 포함되는 고분자성 물질은 실온에서 수용성인 것이 바람직하다. 이런 고분자는 폴리에틸렌글리콜(PEG) 또는 폴리프로필렌 글리콜과 같은 폴리알킬렌 옥시드 단일 고분자(homopolymer), 폴리옥시에틸렌화 폴리올(polyoxyethylenated polyol), 이들의 혼성 고분자(copolymer), 및 수용성이 유지되는 이들의 블럭 혼성 고분자(block copolymer)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

또 다른 실시예에 있어서, 상기 고분자로는 PAO 기반 고분자(PAO-based polymer), 덱스트란(dextran)과 같은 하나 이상의 효과적 비항원성 물질, 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol), 탄수화물 기반 고분자(carbohydrate-based polymer), 하이드록시프로필메탈크릴아마이드(hydroxypropylmethacrylamide; HPMA), 폴리알킬렌 옥시드( polyalkylene oxide) 또는 이들의 혼성 고분자가 이용될 수 있다. 내용이 참조로서 본 명세서에 통합되어 있는, 일반적으로 지정된 미국 특허번호 제 6,153,655호를 참조해라. 본 명세서에 기재된 바와 같이 활성의 동일한 유형을 PEG와 같은 PAO용으로 이용되는 것은 당업자에 의해 이해될 수 있을 것이다. 또한, 당업자는 이전에 나열한 항목이 단지 예시일 뿐이고 본 명세서에 기재된 특성을 가지는 모든 고분자 물질이 고려될 수 있는 것을 인지할 것이다. 본 발명의 목적을 위해, "실질적 또는 효과적 비항원성"은 포유류에서 비독성이고 상당한 면역반응을 유도하지 않는 것으로 당업계에서 이해되는 모든 물질을 의미한다.

일부 실시형태에 있어서, 말단 아민기를 가지는 고분자는 본 명세서에 기재된 화합물을 제조하는데 이용될 수 있다. 고순도에서 말단 아민기를 포함하는 고분자를 제조하는 방법은, 참조로 본 명세서에 통합되어 있는 미국 특허출원번호 제 11/508,507호 및 제 11/537,172호에 기재되어 있다. 예를 들어, 아지드화물(azide)을 가지는 고분자는 트리페닐포스핀(triphenylphosphine)과 같은 포스핀 기반 저해제(phosphine-based reducing agent) 또는 NaBH₄와 같은 알칼리 금속 수소화붕소 저해제(alkali metal borohydride reducing agent)와 반응한다. 또한, 이탈기(leaving group)를 포함하는 고분자는 메틸-테트라-부틸 이미도디카르보네이트(methyl-tert-butyl imidodicarbonate; KNMeBoc)의 칼륨염과 같은 보호된 아민염 또는 디-테트라-부틸 이미도디카르보네이트(di-tert-butyl imidodicarbonate; KNBoc₂)의 칼륨염과 반응하며, 이어서 상기 보호된 아민기의 탈보호시키는 것이 따른다. 이런 공정에 의해 형성된 말단 아민을 포함하는 고분자의 순도는 약 95%, 바람직하게 99% 이상이다.

또 다른 실시형태에 있어서, 말단 카르복실산기를 가지는 고분자는 본 명세서에 기재된 고분자 전달 시스템에 이용될 수 있다. 고순도에서 말단 카르복실산을 가지는 고분자를 제조하는 방법은, 참조로 본 명세서에 통합되어 있는 미국 특허출원 번호 제 11/328,662호에 기재되어 있다. 상기 방법은 우선 폴리알킬렌 옥시드의 3차 알킬 에스테르를 제조한 후, 이어서 이의 카르복실산 유도체에 대한 변형을 포함한다. 상기 공정의 PAO 카르복실산의 제조의 첫번째 단계는 폴리알킬렌 옥시드 카르복실산의 t-부틸 에스테르(t-butyl ester)와 같은 중간물을 형성하는 것을 포함한다. 상기 중간물은 칼륨 t-부톡사이드(potassium t-butoxide)와 같은 염의 존재 하에서 t-부틸 할로아세테이트(t-butyl haloacetate)를 PAO와 반응시킴으로써 형성된다. t-부틸 에스테르 중간물이 형성되면, 폴리알킬렌 옥시드의 카르복실산 유도체는 92% 이상의, 바람직하게 97% 이상의, 더 바람직하게 99% 이상의, 및 가장 바람직하게 99.5% 이상의 순도로 용이하게 제공될 수 있다.

C. 양전하 포함 부분(POSITIVE CHARGE CONTAINING MOIETIE)

본 명세서에 기재된 고분자 화합물은 양전하를 띄는 펩티드(positively-charged peptide) 또는 질소 포함 고리화 탄화수소(nitrogen-containing cyclohydrocarbon)를 포함할 수 있다. 양전하 포함 부분은 실질적 비항원성 고분자에 추가적인 양전하를 제공할 수 있다.

양전하를 띄는 펩티드는 고분자 화합물이 세포막을 투과하는 것을 도울 수 있다. 세포 투과성 펩티드(Cell penetrating peptide; CPP)는 아르기닌(arginine)과 같은 양전하를 띄는 아미노산, 및 라이신(lysine)을 포함한다. 또한, CPP는 본 명세서에 기재된 고분자 화합물의 표적화 전달을 촉진한다.

본 발명의 일실시형태에 있어서, 하나 이상의 펩티드는 본 명세서에 기재된 화합물로 이용될 수 있다. 상기 양전하를 띄는 펩티드는 많은 다양한 조합으로 화합물을 이용될 수 있다. 실시예의 목적을 위해, 임의의 조합이 제공되나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 한 개의 실시예에 있어서, 2개의 TAT 서열과 같은 펩티드의 다중 단위는 일렬로 접합될 수 있다.

여기서 (w)는 약 1 내지 10, 바람직하게 약 3 내지 7의 양의 정수이다; 및 (y)는 약 1 내지 7의 정수이다.

또 다른 실시예에 있어서, 2개 이상의 펩티드의 각각은 세포 흡수를 증진시키기 위해 분지화기(branching group)를 통한 각각의 고분자 분지 말단에 연결될 수 있다.

여기서 (w)는 약 1 내지 10의 정수이고, (y)는 약 1 내지 7의 정수이다.

상기 펩티드는 약 1 내지 50개, 바람직하게 약 2 내지 20, 더 바람직하게 약 3 내지 10의 양전하를 띄는 아미노산을 포함할 수 있다.

본 발명의 한 개의 바람직한 실시예에 있어서, 상기 양전하를 띄는 펩티드는 TAT, 페너트라틴(Penetratin) 및 (Arg)₉와 같은 세포 투과성 펩티드(CPP)를 포함한다. 내용이 참조로 본 명세서에 통합되는 Curr Opin Pharmacol. 2006 Oct;6(5):509-14(펩티드, 단백질 및 올리고뉴클레오티드 전달을 위한 벡터로서 세포 투과성 펩티드)를 참조해라.

본 발명의 일실시형태에 있어서, 양전하를 띄는 펩티드는 자연적으로 발생하는 아미노산 또는 비자연적으로 발생하는 아미노산을 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 펩티드는 아르기닌, 라이신 및 관련 동족체를 포함한다. 상기 펩티드는 자연적으로 발생하는 세포 투과성 펩티드 또는 이의 유도체의 아미노산 또는 이의 일부의 무작위 서열이 될 수 있다.

본 발명의 목적을 위해, 본 명세서에 기재된 고분자 화합물로 고려되는 펩티드는 펩티드의 말단, 또는 이황화결합을 접합 또는 도입하기 위한 펩티드 내에 시스테인(cysteine)을 포함할 수 있다.

본 발명의 한 개의 바람직한 실시예는 전사 단백질의 트랜스 활성인자(trans-activator of transcription protein; TAT)의 양전하를 띄는 펩티드를 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, 용어 "TAT"는 YGRKKRRQRRR의 펩티드 서열, 예를 들어 HS-CYGRKKRRQRRR-CONH₂을 포함하는 전사 활성 단백질의 트랜스 활성인자의 일부를 의미하는 것으로 이해될 수 있다.

C-TAT: CYGRKKRRQRRR (서열번호: 1)

또 다른 바람직한 실시예에 있어서, 양전하를 띄는 펩티드는 (Arg)₅와 같은 폴리아르기닌(polyarginine), 또는 NH(Me)-Sar-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-CONH₂ ("Sar-(Arg)₅")일 수 있다.

C-(Arg)₉: CRRRRRRRRR (서열번호: 2)

본 명세서에 포함되는 적절한 다양한 펩티드기(peptide group)는, 충분한 양의 양전하기(positive charged-group)를 포함한다면 당업자에게 명백해질 것이다. 또한, 상기 펩티드의 길이는 당업자의 필요 및 원하는 양전하기(아미노산에 의해 제공되는)의 수에 따라 다양할 것이다.

일부 바람직한 실시예에 있어서, 상기 펩티드는 약 1 내지 50, 바람직하게 약 2 내지 20, 및 더 바람직하게 약 3 내지 10개의 양전하를 띄는 아미노산을 포함할 것이다. 또한, 내용이 참조로 본 명세서에 통합되는 Zhao, H., et al, Bioconjugate Chem., 2005, 16: 758-766을 참조해라.

양전하를 띄는 펩티드가 SCA와 같은 표적화 부분에 접합되는 경우, SCA가 양전하를 띄는 펩티드에 대해 접합시키기 위해 링커가 삽입될 수 있다. 또한, 당업자에게 공지된 링커는 본 명세서에 기재된 화합물 내에 있는 것으로 고려되어진다.

또 다른 실시형태에 있어서, 양전하 포함 부분은 질소 포함 고리화탄소를 포함한다. 질소 포함 부분은 하기 화학식에 상응한다:

여기서

(aa)는 약 2 내지 10, 바람직하게 2 또는 3, 더 바람직하게 2의 양의 정수이다;

(bb)는 1, 2 또는 3이다;

(cc)는 1 또는 2이다;

(dd)는 약 1 내지 5, 바람직하게 1의 양의 정수이다;

R₁₀₁은 독립적으로 수소, C_1-6알킬, C_2-6 알케닐, C_2-6알키닐, C_3-19 분지화 알킬, C_3-8사이클로알킬, C_1-6치환된 알킬, C_2-6치환된 알케닐, C_2-6치환된 알키닐, C_3-8치환된 사이클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, C_1-6 헤테로알킬, 치환된 C_1-6헤테로알킬, C_1-6알콕시, 아릴옥시, C_1-6헤테로알콕시, 헤테로아릴옥시, C_2-6 알카노일, 아릴카르보닐, C_2-6 알콕시카르보닐, 아릴옥시카르보닐, C_2-6 알카노일옥시, 아릴카르보닐옥시, C_2-6 치환된 알카노일, 치환된 아릴카르보닐, C_2-6 치환된 알카노일옥시, 치환된 아릴옥시카르보닐, C_2-6 치환된 알카노일옥시, 치환된 알카노일옥시 및 아릴카르보닐옥시 중 선택되는 것이다; 및

(q)는 약 2 내지 30의 양의 정수이다.

한 가지 바람직한 실시예에 있어서, (q)는 약 3 내지 18이고, 따라서 각 고분자 분지의 각 말단은 3 내지 18개의 고리화탄화수소 단위를 포함한다. 더 바람직하게, (q)는 약 3 내지 9이다.

한 개의 바람직한 실시예에 있어서, 질소 포함 고리화탄화수소는 하기 중 선택되는 것일 수 있다:

질소 포함 고리화탄화수소 부분은 피페라진을 포함하는 것이 바람직하다.

D. 생물학적 활성 부분(BIOLOGICALLY ACTIVE MOIETIE)

본 명세서에 기재된 화합물은 다양한 음전하를 띄는 분자를 전달하는데 이용될 수 있다. 상기 고분자 화합물은 음전하를 띄는 분자의 생물학적 분포(biodistribution) 뿐만 아니라 세포 흡수를 개선시킨다. 상기 음전하를 띄는 분자는 약학적으로 유효한 화합물(1,500 달톤 이하의 평균 분자량을 가지는 작은 분자량의 화합물), 효소, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 항체, 단클론 항체, 단일 사슬 항체 및 펩티드를 포함할 수 있다. 상기 생물학적 활성 부분은 -NH₂를 포함하는 부분, -OH 를 포함하는 부분, 및 -SH를 포함하는 부분일 수 있다.

한 개의 바람직한 실시예에 있어서, 상기 생물학적 활성 부분은 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명의 범위를 보다 완전하게 인식하기 위해서, 하기에 용어를 정의한다. 당업자는, 별도의 특정이 없다면, 용어 "핵산" 또는 "뉴클레오티드"가 단일 가닥 또는 이중 가닥의 디옥시리보핵산("DNA"), 리보핵산("RNA"), 및 이들의 화학적 변형에 적용하는지를 통찰할 것이다. "올리고뉴클레오티드"는, 일반적으로 예를 들어 길이가 약 2 내지 200 뉴클레오티드, 바람직하게 약 10 내지 30 뉴클레오티드의 크기 범위인, 상대적으로 짧은 폴리뉴클레오티드이다. 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는, 일반적으로 별도의 특정이 없다면 합성 핵산이고 단일 사슬이다. 또한, 용어 "폴리뉴클레오티드"과 "폴리핵산"은 본 명세서에서 동일한 의미로 사용된다.

본 명세서에 사용된, 용어 "안티센스"는 유전자 산물을 암호화하거나 조절 서열을 암호화하는 특이적 DNA 또는 RNA 서열에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 용어 "안티센스 가닥"은 "센스 가닥"에 대해 상보적인 핵산 가닥에 관해서 사용된다. 세포 대사의 정상적인 작동에 있어서, DNA 분자의 센스 가닥은 폴리펩티드 또는 다른 유전자 산물을 암호화하는 가닥이다. 상기 센스 가닥은 메신저 RNA("mRNA") 전사물(안티센스 가닥)의 합성을 위한 주형으로서 제공하고, 이어서 암호화된 유전자 산물의 합성을 지시한다. 안티센스 핵산 분자는, 상보적인 가닥의 합성을 허용하는 바이러스성 프로모터(viral promoter)에 역방향으로 원하는 유전자를 연결시키는 합성 방법을 포함하는, 당업계에 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 세포 내로 도입된다면, 상기 전사된 가닥은 복합체를 형성하기 위해 세포에 의해 생산된 천연 서열과 결합한다. 이런 복합체는 추가적인 전사 또는 번역 중 어느 하나를 억제한다. 이런 방법에서는, 돌연변이 표현형이 유발된다. 또한, 명칭 "음성의" 또는 (-)는 안티센스 가닥을 나타내는 것임을 당업계에 공지되어 있고, "양성의" 또는 (+)는 센스 가닥을 나타내는 것임을 당업계에 공지되어 있다.

본 발명의 한 개의 바람직한 실시예에 있어서, 결합을 위한 선택은 올리고뉴클레오티드(또는 "폴리뉴클레오티드") 및 결합 후이고, 표적은 올리고뉴클레오티드의 잔기로 나타내어진다. 상기 올리고뉴클레오티드는 포스포디에스테르 골격(phosphorodiester backbone) 또는 포스포로티오에이트 골격(phosphorothioate backbone)를 가지는 공지된 올리고뉴클레오티드 및 올리고데옥시뉴클레오티드(oligodeoxynucleotide) 중 선택되는 것일 수 있다.

상기 올리고뉴클레오티드(동족체)는 단일 종류의 올리고뉴클레오티드에 한정되지 않으며, 대신에 다양한 범위의 부분을 가지는 것으로 작동하도록 설계될 수 있으며, 이는 링커가 일반적으로 뉴클레오티드의 PO₄ 또는 SO₄ 기를 하나 이상의 3'- 또는 5'- 말단에 접합시킬 수 있는 것으로 이해된다. 상기 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 앱타머 등을 포함한다. 상기 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유도체는 약 10 내지 1000개의 핵산을 포함할 수 있고, 바람직하게 길이에 있어서 약 2 내지 300개의 뉴클레오티드, 더 바람직하게 약 10 내지 30개의 뉴클레오티드의 크기 범위의 상대적으로 짧은 폴리뉴클레오티드이다. 게다가, 상기 올리고뉴클레오티드는 천연의 포스포로디에스테르 골격 또는 포스포로티오에이트 골격, 또는 LNA(잠금 핵산), PNA(펩티드 골격을 가지는 핵산), 트리싸이클로(tricyclo)-DNA; 디코이(decoy) ODN(이중 가닥의 올리고뉴클레오티드), RNA(촉매 RNA 서열), 리보자임; 내용이 참조로서 본 명세서에 통합되는 Tides 2002, Oligonucleotide and Peptide Technology Conferences, May 6-8, 2002, Las Vegas, NV 및 Oligonucleotide & Peptide Technologies, 18th & 19th November 2003, Hamburg, Germany에 기재되어 있는 스피에겔머(Spiegelmer)(L-형상의 올리고뉴클레오티드), CpG 올리고머 등과 같은 변형된 골격 유도체를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는, 하기 표 1에 나열된 것을 포함하는 당업계에 공지된 적절한 뉴클레오티드 동족체 및 유도체를 선택적으로 포함할 수 있다.

표 1 대표적인 뉴클레오티드 동족체 및 유도체
4-아세틸시티딘	5-메톡시아미노메틸-2-티오우리딘
5-(카르복시하이드록시메틸)우리딘	베타, D-만노실쿠에우오신
2‘-O-메틸시티딘	5-메톡시카르보닐메틸-2-티오우리딘
5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘	5-메톡시카르보닐메틸우리딘
5-카르복시메틸아미노메틸우리딘	5-메톡시우리딘
디하이드로우리딘	2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데노신
2'-O-메틸슈도우리딘	N-((9-베타-D-리보푸라노실-2-메틸티오푸린-6-일)카르바모일)트레오닌
D-갈락토실쿠에우오신	N-((9-베타-D-리보푸라노실-2-메틸티오푸린-6-일)N-메틸카르바모일)트레오닌
2'-O-메틸구아노신	우리딘-5-옥시아세트산-메틸에스테르
이노신	우리딘-5-옥시아세트산
N6-이소펜테닐아데노신	위부톡소신(Wybutoxosine)
1-메틸아데노신	슈도우리딘
1-메틸슈도우리딘	쿠에우오신(Queuosine)
1-메틸구아노신	2-티오시티딘
1-메틸이노신	5-메틸-2-티오우리딘
2,2-디메틸구아노신	2-티오우리딘
2-메틸아데노신	4-티오우리딘
2-메틸구아노신	5-메틸우리딘
3-메틸시티딘	N-((9-베타-D-리보푸라노실-2-메틸티오푸린-6-일)-카르바모일)트레오닌
5-메틸시티딘	2'-O-메틸-5-메틸우리딘
N6-메틸아데노신	2'-O-메틸우리딘
7-메틸구아노신	위부톡소신
5-메틸아미노메틸우리딘	3-(3-아미노-3-카르복시-프로필)우리딘
잠금-아데노신	잠금-시티딘
잠금-구아노신	잠금-티민
잠금-우리딘	잠금-메틸시티딘

본 발명에서 고려되는 올리고뉴클레오티드에 대한 변형은, 예를 들어 기능기 또는 원하는 고분자에 올리고뉴클레오티드의 공유 결합을 허용하는 부분을 가지는 선택되는 뉴클레오티드의 부가 또는 치환, 또는 올리고뉴클레오티드에 부가적인 전하, 분극화 능력(polarizability), 수소결합(hydrogen bonding), 전기적 상호작용(electrostatic interaction) 및 기능성(functionality)을 통합하는 기능성 부분의 부가 또는 치환을 포함한다. 이런 변형은, 2'-위치 당 변형, 5-위치 피리미딘 변형, 8-위치 푸린 변형, 엑소싸이클 아민(exocyclic amine)에서의 변형, 4-티오우리딘(4-thiouridine)의 치환, 5-브로모(5-bromo) 또는 5-아이오우라실(5-iodouracil)의 치환, 골격 변형, 메틸화(methylation), 이소시티딘(isocytidine) 및 이소구아니딘(isoguanidine)과 같은 염기쌍 조합, 및 이와 유사한 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 올리고뉴클레오티드 변형은 캡핑(capping)과 같은 3' 및 5' 변형을 포함한다. 본 명세서의 뉴클레오시드(nucleoside) 동족체의 구조는 하기와 같다.

뉴클레오시드 유도체의 더 많은 예시는, 내용이 참조로서 본 명세서에 통합되는, reier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 및 Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213에 기재되어 있다.

본 발명의 바람직한 일실시형태에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 항암 치료학에 있어서 표적화된 종양 세포 또는 종양 세포의 저항과 관련하여 단백질의 발현 감소와 관련된다. 예를 들어, 암 치료에 관하여 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의해 발현이 감소하는 bcl-2와 같은 당업계에 알려진 단백질이 본 발명에 이용될 수 있다. 내용이 참조로서 본 명세서에 통합되는, 미국 특허출원번호 제 10/822,205호를 참조해라. 바람직한 치료적 올리고뉴클레오티드는 안티센스 HIF-1α 및 안티센스 설비빈(Survivin) 올리고뉴클레오티드를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

상기 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 제나센스(Genasense)[Genta Inc., Berkeley Heights, NJ에 의해 생산된 a/k/a 오블리머센 나트륨(oblimersen sodium)]와 동일하거나 실질적으로 유사한 뉴클레오티드 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 제나센스는, TCTCCCAGCGTGCGCCAT(서열번호: 6)인 18-머(mer) 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드이며, 이는 인간 bcl-2 mRNA(인간 bcl-2 mRNA는 당업계에 공지된 것이고, 참조로 본 명세서에 통합되는 미국 특허번호 제 6,414,134호에서의 서열번호: 19에 기재되어 있다)의 개시 서열 중 처음 6개의 코돈에 상보적이다. 미국 식품의약품안전청(FDA)은 제나센스를 2000년 8월에 희귀 의약품(Orphan Drug) 신분으로 지정하였다:

(i) 안티센스 설비빈(Survivin) LNA(서열번호: 3)

^mC_s-T_s-^mC_s-A_s-a_s-t_s-c_s-c_s-a_s-t_s-g_s-g_s-^mC_s-A_s-G_s-c;

여기서 상기 위첨자는 LNA를 나타내고, "_S"는 포스포티오에이트 골격을 나타낸다;

(ii) 안티센스 Bcl2 siRNA:

센스 5'-GCAUGCGGCCUCUGUUUGAdTdT-3' (서열번호: 4)

안티센스 3'-dTdTCGUACGCCGGAGACAAACU-5' (서열번호: 5)

여기서 dT는 DNA를 나타낸다;

(iii) 제나센스(포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드) (서열번호: 6)

t_s-c_s-t_s-c_s-c_s-c_s-a_s-g_s-c_s-g_s-t_s-g_s-c_s-g_s-c_s-c_s-c_s-a_s-t

여기서 아래첨자는 DNA를 나타내고, "_S"는 포스포티오에이트 골격을 나타낸다;

(iv) 안티센스 HIF1a LNA(서열번호: 7)

5'-_sT_sG_sG_sc_sa_sa_sg_sc_sa_st_sc_sc_sT_sG_sT_sa-3'(서열번호: 7)

여기서 위첨자는 LNA를 나타내고, 포스포티오에이트 골격을 나타낸다.

LNA는 하기에 보여지는 바와 같이 2'-O-,4'-C-메틸렌 바이사이클로뉴클레오티드(2'-O,4'-C methylene bicyclonucleotide)를 포함한다:

설비빈 LNA에 관한 상세한 설명은, 내용이 참조로서 본 명세서에 통합되는, 미국 특허출원번호 제 11/272,124호, 발명의 명칭 "LNA 올리고뉴클레오티드 및 암의 치료"; 및 미국 특허출원번호 제 10/776,934호, 발명의 명칭 "설비빈 발현 조절용 올리고머 화합물"을 참조해라. 또한, 내용이 참조로서 본 명세서에 통합되는, 미국 특허출원번호 제 10/407,807호, 발명의 명칭 "HIF-1 알파 발현 조절용 올리고머 화합물"; 및 미국 특허출원번호 제 11/271,686호, 발명의 명칭 "HIF-1 알파 발현 억제용 유효한 LNA 올리고뉴클레오티드"를 참조하라.

본 명세서에 기재된 화합물에 이용되는 올리고뉴클레오티드는 각 올리고뉴클레오티드의 5' 또는 3' 말단에 (CH₂)_w 아미노 링커를 가지고, 여기서 (w)는 약 1 내지 10, 바람직하게 6인 양의 정수인 것으로 변형될 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 하기에 보여진 바와 같이 NH-(CH₂)_w-올리고뉴클레오티드일 수 있다:

여기서 (y)는 약 1 내지 7의 양의 정수이다.

본 발명의 한 개의 바람직한 실시예에 있어서, siRNA의 센스 가닥의 5' 말단은 변형된다. 예를 들어, 고분자 컨쥬게이트에 이용되는 siRNA는 5'-C₆-NH₂으로 변형된다. 본 발명의 한 개의 특정 실시예는

센스 5'-(NH₂-C₆)GCAUGCGGCCUCUGUUUGAdTdT-3'

안티센스 3'-dTdTCGUACGCCGGAGACAAACU-5'의 서열을 가지는 Bcl2-siRNA를 이용한다.

다른 한편으로는, 본 명세서에서 서술한 혼합물은 (CH2)_W 아미노 링커(amino linkers)를 포함하는 에스테르에 의해 방해를 받는 올리고뉴클레오티드 변형을 포함할 수 있다. 그 내용이 참조로서 통합되는 “가리움 에스테르 기반 생분해가능 링커를 가지는 폴리알킬렌 옥사이드(Polyalkylene Oxides Having Hindered Ester-Based Biodegradable Linkers)”라는 명칭의 미국 가특허출원번호 60/844942 및 “올리고뉴클레오티드 전달을 위한 가리움 에스테르 기반 생분해가능 링커(Hindered Ester-Based Biodegradable Linkers for Oligonucleotide Delivery)”라는 명칭의 미국 가특허출원번호 60/845028에서 확인할 수 있다.

.

또 다른 한편으로는, (CH2)w 설프하이드릴 링커(sulfhydryl linkers)로 변형된 올리고뉴클레오티드(티오 올리고뉴클레오티드, thio oligonucleotides)일 수 있다. 상기 티오 뉴클레오티드(thio oligonucleotides)는 양전하 펩티드의 시스테인에 직접적으로 또는 말레이미딜 그룹(maleimidyl group)을 통하여 결합시켜 사용될 수 있다. 상기 티오 뉴클레오티드는 SH-(CH2)_W-올리고뉴클레오티드 구조를 가질 수 있다. 또한, 상기 티오 뉴클레오티드는 하기 구조를 가지는 가리움 에스테르를 포함할 수 있다:

.

.

상기 올리고뉴클레오티드는 C₆-NH₂꼬리, C₆-SH 꼬리 또는 억제된 에스테르 꼬리로 변형될 수 있다. 전형적인 변형된 올리고뉴클레오티드는 하기를 포함한다:

(i) C₆-NH₂꼬리로 변형된 제나센스(Genasense):

5’- NH₂- C₆- _st_sc_st_sc_sc_sc_sa_sg_sc_sg_st_sg_sc_sg_sc_sc_sa_st -3’

(ii) C₆-NH₂ 꼬리로 변형된 역방향 HIF1α LNA:

5’- NH₂-C₆- _sT_sG_sG_sc_sa_sa_sg_sc_sa_st_sc_sc_sT_sG_sT_sa -3’

(iii) C₆-NH₂ 꼬리로 변형된 역방향 설비빈 LNA:

5’- NH₂- C₆- _s ^mC_sT_s ^mC_sA_sa_st_sc_sc_sa_st_sg_sg_s ^mC_sA_sG_sc -3’

(iv) C₆-SH 꼬리로 변형된 역방향 설비빈 LNA

5’- HS- C₆- _s ^mC_sT_s ^mC_sA_sa_st_sc_sc_sa_st_sg_sg_s ^mC_sA_sG_sc -3’

(v) 가리움 에스테르 꼬리로 변형된 제나센스

.

E. 표적 약물

표적 약물은 생체 조건에서 표적 부위로 결합체를 인도하는 본 명세서에서 기술한 중합 혼합물일 수 있다. 상기 표적 약물은, 표적 부위, 예를 들면, 종양에서 치료 효능을 가지는 올리고뉴클레오티드 같은, 음전자를 띄는 생물학적 활성 부위를 제공한다. 올리고뉴클레오티드 같이 음전하를 띤 분자의 생체 조건에서의 표적화된 전달은 이러한 분자들이 더욱 좋은 치료 효능을 가질 수 있게 세포 흡수를 증가시킨다. 한편으로는, 세포 투과 펩티드는 종양 부위로의 표적화된 전달을 위하여 다양한 표적 펩티드로 교체할 수 있다.

본 발명의 우선된 실시형태는, 단일 사슬 항체(single chain antibody (SCA)) 또는 단일 사슬 항원 결합 항체; 단일 클론 항체; RGD 펩티드 및 셀렉틴(Selectin)같은 세포 부착 펩티드; TAT, 페네트라틴(Penetratin) 및 (Arg)g 같은 세포 투과 펩티드, 수용체 리간드; 표적 탄수화물 분자 또는 렉틴; 올리고뉴클레오티드; LNA(locked nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)같은 올리고뉴클레오티드 유사체; 또는 그 밖에 유사한 것들의 표적 부분을 표적된 부위에 명확히 유도된 세포독성 약물을 제공한다. 그 내용이 참조로서 통합되는 “표적 약물 전달을 위한 세포 부착 분자(J Pharm ScL 2006 Sep; 95(9): 1856-72 Cell adhesion molecules for targeted drug delivery)”에서 확인할 수 있다.

바람직하게는, 표적 부분은 단일 사슬 항체(SCA's) 또는 항체의 단일 사슬 가변 단편(sFv)을 포함한다. 상기 SCA는 표적 암세포에 특이적인 분자에 결합 또는 상기 분자를 인지할 수 있는 항체의 도메인을 포함한다. 항체 결합 부위를 지지하는데 더하여, 링커를 통한 PEG화된 SCA (PEGlated SCA)는 항원성을 낮추고 혈중에서 SCA의 반감기를 증가시킬 수 있다.

“단일 사슬 항체”(SCA), “단일 사슬 항체 결합 분자 또는 항체” 또는“단일 체인 Fv"(sFv)의 용어는 서로 바꾸어 쓸 수 있다. 상기 단일 사슬 항체는 그의 항원에 대한 결합 친화성을 가지고 있다. 단일 사슬 항체(SCA) 또는 단일 사슬 Fv는 여러 가지 방법으로 설계될 수 있다. 단일 사슬 항체 결합 단백질의 이론 및 생산에 대한 설명은 본 명세서에 참조로서 통합되는 미국 출원특허 번호 10/915069 및 미국 특허번호 6824782에 일반적으로 기술되어 있다.

일반적으로, SCA 또는 Fv 도메인은 문헌에서의 26-10, MOPC 315, 741F8, 520C9, McPC 603, D1.3, 쥣과의 phOx, 인간 phOx, RFL3.8 sTCR, 1A6, Sel55-4,18-2-3,4-4-20,7A4-l, B6.2, CC49,3C2,2c, MA-15C5/K12GO, Ox, 등처럼, 그들 일부의 생략을 통해 알려진 단일 클론 항체 중에서 선택될 수 있다(see, Huston, J. S. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); Huston, J. S. et al., SlM News 38(4) (Supp):ll (1988); McCartney, J. et al., ICSU Short Reports 10:114 (1990); McCartney, J. E. et al., unpublished results (1990); Nedelman, M. A. et al., J. Nuclear Med. 32 (Supp.):1005 (1991); Huston, J. S. et al., In: Molecular Design and Modeling: Concepts and Applications, Part B, edited by J. J. Langone, Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Huston, J. S. et al., In: Advances in the Applications of Monoclonal Antibodies in Clinical Oncology, Epenetos, A. A. (Ed-), London, Chapman & Hall (1993); Bird, R. E. et al., Science 242:423-426 (1988); Bedzyk, W. D. et al., J. Biol. Chem. 265:18615-18620 (1990); Colcher, D. et al., J. Nat. Cancer Inst. 82:1191-1197 (1990); Gibbs, R. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4001-4004 (1991); Milenic, D. E. et al., Cancer Research 51:6363-6371 (1991); Pantoliano, M. W. et al., Biochemistry 30:10117- 10125 (1991); Chaudhary, V. K. et al., Nature 339:394-397 (1989); Chaudhary, V. K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1066-1070 (1990); Batra, J. K. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 171:1-6 (1990); Batra, J. K. et al., J. Biol. Chem. 265:15198-15202 (1990); Chaudhary, V. K. et al., Proc. Natl. Acad Sd. USA 87:9491-9494 (1990); Batra, J. K. et al., MoL Cell. Biol. 11:2200-2205 (1991); Brinkmann, U. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8616-8620 (1991); Seetharam, S. et al., J. Biol. Chem. 266:17376-17381 (1991); Brinkmann, U. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3075-3079 (1992); Glockshuber, R. et al., Biochemistry 29:1362-1367 (1990); Skerra, A. et al, Bio/Technol. 9:273-278 (1991); Pack, P. et al., Biochemistry 31 :1579-1534 (1992); Clackson, T. et al., Nature 352:624-628 (1991); Marks, J. D. et al., J. MoI. Biol. 222:581-597 (1991); Iverson, B. L. et al., Science 249:659-662 (1990); Roberts, V. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sd. USA 87:6654-6658 (1990); Condra, J. H. et al., J. Biol. Chem. 265:2292-2295 (1990); Laroche, Y. et al., J. Biol. Chem. 266:16343-16349 (1991); Holvoet, P. et al., J. Biol. Chem. 266:19717-19724 (1991); Anand, N. N. et al., J. Biol. Chem. 266:21874-21879 (1991); Fuchs, P. et al., Biol Technol. 9:1369-1372 (1991); Breitling, F. et al., Gene 104:104-153 (1991); Seehaus, T. et al., Gene 114:235-237 (1992); Takkinen, K. et al., Protein Engng. 4:837-841 (1991); Dreher, M. L. et al., J. Immunol. Methods 139:197-205 (1991); Mottez, E. et al., Eur. J. Immunol. 21 :467-471 (1991); Traunecker, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8646-8650 (1991); Traunecker, A. et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991); Hoo, W. F. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4759-4763 (1993)). 각각의 앞서 발행된 문헌은 참조로서 본 명세서에 편입된다.

표적 그룹의 무한한 리스트는 혈관 내피 세포 성장 인자, FGF2, 소마토스타틴(somatostatin) 및 소마토스타틴 유사체, 트랜스페린(transferrin), 멜라노트로핀(melanotropin), 아포E(ApoE) and 아포E 펩티드(ApoE peptides), 본 윌레브랜즈 인자(von Willebrand's Factor) 및 본 윌레브렌즈 인자 펩티드(von Willebrand's Factor peptides), 아데노바이럴 섬유 단백질(adenoviral fiber protein) 및 아데노바이럴 섬유 단백질 펩티드(adenoviral fiber protein peptides), PDl 및 PDl 펩티드, EGF and EGF 펩티드, RGD 펩티드, 폴라이트(folate) 등을 포함한다. 다른 선택 사항으로 당업자에 의해 인정받은 표적 약제는 본 명세서에서 기술한 혼합물에 사용할 수 있다.

바람직하게는, 상기 표적 약제는 단일 사슬 항체(SCA), RGD 펩티드, 셀렉틴, TAT, 페네트라틴, (Arg)₉, 엽산 등; 및 이러한 약제의 몇몇의 바람직한 구조를 포함한다:

C-TAT: (서열번호 1) CYGRKKRRQRRR;

C-(Arg)₉: (서열 번호 2) CRRRRRRRRR;

직선형 또는 원형의 RGD :

,

또는

; 및

엽산은

의 잔기이다.

Arg_9는CYGRKKRRQRRRC같은 펩티드의 끝에 추가의 시스테인을 더할 수 있는 CRJRRRRRRRR 및 TAT같은 것에 결합시키기 위한 시스테인을 포함할 수 있다.

본 발명의 목적을 위하여, 본 명세서 및 도면에서 하기의 구조에 대하여 약어를 사용하였다:

(i) C-diTAT = CYGRKKRRQRRRYGRKKRRQRRR-NH₂

(ii) Linear RGD = RGDC ;

(iii) Cyclic RGD = c-RGDfC ;

(iv) RGD-TAT = CYGRKKRRQRRRGGGRGDS-NH₂ ; 및

(v) Arg_9.

F. 방출 가능한 링커

본 발명의 우선된 실시형태는, 본 명세서에서 기술한 혼합물은 방출 가능한 링커가 결합된 생물학적 활성을 가진 일부분을 포함한다. 본 발명은 통제가능한 방법에 의해 방출될 수 있는 생물학적 활성을 가진 일부분을 제공한다.

상기 방출 가능한 링커는 벤질 제거 기반 링커(elimination-based linkers), 트리알킬 잠금 기반 링커(trialkyl lock- based linkers) (또는 트리알킬 잠금 락톤화 기반(trialkyl lock lactonization based)), 바이신 기반 링커(bicine-based linkers), 산 불안정 링커(acid labile linkers), 리소좀 절개가능 펩티드(lysosomally cleavable peptides) 및 카텝신 D 절개가능 펩티드(capthepsin B cleavable peptides)일 수 있다. 상기, 산 불안정 링커는 이황화 결합(disulfide bond), 하이드로존 포함 링커(hydrozone- containing linkers) 및 티오프로피온 산 포함 링커(thiopropionate-containing linkers)일 수 있다. 택일적으로, 상기 방출 가능한 링커는 세포내 불안정 링커(intracellular labile linkers), 세포외 링커(extracellular linkers) 및 산 불안정 링커이다.

방출가능 링커는 하기의 형식을 갖는다:

,

,

,

,

,

-Val-Cit-,

-Gly-Phe-Leu-Gly-,

-Ala-Leu-Ala-Leu-,

-Phe-Lys-,

,

,

,

,

-Val-Cit-C(=O)-CH₂OCH₂-C(=O)-,

-Val-Cit-C(=O)-CH₂SCH₂-C(=O)-, 및

-NHCH(CH₃)-C(=O)-NH(CH₂)₆-C(CH₃)₂-C(=O)-인 바,

Y_11-19 는 독립적으로 O, S 또는 NR₄₈이다;

R_31-48, R_50-51 및 A₅₁는 독립적으로 수소, C_1-6알킬(alkyls), C_3-12 브랜치드 알킬(branched alkyls), C_3-8사이클로알킬(cycloalkyls), C_1-6치환된 알킬(substituted alkyls), C_3-8치환된 사이클로알킬(substituted cyloalkyls), 아릴(aryls), 치환된 아릴(substituted aryls), 아랄킬(aralkyls), C_1-6헤테로알킬(heteroalkyls), 치환된 C_1-6헤테로알킬(substituted C_1-6heteroalkyls), C_1-6알록시(alkoxy), 페녹시(phenoxy) 및 C_1-6헤테로알콕시에서 선택되었다;

Ar은 아릴 또는 헤테로 아릴 부위이다;

L_11-15은 독립적으로 이작용기의 스페이서(spacers)에서 선택되었다;

J 및 J’는 독립적으로 표적세포로 활발하게 운반될 수 있는 부분, 소수성 부분, 이작용기의 결합 부위 및 이들의 조합들 중에서 선택되었다;

(c11), (h11), (k11), (111), (m11) 및 (n11)은 독립적으로 양의 정수, 바람직하게는 1에서 선택되었다;

(a11), (e11), (g11), (j11), (o11) 및 (q11)은 독립적으로 0 뿐만 아니라 양의 정수, 바람직하게는 1에서 선택되었다; 및

(b11), (x11), (x’11), (f11), (i11) 및 (p11)은 독립적으로 0 또는 1이다.

벤질 제거 기반 또는 트리알킬 잠금 기반의 다양한 방출가능 링커가 기술되었는데, 예를 들면, 본 명세서에 각 내용이 참조로서 통합될 수 있는 미국 특허번호 6180095, 6720306, 5965119, 6624142 및 6303569에 일반적으로 포함되어 있다. 바이신 기반 링커 역시 기술되었는데, 본 명세서에 참조로서 통합될 수 있는 미국 특허번호 7122189, 7087229 및 미국 출원특허번호 10/557522, 11/502108 및 11/011818에 일반적으로 포함되어 있다.

바람직하게는, 상기 올리고뉴클레오티드는 본 명세서에서 기술한 화합물의 중합체 부분과 산 불안정 링커를 통하여 결합된다. 어떠한 이론에도 한정되지 않고, 산 불안정 링커는 세포 내 및 특히 리소좀, 엔도좀 또는 마크로피노좀(macropinosome)에서 모(母)중합 화합물로부터 올리고뉴클레오티드의 방출을 촉진시킨다.

본 발명의 또다른 택일적인 실시형태는, 상기 양전하 펩티드 및 표적 약물은 산 불안정 링커같은 방출가능한 링커에 의해 본 명세서에서 기술하는 화합물의 중합체 부분과 역시 결합될 수 있다.

G. 이작용기 링커

본 발명의 또다른 실시형태는, 양전하 펩티드 및 표적 약물이 영구적 링커 및 방출가능한 링커 단독으로 또는 조합으로 본 명세서에서 기술하고 있는 화합물의 중합체 부분과 결합될 수 있다. 바람직하게는, 상기 양전하 펩티드 및 표적 약물은 영구적 링커로 결합된다.

상기 이작용기 링커는 아미노산 또는 아미노산 유도체를 포함한다. 상기 아미노산은 자연적인 것 및 비자연적인 것 모두 가능하다. 자연적인 아미노산의 유도체 및 유사체는, 다양한 기술의 비자연적 아미노산(D 또는 L) 뿐만 아니라, 소수성 또는 비소수성 역시 본 발명의 범주에 들어갈 수 있다. 비자연적 아미노산의 무제한의 적당한 목록은 3-아미노아디픽산(3-aminoadipic acid), 베타-알라닌(beta-alanine), 베타-아미노프로피온산(beta-amino-propionic acid), 2-아미노부틸 산(2-aminobutyric acid), 4-아미노부틸산(4-aminobutyric acid), 피퍼리딘산(piperidinic acid), 6-아미노카프로산(6-aminocaproic acid), 2-아미노헵탄산(2-aminoheptanoic acid), 2-아미노이소부틸산(2-aminoisobutyric acid), 3-아미노이소부틸산(3-aminoisobutyric acid), 2-아미노피멜산(2-aminopimelic acid), 2,4-아미노부틸산(2,4-aminobutyric acid), 데스모신(desmosine), 2,2-다이아미노피켈산(2,2-diaminopimelic acid), 2,3-다이아미노프로피온산(2,3-diaminopropionic acid), N-에틸글리신(N-ethylglycine), N-에틸아스파라긴(N-ethylasparagine), 3-하이드록시프롤린(3-hydroxyproline), 4-하이드록시프롤린(4-hydroxyproline), 이소데스모신(isodesmosine), 알로-이소루신(allo-isoleucine), N-메틸글리신(N-methylglycine), 사르코신(sarcosine), N-메틸-이소루신(N-methyl-isoleucine), 6-N-메틸-리신(6-N-methyl-lysine), N-메틸발린(N-methylvaline), 노르발린(norvaline), 노르루신(norleucine), 및 오르니틴(ornithine)을 포함한다. 바람직한 아미노산 잔기에는 글리신, 알라닌, 메티오닌 및 사르코신을 포함한다.

택일적으로, 이작용기 링커는

-[C(=O)]_v(CR₂₂R₂₃)_t[C(=O)]_v’- ,

-[C(=O)]_v(CR₂₂R₂₃)_t-O[C(=O)]_v’- ,

-[C(=O)]_v(CR₂₂R₂₃)_t-NR₂₆[C(=O)]_v’- ,

-[C(=O)]_vO(CR₂₂R₂₃)_t[C(=O)]_v’- ,

-[C(=O)]_vO(CR₂₂R₂₃)_tO[C(=O)]_v’- ,

-[C(=O)]_vO(CR₂₂R₂₃)_tNR₂₆[C(=O)]_v’- ,

-[C(=O)]_vNR₂₁(CR₂₂R₂₃)_t[C(=O)]_v’- ,

-[C(=O)]_vNR₂₁(CR₂₂R₂₃)_tO[C(=O)]_v’- ,

-[C(=O)]_vNR₂₁(CR₂₂R₂₃)_tNR₂₆[C(=O)]_v’- ,

-[C(=O)]_v(CR₂₂R₂₃)_tO-(CR₂₈R₂₉)_t’[C(=O)]_v’- ,

-[C(=O)]_v(CR₂₂R₂₃)_tNR₂₆-(CR₂₈R₂₉)_t’[C(=O)]_v’- ,

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-[C(=O)]_vO(CR₂₂R₂₃)_tO-(CR₂₈R₂₉)_t’[C(=O)]_v’- ,

-[C(=O)]_vO(CR₂₂R₂₃)_tNR₂₆-(CR₂₈R₂₉)_t’[C(=O)]_v’- ,

-[C(=O)]_vO(CR₂₂R₂₃)_tS-(CR₂₈R₂₉)_t’[C(=O)]_v’- ,

-[C(=O)]_vNR₂₁(CR₂₂R₂₃)_tO-(CR₂₈R₂₉)_t’[C(=O)]_v’- ,

-[C(=O)]_vNR₂₁(CR₂₂R₂₃)_tNR₂₆-(CR₂₈R₂₉)_t’[C(=O)]_v’- ,

-[C(=O)]_vNR₂₁(CR₂₂R₂₃)_tS-(CR₂₈R₂₉)_t’[C(=O)]_v’- ,

-[C(=O)]_v(CR₂₂R₂₃CR₂₈R₂₉O)_tNR₂₆[C(=O)]_v’- ,

-[C(=O)]_v(CR₂₂R₂₃CR₂₈R₂₉O)_t[C(=O)]_v’- ,

-[C(=O)]_vO(CR₂₂R₂₃CR₂₈R₂₉O)_tNR₂₆[C(=O)]_v’- ,

-[C(=O)]_vO(CR₂₂R₂₃CR₂₈R₂₉O)_t[C(=O)]_v’- ,

-[C(=O)]_vNR₂₁(CR₂₂R₂₃CR₂₈R₂₉O)_tNR₂₆[C(=O)]_v’- ,

-[C(=O)]_vNR₂₁(CR₂₂R₂₃CR₂₈R₂₉O)_t[C(=O)]_v’- ,

-[C(=O)]_v(CR₂₂R₂₃CR₂₈R₂₉O)_t(CR₂₄R₂₅)_t’[C(=O)]_v’- ,

-[C(=O)]_vO(CR₂₂R₂₃CR₂₈R₂₉O)_t(CR₂₄R₂₅)_t’[C(=O)]_v’- ,

-[C(=O)]_vNR₂₁(CR₂₂R₂₃CR₂₈R₂₉O)_t(CR₂₄R₂₅)_t’[C(=O)]_v’- ,

-[C(=O)]_v(CR₂₂R₂₃CR₂₈R₂₉O)_t(CR₂₄R₂₅)_t’O[C(=O)]_v’- ,

-[C(=O)]_v(CR₂₂R₂₃)_t(CR₂₄R₂₅CR₂₈R₂₉O)_t’[C(=O)]_v’- ,

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-[C(=O)]_vO(CR₂₂R₂₃CR₂₈R₂₉O)_t(CR₂₄R₂₅)_t’O[C(=O)]_v’- ,

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-[C(=O)]_vO(CR₂₂R₂₃)_t(CR₂₄CR₂₅CR₂₈R₂₉O)_t’NR₂₆[C(=O)]_v’- ,

-[C(=O)]_vNR₂₁(CR₂₂R₂₃CR₂₈R₂₉O)_t(CR₂₄R₂₅)_t’O[C(=O)]_v’- ,

-[C(=O)]_vNR₂₁(CR₂₂R₂₃)_t(CR₂₄R₂₅CR₂₈R₂₉O)_t’[C(=O)]_v’- ,

-[C(=O)]_vNR₂₁(CR₂₂R₂₃)_t(CR₂₄R₂₅CR₂₈R₂₉O)_t’NR₂₆[C(=O)]_v’- ,

,

,

,

,

및

에서 선택될 수 있는 바:

R_21-29는 독립적으로 수소, C_1-6알킬, C_3-12 브랜치드 알킬(branched alkyls), C_3-8사이클로알킬(cycloalkyls), C_1-6치환된 알킬(substituted alkyls), C_3-8치환된 사이클로알킬(substituted cyloalkyls), 아릴(aryls), 치환된 아릴(substituted aryls), 아랄킬(aralkyls), C_1-6헤테로알킬(heteroalkyls), 치환된 C_1-6헤테로알킬(substituted C_1-6heteroalkyls), C_1-6알콕시(alkoxy), 페녹시(phenoxy) 및 C_1-6헤테로알콕시(heteroalkoxy) 중에서 선택되었다;

(t) 및 (t’)는 독립적으로 0 또는 양의 정수, 바람직하게는 0 또는 1 내지 12정도의 정수 중 하나, 더욱 바람직하게는 1 내지 8정도의 정수 중 하나, 가장 바람직하게는 1 또는 2이다; 및

(v) 및 (v’)는 독립적으로 0 또는 1이다.

바람직하게는, 상기 이작용기 링커는

-[C(=O)]_rNH(CH₂)₂CH=N-NHC(=O)-(CH₂)₂- ,

-[C(=O)]_rNH(CH₂)₂(CH₂CH₂O)₂(CH₂)₂NH[C(=O)]_r’- ,

-[C(=O)]_rNH(CH₂CH₂)(CH₂CH₂O)₂NH[C(=O)]_r’- ,

-[C(=O)]_rNH(CH₂CH₂)_sNH(CH₂CH₂)_s’[C(=O)]_r’- ,

-[C(=O)]_r NH(CH₂CH₂)_sS(CH₂CH₂)_s’[C(=O)]_r’- ,

-[C(=O)]_rNH(CH₂CH₂)(CH₂CH₂O)[C(=O)]_r’- ,

-[C(=O)]_rNH(CH₂CH₂)_sO(CH₂CH₂)_s’[C(=O)]_r’- ,

-[C(=O)]_rNH(CH₂CH₂O)(CH₂)NH[C(=O)]_r’- ,

-[C(=O)]_rNH(CH₂CH₂O)₂(CH₂)[C(=O)]_r’- ,

-[C(=O)]_rNH(CH₂CH₂O)_s(CH₂)_s’[C(=O)]_r’- ,

-[C(=O)]_rNHCH₂CH₂NH[C(=O)]_r’- ,

-[C(=O)]_rNH(CH₂CH₂)₂O[C(=O)]_r’- ,

-[C(=O)]_rNH(CH₂CH₂O)[C(=O)]_r’- ,

-[C(=O)]_rNH(CH₂CH₂O)₂[C(=O)]_r’- ,

-[C(=O)]_rNH(CH₂)₃[C(=O)]_r’- ,

-[C(=O)]_rO(CH₂CH₂O)₂(CH₂)[C(=O)]_r’- ,

-[C(=O)]_rO(CH₂)₂NH(CH₂)₂[C(=O)]_r’- ,

-[C(=O)]_rO(CH₂CH₂O)₂NH[C(=O)]_r’- ,

-[C(=O)]_rO(CH₂)₂O(CH₂)₂[C(=O)]_r’- ,

-[C(=O)]_rO(CH₂)₂S(CH₂)₂[C(=O)]_r’- ,

-[C(=O)]_rO(CH₂CH₂)NH[C(=O)]_r’- ,

-[C(=O)]_rO(CH₂CH₂)O[C(=O)]_r’- ,

-[C(=O)]_rO(CH₂)₃NH[C(=O)]_r’- ,

-[C(=O)]_rO(CH₂)₃O[C(=O)]_r’- ,

-[C(=O)]_rO(CH₂)₃[C(=O)]_r’- ,

-[C(=O)]_rCH₂NHCH₂[C(=O)]_r’- ,

-[C(=O)]_rCH₂OCH₂[C(=O)]_r’- ,

-[C(=O)]_rCH₂SCH₂[C(=O)]_r’- ,

-[C(=O)]_rS(CH₂)₃[C(=O)]_r’- ,

-[C(=O)]_r(CH₂)₃[C(=O)]_r- ,

,

, 및

중에서 선택될 수 있는바,

(r) 및 (r’)은 독립적으로 0 또는 1이나, (r) 및 (r’)이 동시에 0일 수는 없다.

또한, 본 발명의 택일적인 실시형태에서, 이작용기 링커는 하기를 포함한다:

, ,

,

,

,

,

, 및

.

상기 이작용기 그룹은 직접 중합될 수 있는 이차 시료로 사용될 수 있으므로, 이차 시료로의 중합을 위한 작용기의 첨부의 필요성을 제거할 수 있다.

본 발명의 택일적인 구체적 실시예에서, 이작용기 링커는 상기에 나타낸 것과 일치하는 구조를 포함하지만, 비닐(vinyl), 설폰의 잔기(residues of sulfone), 아미노(amino), 카복시(carboxy), 머캅토(mercapto), 티오프로피온산(thiopropionate), 하이드라지드(hydrazide), 카바즈산(carbazate)같은 말레이미드기 및 그밖에 유사한 말레이미드기는 포함하지 않는다.

H. 가지 그룹

본 명세서에 기재된 혼합물의 중합체 팔 말단은 생물학적 활성 부분, 양전하 부분 및/또는 표적 약물 등을 복합적으로 적재함으로써 분지(分枝)할 수 있다. 바람직하게는 상기 가지 그룹은 양전하 부분을 통해 중합체 팔 말단을 더 공급한다.

상기 가지 그룹은 적어도 세 개의 활성 부위를 가질 수 있다. 중합체 팔 말단의 수는 분지의 정도에 따라 증가된다. 세 개의 활성 부위를 가진 가지 그룹이 중합체 화합물에 결합될 때, 그것은 두 개의 중합 말단을 제공한다. 상기 가지 그룹은 하기에서 선택될 수 있다:

(Ia),

(Ib),

(Ic),

(Id),

(Ie),

(If),

(Ig), 및

(Ih)인 바,

R₅는 독립적으로 수소, C_1-6알킬, C_2-6 알케닐, C_2-6알키닐, C_3-19 브랜치드 알킬(branched alkyl), C_3-8사이클로알킬(cycloalkyl), C_1-6치환된 알킬(substituted alkyl), C_2-6치환된 알케닐(substituted alkenyl), C_2-6치환된 일키닐(substituted alkynyl), C_3-8치환된 사이클로알킬(substituted cycloalkyl), 아릴(aryl), 치환된 아릴(substituted aryl), 헤테아알릴(heteroaryl), 치환된 헤테로아릴(substituted heteroaryl), C_1-6 헤테로알킬(heteroalkyl), 치환된 C_1-6헤테로알킬(substituted C_1-6heteroalkyl), C_1-6알콕시(alkoxy), 아릴옥시(aryloxy), C_1-6헤테로알콕시(heteroalkoxy), 헤테로아릴옥시(heteroaryloxy), C_2-6 알카노일(alkanoyl), 아릴카보닐(arylcarbonyl), C_2-6 알콕시카보닐(alkoxycarbonyl), 아릴옥시카보닐(aryloxycarbonyl), C_2-6 알카노일옥시(alkanoyloxy), 아릴카보닐옥시(arylcarbonyloxy), C_2-6 치환된 알카노일(substituted alkanoyl), 치환된 아릴카보닐(substituted arylcarbonyl), C_2-6 치환된 알카노일옥시(substituted alkanoyloxy), 치환된 아릴옥시카보닐(substituted aryloxycarbonyl), C_2-6 치환된 알카노일옥시(substituted alkanoyloxy), 및 치환된 아릴카보닐옥시(substituted arylcarbonyloxy)에서 선택된다;

(c1), (c2), (c3), (c4), (c5), (c6), (c’6), (c"6), (c7) 및 (c8)은 독립적으로 0 또는 양의 정수, 바람직하게는 0 또는 1 내지 10 중 하나의 정수, 더욱 바람직하게는 0, 1 또는 2이다; 및

(d1), (d2), (d3), (d4), (d5) 및 (d7)은 독립적으로 0 또는 양의 정수, 바람직하게는 0 또는 1 내지 10정도 중 하나의 정수, 더욱 바람직하게는 0 또는 1내지 4정도중 하나의 정수이다.

또한, 본 명세서에서 기재하는 다양한 가지 그룹은 일반적으로 미국 특허번호 6153655, 6395266 및 6638499에 포함되며, 상기 특허는 본 명세서에 참조로서 통합된다. 당업계에서 알려진 다른 모든 선택가능한 가지 그룹은 본 명세서에서 서술하는 화합물에 사용될 수 있다.

바람직하게는, 상기 가지 그룹은 하기를 포함한다:

,

,

,

,

,

,

,

,

및

.

더욱 바람직하게는, 상기 가지 그룹은 아스파트산, 글루탐산, 리신 및 시스테인을 포함한다.

나아가, 실시형태에서, 하나 또는 그 이상의 가지 그룹은 각 중합체 팔의 끝에 사용될 수 있다.

I. 형식에 상응하는 바람직한 실시예

본 발명의 바람직한 구체적 실시예에서, 중합체 화합물은 하기의 형식을 가진다:

인 바,

(e)는 1 또는 2이다;

(e’)는 0, 1 또는 2이다; 및

(f’)는 0 또는 1이다,

인 바 (g’)는 양의 정수이다.

예를 들면, 본 발명과 조화롭게 준비된 결합은 하기와 같다.

,

,

,

,

,

,

,

,

,

,

,

,

,

,

,

,

,

, 및

인 바,

C-TAT은 -S-CYGRKKRRQRRR-CONH₂의 잔기이다.

NH-5’-C₆-GS는 제나센스(Genasense)의 유도체인, 18 단위체 포스포로티오산 역방향 올리고뉴클레오티드 TCTCCCAGCGTGCGCCAT (서열번호 1)

이다;

S-5’-C₆-LNA-설비빈은

; 및

RGD는

이다.

본 발명의 바람직한 구체적 실시예에서, 상기 중합체 화합물은 하기를 포함한다:

siRNA 듀플렉스의 정방향 가닥의 5’-말단은 PEG 링커에 결합하기 위한 C₆-아미노 꼬리로 변형될 수 있다.

J. 중합체 전달 시스템의 합성

일반적으로, 결합체는 순차적으로 다기능 링커에 중합체, 세포 독성 약제, 양전하 함유 부분, 및 표적 부분을 부착하여 만들어질 수 있다. 정확한 첨가의 순서는 상기의 순서에 제한되지 않으며, 당업계의 명백한 기술에 따라, PEG를 가장 먼저 다기능 링커에 첨가한 뒤에 방출가능한 세포 독성 약품의 결합에 이어서 양전하 함유 부분 및 단일 클론 항체같은 표적 약제를 첨가한다. 본 발명의 구체적 실시예의 세부적인 고려사항의 바람직한 실시형태는 하기의 실시예에 나타내었다.

본 발명의 한 실시형태는, OH 또는 이탈기를 함유하는 중합체 화합물은 방출가능한 링커 부분을 함유하는 친핵체와 먼저 반응한 다음, 말단 끝에 다른 작용기를 함유하는 친핵체와 반응한다. 상기 방출가능한 링커는 생물학적 활성 화합물과 결합할 수 있고, 상기 작용기는 양전하 함유 부분과 연결할 수 있다. 택일적으로, 상기 생물학적 활성 부분 및 양전하 함유 부분과 결합된 중합체 화합물은 본 발명의 모든 세가지 구성물을 함유하는 마지막 중합체 표적 부분을 제공하기 위하여 더 반응할 수 있다. 예를 들면, 당업자는 이탈기의 숫자를 비교하여 작은 당량의 친핵체를 링커 및 이탈기 모두를 함유하는 중합체 중간물을 형성하기위한 중합체로 사용할 수 있다. 상기 중간물은 양전하 함유 부분과 더 반응할 수 있고, 택일적으로, 생물학적 활성 화합물, 양전하 함유 부분, 및 표적 약제로 다치환된 중합체 결합물을 형성하기 위한 표적 부분과 한층 더 반응할 수 있다.

택일적으로, 상기 중합체는 다양한 친핵체 부분에 대한 다른 화학적 반응성을 제공하는 다른 그룹에 의하여 활성화 될 수 있다. 예를 들면, 다른 터트-Bu 에스테르(tert-Bu ester) 및 카복실산 말단의 메틸 에스테르(methyl ester of carboxylic acid terminals) 같은 보호기는 세포 독성 약제 및 표적 약제 같은 다른 생물학적 활성 약제와 결합될 수 있는 반응기의 다양성의 정도를 제공하기 위해 선택적이고 단계적으로 비보호 될 수 있다. 도 1에서 나타낸 바와 같이, 말레이미드기(maleimidyl group) 및 숙신이미딜 에스테르(succinimidyl ester)는 SH 또는 NH₂ 함유 부분과 각각 선택적으로 반응할 수 있다.

본 명세서에서 기술한 모든 반응은 당업계에서 잘 알려진 일반적 기술에 따른 단계 및 조건을 필요로 하는 표준 화학 반응이다. 그러므로 본 명세서에서 기술한 상기 합성 반응은 단일 실험을 필요로 하지 않는다.

PEG 및 다른 중합체로의 친핵체의 부착은 당업계에서 잘 알려진 일반적 기술인 표준 화학 합성 기술을 사용하여 수행될 수 있다. SC-PEG, PEG-아민(amine), PEG 산, 등과 같은 활성화된 중합체 부위는 상용화 자원 또는 단일 실험없이 당업자에 의해 합성된 것으로 입수할 수 있다.

중합체 부위로의 친핵체 화합물의 부착은 택일적으로 연결제(coupling agent)의 존재 하에 실시된다. 적합한 연결제의 비제한적 목록에는 예를 들면, 시그마-알드리치 화학(Sigma-Aldrich Chemical)같은 상용화된 자원 또는 알려진 기술을 이용하여 합성된 1,3-다이이소프로필카보다이이미드(1,3-diisopropylcarbodiimide (DIPC)), 어떤 적합한 다이알킬 카보다이이미드(dialkyl carbodiimides), 2-할로-1-알킬-피리디니움 할라이드(2-halo-1-alkyl-pyridinium halides(Mukaiyama reagents)), 1-(3-다이메틸아미노프로필)-3-에틸 카보다이이미드(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethyl carbodiimide (EDC)), 프로판 포스폰산 사이클리칸하이드리드(propane phosphonic acid cyclicanhydride (PPACA)) 및 페닐 다이클로로포스포산(phenyl dichlorophosphates) 등 을 포함한다.

바람직하게는, 상기 반응은 메틸렌 클로라이드(methylene chloride), 클로로포름(chloroform), DMF 또는 이의 혼합물 같은 불활성 용매에서 수행된다. 상기 반응은 바람직하게 다이메틸아미노피리딘(dimethylaminopyridine (DMAP)), 다이이소프로필에틸아민(diisopropylethylamine), 피리딘(pyridine), 타리에틸아민(triethylamine) 등과같은 생성된 어떠한 산을 중화시키는 염기의 존재 하에서 수행될 수 있다. 상기 반응은 0^oC 에서 22^oC (상온)에서 수행될 수 있다. 본 명세서의 하기에 기술하는 방법에 의하여 상세한 구체화가 준비된다:

일실시형태에 있어서, 상기 음전하를 중화시키기 위한 양전하 부분 및 올리고뉴클레오티드 같은 생물학적 활성 부분의 세포 흡수를 증가시킨 중합체 화합물은 하기의 택일적 실시형태를 가질 수 있다:

(i) (CH₂)_w아미노 링커로 올리고뉴클레오티드의 5-´ 또는 3-´ 말단을 변형시킨 올리고뉴클레오티드;

(ii)(CH₂)_w 서프하이드릴(sufhydryl) 링커로 올리고뉴클레오티드의 5-´ 또는 3-´ 말단을 변형시킨 올리고뉴클레오티드;

(iii) 아미노 꼬리(amino tail) 또는 티오 꼬리(thio tail)없이 올리고뉴클레오티드를 분비하는, 가리움 에스테르를 포함하는 (CH₂)_w아미노 링커 또는 (CH₂)_w 서프하이드릴(sufhydryl) 링커로 변형시킨 올리고뉴클레오티드;

(iv) 예를 들면, TAT 서열같은 두 양전하 펩티드를 세포 흡수를 증가시키기 위해 부착시킬 수 있는 하나 또는 그 이상의 양전하 펩티드;

(v) 하나 또는 그 이상의 방출가능한 링커를 부착시킬 수 있다.

가리움 에스테르를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 형식에 관한 서술은 그 내용이 참조에 의해 본 발명에 통합될 수 있는 미국 가출원특허번호 60/845028, 명칭 "올리고뉴클레오티드 전달을 위한 가리움 에스테르 기반 생분해성 링커(Hindered Ester-Based Biodegradable Linkers For Oligonucleotide Delivery)"에 일반적으로 배속되어 있다. 반응 모식도를 도 2에 나타내었다.

K. 처리 방법

보다 높은 실시형태에서, 또한, 형식 (I)의 본 발명의 화합물을 함유하는 약학적 조성물의 효과량을 이를 필요로하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 포유동물 치료의 방법을 제공한다.

본 발명의 특별한 실시형태는, 또한, 형식 (I)의 본 발명의 화합물을 함유하는 약학적 조성물의 효과량을 이를 필요로하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 악성 질환 또는 암을 앓고 있는 환자의 치료 방법을 제공한다는 것이다. 택일적인 실시형태로, 상기 치료받을 암은 하나 또는 그 이상의 하기의 암일 수 있다: 고형암, 임파종, 소세포 폐암, 급성 림프구성 백혈병, 췌장암, 교모세포종, 자궁암, 식도암 등. 상기 조성물은 종양 질환의 치료, 종괴 크기의 감소, 종양의 전이 예방, 및 악성종양 재발/포유동물에서 종양 성장의 방지에 유용하다

본 발명의 또다른 실시형태는 포유동물의 다양한 의학적 조건에서의 치료 방법을 제공한다. 간략히 명시하면, 상기 치료의 필요로 포유동물에게 투여할 수 있는 어떠한 양전하 PEG 중합체에 부착될 수 있는 생물학적 활성 부분이다. 비결합 상태에서 치료 효과를 가지는 어떤 올리고뉴클레오티드 등은 본 명세서에서 기술한 바대로 만들어진 그것의 결합된 형태에서 사용될 수 있다.

예를 들면, 전구약물(prodrug)로서 사용되는 투여될 조성물의 양은 이에 포함된 기원 분자에 의존할 것이다. 일반적으로, 치료 방법에서 사용되는 전구약물의 양은 포유동물에서 바라는 치료 결과를 효과적으로 달성할 수 있는 양이다. 자연적으로, 다양한 전구약물 조성물의 투여량은 기원 분자, 생체 내 가수분해 속도, 중합체의 분자량 등에 매우 의존적일 것이다.

본 발명의 나아간 실시형태는, 폴리뉴클레오티드(올리고뉴클레오티드), 바람직하게는 포유동물 세포에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투여하는 방법을 제공한다. 본 명세서에서 기술한 결합물의 치료할 조건에서의 효과량의 전달을 포함하는 방법은 각 조건에서의 폴리뉴클레오티드의 효능에 의존할 것이다. 예를 들면, 만약 비결합된 올리고뉴클레오티드(예를 들면, 안티센스 BCL3 올리고뉴클레오티드, 안티센스 설비빈 올리고뉴클레오티드)가 암 또는 종양 세포에 대한 효능을 가진다면, 상기 방법은 원래의 올리고뉴클레오티드의 감수성을 간직한 채로, 세포 내로 상기 올리고티드를 함유하는 중합체 결합물의 전달을 포함할 것이다. 상기 전달은 약학적 조성물에 적합한 부분으로 생체 조건에서 또는 생체외 환경에서 세포로 직접적으로 조작할 수 있다. 한 특별한 치료에서, 올리고뉴클레오티드(서열번호 3;서열번호 4 및 5; 서열번호 6; 및 서열번호 7)를 포함하는 상기 중합체 결합물을 사용할 수 있다.

도 1은 실시예 1 내지 3에 기재된 합성 방법을 개략적으로 나타낸 그림이다.

도 2는 실시예 4 내지 13에 기재된 합성 방법을 개략적으로 나타낸 그림이다.

도 3은 실시예 14 내지 20에 기재된 합성 방법을 개략적으로 나타낸 그림이다.

도 4는 실시예 21 내지 26에 기재된 합성 방법을 개략적으로 나타낸 그림이다.

도 5는 실시예 27 내지 31에 기재된 합성 방법을 개략적으로 나타낸 그림이다.

도 6은 실시예 32 내지 34에 기재된 합성 방법을 개략적으로 나타낸 그림이다.

도 7은 실시예 35 내지 38에 기재된 합성 방법을 개략적으로 나타낸 그림이다.

도 8은 실시예 39 내지 41에 기재된 합성 방법을 개략적으로 나타낸 그림이다.

도 9는 실시예 42 내지 49에 기재된 합성 방법을 개략적으로 나타낸 그림이다.

도 10은 실시예 50 내지 53에 기재된 합성 방법을 개략적으로 나타낸 그림이다.

도 11은 실시예 54 내지 58에 기재된 합성 방법을 개략적으로 나타낸 그림이다.

도 12는 실시예 59 내지 62에 기재된 합성 방법을 개략적으로 나타낸 그림이다.

도 13은 실시예 63에 기재된 현광현미경(fluorescent microscopy)의 이미지를 나타낸 그림이다.

도 14는 실시예 63에 기재된 공초점현미경(confocal microscopy)의 이미지를 나타낸 그림이다.

도 15는 실시예 64에 기재된 세포 흡수(cellular uptake)를 나타낸 그림이다.

도 16은 실시예 65에 기재된 세포 흡수를 나타낸 그림이다.

도 17은 실시예 66에 기재된 Bcl2 mRNA 발현 감소(down regulation)를 나타낸 그림이다.

도 18은 실시예 67에 기재된 설비빈(Survivin) 발현 감소를 나타낸 그림이 다.

도 19는 실시예 68에 기재된 설비빈 발현 감소를 나타낸 그림이다.

도 20은 실시예 69에 기재된 설비빈 발현 감소를 나타낸 그림이다.

도 21는 실시예 70에 기재된 설비빈 발현 감소를 나타낸 그림이다.

도 22는 실시예 71에 기재된 설비빈 발현 감소를 나타낸 그림이다.

도 23은 실시예 72에 기재된 설비빈 발현 감소를 나타낸 그림이다.

도 24는 실시예 73에 기재된 생체내 설비빈 발현 감소를 나타낸 그림이다.

하기의 실시예는 본 발명의 나가간 이해를 돕기 위한것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다. 실시예에서 볼드체의 숫자는 도 1에서 나타낸 것에 상응하는 것이다. DCM (dichloromethane), DIEA (diisopropylethylamine), DMAP (4-dimethylaminopyridine), DMF (N,N´-dimethylformamide), DSC (disuccinimidyl carbonate), EDC (1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethyl carbodiimide), IPA (isopropanol), NHS (N-hydroxysuccinimide), PEG (polyethylene glycol), SCA-SH (single-chain antibody), SN38 (7-ethyl-10-hydroxycamptothecin), TBDPS (tert-butyl-dipropylsilyl), 및 TEA (triethylamine) 같은 약어들을 실시예 전반에 걸쳐 사용하였다. .

일반적 절차. 모든 반응은 건조한 질소 또는 아르곤 환경 하에서 행하였다. 상용화된 약제는 추가의 정제 없이 사용하였다. 모든 PEG 조성물은 진공상태 또는 톨루엔으로부터 공비혼합물 정제수로 사용하기 전에 건조하였다. 300 MHz에서의 ¹H NMR 스펙트라(spectra) 및 75.46 MHz에서의 ¹³C NMR 스펙트라(spectra)가 다르게 열거된것이 아닌 한, 바리안 머큐리 300NMR 스펙트로미터(Varian Mercury300 NMR spectrometer) 및 용매로서 중수소화된 클로로포름을 사용하여 시행되었다. 화학물이 ppm으로 알려진 (δ)가 테트라메틸시란(tetramethylsilane (TMS))으로부터의 간섭을 바꾸어놓는다.

HPLC 방법. 반응 혼합물 및 중간물의 순도 및 최종 생산물을 HPLC 기계(Beckman Coulter System GoldHPLC instrument)로 관찰하였다. 그것은 ZORBAX300SB C8 역상 컬럼((150 × 4.6 mm)) 또는 Phenomenex Jupiter 300A C18 역상 컬럼(150 × 4.6 mm)을 1 mL/min의 유속에서 0.05 % 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid (TFA))에 10-90 % 의 아세톤니트릴(acetonitrile) 기울기를 이용하여, 168 다이오드 배열 UV 탐지기(168 Diode Array UV Detector)와 함께 사용하였다.

실시예 1. 화합물 3:

PBS 버퍼(5 mL, pH 7.8)에 녹아있는 화합물 2의 수용액(10 mg, 1.7 mol)에 NOF사의 Mal-PEG5k-NHS(100 mg, 17 mol)을 더한 후, 상온에서 2시간동안 교반시켰 다. 상기× 반응 혼합물을 물로 20 mL까지 희석한 다음, 20 mM Tris-HCl 버퍼, pH 7.0 (A 버퍼)로 전-평형화시킨 프로스 HQ (Poros HQ), 강력 음전하 교환 컬럼(strong anion exchange column (10 mm × 1.5 mm, bed volume ~ 16 mL))에 로드(load)하였다. 상기 컬럼을 과량의 PEG 링커를 제거하기 위하여 3-4배 컬럼 부피의 A 버퍼로 세척하였다. 그 후, 생산물을 20 mM Tris-HCl 버퍼, pH 7.0에 들어있는 0 내지 100 % 구배(gradient)의 1 M NaCl, B 버퍼로 10분간, 100%의 B 버퍼를 10 mL/min의 유속으로 흘려 용출하였다. 상기 용출물을 하이프렙 탈염 컬럼(HiPrep desalting column (50 mL))을 사용하여 탈염하고, 감압하에 동결 건조하여 화합물 3를 수득하였다. 6 mg을 수득하였다(올리고 당량(oligo equivalent), 30%).

실시예 2. 화합물 4:

PBS 버퍼(6 mL, pH 7.0)에 들어있는 화합물 3 용액에, C-Tat 펩티드(5 mg , 3 mol)를 첨가한 다음 상온에서 2시간 동안 교반시켜 주었다. 반응 혼합물을 물로 20 mL까지 희석시키고, 100 mM K₂HPO₄, 5M urea 버퍼, pH 6.5 (buffer A)로 전-평형화시킨 리소스 S (Resource S), 강력 음전하 교환 컬럼(strong anion exchange column (10 mm × 1.5 mm, bed volume ~ 16 mL))에 로드(load)하였다. 상기 컬럼을 반응하지 않은 PEG-올리고 화합물을 제거하기 위하여 3-4배 컬럼 볼륨의 A 버퍼로 세척하였다. 그런 다음, 생산물을 0 내지 100% 농도구배의 2 M KBr (B 버퍼)로 10분간, 10 mL/min의 유속으로 용출하였다. 상기 용출물을 하이프렙 탈염 컬 럼(HiPrep desalting column (50 mL))을 사용하여 탈염하고, 감압하에 동결 건조하여 화합물 4를 수득하였다. 2 mg을 수득하였다(올리고 당량(oligo equivalent), 30%).

실시예 3. 화합물 5:

PBS 버퍼(6 mL, pH 7.0)에 들어있는 화합물 3 용액에, C-diTat 펩티드(5 mg , 3 mol)를 첨가한 다음 상온에서 2시간 동안 교반시켜 주었다. 반응 혼합물을 물로 20 mL까지 희석시키고, 100 mM K₂HPO₄, 5M urea 버퍼, pH 6.5 (buffer A)로 전-평형화시킨 리소스 S (Resource S), 강력 음전하 교환 컬럼(strong anion exchange column (10 mm × 1.5 mm, bed volume ~ 16 mL))에 로드(load)하였다. 상기 컬럼을 반응하지 않은 PEG-올리고 화합물을 제거하기 위하여 3-4배 컬럼 볼륨의 A 버퍼로 세척하였다. 그런 다음, 생산물을 0 내지 100% 농도구배의 2 M KBr (B 버퍼)로 10분간, 10 mL/min의 유속으로 용출하였다. 상기 용출물을 하이프렙 탈염 컬럼(HiPrep desalting column (50 mL))을 사용하여 탈염하고, 감압하에 동결 건조하여 화합물 4를 수득하였다. 2 mg을 수득하였다(올리고 당량(oligo equivalent), 30%).

실시예 4. 화합물 6:

부틸리티움(Butyllithium)(1.6 M, 200 mL)에 THF (500 mL)에 들어있는 에틸 이소부티르산(ethyl isobutyrate) (35 g)용액을 78°C에서 첨가한 다음, 동일온도에서 상기 용액을 1시간 동안 교반시켜 주었다. 1,5-Dibromopetane (100 g)을 더하고, 상기 혼합물을 상온까지 데워주었다. 상기 혼합물을 상온에서 1시간동안 교반하고, 이탄산 수화나트륨(aqueous sodium bicarbonate (500 mL))에 부어주었다. 유기물층은 증발시켰다. 잔여물을 실리카 겔 컬럼을 이용하여 정제하고, 헥세인(hexane)에 들어있는 10% 에틸 아세트산으로 용출하여 화합물 6 용액을 수득하였다(29.2 g, 수득률 36.7%).

실시예 5. 화합물 7:

에틸 7-브로모-2,2-다이메틸헵타노산(Ethyl 7-bromo-2,2-dimethylheptanoate)(화합물 6, 26.5 g)을 DMF (500 mL)에 들어있는 소듐 아자이드(sodium azide (13 g))와 함께 100 °C에서 2시간동안 가열하였다. 상기 혼합물을 농축시키고, 잔여물을 실리카 겔 컬럼을 이용하여 정제하고, 헥세인(hexane)에 들어있는 10% 에틸 아세트산으로 용출하여 화합물 7 용액을 수득하였다(20.5 g, 수득률 90.3%).

실시예 6. 화합물 8:

에틸-7-아자이도-2,2-다이메틸헵타노산(Ethyl 7-azido-2,2-dimethylheptanoate)(화합물 7, 20.5 g)을 에탄올(500 mL)에 들어있는 소듐 하이드록사이드(sodium hydroxide)(10 g, 85%)와 함께 환류 시키면서 2시간 동안 가열하 였다. 상기 혼합물을 농축하고, 물(400 mL)을 첨가시켰다. 상기 혼합물을 pH 2의 농축된 하이드로클로르산(hydrochloric acid)으로 산성화시키고, 에틸 아세트산(500 mL)으로 추출하였다. 유기물층을 농축시키고, 잔여물은 실리카 겔 컬럼을 이용하여 정제하고, 헥세인(hexane)에 들어있는 15% 에틸 아세트산으로 용출하여 화합물 8 용액을 수득하였다(17.1 g, 수득률 95%).

실시예 7. 화합물 9:

에틸-7-아지도-2,2-다이메틸헵타노산(Ethyl 7-azido-2,2-dimethylheptanoate)(화합물 8, 8 g)을 다이클로로메탄(dichloromethane)(200 mL)에 녹였다. 옥살릴 클로라이드(Oxalyl chloride)(6.4 g)을 첨가하고, 혼합물을 환류하면서 2시간 동안 증발시켰다. 잔여물을 다이클로로메탄(dichloromethane)(100 mL)에 녹이고, 피리딘(pyridine)(100 mL)에 들어있는 3‘-아세틸 티미딘(3´-acetyl thymidine)(5.85 g)을 첨가하였다. 상기 용액을 상온에서 24시간 동안 교반시키고, 이탄산 수화나트륨(aqueous sodium bicarbonate (500 mL))에 부어주었다. 상기 혼합물을 다이클로로메탄(dichloromethane)(500 mL)으로 추출하고, 유기물층을 농축시켰다. 잔여물은 실리카 겔 컬럼을 이용하여 정제하고, 다이클로로메탄(dichloromethane)에 들어있는 5% 메탄올로 용출하여 무색의 고체로서 화합물 9를 수득하였다(5.6 g, 수득률 61%).

실시예 8. 화합물 10:

5´-(7-아지도-2,2-다이메틸티미딘)-3´-아세틸티미딘(5´-(7-Azido-2,2-dimethylheptanoyl)-3´-acetylthymidine)(화합물 9, 4.65 g)를 메탄올(200 mL)에서 30 psi이하로 Pd/C (10%, 0.5 g) 존재하에 1시간 동안 경화시켰다. 상기 혼합물을 걸러준 후, 걸러진 것을 증발시켜 고체로서 화합물 10을 수득하였다(4.4 g, 수득률 100%).

실시예 9. 화합물 11:

5´-(7-아지도-2,2-다이메틸헵타노일)-3´-아세틸티미딘(5´-(7-Amino-2,2-dimethylheptanoyl) 3´-acetylthymidine)(compound 10, 4.4 g), 트리에틸아민(triethylamine)(4 mL) 및 4-메톡시트리틸 클로라이드(4-methoxytrityl chloride)(7.5 g)를 피리딘(100 mL) 안에서 10시간동안 교반시켰다. 메틸아민(Methylamine)(40%, 10 mL)을 첨가하고, 상기 용액을 2시간동안 교반시켜 주었다. 상기 혼합물을 이탄산 수화나트륨(aqueous sodium bicarbonate (500 mL))에 부은 후, 다이클로로메탄(dichloromethane)(500 ml)으로 추출하였다. 상기 유기물층을 농축하였다. 잔여물을 실리카 겔 컬럼으로 정제한 다음, 다이클로로메탄(dichloromethane)에 들어있는 5% 메탄올로 용출하여 무색의 고체로서 화합물 11을 수득하였다(4.9 g, 수득률 71%).

실시예 10. 화합물 12:

아세토니트릴(acetonitrile)(50 mL)에 들어있는 5´-(7-[(MMT-아미노)-2,2- 다이메틸헵타노일] 티미딘(5´-(7-[(MMT-amino)-2,2-dimethylheptanoyl] thymidine)(화합물 11, 4.9 g), N,N-테트라이소프로필-시아노에틸 포스포르아미디트(N,N-tetraisopropyl-cyanoethyl phosphoramidite)(3 g) 및 테트라졸(tetrazole)(0.5 g)를 밤새 교반시켰다. 상기 혼합물을 이탄산 수화나트륨(aqueous sodium bicarbonate (500 mL))에 부은 후, 다이클로로메탄(dichloromethane)(500 ml)으로 추출하였다. 상기 유기물층을 농축하였다. 잔여물을 실리카 겔 컬럼으로 정제한 다음, 50% 에틸 아세트산으로 용출하여 무색의 고체로서 화합물 12를 수득하였다(4.5 g, 수득률 71%).

실시예 11. 화합물 14:

화합물 12 를 올리고 합성에서 마지막 단일체로서 사용하기 위하여 트리링크 바이오테크놀로지 사,CA로 옮겼다. Mmt기는 상기 합성 후에 탈보호되고, 상기 올리고를 RP-HPLC에 의하여 정제하여, PEG 결합을 위한 자유 아민이 포함된 화합물 14를 수득하였다.

실시예 12. 화합물 15:

PBS 버퍼(5 mL, pH 7.8)에 포함되어 있는 화합물 14 용액에 30kSCPEG (520 mg, 17 mol)을 첨가하고, 상온에서 5시간동안 교반시켰다. 상기 반응 혼합물을 물로 50 mL까지 희석시킨 다음 20 mM Tris-HCl 버퍼, pH 7.0 (A 버퍼)로 전-평형화시킨 포로스 HQ, (Poros HQ), 강력 음전하 교환 컬럼(strong anion exchange column (10 mm × 1.5 mm, bed volume ~ 16 mL))에 로드(load)하였다. 상기 컬럼을 과량의 PEG 링커를 제거하기 위하여 3-4배 컬럼 부피의 A 버퍼로 세척하였다. 그 후, 생산물을 20 mM Tris-HCl 버퍼, pH 7.0에 들어있는 0 내지 100 % 농도구배(gradient)의 1 M NaCl, B 버퍼로 10분간, 100%의 B 버퍼를 10 mL/min의 유속으로 흘려 용출하였다. 상기 용출물을 하이프렙 탈염 컬럼(HiPrep desalting column (50 mL))을 사용하여 탈염하고, 감압하에 동결 건조하여 화합물 15를 수득하였다. 6 mg을 수득하였다(올리고 당량(oligo equivalent), 60%)

실시예 13. 화합물 16:

PBS 버퍼(5 mL, pH 7.8)에 들어있는 화합물 14(10 mg, 1.7 mol) 용액에 m30PEG-RNL8a-NHS (520 mg, 17 mol)을 첨가하여 상온에서 5시간 동안 교반시켜주었다. 상기 반응 혼합물을 물로 50 mL까지 희석시킨 다음 20 mM Tris-HCl 버퍼, pH 7.0 (A 버퍼)로 전-평형화시킨 포로스 HQ, (Poros HQ), 강력 음전하 교환 컬럼(strong anion exchange column (10 mm × 1.5 mm, bed volume ~ 16 mL))에 로드(load)하였다. 상기 컬럼을 과량의 PEG 링커를 제거하기 위하여 3-4배 컬럼 부피의 A 버퍼로 세척하였다. 그 후, 생산물을 20 mM Tris-HCl 버퍼, pH 7.0에 들어있는 0 내지 100 % 농도구배의 1 M NaCl, B 버퍼로 10분간, 100%의 B 버퍼를 10 mL/min의 유속으로 흘려 용출하였다. 상기 용출물을 하이프렙 탈염 컬럼(HiPrep desalting column (50 mL))을 사용하여 탈염하고, 감압하에 고체로 동결 건조하였다. 5 mg을 수득하였다(올리고 당량(oligo equivalent), 50%).

실시예 14. 화합물 17:

Boc-ext-아민(Boc-ext-amine)(1.7 g, 6.4 mmol, 1 eq)을 4 mL의 DMF에 녹였다. 상기 용액을 15 mL의 포화된 탄산수소나트륨 수용액에 첨가한 다음, 0 °C로 냉각시켰다. 그러고 나서, 말레이미드(Maleimide)(1 g, 6.4 mmol, 1 eq)을 첨가하고, 상기 반응 혼합물을 30 mL의 물을 첨가하면서 15분 간 교반시켜주었다. 상기 반응을 0 °C에서 20분간 교반시키면서 계속해주었다. pH는 황산을 첨가하여 3.5로 맞추어주었고, 다이클로로메탄(dichloromethane)으로 추출한 세가지 추출물을 첨가하였다. 상기 화합된 유기물 층을 0.1 N HCl로 한번 세척하고, 염수로 한번 더 세척한 후, 건조하여 진공기에서 증발시켰다. 상기 정제되지않은 생산물을 에틸 아세트산/헥세인(Ethyl Acetate/Hexane)(8:2, v/v)으로 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다:

¹³C NMR δ28.28, 36.86, 40.19, 67.58, 69.67, 70.00, 78.86, 133.89, 155.63, 170.31.

실시예 15. 화합물 18:

상온의 5 mL 무수의 DCM에 들어있는 Boc0ext-말레이미드(Boc-ext-maleimide)(0.1 g)에 TFA (2.5 mL)를 첨가하였다. 상기 반응을 TLC를 이용하여 관찰하였고, 1.5 시간이 지난 후 완료되는지 확인하였다. 상기 용매를 진공관에서 증 발시킨 후 화합물 18을 수득하였다:

¹³C NMR δ 37.26, 39.98, 66.12, 68.36, 69.77, 69.83, 134.11, 160.44, 171.01.

실시예 16. 화합물 19:

50 mL의 무수의 DCM에 들어있는 Bsmoc-Gly (0.5 g, 1.7 mmol, 1 eq) 및 3-5-다이메틸-4-하이드록시--벤질-OTBS (3,5-dimethyl-4-hydroxy-benzyl-OTBS)(0.448 g, 1.7 mol, 1 eq)에 DMAP (0.042 g, 0.34 mol, 5 eq)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 0 °C로 냉각시킨 후, EDC (0.408 g, 0.002125 mmol, 0.8 eq)를 첨가하였다. 상기의 결과적인 혼탁한 용액을 상온으로 데워 밤새 교반시켜주었다. 상기의 깨끗한 반응 용액을 0.1 N HCl 및 물로 세척하여주었다. 상기 화합된 유기물 층을 MgSO₄로 건조시키고, 필터한 후, 진공관에서 증발시켜 화합물 19를 수득하였다:

¹³C NMR (CDCl₃-CD₃OD, 1:1, v/v) δ 42.10, 56.49, 120.93, 125.21, 129.66, 130.00, 130.18, 133.60, 136.37, 138.63, 155.74, 171.31.

실시예 17. 화합물 20:

5 mL 무수의 DCM에 들어있는 화합물 19 (0.089 g, 0.163 mmol, 1.2 eq) 용액에 상온에서 4-하이페리디노-피페리딘(4-piperidino-piperidine)(0.0247 g, 0.147 mmol, 0.9 eq)을 첨가하였다. 상기 반응을 TLC를 사용하여 관찰하였고, 4시간 후에 완료되었을 때, 20K 8arm-SCPEG (2.72 g, 0.136 mmol)를 첨가하였다. 상기 반응을 상온에서 밤새 교반시켜주었다. 상기 용매를 진공관에서 일부 증발시키고, 결과적인 잔여물을 DMF/IPA에서 고체로 재결정시켜 화합물 20을 수득하였다:

¹³C NMR δ-5.53, 16.02, 18.05, 25.04, 25.62, 42.01, 63.87, 63.95, 67.31-72.85 (PEG), 125.66, 129.14, 138.36, 146.02, 151.00, 155.96, 167.65, 168.112.

실시예 18. 화합물 21:

화합물 20 (1.07g, 0.05 mmol, 1 eq) 및 아미노-3,6-다이옥사옥타노익 말레이미드(amino-3,6-dioxaoctanoic maleimide)(0.60 g, 1.75 mmol, 35 eq)를 0 mL DCM에 녹이고, 얼음 수조에서 냉각시켰다. DIPEA (0.609 mL, 5.5 mmol, 70 eq)를 pH가 7-8에 도달할 때까지 첨가하였다. 상기 반응을 6.5시간 동안 상온에서 시키고 나서 인 바큐오(in vacuo)에서 용매의 일부를 제거시켰다. 고체를 에테르로 침전시킨 다음, 플라스크를 냉장고에서 밤새 보관하였다. 상기 고체를 필터한 다음, DMF/IPA로 재결정화시켜 화합물 21을 수득하였다:

¹³C NMR δ-5.30, 16.28, 18.32, 25.86, 36.90, 40.67, 42.30, 63.72, 64.27, 67.64, 69.23-71.28 (PEG), 125.98, 129.39, 133.92, 138.76, 146.24, 156.08, 167.79, 170.34.

실시예 19. 화합물 22:

화합물 21(0.95 g)을 4 mL CH₃CN 및 2 mL 물에 녹이고, 10 mL 아세트산을 더하였다. 상기 혼합물을 상온에서 밤새 교반시킨 후, 인 바큐오(in vacuo)에서 용매를 제거하였다. 상기 고체를 에테르(ether)로 침전시키고, DMF/IPA로부터 재 결정화하여 알콜을 수득하였다: ¹³C NMR δ 15.93, 36.58, 40.35, 41.98, 63.37, 63.60, 67.31, 68.21-70.88 (PEG), 126.46, 129.31, 133.69, 138.67, 146.27, 155.79, 167.58, 170.05. 탈보호된 벤질 알콜(benzyl alcohol)(1 g, 0.05 mmol, 1 eq)을 2 mL DMF 및 20 mL DCM에 녹인 후, 0℃ 로 냉각시켰다. DSC (0.1024 g, 0.4 mmol, 8 eq) 및 피리딘(pyridine)(0.029 ml, 0.36 mmol, 7.2 eq)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 점차적으로 밤새 상온으로 데웠다. 용매의 일부를 인 바큐오(in vacuo)에서 제거시킨 후, 에테르로 고체로 침전시켰다. 그러고 나서, 상기 정제되지 않은 생산물을 DMF/IPA로 재결정화시켰다:

¹³C NMR δ16.13, 25.24, 36.79, 40.56, 42.21, 63.61, 64.16, 67.54, 69.52-71.29 (PEG), 126.76, 128.56, 130.42, 133.86, 148.01, 155.99, 167.56, 168.20, 170.26.

실시예 20. 화합물 23a-I-R1 (n = 8, Oligo I = siRNA, R1 = -C-TAT):

화합물 22a (737 mg, 0.0369 mmol)를 pH 7.4의 10 × PBS 버퍼 30 mL에 들어 있는 siRNA (50 mg, 0.00368 mmol)와 반응시켰다. 반응을 상온에서 4시간동안 시켰다. 정제되지 않은 물질을 이동상 A: 20 mmol Tris, pH 7.0 및 B: 20 mmol Tris, 2M NaCl, pH 7.0 으로 포로스(Poros)에서 정제한 다음, pH 7.0 인산염 버퍼로 탈염시켰다. Yield 16.6 mg (oligo eq)을 수득하였다. 그러고 나서, 15mg (ologo eq)의 상기 물질을 7 mL의 pH 7.0 인산염 버퍼에 녹였다. SH-TAT (64mg, 0.039mmol)를 질소상태에서 첨가하였다. 상기 반응을 1.5시간 동안 시켜준 뒤, 소스 15S 레진(Source 15S resin)으로 정제하였다. 컬럼은 A 버퍼(5M urea, 100mM KH₂PO₄, 25% CH₃CN, pH 6.5)로 평형화 시켜주었다. 상기 생산물을 B 버퍼(2M KBr)로 용출시켰다. 생산물을 모아 하이프렙 탈염 컬럼(HiPrep desalting column (50 mL))을 사용하여 탈염하고, 감압 하에 동결 건조하였다. 2.4 mg을 수득하였다(oligo eq).

실시예 20A. 화합물 23a-II-R1 (n = 8, Oligo II = FITC-Genasense, R1 = -C-TAT):

화합물 22a를 FITC-제네센스(FITC-Genasense)와 반응시키고, HS-C-TAT과 실시예 20에서 기술한 것과 같은 반응 조건에서 반응시켜 생산물을 수득하였다.

실시예 20B: 화합물 23a-II-R2 (n = 8, Oligo II = FITC-Genasense, R1 =-C-Arg9):

화합물 22를 FITC-Genasense와 반응시킨 후, 실시예 20에 기재된 조건과 동 일하게 HS-C-Arg9와 반응시켜, 생성물을 수득하였다.

실시예 20B. 화합물 23a-II-R2 (n = 8, Oligo II = FITC-Genasense, R1 = -C-Arg ₉ ):

화합물 22a를 FITC-제네센스(FITC-Genasense)와 반응시키고, HS-C-Arg₉과 실시예 20에서 기술한 것과 같은 반응 조건에서 반응시켜 생산물을 수득하였다.

실시예 21. 화합물 24.

8-아미노-3,6-디옥사옥타노산 트리플루오로 아세트산염(8-Amino-3,6-dioxaoctanoic acid trifluoro acetic acid salt; 0.50 g, 0.18 mmol)을 12 mL 아세토니트릴/물(1/1)에 용해시켰다. 상기 용액의 pH는 ~4였다. TEA를 첨가하여 pH를 8-9로 조정하였다. 상기 pH는 8-9로 유지되었다. Bsmoc-OSu (0.61 g, 0.18 mmol)를 추가한 후, pH는 6으로 떨어졌다. TEA를 좀 더 추가하여 pH를 다시 8-9로 조정하였다. 상기 반응 혼합물을 상온에서 45분간 교반하였고, 반응 말기 pH를 8-9로 유지시켰다. 상기 반응 혼합물을 물(5 mL)로 희석하고, 잔존 출발 물질을 제거하기 위하여, DCM으로 추출하였다.수용층(aqueous layer)은 0.1N 염산으로 산성화시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층(organic layer)을 분리하고 소금물로 세척한 후, 황산나트륨으로 건조하고 진공하에 증발시켜 옅은 노란색 오일인 화합물 24((0.45g, 65% 수율)를 수득하였다:

¹³CNMRδ173.3,156.1,139.5,137.2,134.1,130.8,130.7,134.1,130.8,130.4,130.3,125.8,121.7,71.4,70.4,70.3,68.8,57.1,41.3,25.8.

실시예 22. 화합물 25:

40 mL의 무수 DCM 내에 화합물 24(0.41g,0.107mmol) 및 3,5-디메틸-4-하이드록시-벤질-OTBS(3,5-dimethyl-4-hydroxy-benzyl-OTBS; 0.283g,0.107mmol)가 포함된 용액에 DMAP(26mg,0.021mmol)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 0℃로 냉각하고 나서, EDC를 추가하였다. 상온에서 20시간동안 교반하여 반응시켰다. 상기 혼합물을 물로 희석하고 DCM으로 추출한 후, 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 진공하에서 증발시켜 0.65g의 조제품(crude product)을 수득하였다. 에틸 아세테이트/헥산(1:1, v/v)으로 용출시켜 실리카 겔 컬럼으로 정제하여 화합물 25(0.59g,88% 수율:

¹³CNMRδ168.2,155.4,146.2,139.5,138.9,136.9,129.4,126.2,125.2,121.3,70.2,69.9,68.1,64.4,56.4,41.1,26.1,25.9,18.5,16.6,16.5.

실시예 23. 화합물 26:

200 mL의 무수 DCM 내에 화합물 25(363mg,0.6mmol,1.2eq)가 포함된 용액에 4-피페리디노-피페리딘(4-piperidino-piperidine; 90.9mg,0.54mmol,0.9eq)을 상온에서 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 TLC로 모니터링하고 4시간후 완료시점에 20K-8arm-SCPEG(10g,0.5mmol,1eq)를 추가하였다. 하룻밤동안 상온에서 교반하여 반응시켰다. 용매는 부분적으로 진공하에서 증발시켰고, 그 결과 발생한 잔류물(residue)을 에테르로 침전시키고 나서, DMF/IPA로부터 고체성분을 재결정화하여 화합물 26(9.1g)을 수득하였다:

¹³CNMR(75.4MHz,CDCl3):δ-5.35,16.28,18.26,25.25,25.80,40.56,61.40,63.66,64.16,(68.05-73.64,PEG),125.92,129.26,138.64,145.99,151.21,156.01,167.88,168.20.

실시예 24. 화합물 27:

DIEA 아민 (5.6 mL, 32.2 mmol, 70 eq)을 200 mL 무수 DCM 내에 화합물 26(9.2g,0.46mmol,1eq) 및 아미노-3,6-디옥사옥타노익 말레이미드(amino-3,6-dioxaoctanoicmaleimide; 5.5g,16.1mmol,35eq)가 함유된 용액에 0℃에서 pH가 7-8에 다다를 때까지 추가하였다. 반응은 상온에서 5시간동안 진행시켰고, 그리고나서 진공하에서 용매를 부분적으로 제거하였다. 그 후, 잔류물에 에틸 에테르를 추가하여 침전시키고, 냉장고에서 하룻밤동안 플라스크내에 보관하였다. 고형분을 여과하고 DMF/IPA로 재결정화하여 화합물 27(7g)을 수득하였다:

¹³CNMRδ-5.69,15.90,17.87,25.45,36.44,40.20,42.30,63.19,64.36,67.14,68.05-72.68(PEG),125.51,128.88,133.57,138.19,145.64,155.64,167.45,169.90.

실시예 25. 화합물 28:

화합물 27(7g)을 50 mL 아세토니트릴 및 11 mL 물에 용해시킨 후, 22 mL의 아세트산을 추가하였다. 상기 용액을 실온에서 하룻밤동안 교반한 후, 진공하에서 용매를 제거하였다. 잔류물을 에테르로 침전시키고나서, DMF/IPA로부터 재결정화하였다. ¹³CNMRδ15.97,36.58,40.33,63.35,63.60,67.29,69.08-71.06(PEG),126.50,129.20,133.68,138.73,146.27,155.76,167.55,170.03. 상기 비보호된(deprotected) 화합물(7 g, 0.35 mmol, 1 eq)을 14 mL DMF 및 140 mL 디클로로메탄에 용해시키고나서, 상기 용액을 0℃로 냉각하였다. DSC (717 mg, 2.8 mmol, 8 eq) 및 피리딘(pyridine; 0.204 mL, 2.52 mmol, 7.2 eq)을 추가하였다. 상기 반응 혼합물을 하룻밤동안 점차적으로 실온까지 온도를 상승시켰다. 용매를 진공하에 부분적으로 제거하고나서, 에틸 에테르로 고형분을 침전시켰다. 조 고형분(crude solid)을 DMF/IPA로부터 재결정화하였다.

¹³CNMRδ16.13,22.40,25.18,36.73,40.50,42.32,63.54,67.47,69.24-71.20(PEG),126.70,128.53,130.27,133.81,148.01,155.93,167.55,168.17,170.20.

실시예 26. 화합물 29:

화합물 28(1.5g,0.075mmol)을 HIF1-α (20mg, 0.0036mmol)가 함유된 8mL의 pH 7.8 인산염버퍼(phosphate buffer)와 반응시켰다. 반응은 실온에서 2시간동안 수행하였다. 조 물질(crude material)을 Source 15Q resin으로 정제하였다. 컬럼은 버퍼 A(5M urea, 100mM KH₂PO₄,25% CH₃CN,pH 6.5)로 평형화시켰다. 산물은 버퍼 B(2M KBr)로 용출시켰다. 수집된 산물은 물을 이용하여 HiPrep desalting column으로 탈염시키고 동결시켰다. 17.7 mg(oligo eq)의 산물이 생산되었다. 상기 산물 중 8.85mg(oligo eq)을 HS-TAT 93mg이 녹아있는 5 mL의 pH 7.0 인산염버퍼와 반응시켰다. 상기 산물을 Source 15S 레진으로 정제하고 탈염하였다. 수율 1.7 mg(oligo eq).

실시예 27. 화합물 30:

4N HCl이 녹아있는 디옥산(dioxane; 70 mL) 용액을 BocCys(NPys)-OH (1, 5g, 13.32 mmol)에 추가하였다. 상기 현탁액을 실온에서 3시간동안 교반하고나서 700 mL의 에틸 에테르에 혼합하였다. 끝까지 진공을 적용하지 않은 상태로 코스 프리티드 깔대기(cource fritted funnel)를 통해 고형분을 제거하였다. 침전물(cake)을 에틸 에티르(3× 50 mL)으로 세척하고 나서, 하룻밤동안 실온에서 진공하에 건조시켰다.

¹HNMR(CD3OD)δ8.93(1H,dd,J=1.5,4.7Hz),8.66(1H,dd,J=1.5,8.20Hz),7.59(1H,dd,J=4.7,8.2Hz),4.24(1H,dd,J=4.1,9.4Hz),3.58(1H,dd,J=4.1,14.9Hz),3.36(1H,dd,J=9.4,15.2Hz).¹³CNMR(75.4MHz,CDCl3):δ169.40,156.27,154.64,144.13,135.246,123.1 0,52.77,39.27.

실시예 28. 화합물 31a:

화합물 30((1.82g,5.55mmol)이 녹아있는 DMF/DCM (25 mL/45 mL)에 ^20K8arm-PEG-SC(7.30g,0.35mmol)를 추가하였다. 그리고나서, DIEA를 추가하고(3 mL, 16.8 mmol), 그결과로 생기는 현탁액을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 진공하에서 증발시키고나서, 0℃에서 DCM/Et₂O로 침전시켰다. 고형분을 여과시키고나서 80 mL의 DCM에 용해시켰다. 20mL의 0.1N HCl을 첨가한 후, 상기 혼합물을 5분동안 교반하고나서, 분리 깔대기로 옮겨, 유기층을 분리하고, 0.1N HCl (20 mL) 및 소금물(20mL)로 재세척하였다. 상기 유기층은 황산마그네슘으로 건조시켰고, 여과하여, 진공하에서 증발시켰다. 잔류물을 DCM/t₂O로 0℃에서 침전시켰다. 고형분을 여과하고, 30℃ 진공 오븐에서 최소 2시간동안 건조시켰다:

¹³CNMRδ170.90,156.66,155.68,153.86,142.41,133.85,121.24,72.96-69.30,64.08,53.01,41.82.

실시예 29. 화합물 31b:

화합물 30(765mg,2.33mmol)이 녹아있는 DMF/DCM(20mL/40mL) 용액에 ^20K4arm-PEG-SC(6.0g,0.29mmol)를 추가하였다. 그리고나서, DIEA를 추가하고(1.2 mL, 6.96 mmol), 그 결과로 생기는 현탁액을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 진공하에서 증발시키고나서, DCM/Et₂O로 침전시켰다. 고형분을 여과시키고나서 80 mL의 DCM에 용해시켰다. 15mL의 0.1N HCl을 첨가한 후, 상기 혼합물을 5분동안 교반하고나서, 분리 깔대기로 옮겨, 유기층을 분리하고, 0.1N HCl (15 mL) 및 소금물(15mL)로 재세척하였다. 상기 유기층은 황산마그네슘으로 건조시켰고, 여과하여, 진공하에서 증발시켰다. 잔류물을 DCM/t₂O로 침전시켰다. 고형분을 여과하고, 30℃ 진공 오븐에서 최소 2시간동안 건조시켰다:

¹³CNMRδ170.76,156.53,155.57,153.85,142.37,133.79,121.23,72.44-69.30,63.99,52.95,45.36,41.82.

실시예 30. 화합물 32a-I (n = 4, Oligo I = LNA Survivin):

C6-티오-LNA-설비빈(C6-thio-LNA-survivin; 120 mg, 0.021 mmol)이 녹아있는 60 mL pH 6.5 인산염버퍼에 화합물 31a(2.3mg,0.107mmol)를 첨가하고, 상기 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 진행은 음이온-교환 HPLC에 의해 확인하였다. 반응 혼합물은 0.2 마이크론필터를 통해 여과하고 Poros 음이온-교환 컬럼에 적하하였다. pH 7.0에서 20mM Tris. HCl 2M NaCl 버퍼 시스템을 이용한 구배로 산물을 용출시켰다. 탈염 후 수율은 80 mg(oligo eq)이었다.

실시예 30A: 화합물 32b-I (n = 4, Oligo I = LNA Survivin):

C6-티오-LNA-설비빈(C6-thio-LNA-survivin; 300 mg, 0.054 mmol)이 녹아있는 150 mL pH 6.5 인산염버퍼 용액에 화합물 31b (4.8g,0.273mmol)를 첨가하고, 상기 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 진행은 음이온-교환 HPLC로 확인하였다. 반응 혼합물을 0.2 마이크론 필터로 여과하고, Poros 음이온-교환 컬럼에 적하하였다.pH 7.0에서 20mM Tris. HCl 2M NaCl 버퍼 시스템을 이용한 구배로 산물을 용출시켰다. 탈염 후 수율은 225 mg(oligo eq)이었다.

실시예 31. 화합물 33a-I-R1 (n = 8, Oligo I = LNA Survivin, R = R1 = -C-TAT):

화합물 32a(80m goligo eq,0.0142mmol)를 20 ml 버퍼(5M urea,100mM KH₂PO₄)에 용해시켰다. 상기 용액을 질소하에서 0℃로 냉각하고나서, 펩타이드 C-TAT(329mg,0.198mmol)를 첨가하였다. 짙은 노란색이 관찰되었다. 0℃에서 질소 분위기하에서 1.5 시간 동안 교반하고 나서, Source 15S 레진을 이용한 양이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 컬럼(10mm× 10mm)은 3개의 컬럼 부피에 대하여 버퍼 A(5M urea,100mM KH₂PO₄,25% CH₃CN,pH 6.5)로 평형화시키고나서, 상기 샘플을 컬럼에 적하하였다. 버퍼 B(2M KBr)로 산물을 용출시켰다. 상기 수집된 산물을 동결건조하고, 50mM pH 7.4 PBS 버퍼로 HiPrep 탈염 컬럼 상에서 탈염시켰다. 그리고나서, 상기 탈염된 용액을 약 1 mg/mL (oligo eq) 용액으로 농축시켰다. 산물 수율 21.75mg(oligo eq).

실시예 31A. 화합물 33a-I-R2 (n =84, Oligo I = LNA Survivin, R = R2 = -C-Arg9):

화합물 32a를 실시예 31에 기재된 것과 동일한 조건으로 C-Arg9와 반응시켜, 산물을 수득하였다.

실시예 31B. 화합물 3a-I-R3 (n =84, Oligo I = LNA Survivin, R = R3 = -C-TAT-RGD):

화합물 32a를 실시예 31에 기재된 것과 동일한 조건으로 C-TAT-RGD와 반응시켜, 산물을 수득하였다.

실시예 31C. 화합물 33b-I-R1 (n = 4, Oligo I, R = R1 = -C-TAT):

화합물 32b(20mg oligo eq,0.0035 mmol)를 10ml의 버퍼(5M urea,100mM KH₂PO₄)에 용해시켰다. 상기 용액을 질소 하에서 0℃로 냉각하고 나서, 펩타이드 C-TAT(52mg,0.0315mmol)를 첨가하였다. 진한 노란색이 관찰되었다. 0℃에서 질소하에 1.5시간동안 교반하고나서, Source 15S 레진을 이용한 양이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 컬럼(10mm× 10mm)은 3개의 컬럼 부피에 대하여 버퍼 A(5M urea,100mM KH₂PO₄,25% CH₃CN,pH 6.5)로 평형화시키고나서, 상기 샘플을 컬럼에 적하하였다. 버퍼 B(2M KBr)로 산물을 용출시켰다. 상기 수집된 산물을 동결건조하 고, 50mM pH 7.4 PBS 버퍼로 HiPrep 탈염 컬럼 상에서 탈염시켰다. 그리고나서, 상기 탈염된 용액을 약 1 mg/mL (oligo eq) 용액으로 농축시켰다. 산물 수율 12.5mg(oligo eq).

실시예 32. 화합물 34:

8arm^20K-SCPEG(1eq)이 녹아있는 DMF 용액에 펩타이드 (16 eq)를 첨가하였다. 그리고나서, DIEA를 첨가하고(32 eq), 그 결과인 현탁액을 5시간동안 실온에서 교반하였다. 상기 반응혼합물을 DCM/Et₂O로 0℃에서 침전시켰다. 고형분을 여과시키고 나서, 물에 용해시켰다. C18 역상 크로마토그래피를 이용하여 조 고형분을 정제하였다. 산물 피크를 수집하고 동결하여 고체화하였다.

실시예 33. 화합물 35:

화합물 34를 2% 히드라진(hydrazine)이 함유된 DMF 용액에 첨가하고, 상기 용액을 실온에서 4시간동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 역상 컬럼에 적하하여 정제하였다. 상기 산물 피크를 수집하고 동결건조시켰다.

실시예 34. 화합물 36:

화합물 35(1 eq)를 20ml 버퍼(5M urea,100mM KH₂PO₄)에 용해시켰다. 상기 용액을 질소하에서 0℃로 냉각하고나서, Oligo-SH(8 eq)를 첨가하였다. 0℃에서 질소 하에 1.5시간동안 교반하고나서, Source 15S 레진을 이용한 양이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 컬럼(10mm× 10mm)을 3개의 컬럼 부피에 대하여 버퍼 A(5M urea,100mM KH₂PO₄,25% CH₃CN,pH 6.5)로 평형화시키고나서, 상기 샘플을 컬럼에 적하하였다. 버퍼 B(2M KBr)로 산물을 용출시켰다. 상기 수집된 산물을 동결건조하고, 50mM pH 7.4 PBS 버퍼로 HiPrep 탈염 컬럼 상에서 탈염시켰다. 그리고나서, 상기 탈염된 용액을 약 1 mg/mL (oligo eq) 용액으로 농축시켰다.

실시예 35. 화합물 37:

20k-8arm-PEG 숙신이미딜 카보네이트(succinimidyl carbonate) (1eq)이 녹아있는 디클로로메탄 용액에 H-Cys(StBu)-OH 염산염(hydrochloride salt) (1 eq) 및 디이소프로필에틸아민(diisopropylethylamine)(1 eq)을 첨가하였다. 상기 용액을 약 5시간동안 실온에서 교반하였다. 상기 용매를 부분적으로 제거하고나서, 에틸 에테르로 침전시켰다. 여과에 의해 조 산물을 수집하고 2-프로판올로부터 결정화하였다.

실시예 36. 화합물 38:

화합물 37(1 eq) 및 아미노-3,6-디옥사옥타노익 말레이미드(amino-3,6-dioxaoctanoicmaleimide; 35eq)를 디클로로메탄에 용해시킨후, 얼음 수조에서 상기 용액을 냉각시켰다. 디이소프로필에틸 아민(diisopropylethyl amine; 70 eq)을 pH 가 7-8에 이를때까지 첨가하였다. 반응은 실온에서 6.5시간동안 진행시켰고, 이후 진공하에서 용매를 부분적으로 제거하였다. 그리고나서, 에테르에 의해 고형분을 제거하고, 플라스크에 담아 하룻밤동안 냉장고에 저장하였다. 그 후, 고형분을 여과하고, DMF/IPA로부터 재결정화하하였다.

실시예 37. 화합물 39:

화합물 38(215mg, 0.011mmol,1eq)을 버퍼(5M urea,100mM KH₂PO₄)에 용해시켰다. 상기 용액을 질소하에서 0℃로 냉각하고나서, SH-TAT(250 mg,14 eq)를 첨가하였다. 0℃에서 질소하에 1.5시간동안 교반하고나서, Source 15S 레진으로 정제하였다. 컬럼을 버퍼 A(5M urea,100mM KH₂PO₄,25% CH₃CN,pH 6.5)로 평형화시켰다. 버퍼 B(2M KBr)로 산물을 용출시켰다. 상기 수집된 산물을 동결건조하고, 50mM pH 7.4 PBS 버퍼로 HiPrep 탈염 컬럼 상에서 탈염시켰다. 그리고나서, 상기 탈염된 용액을 약 1 mg/mL (oligo eq) 용액으로 농축시켰다.

실시예 38. 화합물 40:

화합물 39(1 eq)가 녹아있는 수용액에 디티오트레이톨(dithiothritol)(2 eq)을 첨가하였다. 상기 용액을 2시간동안 실온에서 교반하고나서, 용매를 제거하였다. 이소프로판올로 조물질(crude material)을 결정화시키고나서, Oligo-S-S-Py(3 eq)가 녹아있는 100mM, pH 6.5 인산염 버퍼와 실온에서 2시간 동안 혼합하였다. 반 응물을 Source 15S 레진으로 정제하였다. 컬럼은 버퍼 A(5M urea,100mM KH₂PO₄,25% CH₃CN,pH 6.5)로 평형화시켰다. 버퍼 B(2M KBr)로 산물을 용출시켰다. 상기 수집된 산물을 동결건조하고, 50mM pH 7.4 PBS 버퍼로 HiPrep 탈염 컬럼 상에서 탈염시켰다. 그리고나서, 상기 탈염된 용액을 약 1 mg/mL (oligo eq) 용액으로 농축시켰다.

실시예 39. 화합물 41:

20k 8armPEG-OH (2.0 g, 0.1 mmol)를 DCM(20mL)에 용해시켰다. TEA((1.62 g, 16.0 mmol)를 첨가하였다. 상기 용액에 아크릴로일 클로라이드(acryloyl chloride) (0.724 g)가 녹아있는 DCM(10 mL)을 0℃에서 1시간동안 첨가하였다. 상기 반응혼합물을 0℃에서 하룻밤동안 교반하였다. 상기 용액을 0℃에서 IPA/에테르 (250 mL/250 mL)에 첨가하였다. 형성된 고형분을 여과하였다. 상기 고형분을 DCM에 용해시키고, 0.4N HCl로 세척하였다. 유기층을 황산마그네슘으로 건조시키고, 셀라이트를 통해 여과하였다. 용매를 제거하고 잔류물을 DCM/에테르로부터 재결정화하였다.¹³CNMR(75.4MHz,CDCl3):δ165.5,130.5,127.8,71.0-67.1(PEG),63.2.

실시예 40. 화합물 42:

C6-티오-LNA-설비빈(C6-thio-LNA-survivin) (100 mg, 0.018 mmol)이 녹아있는 60 mL pH 8.0 인산염버퍼 용액에 화합물 41(3.6g,0.18mmol)을 첨가하였고, 상기 용액을 실온에서 1시간동안 교반하였다. 반응은 음이온-교환 HPLC에 의해 확인하였다. 상기 반응 혼합물을 0.2 마이크론 필터를 통해 여과하고, Poros 음이온-교환 컬럼 상에 적재하였다. pH 7.0에서 20mM Tris. HCl 2M NaCl 버퍼 시스템을 이용한 구배로 산물을 용출시켰다. 탈염후 수율은 60 mg(oligo eq)이었다.

실시예 41. 화합물 43:

화합물 42(8mg,0.0014mmol,oligo eq)를 질소 하에서 SH-TAT-RGD(111mg,0.0496mmol)가 녹아있는 3 mL 버퍼(5M urea,100mM KH₂PO₄)와 혼합하였다. 반응은 2시간동안 진행하였다. 조산물을 Source 15S 레진으로 정제하였다. 컬럼은 버퍼 A(5M urea,100mM KH₂PO₄,25% CH₃CN,pH 6.5)로 평형화시켰다. 버퍼 B(2M KBr)로 산물을 용출시켰다. 상기 수집된 산물을 HiPrep 탈염 컬럼 상에서 탈염시키고, 동결건조하여 57을 수득하였다.

실시예 42. 화합물 46:

1,2-디(피리딘-2-일)디설판(1,2-di(pyridin-2-yl)disulfane; 화합물 44)(8.8g,39.9mmol)이 녹아있는 50 mL 무수 에틸아세테이트에 3-머캅토프로판산(3-mercaptopropanoic acid)(4.2g,39.9mmol)을 첨가하였다. 어두운 곳에서 5시간동안 상기 용액을 교반한 후, 여과하였다. 그리고 나서, 50 mL의 차가운 에틸아세테이트를 고형분에 첨가하였다. 그 후, 여과물을 회전증발시켜 약 50 mL 화합물 45 용액 을 제조하였다. 상기 용액에 t-부틸 카르바제이트(t-butyl carbazate)(4.8g, 36.3 mmol)을 첨가한 후, CDD(7.5 g, 36.3 mmmol)을 첨가하였다. 상기 용액을 어두운 곳에서 16시간 동안 교반하고나서, 여과하고, 증발시키고, 1:1 헥산/에틸아세테이트 혼합물을 이용하여 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여, 8.1 g의 산물, 화합물 46을 수득하였다.

¹³CNMRδ170.1,158.9,155.2,149.5,137.0,121.1,120.4,81.5,34.9,33.7,28.2.

실시예 43. 화합물 47:

tert-butyl2-(3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoyl)hydrazinecarboxylate(화합물 46)(8.1g,24.6mmol)가 녹아있는 64mL DCM에 16mL TFA를 0℃에 추가하였다. 상기 용액을 1시간동안 실온에서 교반하였다. 반응이 완료된 후 용매를 회전증발시키고, 그 후 잔류물을 0℃에서 20/300 mL의 CDM/Et₂O로 침전시켰다. 고형분을 여과하고 건조하여 5.5 g의 화합물 47을 수득하였다.

¹³CNMRδ173.8,159.6,147.9,138.5,121.1,120.7,33.4,32.2.

실시예 44. 화합물 49:

3,3-디에톡시프로판-1-아민(3,3-diethoxypropan-1-amine)(화합물 48) (5.2g,35.3mmol)이 녹아있는 30 mL DCM에 Fmoc-OSu(24g,70.6mmol)을 0℃에서 첨가 하고나서, 실온으로 온도를 높였다. 상기 용액을 출발물질이 TLC에 의해 관찰되지 않을 때까지 실온에서 2시간동안 교반시켰다. 상기 반응액을 30 mL 탈이온수로 희석시켰다. 2× 30 mL DCM으로 수용층을 추출하고, 이후 유기층을 무수 황산 마그네슘으로 건조시키고, 여과하여 농축하였다. 조물질을 용출 용매로 DCM을 이용한 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 5.7g의 화합물 49를 수득하였다. ¹³CNMRδ156.2,143.9,141.2,127.5,126.9,125.0,119.8,102.2,66.5,61.8,47.3,37.2,33.3,15.4.

실시예 45. 화합물 50:

화합물 49(200mg)을 86% 포름산(1.1 mL)에서 1시간동안 실온에서 교반하였다. 용매를 실온 및 진공하에서 회전증발기로 제거하고 잔류물을 DCM(30 mL)에 용해시켰다. 상기 용액을 물(30 mL)로 세척하였다. 분리된 유기층을 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용매를 완전히 제거하여 흰 고체 화합물 50(145 mg)을 수득하였다. ¹³CNMRδ156.2,143.7,141.2,127.6,126.9,124.9,119.9,66.7,47.2,44.1,34.5.

실시예 46. 화합물 51:

화합물 47((258.3mg,0.8746mmol) 및 화합물 50(300mg,0.8746mmol)을 THF(15 mL)에 용해시켰다. 몰리큘러시브(molecular sieve)를 첨가하였다. 반응은 10분 내에 완료하였다. 반응 후, 상기 몰리큘러시브를 여과하였다. 용매를 제거하고, 잔류 물을 에틸에테르로 세척하여 조화합물 51(385 mg)을 수득하였다.

실시예 47. 화합물 52:

추가 정제 없이, 화합물 51(270 mg, 0.53 mmol)에 10%(w/v) DMAP(0.54g)이 녹아있는 DMF(5.4mL)을 질소하, 실온에서 8.5시간동안 처리하여 화합물 52를 수득하였다. 20k 8armSCPEG(650mg,0.033mmol)을 그대로 상기 반응 혼합물에 첨가하였다. 상기 반응은 하룻밤동안 실온에서 방치하였다. 용매를 제거하고, 잔류물을 DCM/에테르로 침전시켰다. 분리된 고형분을 아세토니트릴/IPA로 두 번 재결정화시켜 E 및 Z 이성체(isomer)를 갖는 화합물 10(630 mg)을 수득하였다. ¹³CNMRδ172.1,166.8,159.7,159.1,156.0,149.1,149.0,144.8,136.9,136.7,120.7,120.3,119.7,119.3,78.0-69.2(PEG),63.5,37.6,37.5,34.4,34.1,33.2,32.8,32.4,32.1.

실시예 48. 화합물 54;

C6-티오-LNA-설비빈(C6-thio-LNA-survivin)(10 mg, 0.0018 mmol)이 녹아있는 5 mL pH 7.0 인산염버퍼에 화합물 53(0.36g,0.018mmol)을 첨가하고, 상기 용액을 실온에서 1시간동안 교반하였다. 반응 진행은 음이온-교환 HPLC로 확인하였다. 반응 혼합물을 0.2 마이크론 필터로 여과하고 Poros 음이온-교환 컬럼에 적재하였다. pH 7.0에서 20mM Tris. HCl 2M NaCl 버퍼 시스템을 이용한 구배로 산물을 용출시켰다. 탈염 후 수율은 2 mg(oligo eq)이었다.

실시예 49. 화합물 55:

화합물 54(3mg,0.00053mmol,oligo eq)를 SH-TAT-RGD(16.7mg,0.00743mmol)가 녹아있는 1 mL의 pH 7.0 인산염버퍼와 질소하에 혼합하였다. 상기 반응은 2시간동안 진행하였다. 조산물을 Source 15S 레진으로 정제하였다. 컬럼은 버퍼 A(5M urea,100mM KH₂PO₄,25% CH₃CN,pH 6.5)로 평형화시켰다. 버퍼 B(2M KBr)로 산물을 용출시켰다. 상기 수집된 산물을 HiPrep 탈염 컬럼 상에서 탈염시키고, 동결건조하였다.

실시예 50. 화합물 56:

20K4ArmPEGNHS (5g, 0.25 mmol)가 녹아있는 50 mL의 무수 DCM에 4-아미노프로피온알데하이드 디에틸아세탈(4-aminopropionaldehyde diethylacetal) (0.04g, 0.275 mmol)을 실온에서 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 20시간동안 교반하였다. 진공하에서 용매를 증발시키고, 아세토니트릴/IPA로 조화합물을 재결정화시켜, 흰 고체인 화합물 56을 수득하였다.

¹³CNMRδ168.17,155.87,151.38,101.37,70.21,69.89,63.46,61.29,45.22,36.78,33.24,25.19,15.12.

실시예 51. 화합물 57:

화합물 30(0.36g,0.117mmol)이 녹아있는 10 mL의 무수 DCM에 DIPEA(0.40mL,0.233mmoles)를 실온에서 첨가하였다. 교반된 혼합물에 화합물 56(4.00g,0.0194mmol)이 녹아있는 30 mL의 무수 DCM용액을 첨가하고, 이후 DMF(13 mL)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 5시간동안 교반하였다. 용매를 진공하에 증발시키고, 잔류물을 DCM/에틸에틸로 침전시켰다. 아세토니트릴/IPA로 조화합물을 재결정화하여 흰 고체인 화합물 57(3.6 g)을 수득하였다. ¹³CNMR δ 170.74, 156.53, 155.49,153.75,142.27, 133.69, 121.08, 101.44, 70.66, 69.70, 69.17, 63.89, 63.51, 62.71, 61.34, 53.37, 52.91, 45.27, 41.74, 36.84, 33.27, 25.15, 15.15.

실시예 52. 화합물 58:

화합물 57(0.70g,0.034mmol)이 녹아있는 클로로포름 용액에 포름산(0.15 mL)을 실온에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 20시간동안 교반하였다. 용매를 진공하에 증발시켰다. 조오일(crude oil)을 에테르로 분쇄(triturate)하여 옅은 노란색의 고체인 화합물 58(0.65 g)을 수득하였다. ¹³CNMR:δ170.72,161.87,160.59,156.59,55.57,153.76,142.33,133.75,121.14,70.30,69.75,69.19,68.59,63.98,63.75,62.77,61.40,53.55,52.93,45.31,43.88,41.76,34.26.

실시예 53. 화합물 59:

화합물 58(53mg,0.026mmol)을 C10-설비빈 히드라자이드(C10-survivinhydrazide)(6mg,0.885)가 녹아있는 2 mL의 pH7.0 인산염버퍼와 반응시켰다. 반응은 실온에서 2시간동안 진행시켰다. 조물질을 이동상 A: 20 mmol Tris, pH 7.0 및 B: 20 mmol Tris, 2M NaCl, pH 7.0로 poros상에서 정제하였고, 이후 물로 탈염하였다. 수율은 1.5 mg(oligo eq)이었다. 상기 물질 중 1.2 mg(oliogo eq)을 0.5 mL의 버퍼(5M urea, 100mM KH₂PO₄)에 용해시켰다. SH-TAT(2.3mg,0.00138mmol)를 질소하에 첨가하였다. 상기 반응을 1.5시간동안 수행하고, 이후 Source 15S 레진상에서 정제하였다. 컬럼은 버퍼 A(5M urea,100mM KH₂PO₄,25% CH₃CN,pH 6.5)로 평형화시켰다. 버퍼 B(2M KBr)로 산물을 용출시켰다. 상기 수집된 산물을 HiPrep 탈염 컬럼 상에서 pH 7.4 PBS로 탈염시키고, 동결건조하였다. 수율 250 μg(oligo eq).

실시예 54. 화합물 60:

4-하이드록시-3,5-디메틸 벤즈알데하이드(4-Hydroxy-3,5-dimethyl benzaldehyde) (1.36 g, 10 mmol)가 녹아있는 무수 메탄올(5 mL)에 1.0M 리튬 테트라플루오로 보레이트(0.3 mL)를 첨가한 후, 트리메틸 오르토포르메이트(trimethyl orthoformate) (1.378 g, 13 mmol)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 3시간동안 환류시키고나서, 포화 탄산수소나트륨(soium bicarbonate)(20mL)에 의해 냉각(quench)시켰다. 상기 혼합물을 에틸 아세테이트로 두 번(60 mL, 30 mL) 추출하 였다. 유기층을 모으고, 포화 염화나트륨(20 mL)으로 세척하고, 황산마그네슘으로 건조하였다. 여과 후, 용매를 진공하에 건조시켜 화합물 60을 수득하였다.

실시예 55. 화합물 62:

화합물 61(10g,0.25mmol)이 무수 DCM(100 mL)에 녹아있는 용액에 화합물 60((50.0mg,0.275mmol)을 첨가하고 나서, DMAP(33.6mg,0.275mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 하룻밤동안 환류시켰다. 용매를 진공하에 증발시키고, 잔류물을 DCM/에테르로 결정화하였다. 고형분을 분리하고 CNCH₃/IPA로 재결정화하여 화합물 62를 수득하였다.

실시예 56. 화합물 63:

화합물 62(10g,0.25mmol)가 녹아있는 무수 DCM(100 mL)에 화합물 18(342mg,1.5mmol)을 첨가하고 나서,DMAP(183mg,1.5mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 하룻밤동안 환류시켰다. 용매를 진공하에 증발시키고, 잔류물을 DCM/에테르로 결정화하였다. 고형분을 분리하고 CNCH₃/IPA로 재결정화하여 화합물 63을 수득하였다.

실시예 57. 화합물 64:

화합물 63(0.7g,0.0175mmol)을 클로로포름(0.6 mL)에 용해시켰다. 포름 산(85%, 0.15 mL)을ㄹ 첨가하고 상기 혼합물을 하룻밤동안 교반하였다. 용매를 진공하에 증발시키고, 잔류물을 DCM/에테르로 재결정화하여 화합물 64를 수득하였다.

실시예 58. 화합물 65:

화합물 64를 SH-TAT-RGD가 녹아있는 pH 7.0 인산염버퍼와 질소하에 혼합하였다. 상기 반응은 2시간동안 수행하였다. Source 15S 레진으로 조산물을 정제하였다. 컬럼을 버퍼 A(5M urea,100mM KH₂PO₄,25% CH₃CN,pH 6.5)로 평형화시켰다. 버퍼 B(2M KBr)로 산물을 용출시켰다. 상기 수집된 산물을 HiPrep 탈염 컬럼 상에서 탈염시키고, 동결건조하였다.

실시예 59. 화합물 68:

8armPEG-SC (5.5 g, 0.26 mmol)가 녹아있는 115 mL의 무수 DCM 용액에 화합물 66(117.12 mg, 0.28 mmol, 1.1eq)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 하룻밤동안 교반하고나서, 화합물 67(1.75g,4.52mmol,17.5eq)이 녹아있는 60 mL의 THF를 첨가하고, 4시간동안 실온에서 교반하였다. 용매를 진공하에 제거하고, 고형분을 IPA로 재결정화하여 화합물 68(4.4g)을 수득하였다. ¹³CNMRδ27.93,35.19,37.27,52.53,52.87,53.03,56.26,56.64,61.09,62.77,63.60,69.35-70.51(PEG),126.67,127.78,128.73,137.38,155.87,169.47.

실시예 60. 화합물 69:

화합물 68을 TFA/DCM 용매 혼합물(50/100mL)에 첨가하고 상기 혼합물을 실온에서 하룻밤동안 교반하였다. 용매를 진공하에 제거하고, 잔류물을 에틸 에테르 첨가에 의해 침전시켰다. 고형분을 여과하고 IPA로 재결정화하여 화합물 3의 카르복실산(4.6g)을 수득하였다. ¹³CNMRδ33.88,35.54,48.65,49.72,50.68,51.48,56.47,56.85,59.67,61.05,64.18,69.05-70.36(PEG),128.79,129.81,156.43,169.30. 상기 카르복실산(3.3g,0.14mmol,1eq) 및 3,5-디메틸-4-하이드록시-벤질-OTBS(114mg,0.43mmol,3eq)가 녹았는 0℃의 52mL 무수 DCM 용액에 DMAP(105mg, 0.86mmol, 6 eq)와 EDC(110mg,0.57mmol,4eq)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 용매를 진공하에 제거하고, 잔류물을 DCM/에틸 에테르로 침전시켰다. 고형분을 여과하고, IPA로 재결정화하여 화합물 69(3g)을 수득하였다.

¹³CNMRδ-5.29,16.35,25.86,34.15,36.34,50.01,51.36,52.12,56.67,56.93,60.54,61.52,63.92,64.21,69.25-71.34(PEG),125.98,127.88,128.12,128.36,129.23,156.17,169.90.

실시예 61. 화합물 70:

화합물 69(3g)을 12mL 아세토니트릴 및 6mL의 물에 용해시킨 후, 30 mL 아세트산을 첨가하였다. 용액을 실온에서 하룻밤동안 교반한 후, 진공상태에서 용매를 제거하였다. 고형분을 에테르로 침전하고, DMF/IPA로 재결정화하여 비보호 알콜(deprotected alcohol)을 수득하였다. 알콜(2.7g,0.08mmol,1eq)을 3mL DMF 및 30 mL 디클로메탄에 용해시킨 후, 상기 용액을 0℃로 냉각하였다. DSC (170 mg, 0.65 mmol, 8 eq)와 피리딘(pyridine) (46 mL, 0.57 mmol, 7.2 eq)을 각각 첨가하였다. 반응 혼합물은 조금씩 하룻밤동안 실온으로 가열하였다. 진공하에서 DCM을 부분적으로 제거한 후, 고형분을 에테르로 침전시켰다. 그리고나서, 고형분을 DCM/IPA로 재결정화하여 화합물 70(2.3 g)을 수득하였다.

실시예 62. 화합물 71:

oligo-NH2(3mg,0.5mmol)가 녹아있는 PBS 버퍼(1.5 mL, pH 7.8) 용액에 화합물 70(140mg,5mmol)을 첨가하고 실온에서 2시간동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 10 mL의 물로 희석하고, 20 mM Tris-HCl 버퍼, pH 7.0 (buffer A)로 미리 평형화된 강한 음이온 교환 컬럼(10 mm x 1.5 mm, bed volume ~ 16 mL)인 Poros HQ에 적재하였다. 상기 컬럼은 과다 PEG 링커를 제거하기 위하여 컬럼 3-4배 부피의 버퍼 A로 세척하였다. 그리고나서,1M의 NaCl이 녹아있는 20 mM Tris-HCl 버퍼(pH 7.0, 버퍼 B)로 10분 내에 0에서 100%의 농도구배로 용출하고, 이후 10mL/min의 유속으로 10분동안 100% 버퍼 B로 산물을 용출시켰다. 상기 용출된 산물은 HiPrep 탈염 컬럼(50 mL)을 이용하여 탈염시키고, 동결건조하여 화합물 71을 수득하였다. 수율 2.2 mg(ligo equivalent,73%).

생물학적 데이터

실시예 63. 화합물 23a-II-R1의 In vitro 세포 유입(celluar uptake)

양전하를 띄는 부분을 포함하는 PEG 고분자에 올리고뉴클레오티드가 결합시의 효과를 확인하기 위하여 암세포에 의한 세포 유입(celluar uptake)을 측정하였다. 상기 컨쥬케이트(23a-II-R1)는 C-TAT(서열번호 1)에 부착된 7개의 분지(arm)와 5' 안티센스 BCL-2 올리고뉴클레오티드인 TCTCCCAGCGTGCGCCAT(서열번호 6)에 부착된 1개의 분지(arm)를 함유하고 있다. 대조군 컨쥬게이트(control conjugate)는 화합물 23a-II-R1과 유사하지만, 양전하를 띄는 부분 TAT를 함유하고 있지 않다. 화합물 101의 올리고뉴클레오티드 및 조절 올리고뉴클레오티드 모두는 프로토콜에 따라 FITC로 라벨링되었다.

A549 인간 폐암세포는 10% FBS 성장 배지가 담긴 4웰플레이트에 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 세포를 각 시험화합물로 감염(transfect)기키고 PBS로 3회 세척한 후, 50% 글리세롤이 함유된 PBS(20 ml 100% 글리세롤+20 mL PBS)를 첨가하여 슬라이드 상의 세포를 덮었다. 상기 슬라이드를 4℃에서 하룻밤동안 보관하였다. 형광현미경(fluorescent microscope) 및 공초점 현미경(confocal microscope)을 사용하여 PEG-올리고뉴클레오티드의 세포 유입을 나타내었다. 시험 화합물의 세포 유입은 도 13(형광현미경 이미지) 및 도 14(공초점 현미경 이미지)에 나타내었다.

상기 데이터는 암세포가 양전하를 는 고분자에 컨쥬게이션된 올리고뉴클레오 티드와 같이 음전하를 띄는 치료제를 흡수함으로 보여준다. 상기 데이터는 고분자의 양전하를 띄는 골격(backbone)이 치료 올리고뉴클레오티드가 세포막을 통과하여 종양 세포의 타겟 부위에 도달할 수 있게 한다는 것을 나타낸다.

실시예 64. 23a-II-R1의 세포 유입 효율

화합물 23a-II-R1을 이용하여, 형질전환제의 존재 또는 비존재시 상기 화합물의 세포 유입 효율을 확인하였다. A549 인간 폐암세포를 10% FBS 성장 배지가 담긴 4웰플레이트에 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다.이후, 배지를 제거하고, 세포를 각 시험화합물을 함유하는 1mL/웰 10% FBS 성장 배지로 처리하였다. 대조군 화합물은, 고분자나 양전하를 띄는 부분에 컨쥬게이션되지 않은, 올리고뉴클레오티드, 안티센스 BCL-2 올리고뉴클레오티드(서열번호 7)을 사용하였다. 대조군과 시험 화합물 모두 세포 유입을 나타내기 위해 FITC로 라벨링하였다.

실험결과는 도 15에 나타내었다. 화합물 23a-II-R1에 부착된 올리고뉴클레오티드는 형질전환제 없이 대조군 올리고뉴클레오티드에 비해 세포에 잘 흡수되었다. 양전하를 띄는 고분자에 컨쥬게이션된 올리고뉴클레오티드의 세포 유입은, 원래 올리고뉴클레오티드와 비교하여 볼 때, in vivo 환경과 유사한, 혈청을 함유하는 배지 사용시 현저하게 증가하였다.

상기 결과는 고분자가 올리고뉴클레오티드와 같이 음전하를 띄는 치료제의 타겟 세포로의 전달을 증가시키고, 따라서 올리고뉴클레오티드에 기초한 치료법은 이러한 장점을 이용할 수 있음을 나타낸다.

실시예 65. 23a-II-R1 및 23a-II-R2의 투여량 의존성 세포 유입

유세포측정법(flow cytometry)을 사용하여 양전하를 띄는 고분자에 컨쥬게이션된 올리고뉴클레오티드의 세포 유입 효율을 확인하였다. A549 인간 폐암세포를 10% FBS 성장 배지가 담긴 4웰플레이트에 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 이후, 배지를 제거하고, 세포를 화합물 23a-II-R1 및 본래의 올리고뉴클레오티드(서열번호 6) 각각을 함유하는 1mL/웰 10% FBS 성장 배지로 처리하였다. 처리 후, 세포를 회수하고, 트립신 처리하고, 1% BSA PBS로 3회 세척하고, FACS를 이용하여 분석하였다. 화합물 101의 올리고뉴클레오티드 및 대조군 올리고뉴클레오티드는 FITC로 라벨링되었다.

실험결과는 도 16에 나타내었다. 상기 결과는 TAT(23a-II-R1)이나 Arg₉(23a-II-R2)를 함유하는 양전하를 띄는 고분자에 컨쥬게이트된 올리고뉴클레오티드가 투여량 의존적 방식으로 세포에 유입됨을 보여준다. 이러한 특성은 암을 치료하는데 매우 유리한데, 왜냐하면 임상학자들은 환자의 필요에 따라 치료 올리고뉴클레오티드의 투여량을 조정하기 때문이다.

실시예 66. 23a-I-R1의 BCL2 mRNA 하향조절

암세포에 의해 유입된 올리고뉴클레오티드가 암과 관련된 특정 유전자의 발현을 하향조절하는지 여부를 확인하기 위하여 본 연구를 수행하였다. A431 세포를 형질전환제 없이 본래의 올리고뉴클레오티드 및 화합물 23a-I-R1으로 감염시켰다. 상기 양전하를 띄는 고분자 컨쥬게이트는 TAT와 BCL2 siRNA를 함유하고 있다.

BCL mRNA의 RT-PCR 분석결과는 도 17에 나타내었다. 상기 결과들은 화합물 102의 올리고뉴클레오티드와 대조군 모두가 인간 폐암세포에서 투여량 의존적으로 BCL2 mRNA의 발현을 하향조절함을 보여준다. 양전하를 띄는 고분자에 컨쥬게이트된 BCL2 siRNA는 본래의 Bcl siRNA와 비교하여 볼 때, BCL2 mRNA의 발현을 현저하게 하향 조절하는 것으로 나타났다.

상기 결과들은 본 명세서에 기재된 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA를 포함하는 PEG-올리고뉴클레오티드 컨쥬게이트가 siRNA를 치료제로 사용할 수 있게 함을 보여준다.

실시예 67. A549 세포 모델(고형암, 폐암)에서 [RGD-TATC-S-S]7- ^20K 8arm PEG-S-S-안티센스 설비빈 LNA에 의한 설비빈 mRNA 하향조절

양전하를 띄는 고분자의 설비빈 mRNA 발현에 대한 효과를 확인하기 위하여, 본 연구를 수행하였다. A549 인간 폐아세포를 1000nM, 2000nM,40nM, 8nM 및 1.6nM의 농도로 화합물 33b-I-R4, 33b-I-R5 및 33a-I-R3 각각으로 감염시켰다. 화합물 33b-I-R4([linearRGD-S-S]₃-^20K4armPEG-S-S-antisense Survivin LNA) 및 33b-I-R5([cyclicRGD-S-S]₃-^20K4armPEG-S-S-antisense Survivin LNA)은 안티센스 설비빈 LNA를 함유하지만, 양전하를 띄는 펩타이드(TAT)를 포함하지 않는다. 화합물 33a-I-R3([RGD-TATC-S-S]₇-^20K8armPEG-SS-antisense Survivin LNA)는 TAT 펩타이드 및 안티센스 설비빈 LNA를 포함한다. 각 화합물로 처리한 A549 세포에서의 설비빈 mRNA 발현은 처리 1일 후 RT-PCR에 의해 측정하였다.

TAT 펩타이드를 포함하는 화합물은 형질전환제 없이 설비빈 mRNA의 발현을 현저하게 하향조절하였다. 상기 하향조절은 투여량에 의존적이었다. 이러한 결과들은 도 18에 나타내었다. TAT 펩타이드가 없는 화합물의 안티센스 설비빈 LNA나 본래의 안티센스 설비빈 LNA는 설비빈 mRNA 발현을 억제하지 못하였다. 상기 결과들은 양전하를 띄는 고분자가 음전하를 띄는 올리고뉴클레오티드를 이용한 치료에 유용함으로 보여준다.

실시예 68. DU145 세포 모델(고형암, 전립선암)에서의 [RGD-TATC-S-S]₇-^20K8armPEG-S-S-antisense Survivin LNA에 의한 설비빈 mRNA 하향조절

DU145 세포를 실시예 67에 사용된 동일한 화합물로 감염시켰다. 실시예 67에서와 같이, TAT를 함유하는 화합물은 설비빈 mRNA 발현을 현저하게 하향조절하는 것으로 나타났다. 본래의 안티센스 설비빈 LNA나 양전하를 띄는 펩타이드가 없는 화합물의 안티센스 설비빈 LNA는 DU145 세포에서 설비빈 mRNA 발현을 하향조절하였다. 이러한 결과들은 도 19에 나타내었다. 상기 데이터는 양전하를 띄는 고분자가 다양한 형태의 암을 치료하는데 유익할 수 있음을 보여준다. 설비빈 mRNA 하향조절 은 DU145 세포에서 33a-I-R1(TATC-S-S)₇-^20K8armPEG-S-S-antisense Survivin LNA)의 연구에서와 유사하게 관찰되었다.

실시예 69. A549 세포 모델에서 [(Arg)9C-S-S] ₇ - ^20K 8armPEG-S-S-antisense Survivin LNA에 의한 설비빈 mRNA 하향조절

A549 인간 폐암세포를 화합물 33a-I-R2 및 본래의 안티센스 설비빈 LNA 각각으로 감염시켰다. 화합물 33a-I-R2 ([(Arg)9C-S-S]₇-^20K8armPEG-S-S-antisense Survivin LNA)는 C(Arg)9에 연결된 7개의 고분자 분지 말단 및 세포내 방출가능한(relesable) 이황화 결합을 통해 안티센스 설비빈 LNA에 연결된 1개의 분지 말단을 포함하고 있다. 본래의 올리고뉴클레오티드(안티센스 설비빈 LNA) 역시 형질전환제인 리포펙타민(lipofectamine)으로 형질전환시켰다.

(Arg)₉을 포함하는 화합물은 형질전환제 없이 설비빈 mRNA 발현을 현저하게 하향조절하였다. 상기 결과들은 도 20에 나타내었다. 상기 데이터들은 TAT 및 (Arg)₉과 같이 양전하를 띄는 펩타이드를 함유하는 고분자가 치료제인 올리고뉴클레오티드를 세포 내 타겟 부위에 전달되도록 하게 한다는 것을 보여준다. 올리고뉴클레오티드 기반의 항암 치료법이 양전하를 띄는 고분자로부터 이익을 얻을 수 있을 것이다.

실시예 70. 세포내 불안정한(labile) 링커를 함유하는 양전하를 띄는 고분자에 의한 설비빈 mRNA 하향조절

A549 세포를 화합물 59 및 안티센스 설비빈 LNA 이합체(dimer) 각각으로 형질전환시켰다. C₆-SH tail(antisense Survivin LNA-C6-S-S-C6-antisense Survivin LNA)로 개질된 안티센스 설비빈 LNA 이합체 역시 형질전환제와 함께 형질전환되었다. 화합물 59는 하이드라존(hydrazone)에 기반한 방출링커(relesable linker)를 함유하고 있다. mRNA 하향조절 결과들은 도 21에 나타내었다.

하이드라존 링커를 통해 고분자에 부착되는 안티센스 설비빈 LNA는 설비빈 mRNA 발현을 하향조절하였다. 상기 데이터는 하이드라존 링커를 통해 연결된 안티센스 올리고뉴클레오티드가 세포막을 통과한 후 세포내에 고분자로부터 방출될 수 있음을 보여준다. 상기 고분자는 이황화 결합 및 하이드라존-기반 링커와 같이 다양한 형태의 방출 링커를 사용할 수 있으며, 방출 속도 및 고분자로부터의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 부위를 개질할 수 있다.

실시예 71. A549 세포 모델에서 [RGD-TATC-S-S] ₇ - ^20K 8armPEG-S-S-antisense Survivin LNA에 의한 설비빈 mRNA 하향조절

표적제(tageting agent)를 함유하는 양전하를 띄는 고분자가 표적제가 없는 양전하를 띄는 고분자만큼 효과적인지 여부와 따라서 표적제를 함유하는 고분자가 표적 전달을 위해 이용될 수 있는지를 알아보기 위해, 본 실험을 수행하였다. A549 세포를 화합물 33a-I-R1(TATC-S-S)₇-^20K8armPEG-S-S-antisense Survivin LNA) 및 33a-I-R3([RGD-TATC-S-S]₇-^20K8armPEG-S-S-antisense Survivin LNA) 각각으로 형질전환시켰다. 33a-I-R1 및 33a-I-R3에는, 7개의 고분자 분지 말단이 각각 C-TAT 및 C-TAT-RGD에 연결되어 있다. 세포들을 형질전환제 존재 또는 존재하지 않는 상태로 SH-C₆ tail로 개질된 안티센스 설비빈 LNA로도 형질전환시켰다. 표적제(targeting agent)를 갖거나 갖지않는 고분자들 모두 설비빈 mRNA 발현을 하향조절하였다. 상기 결과들은 도 22에 나타내었다. 이러한 양전하를 띄는 고분자의 특징은 올리고뉴클레오티드 치료법의 전달을 위한 표적제에 유용하다.

실시예 72. 설비빈 mRNA 발현의 특이적 억제

올리고뉴클레오티드가 암세포막을 통과한 후 유전자 발현을 선택적으로 억제할 수 있는지를 알아보기 위해, 본 실험을 수행하였다.

A549 인간 폐암세포를 화합물 33a-I-R1(TATC-S-S)₇-^20K8armPEG-S-S-antisense Survivin LNA), 화합물 33a-II-R1(TATC-S-S)₇-^20K8armPEG-S-S-scrambled Survivin LNA) 및 본래의 안티센스 설비빈 LNA로 형질전환시켰다. 화합물 33a-II-R1은 안티센스 설비빈 LNA (scrambled Survivin LNA: 5'- smCsGsmCsAsgsaststsasgsasasAsmCsmCst-3') 내에 일치하지 않는(mismatching) 뉴클레오티드를 함유하고 있다는 점을 제외하고는 화합물 33a-I-R1과 동일하다. 본래의 안티센스 설비빈 LNA 역시 형질전환제와 함께 형질전환시켰다. 상기 결과들은 도 23에 나타내었다.

상기 결과들은 화합물 33a-I-R1의 안티센스 설비빈 LNA가 화합물 33a-II-R1의 일치하지 않는(mismatching) 안티센스 설비빈 LNA 및 본래의 안티센스 설비빈 LNA와 비교하여 볼 때, 설비빈 mRNA 발현을 현저하게 억제하였다. 일치하지 않는 뉴클레오티드를 함유하는 안티센스 설비빈 LNA는 설비빈 유전자 발현을 억제하지 않았다. 상기 mRNA 하향조절은 특이적이었다. 이러한 특징은 암치료에 있어서 원하지 않는 유전자 발현을 선택적으로 하향조절할 수 있다는 점에서 바람직하다.

실시예 73. Calu-6 종양에서 in vivo 설비빈 하향조절

Calu-6 종양 세포로 이종이식된 마우스에서 안티센스 설비빈 LNA를 함유하는 3개의 PEG 유사체(analog)의 설비빈 하향조절 효율을 평가하였다. 각 그룹은 화합물 33a-I-R1((TATC-S-S)₇-^20K8armPEG-S-S-antisense Survivin LNA), 화합물 33a-I-R3 ([RGD-TATC-S-S]₇-^20K8armPEG-SS-antisense Survivin LNA) 또는 화합물 33a-I-R2([(Arg)9C-S-S]₇-^20K8armPEG-S-S-antisense Survivin LNA)로 처리하였다. 처리후, 마우스를 희생시킬 때 종양 조식을 절개하고, 설비빈 mRNA 발현을 측정하였다. 안 티센스 설비빈 LNA를 포함하는 3개의 고분자 모두는 본래의 안티센스 설비빈 LNA와 비교하여 볼 때, 종양 조직내 설비빈 mRNA 발현을 현저히 억제하였다. 상기 결과들은 도 24에 나타내었다. 상기 결과들은 양전하를 띄는 고분자에 연결된 올리고뉴클레오티드가 고형 종양과 같은 암 치료에 있어서 본래의 안티센스 설비빈 LNA에 비해 훨씬 효과적임을 보여준다.

<110> Enzon Pharmaceuticals, Inc. <120> Polymeric conjugates containing positively-charged moieties <130> 9fpi-02-07 <150> US60/844,945 <151> 2006-09-15 <150> US60/844,945 <151> 2006-09-15 <150> US60/861,349 <151> 2006-11-27 <150> US60/861,350 <151> 2006-11-27 <150> US60/911,734 <151> 2007-04-13 <150> US60/956,814 <151> 2007-08-20 <150> PCT/US2007/078598 <151> 2007-09-15 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 1 Cys Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polyarginine <400> 2 Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucloetide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Thiobackbone <220> <221> modified_base <222> (1) <223> Mehylated cytosine <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> LNA <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> LNA <220> <221> modified_base <222> (3) <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> LNA <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> LNA <220> <221> modified_base <222> (13) <223> Methylated cytosine <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> LNA <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> LNA <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> LNA <400> 3 ctcaatccat ggcagc 16 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> RNA <400> 4 gcaugcggcc ucuguuugat t 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> RNA <400> 5 ucaaacagag gccgcaugct t 21 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> Thiobackbone <400> 6 tctcccagcg tgcgccat 18 <210> 7 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Thiobackbone <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> LNA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(15) <223> LNA <400> 7 tggcaagcat cctgta 16

Claims

하기 식 (I):

[화학식 I]

{여기서,

Z₁ 은 독립적으로
이고;

Z₂ 는 독립적으로 캡핑기(capping group),

또는

이고;

R₁은 실질적 비항원성 고분자이고;

R₂ 및 R'₂는 독립적으로 선택된 양전하를 포함하는 펩티드 또는 질소를 포함하는 고리화 탄화수소 부분(moiety)이고;

R₃ 및 R'₃는 독립적으로 선택된 표적화제이고;

R₄는 생물학적 활성 부분이고;

B₁, B'₁ 및 B''₁은 독립적으로 선택된 분지화기(branching group)이고;

L₁, L'₁, L₁'', L₁''' 및 L₁'''은 독립적으로 선택된 이중작용 링커이고;

L₂, L'₂ 및 L''₂ 는 독립적으로 선택된 방출가능한 링커이고;

(a)는 양의 정수이고;

(b)는 0 또는 양의 정수이고;

(c), (c') 및 (c'')은 독립적으로 0 또는 양의 정수이고;

(d), (d'), (i), (i') 및 (ii)는 독립적으로 0 또는 양의 정수이고;

(e)는 양의 정수이고;

(e') 및 (e'')은 독립적으로 0 또는 양의 정수이고;

(f) 및 (f')은 독립적으로 0 또는 양의 정수이고;

(g)는 양의 정수이고;

(g')은 0 또는 양의 정수이고; 및,

(h) 및 (h')은 독립적으로 양의 정수이고;

(b)이 0이 아니고, 및 모든 Z₂가 캡핑기,
또는 이의 조합일 때, (g')은 양의 정수임}의 화합물.
제 1항에 있어서, 화학식

인 것을 특징으로 하는 화합물.
제 1항에 있어서, 상기 (a) 및 (b)의 합이 대략 1 내지 대략 32인 것을 특징으로 하는 화합물.
제 1항에 있어서, 상기 (a) 및 (b)의 합이 2, 3, 4, 8, 16, 또는 32인 것을 특징으로 하는 화합물.
제 1항에 있어서, 상기 Z₂는 캡핑기이고, (a) 및 (g')은 1인 것을 특징으로 하는 화합물.
제 1항에 있어서, 상기 (a)는 1이고, (b)는 양의 정수 1 내지 7인 것을 특징 으로 하는 화합물.
제 1항에 있어서, 상기 생물학적 활성 부분은 -NH₂를 포함하는 부분, -OH를 포함하는 부분 및 -SH를 포함하는 부분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
제 1항에 있어서, 상기 생물학적 활성 부분는 약학적으로 활성화된 화합물, 효소, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 항체, 단클론 항체, 단쇄 항체 및 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
제 1항에 있어서, 상기 생물학적 활성 부분은 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
제 9항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 잠금 핵산(LNA: locked nucleic acids), 짧은 간섭 RNA(siRNA: short interfering RNA), microRNA(miRNA), 앱타머(aptamers), 펩티드 핵산(PNA: 펩타이드 nucleic acid), 포스포로디아미데이트 모폴리노 올리고뉴클레오티드 (PMO: phosphorodiamidate morpholino oligonucleotides), 트리사이클로-DNA(tricyclo-DNA), 이중가닥 올리고뉴클레오티드 (decoy ODN), 촉매 RNA(RNAi), 앱타머, 스피겔머류(spiegelmers), CpG 올리고머 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
제 1항에 있어서, 상기 생물학적 활성 부분은 안티센스 Bcl-2 올리고뉴클레오티드, 안티센스 HIF-1α 올리고뉴클레오티드, 및 안티센스 서바이빈(Survivin) 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
제 1항에 있어서, 상기 펩타이드는 대략 1 내지 대략 50개의, 양전하를 띄는 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
제 1항에 있어서, 상기 펩타이드는 대략 2 내지 20개의, 양전하를 띄는 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
제 1항에 있어서, 상기 펩타이드는 CYGRKKRRQRRR(서열번호 1) 또는 CRRRRRRRRR(서열번호 2)를 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
제 1항에 있어서, 상기 질소를 포함하는 고리화 탄화수소는 화학식:

{여기서,

(aa)는 양의 정수 대략 2 내지 10이며;

(bb)는 1, 2 또는 3이며;

(cc)는 1 또는 2이며;

(dd)는 양의 정수 대략 1 내지 대략 5이며;

R₁₀₁은 수소, C_1-6알킬, C_2-6 알케닐, C_2-6알키닐, C_3-19 분지화 알킬, C_3-8사이클로알킬, C_1-6치환된 알킬, C_2-6치환된 알케닐, C_2-6치환된 알키닐, C_3-8치환된 사이클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, C_1-6 헤테로알킬, 치환된 C_1-6헤테로알킬, C_1-6알콕시, 아릴옥시, C_1-6헤테로알콕시, 헤테로아릴옥시, C_2-6 알카노일, 아릴카르보닐, C_2-6 알콕시카르보닐, 아릴옥시카르보닐, C_2-6 알카노일옥시, 아릴카르보닐옥시, C_2-6 치환된 알카노일, 치환된 아릴카르보닐, C_2-6 치환된 알카노일옥시, 치환된 아릴옥시카르보닐, C_2-6 치환된 알카노일옥시, 치환된 알카노일옥시 및 아릴카르보닐옥시로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하며; 및,

(q)는 대략 2 내지 30의 양의 정수임}인 것을 특징으로 하는 화합물.
제 15항에 있어서, 상기 질소를 포함하는 고리화 탄화수소는 하기:

로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
제 1항에 있어서, 상기 표적화제는 단클론 항체, 단쇄 항체, 세포부착 펩티 드, 세포 투과성 펩티드, 수용체 리간드, 표적화 탄수화물 분자 또는 렉틴 및 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
제 1항에 있어서, 상기 표적화제는 RGD 펩타이드, 셀렉틴, TAT, 페너트라틴(penetratin), (Arg)₉ 및 폴산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
제 1항에 있어서, 상기 B₁ 및 B'₁은 하기:

:

{여기서,

R₅는 수소, C_1-6알킬, C_2-6 알케닐, C_2-6알키닐, C_3-19 분지화 알킬, C_3-8사이클로알킬, C_1-6치환된 알킬, C_2-6치환된 알케닐, C_2-6치환된 알키닐, C_3-8치환된 사이클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, C_1-6 헤테로알킬, 치환된 C_1-6헤테로알킬, C_1-6알콕시, 아릴옥시, C_1-6헤테로알콕시, 헤테로아릴옥시, C_2-6 알카노일, 아릴카르보닐, C_2-6 알콕시카르보닐, 아릴옥시카르보닐, C_2-6 알카노일옥시, 아릴카르보닐옥시, C_2-6 치환된 알카노일, 치환된 아릴카르보닐, C_2-6 치환된 알카노일옥시, 치환된 아릴옥시카르보닐, C_2-6 치환된 알카노일옥시, 및 치환된 아릴카르보닐옥시로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하며;

(c1), (c2), (c3), (c4), (c5), (c6), (c'6), (c"6), (c7) 및 (c8)는 독립적으로 0 또는 양의 정수이며, 및

(d1), (d2), (d3), (d4), (d5) 및 (d7)은 독립적으로 0 또는 양의 정수임}

로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
제 19항에 있어서, B₁ 및 B'₁은 하기:

:

로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
제 1항에 있어서, 상기 L₁ 및 L'₁은 아미노산 또는 아미노산 유도체로부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
제 1항에 있어서, 상기 L₁ 및 L'₁은 하기:

-[C(=O)]_v(CR₂₂R₂₃)_t[C(=O)]_v'- ,

-[C(=O)]_v(CR₂₂R₂₃)_t-O[C(=O)]_v'- ,

-[C(=O)]_v(CR₂₂R₂₃)_t-NR₂₆[C(=O)]_v'- ,

-[C(=O)]_vO(CR₂₂R₂₃)_t[C(=O)]_v'- ,

-[C(=O)]_vO(CR₂₂R₂₃)_tO[C(=O)]_v'- ,

-[C(=O)]_vO(CR₂₂R₂₃)_tNR₂₆[C(=O)]_v'- ,

-[C(=O)]_vNR₂₁(CR₂₂R₂₃)_t[C(=O)]_v'- ,

-[C(=O)]_vNR₂₁(CR₂₂R₂₃)_tO[C(=O)]_v'- ,

-[C(=O)]_vNR₂₁(CR₂₂R₂₃)_tNR₂₆[C(=O)]_v'- ,

-[C(=O)]_v(CR₂₂R₂₃)_tO-(CR₂₈R₂₉)_t'[C(=O)]_v'- ,

-[C(=O)]_v(CR₂₂R₂₃)_tNR₂₆-(CR₂₈R₂₉)_t'[C(=O)]_v'- ,

-[C(=O)]_v(CR₂₂R₂₃)_tS-(CR₂₈R₂₉)_t'[C(=O)]_v'- ,

-[C(=O)]_vO(CR₂₂R₂₃)_tO-(CR₂₈R₂₉)_t'[C(=O)]_v'- ,

-[C(=O)]_vO(CR₂₂R₂₃)_tNR₂₆-(CR₂₈R₂₉)_t'[C(=O)]_v'- ,

-[C(=O)]_vO(CR₂₂R₂₃)_tS-(CR₂₈R₂₉)_t'[C(=O)]_v'- ,

-[C(=O)]_vNR₂₁(CR₂₂R₂₃)_tO-(CR₂₈R₂₉)_t'[C(=O)]_v'- ,

-[C(=O)]_vNR₂₁(CR₂₂R₂₃)_tNR₂₆-(CR₂₈R₂₉)_t'[C(=O)]_v'- ,

-[C(=O)]_vNR₂₁(CR₂₂R₂₃)_tS-(CR₂₈R₂₉)_t'[C(=O)]_v'- ,

-[C(=O)]_v(CR₂₂R₂₃CR₂₈R₂₉O)_tNR₂₆[C(=O)]_v'- ,

-[C(=O)]_v(CR₂₂R₂₃CR₂₈R₂₉O)_t[C(=O)]_v'- ,

-[C(=O)]_vO(CR₂₂R₂₃CR₂₈R₂₉O)_tNR₂₆[C(=O)]_v'- ,

-[C(=O)]_vO(CR₂₂R₂₃CR₂₈R₂₉O)_t[C(=O)]_v'- ,

-[C(=O)]_vNR₂₁(CR₂₂R₂₃CR₂₈R₂₉O)_tNR₂₆[C(=O)]_v'- ,

-[C(=O)]_vNR₂₁(CR₂₂R₂₃CR₂₈R₂₉O)_t[C(=O)]_v'- ,

-[C(=O)]_v(CR₂₂R₂₃CR₂₈R₂₉O)_t(CR₂₄R₂₅)_t'[C(=O)]_v'- ,

-[C(=O)]_vO(CR₂₂R₂₃CR₂₈R₂₉O)_t(CR₂₄R₂₅)_t'[C(=O)]_v'- ,

-[C(=O)]_vNR₂₁(CR₂₂R₂₃CR₂₈R₂₉O)_t(CR₂₄R₂₅)_t'[C(=O)]_v'- ,

-[C(=O)]_v(CR₂₂R₂₃CR₂₈R₂₉O)_t(CR₂₄R₂₅)_t'O[C(=O)]_v'- ,

-[C(=O)]_v(CR₂₂R₂₃)_t(CR₂₄R₂₅CR₂₈R₂₉O)_t'[C(=O)]_v'- ,

-[C(=O)]_v(CR₂₂R₂₃)_t(CR₂₄R₂₅CR₂₈R₂₉O)_t'NR₂₆[C(=O)]_v'- ,

-[C(=O)]_vO(CR₂₂R₂₃CR₂₈R₂₉O)_t(CR₂₄R₂₅)_t'O[C(=O)]_v'- ,

-[C(=O)]_vO(CR₂₂R₂₃)_t(CR₂₄R₂₅CR₂₈R₂₉O)_t'[C(=O)]_v'- ,

-[C(=O)]_vO(CR₂₂R₂₃)_t(CR₂₄CR₂₅CR₂₈R₂₉O)_t'NR₂₆[C(=O)]_v'- ,

-[C(=O)]_vNR₂₁(CR₂₂R₂₃CR₂₈R₂₉O)_t(CR₂₄R₂₅)_t'O[C(=O)]_v'- ,

-[C(=O)]_vNR₂₁(CR₂₂R₂₃)_t(CR₂₄R₂₅CR₂₈R₂₉O)_t'[C(=O)]_v'- ,

-[C(=O)]_vNR₂₁(CR₂₂R₂₃)_t(CR₂₄R₂₅CR₂₈R₂₉O)_t'NR₂₆[C(=O)]_v'- ,

:

{여기서,

R_21-29는 수소, C_1-6알킬, C_3-12 분지화 알킬, C_3-8사이클로알킬, C_1-6치환된 알 킬, C_3-8치환된 cylo알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아랄킬, C_1-6 헤테로알킬, 치환된 C_1-6헤테로알킬, C_1-6알콕시, 페녹시 및 C_1-6헤테로알콕시로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하며;

(t) 및 (t')은 독립적으로 0 또는 양의 정수이며; 및

(v) 및 (v')은 독립적으로 0 또는 1임}

로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
제 1항에 있어서, 상기 L₁ 및 L'₁은 하기:

로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
제 1항에 있어서, 상기 L₂ 및 L'₂는 벤질 제거 기반 링커(benzyl elimination-based linkers), 트리알킬 잠금 기반 링커(trialkyl lock-based linkers), 바이신 기반 링커(bicine-based linkers), 산분해성 링커(acid labile linkers), 리소좀으로 절단가능한 펩티드 및 캡텝신 B(capthepsin B)로 절단가능한 펩티드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
제 24항에 있어서, 상기 산분해성 링커는 이황화물, 하이드라존(hydrazone)을 포함하는 링커 및 티오프로피오네이트(thiopropionate)를 포함하는 링커로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
제 24항에 있어서, L₂ 및 L'₂는 하기:

-Val-Cit-,

-Gly-Phe-Leu-Gly-,

-Ala-Leu-Ala-Leu-,

-Phe-Lys-,

-Val-Cit-C(=O)-CH₂OCH₂-C(=O)-,

-Val-Cit-C(=O)-CH₂SCH₂-C(=O)-, 및

-NHCH(CH₃)-C(=O)-NH(CH₂)₆-C(CH₃)₂-C(=O)-:

{여기서,

Y_11-19는 독립적으로 O, S 또는 NR₄₈이며;

R_31-48, R_50-51 및 A₅₁은 수소, C_1-6알킬, C_3-12 분지화 알킬, C_3-8사이클로알킬, C_1-6치환된 알킬, C_3-8치환된 cylo알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아랄킬, C_1-6 헤테로알킬, 치환된 C_1-6헤테로알킬, C_1-6알콕시, 페녹시 및 C_1-6헤테로알콕시로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하며;

Ar은 아릴 또는 헤테로아릴 부분이며;

L_11-15는 독립적으로 선택된 이중작용 스페이서이며;

J 및 J'은 활성적으로 표적세포로 전달되는 부분, 소수성 부분, 이중작용 연결 부분 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하며;

(c11), (h11), (k11), (111), (m11) 및 (n11)은 독립적으로 선택된 양의 정수이며;

(a11), (e11), (g11), (j11), (o11) 및 (q11)은 독립적으로 0 또는 양의 정수이며; 및

(b11), (x11), (x'11), (f11), (i11) 및 (p11)은 독립적으로 0 또는 1임}

로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
제 1항에 있어서, 상기 캡핑기는 H, NH₂, OH, CO₂H, C_1-6 알콕시 및 C_1-6 알킬으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
제 1항에 있어서, 상기 R₁은 선형, 분지화 또는 다분지형 폴리알킬렌 옥사이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
제 28항에 있어서, 상기 폴리알킬렌 옥사이드는 선형, 분지화 또는 다분지형 폴리에틸렌 글리콜 및 선형, 분지화 또는 다분지형 폴리프로필렌 글리콜으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
제 28항에 있어서, 상기 폴리알킬렌 옥사이드는 하기:

-Y₇₁-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂Y₇₁- ,

-Y₇₁-(CH₂CH₂O)_n-CH₂C(=Y₂₂)-Y₇₁- ,

-Y₇₁-C(=Y₇₂)-(CH₂)_a2-Y₇₃-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-Y₇₃-(CH₂)_a2-C(=Y₇₂)-Y₇₁- 및

-Y₇₁-(CR₇₁R₇₂)_a2-Y₇₃-(CH₂)_b2-O-(CH₂CH₂O)_n-(CH₂)_b2-Y₇₃-(CR₇₁R₇₂)_a2-Y₇₁- :

{여기서,

Y₇₁ 및 Y₇₃은 독립적으로 O, S, SO, SO₂, NR₇₃ 또는 결합(bond)이며;

Y₇₂는 O, S, 또는 NR₇₄이며;

R_71-73은 수소, C_1-6알킬, C_2-6 알케닐, C_2-6알키닐, C_3-19 분지화 알킬, C_3-8사이클로알킬, C_1-6치환된 알킬, C_2-6치환된 알케닐, C_2-6치환된 알키닐, C_3-8치환된 사이클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, C_1-6 헤테로알킬, 치환된 C_1-6헤테로알킬, C_1-6알콕시, 아릴옥시, C_1-6헤테로알콕시, 헤테로아릴옥시, C_2-6 알카노일, 아릴카르보닐, C_2-6 알콕시카르보닐, 아릴옥시카르보닐, C_2-6 알카노일옥시, 아릴카르보닐옥시, C_2-6 치환된 알카노일, 치환된 아릴카르보닐, C_2-6 치환된 알카노일옥시, 치환된 아릴옥시카르보닐, C_2-6 치환된 알카노일옥시 및 치환된 아릴카르보닐옥시로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하며;

(a2) 및 (b2)는 독립적으로 0 또는 양의 정수이며; 및,

(n)은 대략 10 내지 대략 2300의 정수이다.}

로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
제 28항에 있어서, 상기 폴리알킬렌 옥사이드는 화학식, -O-(CH₂CH₂O)_n- {여기서, (n)은 대략 10 내지 대략 2,300의 정수임}의 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
제 1항에 있어서, 상기 R₁은 평균 분자량이 대략 2,000 내지 대략 100,000 달톤인 것을 특징으로 하는 화합물.
제 1항에 있어서, 상기 R₁은 평균 분자량이 대략 5,000 내지 대략 60,000 달톤인 것을 특징으로 하는 화합물.
제 1항에 있어서, 상기 R₁은 평균 분자량이 대략 5,000 내지 대략 25,000 달톤 또는 대략 20,000 내지 대략 45,000 달톤인 것을 특징으로 하는 화합물
{여기서,

(e)은 1 또는 2이며;

(e')은 0, 1 또는 2이며; 및

(f')은 0 또는 1임} 또는

{여기서, (g')은 양의 정수임}

의 화학식을 갖는 제 1항의 화합물.
{여기서,

각각의 Z는 Z₁ 또는 Z₂이고;

(여기서,

각각의 Z₁은 독립적으로

이고,

각각의 Z₂는 독립적으로 선택된 캡핑기,

이고;

L₂, L'₂ 및 L''₂는 이황화물, 하이드라존(hydrazone)을 포함하는 링커, 티오프로피오네이트(thiopropionate)를 포함하는 링커, 벤질 제거 기반 링커, 트리알킬 잠금 기반 링커 및 바이신 기반 링커, 리소좀으로 절단가능한 펩티드 및 캡텝신 B(capthepsin B)로 절단가능한 펩티드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 방출가능한 링커이며;

(c), (c') 및 (c'')은 독립적으로 0 또는 양의 정수이며;

(d), (d'), (i), (i') 및 (i'')은 독립적으로 0 또는 양의 정수이며;

(e)는 양의 정수이며;

(e') 및 (e'')은 독립적으로 0 또는 양의 정수이며;

(f) 및 (f')은 독립적으로 0 또는 양의 정수이며;

(g)는 양의 정수이며;

(g')은 0 또는 양의 정수이며;

(h) 및 (h')은 독립적으로 양의 정수이며; 및

모든 그외의 변이체들은 이미 정의된 바와 같음}

모든 Z₂가 캡핑기,
또는 이들의 조합일 때, (g')은 양의 정수이다}

로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학식을 갖는 제 1항의 화합물.
로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학식을 갖는 제 1항의 화합물.
치료가 필요한 포유동물에 제 1항의 화합물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 치료방법.
치료가 필요한 세포에 제 1항의 화합물의 유효량을 전달하는 것을 포함하는 포유동물 세포에 폴리뉴클레오티드를 투여하는 방법.