JP2022533966A - Ｔｌｒ－４を標的とするアプタマーによるｔｌｒ－４媒介性の疾患および状態の治療 - Google Patents

Ｔｌｒ－４を標的とするアプタマーによるｔｌｒ－４媒介性の疾患および状態の治療 Download PDF

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Abstract

本開示は、本開示のアプタマーを、それを必要とする対象に単独でまたは他の薬理学的および／もしくは外科的介入と組み合わせて投与することを含む、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態の症状を治療、予防（例えば、抑制、阻害もしくは遅延）、または寛解する方法に関する。特定の態様において、本開示のアプタマーは、虚血性（例えば、心筋梗塞もしくは虚血性脳卒中）、出血性（例えば、出血性脳卒中もしくは出血性変化）、または神経変性（例えば、多発性硬化症）の疾患または状態の治療のために、薬理学的および／または外科的介入（例えば、血栓摘出などの血栓溶解）あるいはそれらの任意の組み合わせの前、最中、または後に投与される。本開示はまた、特定の用量および投与計画を提供する。

Description

本開示は、ＴＬＲ－４の細胞外ドメインを特異的に標的とする核酸アプタマーを投与することを含む、ＴＬＲ－４媒介性の疾患および状態の治療のための方法を提供する。
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、自然免疫の活性化における役割が最初に特定されたパターン認識受容体のファミリーであり、適応免疫応答の活性化を制御することもできる。ＴＬＲ－４は、哺乳動物において特性評価された最初のＴＬＲであった。最も重要な内因性ＴＬＲ－４リガンドは、組織または細胞の損傷に応答して放出される分子である。したがって、ＴＬＲ－４は、脳卒中などの細胞損傷の組織に関連する多くの非常に一般的な病理に関与している。
自然免疫、および特に複数の病理におけるＴＬＲの関与は、薬理学的標的としてのこれらの受容体のアゴニストおよびアンタゴニストの開発への関心を高めている。しかしながら、ＴＬＲ－４を調節できる薬物はほとんどなく、さらに、一般に、ＴＬＲ－４を調節し、現在開発中のＴＬＲ－４を介した治療または予防が可能な薬物は、ある特定の状態または限られた数の状態の治療に適している。したがって、当該技術分野では、ＴＬＲ－４に特異的に結合して阻害する能力を有し、ＴＬＲ－４の過剰発現または過剰活性化に関連する広範囲の疾患および状態に対する治療薬として有用である広域スペクトル分子が必要とされている。
本開示は、急性心筋梗塞の少なくともある症状または後遺症の寛解または改善における使用のためのアプタマーを提供し、
（ａ）アプタマーは、４０～１００ヌクレオチドの長さを有し、配列番号１、２、３、および４（または表１の任意のアプタマー配列もしくはそれらの組み合わせ）からなる群から選択され、
（ｉ）アプタマーは、ＴＬＲ－４の細胞外ドメイン上のエピトープに特異的に結合し、
（ｉｉ）エピトープへのアプタマーの結合は、ＴＬＲ－４活性化を低減および／もしくは阻害するか、または
（ｂ）アプタマーは、配列番号１、２、３、もしくは４（または表１の任意のアプタマー配列もしくはそれらの組み合わせ）に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する（ａ）のアプタマーの機能的に同等の変異体であり、この機能的に同等の変異体は、配列番号１、２、３、もしくは４（または表１の任意のアプタマー配列もしくはそれらの組み合わせ）であり、ＴＬＲ－４に特異的に結合し、その活性化を低減および／もしくは阻害する能力を維持し、
アプタマーは、急性心筋梗塞の最中、前、または直後に投与される。
実施形態では、アプタマーの投与は、梗塞領域の低減を引き起こし、特に、対照条件と比較して、その少なくとも２５％の梗塞領域の低減を引き起こす。
別の実施形態において、アプタマーの投与は、急性心筋梗塞によって引き起こされる線維症および／または壊死の減少を引き起こす。
別の実施形態において、アプタマーの投与は、
（ｉ）心機能の改善、
（ｉｉ）細胞外マトリックスの分解の低減、
（ｉｉｉ）心臓リモデリングの改善、
（ｉｖ）心室の解剖学的構造の保存、
（ｖ）梗塞の進行の低減、または
（ｖｉ）それらの任意の組み合わせをもたらす。
本開示はまた、神経筋または神経変性の疾患または状態の少なくともある症状または後遺症の寛解または改善における使用のための、上記で定義されたアプタマーを提供し、アプタマーは、神経筋または神経変性の疾患もしくは状態の発症の最中、前、または後に投与される。
一実施形態において、アプタマーの投与は、
（ｉ）脱髄の低減、
（ｉｉ）軸索損傷の低減、または
（ｉｉｉ）それらの組み合わせを引き起こす。
別の実施形態において、アプタマーの投与は、対照条件（例えば、プラセボの投与）と比較して、少なくとも２０～８０％の脱髄の阻害を引き起こす。
別の実施形態において、アプタマーの投与は、対照条件（例えば、プラセボの投与）と比較して、少なくとも１０～３０％の軸索損傷の低減（すなわち、それに対する保護）を引き起こす。
いくつかの実施形態において、神経筋または神経変性の疾患または状態は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、および血管性認知症疾患からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、治療に使用されるアプタマーは、ＡｐＴＯＬＬである。他の実施形態において、アプタマーは、約０．５ｍｇ／用量～約１４ｍｇ／用量の用量範囲で投与される。いくつかの実施形態において、アプタマーは、用量当たり約０．００７ｍｇ／ｋｇ～用量当たり約０．２ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。いくつかの実施形態において、アプタマーは、塩化マグネシウム六水和物を含み、任意選択でＡ－トレハロース二水和物を含む、ＰＢＳ（塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸水素二ナトリウム二水和物、およびリン酸二水素カリウム）ｐＨ７．４で製剤化される。実施形態において、アプタマーは、注入によって静脈内投与される。
本開示はまた、ＴＬＲ－４媒介性の疾患および状態（例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、または多発性硬化症）の発作の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、対象に少なくとも１用量の長さ４０～８０核酸塩基の核酸アプタマーを投与することを含む、方法を提供し、このアプタマーは、ＴＬＲ－４の細胞外ドメイン上のエピトープに結合し、このエピトープへのアプタマーの結合は、ＴＬＲ－４活性化を低減および／または阻害する。いくつかの態様において、エピトープへのアプタマーの結合は、ＴＬＲ－４活性化を低減する。いくつかの態様において、エピトープへのアプタマーの結合は、ＴＬＲ－４活性化を阻害する。
いくつかの態様において、この方法は、追加の治療またはそれらの組み合わせを投与することをさらに含む。いくつかの態様において、追加の治療は、第２のＴＬＲ－４アンタゴニストである。いくつかの態様において、追加の治療は、外科的介入である。いくつかの態様において、追加の治療は、抗炎症剤、核酸、ペプチド、またはそれらの組み合わせの投与を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。いくつかの態様において、核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンティミル（ａｎｔｉｍｉｒ）、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡを含む。
いくつかの態様において、核酸アプタマーは、配列番号１、２、３、もしくは４（または表１の任意のアプタマー配列もしくはそれらの組み合わせ）あるいはそれらの組み合わせに対して少なくとも７０％同一である配列を含む。いくつかの態様において、核酸アプタマーは、アプタマーに共有結合的にまたは非共有結合的に付着している生物学的に活性な分子をさらに含む。いくつかの態様において、核酸アプタマーは、配列番号１、２、３、もしくは４（または表１の任意のアプタマー配列もしくはそれらの組み合わせ）と同じＴＬＲ－４エピトープと交差競合するか、またはそれに結合する。いくつかの態様において、核酸アプタマーは、配列番号１、２、３、もしくは４の核酸アプタマー（または表１の任意のアプタマー配列もしくはそれらの組み合わせ）によって認識されるＴＬＲ－４エピトープと重複するエピトープと交差競合するか、またはそれに結合する。
いくつかの態様において、核酸アプタマーは、複数用量を含む用量レジメンで投与される。いくつかの態様において、複数用量は、同時に、連続的に、またはそれらの組み合わせで投与される。いくつかの態様において、複数用量は、２、３、または４、または５用量を含む。いくつかの態様において、各用量は、０．００７～０．２ｍｇ／ｋｇの核酸アプタマーを含む。
いくつかの態様において、核酸アプタマーは、静脈内、動脈内、または腹腔内に投与される。いくつかの態様において、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態は、虚血性の疾患または状態である。いくつかの態様において、虚血状態は、心筋梗塞または虚血性脳卒中である。いくつかの態様において、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態は、出血性状態である。いくつかの態様において、出血状態は、出血性脳卒中または出血性変化である。いくつかの態様において、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態は、神経筋の疾患または状態である。いくつかの態様において、神経筋の疾患または状態は、神経変性疾患または状態である。いくつかの態様において、神経変性の疾患または状態は、多発性硬化症である。
本開示のアプタマー（ＡｐＴＯＬＬ、配列番号１）の一次、二次、および三次配列を示す。 アプタマーＡｐＴＬＲ＃１ＲおよびＡｐＴＬＲ＃４Ｆのインビトロでの拮抗作用を示す。活性化レポーターシステムＳＥＡＰにカップリングしたｈＴＬＲ－４を発現するＨＥＫ－ｂｌｕｅ細胞を、アプタマー（０．２～２００ｎＭ）をインキュベーション培地に添加する１時間前に、選択的ＴＬＲ－４アゴニストＬＰＳ（２００ｎｇ／ｍｌ）とインキュベートした。ｈＴＬＲ－４活性化が定量化され、ＬＰＳの存在下での両方のアプタマーの濃度依存性拮抗作用を示した。 アプタマーＡｐＴＬＲ＃１ＲおよびＡｐＴＬＲ＃４Ｆの配列最適化を示す。３Ｄ構造の取得に関与しないアプタマーＡｐＴＬＲ＃１ＲおよびＡｐＴＬＲ＃４Ｆの配列の一部が削除され、対応する切断型ＡｐＴＬＲ＃１ＲＴおよびＡｐＴＬＲ＃４ＦＴにつながることを示す概略図。 切断型アプタマーＡｐＴＬＲ＃１ＲＴおよびＡｐＴＬＲ＃４ＦＴのｈＴＬＲ－４結合能の維持の確認を示す。Ａ）対照ＨＥＫ２９３細胞と比較した２９３－ｈＴＬＲＡ細胞で発現したｈＴＬＲ－４に対するＡｐＴＬＲ＃１ＲＴ（赤線）およびＡｐＴＬＲ＃４ＦＴ（青線）の定量化を示すフローサイトメトリーチャート、Ｂ）ＬＰＳで２９３－ｈＴＬＲＡ細胞を刺激した後のｈＴＬＲ－４に結合する切断型アプタマーのわずかな変化を示すフローサイトメトリーチャート。 ｈＴＬＲ－４を発現するＨＥＫ－ｂｌｕｅ細胞における切断型アプタマーＡｐＴＬＲ＃１ＲＴおよびＡｐＴＬＲ＃４ＦＴの拮抗作用の確認を示す。Ａ）レポーターシステムＳＥＡＰによって定量化されたｈＴＬＲ－４活性化が、親アプタマーＡｐＴＬＲ＃１ＲおよびＡｐＴＬＲ＃４Ｆと比較して示されている。Ｂ）ＳＥＡＰによって定量化されたｈ－ＴＬＲ－４活性化の時間窓。 内因性リガンド（ＤＡＭＰ）によって活性化されるｈＴＬＲ－４の阻害を示す。内因性ＴＬＲ－４アゴニストによって媒介される活性化に対するＡｐＴＬＲ＃１Ｒ、ＡｐＴＬＲ＃４Ｆおよび対応する切断型（０．２～２００ｎＭ）の阻害効果を示すｈＴＬＲ－４活性アッセイ。 下流のＴＬＲ－４細胞エフェクターに対するＡｐＴＯＬＬの阻害効果を示す。Ａ）ＮＯｘ検出のためのＧｒｉｅｓｓアッセイの基礎となる化学を示す概略図。Ｂ）ＴＬＲ－４アゴニストＬＰＳで活性化され、１時間後にＡｐＴＯＬＬ（２０および２００ｎＭ）とインキュベートされた腹腔マウスマクロファージの培地中のＮＯｘ濃度の定量化。 ＴＬＲ－４に対するＡｐＴＯＬＬのインビトロ結合親和性を示す。カニクイザル単球（Ａ）およびヒト単球（Ｂ）に異なる濃度のＡｐＴＯＬＬを投与した後の受容体飽和の％の定量化。 他のＴＬＲにおけるＡｐＴＯＬＬのアゴニスト作用を示す。ヒトＴＬＲ２、３、４、５、７、８および９を発現する細胞株におけるＴＬＲ活性アッセイ。ＡｐＴＯＬＬ（２０および２００ｎＭ）とのインキュベーション後、アゴニスト効果は検出されなかった。 ｈＴＬＲ２およびｈＴＬＲ５アゴニストであるＰａｍ３およびＦＬＡＴ－ＳＴでそれぞれ活性化されたＨＥＫ－ｂｌｕｅ－ｈＴＬＲ２およびＨＥＫ－ｂｌｕｅ－ｈＴＬＲ５細胞におけるｈＴＬＲ２およびｈＴＬＲ５活性アッセイを示す。ＡｐＴＯＬＬ（２０および２００ｎＭ）とのインキュベーションでは、適切なアゴニストによって以前に活性化されたｈＴＬＲ２およびｈＴＬＲ５の活性化に対する阻害効果は示されなかった。 マウスにおける実験的脳卒中の直後のＡｐＴＯＬＬの保護効果を示す。Ａ）ｐＭＣＡＯ後１０分で腹腔内（ｉ．ｐ．）投与された０．４５ｍｇ／ｋｇおよび０．９ｍｇ／ｋｇの保護を示すＡｐＴＯＬＬ用量反応研究における梗塞体積の定量化。Ｂ）ＡｐＴＯＬＬの効果を示さないＴＬＲ４ノックアウトマウスにおける梗塞体積の定量化。Ｃ）ＡｐＴＯＬＬを静脈内投与した場合の野生型動物の梗塞体積の定量化。（＊）一元配置分散分析ｐ＜０．０５対ビヒクル。 電気凝固マウスモデルによる永続的な中大脳動脈閉塞においてＡｐＴＯＬＬによって媒介される保護を示す。閉塞後１０分で０．９１ｍｇ／ｋｇのＡｐＴＯＬＬを投与した場合の虚血後２４時間での梗塞体積の定量化。（＊）ｔ－スチューデントｐ＜０．０５対ビヒクル。 電気凝固による永続的な中大脳動脈閉塞後のラットにおけるＡｐＴＯＬＬの２用量および３用量の投与（虚血後１０分、２時間および６時間）を示す。Ａ）０．４５ｍｇ／ｋｇのアプタマーが虚血後１０分、１０分および２時間、ならびに１０分、２時間および６時間で投与された場合の保護を示す、ＡｐＴＯＬＬ複数回投与研究における梗塞体積の定量化。（＊）一元配置分散分析ｐ＜０．０５対ビヒクル。 ラットの虚血再灌流後のＡｐＴＯＬＬによって媒介される保護を示す。Ａ）ＷｉｓｔａｒラットにおけるｔＭＣＡＯ後２４時間での梗塞サイズの低減を示す定量化。Ｂ）ＳＤラットにおけるＡｐＴＯＬＬまたはビヒクル処置後の梗塞体積の定量化。（＊）ｔ－スチューデントｐ＜０．０５対ビヒクル。 マウスにおける脳卒中後のＡｐＴＯＬＬの保護の治療可能時間域の設計のスキームを示す。ｐＭＣＡＯ後１０分、２時間または６時間でＡｐＴＯＬＬを投与されたマウスにおける永続的な虚血後２４時間での梗塞サイズの定量化は、試験されたすべての時間で同様の程度の保護を示す。（＊）一元配置分散分析ｐ＜０．０５対ビヒクル。 ＡｐＴＯＬＬ／ビヒクルで処置した動物における虚血後のサイトカイン測定を示す。ｐＭＣＡＯ後２４時間での血漿中のサイトカインレベルの定量化。結果は、ＡｐＴＯＬＬ処置後の動物からの血漿中のいくつかの炎症促進性サイトカインの有意な減少を示す。（＊）ｔ－スチューデントｐ＜０．０５対ビヒクル。 マウスにおける急性ＡｐＴＯＬＬ投与（閉塞後１０分）により誘導された長期の解剖学的および機能的保護を示す。Ａ）ＡｐＴＯＬＬで処置されたマウスの持続的な保護を示す、脳卒中後２４、４８および７２時間でのＴ２Ｗ－ＭＲＩによる脳浮腫の定量化；Ｂ）急性ＡｐＴＯＬＬ投与によって媒介される長期保護を示すニッスル染色切片の、脳卒中後２１日での梗塞サイズの定量化；Ｃ～Ｄ）ＡｐＴＯＬＬで処置された動物に神経学的欠損がないことを示す、脳卒中後２１日での歩長の定量化；Ｅ）フットプリントテストでの汚れた経路、および脳卒中の結果として変化する可能性のある異なる距離を示す写真。（＊）スチューデントのｔ検定ｐ＜０．０５対ビヒクル（Ａ、Ｂ）または二元配置分散分析ｐ＜０．０５対偽（Ｃ、Ｄ）、（＃）二元配置分散分析ｐ＜０．０５対ＭＣＡＯビヒクル。 ラットにおけるＡｐＴＯＬＬの急性投与（閉塞後１０分）により誘導された長期の運動保護を示す。ｐＭＣＡＯ後２１日までの運動スコアテストによる神経機能の評価は、ＡｐＴＯＬＬによって誘導された脳卒中後２日および７日で有意な保護を示した（ｎ＝８）。データは、平均±ＳＥＭを表す。二元配置分散分析とそれに続くボンフェローニ検定（＊ｐ＜０．０５対ビヒクル）。 敗血症のマウスモデルにおけるＡｐＴＯＬＬ（０．９１ｍｇ／ｋｇ、ＬＰＳ注射後１０分）の抗内毒素作用を示す。Ａ）腹腔内ＬＰＳ注射（２０ｍｇ／ｋｇ）後８時間および２４時間でのマウスにおける体重減少の％；Ｂ）腹腔内注射（２０ｍｇ／ｋｇ）後８時間および２４時間でのマウスにおける体温低下の％；Ｃ）マウスにおける２４時間での累積敗血症スコア（ＡｐＴＯＬＬを注射された動物において有意な減少を示す）；Ｄ）ＬＰＳ注射（２０ｍｇ／ｋｇ）後７２時間までの生存曲線（ＡｐＴＯＬＬを注射した動物の生存率の増加を示す）。 ＩＭＰ ＡｐＴＯＬＬ医薬品の製造工程のフローチャートを示す。ＩＭＰは、完全なＧＭＰ条件下で製造された。 生理学的パラメーターに対するＡｐＴＯＬＬの静脈内投与の効果を示す。ビヒクルの静脈内投与と比較した場合、血液中で測定された一連の生理学的パラメーターに対するアプタマーの投与の関連する効果は観察されなかった。 化合物処理を行ったヒト混合皮質ニューロン、皮質グルタミン酸作動性ニューロンおよび皮質ＧＡＢＡ作動性ニューロンを示す。Ａ）細胞生存率（０．０１μＭは、実際には無処理の対照条件（０μＭ）であり、対数グラフ化の目的でのみ使用されることに留意されたい）。Ｂ）１０日間の処理後の培養物からの顕微鏡写真。 ラットにおける呼吸機能に対するＡｐＴＯＬＬの単回静脈内投与の効果を示す。Ａ）呼吸数。Ｂ）一回換気量。Ｃ）分時換気量。 血漿タンパク質へのアプタマーの結合を示す。ヒト（Ａ）、ラット（Ｂ）およびＮＨＰ（Ｃ）血漿タンパク質に結合および非結合の画分における蛍光ＡｐＴＯＬＬを示す溶出プロット。灰色影付きの領域は、非結合アプタマーのピークに対応する。プロットは、３つの独立した試料のデータを別個に示す。 末梢細胞および中枢細胞におけるＡｐＴＯＬＬの検出を示す。Ａ）ＷＴおよびＴＬＲ４－ＫＯマウスにおけるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識ＡｐＴＯＬＬ（４ＦＴ－４８８、０．９１ｍｇ／ｋｇ）のフローサイトメトリー末梢分析。Ｂ）ＷＴマウスにおけるアプタマー投与から５分後の顆粒球領域のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識ＡｐＴＯＬＬ。Ｃ）静脈内注射後２４時間での脳梗塞領域内のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識ＡｐＴＯＬＬの分布。Ｃｙ３とコンジュゲートした抗Ａｌｅｘａ－４８８抗体（ｃ、赤色）でプローブすることによって確認された、虚血性コア内のアプタマーの分布パターン（緑色）。Ｄ）コンジュゲートされていないＡｐＴＯＬＬを陰性対照として使用した。 ３７℃でのλ－エキソヌクレアーゼＡ）、ＤＮＡｓｅ Ｉ Ｂ）による、ならびにラット、サルおよびヒト血漿Ｃ）における分解に対するＡｐＴＯＬＬの抵抗性を示す。３つの実験からの代表的なゲルを示す。 ＡｐＴＯＬＬのヒストグラムを示す。ＡｐＴＯＬＬ（２０ｎＭ）とのインキュベーションでは、ＧＰＣＲ、イオンチャネル、キナーゼ、核内受容体、トランスポーターも、他の非キナーゼ酵素のいずれも選択されていない任意の標的の活性化に対する阻害効果は示されなかった。Ａ）取り込み結果。Ｂ）結合アッセイ。 インビトロでの吸収を示す。ＡｐＴＯＬＬ（２０ｎＭ）とのインキュベーションでは、選択したトランスポーターに対して阻害効果は示されなかった。 ＡｐＴＯＬＬのヒストグラムを示す。ＡｐＴＯＬＬ（２０ｎＭ）投与後の対照値の阻害％。結果は、評価されたＣＹＰ酵素のいかなる阻害にも有意な影響がないことを示す。 ＣＹＰ酵素の誘導を示す。ＡｐＴＯＬＬ（２－２０－２００ｎＭ）の投与後のビヒクル活性の誘導倍率。カットオフ値は、１０個の既知のＣＹＰ誘導体および５個の既知のＣＹＰ非誘導体を使用して事前に決定した。結果は、評価された任意のＣＹＰ酵素の誘導に有意な影響がないことを示す。 ＡｐＴＯＬＬのインビトロ細胞毒性アッセイを示す。細胞生存率アッセイＡ）ＭＴＴ活性およびＢ）ＬＤＨ測定、ＨＥＰＧ２およびＨＬ６０細胞株とＡｐＴＯＬＬ（２～２０００ｎＭ）との２４時間および４８時間のインキュベーションの効果を定量化し、生物学的に活性な濃度（２～２０ｎＭ）で細胞毒性効果がないことを示す。（＊）スチューデントのｔ検定ｐ＜０．０５対対照細胞。 ＧＪ９６ＮＤ試験（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットの薬物動態試験）に参加した群の設計を示す。 ＭＣ４７ＫＣ試験（カニクイザル毒性研究）において得られたｔｍａｘ、ＣｍａｘおよびＡＵＣｔ値の要約を示す。 インビトロ細菌細胞毒性アッセイＡｐＴＯＬＬを示す。細胞毒性の結果は、対照成長のパーセント（ＯＤ６５０）として表される。 図３４に存在するものに加えて、インビトロ細菌細胞毒性アッセイＡｐＴＯＬＬを示す。細胞毒性の結果は、対照成長のパーセント（ＯＤ６５０）として表される。 ＡｐＴＯＬＬのインビトロＡｍｅｓ試験を示す。弱い陽性は、ｐ＜０．０５の場合、「＋」と表示される。強い陽性は、ｐ＜０．０１の場合、「＋＋」と表示される。非常に強い陽性は、ｐ＜０．００１の場合、「＋＋＋」と表示される。可能であれば、スコアがバックグラウンドを有意に下回る化合物にフラグを付ける。これは、成長アッセイでは検出できない低レベルの細胞毒性を示している場合がある。化合物には、下記のようにフラグを付ける。ｐ＜０．０５の場合、「＜」としてフラグを付け、ｐ＜０．０１の場合、「＜＜」としてフラグを付け、ｐ＜０．００１の場合、「＜＜＜」としてフラグを付ける。ハイフン（－）は、負の結果を示す。 図３６に示されるものに加えて、ＡｐＴＯＬＬのインビトロＡｍｅｓ試験結果を示す。 ＡｐＴＯＬＬのインビトロ小核アッセイを示す。異なる濃度でのＡｐＴＯＬＬ処理後の小核細胞の％。「＋」ｐ＜０．０５（ｔ検定による）および小核細胞の％はバックグラウンドレベルより少なくとも３倍高い。「＋／－」ｐ＜０．０５（ｔ検定による）および小核細胞の％はバックグラウンドレベルより少なくとも２倍高い。「－」ｐ＞０．０５（ｔ検定による）および小核細胞の％はバックグラウンドレベルより２倍未満高い。ＣＹＴＯ：細胞毒性が高く、スコアリング可能な細胞の数が不十分である（＞８０％の細胞毒性）。 Ａ）ラットにおける時間窓研究の設計のスキームを示す。再灌流前（Ｂ．Ｒ．）３０分および再灌流後１０分、２時間、６時間、９時間、１２時間または２４時間でＡｐＴＯＬＬを投与した場合のラットにおける一過性脳虚血の７２時間後の梗塞体積（Ｂ）および浮腫（Ｃ）の定量化。ｔＭＣＡＯラットにおける保護、１２時間までの治療可能時間域の延長および再灌流前にＡｐＴＯＬＬを投与した場合の保護を確認する。 心臓の筋肉の収縮性におけるＡｐＴＯＬＬの効果を示す。左心室心エコーパラメーターＡ）駆出率（％）およびＢ）短縮率（％）を、虚血－再灌流心筋梗塞（ＩＲ）の前（基礎）および７２時間後にそれぞれのラットから記録した。治療は、再灌流の１０分後に、ビヒクル（ＭｇＣｌ２を含むＰＢＳ、ｎ＝７）または単一用量（０．４５ｍｇ／Ｋｇ、ｎ＝１１）のＡｐＴＯＬＬの静脈内注射によって投与した。（＊）示されているデータは、平均±ＳＥＭを表す。ｔ－スチューデント＊＊ｐ＜０．０１対ビヒクル。 多発性硬化症の前臨床研究の結果を示す。ＥＡＥモデル中の臨床スコア：症状の発症においてビヒクル（ｎ＝７）または０．９１ｍｇ／ＫｇのＡｐＴＯＬＬ（ｎ＝１２）を静脈内注射したマウスの疾患進行。（＊）示されているデータは、平均±ＳＥＭを表す。ｔ－スチューデント＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１対ビヒクル。 ７日齢のラットのＯＰＣにおけるＡｐＴＯＬＬの効果を示す。Ａ）ＭＴＴアッセイによって決定された細胞生存率は、対照の％として表された（ｎ＝３）。Ｈ２Ｏ２を死亡対照として使用した。Ｂ）増殖は免疫細胞化学によって定量化され、Ｏｌｉｇ２＋に対する細胞ＢｒｄＵ＋／Ｏｌｉｇ２＋の％として表された（ｎ＝６）。Ｃ）分化は免疫細胞化学によって定量化され、Ｏｌｉｇ２＋に対する細胞ＭＢＰ＋／Ｏｌｉｇ２＋の％として表された（ｎ＝５）。Ｔ３（甲状腺ホルモン）を分化対照として使用した。（＊）示されているデータは、平均±ＳＥＭを表す。ｔ－スチューデント＊ｐ＜０．０５対ビヒクル。 電気凝固による永続的な中大脳動脈閉塞後のラットにおけるＡｐＴＯＬＬ複数用量研究における梗塞体積の定量化を示す。１つ（１０分）、２つ（１０分および２時間）、３つ（１０分、２時間、および６時間）、４つ（１０分、２時間、６時間、および２４時間）、または５つ（１０分、２時間、６時間、２４時間および４８時間）の０．４５ｍｇ／ｋｇのアプタマーを、脳虚血後に投与した。試験したすべての投与量で保護が観察された。すべての群をそれぞれのビヒクル群と比較した（１、２、３および４用量を、４８時間で安楽死させたビヒクル群と比較し、群５およびそのビヒクル対照群を７２時間で安楽死させた）。（＊）スチューデントｔ検定、ｐ＜０．０５対ビヒクル。 症状の発症後２４時間でＡｐＴＯＬＬ（すなわち、０．９１ｍｇ／ｋｇ）を投与した実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）マウスモデルにおける臨床スコアを示す。 ＭＳのマウスＥＡＥモデルにおけるＡｐＴＯＬＬの結果を示す。独立したアッセイにおける異なる用量のＡｐＴＯＬＬの静脈内投与後の臨床スコアの進展。それぞれの用量に使用された動物の数は、次のとおりであった：０．４５ｍｇ／ｋｇ用量：６ＥＡＥ－ＡｐＴＯＬＬ、１５ＥＡＥ－ＶＥＨおよび５偽；０．９１ｍｇ／ｋｇ用量：１３ＥＡＥ－ＡｐＴＯＬＬ、６ＥＡＥ－ＶＥＨおよび２０偽；用量１．８２ｍｇ／ｋｇ：８ＥＡＥ－ＡｐＴＯＬＬ、７ＥＡＥ－ＶＥＨおよび８偽；用量３．６ｍｇ／ｋｇの場合：５ＥＡＥ－ＡｐＴＯＬＬ、１５ＥＡＥ－ＶＥＨおよび５偽。ＥＡＥ－ＡｐＴＯＬＬ＝ＡｐＴＯＬＬで処置されたＥＡＥモデルマウス。ＥＡＥ－ＶＥＨ＝ビヒクルで処置されたＥＡＥモデルマウス。 ＭＳのＥＡＥモデルで研究されたＡｐＴＯＬＬの４つの用量（静脈内、０．４５ｍｇ／ｋｇ、０．９１ｍｇ／ｋｇ、１．８２ｍｇ／ｋｇ、および３．６ｍｇ／ｋｇ）の比較を示す。データは、ビヒクル群と比較した、ＡｐＴＯＬＬのそれぞれの用量で処置された動物の臨床経過の追跡調査を示す。 異なる用量のＡｐＴＯＬＬまたはビヒクルで処置した動物の脊髄切片におけるエリオクロム－シアニン染色によって測定されたミエリン喪失の研究結果を示す。それぞれの実験群における白質の面積に対する脱髄のパーセンテージの定量化が表される。ＡｐＴＯＬＬは、研究されたすべての用量で脱髄領域の減少を誘導する。 ＥＡＥ－ＡｐＴＯＬＬ（０．９１および１．８２ｍｇ／ｋｇ）とＥＡＥ－ＶＥＨマウスとを比較した再ミエリン化、軸索損傷および炎症の組織学的研究の結果を示す。グラフ表示ミエリン領域（ＭＢＰマーカーの定量化）。軸索損傷領域のグラフ表示（ＮＦＨマーカーの定量化）。全細胞（Ｉｂａ１マーカー）に対する小膠細胞のパーセンテージの定量化。 ＥＡＥ－ＡｐＴＯＬＬ（０．９１および１．８２ｍｇ／ｋｇ）ならびにＥＡＥ－ＶＥＨ投与後のオリゴデンドログリア系統Ｏｌｉｇ２＋細胞、成熟細胞（ＣＣ１＋）、およびオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＰＤＧＦＲα）の定量化を示す。 ブタの虚血／再灌流心筋梗塞のモデルにおいて、再灌流後８時間および２４時間での血漿中の心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）レベルを示す。値は、平均±標準偏差 ＊ｐ＜０．００２ ＡｐＴＯＬＬ ２４時間（ｎ＝１０）対ビヒクル２４時間（ｎ＝１０）として表される。 ＥＦ（駆出率）およびＦＳ（短縮率）として表される再灌流後７日でのブタの心機能を示す。Ｎ＝９ ＡｐＴＯＬＬ（アプタマー、静脈内、０．０７８ｍｇ／ｋｇ）／８プラセボ（対照）。データは、平均±標準偏差として表される。ＥＦ：＊ｐ＜０．０００６アプタマー対対照。ＦＳ：＊ｐ＜０．００３アプタマー対対照。 ＡｐＴＯＬＬ（静脈内、０．０７８ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルによる処置後７日で行われた二重カテーテル挿入後の梗塞領域の低減を示す。Ａ）ＴＴＣ／エバンスブルー二重染色を、０．５ｃｍの心臓切片で実施し、健康な領域（Ｈでマーク）、リスクのある領域（Ｒ）および壊死（梗塞）領域（白）を示す。Ｂ）梗塞領域の定量化は、リスクのある領域のパーセンテージとして表される。値は、平均±標準偏差として表される。＊ｐ＜０．００２プラセボ（ビヒクル）対ＡｐＴＯＬＬ。 以下を示す（Ａ）中央パネル：再灌流およびＨ＆Ｅ染色後７日での０．５μｍ心臓切片の明視野顕微鏡写真（２０倍）。外部パネル：中央パネルの倍率（６０倍）。Ｎ＝５ ＡｐＴＯＬＬ／４プラセボ。（Ｂ）再灌流後７日でマッソントリクロームにより染色された０．５μｍの心臓切片の明視野顕微鏡写真。Ｎ＝５ ＡｐＴＯＬＬ／４プラセボ。 ７日間の再灌流後のＡｐＴＯＬＬまたはプラセボＭＭＰ－９で処置されたブタの心臓切片におけるマトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ－９）の共焦点顕微鏡検出を示す。核を蛍光プローブ４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色した。Ｎ＝５ ＡｐＴＯＬＬ／４プラセボ。値は、平均±標準偏差として表される。＊ｐ＜０．００１プラセボ対ＡｐＴＯＬＬ。 ｑＰＣＲによって測定したＡｐＴＯＬＬの組織分布を示す。（Ａ）心臓、肺、腎臓、脾臓、肝臓、小腸、膵臓、胸腺および上衣脂肪におけるＡｐＴＯＬＬの定量化。（Ｂ）脾臓、腎臓および肝臓におけるＡｐＴＯＬＬの定量化。（Ｃ）虚血性（同側および対側半球）ならびにナイーブラットの脳におけるＡｐＴＯＬＬの分布。
本開示は、ＴＬＲ－４媒介性の疾患および状態（例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、虚血性脳卒中、もしくは多発性硬化症）の治療方法であって、それを必要とする患者に、少なくとも１つの治療有効用量の、本開示の少なくとも１つの核酸（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を単独で、または疾患もしくは状態の治療に一般に使用される少なくとも別の治療法、例えば、心筋梗塞における薬理学的および／または機械的血栓溶解（例えば、血栓摘出）と組み合わせて投与することを含む、方法を対象とする。核酸アプタマー、化学的に修飾された核酸アプタマー、アプタマーを含む薬学的組成物および製剤、本開示の方法を実施するための用量および投与計画、キットおよび製造品、ならびに製造および製剤化の方法も提供される。
本明細書に開示される疾患および状態は、異なる組織および臓器に影響を及ぼし、異なる原因を有し、多種多様な症状および後遺症を有するＴＬＲ－４媒介性の疾患および状態の広範な試料を表し、これは、本開示の核酸アプタマーが、ＴＬＲ－４媒介性の細胞シグナル伝達の調節を介して様々な疾患、状態、ならびにそれらの症状および後遺症にうまく適用することができる広範囲の薬剤であることを実証する。
ＴＬＲ－４媒介性の疾患および状態は、例えば、腸結腸炎、インフルエンザ、虚血性脳卒中、敗血症、腎虚血－再灌流、肝臓虚血－再灌流、脳内出血、または心筋虚血などの急性疾患および状態；多発性硬化症、依存症の離脱、腺筋症、角膜炎、または肺の炎症などの亜急性の疾患および状態；リウマチ性関節炎、アテローム性動脈硬化症、喘息、狼瘡、骨粗鬆症、移植拒絶、皮膚炎、乾癬、肥満、ＩＩ型糖尿病、神経障害性疼痛、高血圧、ＲＬＡ、大動脈瘤、結腸がん、びまん性軸索損傷、または慢性疼痛などの慢性疾患および状態を含む。ＴＬＲ－４媒介性の疾患および状態はまた、例えば、乳がん、肺がん、膵臓がん、皮膚がん、胃腸がん、肝臓がん、膀胱がん、頭頸部がん、食道がん、胃がん、結腸直腸がん、卵巣がん、子宮頸がん、または前立腺がんを含む。例えば、Ｍａｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＯｎｃｏＴａｒｇｅｔｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：１５７３－８７を参照されたい（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＴＬＲ－４を阻害することによって、がんにおける細胞の遊走および浸潤を低減することができ、したがって、ＴＬＲ－４を阻害することによって、がんの転移を低減することができる。ＴＬＲ－４阻害は、脂肪肝を低減することもできる。したがって、本明細書に開示される方法および組成物は、本明細書に開示されるＴＬＲ－４媒介性の疾患および状態のうちのいずれかの治療に、単独で、またはそのようなＴＬＲ－４媒介性の疾患および状態を治療するために一般に使用される治療的介入（例えば、薬理学的および／または外科的）と組み合わせて適用することができる。さらに、本明細書に開示される方法および組成物は、本明細書に開示されるＴＬＲ－４媒介性の疾患および状態、ならびに当該技術分野で知られる他のＴＬＲ－４媒介性の疾患および状態のうちのいずれかに関連する、当該技術分野で知られている症状および／または後遺症を治療するために使用することができる。例えば、がんなどの状態を治療するための本明細書に開示される方法の使用に関して、開示される方法および組成物は、例えば、腫瘍成長を低減または防止し、進行を遅らせ、血管新生を阻害または低減し、腫瘍浸潤を阻害または低減し、転移を阻害または低減し、生存率を高め、生活の質を高め、予後を改善することなどができる。
ＴＬＲ－４の過剰発現は、化学療法に対する抵抗性、例えば、卵巣がんでのパクリタキセルに対する抵抗性、および前立腺がんでのｓｉＲＮＡ療法に対する抵抗性に寄与する可能性がある。ＴＬＲ－４シグナル伝達は、肝臓がんでの化学療法に対する抵抗性にも関連している。したがって、本明細書に開示される方法および組成物は、がん患者における化学療法に対する抵抗性を低減、予防、または逆転させるために使用することができる。
腫瘍微小環境の免疫細胞および炎症細胞におけるＴＬＲ－４シグナル伝達は、炎症性サイトカインの産生につながり、腫瘍関連マクロファージのさらなる分極化、線維芽細胞の腫瘍促進がん関連線維芽細胞への変換、樹状細胞の腫瘍関連ＤＣへの変換、および未成熟骨髄細胞の腫瘍形成促進機能の活性化をもたらし得る。したがって、いくつかの態様において、本開示の方法および組成物は、（ｉ）炎症性サイトカインの産生を阻害もしくは低減する、（ｉｉ）腫瘍関連マクロファージの分極を低減もしくは阻害する、（ｉｉｉ）線維芽細胞の腫瘍促進がん関連線維芽細胞への変換を低減もしくは阻害する、（ｉｖ）樹状細胞の腫瘍関連ＤＣへの変換を低減もしくは阻害する、（ｖ）未成熟骨髄細胞の腫瘍形成促進機能の活性化を低減もしくは阻害する、または（ｖｉ）それらの任意の組み合わせが可能である。
ＴＬＲ－４活性化の増加は、インスリン抵抗性に関連している。したがって、肥満または糖尿病に関して、本明細書に開示される方法および組成物を使用して、インスリン抵抗性を低減または予防することができる。
子宮内感染におけるＴＬＲ－４活性化は、子宮平滑筋の収縮につながる。したがって、本明細書に開示される方法および組成物を使用して、子宮平滑筋収縮を予防または阻害することができる。
ＴＬＲ－４の活性化は、いくつかの自己免疫性炎症性疾患、例えば、ヒト全身性硬化症（ＳＳｃ）、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、乾癬、多発性硬化症、または自己免疫性糖尿病にも関連しており、特にＴＬＲ－４の阻害は、線維症、例えば、皮膚または肺の線維症を低減することが観察されている。したがって、本明細書に開示される方法および組成物を使用して、ヒト全身性硬化症（ＳＳｃ）、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、乾癬、多発性硬化症、または自己免疫性糖尿病などのＴＬＲ－４の発現および／または活性化の増加に関連する自己免疫炎症性疾患の症状を治療または寛解することができる。いくつかの態様において、本明細書に開示される方法および組成物を使用して、ヒト全身性硬化症（ＳＳｃ）、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、乾癬、多発性硬化症、または自己免疫性糖尿病などのＴＬＲ－４の発現および／または活性化の増加に関連する自己免疫炎症性疾患における線維症を阻害または低減することができる。
いくつかの態様において、本明細書に開示される方法および組成物を使用して、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、および血管性認知症疾患を含む中枢神経疾患の症状および後遺症のうちのいずれかを治療、予防（例えば、抑制、阻害もしくは遅延）、または寛解することができる。
本開示がより詳細に記載される前に、本開示は、記載された特定の組成物またはプロセスステップに限定されず、そのようなものとして、当然のことながら変化し得ることを理解されたい。本開示を読むと当業者には明らかとなるように、本明細書に記載および図示された個々の態様のそれぞれは、本開示の範囲または趣旨から逸脱することなく他のいくつかの態様のうちのいずれかの特徴から容易に分離され得るか、または組み合わせることができる別個の構成要素および特徴を有する。任意の列挙された方法は、列挙された事象の順序で、または論理的に可能な任意の他の順序で実行することができる。
本明細書で提供される見出しは、本明細書全体を参照することによって定義することができる、本開示の様々な態様の制限ではない。本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用される用語は、特定の態様を説明することのみを目的としており、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
したがって、直下で定義される用語は、明細書全体を参照することによってより完全に定義される。
Ｉ．定義
本説明をより容易に理解できるようにするために、ある特定の用語が最初に定義される。追加の定義は、詳細な説明全体に記載されている。
「ａ」または「ａｎ」実体という用語は、その実体の１つ以上を指すことに留意されたい。例えば、「ヌクレオチド配列」は、１つ以上のヌクレオチド配列を表すと理解される。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」、および「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では交換可能に使用することができる。さらに、特許請求の範囲は、いかなる任意選択的要素をも除外するように起草することができることに留意されたい。したがって、この声明は、請求要素の列挙、または否定的な制限の使用に関連して、「単独で」、「のみ」などの排他的な用語を使用するための先行する基礎として機能することを意図している。
さらに、本明細書で使用される「および／または」は、２つの特定の特徴または構成要素のそれぞれの特定の開示として、他方の有無にかかわらず解釈されるものである。したがって、本明細書において「Ａおよび／またはＢ」などの句で使用される「および／または」という用語は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、および「Ｂ」（単独）を含むことを意図している。同様に、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの句で使用される「および／または」という用語は、以下の態様のそれぞれを包含することを意図している：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）。
態様が「含む」という言葉で本明細書に記載されている場合は常に、そうでなければ「からなる」および／または「本質的にからなる」に関して記載されている類似の態様も提供されることが理解される。
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が関連する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、およびｔｈｅ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは、この開示で使用される多くの用語の一般的な辞書を当業者に提供する。
単位、接頭辞、および記号は、国際単位系（Ｓｙｓｔｅｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ Ｕｎｉｔｅｓ（ＳＩ））で承認された形式で示される。数値範囲には、範囲を定義する数値が含まれる。値の範囲が記載されている場合、その範囲の記載された上限と下限との間にあるそれぞれの介在整数値、およびそのそれぞれの分数もまた、そのような値の間のそれぞれの部分範囲とともに具体的に開示されることが理解されるべきである。任意の範囲の上限および下限は、独立して、範囲に含まれるか、または範囲から除外され得、いずれか、もしくは両方の極限値が含まれるか、またはいずれの限界値も含まれないそれぞれの範囲もまた、本開示に包含される。したがって、本明細書に記載されている範囲は、記載されているエンドポイントを含む、範囲内のすべての値の省略形であると理解されている。例えば、１～１０の範囲は、任意の数、数の組み合わせ、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０からなる群からの部分範囲を含むと理解される。
値が明示的に記載されている場合、記載されている値とほぼ同じ数量または量である値もまた、本開示の範囲内であることが理解されるべきである。組み合わせが開示される場合、その組み合わせの要素のそれぞれの部分的組み合わせも具体的に開示され、本開示の範囲内である。逆に、異なる要素または要素の群が個々に開示される場合、それらの組み合わせも開示される。開示のいずれかの要素が複数の代替案を有するものとして開示される場合、それぞれの代替案が単独で、または他の代替案との任意の組み合わせで除外されるその開示の例もまた、本明細書に開示される。開示の複数の要素がそのような除外を有することができ、そのような除外を有する要素のすべての組み合わせが本明細書に開示される。
ヌクレオチドは、一般的に受け入れられている１文字のコードで参照される。特に明記しない限り、ヌクレオチド配列は、５’から３’の方向で左から右に書かれている。ヌクレオチドは、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会が推奨する一般的に知られている１文字の記号で本明細書で参照される。したがって、「ａ」はアデニンを表し、「ｃ」はシトシンを表し、「ｇ」はグアニンを表し、「ｔ」はチミンを表し、「ｕ」はウラシルを表す。
アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの方向で左から右に書かれている。アミノ酸は、本明細書では、一般的に知られている３文字の記号、またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会が推奨する１文字の記号のいずれかで参照される。
約：「約」という用語は、本明細書では、およそ、大まかに、その周辺、または～の領域内を意味するために使用される。「約」という用語が数値範囲と併せて使用される場合、それは、示された数値の上下の境界を拡張することによってその範囲を修正する。一般に、「約」という用語は、例えば、１０パーセント上または下（より高いまたはより低い）の変動によって、記載された値の上下の数値を修正することができる。本明細書で使用される場合、一連の値または範囲に適用される場合、「約」または「少なくとも約」という用語は、リストのすべてのメンバーに等しく適用される。したがって、「少なくとも約１、２、３、４…」は、「少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４…」と交換可能である。
投与：「投与」、「投与すること」という用語、およびそれらの文法的変形は、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）などの組成物を、薬学的に許容される経路を介して対象に導入することを指す。本開示のアプタマーなどの組成物の対象への導入は、経口、肺、鼻腔内、非経口（静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下）、直腸、リンパ管内、髄腔内、眼周囲または局所的を含む、任意の好適な経路によることができる。投与には、自己投与および他者による投与が含まれる。
好適な投与経路は、組成物またはアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）がその意図された機能を実施することを可能にする。例えば、好適な経路が静脈内または動脈内である場合、組成物は、組成物または薬剤を対象の静脈または動脈に導入することによって投与される。
アンタゴニスト：本明細書で使用される場合、「アンタゴニスト」という用語は、受容体に結合したときに生物学的応答自体を誘導するのではなく、アゴニスト媒介応答を遮断または弱める分子を指す。多くのアンタゴニストは、受容体上の構造的に定義された結合部位で内因性リガンドまたは基質と競合することによってそれらの効力を達成する。アンタゴニストは、競合的、非競合的、または不競合的アンタゴニストであり得る。本開示のいくつかの態様において、アンタゴニストは、ＴＬＲ－４アンタゴニスト、例えば、ＡｐＴＯＬＬなどの本開示のアプタマーである。
抗体：本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、天然または部分的もしくは全体的に合成された免疫グロブリン、およびそのフラグメントを包含する。この用語はまた、免疫グロブリン結合ドメインに相同である結合ドメインを有する任意のタンパク質を包含する。「抗体」は、抗原に特異的に結合して認識する免疫グロブリン遺伝子またはそのフラグメントからのフレームワーク領域を含むポリペプチドをさらに含む。抗体という用語の使用は、全抗体、ポリクローナル、モノクローナルおよび組換え抗体、それらのフラグメントを含むことを意味し、さらに、一本鎖抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、キメラ、マウス－ヒト、マウス－霊長類、霊長類－ヒトモノクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、およびＦｄフラグメントなどの抗体フラグメント、ダイアボディ、ならびに抗体関連ポリペプチドを含む。抗体は、それらが所望の生物学的活性または機能を示す限り、二重特異性抗体および多重特異性抗体を含む。本開示のいくつかの態様において、生物学的に活性な分子は、抗体またはその抗原結合フラグメントを含む分子である。
およそ：本明細書で使用される場合、「およそ」という用語は、関心対象の１つ以上の値に適用される場合、記載された参照値と同様の値を指す。ある特定の態様において、「およそ」という用語は、特に明記されていない限り、または文脈から明らかでない限り、記載された参照値のいずれかの方向に（より大きいまたは小さい）１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下の範囲内にある値の範囲を指す（そのような数値が可能な値の１００％を超える場合を除く）。
アプタマー：本明細書で使用される場合、「アプタマー」という用語は、従来のワトソン・クリック塩基対合以外の相互作用を介して、モノクローナル抗体に匹敵する高い特異性および親和性で分子標的に結合することを可能にする特定の三次構造を採用する一本鎖核酸鎖を指す。一般に、アプタマーは、指数関数的濃縮（ＳＥＬＥＸ）技術によるリガンドの系統的進化によってコンビナトリアルライブラリーから選択される。ＳＥＬＥＸは、高い特異性およびナノモル親和性で細胞外および細胞内の標的分子を認識して選択的に結合するＤＮＡおよびＲＮＡアプタマーを同定するために使用される。生理学的条件下で折り畳まれると、アプタマーは、それらのヌクレオチド配列に基づいて固有の三次元構造を獲得し、これは、それらの標的に対する選択性および親和性を与えるアプタマーの三次構造である。
アプタマー結合部位：「アプタマー結合部位」という用語は、相補的アプタマーが特異的に結合する連続または不連続部位（すなわち、エピトープ）を含むＴＬＲ－４の細胞外領域内の領域を指す。したがって、アプタマー結合部位は、エピトープを超え、結合親和性および／もしくは安定性などの特性を決定するか、または抗原酵素活性もしくは二量体化などの特性に影響を与えることができる、ＴＬＲ－４配列内の追加の領域を含むことができる。したがって、２つのアプタマーがＴＬＲ－４の細胞外領域内の同じエピトープに結合する場合でも、アプタマーがエピトープの外側のアミノ酸との別個の分子間接触を確立する場合、そのようなアプタマーは、別個のアプタマー結合部位に結合するとみなされる。
本開示のアプタマー：「本開示のアプタマー」という用語およびその文法的変形は、ＴＬＲ－４の細胞外ドメインに位置するエピトープに結合することができ、ＴＬＲ－４媒介性シグナル伝達を調節することができる、例えば、ＴＬＲ－４アンタゴニストとして作用することができるアプタマーを指す。いくつかの態様において、本開示のアプタマーは、ＮＦ－κＢ細胞内シグナル伝達経路の活性化および／または炎症性サイトカイン産生を防止または低減する。いくつかの態様において、本開示のアプタマーは、本明細書に開示される疾患または状態（例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、もしくは多発性硬化症）の発症後に放出される炎症反応を遮断する。いくつかの態様において、本開示のアプタマーは、配列番号１～４のアプタマー、あるいはその変異体（例えば、配列番号１～４のアプタマーに対してある特定のパーセンテージの配列同一性を有するアプタマー）または誘導体（例えば、配列番号１～４のアプタマーもしくはそのアプタマーに共有結合的にもしくは非共有結合的に付着した少なくとも１つの生物学的に活性な分子を含むその変異体）である。
他の態様において、本開示のアプタマーは、ＴＬＲ－４細胞外ドメインへの結合について配列番号１～４のアプタマーと競合するアプタマーである。さらに別の態様において、本開示のアプタマーは、配列番号１～４のアプタマーが結合するエピトープと部分的にまたは完全に重複するＴＬＲ－４細胞外ドメインエピトープに結合するアプタマーである。他の態様において、本開示のアプタマーは、表１に開示されているアプタマーまたはその変異体もしくは誘導体である。
結合：「結合」という用語は、少なくとも２つの実体、例えば、アプタマーとその標的エピトープ、アプタマーと標的タンパク質、またはアプタマーと標的細胞との間の物理的相互作用を指す。
結合親和性：「結合親和性」は、一般に、分子の単一の結合部位（例えば、本開示のアプタマー）とその結合パートナー（例えば、ＴＬＲ－４）との間の非共有相互作用の合計の強さを指す。特に明記しない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、アプタマーおよびＴＬＲ－４）間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのパートナーＹに対する親和性は、一般に、そのＫａ（会合定数）またはその解離定数（Ｋｄ）（これは会合定数の逆数である）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載されているものを含む、当該技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。低親和性結合分子、例えば、低親和性アプタマーは、一般に、標的エピトープにゆっくりと結合し、容易に解離する傾向があるが、高親和性分子、例えば、高親和性アプタマーは、一般に、標的エピトープにより速く結合し、より長く結合されたまま残る傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が当該技術分野で知られており、それらのいずれも本開示の目的のために使用することができる。
本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）がＴＬＲ－４に特異的に結合する能力は、例えば、酵素結合オリゴヌクレオチドアッセイ（ＥＬＯＮＡ）、酵素結合アプタマー吸着剤アッセイ（ＥＬＡＳＡ）、沈殿および定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）などのインビトロ結合アッセイによって、またはアプタヒストケミストリー、アプタサイトケミストリー、蛍光顕微鏡法もしくはフローサイトメトリーなどの蛍光技法によって決定することができる。同様に、ＴＬＲ－４への特異的結合の能力およびＴＬＲ－４に対するアプタマーの親和性の両方は、ゲル移動度シフトアッセイ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、動的キャピラリー電気泳動および蛍光結合アッセイなどの当業者に周知の技法によって決定することができる。簡単に言えば、蛍光結合アッセイは、異なる濃度（例えば、０～１００ｎＭ）の標識された本発明のアプタマー（例えば、カルボキシフルオレセイン、ＦＡＭ）を有するＴＬＲ－４でコーティングされた磁気ボールのインキュベーション、ならびに結合したアプタマーのその後の溶出および検出からなり、解離定数（Ｋｄ）は、非線形フィット分析によって計算される。
結合特異性：「特異性」または「結合特異性」という用語は、結合分子、例えば、本開示のアプタマーが異なるエピトープに対してあるエピトープに優先的に結合する能力を指し、必ずしも高い親和性を意味するわけではない。「結合特異性」および「特異性」という用語は交換可能に使用され、（ｉ）結合分子（例えば、アプタマー）の特定の部分、および（ｉｉ）結合分子が特定のエピトープに特異的に結合する能力の両方を指し得る。アプタマーとその標的エピトープとの間に特異的な相互作用がある場合、結合分子、例えば、アプタマーは「特異的に結合する」。「特異的に結合する」という用語は、アプタマーがその標的エピトープに結合するように生成されていることを意味する。「非特異的結合」という用語は、アプタマーが標的エピトープに特異的に結合するように生成されていないが、何らかの形で非特異的手段を介してエピトープに結合することを意味する。
生物学的に活性な分子：本明細書で使用される「生物学的に活性な分子」という用語は、共有結合的にまたは非共有結合的に本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）に付着することができる任意の分子を指し、この分子は、必要としている対象において治療もしくは予防効果を有し得るか、または診断目的で使用され得る。したがって、例として、生物学的に活性な分子という用語は、タンパク質（例えば、抗体、タンパク質、ポリペプチド、ならびにそれらの誘導体、フラグメント、および変異体）、脂質およびその誘導体、炭水化物（例えば、糖タンパク質中のグリカン部分）、または小分子を含む。いくつかの態様において、生物学的に活性な分子は、放射性同位体である。いくつかの態様において、生物学的に活性な分子は、検出可能な部分、例えば、放射性核種、蛍光分子、または造影剤である。いくつかの態様において、生物学的に活性な分子は、本開示のアプタマーに共有結合的に付着することができる。いくつかの態様において、生物学的に活性な分子は、アプタマーに直接付着している。他の態様において、生物学的に活性な分子は、リンカーを介してアプタマーに付着している。
保存された：本明細書で使用される場合、「保存された」という用語は、それぞれ、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のヌクレオチドまたはアミノ酸残基を指し、これらは、比較される２つ以上の配列の同じ位置で変化せずに生じるものである。比較的保存されているヌクレオチドまたはアミノ酸は、配列の他の場所に現れるヌクレオチドまたはアミノ酸よりも関連性の高い配列間で保存されているものである。
いくつかの態様において、２つ以上の配列は、それらが互いに１００％同一である場合、「完全に保存されている」または「同一である」と言われる。いくつかの態様において、２つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である場合、「高度に保存されている」と言われる。いくつかの態様において、２つ以上の配列は、それらが互いに約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％、約９８％、または約９９％同一である場合、「高度に保存されている」と言われる。いくつかの態様において、２つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも３０％同一、少なくとも４０％同一、少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である場合、「保存されている」と言われる。いくつかの態様において、２つ以上の配列は、それらが互いに約３０％同一、約４０％同一、約５０％同一、約６０％同一、約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、または約９９％同一である場合、「保存されている」と言われる。配列の保存は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの全長に適用することができるか、またはその一部、領域もしくは特徴に適用することができる。
交差競合：結合分子、例えば、本開示のアプタマーに関して本明細書で使用される「競合」または「交差競合」という用語は、第１の結合分子、例えば、第１のアプタマーが、第２の結合分子、例えば、第２のアプタマーの結合と十分に類似した方法でエピトープに結合することを意味し、それにより第１の結合分子とその同族エピトープとの結合の結果は、第２の結合分子の非存在下での第１の結合分子の結合と比較して、第２の結合分子の存在下で検出可能に減少される。
第２の結合分子のそのエピトープへの結合もまた、第１の結合分子の存在下で検出可能に減少する代替案は、そうであり得るが、そうである必要はない。すなわち、第１の結合分子は、その第２の分子がそのそれぞれのエピトープへの第１の結合分子の結合を阻害することなく、そのエピトープへの第２の結合分子の結合を阻害することができる。しかしながら、それぞれの結合分子が他の結合分子とその同族のエピトープ（または二重特異性結合分子の場合はエピトープ）との結合を検出可能に阻害する場合、同じ程度、より大きい程度、またはより小さい程度であるかどうかにかかわらず、結合分子は、「それぞれのエピトープの結合について互いに「交差競合」すると言われる。競合する結合分子および交差競合する結合分子の両方が、本開示に包含される。
アプタマーが交差競合して、１つのアプタマーのみが所与の時点でエピトープに結合できる場合、すなわち、一方の結合分子が、他方の結合または調節効果を防ぐ場合、アプタマーは「同じエピトープに結合する」または「同じ結合部位を含む」または「本質的に同じ結合」特性を有すると言われる。
本明細書における競合は、例えば、競合ＥＬＯＮＡもしくはＥＬＡＳＡ分析または当該技術分野で知られている任意の適切な方法によって決定して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％よりも大きな相対的阻害を意味する。特定の状況における競合の好適なレベルが何であるかの基準として、相対的阻害のより高い閾値を設定することが望ましい場合がある。したがって、例えば、競合的結合の基準を設定することが可能であり、アプタマーが十分に競合的であるとみなされる前に、少なくとも約４０％の相対的阻害、または少なくとも約４５％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約５５％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約６５％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約７５％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約８５％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは約９５％、もしくはさらには約１００％の相対的阻害が検出される。
から誘導される：本明細書で使用される「から誘導される」、「誘導体」（例えば、「核酸誘導体」もしくは「アプタマー誘導体」）という用語、またはそれらの任意の文法的変形は、特定の分子（例えば、本開示の核酸アプタマー）から単離されるか、またはそれを使用して作製される成分を指す。例えば、第１の核酸配列（例えば、親アプタマー）から誘導される核酸配列（例えば、アプタマー）は、第１の核酸配列のヌクレオチド配列と同一または実質的に類似するヌクレオチド配列を含み得る。ヌクレオチドの場合、誘導種は、例えば、天然に存在する変異誘発、人工的指向性変異誘発、または人工的ランダム変異誘発によって得ることができる。ヌクレオチドを誘導するために使用される変異誘発は、意図的に指向されるか、意図的にランダムであるか、またはそれぞれの混合であり得る。最初のものから誘導される異なるヌクレオチドを創出するためのヌクレオチドの変異誘発は、ランダムな事象（例えば、ポリメラーゼの不忠実によって引き起こされる）であり得、誘導されたヌクレオチドの同定は、適切なスクリーニング方法によって行われ得る。
いくつかの態様において、本開示の誘導されたヌクレオチド配列は、例えば、コンビナトリアルケミストリーを使用して、特定の位置のヌクレオチド単位を化学的に修飾して、特定の位置のヌクレオチド単位をヌクレオチド類似体で置換して、骨格の化学結合を修飾して、ヌクレオチド配列を生物学的に活性な分子と融合もしくはコンジュゲートして、またはそれらの任意の組み合わせで生成され得る。
いくつかの態様において、誘導された核酸配列は、例えば、
（ｉ）別の治療薬（例えば、別のＴＬＲアンタゴニスト）へのコンジュゲーション、
（ｉｉ）標的化を容易にする部分（例えば、リガンド、結合部分、またはアプタマーをある特定の細胞もしくは組織に向ける部分）へのコンジュゲーション、
（ｉｉｉ）（例えば、ヌクレアーゼに対する抵抗性を調節すること、または腎臓もしくは肝臓のクリアランスを変化させることによって）血漿半減期を調節する、すなわち増加または減少させる部分へのコンジュゲーション、
（ｉｖ）送達部分へのコンジュゲーション（例えば、ＰＥＧまたは血液脳関門を通過する輸送を促進するであろう脂質、ペプチド、もしくは炭水化物などの生体高分子）、あるいは
（ｖ）それらの任意の組み合わせによって生成され得る。
いくつかの態様において、第１のヌクレオチド配列（例えば、親アプタマー）から誘導されるヌクレオチド配列（例えば、アプタマー）は、第１のヌクレオチド配列に対してそれぞれ少なくとも約５０％、少なくとも約５１％、少なくとも約５２％、少なくとも約５３％、少なくとも約５４％、少なくとも約５５％、少なくとも約５６％、少なくとも約５７％、少なくとも約５８％、少なくとも約５９％、少なくとも約６０％、少なくとも約６１％、少なくとも約６２％、少なくとも約６３％、少なくとも約６４％、少なくとも約６５％、少なくとも約６６％、少なくとも約６７％、少なくとも約６８％、少なくとも約６９％、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有し、第１のヌクレオチド配列は、第２のヌクレオチド配列の生物活性（本開示のアプタマーの場合、例えば、そのＴＬＲ－４エピトープに特異的に結合し、ＴＬＲ－４を阻害する能力）を保持する。
相補的：「相補的」および「相補性」という用語は、ワトソン・クリック塩基対合則によって互いに関連する２つ以上のオリゴマー（すなわち、それぞれが核酸配列を含む）、またはオリゴマーと標的遺伝子との間を指す。例えば、核酸配列「Ｔ－Ｇ－Ａ（５’→３’）」は、核酸配列「Ａ－Ｃ－Ｔ（３’→５’）」に相補的である。相補性は「部分的」であり得、この場合、すべてではないが第１の核酸配列の核酸塩基が、塩基対合則に従って第２の核酸配列の他の核酸塩基と一致する。例えば、いくつかの態様において、所与の核酸配列と他の核酸配列との間の相補性は、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％または約９５％であり得る。または、この例を続けると、所与の核酸配列と他の核酸配列との間に「完全な」または「完璧な」（１００％）相補性があり得る。核酸配列間の相補性の程度は、配列間のハイブリダイゼーションの効率および強度に大きな影響を及ぼす。
有効量：本明細書で使用される場合、薬剤、例えば、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の「有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果、例えば、臨床結果をもたらすのに十分な量であり、したがって、「有効量」は、それが適用されている状況に依存する。例えば、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、もしくは多発性硬化症を治療する、またはＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、もしくは多発性硬化症と関連した後遺症および／または症状を寛解または予防（例えば、抑制、阻害もしくは遅延）する薬剤を投与する状況において、有効量の薬剤、例えば、本開示のアプタマーは、例えば、薬剤の投与なしで得られた応答と比較して、例えば、組織損傷、組織炎症、生理学的、身体的、もしくは行動的症状もしくは後遺症、またはそれらの任意の組み合わせを低減もしくは減少させるのに十分な量である。
「有効量」という用語は、「有効用量」、「治療有効量」、または「治療有効用量」と交換可能に使用することができる。特定の態様において、この用語は、例えば、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、もしくは多発性硬化症の症状または後遺症を治療、予防、低減、または寛解することができる本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の量を指す。
特定の態様において、この用語は、未治療の対象または未治療の対象の母集団から得られた参照値と比較して、（ｉ）損傷組織の低減、（ｉｉ）炎症の低減、（ｉｉｉ）神経学的転帰の改善、（ｉｖ）炎症性バイオマーカー（例えば、インターフェロン－γ、インターロイキン－１２ｐ７０、ＴＮＦα、ＩＬ－６、もしくはそれらの任意の組み合わせ）のレベルの低下、（ｉｖ）運動および／または行動スコアの改善（例えば、可動性もしくは刺激に対する応答の改善）、（ｖ）生存率の増加、（ｖｉ）生活の質の向上、（ｖｉｉ）疼痛もしくは不快感の軽減、あるいは（ｖｉｉｉ）それを必要とする対象におけるそれらの任意の組み合わせを達成するために必要とされる本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の量を指す。
エピトープ：本明細書で使用される「エピトープ」という用語は、結合分子、例えば、ＡｐＴＯＬＬなどの本開示のアプタマーに結合することができるタンパク質決定基（例えば、ＴＬＲ－４のアミノ酸部分配列）を指す。エピトープは通常、アミノ酸または糖側鎖などの化学的に活性な分子の表面グルーピングからなり、通常、特定の三次元構造特性および特定の電荷特性を有している。エピトープを認識するアプタマーの部分は、パラトープと呼ばれる。エピトープは、それらの構造およびパラトープとの相互作用に基づいて、構造的エピトープおよび線状エピトープの２つのカテゴリーに分類される。構造的エピトープは、標的タンパク質（例えば、ＴＬＲ－４）アミノ酸配列の不連続なセクションで構成されている。これらのエピトープは、標的タンパク質（例えば、ＴＬＲ－４）の３Ｄ表面の特徴および形状または三次構造に基づいて、アプタマーパラトープと相互作用する。対照的に、線状エピトープは、それらの一次構造に基づいてパラトープと相互作用する。線状エピトープは、標的タンパク質（例えば、ＴＬＲ－４）からのアミノ酸の連続配列によって形成される。
賦形剤：「賦形剤」および「担体」という用語は交換可能に使用され、化合物、例えば、本開示の核酸アプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の投与をさらに容易にするために薬学的組成物に添加される不活性物質を指す。
相同性：本明細書で使用される場合、「相同性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間の全体的な関連性を指す。一般に、「相同性」という用語は、２つの分子間の進化的関係を意味する。したがって、相同である２つの分子は、共通の進化の祖先を有するであろう。本開示の文脈において、相同性という用語は、同一性および類似性の両方を包含する。
いくつかの態様において、ポリマー分子は、分子内のモノマーの少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％が同一（まったく同じモノマー）であるか、または類似（保存的置換）である場合、互いに「相同」であるとみなされる。「相同」という用語は、必然的に、少なくとも２つの配列（例えば、ポリヌクレオチド配列）間の比較を指す。
同一性：本明細書で使用される場合、「同一性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、ポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間の全体的なモノマー保存を指す。いかなる追加の修飾子もない「同一」という用語、例えば、核酸Ａは、核酸Ｂと同一であり、配列が１００％同一である（１００％配列同一性）ことを意味する。２つの配列を、例えば、「７０％同一」として説明することは、それらを、例えば、「７０％の配列同一性」を有するものとして説明することと同等である。
２つのポリマー分子、例えば、ポリヌクレオチド配列の同一性パーセントの計算は、例えば、最適な比較目的のために２つの配列を整列させることによって実施することができる（例えば、最適なアラインメントのために、第１および第２のポリヌクレオチド配列の一方または両方にギャップを導入することができ、同一でない配列は、比較の目的で無視することができる）。ある特定の態様において、比較目的のために整列された配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％である。次いで、ポリヌクレオチドの場合、対応する塩基位置の塩基が比較される。
最初の配列の位置が２番目の配列の対応する位置と同じ塩基で占められている場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップの数、および２つの配列の最適な整列のために導入される必要があるそれぞれのギャップの長さを考慮に入れて、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して実行することができる。
好適なソフトウェアプログラムは、様々なソースから、タンパク質配列およびヌクレオチド配列の両方のアラインメントに利用可能である。配列同一性パーセントを決定するための１つの好適なプログラムは、米国政府の国立生物工学情報センターのＢＬＡＳＴウェブサイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から入手可能なプログラムのＢＬＡＳＴスイートの一部であるｂｌ２ｓｅｑである。Ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用して２つの配列間の比較を行う。ＢＬＡＳＴＮは、核酸配列を比較するために使用され、ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸配列を比較するために使用される。他の好適なプログラムは、例えば、Ｎｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、Ｗａｔｅｒ、またはＭａｔｃｈｅｒであり、バイオインフォマティクスプログラムのＥＭＢＯＳＳスイートの一部であり、欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＢＩ）（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ）からも入手可能である。
配列アラインメントは、ＭＡＦＦＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ（Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ ＸまたはＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ）、ＭＵＳＣＬＥなどの当該技術分野で知られている方法を使用して行うことができる。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド参照配列と整列する単一のポリヌクレオチドまたはポリペプチド標的配列内の異なる領域は、それぞれ、それら自体の配列同一性パーセントを有することができる。配列同一性パーセント値は、少数第１位に丸められることに留意されたい。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３、および８０．１４は、８０．１に切り捨てられ、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８、および８０．１９は、８０．２に切り上げられる。長さの値は、常に整数になることにも留意されたい。
ある特定の態様において、第１のアミノ酸配列または核酸配列と第２のアミノ酸配列または核酸配列との同一性のパーセンテージ（％ＩＤ）は、％ＩＤ＝１００×（Ｙ／Ｚ）として計算され、ここで、Ｙは、第１および第２の配列のアラインメントで同一の一致として（例えば、目視検査もしくは特定の配列アラインメントプログラムによって整列されたものとして）スコア付けされたアミノ酸残基または核酸塩基の数であり、Ｚは、第２の配列の残基の総数である。第１の配列の長さが第２の配列よりも長い場合、第２の配列に対する第１の配列のパーセント同一性は、第１の配列に対する第２の配列のパーセント同一性よりも高くなる。
当業者は、配列同一性パーセントの計算のための配列アラインメントの生成が、一次配列データによって排他的に駆動されるバイナリ配列－配列比較に限定されないことを理解するであろう。配列アラインメントは、配列データを、構造データ（例えば、結晶学的タンパク質構造）、機能データ（例えば、変異の位置）、または系統発生データなどの異種ソースからのデータと統合することによって生成できることも理解されよう。異種データを統合して多重配列アラインメントを生成する好適なプログラムは、Ｔ－Ｃｏｆｆｅｅであり、ｗｗｗ．ｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇで入手可能であり、あるいは、例えば、ＥＢＩから入手可能である。配列同一性パーセントを計算するために使用される最終的なアラインメントは、自動または手動のいずれかでキュレートできることも理解されよう。
ＴＬＲ－４を阻害する：「ＴＬＲ－４を阻害する」、「ＴＬＲ－４の阻害」、「ＴＬＲ－４阻害」という用語、およびそれらの文法的変形は、ＴＬＲ－４の活性化および／または活性、例えば、ＴＬＲ－４を介したシグナルの伝達の遮断および／または低減を指す。本開示の文脈において、ＴＬＲ－４のシグナル伝達活性が、天然アゴニスト、例えば、リポ多糖（ＬＰＳ）の存在下でのＴＬＲ－４の活性と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または約１００％低減した場合、ＴＬＲ－４は、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）によって阻害されると考えられる。内毒素としても知られるリポ多糖は、グラム陰性菌の外細胞壁の主要な糖脂質成分である。ＬＰＳ分子は、典型的に、Ｏ抗原として知られる株特異的な遠位多糖側鎖、親水性コアオリゴ糖、およびリピドＡと呼ばれる疎水性ドメインからなる。
いくつかの態様において、ＴＬＲ－４を阻害するという用語は、例えば、（ｉ）ＴＬＲ－４活性化の遮断もしくは完全な阻害、（ｉｉ）ＴＬＲ－４活性化の低減または部分的阻害、（ｉｉｉ）ＴＬＲ－４シグナル伝達活性の遮断もしくは完全な阻害、（ｉｖ）ＴＬＲ－４シグナル伝達活性の低減または部分的阻害、または（ｖ）本開示のアプタマーによるそれらの任意の組み合わせを指す。
本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）がＴＬＲ－４を阻害する能力は、当該技術分野で利用可能な一連のアッセイによって決定することができる。いくつかの態様において、本開示のアプタマーのＴＬＲ－４を阻害する能力は、組換えＴＬＲ－４およびレポーター遺伝子を発現する細胞を用いたインビトロアッセイによって決定され、その発現は、組換えＴＬＲ－４の活性化と関連している。当業者は、使用される細胞および組換え遺伝子に応じて、この方法の複数の変形が存在することを認識するであろう。このアッセイの例は、例えば、米国特許第１０，１９６，６４２号に含まれており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。他の利用可能な技法には、ＴＬＲ－４を発現する細胞によって放出されるＩＬ－１、ＩＬ－８、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－１２などの炎症性サイトカインのレベルの測定が含まれる。
単離された：本明細書で使用される場合、「単離された」、「精製された」、「抽出された」という用語、およびそれらの文法的変形は、交換可能に使用され、精製の１つ以上のプロセスを経ている本開示の所望の組成物（例えば、本開示のアプタマー）の調製物の状態を指す。いくつかの態様において、本明細書で使用される単離または精製は、汚染物質を含む試料から本開示の組成物（例えば、画分）を除去する、部分的に除去するプロセスである。いくつかの態様において、単離された組成物は、検出可能な望ましくない活性を有しないか、または、望ましくない活性のレベルもしくは量が、許容可能なレベルもしくは量以下である。他の態様において、単離された組成物は、許容可能な量および／または濃度および／または活性以上で、本開示の所望の組成物の量および／または濃度を有する。他の態様において、単離された組成物は、組成物が得られる出発物質と比較して濃縮されている。この濃縮は、出発物質と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９％、少なくとも約９９．９９％、少なくとも約９９．９９９％、少なくとも約９９．９９９９％、または９９．９９９９％超であり得る。
いくつかの態様において、単離された調製物は、残留する生物由来物質を実質的に含まない。いくつかの態様において、単離された調製物は、任意の汚染生物物質を１００％含まない、少なくとも約９９％含まない、少なくとも約９８％含まない、少なくとも約９７％含まない、少なくとも約９６％含まない、少なくとも約９５％含まない、少なくとも約９４％含まない、少なくとも約９３％含まない、少なくとも約９２％含まない、少なくとも約９１％含まない、または少なくとも約９０％含まない。残留生物由来物質には、非生物的物質（化学物質を含む）または不要な核酸、タンパク質、脂質、もしくは代謝物が含まれ得る。
連結された：本明細書で使用される「連結された」という用語は、それぞれ、第２のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列に共有結合的にまたは非共有結合的に接合または付着された第１のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列（例えば、本開示のアプタマー）を指す。第１のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列（例えば、本開示のアプタマー）は、第２のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列に直接接合または並置することができるか、あるいは、介在する配列は、第１の配列を第２の配列に共有結合的に接合することができる。「連結された」という用語は、第１のポリヌクレオチド配列の、５’末端または３’末端での第２のポリヌクレオチド配列への融合を意味するだけでなく、第１のポリヌクレオチド配列全体（または第２のポリヌクレオチド配列）の、第２のポリヌクレオチド配列（またはそれぞれ第１のポリヌクレオチド配列）中の任意の２つのヌクレオチドへの挿入も含む。第１のポリヌクレオチド配列は、ホスホジエステル結合またはリンカーによって第２のポリヌクレオチド配列に連結することができる。リンカーは、例えば、ポリヌクレオチドであり得る。
ミスマッチ：「ミスマッチ」または「ミスマッチ（複数）」という用語は、塩基対合則に従い、第２の核酸配列（例えば、本開示のアプタマーの変異体または誘導体）に一致しない第１の核酸配列（例えば、本開示のアプタマー）における（連続または別個の）１つ以上の核酸塩基を指す。完璧な相補性がしばしば所望されるが、いくつかの態様は、親アプタマーに関してアプタマー変異体間に１つ以上、しかし好ましくは２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個のミスマッチを含むことができる。アプタマー内の任意の場所での変動が含まれている。ある特定の態様において、本開示のアプタマーは、末端近く、内部にある核酸塩基配列の変異体を含み、存在する場合、典型的には約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個の５’および／または３’末端のサブユニット内にある。ある特定の態様において、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個の核酸塩基を除去しても、依然としてオンターゲット結合を提供することができる。
調節する：本明細書で使用される場合、「調節する」、「改変する」という用語、およびそれらの文法的変形は、一般に、特定の濃度、レベル、発現、機能または動作に適用される場合、増加または減少させることによって、例えば、アンタゴニストまたはアゴニストとして作用するために、特定の濃度、レベル、発現、機能もしくは動作を直接的もしくは間接的に促進／刺激／上方調節するか、または干渉／阻害／下方調節することによって変化させる能力を指す。場合によっては、モジュレーターは、対照と比較して、または一般に期待されるであろう活性の平均レベルと比較して、または活性の対照レベルと比較して、ある特定の濃度、レベル、活性または機能を増加および／または減少させることができる。
核酸：「核酸」、「核酸分子」、「ヌクレオチド配列」、「ポリヌクレオチド」、およびそれらの文法的変形は、交換可能に使用され、リボヌクレオシドのリン酸エステルポリマー形態（アデノシン、グアノシン、ウリジンもしくはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、もしくはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）、または一本鎖形態もしくは二本鎖らせんのいずれかにおけるホスホロチオエートおよびチオエステルなどのそれらの任意のホスホエステル類似体を指す。
一本鎖核酸配列は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）または一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を指す。二本鎖ＤＮＡ－ＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡおよびＲＮＡ－ＲＮＡらせんが可能である。核酸分子、特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子という用語は、分子の一次および二次構造のみを指し、いかなる特定の三次形態にも限定されない。したがって、この用語には、とりわけ、線状または環状のＤＮＡ分子（例えば、制限フラグメント）、プラスミド、スーパーコイル状のＤＮＡおよび染色体に見られる二本鎖ＤＮＡが含まれる。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を議論する際に、配列は、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡに相同な配列を有する鎖）に沿って５’から３’方向の配列のみを付与する正常な変換に従って本明細書に記載され得る。「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作を受けたＤＮＡ分子である。ＤＮＡとしては、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、合成ＤＮＡ、および半合成ＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。本開示の「核酸組成物」は、本明細書に記載されるような１つ以上の核酸（例えば、核酸アプタマー）を含むことができる。
核酸という用語はまた、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）などの変異体、ならびにそれらの組み合わせ、修飾ヌクレオチドなどを含むそれらの修飾を包含する。核酸は、天然源から精製することができ、組換え発現系を使用して産生することができ、また任意選択で、精製、化学合成などが可能である。適切な場合、例えば、化学的に合成された分子の場合、核酸は、化学的に修飾された塩基または糖、骨格の修飾などを有する類似体などのヌクレオシド類似体を含み得る。
非経口投与：本明細書で使用される「非経口投与」および「非経口的に投与される」という句は、通常は注射による経腸および局所投与以外の投与様式を意味し、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、被膜内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内および胸骨内の注射および注入を含む。いくつかの態様において、非経口投与は、静脈内または動脈内である。いくつかの態様において、静脈内または動脈内投与は、ボーラス投与によるものであり、例えば、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を含む薬学的組成物のゆっくりとしたボーラスの投与によるものである。
薬学的に許容される担体：「薬学的に許容される担体」、「薬学的に許容される賦形剤」という用語、およびそれらの文法的変形は、米国連邦政府の規制当局によって承認された、またはヒトを含む動物で使用するために米国薬局方にリストされた薬剤、ならびに対象への組成物の投与を禁止する程度に望ましくない生理学的効果の生成を引き起こさず、投与された化合物の生物学的活性および特性を無効にしない任意の担体または希釈剤のうちのいずれかを包含する。薬学的組成物を調製するのに有用であり、一般に安全で、毒性がなく、望ましい賦形剤および担体が含まれる。
薬学的組成物：本明細書で使用される場合、「薬学的組成物」という用語は、本明細書に記載の化合物のうちの１つ以上、例えば、薬学的に許容される担体および賦形剤などの１つ以上の他の化学成分と混合された、または混ざり合った、または懸濁されたＡｐＴＯＬＬなどの本開示のアプタマーを指す。薬学的組成物の１つの目的は、対象へのアプタマーの調製物の投与を容易にすることである。
ポリヌクレオチド：「ポリヌクレオチド」という用語は、「核酸」と交換可能に使用され、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、それらの類似体、またはそれらの混合物を含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指す。いくつかの態様において、この用語は、分子の一次構造を指す。したがって、この用語には、三本鎖、二本鎖、および一本鎖のデオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）、ならびに三本鎖、二本鎖、および一本鎖のリボ核酸（「ＲＮＡ」）が含まれる。それはまた、例えば、アルキル化によって、および／またはキャッピングによって修飾された形態、ならびに修飾されていない形態のポリヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、「ポリヌクレオチド」という用語は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２－デオキシ－Ｄ－リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ－リボースを含む）を含み、例えば、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、または二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、スプライシングされているかスプライシングされていないかにかかわらず、プリンまたはピリミジン塩基のＮ－またはＣ－グリコシドである任意の他のタイプのポリヌクレオチド、およびノルムクレオチド主鎖を含む他のポリマー、例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸「ＰＮＡ」）およびポリモルホリノポリマー、ならびに他の合成配列特異的核酸ポリマーを含むが、ポリマーが、ＤＮＡおよびＲＮＡに見られるような塩基対合および塩基スタッキングを可能にする構成で核酸塩基を含むことを条件とする。
いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、例えば、本開示の核酸アプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）であり得る。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡである。いくつかの態様において、ＤＮＡは、合成ＤＮＡ、例えば、合成ｓｓＤＮＡである。いくつかの態様において、合成ＤＮＡは、少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む。いくつかの態様において、ある特定のクラスのすべての核酸塩基は、非天然の核酸塩基で置き換えられている（例えば、本明細書に開示されるポリヌクレオチド中のすべてのウリジンは、非天然の核酸塩基、例えば、５－メトキシウリジンで置き換えることができる）。
ポリペプチド：「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、修飾アミノ酸を含むことができる。これらの用語はまた、自然にまたは介入、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分とのコンジュゲーションなどの任意の他の操作または修飾によって修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する。定義には、例えば、アミノ酸の１つ以上の類似体（例えば、ホモシステイン、オルニチン、ｐ－アセチルフェニルアラニン、Ｄ－アミノ酸、およびクレアチンなどの非天然アミノ酸を含む）、ならびに当該技術分野で知られている他の修飾を含有するポリペプチドも含まれる。本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを指す。ポリペプチドには、遺伝子産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、ホモログ、オルソログ、パラログ、フラグメントならびにそれらの他の同等物、変異体、および類似体が含まれる。ポリペプチドは、単一のポリペプチドであり得るか、または二量体、三量体または四量体などの多分子複合体であり得る。それらはまた、一本鎖または多鎖ポリペプチドを含み得る。最も一般的なジスルフィド結合は、多鎖ポリペプチドに見られる。ポリペプチドという用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学類似体である、アミノ酸ポリマーにも適用できる。いくつかの態様において、「ペプチド」は、５０アミノ酸長以下、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長であり得る。いくつかの態様において、ポリペプチドは、本開示のアプタマーに共有結合的にまたは非共有結合的に付着することができる。
予防する：本明細書に開示される疾患もしくは状態、またはその症状もしくは後遺症に適用される、本明細書で使用される「予防する」、「阻害する」、「抑制する」という用語およびそれらの変形は、例えば、以下を指す。
（ｉ）疾患、障害および／または状態、例えば、本明細書に開示される任意のＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態（例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、血管性認知症疾患、もしくは虚血性脳卒中）の発症を部分的または完全に遅らせる；
（ｉｉ）特定の疾患、障害、および／または状態、例えば、本明細書に開示される任意のＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態（例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、血管性認知症疾患、もしくは虚血性脳卒中）の１つ以上の症状、特徴、または臨床徴候の発症を部分的または完全に遅らせる；
（ｉｉｉ）特定の疾患、障害、および／または状態、例えば、本明細書に開示される任意のＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態（例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、血管性認知症疾患、もしくは虚血性脳卒中）の１つ以上の症状、特徴、または徴候の発症を部分的または完全に遅らせる；
（ｉｖ）特定の疾患、障害および／または状態、例えば、本明細書に開示される任意のＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態（例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、血管性認知症疾患、もしくは虚血性脳卒中）からの進行を部分的または完全に遅らせる；ならびに／あるいは
（ｖ）疾患、障害、および／または状態、例えば、本明細書に開示される任意のＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態（例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、血管性認知症疾患、もしくは虚血性脳卒中）と関連した病理を発達させるリスクを低下させる。
いくつかの態様において、転帰の予防、阻害、または抑制は、予防的治療を通して、例えば、本開示のアプタマーを投与することによって達成される。
予防的：本明細書で使用される場合、「予防的」は、疾患または状態、例えば、本明細書に開示される任意のＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態（例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、血管性認知症疾患、もしくは虚血性脳卒中）の発症を予防、阻害、抑制するため、あるいは疾患または状態、例えば、本明細書に開示される任意のＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態（例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、血管性認知症疾患、もしくは虚血性脳卒中）と関連した症状を予防、阻害、抑制、または遅延させるために使用される治療薬または一連の行為を指す。
いくつかの態様において、予防効果は、本開示のアプタマー、例えば、ＡｐＴＯＬＬを、本明細書に開示される任意のＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態（例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、血管性認知症疾患、もしくは虚血性脳卒中）のリスクがある対象、あるいは本明細書に開示される任意のＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態の発症後にある特定の症状または後遺症（例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、血管性認知症疾患、もしくは虚血性脳卒中）のリスクがある対象に投与することによって達成され得る。
予防：本明細書で使用される場合、「予防」は、健康を維持し、本明細書に開示されるＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態（例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、血管性認知症疾患、もしくは虚血性脳卒中）の発症を予防、阻害、抑制、または遅延させるか、あるいは本明細書に開示されるＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態の発生と関連した症状（例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、血管性認知症疾患、もしくは虚血性脳卒中）を予防、抑制、抑制、または遅延させるために取られる手段を指す。いくつかの態様において、本開示のアプタマーは、本明細書に開示されるＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態（例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、血管性認知症疾患、もしくは虚血性脳卒中）の予防に使用することができる。
類似性：本明細書で使用される場合、「類似性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、ポリヌクレオチド分子間（例えば、ＤＮＡ分子および／もしくはＲＮＡ分子）、ならびに／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。ポリマー分子の相互の類似性パーセントの計算は、同一性パーセントの計算と同じ方法で実施することができるが、類似性パーセントの計算は、当該技術分野で理解されているように保存的置換を考慮に入れる。類似性のパーセンテージは、使用される比較スケール、すなわち、アミノ酸が、例えば、それらの進化的近接性、電荷、体積、柔軟性、極性、疎水性、芳香族性、等電点、抗原性、またはそれらの組み合わせに従って比較されるかどうかを条件とすることが理解される。
対象：「対象」、「患者」、「個体」、および「宿主」という用語、およびそれらの変形は、本明細書で交換可能に使用され、限定されないが、診断、治療、または治療法が所望されるヒト、飼育動物（例えば、イヌ、ネコなど）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）、および実験動物（例えば、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモットなど）を含む、任意の哺乳動物対象、特にヒトを指す。本明細書に記載の方法は、ヒト治療および獣医用途の両方に適用可能である。
本開示全体を通しての「ＴＬＲ－４」への言及は、ヒト対象に関してヒトＴＬＲ－４を指し、対象がヒト対象でない場合のそれぞれのオルソログ、すなわち、例えば、ウマ、ネコ、またはイヌの対象に本明細書に開示される方法の獣医用途は、ウマ、ネコ、またはイヌのＴＬＲ－４の細胞外ドメインに特異的に結合することができる本開示のアプタマーによるウマ、ネコまたはイヌのＴＬＲ－４の阻害を必要とする。
それを必要とする対象：本明細書で使用される場合、「それを必要とする対象」という句は、例えば、止血を改善するために、本開示のアプタマー、例えば、ＡｐＴＯＬＬーの投与から利益を得るであろう哺乳動物対象などの対象を含む。
感受性：疾患、障害、および／もしくは状態、またはその症状もしくは後遺症の「感受性」または「リスクがある」対象は、疾患、障害および／または状態と診断されていない、および／またはその症状を示していないが、疾患またはその症状を発症する傾向がある。
いくつかの態様において、疾患、障害、および／または状態（例えば、虚血性脳卒中）に感受性またはリスクがある対象は、以下のうちの１つ以上を特徴とし得る：（１）疾患、障害、および／または状態の発症と関連した遺伝子変異；（２）疾患、障害、および／または状態の発症と関連した遺伝子多型；（３）疾患、障害、および／または状態と関連したタンパク質および／または核酸の発現および／または活性の増加および／または減少；（４）疾患、障害、および／または状態の発症と関連した習慣および／またはライフスタイル；（５）疾患、障害、および／または状態の家族歴；ならびに（６）疾患、障害、および／または状態の発症と関連した微生物への曝露および／または感染。
いくつかの態様において、疾患、障害、および／または状態に感受性またはリスクがある対象は、疾患、障害、および／または状態を発症するであろう。いくつかの態様において、疾患、障害、および／または状態に感受性またはリスクがある対象は、疾患、障害、および／または状態を発症しないであろう。
全身投与：本明細書で使用される「全身投与」、「全身的に投与される」、「末梢投与」および「末梢的に投与される」という句は、中枢神経系への直接投与以外の化合物、薬物または他の物質の投与を意味し、患者の系に入り、したがって、代謝および他の同様のプロセス、例えば、静脈内または動脈内投与の対象となる。
標的細胞：本明細書で使用される「標的細胞」という用語は、とりわけ、単球、マクロファージ、ミクログリア細胞、顆粒球および未成熟樹状細胞などの骨髄系細胞、ならびにニューロンなどの他の系統の細胞を含む、ＴＬＲ－４を発現する特定の細胞を指す。特定の態様において、標的細胞は、単球またはマクロファージである。いくつかの態様において、標的細胞は、小膠細胞である。いくつかの態様において、標的細胞は、顆粒球である。いくつかの態様において、標的細胞は、未成熟樹状細胞である。いくつかの態様において、標的細胞は、ニューロンである。いくつかの態様において、本開示のアプタマーは、本明細書に開示される標的細胞の表面上に発現されるＴＬＲ－４に結合する。
治療有効量：本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、所望の治療効果、薬理学的および／または生理学的効果を必要とする対象において、それを生み出すのに十分な本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を含む組成物の量である。予防は治療法とみなすことができるため、治療有効量は、「予防有効量」であり得る。
「治療有効量」という用語はまた、送達される本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を含む組成物の量を意味し、以下のために十分である：
（ｉ）ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、血管性認知症疾患、または虚血性脳卒中を治療する；
（ｉｉ）ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、血管性認知症疾患、または虚血性脳卒中の症状を改善する；
（ｉｉｉ）ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、血管性認知症疾患、または虚血性脳卒中の後遺症を改善する；
（ｉｖ）ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、血管性認知症疾患、または虚血性脳卒中を予防、阻害、抑制、または遅延させる；
（ｖ）ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、血管性認知症疾患、または虚血性脳卒中を遅延させる；
（ｖｉ）ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、血管性認知症疾患、または虚血性脳卒中の後遺症を遅延させる；
（ｖｉｉ）ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、血管性認知症疾患、または虚血性脳卒中の発症を予防、阻害、抑制、または遅延させる；
（ｖｉｉｉ）ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、血管性認知症疾患、または虚血性脳卒中の再発を予防、阻害、抑制、または遅延させる；
（ｉｘ）対象に投与された場合のそれらの任意の組み合わせ（または「治療」という用語の定義において以下に開示される行為のうちのいずれか）
（ａ）ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、血管性認知症疾患、または虚血性脳卒中を患っている；
（ｂ）ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、血管性認知症疾患、または虚血性脳卒中に感受性またはリスクがある；
（ｃ）ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、血管性認知症疾患、または虚血性脳卒中の感受性または再発もしくは悪化のリスクがある；あるいは
（ｄ）例えば、基礎となる感染症、疾患、障害、状態、ライフスタイルに起因するＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、血管性認知症疾患、または虚血性脳卒中のリスクがある；あるいは
（ｅ）それらの任意の組み合わせ。
治療的に有効な転帰：本明細書で使用される場合、「治療的に有効な転帰」という用語は、
（ｉ）ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、血管性認知症疾患、または虚血性脳卒中を患っている；
（ｉｉ）ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、血管性認知症疾患、または虚血性脳卒中に感受性またはリスクがある；
（ｉｉｉ）ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、血管性認知症疾患、または虚血性脳卒中の感受性または再発もしくは悪化のリスクがある；
（ｉｖ）例えば、基礎となる感染症、疾患、障害、状態、ライフスタイルに起因するＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、血管性認知症疾患、または虚血性脳卒中のリスクがある；あるいは
（ｖ）それらの任意の組み合わせである対象において、
とりわけ、効果的に
（ａ）ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、血管性認知症疾患、または虚血性脳卒中を治療する；
（ｂ）ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、血管性認知症疾患、または虚血性脳卒中の症状を改善する；
（ｃ）ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、血管性認知症疾患、または虚血性脳卒中の後遺症を改善する；
（ｄ）ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、血管性認知症疾患、または虚血性脳卒中を予防、阻害、抑制、または遅延させる；
（ｅ）ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、血管性認知症疾患、または虚血性脳卒中を遅延させる；
（ｆ）ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、血管性認知症疾患、または虚血性脳卒中の後遺症を遅延させる；
（ｇ）ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、血管性認知症疾患、または虚血性脳卒中の発症を予防、阻害、抑制、または遅延させる；
（ｈ）ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、血管性認知症疾患、または虚血性脳卒中の再発を予防、阻害、抑制、または遅延させる；あるいは
（ｉ）それらの任意の組み合わせ（または「治療」という用語の定義において以下に開示される作用のうちのいずれか）に十分な治療（例えば、少なくとも１用量の本開示のアプタマー、例えば、ＡｐＴＯＬＬの投与）の転帰を意味する。
ＴＬＲ－４：本明細書で使用される「ＴＬＲ－４」という用語は、膜受容体ｔｏｌｌ様受容体４を指す。ＴＬＲ－４の活性化は、例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－８、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、およびＩＬ－１２などの炎症性サイトカインの放出をもたらすシグナル伝達カスケードを産生し、炎症および細胞損傷を引き起こす。受容体ＴＬＲ－４は、ＡＲＭＤ１０、ＣＤ２８４、ＴＬＲ－４またはｈＴＯＬＬと呼ばれることもある。ヒトにおいて、受容体ＴＬＲ－４は、２０１４年５月２７日にアクセッション番号０００２０６．２でＧｅｎＢａｎｋに登録されており、ＴＬＲ４遺伝子によってコードされている。ＴＬＲ－４にはいくつかのアイソフォームがある。ＴＬＲ－４の異なる構造ドメインの位置を説明するために使用されるアミノ酸番号付けは、８３９アミノ酸長のアイソフォーム（アイソフォーム１、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｏ００２０６－１）を指す。アミノ酸残基１～２３は、シグナル配列を構成し、残基２４～６３１は、細胞外ドメインを構成し、残基６３２～６５２は、膜貫通ドメインを構成し、残基６５３～８３９は、細胞質ドメインを構成する。ＴＬＲ－４アイソフォーム２（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｏ００２０６－２）は、標準的なアイソフォーム１配列のアミノ酸１～４０を欠いている。したがって、アイソフォーム２の細胞外ドメインは、アイソフォーム１のアミノ酸４１～６３１を含む。ＴＬＲ－４アイソフォーム３（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｏ００２０６－３）は、標準的なアイソフォーム１配列のアミノ酸１～２００を欠いている。したがって、アイソフォーム３の細胞外ドメインは、アイソフォーム１のアミノ酸２０１～６３１を含む。
ＴＬＲ－４という用語はまた、多型および天然変異体、例えば、吸入ＬＰＳに対する鈍化反応と関連した対立遺伝子ＴＬＲ－４＊Ｂ（Ｇｌｙ－２９９、Ｉｌｅ－３９９）、または以下の天然に存在する置換のうちの１つ以上を伴う天然変異体も包含する：Ｔ１７５Ａ、Ｑ１８８Ｒ、Ｃ２４６Ｓ、Ｅ２８７Ｄ、Ｄ２９９Ｇ、Ｃ３０６Ｗ、Ｖ３１０Ｇ、Ｎ３２９Ｓ、Ｆ３４２Ｙ、Ｌ３８５Ｆ、Ｔ３９９Ｉ、Ｓ４００Ｎ、Ｆ４４３Ｌ、Ｅ４７４Ｋ、Ｑ５１０Ｈ、Ｋ６９４Ｒ、Ｒ７６３Ｈ、またはＱ８３４Ｈ。
特定の態様において、本開示のアプタマーは、ＴＬＲ－４アイソフォーム１の細胞外ドメイン（すなわち、ＴＬＲ－４アイソフォーム１のアミノ酸２４～６３１）に位置するエピトープに特異的に結合する。
非ヒト対象において、ＴＬＲ－４という用語は、それぞれのＴＬＲ－４、アイソフォーム、多形、および天然変異体を指す。
治療：本明細書で使用される「治療する」、「治療」、「治療法」という用語は、ＴＬＲ－４媒介性の疾患もしくは状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、もしくは虚血性脳卒中の重症度の低下；疾患もしくは状態と関連した１つ以上の症状もしくは後遺症の寛解もしくは排除；または必ずしも疾患もしくは状態を治癒することなく、疾患もしくは状態を有する対象に有益な効果を提供することを指す。この用語はまた、疾患もしくは状態またはその症状もしくはその後遺症の予防または防止（例えば、抑制、阻害もしくは遅延）を含む。
いくつかの態様において、この用語は、例えば、本開示の少なくとも１つのアプタマーによる治療がない場合に予想されるものに関して、疾患または状態を予防する（例えば、抑制もしくは阻害する）；疾患または状態を治癒する；疾患または状態の発症を遅延させる；疾患または状態の重症度を低減する；１つ以上の症状を改善する；１つ以上の後遺症を改善する；１つ以上の症状を予防する（例えば、抑制、阻害、または遅延させる）；１つ以上の後遺症を予防する（例えば、抑制、阻害、または遅延させる）；１つ以上の症状を遅延させる；１つ以上の後遺症を遅延させる；１つ以上の症状を寛解する；１つ以上の後遺症を寛解する；１つ以上の症状の期間を短縮する；１つ以上の後遺症の期間を短縮する；１つ以上の症状の頻度を低減する；１つ以上の後遺症の頻度を低減する；１つ以上の症状の重症度を低減する；１つ以上の後遺症の重症度を低減する；生活の質を向上させる；生存率を高める；疾患または状態の再発を予防する（例えば、抑制、阻害、または遅延させる）；疾患または状態の再発を遅延させるための臨床介入；あるいはそれらの任意の組み合わせを指す。いくつかの態様において、疾患または状態は、ＴＬＲ－４の発現の増加および／またはＴＬＲ－４活性化の増加を特徴とする病理である。
ＩＩ．ＴＬＲ－４結合アプタマーによるＴＬＲ－４媒介性の疾患の治療
本開示は、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、または虚血性脳卒中の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、少なくとも１つの治療上有効な用量の長さ約４０～約１００核酸塩基、例えば、長さ約４０～約８０核酸塩基の核酸アプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）またはその変異体もしくは誘導体を対象に投与することを含む、方法を提供し、アプタマー、変異体または誘導体は、ＴＬＲ－４の細胞外ドメイン上のエピトープに結合し、アプタマーのエピトープへの結合は、ＴＬＲ－４活性化を低減および／または阻害する。一態様において、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態は、虚血性脳卒中、またはその症状もしくは後遺症である。別の態様において、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態は、心筋梗塞、またはその症状もしくは後遺症である。さらに別の態様において、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態は、出血性脳卒中、またはその症状もしくは後遺症である。いくつかの態様において、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態は、出血性変化、またはその症状もしくは後遺症である。別の態様において、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態は、多発性硬化症、またはその症状もしくは後遺症である。
本明細書に開示されるすべての方法は、代替として、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、または虚血性脳卒中の治療に使用するため、上述のような長さ約４０～約１００核酸塩基、例えば、長さ約４０～約８０核酸塩基の核酸アプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）、またはその変異体もしくは誘導体として製剤化され得ることが理解される。あるいは、当該ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態を治療するための薬剤を調製するための核酸アプタマーの使用も提供される。
ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、または虚血性脳卒中の少なくとも１つの症状または後遺症の予防（例えば、抑制、阻害もしくは遅延）を必要とする対象においてそれを行う方法も提供され、少なくとも１つの治療的に有効な用量の、長さ約４０～約１００核酸塩基、例えば、長さ約４０～約８０核酸塩基の核酸アプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）またはその変異体もしくは誘導体を対象に投与することを含み、アプタマー、変異体または誘導体は、ＴＬＲ－４の細胞外ドメイン上のエピトープに結合し、アプタマーのエピトープへの結合は、ＴＬＲ－４活性化を低減および／または阻害する。
本開示はまた、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、または虚血性脳卒中の少なくとも１つの症状の寛解を必要とする対象においてそれを行う方法であって、少なくとも１つの治療上有効な用量の、長さ約４０～約１００核酸塩基、例えば長さ約４０～約８０核酸塩基の核酸アプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）またはその変異体もしくは誘導体を対象に投与することを含む、方法を提供し、アプタマー、変異体または誘導体は、ＴＬＲ－４の細胞外ドメイン上のエピトープに結合し、エピトープへのアプタマーの結合は、ＴＬＲ－４活性化を低減および／または阻害する。
本明細書で使用される「虚血性脳卒中」という用語は、異常なほど突然に脳血流の重要な減少によって引き起こされる神経学的欠損を特徴とする脳卒中のタイプ（脳血管疾患、脳梗塞、または卒中としても知られる）を指す。虚血性脳卒中において、脳塊を灌注する動脈のいずれかの閉塞による血流の突然かつ即時の中断に起因して血液灌注が失われ、梗塞領域の外観を生成する。動脈閉塞は、一般に、別の場所、一般に心臓または他の動脈を起源とするアテローム性動脈硬化症または塞栓症（脳塞栓症）に起因する。虚血性脳卒中は、ＴＬＲ－４の発現の増加および／またはＴＬＲ－４活性化の増加を特徴とする病理である。ＴＬＲ－４の活性化がシグナル伝達カスケードを産生し、ＩＬ－１、ＩＬ－８、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、およびＩＬ－１２などの炎症性サイトカインの放出をもたらし、炎症および細胞損傷を引き起こすことを考えると、ＴＬＲ－４の発現の増加および／またはＴＬＲ－４の活性化の増加を特徴とする病理は、炎症性成分を有することをさらに特徴とし得る。
いくつかの態様において、虚血性脳卒中は、血栓性、塞栓性、または低灌流による可能性がある。いくつかの態様において、虚血性脳卒中は、例えば、アテローム性動脈硬化症、血管炎、椎骨および頸動脈解離、多発性血小板血症、凝固亢進状態、感染症、弁植生、壁血栓、近位源からの動脈－動脈塞栓、脂肪塞栓、敗血症性塞栓、全身性低血圧、鎌状細胞貧血、圧迫血管、心室頻拍、血栓、心呼吸停止、脳卒中、または先天性心臓欠陥をもたらす心不全によって引き起こされ得る。したがって、本開示は、これらの疾患または状態のうちのいずれかの治療を必要とする対象（例えば、虚血性脳卒中を患っている、虚血性脳卒中のリスクがある、もしくは虚血性脳卒中の再発のリスクがある対象）においてそれを行う方法であって、少なくとも１つの治療上有効な用量の、本開示の少なくとも１つのアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を対象に投与することを含む、方法を提供する。
虚血性脳卒中の症状および後遺症は、例えば、意識喪失、失明、緊張性眼球偏位、全体的失語症、書字障害、失読症、計算障害、方向感覚喪失、空間無視、視覚無視、顔面の感覚および／または運動症状ならびに欠陥、四肢（上肢、下肢、もしくは両方）の感覚および／または運動症状、尿失禁、無動性無言症、超皮質運動性失語症、混乱、運動半側空間無視、片麻痺、顔面麻痺、感覚喪失、構音障害、不注意、同側性半盲、ＣＮ欠損、めまい、空間識失調、随意運動不能、複視、嚥下障害、一過性ＡＬＯＣ、転倒発作、立ちくらみ、四肢麻痺、昏睡、閉じ込め症候群、死亡、ミラード・ガブラー症候群、垂直眼球運動の温存、ワンアンドハーフ（ｏｎｅ ａｎｄ ａ ｈａｌｆ）症候群、内側下橋症候群、眼振、運動失調、固有感覚低下、内側中橋症候群、対側麻痺、咽頭／声帯／顔面のミオクローヌス、外側上橋症候群、ホーナー症候群、注視麻痺、顔面／四肢／体幹の痛みまたは体温の喪失、片側性頭痛、視野欠損、視覚失調、外側中脳症候群、対側性片側運動失調、振戦、運動亢進、内側中脳症候群、外側下橋症候群、顔面麻痺、角膜反射の喪失、聴力喪失、四肢および歩行運動失調、ワレンベルグ症候群、しわがれ声、手不器用症候群、内側延髄症候群、舌偏位、または前脊髄動脈症候群を含む。
したがって、本開示はまた、本明細書に開示される虚血性脳卒中の症状および後遺症のうちのいずれかまたはそれらの任意の組み合わせの治療、予防（例えば、抑制、阻害もしくは遅延）、または寛解を必要とする対象においてそれを行う方法であって、少なくとも１つの治療上有効な用量の、本開示の少なくとも１つのアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を対象に投与することを含む、方法を提供する。
本明細書で使用される場合、「出血性脳卒中」という用語は、脳の血管の破裂が起こり、その血液の動脈に依存する脳の領域を奪う状態を指す。さらに、流出した血液は他の血管を含む脳構造を圧迫し、脳内出血に続発する虚血によって患部を増加させる。出血性脳卒中の症状としては、意識の完全または限定的な喪失、吐き気、嘔吐、突然の激しい頭痛、体の片側の顔、脚、もしくは腕の衰弱もしくはしびれ、発作、めまい、平衡感覚の喪失、発話もしくは嚥下の問題、混乱、または方向感覚の喪失を挙げることができる。最も一般的な原因は、動脈瘤である。まれな原因は、動静脈奇形（ＡＶＭ）である。出血性脳卒中には、脳内出血およびくも膜下出血の２種類がある。一般に、出血性脳卒中によって引き起こされる虚血性事象は、虚血性脳卒中について上記した後遺症を引き起こす可能性がある。
したがって、本開示はまた、本明細書に開示される出血性脳卒中（脳内出血もしくはくも膜下出血のいずれか）の症状および後遺症のうちのいずれかまたはそれらの任意の組み合わせの治療、予防（例えば、抑制、阻害もしくは遅延）、または寛解を必要とする対象においてそれを行う方法であって、少なくとも１つの治療上有効な用量の、本開示の少なくとも１つのアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を対象に投与することを含む、方法を提供する。
本明細書で使用される場合、「出血性変化」という用語は、例えば、虚血性脳卒中の結果である無刺激性梗塞の、血性梗塞への変換を指す。したがって、この用語は、死んだ組織または死にかけている組織、例えば、虚血性脳卒中によって通常の血液供給を奪われた脳組織で発生する出血を指す。出血性変化のスペクトルは、軽度の点状出血（出血性梗塞）から重度の大量生産性出血（実質性血腫）の範囲に及ぶ。一般に、例えば、虚血性脳卒中に起因する出血性変化は、虚血性脳卒中について上記した後遺症を引き起こす可能性がある。
本開示はまた、本明細書に開示される出血性変化（例えば、出血性梗塞もしくは実質性血腫）の症状および後遺症のうちのいずれかまたはそれらの任意の組み合わせの治療、予防（例えば、抑制、阻害もしくは遅延）、または寛解を必要とする対象においてそれを行う方法であって、少なくとも１つの治療上有効な用量の、本開示の少なくとも１つのアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を対象に投与することを含む、方法を提供する。
本明細書で使用される場合、「心筋梗塞」（「梗塞」または「心臓発作」としても知られる）という用語は、冠状動脈のうちの１つにおける閉塞によって引き起こされる、心臓の領域における組織損傷を伴う不十分な血液供給を特徴とする病理を指す。そのような閉塞に起因する虚血または心筋への不十分な酸素供給は狭心症を引き起こし、狭心症は、十分に早く再環状化された場合、心臓組織の死を引き起こさないが、この無酸素症が維持される場合、心筋は損傷し、最終的に壊死、すなわち梗塞が起こる。心筋梗塞の原因は、しばしばアテローム性動脈硬化症である。他の考えられる原因は、冠状動脈の痙攣である。心筋梗塞は、心不全、不整脈、心原性ショック、または心停止を引き起こす可能性がある。リスク因子としては、とりわけ、高血圧、喫煙、糖尿病、運動不足、肥満、高血中コレステロール、貧しい食生活、および過剰なアルコール摂取が挙げられる。心筋への血流障害は、虚血性カスケードを引き起こす可能性がある。心筋梗塞は、組織の損傷（主に壊死）を引き起こし、コラーゲン瘢痕の形成をもたらす可能性がある。組織の死および心筋瘢痕は、心臓の正常な伝導経路を変化させ、患部を弱める。したがって、心筋梗塞は、異常な心臓リズム（不整脈）、心臓ブロック、心室の動脈瘤、心臓の炎症、または心臓の破裂などの後遺症につながる可能性がある。
したがって、本開示はまた、本明細書に開示される心筋梗塞の症状および後遺症のうちのいずれかまたはそれらの任意の組み合わせの治療、予防（例えば、抑制、阻害もしくは遅延）、または寛解を必要とする対象においてそれを行う方法であって、少なくとも１つの治療上有効な用量の、本開示の少なくとも１つのアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を対象に投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの態様において、心筋梗塞後の対象への本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の投与は、未治療の対象または未治療の対象集団において観察された心機能（例えば、駆出率および／もしくは短縮率の測定によって決定される）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％の心機能の改善をもたらす。
本明細書で使用される場合、「短縮率」という用語は、心臓のポンプ機能の尺度を指す。これは、弛緩したときの左心室の直径と収縮したときの左心室の直径との比率である。
本明細書で使用される場合、「駆出率」という用語は、それぞれの収縮（または心拍）でチャンバー（通常は心臓）から駆出される流体（通常は血液）の体積分率（または全体の一部）を指す。駆出率は、心臓のポンプ効率の尺度として広く使用されており、心不全のタイプを分類するために使用される。また、心不全の重症度の指標としても使用される。
本明細書で使用される「多発性硬化症」という用語は、中枢神経系の脱髄性、神経変性性および慢性病変の発症を特徴とする病理を指す。様々な自己免疫機序の関与が実証されているが、その原因は現在不明である。多発性硬化症の患者では、リンパ球が血液脳関門を通過してミエリンに影響を及ぼし、マクロファージおよび神経膠細胞に助けられた炎症プロセスが起こる。
脱髄は、神経系の一部のコミュニケーション能力を破壊し、身体的、精神的、時には精神医学的問題を含む様々な徴候および症状をもたらす。特定の症状には、複視、片方の目の失明、筋力低下、感覚の問題、または協調の問題が含まれ得る。多発性硬化症にはいくつかの形態があり、新しい症状は、単独の発作において起こる（再発性の形態）、または時間の経過とともに蓄積する（進行性の形態）。発作の合間に、症状が完全に消失することがあるが、特に疾患が進行するにつれて、永続的な神経学的問題が残ることがよくある。
多発性硬化症は、様々な症状、例えば、感覚の変化（感覚鈍麻）、筋力低下、異常な筋痙攣、動きの困難；協調および平衡障害；発話（構音障害）または嚥下（嚥下障害）の問題、視覚の問題（眼振、視神経炎、ホスフェンもしくは複視）、運動失調、振戦、疼痛、痙攣、性機能障害、痙縮、疲労および急性または慢性の疼痛症候群、膀胱および腸の困難、認知障害、あるいは感情的な症候学（主に大うつ病）を引き起こす可能性がある。障害の進行および症状の重症度の主な臨床的尺度は、拡張障害ステータススケールまたはＥＤＤＳである。最も一般的な認知障害のいくつかは、最近の記憶、注意、処理速度、視覚－空間能力、および実行機能に影響を与える。
ＭＳの主な病態生理学的特徴は、他の原発性脱髄疾患と同様に、中枢神経系、したがって白質と灰白質の両方でのミエリンの喪失である。一方、多発性硬化症の病理の根底にある自己免疫成分は、炎症、脱髄、軸索ネットワークの損傷のプロセスのプロモーターであり、ＴＬＲ－４およびその活性化を引き起こす炎症性シグナル伝達が重要な役割を果たす。
疾患の根底にある病態生理学的プロセスの中で、中枢神経系および末梢神経系の軸索脱髄は重要な役割を果たしており、疾患によって影響を受ける個体により提示される症状の基礎である。ミエリンは、神経インパルスの正しい伝達を可能にする細胞分化であり、オリゴデンドロサイト（中枢神経系）および細胞（末梢神経系）によって生理学的に合成される。
したがって、本開示はまた、本明細書に開示される多発性硬化症の症状および後遺症のうちのいずれかまたはそれらの任意の組み合わせの治療、予防（例えば、抑制、阻害もしくは遅延）、または寛解を必要とする対象においてそれを行う方法であって、少なくとも１つの治療上有効な用量の、本開示の少なくとも１つのアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を対象に投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの態様において、多発性硬化症を有する対象への本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の投与は、臨床スコアの低下をもたらし、より高い臨床スコアは、より高い程度の障害および症状の重症度に関連し、観察された臨床スコアは、未治療の対象または未治療の対象集団において観察された臨床スコア値の約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、または約３０％未満である。
いくつかの態様において、多発性硬化症を有する対象への本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の投与は、対象がフィンゴリモド（ＧＹＬＥＮＹＡ（登録商標））またはメチルプレドニゾロン（ＵＲＢＡＳＯＮ（登録商標））で処理されたときに観察された可動性の増加よりも少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％高い可動性の増加をもたらす。
いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の投与は、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の非存在下で成長するオリゴデンドロサイト前駆細胞において観察された増殖のレベルよりも少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、または少なくとも約５０％高いオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖の増加をもたらし得る。
いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の投与は、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の非存在下で成長するオリゴデンドロサイト前駆細胞において観察された分化のレベルよりも少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、または少なくとも約５０％高いオリゴデンドロサイト前駆細胞の分化の増加をもたらし得る。
いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の、それを必要とする対象への投与は、例えば、急性（例えば、虚血性脳卒中、脳内出血、出血性脳卒中、もしくは出血性変化）、亜急性（例えば、多発性硬化症）、または慢性（例えば、びまん性軸索損傷）ＴＬＲ－４媒介性の疾患もしくは状態の結果として、損傷したニューロン組織の再ミエリン化をもたらし得る。いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を必要とする対象へのその投与は、急性（例えば、虚血性脳卒中、脳内出血、もしくはくも膜下出血）、亜急性（例えば、多発性硬化症）、または慢性（例えば、びまん性軸索損傷）ＴＬＲ－４媒介性の疾患もしくは状態の結果として、その間に損傷したニューロン組織のニューロン増殖および／またはニューロン分化をもたらし得る。したがって、本開示は、急性（例えば、虚血性脳卒中、脳内出血もしくはくも膜下出血）、亜急性（例えば、多発性硬化症）、または慢性（例えば、びまん性軸索損傷）ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態の結果として損傷したニューロン組織を再ミエリン化する方法であって、少なくとも１つの治療上有効な用量の、長さ４０～８０核酸塩基の核酸アプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）またはその変異体もしくは誘導体を対象に投与することを含む、方法を提供し、アプタマー、変異体または誘導体は、ＴＬＲ－４の細胞外ドメイン上のエピトープに結合し、エピトープへのアプタマーの結合は、ＴＬＲ－４活性化を低減および／または阻害する。
いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、または虚血性脳卒中の発症から１６時間以内に投与される。いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、または虚血性脳卒中の発症後、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、５０５、５１０、５１５、５２０、５２５、５３０、５３５、５４０、５４５、５５０、５５５、５６０、５６５、５７０、５７５、５８０、５８５、５９０、５９５、６００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５、９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、または９６０分未満で投与される。
いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、または虚血性脳卒中の発症後、約１時間未満、約２時間未満、約３時間未満、約４時間未満、約５時間未満、約６時間未満、約７時間未満、約８時間未満、約９時間未満、約１０時間未満、約１１時間未満、約１２時間未満、約１３時間未満、約１４時間未満、約１５時間未満、約１６時間未満、約１７時間未満、約１８時間未満、約１９時間未満、約２０時間未満、約２１時間未満、約２２時間未満、約２３時間未満、または約２４時間未満で投与される。
いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、または虚血性脳卒中の発症後、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、または約２４時間で投与される。
いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、または虚血性脳卒中の発症の直後に投与される。
いくつかの態様において、追加用量の本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、その後、最初の用量の後に投与される。いくつかの態様において、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の追加用量が、最初の用量の後に投与される。いくつかの態様において、いくつかの用量が、同日中に投与される。いくつかの態様において、１つ以上のブースター用量の後に、１つ以上の維持用量が続く。いくつかの態様において、すべての用量は、同量の本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を含む。
いくつかの態様において、追加用量の本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、または虚血性脳卒中の発症後、約２時間および約６時間で投与される。他の態様において、追加用量の本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、または虚血性脳卒中の発症後、約２時間、約６時間、約１２時間、および約２４時間でさらに投与される。
いくつかの態様において、特に急性ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態の場合、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、一般に、急性事象後、数分（例えば、１０～６０分）、数時間（例えば、１時間～４８時間）、または数日で投与される。他の態様において、例えば、亜急性（例えば、多発性硬化症）または慢性（例えば、関節リウマチ）ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、数週間、数ヶ月、または数年間投与され得る。
いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、約０．５ｍｇ／日～約８０ｍｇ／日の投与量で投与される。いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、少なくとも約０．５ｍｇ／日、少なくとも約１ｍｇ／日、少なくとも約２ｍｇ／日、少なくとも約５ｍｇ／日、少なくとも約１０ｍｇ／日、少なくとも約１５ｍｇ／日、少なくとも約２０ｍｇ／日、少なくとも約２５ｍｇ／日、または少なくとも約３０ｍｇ／日の投与量で投与される。いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、０．５ｍｇ／日の投与量で投与される。いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、１ｍｇ／日の投与量で投与される。いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、２ｍｇ／日の投与量で投与される。いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、５ｍｇ／日の投与量で投与される。いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、１０ｍｇ／日の投与量で投与される。いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、１５ｍｇ／日の投与量で投与される。いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、２０ｍｇ／日の投与量で投与される。いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、２５ｍｇ／日の投与量で投与される。いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、３０ｍｇ／日の投与量で投与される。
いくつかの態様において、およそ１４ｍｇ／ｋｇ／日の用量の本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、アプタマーが１日２回（例えば、６時間間隔で）、静脈内または動脈内経路（ボーラス）によって１４日間投与される場合、無有害作用量（ＮＯＡＥＬ）とみなされる。いくつかの態様において、健康な対象に投与されるべき最大推奨開始用量（ＭＲＳＤ）は、体重７０ｋｇの対象に対しておよそ３１．５ｍｇである。いくつかの態様において、健康な対象に投与されるべき最大推奨開始用量（ＭＲＳＤ）は、体重７０ｋｇの対象に対しておよそ０．５ｍｇである。
いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、約０．００７ｍｇ／ｋｇ（すなわち、７０ｋｇの対象に対しておよそ０．５ｍｇ／日）の用量で投与される。いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２．２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２．３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２．４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２．６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２．７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２．８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２．９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３．２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３．３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３．４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３．６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３．７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３．８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３．９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約４．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約４．２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約４．３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約４．４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約４．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約４．６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約４．７ｍｇ／ｋｇ、で少なくとも約４．８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約４．９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約５．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約５．２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約５．３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約５．４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約５．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約５．６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約５．７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約５．８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約５．９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約６．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約６．２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約６．３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約６．４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約６．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約６．６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約６．７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約６．８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約６．９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約７．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約７．２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約７．３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約７．４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約７．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約７．６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約７．７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約７．８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約７．９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約８．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約８．２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約８．３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約８．４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約８．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約８．６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約８．７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約８．８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約８．９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約９．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約９．２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約９．３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約９．４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約９．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約９．６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約９．７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約９．８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約９．９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２９ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約３０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与される。
いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、少なくとも約０．００１ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも約０．００２ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも約０．００３ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも約０．００４ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも約０．００５ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも約０．００６ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも約０．００７ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも約０．００８ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも約０．００９ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも約０．０１０ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも約０．０１５ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも約０．０２０ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも約０．０２５ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも約０．０３０ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも約０．０３５ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも約０．０４０ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも約０．０４５ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも約０．０５０ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも約０．０５５ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも約０．０６０ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも約０．０６５ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも約０．０７０ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも約０．０７５ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも約０．０８０ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも約０．０８５ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも約０．０９０ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも約０．０９５ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ／日、約０．１１ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも約０．１２ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも約０．１３ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも約０．１４ｍｇ／ｋｇ／日、または少なくとも約０．１５ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で投与される。
いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、少なくとも約１μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１．１μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１．２μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１．３μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１．４μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１．５μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１．６μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１．７μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１．８μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１．９μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約２μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約２．１μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約２．２μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約２．３μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約２．４μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約２．５μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約２．６μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約２．７μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約２．８μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約２．９μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約３μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約３．１μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約３．２μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約３．３μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約３．４μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約３．５μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約３．６μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約３．７μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約３．８μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約３．９μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約４μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約４．１μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約４．２μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約４．３μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約４．４μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約４．５μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約４．６μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約４．７μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約４．８μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約４．９μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約５μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約５．１μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約５．２μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約５．３μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約５．４μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約５．５μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約５．６μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約５．７μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約５．８μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約５．９μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約６μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約６．１μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約６．２μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約６．３μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約６．４μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約６．５μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約６．６μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約６．７μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約６．８μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約６．９μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約７μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約７．１μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約７．２μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約７．３μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約７．４μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約７．５μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約７．６μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約７．７μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約７．８μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約７．９μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約８μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約８．１μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約８．２μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約８．３μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約８．４μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約８．５μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約８．６μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約８．７μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約８．８μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約８．９μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約９μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約９．１μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約９．２μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約９．３μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約９．４μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約９．５μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約９．６μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約９．７μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約９．８μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約９．９μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１０．１μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１０．２μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１０．３μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１０．４μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１０．５μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１０．６μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１０．７μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１０．８μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１０．９μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１１μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１１．１μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１１．２μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１１．３μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１１．４μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１１．５μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１１．６μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１１．７μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１１．８μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１１．９μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１２μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１２．１μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１２．２μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１２．３μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１２．４μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１２．５μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１２．６μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１２．７μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１２．８μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１２．９μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１３μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１３．１μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１３．２μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１３．３μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１３．４μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１３．５μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１３．６μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１３．７μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１３．８μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１３．９μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１４μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１４．１μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１４．２μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１４．３μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１４．４μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１４．５μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１４．６μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１４．７μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１４．８μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１４．９μｇ／ｋｇ／日、または少なくとも約１５μｇ／ｋｇ／日の投与量で投与される。
いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、少なくとも約１μｇ／ｋｇ／日～少なくとも約２μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約２μｇ／ｋｇ／日～少なくとも約３μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約３μｇ／ｋｇ／日～少なくとも約４μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約４μｇ／ｋｇ／日～少なくとも約５μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約５μｇ／ｋｇ／日～少なくとも約６μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約６μｇ／ｋｇ／日～少なくとも約７μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約７μｇ／ｋｇ／日～少なくとも約８μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約８μｇ／ｋｇ／日～少なくとも約９μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約９μｇ／ｋｇ／日～少なくとも約１０μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ／日～少なくとも約１１μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１１μｇ／ｋｇ／日～少なくとも約１２μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１２μｇ／ｋｇ／日～少なくとも約１３μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１３μｇ／ｋｇ／日～少なくとも約１４μｇ／ｋｇ／日、または少なくとも約１４μｇ／ｋｇ／日～少なくとも約１５μｇ／ｋｇ／日の投与量で投与される。
いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、少なくとも約１μｇ／ｋｇ／日～少なくとも約３μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約３μｇ／ｋｇ／日～少なくとも約６μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約６μｇ／ｋｇ／日～少なくとも約９μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約９μｇ／ｋｇ／日～少なくとも約１２μｇ／ｋｇ／日、または少なくとも約１２μｇ／ｋｇ／日～少なくとも約１５μｇ／ｋｇ／日の投与量で投与される。
いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、少なくとも約１μｇ／ｋｇ／日～少なくとも約４μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約４μｇ／ｋｇ／日～少なくとも約８μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約８μｇ／ｋｇ／日～少なくとも約１２μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１１μｇ／ｋｇ／日～少なくとも約１５μｇ／ｋｇ／日の投与量で投与される。
いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、少なくとも約１μｇ／ｋｇ／日～少なくとも約５μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約５μｇ／ｋｇ／日～少なくとも約１０μｇ／ｋｇ／日、または少なくとも約１０μｇ／ｋｇ／日～少なくとも約１５μｇ／ｋｇ／日の投与量で投与される。
いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、少なくとも約６．５μｇ／ｋｇ／日～少なくとも約７．５μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約６μｇ／ｋｇ／日～少なくとも約８μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約５．５μｇ／ｋｇ／日～少なくとも約８．５μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約５μｇ／ｋｇ／日～少なくとも約９μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約４．５μｇ／ｋｇ／日～少なくとも約９．５μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約４μｇ／ｋｇ／日～少なくとも約１０μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約３．５μｇ／ｋｇ／日～少なくとも約１０．５μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約３μｇ／ｋｇ／日～少なくとも約１１μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約２．５μｇ／ｋｇ／日～少なくとも約１１．５μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約２μｇ／ｋｇ／日～少なくとも約１２μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１．５μｇ／ｋｇ／日～少なくとも約１２．５μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１μｇ／ｋｇ／日～少なくとも約１３μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１μｇ／ｋｇ／日～少なくとも約１３．５μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１μｇ／ｋｇ／日～少なくとも約１４μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１μｇ／ｋｇ／日～少なくとも約１４．５μｇ／ｋｇ／日、または少なくとも約１μｇ／ｋｇ／日～少なくとも約１５μｇ／ｋｇ／日の投与量で投与される。
上記に開示された投与量は、１日の間に単一用量または複数用量として投与することができる。したがって、０．６ｍｇの総日用量は、例えば、２つの０．３ｍｇ用量、または３つの０．２ｍｇ用量、または５つの０．１用量として投与することができる。
いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、約０．５時間、約０．６時間、約０．７時間、約０．８時間、約０．９時間、約１時間、約１．１時間、約１．２時間、約１．３時間、約１．４時間、約１．５時間、約１．６時間、約１．７時間、約１．８時間、約１．９時間、約２時間、約２．１時間、約２．２時間、約２．３時間、約２．４時間、約２．５時間、約２．６時間、約２．７時間、約２．８時間、約２．９時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、または約８時間のＴ１／２（血漿半減期）を有する。１つの特定の態様において、アプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）のＴ１／２は、約０．８時間および１．４時間である。１つの特定の態様において、アプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）のＴ１／２は、約１．４時間である。１つの特定の態様において、ヒト血漿中のＡｐＴＯＬＬのＴ１／２は、約８時間である。
いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、複数用量で投与される。一態様において、アプタマーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０用量で投与される。いくつかの態様において、アプタマーは、３つの用量で投与される。いくつかの態様において、３つの用量は、同日中に投与される。いくつかの態様において、最初の用量は、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、または虚血性脳卒中の発症後１時間未満、例えば、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、または虚血性脳卒中の発症後１０分で投与される。いくつかの態様において、第２の用量は、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、または虚血性脳卒中の発症後３時間未満、例えば、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、または虚血性脳卒中の発症後約２時間で投与される。いくつかの態様において、第３の用量は、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、または虚血性脳卒中の発症後８時間未満、例えば、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、または虚血性脳卒中の発症後約６時間で投与される。
いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、静脈内または動脈内に投与される。特定の態様において、本開示のアプタマーは、ボーラスとして投与される。いくつかの態様において、ボーラスは、ゆっくりとしたボーラスである。
いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、虚血性脳卒中、多発性硬化症を有する対象への投与は、
（ｉ）損傷した組織の低減、
（ｉｉ）炎症の低減、
（ｉｉｉ）予後および転帰の改善、
（ｉｖ）炎症性バイオマーカー（例えば、インターフェロン－γ、インターロイキン－１２ｐ７０、ＴＮＦα、ＩＬ－６、またはそれらの任意の組み合わせ）のレベルの低下、
（ｖ）生活の質の向上、
（ｖｉ）機能スコア、例えば、運動スコアの改善（例えば、可動性の改善）、
（ｖｉｉ）生存率の増加、または
（ｖ）それらの任意の組み合わせをもたらす。
上記の効果は、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、虚血性脳卒中、多発性硬化症を有するか、または有していたが、本開示のアプタマー、例えば、ＡｐＴＯＬＬを投与されていない対照対象または対照対象集団に関するものである。
いくつかの態様において、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、虚血性脳卒中、または多発性硬化症の発症後の対象への本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の投与は、未治療の対象、または未治療の対象の対照集団から得られた参照値に関して２０％～７５％の組織損傷（例えば、脳組織もしくは心臓組織）の低減をもたらす。１つの特定の態様において、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、虚血性脳卒中、または多発性硬化症の発症後の対象への本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の投与は、未治療の対象、または未治療の対象の対照集団から得られた参照値に関しておよそ６５％の組織損傷（例えば、脳組織もしくは心臓組織）の低減をもたらす。
いくつかの態様において、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、虚血性脳卒中、または多発性硬化症の発症後の対象への本開示のアプタマーの投与は、未治療の対象または未治療の対象の対照集団から得られた参照値に関して少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％の組織損傷（例えば、脳組織もしくは心臓組織）の低減をもたらす。
特定の態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を必要とする対象へのその投与は、損傷または病変した領域（例えば、虚血性事象後の梗塞領域）のサイズを低減し、これは投与が複数用量レジメンである場合は著しく小さくなる。例えば、特定の態様において、３用量のアプタマーの投与（例えば、梗塞後１０分、２時間、および６時間）は、単一用量を梗塞後１０分で投与した場合に観察されたおよそ１９％の低減と比較して、損傷または病変した領域（例えば、虚血性事象後の梗塞領域）のサイズを少なくとも２４％低減する。
いくつかの態様において、複数用量レジメンの提示された開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を必要とする対象へのその投与は、対応する単一用量レジメンの投与後に観察された損傷または病変した領域（例えば、虚血性事象後の梗塞領域）のサイズと比較して、損傷または病変した領域（例えば、虚血性事象後の梗塞領域）のサイズの少なくとも少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約１００％、少なくとも１０５％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１１５％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１２５％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１３５％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１４５％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１５５％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１６５％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１７５％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１８５％、少なくとも約１９０％、少なくとも約１９５％、少なくとも約２００％、少なくとも約２０５％、少なくとも約２１０％、少なくとも約２１５％、少なくとも約２２０％、少なくとも約２２５％、少なくとも約２３０％、少なくとも約２３５％、少なくとも約２４０％、少なくとも約２４５％、少なくとも約２５０％、少なくとも約２５５％、少なくとも約２６０％、少なくとも約２６５％、少なくとも約２７０％、少なくとも約２７５％、少なくとも約２８０％、少なくとも約２８５％、少なくとも約２９０％、少なくとも約２９５％、少なくとも約３００％、少なくとも約３０５％、少なくとも約３１０％、少なくとも約３１５％、少なくとも約３２０％、少なくとも約３２５％、少なくとも約３３０％、少なくとも約３３５％、少なくとも約３４０％、少なくとも約３４５％、または少なくとも約３５０％の低減における有効性をもたらす。
いくつかの態様において、本開示の少なくとも１つのアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を投与することによる、本明細書に開示されるＴＬＲ－４媒介性の開示されるまたは状態、例えば、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、虚血性脳卒中、または多発性硬化症の治療は、他の治療的および／または予防的処置と組み合わせることができる。例えば、本開示のアプタマーは、抗凝固剤、抗炎症剤、または血圧調節剤などの生物学的に活性な分子とともに投与することができる。
いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の投与は、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、または虚血性脳卒中を患う対象において、例えば、外科的介入、例えば、血栓摘出と組み合わせることができる。いくつかの態様において、本開示のアプタマーの投与は、カテーテル法、例えば、バルーンカテーテル法、またはステントの挿入と組み合わせることができる。いくつかの態様において、動脈の再開通は、薬理学的に（例えば、血栓溶解）、機械的に（例えば、血管内血栓摘出）、またはそれらの組み合わせによって誘導され得る。
いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の投与は、手術（例えば、血栓摘出）、またはそれらの組み合わせの前、最中、または後に行われる。いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の投与は、血栓溶解、例えば、薬理学的血栓溶解、薬力学的血栓溶解、機械的血栓摘出、またはそれらの組み合わせの前、最中、または後に行われる。いくつかの態様において、血栓摘出は、ステント回収血栓摘出、バルーン塞栓除去、直接吸引血栓摘出、外科的塞栓除去、またはそれらの任意の組み合わせである。
いくつかの態様において、本明細書に開示される虚血性脳卒中の治療方法は、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の投与と組み合わせた血栓溶解（例えば、薬力学的血栓溶解）および／または血栓摘出（例えば、機械的血栓摘出）を含み、この複合治療は、血栓溶解の非存在下で本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の投与後に観察された組織損傷（例えば、梗塞領域）の低減における有効性と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約１００％、少なくとも約１０５％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１１５％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１２５％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１３５％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１４５％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１５５％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１６５％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１７５％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１８５％、少なくとも約１９０％、少なくとも約１９５％、少なくとも約２００％、少なくとも約２０５％、少なくとも約２１０％、少なくとも約２１５％、少なくとも約２２０％、少なくとも約２２５％、少なくとも約２３０％、少なくとも約２３５％、少なくとも約２４０％、少なくとも約２４５％、少なくとも約２５０％、少なくとも約２５５％、少なくとも約２６０％、少なくとも約２６５％、少なくとも約２７０％、少なくとも約２７５％、少なくとも約２８０％、少なくとも約２８５％、少なくとも約２９０％、少なくとも約２９５％、少なくとも約３００％、少なくとも約３０５％、少なくとも約３１０％、少なくとも約３１５％、約３２０％、少なくとも約３２５％、少なくとも約３３０％、少なくとも約３３５％、少なくとも約３４０％、少なくとも約３４５％、または少なくとも約３５０％の組織損傷の低減（例えば、梗塞領域の低減）における有効性の増加をもたらす。
本開示のいくつかの態様において、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、虚血性脳卒中、または多発性硬化症の発症後の対象への本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の投与は、保護効果をもたらす。
したがって、いくつかの態様において、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、虚血性脳卒中の発症後の対象への本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の投与は、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態の発症後、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、または９６時間にわたって、特定の合併症、例えば、脳梗塞の発生率の持続的な低減をもたらす。
いくつかの態様において、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、虚血性脳卒中の発症後の対象への本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の投与は、本開示のアプタマーの（単独でまたは薬理学的介入（例えば、血栓溶解）および／もしくは機械的介入（例えば、血管内血栓摘出）と組み合わせての）投与後、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、または９６時間にわたって、特定の合併症、例えば、脳梗塞の発生率の持続的な低減をもたらす。
いくつかの態様において、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、または虚血性脳卒中、事象などのＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態の発症後の対象への本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の投与は、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態の発症後、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、または９６時間にわたって、持続的な保護効果（例えば、再発の低減、組織損傷の低減、炎症の低減、症状および／もしくは後遺症の低減、またはそれらの任意の組み合わせ）をもたらす。
いくつかの態様において、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、または虚血性脳卒中などのＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態の発症後の対象への本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の投与は、本開示のアプタマーの（単独で、または薬理学的介入（例えば、血栓溶解）および／または機械的介入（例えば、血管内血栓摘出）と組み合わせての）投与後、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、または９６時間にわたって持続的な保護効果（例えば、再発の低減、組織損傷の低減、炎症の低減、症状および／もしくは後遺症の低減、またはそれらの任意の組み合わせ）をもたらす。
いくつかの態様において、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、または虚血性脳卒中の発症後の対象への本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の投与は、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態の発症後、少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２１、少なくとも約２２、少なくとも約２３、少なくとも約２４、少なくとも約２５、少なくとも約２６、少なくとも約２７、または少なくとも約２８日にわたって持続的な保護効果（例えば、再発の低減、組織損傷の低減、炎症の低減、症状および／もしくは後遺症の低減、またはそれらの任意の組み合わせ）をもたらす。
いくつかの態様において、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、または虚血性脳卒中の発症後の対象への本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の投与は、本開示のアプタマーの（単独でまたは薬理学的介入（例えば、血栓溶解）および／もしくは機械的介入（例えば、血管内血栓摘出）と組み合わせての）投与後、少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２１、少なくとも約２２、少なくとも約２３、少なくとも約２４、少なくとも約２５、少なくとも約２６、少なくとも約２７、または少なくとも約２８日にわたって持続的な保護効果（例えば、再発の低減、組織損傷の低減、炎症の低減、症状および／もしくは後遺症の低減、またはそれらの任意の組み合わせ）をもたらす。
いくつかの態様において、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、虚血性脳卒中、または多発性硬化症の発症後の対象への本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の投与は、本開示のアプタマーによる治療の非存在下で対照対象または対照集団において観察された損傷組織の体積に関して、（例えば、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態の発症後２４時間、４８時間、もしくは７２時間で測定して）少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％の損傷組織の体積（例えば、梗塞体積）の低減をもたらす。
いくつかの態様において、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、虚血性脳卒中、または多発性硬化症の発症後の対象への本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の投与は、本開示のアプタマーによる治療の非存在下で対照対象または対照集団において観察された損傷組織の体積に関して、（例えば、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態の発症後２４時間、４８時間、もしくは７２時間で測定して）約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、または約７５％の損傷組織の体積（例えば、梗塞体積）の低減をもたらす。
いくつかの態様において、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、虚血性脳卒中、または多発性硬化症の発症後の対象への本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の投与は、本開示のアプタマーによる治療の非存在下で対照対象または対照集団において観察された組織損傷（例えば、皮質損傷または心筋損傷）に関して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、約３５％、または少なくとも約４０％の組織損傷（例えば、皮質損傷または心筋損傷）の低減をもたらす。
いくつかの態様において、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、虚血性脳卒中、または多発性硬化症の発症後の対象への本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の投与は、本開示のアプタマーによる治療の非存在下で対照対象または対照集団において観察された神経学的回復に関して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％の神経学的回復の改善をもたらす。
いくつかの態様において、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、虚血性脳卒中、または多発性硬化症の発症後の対象への本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の投与は、本開示のアプタマーによる治療の非存在下で対照対象または対照集団において観察された運動スコアに関して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％の運動機能の改善をもたらす。
いくつかの態様において、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、虚血性脳卒中、または多発性硬化症の発症後の対象への本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の投与は、本開示のアプタマーによる治療の非存在下で対照対象または対照集団において観察された炎症促進性バイオマーカーの血漿タンパク質レベルに関して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％の炎症促進性バイオマーカーの血漿タンパク質レベルの低減をもたらす。
いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、被膜内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、気管内、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内および胸骨内注射および注入を介して投与され得る。特定の態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、例えば、注入またはボーラスを介して、静脈内または動脈内に投与される。いくつかの態様において、投与は、ゆっくりとしたボーラスを介して行われ、すなわち用量は、約１分、約２分、約３分、約４分、約５分、約６分、約７分、約８分、約９分、約１０分、約１１分、約１２分、約１３分、約１４分、または約１５分続く注射を介して投与される。
いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、虚血状態および／または血栓の治療に好適な他の薬剤または治療、例えば、上述の血栓溶解と同時に使用することができる。
いくつかの態様において、本明細書に開示される方法による本開示の使用アプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、当該技術分野で知られている虚血性脳卒中の治療のための１つ以上の治療法（薬理学的および／または外科的）と組み合わせることができる。いくつかの態様において、本明細書に開示される方法による本開示の使用アプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、当該技術分野で知られている心筋梗塞の治療のための１つ以上の治療法（薬理学的および／または外科的）と組み合わせることができる。いくつかの態様において、本明細書に開示される方法による本開示の使用アプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、当該技術分野で知られている心筋梗塞の治療のための１つ以上の治療法（薬理学的および／または外科的）と組み合わせることができる。いくつかの態様において、本明細書に開示される方法による本開示の使用アプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、当該技術分野で知られている出血性脳卒中の治療のための１つ以上の治療法（薬理学的および／または外科的）と組み合わせることができる。いくつかの態様において、本明細書に開示される方法による本開示の使用アプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、当該技術分野で知られている出血性変化の治療のための１つ以上の治療法（薬理学的および／または外科的）と組み合わせることができる。いくつかの態様において、本明細書に開示される方法による本開示の使用アプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、当該技術分野で知られている多発性硬化症の治療のための１つ以上の治療法（薬理学的および／または外科的）と組み合わせることができる。
いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、例えば、ＴＬＲ－４アンタゴニスト、抗炎症剤、核酸、ペプチドもしくはタンパク質、またはそれらの組み合わせと組み合わせて投与することができる。いくつかの態様において、本明細書に開示される方法はまた、頸動脈内膜剥離術および／または頸動脈ステント留置術などの手術手順と組み合わせることができる。
いくつかの態様において、本明細書に開示される方法は、本開示の少なくとも１つのアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の、単独で、または薬理学的もしくは機械的血栓溶解と組み合わせて、および任意選択でイブジラスト、ＴＡＫ２４２、ＮＩ－０１０１、エリトラン、エダラボン、尿酸、フィンゴリモド、ナタリズマブ、ミノサイクリン、アナキンラ、ネリネチド、またはそれらの任意の組み合わせと組み合わせての投与を含む。
いくつかの態様において、本明細書に開示される方法は、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）のうちの少なくとも１つの同時投与を、以下の投与を含む併用療法として含む。
（ｉ）ナロキソン、（＋）－ナロキソン、ナルトレキソン、（＋）－ナルトレキソン、リポ多糖（ＬＰＳ）、イブジラスト、プロペントフィリン、アミトリプチリン、ケトチフェン、シクロベンザプリン、ミアンセリン、イミプラミン、リピドＡ類似体（例えば、エリトランもしくはＥ５５３１）、ピノセンブリン、パルミトイルエタノールアミド、タペンタドール、ポリプロピルエーテルイミンデンドリマーグルコサミン（ＤＧ）、アミノアルキルグルコサミニド４－リン酸塩（例えば、ＣＲＸ－５２６）、ＩＡＸＯ－１０２、Ｒｓ－ＬＰＳ、ＴＬＲ－ＩＮ－Ｃ３４、ＴＡＫ－２４２、Ｅ５５６４、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＴＬＲ－４アンタゴニスト；
（ｉｉ）抗血小板薬、例えば、アスピリンまたはクロピドグレル；
（ｉｉｉ）抗凝固剤、例えば、ヘパリン、アセノクマロール、ワルファリン、ダビガトラン、またはリバロキサバン；
（ｉｖ）抗酸化剤、例えば、エダラボン；
（ｖ）組織プラスミノーゲン活性化因子、あるいは
（ｖｉ）それらの任意の組み合わせ。
いくつかの態様において、本明細書に開示される方法は、併用療法として、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の少なくとも１つの同時投与を含み、ＴＬＲ－４の発現の増加および／またはＴＬＲ－４の活性化の増加を特徴とする病理に関与する遺伝子の発現をサイレンシングする能力を有する核酸、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、抗マイクロＲＮＡ（アンティミル）；シグナル伝達ペプチドおよび標的結合ペプチドなどのペプチド（例えば、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗原－薬物コンジュゲートもしくは免疫毒素などの抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含む化合物）の投与を含む。
いくつかの態様において、本明細書に開示される方法は、本開示の少なくとも１つのアプタマー、例えば、ＡｐＴＯＬＬまたは以下に開示されるアプタマーのうちのいずれか、特に表１に開示されるアプタマーのうちのいずれか、またはその変異体もしくは誘導体の投与を含む。
いくつかの態様において、本明細書に開示される方法は、ＴＬＲ－４タンパク質に結合することによってＴＬＲ－４作用を低減および／または阻害する代わりに、ＴＬＲ－４遺伝子もしくはＴＬＲ－４をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）などのＴＬＲ４遺伝子の転写産物と、またはＴＬＲ－４の発現を調節する核酸（例えば、ｍｉＲＮＡ）、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、もしくはアンティミルと相互作用することによって、直接的または間接的にＴＬＲ－４発現を低減および／または阻害（例えば、枯渇または廃止）するアプタマー以外の核酸を使用して実施することができる。また、ＴＬＲ－４発現を一時的または永続的に変化させる薬剤、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、またはＺＦＮを使用する遺伝子治療アプローチを使用して、ここに開示される方法の実践も企図されている。また、ＴＬＲ－４の活性を転写後に改変するか、またはＴＬＲ－４の原形質膜への組み込みを変化させるか、ＴＬＲ－４機能を変化させるか（例えば、抗体もしくは小分子薬物）、ＴＬＲ－４の輸送および／またはリサイクルを変化させるか、あるいはＴＬＲ－４シグナル伝達経路の上流および／または下流に薬理学的または遺伝子療法の介入によってＴＬＲ－４シグナル伝達を変化させる薬剤を使用する、本明細書に開示される方法の実践も企図されている。
いくつかの態様において、本開示は、疾患または状態の少なくともある症状または後遺症の寛解または改善を必要とする対象においてそれを行う際に使用するための核酸アプタマーを提供し、
（ａ）アプタマーは、例えば、約４０～約１００ヌクレオチドの長さを有し、配列番号１、２、３、および４からなる群から選択され、
（ｉ）アプタマーは、ＴＬＲ－４の細胞外ドメイン上のエピトープに特異的に結合し、
（ｉｉ）エピトープへのアプタマーの結合は、ＴＬＲ－４活性化を低減および／もしくは阻害するか、または
（ｂ）アプタマーは、例えば、配列番号１、２、３、もしくは４に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する（ａ）のアプタマーの機能的に同等の変異体であり、機能的に同等の変異体は、配列番号１、２、３、もしくは４から誘導され、ＴＬＲ－４に特異的に結合し、その活性化を低減および／もしくは阻害する能力を維持する。
いくつかの態様において、本開示は、本明細書に開示される疾患または状態を治療する方法であって、治療を必要とする対象への核酸の投与を含む、方法を提供し、
（ａ）アプタマーは、例えば、約４０～約１００ヌクレオチドの長さを有し、配列番号１、２、３、および４からなる群から選択され、
（ｉ）アプタマーは、ＴＬＲ－４の細胞外ドメイン上のエピトープに特異的に結合し、
（ｉｉ）エピトープへのアプタマーの結合は、ＴＬＲ－４活性化を低減および／もしくは阻害するか、または
（ｂ）アプタマーは、例えば、配列番号１、２、３、もしくは４に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する（ａ）のアプタマーの機能的に同等の変異体であり、機能的に同等の変異体は、配列番号１、２、３、もしくは４から誘導され、ＴＬＲ－４に特異的に結合し、その活性化を低減および／もしくは阻害する能力を維持する。
いくつかの態様において、本開示は、本明細書に開示される疾患または状態の少なくともある症状または後遺症の寛解、改善、阻害、または低減を必要とする対象においてそれを行うための方法であって、対象への核酸の投与を含む、方法を提供し、
（ａ）アプタマーは、例えば、約４０～約１００ヌクレオチドの長さを有し、配列番号１、２、３、および４からなる群から選択され、
（ｉ）アプタマーは、ＴＬＲ－４の細胞外ドメイン上のエピトープに特異的に結合し、
（ｉｉ）エピトープへのアプタマーの結合は、ＴＬＲ－４活性化を低減および／もしくは阻害するか、または
（ｂ）アプタマーは、例えば、配列番号１、２、３、もしくは４に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する（ａ）のアプタマーの機能的に同等の変異体であり、機能的に同等の変異体は、配列番号１、２、３、もしくは４から誘導され、ＴＬＲ－４に特異的に結合し、その活性化を低減および／もしくは阻害する能力を維持する。
いくつかの態様において、本明細書に開示される方法は、表１に開示されるアプタマーのうちのいずれか、またはそれらの組み合わせを実施することができる。したがって、いくつかの態様において、例えば、約４０～約１００ヌクレオチドの長さを有するアプタマーは、配列番号１～１６からなる群から選択される。
いくつかの態様において、例えば、約４０～約１００ヌクレオチドの長さを有するアプタマーは、例えば、配列番号１～１６のアプタマーに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する機能的に同等の変異体であり、機能的に同等の変異体は、配列番号１～１６から誘導され、ＴＬＲ－４に特異的に結合し、その活性化を低減および／または阻害する能力を維持する。
いくつかの態様において、アプタマーは、約４５、約５９、約６８、約７６、または約７８ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの態様において、アプタマーは、約４５～約７８ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの態様において、アプタマーは、約５９～約７８ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの態様において、アプタマーは、約６８～約７８ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの態様において、アプタマーは、約４５～約７６ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの態様において、アプタマーは、約４５～約６８ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの態様において、アプタマーは、約４５～約５９ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの態様において、アプタマーは、約５９～約７６ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの態様において、アプタマーは、約５９～約６８ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの態様において、アプタマーは、約６８～約７６ヌクレオチドの長さを有する。
いくつかの態様において、虚血状態および／または血栓を有する対象への本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）またはその組み合わせの投与は、梗塞体積を減少させることができる。いくつかの態様において、虚血状態および／または血栓を有する対象への本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）またはその組み合わせの投与は、複数用量（例えば、１、２、３、４、もしくは５用量）の本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）またはその組み合わせの投与後に梗塞体積を減少させることができる。
いくつかの態様において、複数用量の本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）またはその組み合わせの投与は、例えば、閉塞後約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間、または約４８時間で開始することができる。いくつかの態様において、単一用量は、例えば、閉塞後約１０分で投与され、アプタマーの投与は、対照条件と比較して、例えば、アプタマーで治療されていない対象の梗塞体積と比較して、梗塞体積の減少を誘導する。
いくつかの態様において、２つの用量が、例えば、閉塞後約１０分および約２時間で投与される。いくつかの態様において、３つの用量が、例えば、閉塞後約１０分、約２時間、および約６時間で投与される。いくつかの態様において、４つの用量が、例えば、閉塞後約１０分、約２時間、約６時間、および約２４時間で投与される。いくつかの態様において、５つの用量が、例えば、閉塞後約１０分、約２時間、約６時間、約２４時間、および約４８時間で投与される。いくつかの態様において、そのような用量レジメンは、対照条件と比較して、例えば、アプタマーで治療されていない対象における梗塞体積と比較して、梗塞体積の減少を誘導する。
いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）またはその組み合わせの投与は、対照条件と比較して、例えば、アプタマーで治療されていない対象の梗塞体積と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも１５％、少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％の梗塞体積の低減を誘導する。
いくつかの態様において、虚血状態および／または血栓を有する対象への本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の投与は、虚血性事象の直後、例えば、虚血性事象後約５分、約１０分、約１５分、約２０分、または約３０分で投与された場合、梗塞体積を低減する。いくつかの態様において、梗塞体積の低減は、対照条件下で観察された梗塞体積と比較して、例えば、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）で治療されていない対象における梗塞体積と比較して、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、または約７５％である。
いくつかの態様において、虚血状態および／または血栓を有する対象への本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の静脈内投与は、虚血性事象後約１０分で投与された場合、梗塞体積を約６５％低減する。
本開示はまた、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）による治療のために虚血状態および／または血栓を有する対象を選択する方法を提供し、対象は、例えば、コンピューター断層撮影血管造影法（ＣＴＡ）によって決定または確認される、例えば、機械的血栓摘出に好適な血管閉塞である場合、治療から選択される。いくつかの態様において、選択に使用される基準は、以下のような神経画像基準（ＣＴまたはＭＲＩ）によって決定または確認される機械的血栓摘出に好適な大血管閉塞である。
（ｉ）磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）基準：例えば、ＲＡＰＩＤ（登録商標）ソフトウェアによって決定された拡散強調画像法（ＤＷＩ）制限の量≧約５ｍＬ～≦約７０ｍＬ、および／または
（ｉｉ）コンピューター断層撮影（ＣＴ）基準：アルバータ脳卒中プログラム早期ＣＴスコア（Ａｌｂｅｒｔａ Ｓｔｒｏｋｅ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｅａｒｌｙ ＣＴ Ｓｃｏｒｅ（ＡＳＰＥＣＴＳ））約６～約１０、および例えば、ＲＡＰＩＤ（登録商標）ソフトウェアによって決定された入院時脳血流量（ＣＢＦ）＜３０％および≧約５ｍＬ～≦約７０ｍＬ。
いくつかの態様において、対象の選択に使用される基準は、症状の発症からの時間である。したがって、いくつかの態様において、対象は、虚血状態および／または血栓の発症から６時間未満、例えば、５時間未満、４時間未満、３時間未満、２時間未満、または１時間未満が経過した場合、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）による治療のために選択される。
いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）による治療のための対象の選択に使用される基準は、対象が、ＥＶＴ治療、例えば、血栓摘出を受ける候補であるかどうかである。
いくつかの態様において、対象は、ヒト対象であり、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、約０．００７ｍｇ／ｋｇ～約０．２ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。したがって、いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、本明細書に開示される疾患または状態のうちのいずれかを治療するために、またはそのような疾患もしくは状態と関連した症状および／もしくは後遺症のうちのいずれかを予防、阻害、もしくは低減するために、用量当たり約０．００７ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．００８ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．００９ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０１０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０１１ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０１２ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０１３ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０１４ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０１５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０１６ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０１７ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０１８ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０１９ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０２０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０２１ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０２２ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０２３ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０２４ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０２５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０３０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０３５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０４０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０４５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０５０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０５５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０６０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０６５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０７０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０７５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０８０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０８５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０９０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０９５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１００ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１０５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１１０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１１５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１２０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１２５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１３０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１３５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１４０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１４５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１５０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１５５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１６０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１６５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１７０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１７５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１８０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１８５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１９０ｍｇ／ｋｇ、または用量当たり約０．２ｍｇ／ｋｇの投与量でヒト対象に投与される。
上記の開示によれば、約０．００７ｍｇ／ｋｇ～約０．２０ｍｇ／ｋｇの用量範囲を考慮し、約７０ｋｇのヒト対象の標準体重を考慮して、標準的な単一用量の量は、約０．５ｍｇ／用量～約１０ｍｇ／用量である。したがって、いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、本明細書に開示される疾患または状態のうちのいずれかを治療するために、またはそのような疾患もしくは状態と関連した症状および／もしくは後遺症のうちのいずれかを予防、阻害、もしくは低減するために、約０．５ｍｇ／用量、約０．６ｍｇ／用量、約０．７ｍｇ／用量、約０．８ｍｇ／用量、約０．９ｍｇ／用量、約１ｍｇ／用量、約１．１ｍｇ／用量、約１．２ｍｇ／用量、約１．３ｍｇ／用量、約１．４ｍｇ／用量、約１．５ｍｇ／用量、約１．６ｍｇ／用量、約１．７ｍｇ／用量、約１．８ｍｇ／用量、約１．９ｍｇ／用量、約２ｍｇ／用量、約２．５ｍｇ／用量、約３ｍｇ／用量、約３．５ｍｇ／用量、約４ｍｇ／用量、約４．５ｍｇ／用量、約５ｍｇ／用量、約５．５ｍｇ／用量、約６ｍｇ／用量、約６．５ｍｇ／用量、約７ｍｇ／用量、約７．５ｍｇ／用量、約８ｍｇ／用量、約８．５ｍｇ／用量、約９ｍｇ／用量、約９．５ｍｇ／用量、約１０ｍｇ／用量、約１１ｍｇ／用量、約１２ｍｇ／用量、約１３ｍｇ／用量、約１４ｍｇ／用量、約１５ｍｇ／用量、約１６ｍｇ／用量、約１７ｍｇ／用量、約１８ｍｇ／用量、約１９ｍｇ／用量、または約２０ｍｇ／用量の投与量でヒト対象に投与される。
いくつかの態様において、本開示は、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の投与を含む、急性心筋梗塞を患った対象の炎症反応の発症を予防するための予防的方法を提供する。
いくつかの態様において、本開示は、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）による治療のために急性心筋梗塞を患った対象を選択する方法であって、例えば、（ｉ）梗塞領域の測定、評価、もしくは定量化を実施すること、（ｉｉ）心機能を評価すること、（ｉｉｉ）組織損傷または組織リモデリングに関連するバイオマーカーの測定、または（ｉｖ）それらの組み合わせを含む、方法を提供する。
本開示はまた、急性心筋梗塞を患った対象における心機能の回復を促進または誘導する方法を提供し、この方法は、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を対象に投与することを含む。急性心筋梗塞を患った対象における壊死（例えば、左心室壊死）および／または線維症を低減する方法も提供され、この方法は、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を対象に投与することを含む。いくつかの態様において、心機能の回復、対照に関する梗塞領域の低減、対照に関する壊死（例えば、左心室壊死）の低減、対照に関する線維症の低減、またはそれらの任意の組み合わせは、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を対象に投与した後、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、または１４日で観察することができる。いくつかの態様において、急性心筋梗塞を患い、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を投与された対象におけるトロポニンＩレベルは、アプタマーを投与されていない対象におけるトロポニンＩレベルよりも低い。いくつかの態様において、より低いトロポニンＩレベルは、例えば、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を対象に投与した後約２時間、約４時間、約６時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約１４時間、約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２２時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間、または約４８時間で検出可能である。
いくつかの態様において、急性心筋梗塞を患った対象への本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の投与は、対照条件に関して、例えば、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を投与されていない対象に関して、梗塞領域を少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、または少なくとも約５０％低減することができる。
いくつかの態様において、急性心筋梗塞を患った対象への本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の投与は、
（ｉ）対照に関して梗塞領域（例えば、梗塞領域の体積）を低減する；
（ｉｉ）心臓組織の完全性を維持する；
（ｉｉｉ）線維症を低減もしくは阻害する；
（ｉｖ）細胞外マトリックスの分解のマーカーの発現を阻害する；
（ｖ）誤った心臓リモデリングを低減する、リスクを低減する、もしくは阻害する；
（ｖｉ）心臓保護を誘導する；
（ｖｉｉ）細胞外マトリックスの分解を低減もしくは阻害する；
（ｖｉｉｉ）心臓リモデリングを改善もしくは促進する；
（ｉｘ）心室の解剖学的構造を維持する；
（ｘ）心機能を維持する；
（ｘｉ）梗塞の進行を抑える；
（ｘｉｉ）心筋修復を改善する；
（ｘｉｉｉ）心室収縮性を増加もしくは回復する；または
（ｘｉｖ）それらの任意の組み合わせが可能である。
したがって、いくつかの態様において、本開示は、急性心筋梗塞を患った対象において、
（ｉ）対照に関して梗塞領域（例えば、梗塞領域の体積）を低減する；
（ｉｉ）心臓組織の完全性を維持する；
（ｉｉｉ）線維症を低減もしくは阻害する；
（ｉｖ）細胞外マトリックスの分解のマーカーの発現を阻害する；
（ｖ）誤った心臓リモデリングを低減する、リスクを低減する、もしくは阻害する；
（ｖｉ）心臓保護を誘導する；
（ｖｉｉ）細胞外マトリックスの分解を低減もしくは阻害する；
（ｖｉｉｉ）心臓リモデリングを改善もしくは促進する；
（ｉｘ）心室の解剖学的構造を維持する；
（ｘ）心機能を維持する；
（ｘｉ）梗塞の進行を抑える；
（ｘｉｉ）心筋修復を改善する；
（ｘｉｉｉ）心室収縮性を増加もしくは回復する；または
（ｘｉｖ）それらの任意の組み合わせのための方法であって、
本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を対象に投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を対象に投与することを含む急性心筋梗塞を患った対象におけるＭＭＰ－９の発現は、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を投与されていない対象における発現に関して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％低減される。
いくつかの態様において、本開示は、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の投与のために急性心筋梗塞を患った対象を選択する方法を提供し、この方法は、対象におけるＭＭＰ－９の発現レベル（例えば、タンパク質発現レベル、ｍＲＮＡ発現レベル、もしくはそれらの組み合わせ）を測定すること、およびＭＭＰ－９が対照値、例えば、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）で治療されていない対象において観察された値または標準的な正常発現値に関して上昇した場合に、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を投与することを含む。
いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、急性心筋梗塞を患ったヒト対象に、約０．００７ｍｇ／ｋｇ～約０．２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。したがって、いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、急性心筋梗塞を患ったヒト対象に、用量当たり約０．００７ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．００８ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．００９ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０１０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０１１ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０１２ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０１３ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０１４ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０１５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０１６ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０１７ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０１８ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０１９ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０２０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０２１ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０２２ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０２３ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０２４ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０２５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０３０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０３５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０４０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０４５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０５０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０５５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０６０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０６５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０７０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０７５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０８０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０８５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０９０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０９５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１００ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１０５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１１０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１１５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１２０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１２５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１３０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１３５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１４０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１４５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１５０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１５５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１６０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１６５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１７０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１７５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１８０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１８５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１９０ｍｇ／ｋｇ、または用量当たり約０．２ｍｇ／ｋｇの投与量で投与される。
上記の開示によれば、約０．００７ｍｇ／ｋｇ～約０．２０ｍｇ／ｋｇの用量範囲を考慮し、約７０ｋｇの急性心筋梗塞を患ったヒト対象の標準体重を考慮して、標準的な単一用量の量は、約０．５ｍｇ／用量～約１０ｍｇ／用量である。したがって、いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、急性心筋梗塞を患ったヒト対象に、約０．５ｍｇ／用量、約０．６ｍｇ／用量、約０．７ｍｇ／用量、約０．８ｍｇ／用量、約０．９ｍｇ／用量、約１ｍｇ／用量、約１．１ｍｇ／用量、約１．２ｍｇ／用量、約１．３ｍｇ／用量、約１．４ｍｇ／用量、約１．５ｍｇ／用量、約１．６ｍｇ／用量、約１．７ｍｇ／用量、約１．８ｍｇ／用量、約１．９ｍｇ／用量、約２ｍｇ／用量、約２．５ｍｇ／用量、約３ｍｇ／用量、約３．５ｍｇ／用量、約４ｍｇ／用量、約４．５ｍｇ／用量、約５ｍｇ／用量、約５．５ｍｇ／用量、約６ｍｇ／用量、約６．５ｍｇ／用量、約７ｍｇ／用量、約７．５ｍｇ／用量、約８ｍｇ／用量、約８．５ｍｇ／用量、約９ｍｇ／用量、約９．５ｍｇ／用量、約１０ｍｇ／用量、約１１ｍｇ／用量、約１２ｍｇ／用量、約１３ｍｇ／用量、約１４ｍｇ／用量、約１５ｍｇ／用量、約１６ｍｇ／用量、約１７ｍｇ／用量、約１８ｍｇ／用量、約１９ｍｇ／用量、約２０ｍｇ／用量の投与量で投与される。
いくつかの態様において、本開示は、神経筋または神経変性の疾患または状態、例えば、多発性硬化症の症状および／または後遺症の発症の予防、阻害、抑制、または遅延を必要とする対象においてそれを提供し、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を対象に投与することを含む。いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、神経筋または神経変性の疾患または状態の症状の発症後、約２４時間で対象に投与されている。いくつかの態様において、単一用量の本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）が対象に投与される。いくつかの態様において、複数用量（例えば、２、３、４、または５用量）の本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）が対象に投与されている。
いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を神経筋または神経変性の疾患または状態を有する対象に投与することは、（ｉ）臨床スコアの改善、（ｉｉ）体重減少（体重回復）の低減、（ｉｉｉ）再ミエリン化、（ｉｖ）軸索損傷の低減、（ｖ）炎症の低減、（ｖｉ）脱髄の低減、（ｖｉｉ）ミエリン領域の増加、（ｖｉｉｉ）ニューロフィラメントの増加、または（ｉｘ）任意の組み合わせをもたらす。したがって、いくつかの態様において、本開示は、神経筋または神経変性の疾患または状態を有する対象において、（ｉ）臨床スコアを改善する、（ｉｉ）体重減少を低減する（体重を回復する）、（ｉｉｉ）再ミエリン化する、（ｉｖ）軸索損傷を低減する、（ｖ）炎症を低減する、（ｖｉ）脱髄を低減する、（ｖｉｉ）ミエリン領域を増加させる、（ｖｉｉｉ）ニューロフィラメントを増加させる、または（ｉｘ）任意の組み合わせを行う方法を提供し、この方法は、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を対象に投与することを含む。いくつかの態様において、再ミエリン化は、ＰＤＧＦＲα、ＣＣ１、Ｏｌｉｇｏ２、またはそれらの組み合わせなどのバイオマーカーのレベルを測定することによって決定することができる。
いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、神経筋または神経変性の疾患または状態を有するヒト対象に、約０．００７ｍｇ／ｋｇ～約０．２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。したがって、いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、神経筋または神経変性の疾患または状態を有するヒト対象に、用量当たり約０．００７ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．００８ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．００９ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０１０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０１１ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０１２ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０１３ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０１４ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０１５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０１６ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０１７ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０１８ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０１９ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０２０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０２１ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０２２ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０２３ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０２４ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０２５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０３０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０３５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０４０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０４５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０５０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０５５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０６０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０６５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０７０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０７５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０８０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０８５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０９０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０９５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１００ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１０５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１１０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１１５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１２０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１２５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１３０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１３５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１４０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１４５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１５０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１５５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１６０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１６５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１７０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１７５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１８０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１８５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１９０ｍｇ／ｋｇ、または用量当たり約０．２ｍｇ／ｋｇの投与量で投与される。
上記の開示によれば、約０．００７ｍｇ／ｋｇ～約０．２０ｍｇ／ｋｇの用量範囲を考慮し、約７０ｋｇの神経筋または神経変性の疾患または状態を有するヒト対象の標準体重を考慮して、標準的な単一用量の量は、約０．５ｍｇ／用量～約１０ｍｇ／用量である。したがって、いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、神経筋または神経変性の疾患または状態を有するヒト対象に、約０．５ｍｇ／用量、約０．６ｍｇ／用量、約０．７ｍｇ／用量、約０．８ｍｇ／用量、約０．９ｍｇ／用量、約１ｍｇ／用量、約１．１ｍｇ／用量、約１．２ｍｇ／用量、約１．３ｍｇ／用量、約１．４ｍｇ／用量、約１．５ｍｇ／用量、約１．６ｍｇ／用量、約１．７ｍｇ／用量、約１．８ｍｇ／用量、約１．９ｍｇ／用量、約２ｍｇ／用量、約２．５ｍｇ／用量、約３ｍｇ／用量、約３．５ｍｇ／用量、約４ｍｇ／用量、約４．５ｍｇ／用量、約５ｍｇ／用量、約５．５ｍｇ／用量、約６ｍｇ／用量、約６．５ｍｇ／用量、約７ｍｇ／用量、約７．５ｍｇ／用量、約８ｍｇ／用量、約８．５ｍｇ／用量、約９ｍｇ／用量、約９．５ｍｇ／用量、約１０ｍｇ／用量、約１１ｍｇ／用量、約１２ｍｇ／用量、約１３ｍｇ／用量、約１５ｍｇ／用量、約１６ｍｇ／用量、約１７ｍｇ／用量、約１８ｍｇ／用量、約１９ｍｇ／用量、約２０ｍｇ／用量の投与量で投与される。
また、対象における脳卒中または頭蓋脳外傷（外傷性脳損傷）などの一次および二次脱髄を含む病理における症状および／または後遺症の発症を予防、阻害、抑制、または遅延させる方法であって、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を対象に投与することを含む、方法も提供される。
いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、脳卒中または外傷性脳損傷を患ったヒト対象に、約０．００７ｍｇ／ｋｇ～約０．２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。したがって、いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、脳卒中または外傷性脳損傷を患ったヒト対象に、用量当たり約０．００７ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．００８ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．００９ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０１０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０１１ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０１２ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０１３ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０１４ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０１５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０１６ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０１７ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０１８ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０１９ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０２０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０２１ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０２２ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０２３ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０２４ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０２５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０３０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０３５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０４０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０４５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０５０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０５５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０６０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０６５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０７０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０７５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０８０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０８５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０９０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．０９５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１００ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１０５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１１０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１１５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１２０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１２５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１３０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１３５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１４０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１４５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１５０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１５５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１６０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１６５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１７０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１７５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１８０ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１８５ｍｇ／ｋｇ、用量当たり約０．１９０ｍｇ／ｋｇ、または用量当たり約０．２ｍｇ／ｋｇの投与量で投与される。
上記の開示によれば、約０．００７ｍｇ／ｋｇ～約０．２０ｍｇ／ｋｇの用量範囲を考慮し、約７０ｋｇの脳卒中または外傷性脳損傷を患ったヒト対象の標準体重を考慮して、標準的な単一用量の量は、約０．５ｍｇ／用量～約１０ｍｇ／用量である。したがって、いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、脳卒中または外傷性脳損傷を患ったヒト対象に、約０．５ｍｇ／用量、約０．６ｍｇ／用量、約０．７ｍｇ／用量、約０．８ｍｇ／用量、約０．９ｍｇ／用量、約１ｍｇ／用量、約１．１ｍｇ／用量、約１．２ｍｇ／用量、約１．３ｍｇ／用量、約１．４ｍｇ／用量、約１．５ｍｇ／用量、約１．６ｍｇ／用量、約１．７ｍｇ／用量、約１．８ｍｇ／用量、約１．９ｍｇ／用量、約２ｍｇ／用量、約２．５ｍｇ／用量、約３ｍｇ／用量、約３．５ｍｇ／用量、約４ｍｇ／用量、約４．５ｍｇ／用量、約５ｍｇ／用量、約５．５ｍｇ／用量、約６ｍｇ／用量、約６．５ｍｇ／用量、約７ｍｇ／用量、約７．５ｍｇ／用量、約８ｍｇ／用量、約８．５ｍｇ／用量、約９ｍｇ／用量、約９．５ｍｇ／用量、約１０ｍｇ／用量、約１１ｍｇ／用量、約１２ｍｇ／用量、約１３ｍｇ／用量、約１４ｍｇ／用量、約１５ｍｇ／用量、約１６ｍｇ／用量、約１７ｍｇ／用量、約１８ｍｇ／用量、約１９ｍｇ／用量、約２０ｍｇ／用量の投与量で投与される。
ＩＩＩ．ＴＬＲ－４に特異的なアプタマー
本開示の方法で使用されるアプタマーは、ＴＬＲ－４の細胞外ドメイン上に位置する少なくとも１つのエピトープに特異的に結合し、ＴＬＲ－４を阻害する能力を有する。本開示のアプタマーの特定の例を表１に提示する。いくつかの態様において、本開示のアプタマーは、表１に開示されるアプタマーの変異体および／または誘導体である。
Figure 2022533966000002
表１のアプタマーは、４５ヌクレオチド～７８ヌクレオチドの長さを有する。Ａ含有率は、約１７％～約２７％の範囲である。Ｔ含有率は、約１７％～約２８％の範囲である。Ｇ含有率は、約２１％～約３３％の範囲である。Ｃ含有率は、約２０％～約３４％の範囲である。
いくつかの態様において、本開示のアプタマーは、以下に開示されるような化学的に修飾されたアプタマーである。いくつかの態様において、本開示のアプタマーは、表１に開示されるアプタマーのＴＬＲ－４に特異的に結合し、阻害する能力の少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％でＴＬＲ－４に特異的に結合し、阻害することができるＤＮＡおよび／またはＲＮＡアプタマー（例えば、ｓｓＤＮＡアプタマー）である。
いくつかの態様において、本開示のアプタマーは、表１に開示されている配列の５’に少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００個、またはそれ以上のヌクレオチドを含み、アプタマーは、ＴＬＲ－４に特異的に結合し、阻害することができる。
いくつかの態様において、本開示のアプタマーは、表１に開示されている配列の３’に少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００個、またはそれ以上のヌクレオチドを含み、アプタマーは、ＴＬＲ－４に特異的に結合し、阻害することができる。
いくつかの態様において、本開示のアプタマーは、表１に開示された配列に対して少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含み、アプタマーは、ＴＬＲ－４に特異的に結合し、阻害することができる。
いくつかの態様において、本開示のアプタマーは、約３０～約２００ヌクレオチド、約３５～約１５０ヌクレオチド、約４０～約１００ヌクレオチド、約４５～約８０ヌクレオチド、約４０～約５０ヌクレオチド、約３５～約５５ヌクレオチド、３０～約６０ヌクレオチド、約３５～約６５ヌクレオチド、約４０～約７０ヌクレオチド、約７５～約８５ヌクレオチド、約７０～約９０ヌクレオチド、約６５～約９５ヌクレオチド、約６０～約１００ヌクレオチド、約５５～約９５ヌクレオチド、約５０～約９０ヌクレオチド、約４５～約８５ヌクレオチド、約５０～約８０ヌクレオチド、約５５～約７５ヌクレオチド、または約６０～約７５ヌクレオチドの核酸配列（例えば、ｓｓＤＮＡ）からなる。
いくつかの態様において、本開示のアプタマーは、少なくとも１つの生物学的に活性な分子に共有結合的にまたは非共有結合的に付着することができる。いくつかの態様において、生物学的に活性な分子は、ＴＬＲ－４に特異的に結合することができる。いくつかの態様において、生物学的に活性な分子は、例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント、小分子、ペプチド、アプタマー、脂質、リポ多糖、多糖、酵素、または核酸を含む。いくつかの態様において、生物学的に活性な分子は、抗炎症剤を含む。
いくつかの態様において、生物学的に活性な分子は、ナロキソン、（＋）－ナロキソン、ナルトレキソン、（＋）－ナルトレキソン、リポ多糖（ＬＰＳ）、イブジラスト、プロペントフィリン、アミトリプチリン、ケトチフェン、シクロベンザプリン、ミアンセリン、イミプラミン、リピドＡ類似体（例えば、エリトランもしくはＥ５５３１）、ピノセンブリン、パルミトイルエタノールアミド、タペンタドール、ポリプロピルエーテルイミンデンドリマーグルコサミン（ＤＧ）、アミノアルキルグルコサミニド４－リン酸塩（例えば、ＣＲＸ－５２６）、ＩＡＸＯ－１０２、Ｒｓ－ＬＰＳ、ＴＬＲ－ＩＮ－Ｃ３４、ＴＡＫ－２４２、Ｅ５５６４、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＴＬＲ－４アンタゴニストである。
いくつかの態様において、生物学的に活性な分子は、抗血小板薬、例えば、アスピリンまたはクロピドグレルを含む。いくつかの態様において、生物学的に活性な分子は、抗凝固剤、例えば、ヘパリン、アセノクマロール、ワルファリン、ダビガトラン、またはリバロキサバンを含む。いくつかの態様において、生物学的に活性な分子は、抗酸化剤、例えば、エダラボンを含む。いくつかの態様において、生物学的に活性な分子は、組織プラスミノーゲン活性化因子である。
いくつかの態様において、生物学的に活性な分子は、ベータ遮断薬、例えば、メトプロロールもしくはカベジロール、ＡＣＥ阻害剤、スタチン、またはアルドステロンアンタゴニスト、例えば、スピロノラクトンまたはエプレレノンである。
いくつかの態様において、生物学的に活性な分子は、ＴＬＲ－４の発現の増加および／または限定されないが、ＮＦＫＢ１、ＲＩＰＫ３、ＩＦＮＢ１、ＬＹ９６（ＭＤ－２）、ＩＲＦ３、ＴＬＲ３、ＴＩＲＡＰ（ＭａＩ）、ＴＩＣＡＭ１（ＴＲＩＦ）、ＲＩＰＫ１、ＴＲＡＦ６、ＣＤ１４、ＴＲＡＭ、ＩＫＢＫＧ（ＩＫＫ－γ）、ＩＦＮＡ１およびＴＬＲ４遺伝子を含む、ＴＬＲ－４の活性化の増加を特徴とする病理に関与する遺伝子の発現をサイレンシングする能力を有する核酸（例えば、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡおよび低分子干渉ＲＮＡ）を含む。本開示の文脈における「アンチセンスＲＮＡ」という用語は、そのヌクレオチド配列が標的メッセンジャーＲＮＡに相補的であり、それにより、それぞれの遺伝子の発現を干渉する一本鎖ＲＮＡを指す。本開示の文脈における「アンチセンスＤＮＡ」という用語は、そのヌクレオチド配列が標的メッセンジャーＲＮＡに相補的であり、それにより、それぞれの遺伝子の発現を干渉するか、またはサイレンシングする一本鎖ＤＮＡを指す。本開示の文脈における「低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」という用語は、その標的メッセンジャーＲＮＡのヌクレオチド配列に非常に特異的である、２０～２５ヌクレオチドの長さを有する二本鎖ＲＮＡを指し、それにより、それぞれの遺伝子の発現を干渉する。
いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、λ－エキソヌクレアーゼによる分解に対して抵抗性がある。いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、例えば、ヌクレアーゼと少なくとも約５分間、少なくとも約１５分間、少なくとも約３０分間、少なくとも約１時間、少なくとも２時間、または少なくとも約４時間インキュベートした後、λ－エキソヌクレアーゼによる分解に抵抗性がある。
いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、例えば、当該技術分野で知られている方法を使用し、ｈＴＬＲ－４を発現するＨＥＫ－ｂｌｕｅ－ｈＴＬＲ－４細胞およびＴＬＲ－４コアクチベータータンパク質ＭＤ２およびＣＤ１４を使用して測定されるように、ＬＰＳ（リポ多糖）によって媒介されるＴＬＲ－４活性化を阻害または低減する。いくつかの態様において、そのような活性化の低減は、例えば、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の投与なしで、対照条件下で観察された作用と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％である。
いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、当該技術分野で知られている方法ならびにカニクイザルおよびヒト単球を使用して測定される場合、３０～６０ｎＭのヒトＴＬＲ－４に対する結合親和性を有する。いくつかの態様において、本開示のアプタマーは、少なくとも約２０ｎＭ、少なくとも約２５ｎＭ、少なくとも約３０ｎＭ、少なくとも約３５ｎＭ、少なくとも約４０ｎＭ、少なくとも約４５ｎＭ、少なくとも約５０ｎＭ、少なくとも約５５ｎＭ、少なくとも約６０ｎＭ、少なくとも約６５ｎＭ、または少なくとも約７０ｎＭのヒトＴＬＲ－４に対する結合親和性を有する。
いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、例えば、当該技術分野で知られている方法を使用し、ｈＴＬＲ－４を発現するＨＥＫ－ｂｌｕｅ－ｈＴＬＲ－４細胞およびＴＬＲ－４コアクチベータータンパク質ＭＤ２およびＣＤ１４を使用して測定されるように、ダメージ関連分子パターン（ＤＡＭＰ）によって誘導されるＴＬＲ－４活性化を阻害する。ＤＡＭＰ（ダメージ関連分子パターン）は、熱ショックタンパク質、核酸、フィブロネクチン、またはヒアルロン酸などの組織分子であり、損傷条件下で脳実質に放出される。したがって、いくつかの態様において、本開示のアプタマーは、内因性ＴＬＲ－４アゴニスト（例えば、ＤＡＭＰ）によるＴＬＲ－４活性化を、（例えば、本開示のアプタマーの投与がない）対照条件と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％阻害することができる。
いくつかの態様において、本開示のアプタマーは、例えば、当該技術分野で知られている方法を使用して測定されるように、ＬＰＳによって刺激されるマウス腹腔マクロファージにおいて、ＮＯｘレベルなどの下流ＴＬＲ－４細胞エフェクターの低減を誘導する。いくつかの態様において、本開示のアプタマーの投与は、（例えば、本開示のアプタマーの投与がない）対照条件と比較して、ＮＯｘレベルの少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％の低減を誘導する。
いくつかの態様において、本開示のアプタマーは、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８またはＴＬＲ９ヒトＴｏｌｌ受容体に対して検出可能なアゴニスト効果を有さず、ＴＬＲ２およびＴＬＲ５に対してアンタゴニスト効果を有しない。
いくつかの態様において、ＴＬＲ－４受容体は、例えば、当該技術分野で知られている方法を使用してヒトマクロファージで測定されるように、本開示のアプタマーに結合した後に内在化される。いくつかの態様において、本開示の結合アプタマーを含むＴＬＲ－４受容体は、アプタマーがＴＬＲ－４に結合してからおよそ２０分後に細胞質に内在化される。
いくつかの態様において、本開示のアプタマーに結合することができる新しいＴＬＲ－４受容体は、例えば、当該技術分野で知られている方法を使用してヒトマクロファージで測定される場合、本開示のアプタマーがＴＬＲ－４に結合した後のＴＬＲ－４内在化後に細胞表面上で検出される（すなわち、内在化されたＴＬＲ－４は、形質膜にリサイクルされる）。
いくつかの態様において、本開示のアプタマーに結合することができる新しいＴＬＲ－４受容体は、本開示のアプタマーがＴＬＲ－４に結合した後のＴＬＲ－４内在化のおよそ５時間後に細胞表面上で検出される。
いくつかの態様において、本開示のアプタマーのｉＰＳＣ由来皮質グルタミン作動性（８０％）およびＧＡＢＡ作動性（２０％）ニューロンへの投与は、ニューロンに対する検出可能な毒性をもたらさない。
いくつかの態様において、本開示のアプタマーの投与を必要とする対象へのその投与は、炎症性サイトカインの減少をもたらす。いくつかの態様において、炎症性サイトカインは、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）、インターロイキン－１２ｐ７０（ＩＬ－１２ｐ７０）およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
一態様において、本開示のアプタマーの投与は、（例えば、本開示のアプタマーの投与がない）対照条件と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも１５％、少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％のインターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）レベルの低減をもたらし得る。
一態様において、本開示のアプタマーの投与は、（例えば、本開示のアプタマーの投与がない）対照条件と比較して、インターロイキン－１２ｐ７０（ＩＬ－１２ｐ７０）レベルの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、または少なくとも約３５％の低減をもたらす。
一態様において、本開示のアプタマーの投与は、（例えば、本開示のアプタマーの投与がない）対照条件と比較して、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）レベルの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、または少なくとも約１５％の低減をもたらし得る。
一態様において、本開示のアプタマーの投与は、（例えば、本開示のアプタマーの投与がない）対照条件と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも４５％、または少なくとも約５０％のインターロイキン－６（ＩＬ－６）レベルの低減をもたらし得る。
いくつかの態様において、本開示のアプタマーは、血液脳関門（ＢＢＢ）を越えて輸送され得る。いくつかの態様において、本開示のアプタマーは、例えば、出血性または虚血性事象によってＢＢＢが損なわれた後、ＢＢＢを越えて輸送され得る。したがって、いくつかの態様において、本開示のアプタマーは、健康な対象においてＢＢＢを通過することができない。
１つの特定の態様において、本開示のアプタマーは、ＡｐＴＯＬＬである。本明細書で使用される場合、「ＡｐＴＯＬＬ」という用語は、配列番号１の配列を含むＴＬＲ－４に特異的に結合する核酸（一本鎖ＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ）アプタマーを指す。特定の態様において、ＡｐＴＯＬＬという用語は、配列番号１の構造化された核酸アプタマーを指す。本明細書で使用される場合、「構造化核酸アプタマー」または「構造化アプタマー」という用語は、変性条件への曝露（例えば、９５℃などの高温、例えば１０分間）によって線形化され、その後、低温で（例えば、氷に浸漬することによって、例えば、１０分間）リフォールディングされた核酸アプタマーを指し、それにより構造化されたアプタマー、例えば、ＡｐＴＯＬＬとその標的、例えば、ＴＬＲ－４の細胞外ドメイン上のエピトープとの間の相互作用を可能にする三次構造を獲得する。図１を参照されたい。
ＡｐＴＯＬＬの化学式は、Ｃ５７５Ｈ７２３Ｎ２２３Ｏ３５１Ｐ５８であり、その分子量は、１８，１７０．８０Ｄａである。ＡｐＴＯＬＬの分子配列は、制御された酵素消化とそれに続くＭＳ－ＭＳ（質量分析）配列決定によって確認されている。正しい構造は、インビトロアッセイにおいて予想される生物学的活性を確認することによって評価されている。生物学的に活性なコンフォメーションを採用するには、アプタマーをＰＢＳ－１ｍＭ ＭｇＣｌ２に溶解し、溶解後、アプタマーを９５℃で約１０分間加熱し、氷上で約１０分間急冷する必要がある。この緩衝液および条件は、アプタマーの構造およびその生物学的活性を支持する。
治験薬（ＩＭＰ）ＡｐＴＯＬＬの剤形は、注射用水で再構成され、さらに静脈内投与のために生理食塩水で希釈される凍結乾燥粉末からなる、注入用濃縮液のための粉末に相当する。
ＡｐＴＯＬＬは、ヒトＴＬＲ－４への特異的結合ならびにＴＬＲ４拮抗作用を実証している。ＡｐＴＯＬＬは、例えば、中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）によって誘導される脳損傷に対する長期的な保護効果を示している。さらに、脳虚血－再灌流のモデルにおけるＡｐＴＯＬＬの有効性は、薬理学的および／または機械的介入によって誘導された動脈再開通を受けている患者におけるこのアプタマーの使用を支持する。
前臨床薬物動態研究は、ラットにおけるＡｐＴＯＬＬのＣｍａｘ値が、０．４５～２ｍｇ／ｋｇの用量範囲にわたって用量非依存性（線形）動態を特徴とするようであり、ＡｐＴＯＬＬへの雌ラットの全身曝露の程度が、０．４５～２ｍｇ／ｋｇの用量範囲にわたって非線形（用量依存性）動態を特徴とするようであることを実証した。ＡｐＴＯＬＬの用量を０．４５ｍｇ／ｋｇを超えて増加させると、線形関係から予測されるよりも全身曝露が低くなる可能性があり、これは、より高い用量レベルでのＡｐＴＯＬＬの血漿クリアランスの増加の可能性と一致する。マウス（Ｃ５７Ｂｌ６、ＩＣＲ）、ラット（ＷｉｓｔａｒおよびＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ））、ＮＨＰ（非ヒト霊長類、カニクイザル）の３種で、ＡｐＴＯＬＬを特性評価するために、薬力学、安全性薬理学、薬物動態学および毒物学の非臨床研究を実施した。これらの種は、受容体のヒト相同性およびＴＬＲ４薬理学のために選択された。
インビトロおよびインビボで実施された薬力学的特性評価は、ヒトおよび非ヒト霊長類（ＮＨＰ）からのＴＬＲ－４へのＡｐＴＯＬＬの結合が、およそ３０～６０ｎＭのＫａを有し、他のＴＬＲへのＡｐＴＯＬＬの結合がないことも示している。
本開示のアプタマー、例えば、インビボでのアプタマーの薬力学的特性評価は、例えば、急性虚血性脳卒中を患った対象へのアプタマーの投与後に、梗塞体積の最大６５．５％の低減が観察され得ることを示す。最大１２時間の治療可能時間域が観察されている。本開示のアプタマー、例えば、ＡｐＴＯＬＬの複数用量の投与は、一般に、単一用量の投与よりも優れた保護を提供する。急性虚血性脳卒中を患った対象への本開示のアプタマー、例えば、ＡｐＴＯＬＬの投与は、短期および長期の両方で、神経学的転帰の改善をもたらす。実験的観察により、本開示のアプタマー、例えば、ＡｐＴＯＬＬの投与を必要とする対象へのその投与は、炎症カスケードの遮断をもたらすことが確認された。さらに、本開示のアプタマー、例えば、ＡｐＴＯＬＬの投与は、静脈内ｒｔ－ＰＡとの薬物間相互作用を示さなかった。
生体内分布の研究では、ＡｐＴＯＬＬは主に、ナイーブ対象および虚血性対象の両方において、静脈内注射の１時間後に腎臓、脾臓および肝臓に存在することが示された。注射の２４時間後、ＡｐＴＯＬＬレベルはほとんど検出できない。生理学的条件下では、ＡｐＴＯＬＬは、健康な対象においてＢＢＢを通過することができない。しかしながら、ＡｐＴＯＬＬは、虚血性事象を経験した個体においてＢＢＢを通過することができる。虚血性事象の後に投与される場合、ＡｐＴＯＬＬは、主に対象の脳の同側半球（すなわち、虚血性事象を患った半球）に存在する。
ＡｐＴＯＬＬの代謝および分布は、インビトロおよびインビボの両方で決定されている。ＡｐＴＯＬＬは、投与後数分で血漿中のエキソヌクレアーゼによって分解される。薬物相互作用もトランスポーターまたはシトクロムの阻害も検出されなかった。ＳＤラットで実施されたインビボ調節薬物動態研究は、Ｔｍａｘが投与後１分で達成されたことを示し、Ｃｍａｘは、０．４５ｍｇ／ｋｇ～２ｍｇ／ｋｇの用量範囲にわたって線形動態を示したのに対し、曝露（ＡＵＣｔ）は、同じ用量範囲にわたって非線形動態を示した。
いくつかの特定の態様において、ＡｐＴＯＬＬは、３ｍＬの水で再構成されてＡｐＴＯＬＬ濃縮物を生成する７ｍｇの凍結乾燥粉末の１バイアルとして提示され、これは１００ｍＬの０．９％塩化ナトリウム溶液でさらに希釈される。得られた溶液は、例えば、注入ポンプを介して静脈内投与することができる。いくつかの態様において、ＡｐＴＯＬＬ投与は、単一用量として行われる。他の態様では、複数用量が投与される。いくつかの態様において、ＡｐＴＯＬＬ注入は、およそ３０分の持続時間を有する。
いくつかの態様において、ＡｐＴＯＬＬ注入が血栓摘出手順の一部として投与される場合、ＡｐＴＯＬＬ注入は、適切な場合、ｒｔ－ＰＡ（組換え組織プラスミノーゲン活性化因子、アルテプラーゼ）投与を含む静脈内血栓溶解の直後、および血栓摘出の前に投与される。
ＩＶ．化学的に修飾されたアプタマー
本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、化学的に修飾して非常に安定にするか、またはさらに切断して、標的との相互作用または正しい三次元アプタマー構造にとって重要ではないオリゴヌクレオチド配列を排除することができる。本開示のアプタマーは、例えば、急性虚血性脳卒中、およびそれらの迅速な薬物動態および低毒性プロファイルのために本明細書に開示される他の疾患および状態の治療のための、修飾されていない一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）アプタマーの形態であり得る。しかしながら、例えば、本開示のアプタマーの治療および／または保護効果を拡張するために、アプタマーは、例えば、ヌクレアーゼによる分解に対するそれらの抵抗性および／または循環中のそれらの半減期を増加させることを目的とした修飾を受けることができる。
いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオシドおよび／またはヌクレオチドを含む。本開示のアプタマーが化学的に修飾されている場合、アプタマーは「修飾されたアプタマー」と呼ばれ得る。
「ヌクレオシド」は、糖分子（例えば、ペントースもしくはリボース）またはその誘導体を有機塩基（例えば、プリンもしくはピリミジン）またはその誘導体（本明細書では「核酸塩基」とも呼ばれる）と組み合わせて含む化合物を指す。
「ヌクレオチド」は、リン酸基を含むヌクレオシドを指す。修飾ヌクレオチドは、例えば、化学的、酵素的、または組換え的に、任意の有用な方法によって合成して、１つ以上の修飾または非天然ヌクレオシドを含むことができる。
本開示のアプタマーは、連結されたヌクレオシドの１つまたは複数の領域を含むことができる。そのような領域は、可変の骨格結合を有することができる。結合は、標準的なホスホジエステル結合であり得、この場合、アプタマーは、ヌクレオチドの領域を含むであろう。
本明細書に開示される修飾アプタマーは、様々な別個の修飾を含み得る。いくつかの態様において、修飾されたアプタマーは、１つ、２つ、またはそれ以上（任意選択で異なる）ヌクレオシドまたはヌクレオチド修飾を含む。いくつかの態様において、修飾されたアプタマーは、１つ以上の望ましい特性、例えば、対応する未修飾アプタマーと比較して、改善された熱的または化学的安定性、低減した免疫原性、低減した分解、ＴＬＲ－４標的エピトープへの増加した結合、ＴＬＲ－の他の領域または他の分子、例えば、他のＴｏｌｌ様受容体への低減した非特異的結合を示し得る。
いくつかの態様において、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＡｐＴＯＬＬなどのアプタマー）は、化学的に修飾されている。ポリヌクレオチドに関して本明細書で使用される場合、「化学修飾」または適切な場合、「化学的に修飾された」という用語は、アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、ウリジン（Ｕ）、チミジン（Ｔ）またはシチジン（Ｃ）リボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオシドに関して、その核酸塩基、糖、骨格、またはそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない、それらの位置、パターン、パーセントまたは集団のうちの１つ以上における修飾を指す。
いくつかの態様において、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＡｐＴＯＬＬなどのアプタマー）は、同じヌクレオシドタイプのすべてもしくはいずれかの均一な化学修飾または同じヌクレオシドタイプのすべてもしくはいずれかの同じ開始修飾の下方滴定によってもたらされる修飾の集団、あるいはランダムな組み込みを有するが同じヌクレオシドタイプのいずれかすべての測定した化学修飾のパーセントを有し得る。別の態様において、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＡｐＴＯＬＬなどのアプタマー）は、ポリヌクレオチド全体にわたって同じヌクレオシドタイプのうちの２、３、または４つの均一な化学修飾を有し得る（例えば、すべてのアデノシンおよび／またはすべてのシチジンなどは、同じ方法で修飾される）。
修飾ヌクレオチド塩基対合は、標準的なアデニン－チミン、アデニン－ウラシル、またはグアニン－シトシン塩基対だけでなく、ヌクレオチドおよび／または非標準塩基もしくは修飾塩基を含む修飾ヌクレオチド間で形成される塩基対も含み、水素結合ドナーおよび水素結合アクセプターの配置は、非標準塩基と標準塩基との間、または２つの相補的な非標準塩基構造の間の水素結合を可能にする。そのような非標準塩基対合の一例は、修飾された核酸塩基イノシンとアデニン、シトシンまたはウラシルとの間の塩基対合である。塩基／糖またはリンカーの任意の組み合わせを、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＡｐＴＯＬＬなどのアプタマー）に組み込むことができる。
いくつかの態様において、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＡｐＴＯＬＬなどのアプタマー）中の核酸塩基、糖、骨格結合、またはそれらの任意の組み合わせは、少なくとも約５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％修飾される。
１．塩基の修飾
ある特定の態様において、化学修飾は、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＡｐＴＯＬＬなどのアプタマー）の核酸塩基にある。いくつかの態様において、少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオシドは、修飾ウリジン（例えば、シュードウリジン（ψ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）、１－エチル－シュードウリジン（ｅ１ψ）、もしくは５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ））、修飾シトシン（例えば、５－メチル－シトシン（ｍ５Ｃ））、修飾アデノシン（例えば、１－メチル－アデノシン（ｍ１Ａ）、Ｎ６－メチル－アデノシン（ｍ６Ａ）、もしくは２－メチル－アデニン（ｍ２Ａ））、修飾グアノシン（例えば、７－メチル－グアノシン（ｍ７Ｇ）もしくは１－メチル－グアノシン（ｍ１Ｇ））、またはそれらの組み合わせである。
いくつかの態様において、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＡｐＴＯＬＬなどのアプタマー）は、特定の修飾のために均一に修飾される（例えば、完全に修飾される、配列全体にわたって修飾される）。例えば、ポリヌクレオチドは、同じタイプの塩基修飾、例えば、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）で均一に修飾することができ、これは、ポリヌクレオチド配列中のすべてのシトシン残基が５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）で置き換えられることを意味する。同様に、ポリヌクレオチドは、例えば、上記のいずれかの修飾ヌクレオシドで置き換えることにより、配列中に存在する任意のタイプのヌクレオシド残基について均一に修飾することができる。
いくつかの態様において、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＡｐＴＯＬＬなどのアプタマー）は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０個または８０個を超える修飾核酸塩基の組み合わせを含む。いくつかの態様において、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＡｐＴＯＬＬなどのアプタマー）中のあるタイプの核酸塩基の少なくとも約５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％は、修飾核酸塩基である。
２．骨格の修飾
いくつかの態様において、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＡｐＴＯＬＬなどのアプタマー）は、ヌクレオシド間の結合に対する任意の有用な修飾を含む。本開示の組成物中で有用な骨格修飾を含むそのような結合としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：３’－アルキレンホスホナート、３’－アミノホスホロアミダート、アルケン含有骨格、アミノアルキルホスホロアミダート、アミノアルキルホスホトリエステル、ボラノホスフェート、－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＨ２－、キラルホスホナート、キラルホスホロチオエート、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレン（メチルイミノ）、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、モルホリノ結合、－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－、ヘテロ原子ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオシド、ホスフィナート、ホスホロアミダート、ホスホロチオエート、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、ＰＮＡ、シロキサン骨格、スルファメート骨格、スルフィドスルホキシドおよびスルホン骨格、スルホナートおよびスルホンアミド骨格、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびにチオノホスホロアミダート。
Figure 2022533966000003
いくつかの態様において、上に開示された骨格結合の存在は、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＡｐＴＯＬＬなどのアプタマー）の安定性（例えば、熱的安定性）および／または分解に対する抵抗性（例えば、酵素分解）を増加させる。
いくつかの態様において、分解（例えば、ヌクレアーゼによる分解）に対する安定性および／または抵抗性は、修飾なしの対応するポリヌクレオチド（参照もしくは対照アプタマー）と比較して、本開示の修飾ポリヌクレオチド中で少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％増加する。
いくつかの態様において、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＡｐＴＯＬＬなどのアプタマー）中の骨格結合の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％は、修飾されている（例えば、それらのすべてはホスホロチオエートである）。
いくつかの態様において、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＡｐＴＯＬＬなどのアプタマー）中の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０個、または８０個を超える骨格結合が修飾されている（例えば、ホスホロチオエート）。
いくつかの態様において、骨格は、ホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、メチルホスホネート結合、ホスホロアミダート結合、ホスホロチオエート結合、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される結合を含む。
３．糖の修飾
本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＡｐＴＯＬＬなどのアプタマー）に組み込むことができる修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、核酸の糖上で修飾することができる。したがって、いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、少なくとも１つのヌクレオシド類似体（例えば、糖修飾を有するヌクレオシド）を含む。
いくつかの態様において、糖修飾は、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＡｐＴＯＬＬなどのアプタマー）の、その標的エピトープへの結合の親和性を増加させる。ＬＮＡまたは２’置換糖などの本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＡｐＴＯＬＬなどのアプタマー）に親和性増強ヌクレオチド類似体を組み込むことにより、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＡｐＴＯＬＬなどのアプタマー）の長さを低減することができ、また非特異的または異常な結合が起こる前に、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＡｐＴＯＬＬなどのアプタマー）のサイズの上限を低減することができる。
いくつかの態様において、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＡｐＴＯＬＬなどのアプタマー）中のヌクレオチドの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％は、糖修飾を含む（例えば、ＬＮＡ）。
いくつかの態様において、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＡｐＴＯＬＬなどのアプタマー）中の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０個、または８０個を超えるヌクレオチド単位は、糖修飾されている（例えば、ＬＮＡ）。
一般に、ＲＮＡには、酸素を有する５員環である糖基リボースが含まれる。例示的な非限定的修飾ヌクレオチドには、リボース中の酸素の（例えば、Ｓ、Ｓｅ、またはアルキレン、例えばメチレンまたはエチレンでの）置換；二重結合の付加（例えば、リボースをシクロペンテニルまたはシクロヘキセンに置き換えるため）；リボースの環縮小（例えば、シクロブタンまたはオキセタンの４員環を形成するため）；リボースの環拡大（例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、およびホスホロアミダート骨格も有するモルホリノなどの、追加の炭素またはヘテロ原子を有する６員または７員環を形成するため）；多環式形態（例えば、トリシクロ、およびグリコール核酸（ＧＮＡ）などの「アンロック」形態（例えば、リボースがホスホジエステル結合に付着したグリコール単位によって置き換えられるＲ－ＧＮＡまたはＳ－ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ、リボースはα－Ｌ－トレオフラノシル－（３’→２’）で置き換えられる）、ならびにペプチド核酸（ＰＮＡ、２－アミノ－エチル－グリシン結合がリボースおよびホスホジエステル骨格を置き換える）が含まれる。糖基はまた、リボース中の対応する炭素の立体化学的配置とは反対の立体化学的配置を有する１つ以上の炭素を含むことができる。したがって、ポリヌクレオチド分子は、例えば、糖としてアラビノースを含むヌクレオチドを含むことができる。
リボースの２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、修飾するか、またはいくつかの異なる置換基で置き換えることができる。２’位での例示的な置換には、Ｈ、ハロ、任意選択で置換されたＣ１～６アルキル；任意選択で置換されたＣ１～６アルコキシ；任意選択で置換されたＣ６～１０アリールオキシ；任意選択で置換されたＣ３～８シクロアルキル；任意選択で置換されたＣ３～８シクロアルコキシ；任意選択で置換されたＣ６～１０アリールオキシ；任意選択で置換されたＣ６～１０アリール－Ｃ１～６アルコキシ、任意選択で置換されたＣ１～１２（ヘテロシクリル）オキシ；糖（例えば、リボース、ペントース、または本明細書に記載のいずれか）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ（Ｒは、Ｈまたは任意選択で置換されたアルキルであり、ｎは、０～２０の整数である（例えば、０～４、０～８、０～１０、０～１６、１～４、１～８、１～１０、１～１６、１～２０、２～４、２～８、２～１０、２～１６、２～２０、４～８、４～１０、４～１６、および４～２０））；２’－ヒドロキシルがＣ１～６アルキレンまたはＣ１～６ヘテロアルキレン架橋によって同じリボース糖の４’－炭素に接続されている「ロック」核酸（ＬＮＡ）（例示的な架橋には、メチレン、プロピレン、エーテル、アミノ架橋、アミノアルキル、アミノアルコキシ、アミノ、およびアミノ酸が含まれる）が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの態様において、本開示のポリヌクレオチド中に存在するヌクレオシド類似体（例えば、ＡｐＴＯＬＬなどのアプタマー）は、例えば、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡユニット、２’－ＯＭｅ－ＲＮＡユニット、２’－Ｏ－アルキル－ＳＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡユニット、２’－フルオロ－ＤＮＡユニット、ＬＮＡユニット、アラビノ核酸（ＡＮＡ）ユニット、２’－フルオロ－ＡＮＡユニット、ＨＮＡユニット、ＩＮＡ（挿入核酸）ユニット、２’ＭＯＥユニット、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、ＬＮＡは、例えば、オキシ－ＬＮＡ（β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡもしくはα－Ｌ－オキシ－ＬＮＡなど）、アミノ－ＬＮＡ（β－Ｄ－アミノ－ＬＮＡもしくはα－Ｌ－アミノ－ＬＮＡ）、チオ－ＬＮＡ（β－Ｄ－チオ０－ＬＮＡもしくはα－Ｌ－チオ－ＬＮＡなど）、ＥＮＡ（β－Ｄ－ＥＮＡもしくはα－Ｌ－ＥＮＡなど）、または任意の組み合わせである。
いくつかの態様において、本開示のポリヌクレオチド中に存在するヌクレオシド類似体（例えば、ＡｐＴＯＬＬなどのアプタマー）は、ロック核酸（ＬＮＡ）；２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ；２’－アミノ－ＤＮＡ；２’－フルオロ－ＤＮＡ；アラビノ核酸（ＡＮＡ）；２’－フルオロ－ＡＮＡ、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、挿入核酸（ＩＮＡ）、拘束エチルヌクレオシド（ｃＥｔ）、２’－Ｏ－メチル核酸（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル核酸（２’－ＭＯＥ）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの態様において、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＡｐＴＯＬＬなどのアプタマー）は、修飾されたＲＮＡヌクレオチド類似体（例えば、ＬＮＡ）およびＤＮＡユニットの両方を含むことができる。例えば、米国特許第８，４０４，６４９号、同第８，５８０，７５６号、同第８，１６３，７０８号、同第９，０３４，８３７号を参照されたい（これらはすべて、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。
Ｖ．製造および製剤化の方法
本開示はまた、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を作製する方法を提供する。一般に、本開示のアプタマーは、米国特許第１０，１９６，６４２号に開示された方法を使用して得られ、そこに記載された方法または当該技術分野で一般に知られている方法を使用して合成され得る。
本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の産生は、当該技術分野における従来の方法に従って実行することができる。アプタマーの産生のための技法の非限定的な例としては、転写、組換え発現系、および標準的な固相（または液相）化学合成などの酵素技法が挙げられ、これらはすべて市販されている。適切な場合、例えば、本開示のアプタマーが、上記のものなどの核酸変異体、化学的に修飾された塩基または糖を有する類似体などのヌクレオチド類似体、骨格修飾などを含む場合、本発明のアプタマーは、化学合成によって産生され得る。あるいは、組換え発現は、アプタマーが、例えば、２００ヌクレオチド以上の長さを有する場合、本開示のアプタマーの産生に好ましい技法であり得る。前述の技法のうちのいずれかによって産生されたアプタマーは、当該技術分野で周知の方法によって任意選択で精製することができる。
本明細書で使用される場合、「合成する」という用語は、当該技術分野で知られているポリヌクレオチド合成方法を使用してアプタマーを組み立てることを指す。合成するという用語はまた、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）および少なくとも１つの生物学的活性分子（例えば、アプタマーに共有結合的にまたは非共有結合的に付着した小分子薬物）を含むコンジュゲートまたは複合体の集合体を包含する。例えば、ペプチドまたは小分子成分は、組換え的、化学的、または酵素的に調製され得、その後、１つ以上の合成ステップ（例えば、本開示のアプタマーへのリンカーのコンジュゲーションとそれに続くリンカーへの小分子のコンジュゲーション）においてアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）にコンジュゲートされ得る。いくつかの態様において、本開示の少なくとも１つのアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を含むコンジュゲートまたは複合体の成分のそれぞれは、当該技術分野で知られている方法、例えば、組換えタンパク質産生、固相ペプチドもしくは核酸合成、化学合成、酵素合成、またはそれらの任意の組み合わせを使用して調製することができ、得られた成分は、当該技術分野で知られている化学的および／または酵素的方法を使用してコンジュゲートすることができる。
本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、汚染物質を除去するために、例えば、濾過によって精製することができる。いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の製造は、凍結乾燥または再構成に適した任意の他の形態の乾燥貯蔵を含む。いくつかの態様において、乾燥形態でのアプタマーの調製は、アプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を生物学的に活性な分子（例えば、小分子薬物）と組み合わせた後に行われる、すなわち、両方の治療薬を共凍結乾燥することができる。
いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を生物学的に活性な分子（例えば、小分子薬物）とともに含む組成物を調製する方法は、アプタマーを溶液中の生物学的に活性な分子（例えば、小分子薬物）と混合することを含む。いくつかの態様において、溶液中のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）および生物学的に活性な分子（例えば、小分子薬物）の組み合わせ後、得られた溶液は、凍結乾燥または乾燥される。いくつかの態様において、アプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）と生物学的に活性な分子（例えば、小分子薬物）との組み合わせは、乾燥形態で行われる。
いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、例えば、汚染物質を除去するために、および／またはアプタマーの均一な集団を生成するために精製され得る。
本開示はまた、本開示のアプタマー、例えば、ＡｐＴＯＬＬを含む製剤を提供する。本開示のアプタマーは、図２０に概略的に示されている方法に従って製剤化することができる。アプタマーＡＰＩ（Ａｃｔｉｖｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ、医薬品有効成分）は、事前に濾過された賦形剤を含む溶液と組み合わされる。構造化段階の後、アプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）および賦形剤を含む溶液は、２つの濾過ステップにかけられ、バイアルに移され、凍結乾燥される。構造化ステップは、アプタマー（ＡｐＴＯＬＬなど）の調製における重要なステップである。構造化プロセスは、アプタマーを適切な溶媒に溶解することを含む。いくつかの態様において、溶媒は、二価イオンを含む。いくつかの態様において、二価イオンは、Ｍｇ２＋である。いくつかの態様において、溶媒は、ＭｇＣｌ２を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。いくつかの態様において、溶媒は、１ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＰＢＳである。アプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）が溶解した後、それを変性温度（例えば、９５℃）まで短時間（例えば、およそ１０分）加熱し、続いて（例えば、氷に移すことによって、例えば、およそ１０分間）急速に冷却する。いくつかの態様において、アプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、加熱および冷却ステップがない場合には機能しない。
合成後、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、線形である。温度を上げるとアプタマーは完全に線形化されるが、その後の冷却ではアプタマーが正しく折り畳まれ、機能的なアプタマーが得られる。いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、加熱および冷却ステップが二価イオン、例えば、Ｍｇ２＋の存在下で行われない場合は機能しない。本開示の特定の態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、Ｍｇ２＋（例えば、１ｍＭのＭｇＣｌ２）を含む緩衝液に溶解され、９５℃で１０分間加熱され、その後に氷中０℃で１０分間冷却されない限り、治療的に機能しない。
本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の製造プロセスは、２つの凍結乾燥ステップを含む。第１のステップにおいて、構造化されたアプタマー（例えば、ＰＢＳ中の本開示のアプタマーは、凍結乾燥される。凍結乾燥されたアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、緩衝液、例えば、ＰＢＳに再溶解され、再凍結乾燥される。第２の凍結乾燥は、単一の凍結乾燥ステップを受ける同じアプタマーに関して、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の安定性を増加させる。
いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、７ｍｇのアプタマー、例えば、構造化および凍結乾燥されたアプタマーを含む用量で製剤化される。他の態様において、本開示のアプタマーは、少なくとも約１ｍｇ、少なくとも約２ｍｇ、少なくとも約３ｍｇ、少なくとも約４ｍｇ、少なくとも約５ｍｇ、少なくとも約６ｍｇ、少なくとも約７ｍｇ、少なくとも約８ｍｇ、少なくとも約９ｍｇ、または少なくとも約１０ｍｇの本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を含む用量で製剤化される。
いくつかの態様において、本開示のアプタマーは、例えば、ナノ粒子に共有結合的にまたは非共有結合的に付着された（例えば、ナノ粒子にカプセル化された）本開示のアプタマーを含む、ポリマーナノ粒子、脂質ナノ粒子（例えば、リポソームもしくはミセル）、または金属ナノ粒子などのナノ粒子に製剤化することができる。例えば、米国特許第１０，１９６，６４２号を参照されたい（これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
上記のように、本開示のアプタマーは、生物学的に活性な分子および／またはナノ粒子（例えば、形成されたナノ粒子もしくはナノ粒子の成分）に共有結合的にまたは非共有結合的に付着することができる。本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）と生物学的に活性な分子および／またはナノ粒子との間の共有結合的付着は、当業者に周知のコンジュゲーション技法によって実行することができる。結果は、本開示のアプタマーと生物学的に活性な分子との間、および／またはナノ粒子もしくはその成分との間の共有結合である。コンジュゲーションは、アプタマーの化学合成中に、本開示のアプタマーの３’または５’末端の一級アミンの、官能基への結合を伴い得る。
コンジュゲーションはまた、従来の架橋反応によっても行うことができ、ヌクレオチド自体のアリールアミンに関して、一級アルキルアミン標識の化学反応性がはるかに高いという利点がある。コンジュゲーションの方法は、当該技術分野で周知であり、架橋試薬の使用に基づいている。架橋試薬は、本開示のアプタマーにコンジュゲートされる生物学的に活性な分子および／またはナノ粒子中に、一級アミン、スルフヒドリル、アルデヒド、カルボキシル、ヒドロキシル、アジドなどのような基を標的とする少なくとも２つの反応基を含む。
架橋剤は、それらの化学的特異性、スペーサーアームの長さ、スペーサーアームの組成、開裂スペーサーアーム、および構造が異なる。例えば、生物学的に活性な分子および／またはナノ粒子またはそれらの成分の本開示のアプタマーへのコンジュゲーションは、アプタマーおよび／または官能基（アミン、カルボキシル、フェニル、チオール、もしくはヒドロキシル基など）中の１つ以上の非官能基を介して、直接または連結部分を介して実行することができる。ヘテロ二官能性リンカーを使用することによって、より選択的な結合を実現することができる。ジイソシアネート、ジイソチオシアネート、ビス（ヒドロキシスクシンイミド）エステル、カルボジイミド、マレイミド－ヒドロキシスクシンイミドエステル、グルタルアルデヒドなどの従来のリンカー、またはヒドラジンおよび４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）などのヒドラジドを使用することが可能である。
いくつかの態様において、コンジュゲーションは、組換えまたは酵素的方法による本開示のアプタマーの生成に続いて起こり得る。
いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、バイアル内で製剤化され、それぞれの用量バイアルは、バイアル当たり約０．５、約１、約１．５、約２、約２．５、約３、約３．５、約４、約４．５、約５、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、約９、約９．５、または約１０ｍｇの本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を含む。１つの特定の態様において、それぞれの用量バイアルは、バイアル当たり７ｍｇの本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を含む。いくつかの態様において、バイアルの内容物は、本開示の凍結乾燥アプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）である。
ＶＩ．薬学的組成物
本開示はまた、本明細書に開示された方法（例えば、本明細書に開示された疾患または状態、例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、血管性認知症疾患、または虚血性脳卒中のうちのいずれかに対する方法）による対象への投与に好適な本開示の１つ以上のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を含む、薬学的組成物を提供する。
薬学的組成物は、一般に、所望の純度を有する本開示の１つ以上のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）、および対象への投与に好適な形態の薬学的に許容される賦形剤または担体を含む。薬学的に許容される賦形剤または担体は、投与されている特定の組成物、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって部分的に決定される。したがって、本開示の１つ以上のアプタマーを含む薬学的組成物の多種多様な好適な製剤が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．１８ｔｈ ｅｄ．（１９９０）を参照）。薬学的組成物は、一般に無菌で製剤化され、米国食品医薬品局のすべての適正製造基準（ＧＭＰ）の規制に完全に準拠している。
いくつかの態様において、薬学的組成物は、本開示の１つ以上のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を含む。ある特定の態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、薬学的に許容される担体中の１つ以上の追加の治療薬、および／または外科的手順（例えば、心筋梗塞の場合の血栓摘出）と同時投与される。いくつかの態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を含む薬学的組成物は、追加の治療薬の投与、および／または外科的手順（例えば、心筋梗塞の場合の血栓摘出）の前に投与される。
他の態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を含む薬学的組成物は、追加の治療薬の投与、および／または外科的手順（例えば、心筋梗塞の場合の血栓摘出）の後に投与される。さらなる態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を含む薬学的組成物は、追加の治療薬、および／または外科的手順（例えば、心筋梗塞の場合の血栓摘出）と同時に投与される。
許容される担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる投与量および濃度でレシピエント（例えば、動物もしくはヒト）に対して無毒であり、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存料（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；単糖、二糖、およびグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
担体または希釈剤の例としては、水、生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および化合物の使用は、当該技術分野で周知である。任意の従来の媒体または化合物が本開示のアプタマーと適合しない場合を除いて、組成物におけるそれらの使用が企図される。
本明細書に開示される疾患または状態（例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、血管性認知症疾患、もしくは虚血性脳卒中）のうちのいずれかの治療または予防（例えば、抑制、阻害、もしくは遅延）に好適な、あるいは本明細書に開示される疾患または状態（例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、血管性認知症疾患、もしくは虚血性脳卒中）のうちのいずれかを患っている、患ったことがある、またはそのリスクがある対象のホメオスタシスの改善に好適な補助的治療薬もまた、本開示の組成物に組み込むことができる。
典型的には、薬学的組成物は、その意図された投与経路と適合性があるように製剤化される。本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、例えば、非経口、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、皮内、経皮、直腸、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内、もしくは筋肉内経路によって、または吸入剤として投与することができる。
ある特定の態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を含む薬学的組成物は、例えば、注射によって、静脈内または動脈内に投与される。本明細書に記載のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、任意選択で、本明細書に記載のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）が対象とする、本明細書に開示される疾患または状態（例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、血管性認知症疾患、もしくは虚血性脳卒中）のうちのいずれかを治療することにおいて少なくとも部分的に効果的である他の治療薬と組み合わせて投与され得る。
溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌性化合物；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート化合物；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張性を調整するための化合物。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整することができる。調製物は、アンプル、使い捨て注射器、またはガラスもしくはプラスチック製の複数用量バイアルに入れることができる。
注射用途に好適な薬学的組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液および滅菌粉末が含まれる。静脈内または動脈内投与の場合、好適な担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。組成物は、一般に、容易な注射可能性が存在する程度まで無菌かつ流動性である。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、ならびにそれらの好適な混合物を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散の場合に必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌性および抗真菌性化合物、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。必要に応じて、等張化合物、例えば、糖、マンニトール、ソルビトール、および塩化ナトリウムなどの多価アルコールを組成物に添加することができる。注射可能な組成物の長期吸収は、吸収を遅らせる化合物、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることによってもたらすことができる。
本開示の薬学的組成物は、従来の周知の滅菌技法によって滅菌することができる。水溶液は、使用するために包装するか、無菌条件下で濾過して凍結乾燥することができ、凍結乾燥した調製物を、投与前に滅菌水溶液と組み合わせる。
滅菌注射可能溶液は、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を、必要に応じて、本明細書に列挙される成分のうちの１つまたは組み合わせを有効量でおよび適切な溶媒に組み込むことによって調製することができる。一般に、分散液は、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を、基本的な分散媒体および任意の所望の他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射液を調製するための滅菌粉末の場合、調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、有効成分の粉末に加えて、以前に滅菌濾過された溶液から任意の追加の所望の成分が得られる。本明細書に記載のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、本開示のアプタマーの持続的または脈動放出を可能にするような方法で製剤化することができるデポー注射またはインプラント調製物の形態で投与することができる。
本明細書に記載のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を含む組成物の全身投与もまた、経粘膜的手段によることができる。経粘膜投与の場合、浸透するバリアに適した浸透剤を製剤に使用する。そのような浸透剤は、当該技術分野で一般に知られており、例えば、経粘膜投与用、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、例えば、鼻スプレーの使用によって達成することができる。
ある特定の態様において、本開示のアプタマーを含む薬学的組成物（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）は、薬学的組成物から利益を得るであろう対象に静脈内または動脈内に投与される。ある特定の他の態様において、組成物は、例えば、リンパ系内注射、結節内注射（例えば、Ｓｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １０５（４６）：１７９０８（２００８）を参照）、筋肉内注射、腹腔内、または皮下投与によってリンパ系に投与される。
ある特定の態様において、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を含む薬学的組成物は、液体懸濁液として投与される。ある特定の態様において、薬学的組成物は、投与後にデポーを形成することができる製剤として投与される。ある特定の好ましい態様において、デポーは、アプタマーをゆっくりと循環に放出するか、またはデポー形態のままである。
典型的には、薬学的に許容される組成物は、汚染物質を含まないように高度に精製され、生体適合性であり、毒性がなく、対象への投与に適している。水が担体の構成要素である場合、水を高度に精製および処理して、汚染物質、例えば、内毒素を含まないようにする。
薬学的に許容される担体は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシ安息香酸塩、プロピルヒドロキシ安息香酸塩、タルク、ステアリン酸マグネシウム、および／または鉱物油であり得るが、これらに限定されない。薬学的組成物は、潤滑剤、湿潤剤、甘味料、調味料、乳化剤、懸濁剤、および／または防腐剤をさらに含むことができる。
本明細書に記載の薬学的組成物は、本明細書に記載のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）および任意選択で薬学的に活性な薬剤または治療薬を含む。治療薬は、例えば、生物学的薬剤（例えば、ペプチドもしくは核酸）、小分子剤、またはそれらの組み合わせであり得る。
本明細書に開示された方法に従って使用するための、本明細書に記載のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）または薬学的組成物を含む剤形が提供される。いくつかの態様において、剤形は、静脈内または動脈内注射のための液体懸濁液として製剤化される。
本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）または本開示のアプタマーを含む薬学的組成物は、他の治療法、例えば、薬物および／または手術と同時に使用することができる。具体的には、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）または薬学的組成物は、本明細書に開示される疾患または状態（例えば、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、血管性認知症疾患、もしくは虚血性脳卒中）のうちのいずれかの治療に一般に使用される医薬品と一緒に、あるいはそのような疾患または状態を治療するために使用される当該技術分野で知られている薬理学的および／または外科的手順（例えば、心筋梗塞の場合の血栓摘出）との組み合わせ心筋梗塞の場合）と組み合わせて使用され得る。
ＶＩＩ．キット
本開示はまた、本開示のアプタマー（例えば、本開示の単離されたアプタマーまたは生物学的に活性な分子にコンジュゲートもしくは複合体化された本開示のアプタマー、例えばＡｐＴＯＬＬ）および任意選択で本開示の方法に従って使用するための説明書を含む、キットまたは製造製品を提供する。
いくつかの態様において、キットまたは製造製品は、本開示の少なくとも１つのアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）を１つ以上の容器に含む本開示の薬学的組成物、および任意選択で本開示の方法に従って使用するための説明書を含む。
いくつかの態様において、キットまたは製造製品は、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）、または本開示の薬学的組成物およびパンフレットを含む。いくつかの態様において、キットまたは製造製品は、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）、または本開示の薬学的組成物および使用のための説明書を含む。当業者は、アプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）もしくは本開示の薬学的組成物、またはそれらの組み合わせが、当該技術分野で周知の確立されたキットフォーマットのうちの１つに容易に組み込まれ得ることを容易に認識するであろう。
いくつかの態様において、キットまたは製造製品は、容器（例えば、ガラスバイアル）中の乾燥形態の本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）、および任意選択でアプタマーを水和するのに好適な溶媒を有するバイアル、および任意選択で本明細書に開示された方法に従って再構成された製品を使用するための説明書を含む。いくつかの態様において、キットまたは製造製品は、生物学的に活性な分子（例えば、第２のＴＬＲ－４アンタゴニスト）を含む少なくとも１つの追加の容器（例えば、ガラスバイアル）をさらに含む。
当業者は、本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）、本開示のアプタマーを含む薬学的組成物（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）、またはそれらの組み合わせが、当該技術分野において周知の確立されたキットフォーマットのうちの１つに容易に組み込まれ得ることを容易に認識するであろう。
いくつかの態様において、キットは、生物学的に活性な分子を本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）にコンジュゲートするための試薬、コンジュゲーションを行うための説明書、および本開示の方法に従ってコンジュゲートを使用するための説明書を含む。
いくつかの態様において、キットは、生物学的に活性な分子および本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）、それらを混和して複合体の形成を行うための説明書、および本開示の方法に従って得られた複合体を使用するための説明書を含む。
いくつかの態様において、キットまたは製造製品は、溶液中の本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）、および本開示の方法に従って使用するための説明書を含む。いくつかの態様において、キットまたは製造製品は、乾燥形態の本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）、および使用説明書（例えば、本明細書に開示される方法に従って再構成および投与するための説明書）を含む。
ＶＩＩＩ．実施形態
Ｅ１．少なくとも１用量の、長さ４０～８０核酸塩基の核酸アプタマーを対象に投与することを含む、ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、アプタマーが、ＴＬＲ－４の細胞外ドメイン上のエピトープに結合し、エピトープへのアプタマーの結合が、ＴＬＲ－４活性化を低減および／または阻害する、方法。
Ｅ２．追加の治療またはそれらの組み合わせを投与することをさらに含む、実施形態Ｅ１に記載の方法。
Ｅ３．追加の治療が、第２のＴＬＲ－４アンタゴニストである、実施形態Ｅ２に記載の方法。
Ｅ４．追加の治療が、外科的介入である、実施形態Ｅ３に記載の方法。
Ｅ５．追加の治療が、抗炎症剤、核酸、ペプチド、またはそれらの組み合わせの投与を含む、実施形態Ｅ２に記載の方法。
Ｅ６．ペプチドが、抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、実施形態Ｅ５に記載の方法。
Ｅ７．核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンティミル（ａｎｔｉｍｉｒ）、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡを含む、実施形態Ｅ５に記載の方法。
Ｅ８．核酸アプタマーが、配列番号１、２、３、もしくは４と少なくとも７０％同一の配列、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態Ｅ１に記載の方法。
Ｅ９．核酸アプタマーが、アプタマーに共有結合的にまたは非共有結合的に付着している生物学的に活性な分子をさらに含む、実施形態Ｅ１に記載の方法。
Ｅ１０．核酸アプタマーが、配列番号１、２、３、または４の核酸アプタマーと同じＴＬＲ－４エピトープと交差競合するか、またはそれに結合する、実施形態Ｅ１に記載の方法。
Ｅ１１．核酸アプタマーが、配列番号１、２、３、または４の核酸アプタマーによって認識されるＴＬＲ－４エピトープと重複するエピトープと交差競合するか、またはそれに結合する、実施形態Ｅ１に記載の方法。
Ｅ１２．核酸アプタマーが、複数用量を含む用量レジメンで投与される、実施形態Ｅ１に記載の方法。
Ｅ１３．複数用量が、同時に、連続して、またはそれらの組み合わせで投与される、実施形態Ｅ１２に記載の方法。
Ｅ１４．複数用量が、２、３、４、または５つの用量を含む、実施形態Ｅ１２に記載の方法。
Ｅ１５．それぞれの用量が、０．００７～０．４５ｍｇ／ｋｇの核酸アプタマーを含む、実施形態Ｅ１に記載の方法。
Ｅ１６．核酸アプタマーが、静脈内、動脈内、または腹腔内に投与される、実施形態Ｅ１に記載の方法。
Ｅ１７．ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態が、虚血性の疾患または状態である、実施形態Ｅ１に記載の方法。
Ｅ１８．虚血状態が、心筋梗塞または虚血性脳卒中である、実施形態Ｅ１７に記載の方法。
Ｅ１９．ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態が、出血性状態である、実施形態Ｅ１に記載の方法。
Ｅ２０．出血状態が、出血性脳卒中または出血性変化である、実施形態Ｅ１９に記載の方法。
Ｅ２１．ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態が、神経筋の疾患または状態である、実施形態Ｅ１に記載の方法。
Ｅ２２．神経筋の疾患または状態が、神経変性の疾患または状態である、実施形態Ｅ２１に記載の方法。
Ｅ２３．神経変性の疾患または状態が、多発性硬化症である、実施形態Ｅ２２に記載の方法。
Ｅ２４．急性心筋梗塞の最中、前、または直後に対象にアプタマーを投与することを含む、急性心筋梗塞の少なくともある症状または後遺症の寛解または改善を必要とする対象においてそれを行う方法であって、
（ａ）アプタマーが、４０～１００ヌクレオチドの長さを有し、配列番号１、２、３、および４からなる群から選択され、
（ｉ）アプタマーが、ＴＬＲ－４の細胞外ドメイン上のエピトープに特異的に結合し、
（ｉｉ）エピトープへのアプタマーの結合が、ＴＬＲ－４活性化を低減および／もしくは阻害するか、または
（ｂ）アプタマーが、配列番号１、２、３、もしくは４に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する（ａ）のアプタマーの機能的に同等の変異体であり、機能的に同等の変異体が、配列番号１、２、３、もしくは４から誘導され、ＴＬＲ－４に特異的に結合し、その活性化を低減および／もしくは阻害する能力を維持する、方法。
Ｅ２５．アプタマーの投与が、梗塞領域の低減を引き起こす、実施形態２４に記載の方法。
Ｅ２６．アプタマーの投与が、対照条件と比較して、少なくとも２５％の梗塞面積の低減を引き起こす、実施形態Ｅ２５に記載の方法。
Ｅ２７．アプタマーの投与が、急性心筋梗塞によって引き起こされる線維症および／または壊死の減少を引き起こす、実施形態Ｅ２４に記載の方法。
Ｅ２８．アプタマーの投与が、
（ｉ）心機能の改善、
（ｉｉ）細胞外マトリックスの分解の低減、
（ｉｉｉ）心臓リモデリングの改善、
（ｉｖ）心室の解剖学的構造の保存、
（ｖ）梗塞の進行の低減、または
（ｖｉ）それらの任意の組み合わせをもたらす、実施形態Ｅ２４に記載の方法。
Ｅ２９．神経筋または神経変性の疾患または状態の発症中、発症前、または発症後に対象にアプタマーを投与することを含む、神経筋または神経変性の疾患または状態の少なくともある症状または後遺症を寛解または改善する方法であって、
（ａ）アプタマーが、４０～１００ヌクレオチドの長さを有し、配列番号１、２、３、および４からなる群から選択され、
（ｉ）アプタマーが、ＴＬＲ－４の細胞外ドメイン上のエピトープに特異的に結合し、
（ｉｉ）エピトープへのアプタマーの結合が、ＴＬＲ－４活性化を低減および／もしくは阻害するか、または
（ｂ）アプタマーが、配列番号１、２、３、もしくは４に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する（ａ）のアプタマーの機能的に同等の変異体であり、機能的に同等の変異体が、配列番号１、２、３、もしくは４から誘導され、ＴＬＲ－４に特異的に結合し、その活性化を低減および／もしくは阻害する能力を維持する、方法。
Ｅ３０．アプタマーの投与が、
（ｉ）脱髄の低減、
（ｉｉ）軸索損傷の低減、または
（ｉｉｉ）それらの組み合わせを引き起こす、実施形態Ｅ２９に記載の方法。
Ｅ３１．アプタマーの投与が、対照条件（例えば、プラセボの投与）と比較して、少なくとも２０～８０％の脱髄の阻害を引き起こす、実施形態Ｅ３０に記載の方法。
Ｅ３２．アプタマーの投与が、対照条件（例えば、プラセボの投与）と比較して、少なくとも１０～３０％の軸索損傷の低減を引き起こす、実施形態Ｅ３０に記載の方法。
Ｅ３３．神経筋または神経変性の疾患または状態が、心筋梗塞、出血性脳卒中、出血性変化、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、血管性認知症疾患、または虚血性脳卒中からなる群から選択される、実施形態Ｅ２９に記載の方法。
Ｅ３４．アプタマーが、ＡｐＴＯＬＬである、実施形態Ｅ２４またはＥ２９に記載の方法。
Ｅ３５．アプタマーが、約０．５ｍｇ／用量～約１４ｍｇ／用量の間の用量範囲で投与される、実施形態Ｅ２４またはＥ２９に記載の方法。
Ｅ３６．アプタマーが、用量当たり約０．００７ｍｇ／ｋｇ～用量当たり約０．２ｍｇ／ｋｇの間の用量範囲で投与される、実施形態Ｅ２４またはＥ２９の方法。
Ｅ３７．アプタマーが、塩化マグネシウム六水和物を含み、任意選択でＡ－トレハロース二水和物を含む、ＰＢＳ（塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸水素二ナトリウム二水和物、およびリン酸二水素カリウム）ｐＨ７．４で製剤化される、実施形態Ｅ２４またはＥ２９に記載の方法。
Ｅ３８．アプタマーが、注入によって静脈内投与される、実施形態Ｅ２４またはＥ２９の方法。
本開示の実施は、別途示されない限り、当該技術分野の技術の範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技法を用いる。そのような技法は、文献で完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．（１９９２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）、Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．，（１９８５）ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ、Ｇａｉｔ，ｅｄ．（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．米国特許第４，６８３，１９５号、Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７）Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）（１９８６）、Ｐｅｒｂａｌ（１９８４）Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）、Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．（１９８７）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４ ａｎｄ １５５、Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）、Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，（１９８６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＶ；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８６）、Ｃｒｏｏｋｅ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２ｎｄ Ｅｄ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（２００７）およびｉｎ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）を参照されたい。
本出願を通して引用され得るすべての引用された参考文献（文献の参考文献、特許、特許出願、およびウェブサイトを含む）の内容は、そこに引用された参考文献と同様に、あらゆる目的のためにそれら全体が参照により明示的に組み込まれる。
以下の実施例は、限定ではなく説明のために提供されている。
本開示のアプタマーの選択、特性評価、および最適化のための方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第１０，１９６，６４２号に詳細に開示されている。
実施例１．インビトロ一次薬力学
ｈＴＬＲ－４活性化に対するアプタマーの拮抗作用
ｈＴＬＲ－４活性化アッセイは、ＨＥＫ－ｂｌｕｅ－ｈＴＬＲ４細胞で実施した。超高純度ＬＰＳ（０．１ｎｇ／ｍｌ）が使用されたため、腎結石形成の機序に関連する重要な態様もまた、そのような研究から導き出すことができる。
細胞を活性化するためのＴＬＲ－４アゴニストおよび天然のＬＰＳアンタゴニスト（ＬＰＳ－ＲＳ、２００ｎｇ／ｍｌ）をｈＴＬＲ－４に対するアンタゴニスト活性の陽性対照として使用した。ｈＴＬＲ－４活性化は、インキュベーション培地へのリガンドの添加後２４時間で分泌された胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を測定することによって定量化した。ポリ－ＡＧヌクレオチド（３８ｘ）（３８ｘ（ＡＧ））を対照ｓｓＤＮＡとして（スクランブルとして使用した。３８ｘ（ＡＧ）は、オリゴヌクレオチドｓｓＤＮＡ、固定配列、Ａ－Ｇの３８倍である。それは実験室で設計されているため、３Ｄ構造を持たない、または非常に限定された不安定な構造の多様性を備えた対照アプタマーであり、いかなる標的も具体的に認識せず、実際、タンパク質と相互作用する場合、弱い負荷によってのみ認識される。結果は、ＡｐＴＬＲ＃１ＲおよびＡｐＴＬＲ＃４Ｆの両方が、ＬＰＳによって誘導されるｈＴＬＲ－４活性化を部分的に阻害したことを示した（図２）。濃度反応曲線は、最大の拮抗活性が２０ｎＭ濃度（ＡｐＴＬＲ＃１Ｒ）および２００ｎＭ（ＡｐＴＬＲ＃４Ｆ）で得られたことを示し、ＬＰＳによって媒介されるｈＴＬＲ－４活性化の３０％の低減を示した。受容体の飽和のために濃度を増加させた場合、それ以上の影響は観察されなかった。アッセイ中にアプタマーのアゴニスト活性は観察されなかった。
ｈＴＬＲ－４拮抗活性を持つアプタマーのリード最適化
アプタマーＡｐＴＬＲ＃１ＲおよびＡｐＴＬＲ＃４Ｆの配列および誘導された二次構造は、分子の生物学的利用能および体内分布を改善するために、それぞれの分子の両端に位置する領域（二次構造の取得に寄与せず、特定の結合特性に影響を与えるとは予想されない）を削除することによって修飾した。得られたアプタマーの切断型は、ＡｐＴＬＲ＃１ＲＴおよびＡｐＴＬＲ＃４ＦＴと名付けた（図３）。
ＡｐＴＬＲ＃１ＲＴおよびＡｐＴＬＲ＃４ＦＴが親分子によって示されるｈＴＬＲ－４に対して同じ親和性を維持するかどうかを試験するために、ＴＬＲ－４発現を有しないＨＥＫ－２９３細胞を対照として使用して、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８とコンジュゲートし、２９３－ｈＴＬＲ４Ａ細胞とインキュベートしたＡｐＴＬＲ＃１ＲＴおよびＡｐＴＬＲ＃４ＦＴ（２０ｎＭ）を使用して、フローサイトメトリーアッセイを実施した。
両方のアプタマーは２９３－ｈＴＬＲ４細胞（図４、パネルＡ、右パネル）に結合したが、ＨＥＫ－２９３細胞（図４、パネルＡ、左パネル）には結合せず、ＡｐＴＬＲ＃１ＲＴ（図４、パネルＡ、赤線）よりもＡｐＴＬＲ＃４ＦＴ（図４、パネルＡ、青線）に対してより高い結合親和性を示した。細胞が以前にＬＰＳで活性化された場合、ＦＬ－１シグナルの増加は、ＨＥＫ－２９３細胞（平均９．０４の増加）よりも２９３－ｈＴＬＲ４Ａ細胞（平均９．９の増加）においてわずかに高かった（図４、パネルＢ、左対右パネル）。
ＳＥＡＰアッセイによる切断型アプタマーの拮抗活性の定量化は、両方のアプタマーが２０ｎＭ濃度で親分子の特性を維持することを示した（図５、パネルＡ）。さらに、ＡｐＴＬＲ＃４ＦＴの場合、この阻害活性は、９６時間の投与後に示された（図５、パネルＢ）。
ＤＡＭＰによるｈＴＬＲ－４活性化に対する拮抗作用
ＡｐＴＬＲ＃１Ｒ、ＡｐＴＬＲ＃４Ｆ、および対応する切断型の拮抗プロファイルもまた、内因性ＴＬＲ－４リガンドに対して試験され、虚血性脳組織と同様のＴＬＲ－４活性化の分子環境を再現した。ＤＡＭＰ（ダメージ関連分子パターン）としても知られる内因性ＴＬＲ－４アゴニストは、熱ショックタンパク質、核酸、フィブロネクチン、ヒアルロン酸などの組織分子であり、損傷条件下で脳実質に放出される。ＤＡＭＰによるＴＬＲ－４活性化をシミュレートするために、（ＴＬＲ－４活性化に応答してＳＥＡＰを発現する）ＨＥＫ－ｂｌｕｅ－ｈＴＬＲ４細胞を、細胞由来のＤＡＭＰを含むＨＥＫ－２９３細胞溶解物とインキュベートした。以前の実験では、細胞溶解物の１：１希釈は、ＴＬＲ－４活性化に関して０．２ｎｇのＬＰＳに匹敵することが決定された。細胞溶解物希釈液を、いくつかの濃度のアプタマーの存在下または非存在下でインキュベーション培地に加えた。４つのアプタマーはすべて、試験したすべての濃度でＤＡＭＰによって誘導されたｈＴＬＲ－４活性化を部分的に無効にした（図６）。ＡＧＡ（３８ｘＡＧ）を対照ｓｓＤＮＡ（スクランブル）として使用した。
したがって、ＴＬＲ－４に対する拮抗活性が確認された２つの候補アプタマー（ＡｐＴＬＲ＃１ＲおよびＡｐＴＬＲ＃４Ｆ）から始めて、インビトロおよび薬理学の追加試験用に最適化された切断型が生成された。虚血性脳卒中の治療のためのアプタマーの開発は、さらなる特性評価のためにＡｐＴＬＲ＃４ＦおよびＡｐＴＬＲ＃４ＦＴに焦点を合わせている。最良の候補アプタマーを特定するために、両方のアプタマーの薬力学的、薬物動態学的、および毒物学的特性を特性評価することを目的とした一連の研究が開始された。同様の薬物動態および毒物学プロファイルを示したため、薬力学的基準を主要分子の選択に使用した。この点で、ＡｐＴＬＲ＃４ＦＴは、マウスｐＭＣＡＯモデルでより良い用量反応曲線の有効性を示し、ラットｔＭＣＡＯモデルでより優れた有効性を示し、インビボでより広範囲の虚血モデルをカバーした。さらに、より小さいサイズのＡｐＴＬＲ＃４ＦＴは、身体区画内の分子のより良い分布を示し、これは、潜在的な標的臓器のうちの１つが脳である虚血性脳卒中としての適応症における興味深い特徴である。虚血性条件下では、血液脳関門が通常の条件下よりも寛容であることは周知であるが、分子サイズが小さいほど、静脈内または動脈内投与後の脳分布をさらに改善することができる。一緒に、これらの証拠は、脳卒中の適応のためのより良い薬理学的プロファイルを有する候補アプタマーとしてのＡｐＴＬＲ＃４ＦＴを示し、ＡｐＴＬＲ＃４ＦＴ（ＡｐＴＯＬＬと指定）は、その臨床的位置付けに向けたさらなる開発のために選択された。
生物学的に関連する炎症性エンドポイントに対するＡｐＴＯＬＬの薬力学的効果
ＡｐＴＯＬＬの拮抗作用は、ＬＰＳ（５００ｎｇ／ｍｌ）によって刺激されたマウス腹腔マクロファージでさらに確認された。ＬＰＳ後１時間でＡｐＴＯＬＬ（２０ｎＭおよび２００ｎＭ）をインキュベーション培地に添加し、２４時間後、ＮＯｘの濃度をＧｒｉｅｓｓ反応（図７、パネルＡ）によって、ＴＬＲ－４活性化に応答して発現した主要な標的タンパク質のうちの１つである誘導性一酸化窒素シンターゼの酵素活性のエンドポイントパラメーターとして測定した。アプタマーは、インキュベーション培地中のＮＯｘレベルの低下を誘導した（図７、パネルＢ）。
インビトロ結合特性評価
ＡｐＴＯＬＬに対するＴＬＲ－４受容体の親和性を特性評価するために、単球で親和性研究を実施した。この目的のために、細胞は、カニクイザルとヒトの血液試料から得られ、２％ ＦＢＳ（２００～４００万／ｍｌ細胞）を補足したＲＰＭＩ１６４０培地で培養された。ＡｐＴＯＬＬ－４８８（０～１００ｎＭ）およびＬＰＳ（５０ｎＭ）を培地に添加し、細胞をフローサイトメトリーによって分析した。合計１０，０００個の生細胞をカウントした。ヨウ化プロピジウム染色を実行して、生存不能な集団を排除した。結果は、Ｋａ（親和性定数）がサルおよびヒト単球において３０～６０ｎＭの値を呈したことを示した（図８）。
他のｔｏｌｌ様受容体への結合の非存在
すべてのＴＬＲにおけるＡｐＴＯＬＬの非アゴニスト効果を可能な限り良く特性評価するために、特定の研究において、ヒトＴＬＲ２、－３、－４、－５、－７、－８および９を発現する細胞株をＡｐＴＯＬＬ（２０ｎＭおよび２００ｎＭ）ならびにそれらの対応するアゴニストとインキュベートした。結果は、試験されたどのＴＬＲにおいてもアプタマーのアゴニスト活性を示さなかった（図９）。
ｔｏｌｌ様受容体タイプ２（ＴＬＲ２）およびタイプ５（ＴＬＲ５）（ＴＬＲ－４とより高い構造的および機能的相同性を持つｔｏｌｌ様受容体ファミリーのメンバー）に対するＡｐＴＯＬＬの特異性を、ＳＥＡＰレポーター系にカップリングされたｈＴＬＲ２およびｈＴＬＲ５を発現する細胞株を使用して評価した。アプタマーは、それぞれ、Ｐａｍ３およびＦＬＡＴ－ＳＴによるｈＴＬＲ２およびｈＴＬＲ５の活性化に対する干渉を示さず、ｈＴＬＲ２およびｈＴＬＲ５に対する拮抗活性がないことを示している（図１０）。したがって、ＡｐＴＯＬＬは、これらの受容体に対していかなる拮抗作用も示さなかった。
実施例２．インビボ一次薬力学。脳卒中のげっ歯類モデルにおける有効性
この研究で使用された動物モデルは、以下で構成されていた。
ａ）マウスにおける結紮による永続的な中大脳動脈閉塞（ｐＭＣＡＯ）および結紮による一過性中大脳動脈閉塞（ｔＭＣＡＯ）（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｓｔｒｏｋｅ １７（４）：７３８－７４３）、
ｂ）ラットにおける一過性管腔内中大脳動脈閉塞（ｔＭＣＡＯ）（Ｊｕｓｔｉｃｉａ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ ２１（９）：１０９７－１１０４）、
ｃ）ならびにラットおよびマウスにおける電気凝固による永続的な中大脳動脈閉塞（Ｍｏｒａｎｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ａｐｐｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ ２０１２）。
すべてのモデルにおいて、片側性の限局性虚血性病変は、永続的または一過性の中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）によって大脳皮質において外科的に誘導された。脳卒中の前臨床調査のＳＴＡＩＲ推奨事項に従うために（ＳＴＡＩＲ ｇｒｏｕｐ：Ｕｐｄａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔｒｏｋｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｏｕｎｄｔａｂｌｅ Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ．Ｓｔｒｏｋｅ ２００９，４０（６）：２２４４－５０）、異なる承認された虚血モデル（電気凝固、結紮、管腔内）を実施し、結果を４つの独立した研究所で再現した。すべての実験群において、動物を２０％ Ｏ２および８０％圧縮空気に混合した２％イソフルランで麻酔し、体温をモニターし、手順全体を通してサーモスタット加熱経路によって安定させ、脳損傷をＴ２強調磁気共鳴画像法（Ｔ２ＷＩ）によって、または２，３，５－トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）で脳切片を染色することによって評価した。閉塞後２４時間（結紮によるｐＭＣＡＯ、電気凝固によるｐＭＣＡＯおよびラットにおけるｔＭＣＡＯ）または４８時間（マウスにおけるｔＭＣＡＯ；この特定のｔＭＣＡＯモデルにおいて、梗塞体積は２４時間～４８時間の間に変化する可能性がある）で得られた共鳴画像またはＴＴＣ染色脳切片を、梗塞サイズの定量化に使用した。
２．１．結紮マウスモデルによるｐＭＣＡＯ
ＡｐＴＯＬＬを、永続的な中大脳動脈閉塞後１０分で単回注射において８～１０週齢の野生型雄マウス（Ｃ５７ｂｌ／１０Ｊ）に腹腔内注射した。０．００９ｍｇ／ｋｇ～９ｍｇ／ｋｇの用量を対象とした用量反応研究を実施し、研究群当たり最低９匹の動物を保証した。脳梗塞サイズの定量化は、ビヒクル群（ｎ＝１５）と比較して、０．９１ｍｇ／ｋｇ用量でのＡｐＴＯＬＬ（２６．７％低減、ｎ＝群当たり９）（図１１、パネルＡ）の保護効果を明らかにした。ＡｐＴＯＬＬはまた、０．４５ｍｇ／ｋｇの用量でも保護を示した。試験した残りの用量は、梗塞サイズに対して統計的に有意な影響を示さなかった。
ＡｐＴＯＬＬによって誘導された梗塞サイズの低減が、ＴＬＲ－４拮抗作用によるものであることを確認するために、アプタマーを８～１０週齢のＴＬＲ４ノックアウト雄マウス（Ｃ５７Ｂｌ／１０ＳｃＮＪ、ｎ＝４）に注射した。ＴＬＲ－４が存在しない場合、保護効果は観察されず（図１１、パネルＢ）、これは、ＴＬＲ－４阻害が、ＡｐＴＯＬＬによって媒介される保護に直接関与していたことを示している。
ヒト脳卒中患者における投与の場合、静脈内経路が最も可能性が高いため、腹腔内投与後にすでに特性評価されているＡｐＴＯＬＬの保護効果を、尾静脈または頸静脈への静脈内注射後に試験した。結果は、ＡｐＴＯＬＬによって媒介される保護が、単回ボーラス（０．９１ｍｇ／ｋｇ；図１１、パネルＣ）の静脈内注射後に維持されたことを示した。
２．２．電気凝固マウスモデルによるｐＭＣＡＯ
ＡｐＴＯＬＬ（０．９１ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルを、永続的な中大脳動脈閉塞後１０分で単回注射においてＣ５７ｂｌ／６Ｊ ８～１０週齢の雄マウス（ｎ＝１５）に腹腔内注射した。梗塞サイズを、閉塞後２４時間での脳切片のＴＴＣ染色によって分析した。結果は、ＡｐＴＯＬＬ対ビヒクルで処置されたマウスにおける梗塞体積の３２％の減少を示した（図１２）。
２．３．電気凝固ラットモデルによるｐＭＣＡＯ。複数回投与
マウスモデルで使用された０．９１ｍｇ／ｋｇのＡｐＴＯＬＬ用量を、種間の用量外挿に関するＦＤＡガイドラインに従って（体表面基準に従って、および動物の体重に対して補正して）ラットに外挿し、０．４５ｍｇ／ｋｇを、閉塞後１０分で８～１０週齢のＷｉｓｔａｒラットに腹腔内注射した（群当たり８匹の動物）。このアッセイでは、複数用量の投与の効果を決定するために、第２および第３の用量を、閉塞後２時間（１０分＋２時間）および６時間（１０分＋２時間＋６時間）で投与した。梗塞体積は、閉塞後４８時間で評価した（図１３）。
結果および結論：虚血後１０分でラットに０．４５ｍｇ／ｋｇのＡｐＴＯＬＬを投与すると、ビヒクルで処置した動物と比較して、梗塞体積の減少を誘導した（３２．４％保護、ｎ＝８）。ＡｐＴＯＬＬを２回投与した場合（閉塞後１０分および２時間）、最終的な梗塞体積の低減も同様に観察した（３５％保護、ｎ＝８）。最後に、第３の用量を投与したとき、１５％の低減が確認された。これらのデータは、複数用量の投与による永続的虚血の動物モデルおよび異なるげっ歯類種（ラット）におけるＡｐＴＯＬＬの有効性を確認した。研究は、２４時間での第４の用量の投与（閉塞後４８時間で梗塞を評価する）、および閉塞後４８時間での第５の用量の投与（閉塞後７２時間で梗塞領域を測定する）で完了した。
虚血後１０分でラットに０．４５ｍｇ／ｋｇのＡｐＴＯＬＬを投与すると、ビヒクルで処置した動物と比較して、梗塞体積の減少を誘導した（１９％保護、ｎ＝８）。複数用量のＡｐＴＯＬＬを投与した場合、梗塞体積の低減も検出された。閉塞後１０分および２時間で２用量を投与すると、２１％の保護がもたらされた（ｎ＝８）。閉塞後１０分、２時間、および６時間で３用量を投与すると、２４％の保護がもたらされた（ｎ＝８）。閉塞後１０分、２時間、６時間、および２４時間で４用量を投与すると、２５％の保護がもたらされた（ｎ＝８）。閉塞後１０分、２時間、６時間、２４時間、および４８時間で５用量を投与すると、１８％の保護がもたらされた（ｎ＝８）。保護という用語は、虚血の影響または後遺症である梗塞体積の予防、阻害、または低減を指す。
１、２、３または４用量を受けた群の動物は、ｐＭＣＡＯ後４８時間で安楽死させた。５用量を受けた群の動物は、ｐＭＣＡＯ後７２時間で安楽死させた。すべてのＡｐＴＯＬＬ処置群を、それぞれのビヒクル処置群と比較した（図４３）。したがって、ＡｐＴＯＬＬは、虚血性事象後に複数用量で投与された場合、例えば、虚血性事象後最長４８時間にわたって１、２、３、４または５用量で投与された場合、梗塞体積の減少を誘導する。
２．４．ｔＭＣＡＯラットモデル
この研究において、８～１０週齢の雄のＷｉｓｔａｒラット（１群当たり５匹の動物）を使用した。手術後１０分で、ラットに０．４５ｍｇ／ｋｇのＡｐＴＯＬＬまたはビヒクルを静脈内投与したところ、ビヒクルを受けたラットと比較して、脳卒中の誘導後２４時間で最終梗塞体積が低減した（図１４、パネルＡ）。これらのデータは、虚血－再灌流の異なる動物モデルにおけるＡｐＴＯＬＬの有効性を確認した。
さらに、８～１０週齢の雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（群当たり１５匹の動物）を使用して、この結果を再現した。虚血手順および治療は、以前に記載されたものと同じであったが、アッセイは独立した実験室で実施した。結果は、ビヒクルで処置した動物と比較した場合、ＡｐＴＯＬＬを受けたラットにおける梗塞体積の減少を示した（図１４、パネルＢ）。
２．５．脳卒中発症後のＡｐＴＯＬＬの保護の時間窓の特性評価
マウスでの研究は、結紮による永続的な中大脳動脈閉塞に曝された、８～１０週齢のＣ５７Ｂｌ／６雄株（群当たり８匹の動物）で実施した。ＡｐＴＯＬＬ（０．９１ｍｇ／ｋｇ）によって媒介される保護は、ｐＭＣＡＯ後６時間まで静脈内投与された場合に維持され（図１５）、したがって、急性虚血性脳卒中治療（ｒ－ｔＰＡ）の唯一の薬理学的療法の治療可能時間域が延長された。保護の時間窓は、６時間を超える場合がある。
第２の決定のセットは、Ｗｉｓｔａｒ雄ラット（８～１０週齢、群当たり８匹の動物）で行われた。モノフィラメントｔＭＣＡＯモデルを実施し、ビヒクルまたはＡｐＴＯＬＬ（０．４５ｍｇ／ｋｇ）を再灌流前（Ｂ．Ｒ．）３０分、または再灌流後１０分、２時間、６時間、９時間、１２時間または２４時間に注射した。梗塞体積および浮腫を、虚血後７２時間で評価し、結果は、虚血後１２時間までＡｐＴＯＬＬによって媒介される保護を確認し、この研究における梗塞体積の低減は、ｐＭＣＡＯモデルで実施されたものよりもさらに高く、５０％（Ｂ．Ｒ．３０分）、６５．５％（１０分）、４５％（２時間、６時間および９時間）ならびに４０％（１２時間）の低減を確認した。虚血後２４時間でアプタマーを投与した場合、効果は失われた（図３９）。興味深いことに、ＡｐＴＯＬＬは、再灌流前に投与した場合にも高い保護力を発揮する。これらの結果は、梗塞体積および浮腫の低減に基づいて、血栓摘出と組み合わせてＡｐＴＯＬＬを投与するのに最適な時期は、再灌流の直前および数分後であることを示す。このため、またヒトへの投与はボーラスではなく３０分の注入であることを考慮すると、患者におけるＡｐＴＯＬＬの注入は、血栓摘出の直前に開始することができる。
２．６．ＡｐＴＯＬＬ投与後のバイオマーカーの特性評価
インビボでの脳卒中転帰の可能なバイオマーカーを同定するために、０．９１ｍｇ／ｋｇのＡｐＴＯＬＬ／ビヒクル腹腔内治療を伴う虚血性マウスからの血漿試料を、ｐＭＣＡＯ後２４時間で取得し、ＣＢＡを使用して分析した。これらのバイオマーカーを評価するために、電気凝固マウスモデルによる前のセクションｐＭＣＡＯのサブスタディを実施し、ＣＢＡ技法を行った。簡単に説明すると、ＢＤ（商標）ＣＢＡマウス炎症キットを一般的に使用して、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）、単球化学誘引物質タンパク質－１（ＭＣＰ－１）、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）、単一試料中の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびインターロイキン－１２ｐ７０（ＩＬ－１２ｐ７０）タンパク質レベルを定量的に測定する。この研究で得られた結果は、ＡｐＴＯＬＬによる治療が、ビヒクルマウス群と比較して、虚血性発作後２４時間で、ＩＬ－６、ＩＬ－１２ｐ７０およびＩＦＮ－γの血漿レベルを有意に低減したが、ＴＮＦ、ＩＬ－１０またはＭＣＰ－１の血漿レベルを低減しなかったことを示した（図１６、ｎ＝８）。
２．７．ＡｐＴＯＬＬによって誘導される保護効果の長期的な解剖学的および機能的関連性
ＡｐＴＯＬＬのインビボでの有効性の評価を、臨床試験における脳卒中患者の保護のエンドポイント評価に近づけるために、急性投与時にＡｐＴＯＬＬによって誘導される梗塞サイズの低減の長期的な永続性、ならびに解剖学的保護とマウスの機能的、神経学的パフォーマンスとの相関関係を独立した研究で検証した。脳卒中後１０分で投与された０．９１ｍｇ／ｋｇの静脈内ＡｐＴＯＬＬによって達成された保護は、亜急性期を通して持続した（脳卒中発症後７２時間まで）（図１７、パネルＡ）。さらに、脳卒中後２１日での長期損傷サイズの定量化は、このマウスモデル（Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ雄マウス、８～１０週齢、結紮による永続的な中大脳動脈閉塞に曝された）において梗塞が安定したこの時点までの保護効果の保存を示した（図１７、パネルＢ）。神経学的機能の評価は、フットプリント試験を使用して実施した（図１７、パネルＥ）。脳卒中後２１日で、ビヒクルを受けたマウスは、脳損傷のない偽手術された動物と比較して、ストライド長の増加を急激に示し（図１７、パネルＤ）、経路中の四肢制御の変化を示した。この効果は、前肢および同側後肢の両方で観察された（図１７、パネルＣ；図１７、パネルＤ）。脳卒中後１０分で０．９１ｍｇ／ｋｇのＡｐＴＯＬＬを受けたマウスは、脳卒中後２１日でこの神経学的欠損がないことを示し（図１７、パネルＣ；図１７、パネルＤ）、アプタマーによって誘導された梗塞サイズの低減が、長期的な機能性能の向上に関連していたことを示す。
別の一連の実験において、神経学的な長期転帰をラットで評価した。雄のＷｉｓｔａｒラットは、電気凝固モデルによって永続的な脳虚血に曝された（ｎ＝群当たり８匹の動物）。閉塞後１０分でＡｐＴＯＬＬを投与し、その後２、７、１４および２１日目に運動評価を実施した。得られた結果は、ビヒクルで処置したラットと比較した場合、ＡｐＴＯＬＬで処置したラットにおいて脳卒中後２日および７日で運動スコアの有意な減少を示した（図１８）。
２．８．敗血症のマウスモデルにおけるインビボでのＬＰＳによるＴＬＲ－４活性化に対する拮抗効果
インビボでのＴＬＲ－４アンタゴニストとしてのＡｐＴＯＬＬの有効性を検証するために、８～１０週齢のＣ５７Ｂｌ／６Ｊ雄マウスに２０ｍｇ／ｋｇの超高純度ＬＰＳを腹腔内注射した。ＬＰＳ注射は、マウスに内毒素血症を引き起こし、これは８時間で測定可能な体重減少に反映され、２４時間でより重篤になった（図１９、パネルＡ）。さらに、温度低下も８時間で顕著であり、２４時間で悪化した（図１９、パネルＢ）。敗血症スコアは、内毒素血症の目に見える徴候に関連する複数の変数の定量化によって得られた（Ｓｃｈｒｕｍ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＢＭＣ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｎｏｔｅｓ ７：２３３）（図１９、パネルＣ）。０．９１ｍｇ／ｋｇのＡｐＴＯＬＬを注射した動物の群は、ビヒクルを注射した動物と比較して、８時間で体重減少の％の低減（図１９、パネルＡ）ならびに２４時間で敗血症スコアの低減（図１９、パネルＣ）を示した。アプタマーＡｐＴＯＬＬで処置した動物の生存率もＬＰＳ注射後７２時間で高く（ビヒクルで処置したマウスで３０％対７％の生存率、図１９、パネルＤ）、ＡｐＴＯＬＬがＴＬＲ－４のＬＰＳ活性化を干渉し、誘導された内毒素血症の重症度を低減した。
２．９．薬力学的薬物相互作用
ＡｐＴＯＬＬのｒｔ－ＰＡとの相互作用を決定するための研究は、ｒｔ－ＰＡが虚血性脳卒中に対して承認された唯一の薬理学的治療であり、したがって、両方の薬物が臨床診療で併用される可能性が高いという事実のために実施した。
Ｗｉｓｔａｒナイーブ雄ラット（８～１０週齢、群当たり４匹の動物）に、ＡｐＴＯＬＬ、ＡｐＴＯＬＬ＋ｒｔ－ＰＡまたはｒｔ－ＰＡのみを投与した。投与後に臨床徴候を評価し、いずれの場合も徴候は現れなかった。
実施例３．ヒトにおけるＡｐＴＯＬＬ効果
３．１ 耐性および薬物動態を評価するための、健康なボランティアにおける急性虚血性脳卒中の治療のためのＡｐＴＯＬＬの二重盲検、プラセボ対照、ランダム化、第Ｉａ相臨床試験
ヒトにおける最大推奨開始用量
健康な対象に投与される最大推奨開始用量（ＭＲＳＤ）の計算：
ＮＯＡＥＬ（観察された有害作用レベルなし）：
ラット：高用量、５０ｍｇ／ｋｇ／日を静脈内で１４日間投与して、有害作用は観察されなかった。
カニクイザル：高用量、１３．９ｍｇ／ｋｇ／日（静脈内ボーラス）１４日間で副作用は観察されなかった。
ＨＥＤ（ヒト等価用量）は、体表面積に基づいて動物の用量をヒト等価に変換することを考慮して、ＮＯＡＥＬから計算した。補正係数１０を考慮した。
ラット：５０ｍｇ／ｋｇ×０．１６２／１０＝０．８１ｍｇ／ｋｇ
サル：１３．９ｍｇ／ｋｇ×０．３２４／１０＝０．４５ｍｇ／ｋｇ
したがって、より低い計算用量（０．４５ｍｇ／ｋｇ）を考慮すると、体重７０ｋｇの人のＭＲＳＤは、３１．５ｍｇであった。
ＭＡＢＥＬ（予想される最小の生物学的影響レベル）：
脳卒中のげっ歯類モデルにおける有効性：
ａ）結紮マウスモデルによるｐＭＣＡＯ：０．９１ｍｇ／ｋｇ用量の保護（静脈内単回ボーラス）。
ｂ）電気凝固マウスモデルによるｐＭＣＡＯ：０．９１ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与。
ｃ）ｔＭＣＡＯマウスモデル：０．９１ｍｇ／ｋｇの静脈内投与。
ｄ）電気凝固ラットモデルによるｐＭＣＡＯ：０．４５ｍｇ／ｋｇの２回静脈内投与（閉塞後１０分および２時間）、１用量と同様の有効性。
ｆ）ｔＭＣＡＯラットモデル：０．４５ｍｇ／ｋｇの静脈内単回ボーラス。
ＨＥＤは、体表面積に基づく動物の用量からヒト等価への変換を考慮して、ＭＡＢＥＬから計算した。補正係数１０を考慮した。
ａ）マウス：０．９１ｍｇ／ｋｇ×０．０８１／１０＝０．００７３ｍｇ／ｋｇ
ｂ）ラット：０．４５ｍｇ／ｋｇ×０．１６２／１０＝０．００７３ｍｇ／ｋｇ
したがって、体重７０ｋｇの人のＭＲＳＤは、０．５ｍｇであった。
ＮＯＡＥＬから計算されたＭＲＳＤよりもはるかに低かったため、この用量を考慮した。
研究の概要
対象：妊娠する可能性のない健康な男性または女性。
設計：健康な対象における単一用量、静脈内投与（ゆっくりとした注入）、最大７つの単一用量レベルでの用量漸増、ランダム化、二重盲検、プラセボ対照（生理食塩水）、その後の健康な対象における複数用量。
臨床試験は２つの部分を有していた。
Ａ－健康な対象（最大３８人の対象）における単一用量の漸増
用量漸増のための用量レベル：
－第１の用量レベル：２人の対象を０．７ｍｇまたはプラセボ（生理食塩水）にランダム化した。
－第２の用量レベル：２人の対象を２．１ｍｇまたはプラセボにランダム化した。
－第３の用量レベル：２人の対象を７ｍｇまたはプラセボにランダム化した。
－第４の用量レベル：２人のセンチネル対象を１４ｍｇまたはプラセボにランダム化し、続いて６人の対象を１４ｍｇ（５人の対象）またはプラセボ（１人の対象）にランダム化した。
－第５の用量レベル：２人のセンチネル対象を２１ｍｇまたはプラセボにランダム化し、続いて５人の対象を２１ｍｇ（５人の対象）またはプラセボ（１人の対象）にランダム化した。
－第６の用量レベル：２人のセンチネル対象を４２ｍｇまたはプラセボにランダム化し、続いて６人の対象を４２ｍｇ（５人の対象）またはプラセボ（１人の対象）にランダム化した。
－第７の用量レベル：２人のセンチネル対象を７０ｍｇまたはプラセボにランダム化し、続いて６人の対象を７０ｍｇ（５人の対象）またはプラセボ（１人の対象）にランダム化した。
それぞれの対象は、投与前夜から投与後２日まで臨床試験病棟に入院した。安全性の問題が検出されなかった場合、彼／彼女は、投与後４８時間で帰宅することができ、投与後７２時間（３日）、９６時間（４日）、１２０時間（５日）、１６８時間（７日）、２４０時間（１０日）および３３６時間（１４日）で臨床試験病棟に戻った。
ある用量レベルと次の用量レベルとの間には少なくとも２週間の間隔があり、データ安全性モニタリング委員会（ＤＳＭＣ）がすべての情報を確認し、次の用量レベルを続行することを決定するのに十分な時間を与えた。センチネル対象と同じ用量レベルの他の対象との間にも１週間の間隔があった。
Ｂ－健康な対象（８人の対象）における複数用量
２人のセンチネル対象を、０、８、および１６時間での３用量の薬物（パートＡのより高い安全用量）またはプラセボにランダム化した。
安全性の問題は報告されず、他の６人の対象を同じ用量（５人の対象）またはプラセボ（１人の対象）にランダム化した。
ボランティアは、有害事象が検出されない限り、薬物投与後４８時間で臨床試験病棟を去り、有害事象が検出された場合は、解決するまで入院し続けた。
薬物投与：
薬剤（ＡｐＴＯＬＬ、原薬－バッチ番号２５５８８７）を１００ｍＬの生理食塩水で希釈し、ポンプで３０分以内にゆっくりと静脈内注入することによって投与した（注入開始時の注入速度が遅いことを考慮し、その後増加させ、何らかの有害事象が現れた場合は停止する）。
対象の評価：
－対象の安全性は、以下によって評価した。
研究中に発生したすべての有害事象の記録。
身体検査。
定期的な臨床検査による評価（血液、生化学的および尿検査）：スクリーニング、１日目（投与前）、２日目、７日目および１４日目。
尿中の毒性：スクリーニング、１日目（投与前）および１４日目。
血清学（ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ）：スクリーニング。
血圧、心拍数、呼吸数および１２誘導心電図：ベースライン、入院中の様々な時点およびそれぞれの訪問時。
－薬物動態：１５の血液試料（それぞれ９ｍＬ）を異なる時間で採取して、薬物の薬物動態プロファイルを定義した：投与前、０．５時間、１時間、１．５時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間および３２時間。
－薬力学：４つの血液試料（それぞれ９ｍＬ）を異なる時間で採取して、エクスビボリポ多糖チャレンジによって誘導されたサイトカインレベルを評価した：投与前、４時間、８時間および２４時間。
第Ｉａ相臨床試験の結果
これは、健康なボランティアにおけるＡｐＴＯＬＬの耐性および薬物動態を評価するための、第Ｉ相、ヒトにおいて初の用量漸増、ランダム化、プラセボ対照臨床試験であった。この研究の主な目的は、次のとおりであった。
（ｉ）漸増投与スキームに従い、絶食状態での単一用量投与後、健康なボランティアにおけるＡｐＴＯＬＬの耐性および薬物動態特性を評価すること。この化合物の薬力学的特性も評価した。
（ｉｉ）絶食状態での複数用量の投与後、健康なボランティアにおけるＡｐＴＯＬＬの耐性および薬物動態特性を評価すること。この化合物の薬力学的特性も評価した
この研究は、２つのパートに分けられた：第１のパート（パートＡ）は、最大７つの単一用量レベルでの用量漸増であった。このパートが完了すると、前のパートから選択された用量で、健康なボランティアにおいて複数用量（３回投与）パート（パートＢ）を実行した。両方のパートは、ランダム化、二重盲検、プラセボ対照（生理食塩水）であった。この研究は、健康な男性対象において行った。用量漸増（パートＡ）および複数用量（パートＢ）のために選択された用量レベルは上記のとおりであった。
この臨床試験は完了しており、結論は次のとおりである。
１．安全性の問題に関しては、どの用量レベルでも重篤な有害事象または重大な分析的変化は報告されなかった。
２．薬物動態：１５の血液試料（それぞれ９ｍＬ）を異なる時間で採取して、薬物の薬物動態プロファイルを定義した：投与前、０．５時間、１時間、１．５時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、３２時間、４８時間および７２時間。ＳＡＤ（単一漸増用量）パートにおいて、Ｃｍａｘデータは、注射後０．５時間の時点で（注入終了時に）最大値を示し、その後すぐに時間とともに減少し、推定平均半減期は８時間であった。ＡｐＴＯＬＬレベルは、７２時間の時点では定量化できない。
３．治験薬に関連している可能性があると考えられる、臨床的に重要な検査室、バイタルサイン、またはＥＣＧの所見はなかった。したがって、ＡｐＴＯＬＬは、プラセボと同様の安全性および耐性のプロファイルを有する。
実施例４．ＡｐＴＯＬＬ製剤
４．１．ヒトにおける非経口投与のためのＡｐＴＯＬＬ製剤
ＩＭＰ（Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ、治験薬）は、完全なＧＭＰ条件下で製造される（図２０）。簡単に言えば、非経口調製のプロセスは、滅菌領域で行われるべきであり、次のように進展する。
１．賦形剤溶液の調製：
撹拌機を備えた反応器に、２０～２５℃の温度で注射用水のおよそ８０％を入れる。塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、リン酸二水素カリウム、塩化マグネシウム六水和物を添加し、完全に溶解するまで撹拌する。注射用水で溶液を最大１００％容量にし、溶液のｐＨを確認し、必要に応じて７．４に調整する。
２．滅菌のために０．２２μｍフィルターで緩衝液を濾過する。
３．医薬品有効成分アプタマー４ＦＴの添加：９０％容量の賦形剤溶液をジャケット付きガラス反応器に入れ、完全に溶解するまで撹拌しながらアプタマー４ＦＴを緩衝液に溶解する。
４．容量の調整：前に調製した賦形剤溶液で溶液を最大１００％容量にする。最低１０分間撹拌する。
５．その生物学的活性について、三次構造を提供するために、それをＰＢＳ－１ｍＭのＣｌ２Ｍｇに溶解する必要がある。溶解後、アプタマーを９５℃±２℃まで加熱しなければならない。溶液をこの温度で最低１０分間保持する。次いで、溶液を５℃±３℃まで冷却する。溶液をこの温度で１０分間保持する。
６．バイオバーデンの低減：
０．２μｍのポリエーテルスルホン滅菌フィルターで溶液を濾過する。泡立ち点試験の最小値を用いて、フィルター１（水を含む）の完全性を検証する。
品質管理部（バイオバーデン）のフィルター１の後に１００ｍｌの試料を採取する。
７．前に蒸気滅菌器で滅菌した０．２μｍポリエーテルスルホンフィルターによる滅菌濾過。
８．バイアルの充填（無菌条件下）：バイアルの洗浄および滅菌（バイアル：オーブン、ストッパー：ガンマ線照射、アルミニウムカプセル：蒸気滅菌器）。充填および事前閉鎖プロセス。
９．凍結乾燥プロセス：凍結プロセス、乾燥（一次および二次）、バイアル閉鎖。
１０．バイアルのキャッピングおよび制御
４．２．インビボ研究のためのＡｐＴＯＬＬ製剤
アプタマーを凍結乾燥させ、使用まで－２０℃で保持する。汚染を避ける：手袋、フィルターチップ、ヌクレアーゼを含まないチューブを着用する。緩衝液Ａに溶解する：ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）＋１ｍＭのＭｇＣｌ２を含まないヌクレアーゼ。
１－緩衝液を添加する前に、凍結乾燥したアプタマーを含むチューブを遠心分離する。
２－ストック溶液：凍結乾燥したアプタマーに緩衝液Ａを添加し、完全に溶解するまで撹拌する。アリコートに分け、使用するまで－２０℃／－４０℃で保持する。
３－作業溶液：緩衝液Ａ中のストック溶液を所望の最終濃度に希釈する。
４－折り畳みプロセス：溶液を９５℃に１０分間加熱し、次いで氷上で１０分間保持する。
５－構造化されたアプタマーをアッセイで使用する。
構造化されたアプタマーは、機能的コンフォメーションを維持する：室温で１時間、４℃で２４時間。
実施例５．安全性薬理学
一般的な生理学的パラメーターへの影響
一般的な生理学的パラメーターに対するＡｐＴＯＬＬの潜在的な効果は、ナイーブおよび虚血性動物（Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ雄マウス、８～１０週齢）で試験した。ＡｐＴＯＬＬの投与は、ビヒクル投与と比較した場合、測定されたパラメーターのいずれにも影響を示さなかった（図２１）。
神経毒性
異なる研究により、高度に特殊化された輸送機序が関与するいくつかの例外を除いて、アプタマーは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過しないことが示された（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ２（１）：ｅ６７）。具体的には、ＡｐＴＯＬＬの場合、非規制レベルでの動物実験では、投与の数分以内に肺または脾臓などの異なる組織に分布することが示されている。しかしながら、脳内のＡｐＴＯＬＬの存在は、ＢＢＢが損なわれた実験的脳卒中の誘導後にのみ実証されているが、これらの動物では、薬物の神経保護効果が明確に実証されている。
一方、ＡｐＴＯＬＬの短い自己寿命とその急速な分解は、すべてのオリゴヌクレオチドと同様に、ＢＢＢが損なわれていない状態（すなわち、健康なボランティア）では脳組織へのアクセスを妨げる。実際、Ｉｏｎｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（現在のパイオニアであるＩｓｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）またはＯｐｔｈｏｔｅｃｈなどの企業がこの種の分子についてこれまでに行った研究は、中枢神経系にも作用が集中していることは、ヒトにおけるその投与における神経毒性事象がないことの明らかな例である。これらの企業が参加した臨床試験は、硝子体内に高濃度のＤＮＡおよびＲＮＡ分子を直接注射し、神経細胞に毒性作用を生じさせることはない。
インビトロ神経毒性評価
ＡｐＴＯＬＬの一般化された毒性を評価するために、用量反応曲線を０．０１～３０μＭの８つの濃度で半対数の増分で生成した。それぞれのポイントは、ｎ＝３であった。ヒトｉＰＳＣ由来の皮質グルタミン酸作動性（８０％）およびＧＡＢＡ作動性（２０％）ニューロンの混合培養物を１週間培養した後、試験化合物で処理した。陽性対照（ロテノン）および陰性対照（ＤＭＳＯ）の両方が含まれていた。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ ２．０蛍光細胞生存アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、処理後７２時間で毒性を評価し、これは総ＡＴＰ濃度を測定し、生細胞数に比例する。
この研究で得られた結果は、形態学的基準に基づいて、すべての培養物が処理時に優れた細胞の健康を表したことを示した。さらに、ミトコンドリアの電子伝達系を阻害する陽性の毒性化合物ロテノンは、細胞ＡＴＰレベルの測定によって評価されるように、明らかな用量依存性の毒性を示した。ＡｐＴＯＬＬは、試験した最高用量（３０μＭ）まで毒性を示さなかった。この毒性の欠如は、グルタミン酸作動性（８０％）およびＧＡＢＡ作動性（２０％）ニューロンの混合培養物、ならびにそれぞれのタイプの純粋な培養物で観察された（図２２）。
血液脳関門ＢＢＢを通過する
目的は、アプタマーが血液脳関門（ＢＢＢ）を通過できるかどうかを判断することであった。この目的のために、トランズウェルインサートの土壌層に位置するＢｅｎｄ．３細胞（マウス内皮細胞）および星状細胞（ＣＴＸ－ＴＮＡ２）は、ＢＢＢをシミュレートする。インキュベーション後、培地中のアプタマーの存在をｑＰＣＲによって決定した。ＡｐＴＯＬＬは、４０ｎＭ～４０００ｎＭの濃度範囲で試験した。ＢＢＢを通過できる７６ｎｔのｓｓＤＮＡアプタマーを、陽性対照のように使用した。この研究で得られた結果は、アプタマーが通常の生理学的状態において（表２）、すなわち、ＢＢＢ透過性を変化させる疾患または状態がない場合、例えば、ＴＬＲ媒介性の疾患または状態ではＢＢＢを通過できないことを示した。
Figure 2022533966000004
神経毒性
ラットにおける神経毒性評価：この研究は、主要毒性研究の一部として実施した：ラットにおける２週間の毒性研究と、それに続く１週間の回復期間。毒性研究の目的は、ラットに５、２５および５０ｍｇ／ｋｇ／日を１日１回、２週間にわたって静脈内投与した場合のＡｐＴＯＬＬの毒性効果を評価することであった。この研究は、ＧＬＰに準拠して実施した。観察（感覚反応性、握力および自発運動）は、治療前および治療の２週目に回復動物において行った。この研究で得られた結果は、ＦＯＢ記録の群間に関連する変化がなかったことを示した。
虚血ラットにおける神経毒性評価：虚血後、ＢＢＢの透過性が損なわれ、ＡｐＴＯＬＬは、脳組織に到達することができる。このため、ＡｐＴＯＬＬ投与に由来する潜在的な神経毒性は、修正されたＩｒｗｉｎ試験を使用することによって評価した。この試験は、薬物に由来する神経毒性作用の存在を評価するための一連のアッセイで構成されていた。この目的のために、ＡｐＴＯＬＬ（０．４５ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルを注射した虚血ラット（ｎ＝８）を試験した。この研究で使用された実験モデルは、電気凝固による永続的虚血であった。処置した動物またはビヒクル動物のいずれにおいても、ＡｐＴＯＬＬの投与後に差異は検出されなかった。したがって、筋緊張、協調および感覚運動反応に関連するパラメーターへの影響は観察されなかった。オープンフィールド試験における変化は報告されなかった。
呼吸機能における影響
この研究の目的は、ラットの呼吸数、一回換気量および分時換気量に対するＡｐＴＯＬＬの考えられる副作用を評価することであった。
ＡｐＴＯＬＬは、呼吸数、一回換気量および分時換気量に対する影響を評価するために、雄のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（８／群）に５、２５および５０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内ボーラス注射によって投与した。２つの追加群は、単一静脈内ボーラス用量として等量（３ｍＬ／ｋｇ）のビヒクル、または２０ｍｇ／ｋｇの用量で経口用量（１０ｍＬ／ｋｇ）のバクロフェンを受けた（陽性対照）。呼吸数、一回換気量および分時換気量は、投与後０分（投与前）、３０分、６０分、９０分、１２０分、１５０分、１８０分、２１０分および２４０分に報告した。
５、２５および５０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内ボーラスによって投与されたＡｐＴＯＬＬは、試験項目に関連すると考えられた呼吸数、一回換気量または分時換気量に対して生物学的に関連する効果をもたらさなかった（図２３）。２０ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与されたバクロフェンは、有意に低い呼吸数および有意に高い一回換気量値をもたらした。有害な臨床徴候は観察されなかった。
心血管系への影響
この研究は、主要毒性研究の一部としてＧＬＰ基準に準拠していた：ラットでの２週間の毒性研究と、それに続く１週間の回復期間。この研究の目的は、１４日間にわたってカニクイザルに静脈内経路（ボーラス）で６時間間隔で１日２回投与した場合の、心血管系におけるＡｐＴＯＬＬの効果を評価することであった。
ＡｐＴＯＬＬを、合計３２匹のサルに投与した（０．７、２．３、６．９ｍｇ／ｋｇ／１日２回）。心拍数、Ｐ波の持続時間および振幅、Ｐ－Ｑ間隔、ＱＲＳ間隔、Ｑ－Ｔ間隔は、リードＩＩの心電図の代表的なセクションを使用して測定した。心拍数のＱＴ間隔の補正も計算した。記録は、予備試験時、治療１３日目（最初の日用量後）、および回復中に行われた。結果は、試験項目による治療に関連する所見がないことを示した。
実施例６．動物における薬物動態および製品代謝
分布
血漿タンパク質への結合
ＡｐＴＯＬＬ結合血漿タンパク質の画分を決定した。この目的のために、Ａｌｅｘａ－４８８にコンジュゲートしたＡｐＴＯＬＬを使用した。血漿タンパク質に結合したアプタマーのパーセンテージは、２～３つの異なるヒト、ラットおよびＮＨＰ試料中の比率（すべての画分の蛍光の合計／全蛍光）×１００によって計算した（図２４）。
すべての場合において、血漿タンパク質の非存在下でのアプタマーの溶液を、非結合溶出ピークの決定のための対照として実行した。血漿タンパク質に結合したＡｐＴＯＬＬの割合は、ヒト試料で１５．７％、ラットおよびＮＨＰ血漿で３．５％であった。
標的臓器（脳）におけるＡｐＴＯＬＬのインビボ分布
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識ＡｐＴＯＬＬを使用したＡｐＴＯＬＬ、末梢および中枢の分布の研究を実施した。
最初に、手術を実施した後１０分間、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識されたＡｐＴＯＬＬ（０．９ｍｇ／ｋｇ）の静脈内投与を受けた、ｐＭＣＡＯに供したＴＬＲ４＋／＋およびＴＬＲ４－／－マウス（ｎ＝３～５）の血液中のアプタマーのフローサイトメトリー分析。尾からの基礎試料および連続血液試料を、アプタマー投与の５分、１０分、１５分、３０分および５時間後に得た。結果は、ｐＭＣＡＯ ＴＬＲ４＋／＋マウスへの投与後５分で、ＡｐＴＯＬＬが血中で検出されたことを実証した（図２５、パネルＡ）。しかしながら、ＴＬＲ４－／－マウスでは、研究したどの時点でもアプタマー結合は検出されなかった。また、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識されたＡｐＴＯＬＬゲート細胞は、前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）ゲーティング戦略に基づいて主に顆粒球領域にあった（図２５、パネルＢ）。
さらに、Ａｌｅｘａ－４８８とコンジュゲートしたＡｐＴＯＬＬを使用して、静脈内注射後の脳内での存在を検出した。虚血性脳の血液脳関門の状態を再現するために、６匹のマウス（Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ雄マウス、８～１０週齢）をｐＭＣＡＯに供し、ｐＭＣＡＯ後１０分で標識アプタマーを注射し、脳を収集し、２４時間で免疫蛍光のために処理した。虚血領域で緑色蛍光が観察され（図２５、パネルＣ）、シグナルの特異性は、脳切片をＣｙ３でコンジュゲートした抗Ａｌｅｘａ４８８抗体とインキュベートすることによって確認された（図２５、パネルＣ、赤）。非標識アプタマーを注射した動物では蛍光は見られなかった（図２５、パネルＤ）。これらの観察は、ＡｐＴＯＬＬが静脈内注射後少なくとも２４時間で梗塞した脳組織内に存在したことを示した。
代謝
ヒト、ラットおよびサルの血漿中およびヌクレアーゼに対するインビトロ安定性
λ－エキソヌクレアーゼおよびＤＮＡｓｅ Ｉ治療の存在下でのＡｐＴＯＬＬの完全性、ならびにラット、サルまたはヒトの血漿中の安定性を定量化した。結果は、ＡｐＴＯＬＬが４時間のインキュベーション後でもλ－エキソヌクレアーゼに抵抗性があることを示した（図２６、パネルＡ）。この結果は、λ－エキソヌクレアーゼ活性に必要な合成アプタマーに３’末端リン酸がないことと一致していた。対照的に、ＡｐＴＯＬＬの分解は、ＤＮＡｓｅ Ｉへの５分間の曝露後に明白であった（図２６、パネルＢ）。ＡｐＴＯＬＬをラット、サルおよびヒトの血漿中で生理学的条件でインキュベートした場合、時間依存性の分解が観察された（図２６、パネルＣ）。ＡｐＴＯＬＬに提案された適応症が急性脳卒中治療であることを考慮に入れると、この半減期プロファイルは、例えば、虚血性脳卒中などの急性ＴＬＲ－４媒介性の疾患または状態を治療するために、ＴＬＲ－４のアプタマーへの短期間の急性曝露に最適であるとみなされる。
薬物動態学的薬物相互作用
この研究の目的は、結合、酵素および取り込み、インビトロ吸収およびインビトロ代謝アッセイでＡｐＴＯＬＬを試験することであった。薬力学的研究で得られた結果により、ＡｐＴＯＬＬは２０ｎＭで試験した（前のセクションを参照されたい）。
インビトロ薬理学：取り込みアッセイおよび結合アッセイ
ＳａｆｅｔｙＳｃｒｅｅｎ４４（商標）パネルは、ＡｐＴＯＬＬとの重要なオフターゲット相互作用の早期識別を可能にするために実施した。４４の標的（ＧＰＣＲ、イオンチャネル、キナーゼ、核内受容体、トランスポーターおよび他の非キナーゼ酵素）はすべて、堅牢性（それぞれのアッセイはＨＴＳ互換性である）および情報豊富な標的の戦略的選択の両方をまとめるために選択された。化合物結合は、それぞれの標的に特異的な放射性標識リガンドの結合の阻害％として計算した。化合物酵素阻害効果は、対照酵素活性の阻害％として計算した。５０％よりも高い阻害を示す結果は、試験化合物の有意な効果を表すとみなされた。そのような効果は、研究されたどの標的でも観察されなかった（図２７）。それぞれの実験において、該当する場合は、それぞれの参照化合物をＡｐＴＯＬＬと同時に試験し、データを履歴値と比較した。
酵素アッセイで得られた値は有意な効果を示さなかったにもかかわらず、ＰＤＥ３ＡおよびＰＤＥ４Ｄ２についてより詳細な特性評価を実施し、有意な結果は得らなかった。したがって、選択したどの標的でも阻害効果は検出されなかった。
ＡＤＭＥ－Ｔｏｘ：インビトロ吸収
これらのアッセイは、化合物が主要な薬物トランスポーターにどのように影響し得るかを評価するために設計された。具体的には、これらのアッセイは、ＡｐＴＯＬＬの吸収、分布または排泄を干渉する可能性のある薬物トランスポーターの潜在的な阻害を試験した。
ＡｐＴＯＬＬトランスポーター阻害効果は、ビヒクル対照活性の阻害％として計算した。５０％よりも高い阻害を示す結果は、試験化合物の有意な効果を表すとみなされた。そのような効果は、研究されたどの受容体でも観察されなかった（図２８）。
薬物トランスポーターアッセイで得られた値が有意な効果を示さなかったにもかかわらず、ＡＳＢＴについて詳細な特性評価を実施し、この研究条件では効果は検出されなかった。
シトクロム阻害アッセイ
これらのアッセイは、ＡｐＴＯＬＬが、同時投与された化合物の蓄積につながる可能性のあるシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）酵素の潜在的な阻害効果を特性評価する主要な薬物代謝酵素にどのように影響するかを評価するために実施した。
ＡｐＴＯＬＬ ＣＹＰ酵素阻害効果は、ビヒクル対照活性の阻害％として計算した。５０％よりも高い阻害を示す結果は、試験化合物の有意な効果を表すとみなされた。そのような効果は、研究されたどの酵素でも観察されなかった（図２９）。
さらに、これらのアッセイでは、ＣＹＰ酵素の誘導を評価して、ＡｐＴＯＬＬまたは同時投与された化合物の血漿濃度の低下を防いだ。ＡｐＴＯＬＬは、より良い現象の特性評価を行うために、異なる濃度（２、２０、２００ｎＭ）で投与した。
ＡｐＴＯＬＬ ＣＹＰ酵素誘導効果は、ビヒクル対照活性の誘導倍率として計算した。５０％よりも高い刺激を示す結果は、試験化合物の有意な効果を表すとみなされる。そのような効果は、研究されたどの酵素でも観察されなかった（図３０）。
他の薬物動態研究
Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットにおける静脈内薬物動態研究
この研究の目的は、雌のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに０．４５、１および２ｍｇ／ｋｇの単回静脈内ボーラス投与後のＡｐＴＯＬＬの薬物動態プロファイルを取得することであった。したがって、９匹の雌ラット（１０～１２週齢）に、ＡｐＴＯＬＬを０．４５、１および２ｍｇ／ｋｇ、１ｍＬ／ｋｇで、外側尾静脈に単回静脈内ボーラスによって投与した。
投与日に、血液試料を次の時間に外側尾静脈から採取した：１分（投与直後）、５分、１５分、３０分および１時間、２時間、４時間、８時間および２４時間。
血液試料（それぞれおよそ２５０μＬ）を、ＥＤＴＡ－Ｋ３チューブに収集し、血漿を調製した。チューブを２～８℃で１０分間、１９００ｇで遠心分離するまで、３０分以内にわたって冷浴に入れた。遠心分離後、少なくとも１００μＬの血漿をプラスチック（ポリプロピレン）チューブに移し、出荷まで－８０±１０℃で保存した。
薬物動態分析は、血漿中のＡｐＴＯＬＬ濃度が、投与後８時間までのすべての用量レベル（試料が利用可能な場合）ですべての動物で定量可能であることを示した。一般に、最大血漿濃度は、最初の時点（１分）で観察された（Ｔｍａｘ）。平均ＣｍａｘおよびＡＵＣｔ値は、以下に要約されている。
Figure 2022533966000005
この研究から導き出された主な結論は次のとおりであった。
－動物は、正しい用量レベルで投与された。
－実験が困難なため、８時間目に動物番号３Ｆを除くすべての動物から血液試料を収集した。試料は、２時間、４時間および２４時間の試料採取時点で１分および５分ずれた５つの試料を除いて、正しい時間に取得した。
－臨床症状はなかった。
－適格な方法に従って分析された研究試料は、良好なアッセイ性能を示した。
－血漿ＡｐＴＯＬＬ濃度は、投与後８時間までのすべての用量レベル（試料が利用可能な場合）ですべての動物において定量可能であり、Ｔｍａｘは、最初の時点（投与後１分）であった。
－Ｃｍａｘは、０．４５～２ｍｇ／ｋｇの用量範囲にわたって線形動態を示したが、曝露（ＡＵＣｔ）は、同じ用量範囲にわたって非線形動態を示した。
薬力学および薬物動態の結論
ＰＤおよびＰＫ研究から導き出された主な結論を以下に要約する。
－ＡｐＴＯＬＬは、ＴＬＲ－４に対するその適切な拮抗プロファイルのために設計された多数のアプタマーから選択されている。
－インビトロでは、ＡｐＴＯＬＬは、２０ｎＭおよび２００ｎＭで良好な薬力学的プロファイルを示す。
－サルおよびヒト単球細胞におけるＡｐＴＯＬＬのＫａは、３０～６０ｎＭである。
－ＡｐＴＯＬＬは、他のＴＬＲとの相互作用を示さない（アゴニストでもアンタゴニストでもない）。
－マウスおよびラットでは、ＡｐＴＯＬＬは、短期および長期の両方で、また異なる実験モデルで、脳虚血後の保護を誘導する。
－ＡｐＴＯＬＬの治療可能時間域は、少なくとも脳卒中後６時間である。
－ＡｐＴＯＬＬは、生理学的パラメーターにも神経毒性にも影響を与えない。
－ＰＫ研究の臨床徴候は報告されていない。適格な方法に従って分析された研究試料は、良好なアッセイ性能を示した。
－血漿ＡｐＴＯＬＬ濃度は、投与後８時間までのすべての用量レベル（試料が利用可能な場合）ですべての動物において定量可能であり、Ｔｍａｘは、最初の時点（投与後１分）であった。
－Ｃｍａｘは、０．４５～２ｍｇ／ｋｇの用量範囲にわたって線形動態を示したが、曝露（ＡＵＣｔ）は、同じ用量範囲にわたって非線形動態を示した。
実施例７．毒性学
単一用量毒性
インビトロ毒性学：細胞生存率に対するＡｐＴＯＬＬの影響
ＡｐＴＯＬＬの潜在的な細胞毒性を、これらの研究に日常的に使用されている２つの異なる細胞株（Ｈｅｐ－Ｇ２およびＨＬ６０）とのインキュベーションによって評価した。細胞生存率は、インキュベーション培地にアプタマー（２～２０００ｎＭ）を添加してから２４時間後および４８時間後にＭＴＴおよびＬＤＨアッセイによって定量化した（図３１）。生物学的に活性な濃度よりも１００倍高い濃度のみが、２４時間で細胞生存率に対して中程度の影響を示した（図３１、パネルＡ）。さらに、高用量での４８時間のインキュベーション後のＬＤＨレベルの減少は、これらの培養物における細胞数の減少に潜在的に関連している（図３１、パネルＢ）。
反復用量毒性
反復用量毒性研究では、ラットをげっ歯類モデルとして選択し（薬理学が類似しているため）、サルを非げっ歯類モデルとして選択した（そのヒト－ＴＬＲ－４相同性のため）。
Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットにおける予備毒性研究
この研究の目的は、ラットに７日間連続して毎日静脈内投与した後のＡｐＴＯＬＬの毒性効果を評価することであった。この研究は、潜在的な標的臓器を示し、その後の２週間の毒性研究のための用量レベルの選択の合理的な基礎を提供した。
ＡｐＴＯＬＬをＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに１日１回７日間静脈内投与した。動物を、以下のように４つの治療群に割り当てた。
Figure 2022533966000006
すべての動物は、生存率／死亡率について、研究全体を通して１日２回観察された。毎日のケージ側の観察は、順応および予備試験の間に実施し、臨床徴候も治療期間中に毎日記録した。注射部位は、投薬の前後に局所的な徴候がないか検査した。摂餌量を、治療開始前、および治療期間中に週２回記録した。体重は、予備試験中に１回、治療期間中および犠牲（絶食なし）の前に週２回記録した。血液学および臨床生化学のための血液試料は、すべての動物から治療期間の終わり（８日目）に収集した。治療の完了後、すべての主要な動物を犠牲にして壊死させ、臓器の重さを量った。組織のフルセットは保持されたが、検査されなかった。
研究の結果を以下のように要約する。
－すべての動物は、治療期間の終わりまで生き残り、８日目に予定通り犠牲にした。
－５、２５および５０ｍｇ／ｋｇ／日でＡｐＴＯＬＬを投与された動物では、試験項目に関連する臨床徴候は記録されなかった。しかしながら、５日目から７日目まで、対照を含む一部の動物で発声および尾の不快感が観察された。
－どの投与された用量でも注射部位に局所的な徴候は観察されなかった。
－５、２５および５０ｍｇ／ｋｇ／日のＡｐＴＯＬＬでは、試料サイズと変化の大きさを考慮しても、摂餌量に関連する差異はなかった。対照群では、摂餌量に目立った変化は観察されなかった。
－５、２５または５０ｍｇ／ｋｇ／日のＡｐＴＯＬＬでは、体重に顕著な差異は観察されなかった。
－毒物学的に関連する血液学または生化学への影響はなかった。
－ＡｐＴＯＬＬの投与は、剖検時に検査項目に関連する肉眼的所見を引き起こさなかった。
－収集された臓器（脳、心臓、腎臓、肝臓、肺および気管支および脾臓）の平均絶対重量または調整後重量に統計的に有意な差異はなかった。
－治療前群および終末群の両方で雌のＩＬ－６がわずかに増加したことを除いて、治療群全体または時点間でＡｐＴＯＬＬに対するサイトカイン反応は観察されなかった。
この研究の条件下で、ＡｐＴＯＬＬをＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに１日１回、最大５０ｍｇ／ｋｇ／日まで７日間静脈内投与しても、毒性学的影響を引き起こさなかった。
ラットにおける２週間の毒性研究とそれに続く１週間の回復期間
この毒性研究の目的は、ラットに５、２５および５０ｍｇ／ｋｇ／日を１日１回、２週間にわたって静脈内投与した場合のＡｐＴＯＬＬの毒性効果を評価することであった。さらに、治療に関連する変化または遅延毒性の可逆性または進行を、１週間の無治療回復期間後に数匹の動物で評価した。この研究は、潜在的な標的臓器を示し、ヒトのリスク評価の合理的根拠を提供した。
合計７４匹の雄および７４匹の雌、５～７週齢のＳＤラットを研究に使用した。ラットを、それぞれ１５～２０匹の雄および１５～２０匹の雌を含む４つの群に分けた。ＡｐＴＯＬＬを、１日１回、単回ボーラスで静脈内投与した。治療期間は次のとおりであった。
－１４日（主要および回復）
－１４日（毒物動態）
－１日（バイオマーカー）
治療群および用量を図３２に示す。
この研究で得られた結果は、ＡｐＴＯＬＬ投与後に臨床徴候がないことを示した。さらに、ＡｐＴＯＬＬによる治療後のラットは、ＦＯＢ試験の実施に変化を示さなかった。血液学、凝固、臨床生化学および尿検査は、正常なパラメーターの範囲内であった。マクロ病理学も同様に正常であった。ＩＰ－１０を除いて、ＡｐＴＯＬＬ投与後のサイトカインレベルに統計的に有意な用量関連の差異は観察されなかった。対照群と比較したＩＰ－１０レベルの有意差の量は、１日目の試料すべての用量の増加とともに増加した。１４日目に群３および４の雄ラットにおいて、小さいが有意な増加が観察された。しかしながら、対照群と比較した場合、１４日目にラットで有意な増加は観察されなかった。
ＳＤラット（５０ｍｇ／ｋｇ）にＡｐＴＯＬＬを１４日間連続および毎日投与した後、有意な毒物学的所見（すなわち、治療動物の形態、機能的能力、成長、発達またはスパンの有害な変化）は観察されなかったため、上記の研究の主要な結論は、この化合物が顕著な毒物学的変化を誘導しなかったことであった。
したがって、５０ｍｇ／ｋｇのＡｐＴＯＬＬをＮＯＡＥＬ（無有害作用量）とみなした。５０ｍｇ／ｋｇが使用された最大用量であった。より高い用量の使用は、より高いＮＯＡＥＬ値につながる可能性がある。
毒物動態評価：投与後５分で、１日目に雄３匹および雌２匹（範囲１．０～１８．３ｎｇ／ｍＬ）、１４日目に雄３匹および雌１匹（１．４～１１．４ｎｇ／ｍＬ）に定量可能な濃度が認められた。これらの濃度は、同等の時間に処置された動物で観察された濃度よりもはるかに低かった。しかしながら、この明らかな不一致の原因は特定されなかった。
ＡｐＴＯＬＬ濃度の血漿中の個体間変動は高く、変動係数は一般に７０％を超え、２．２％～１７３％の範囲であった。
全体として、最大血漿濃度が観察された時間（Ｔｍａｘ）は、静脈内投与後に予想されたように、最初の時点（５分）であった。それにもかかわらず、１日目に２５ｍｇ／ｋｇ／日の用量レベルを受けた雌の血漿中濃度－時間プロファイルは、これらの動物が静脈内投与を受けなかったことを示唆している（例えば、用量は動脈内または筋肉内に投与された）。
ＡｐＴＯＬＬの最大平均血漿濃度（Ｃｍａｘ）と、１日目および１４日目の最終定量可能時間までの血漿濃度（ＡＵＣｔ）の平均血漿ＡｐＴＯＬＬ濃度時間曲線下の面積を以下に要約する。
Figure 2022533966000007
ラットのＡｐＴＯＬＬへの全身曝露の程度は、１日目および１４日目の５～５０ｍｇ／ｋｇ／日の用量範囲にわたる非線形（用量依存）動態を特徴とするようであった。
全体として、ＡｐＴＯＬＬ濃度は一般に雄の濃度と同様であり、１４日間の反復静脈内ボーラス投与後に蓄積は観察されなかった。
カニクイザルにおける予備的な７日間の静脈内（ボーラス）毒性研究
この研究の目的は、サルに７日間連続して毎日静脈内投与した後のＡｐＴＯＬＬの毒性効果を評価することであった。この研究は、潜在的な標的臓器を示し、その後の２週間の毒性研究のための用量レベルの選択の合理的な基礎を提供した。
ＡｐＴＯＬＬを、６匹のカニクイザル（雄３匹および雌３匹、生後２４～３６ヶ月齢）に１日１回７日間静脈内投与した。動物を、以下のように４つの治療群に割り当てた。
Figure 2022533966000008
この研究で得られた結果は、ＡｐＴＯＬＬ投与後に関連した臨床徴候が観察されなかったことを示す。摂餌量および体重は、通常のパラメーターのままであった。決定されたサイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、およびＴＮＦ－α）のうちのいずれか、または決定された補体活性化複合体（ＣＨ５０およびＣ５Ｂ－９）のいずれについても、治療または性別に関連する影響を決定することができなかった。肉眼的所見も臓器重量の変動も報告されなかった。
これらの結果に基づいて、１週間の毎日の投与後のＭＴＤ（最大耐量）は、６．９ｍｇ／ｋｇ／日のＡｐＴＯＬＬで確立された。
毒物動態：抗ＴＬＲ－４ ＤＮＡアプタマーの最大血漿中濃度（Ｃｍａｘ）と、最終定量可能時間までの血漿中濃度（ＡＵＣｔ）の血漿中濃度－時間曲線下面積を以下に要約する。
Figure 2022533966000009
したがって、サルのＡｐＴＯＬＬへの全身曝露のＣｍａｘ値および程度は、単一用量後、０．７～６．９ｍｇ／ｋｇ／日の用量範囲にわたって線形（用量非依存）動態を特徴とするようであった。
終末半減期（ｔ１／２）は、０．８～１．４時間の範囲であり、用量および性別とは無関係であるようであった。総血漿クリアランス（Ｃｌ）は、２５２～４０９ｍＬ／ｈ／ｋｇの範囲であり、定常状態での平均分布容積（Ｖｓｓ）は、３４．０～６８．３ｍＬ／ｋｇの範囲であった。
静脈内経路によるカニクイザルの１４日間の反復用量毒性研究とそれに続く１週間の回復期間
この研究の目的は、カニクイザルに静脈内経路（ボーラス）によって１日２回、６時間間隔で１４日間投与した場合の、ＡｐＴＯＬＬの累積毒性および毒物動態を評価することであった。治療に関連する変化または遅延毒性の可逆性または進行は、治療期間後の一部の動物の１週間の回復期間中に評価した。
合計３２匹の動物（雄１６匹および雌１６匹、２８～２９ヶ月齢）を、動物に投与したＡｐＴＯＬＬの濃度が異なる４つの群に割り当てた。
Figure 2022533966000010
この研究で得られた結果は、ＡｐＴＯＬＬ投与に関連する毒物学的徴候がないことを示した。対照群を含む注射部位の血管周囲線維症および皮下線維症のみが、治療の終了時に観察され、１週間後に部分的に回復した。関連する臨床徴候は観察されなかった：すべての動物は研究の終わりまで生き残り、摂餌量または体重変化への影響はなく、検眼鏡検査での所見もなかった。決定されたサイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、およびＴＮＦ－α）のうちのいずれか、または決定された補体活性化複合体（ＣＨ５０およびＣ５Ｂ－９）のいずれについても、治療または性別に関連する影響を観察することはできなかった。肉眼的または顕微鏡的変化は報告されなかった。
結論として、１３．９ｍｇ／ｋｇ／日のＡｐＴＯＬＬの用量は、ＡｐＴＯＬＬがカニクイザルに静脈内（ボーラス）経路で１日２回（６時間間隔で）１４日間投与された場合、ＮＯＡＥＬとみなされた。
毒物動態
４ＦＴアプタマーの主な毒物動態パラメーターの要約を図３３に示す。
これらの投与計画では、ＡｐＴＯＬＬの蓄積は観察されなかった。
すべての群で、男性と女性との間で同等の曝露が観察された。男性／女性の比率は、Ｃｍａｘでは１．０～１．５、ＡＵＣｔでは０．７～１．６の範囲であった。
遺伝毒性
インビトロ
遺伝子毒性アッセイは、ＩＣＨ Ｓ２（Ｒ２）ガイドラインに従って設計された。Ａｍｅｓおよびインビトロ小核アッセイ（Ｓ９による代謝活性化の有無にかかわらず）を含む試験バッテリーを実施した。Ａｍｅｓゆらぎ試験は化合物の潜在的変異原性を評価し、インビトロ小核アッセイは、染色体損傷などの遺伝子毒性効果の評価においてＡｍｅｓゆらぎ試験を補完した。細胞毒性は、細胞毒性に起因する可能性のある偽陰性を特定するために、それぞれのアッセイ中に並行して評価した。
様々なタイプの遺伝子毒性を評価するために、いくつかのインビトロアッセイをスクリーニングツールとして使用した。それぞれの実験において、該当する場合は、それぞれの参照化合物をＡｐＴＯＬＬと同時に試験し、データを履歴値と比較した。
細菌の細胞毒性：化合物の細菌の細胞毒性をＡｍｅｓアッセイと並行して試験し、細胞毒性に起因する可能性のある偽陰性を特定した。細胞数 細胞毒性％は、細胞数に基づく指標であり、以下のとおりであった。
Figure 2022533966000011
成長率が対照より６０％以下の化合物にはフラグを付け、細胞毒性があるとみなした。これらの条件下で、この研究で得られた結果は、非細菌性の細胞毒性効果を示している（図３４および図３５）。
Ａｍｅｓ試験：Ａｍｅｓ試験を実施して、ＡｐＴＯＬＬが直接的なＤＮＡ変異を引き起こす可能性があるかどうかを判断した。遺伝子変異は、成長要件の変化によって引き起こされる細菌で簡単に測定することができる。Ａｍｅｓ試験は、遺伝子変異を引き起こす可能性のある化合物を同定するために広く使用されている細菌アッセイであるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍを使用して実施され、げっ歯類の発がん性試験で高い予測値を示した。Ａｍｅｓ試験では通常、細菌が必須アミノ酸のヒスチジンを合成できなくなり、その結果、ヒスチジンを含まない培地で成長できない既存の変異を持つサルモネラ菌の５つの菌株を使用する。
Ａｍｅｓゆらぎアッセイは、４つのサルモネラ菌株ＴＡ９８、ＴＡ１００、ＴＡ１５３５およびＴＡ１５３７を使用して３８４ウェルプレートで実施した。細菌プレートを試験化合物とともに９６時間インキュベートし、細菌成長を、細菌成長による培地の酸性化に応答して色が変化するｐＨ指示薬を使用して分光光度的に測定した。代謝活性化は、ラット肝臓Ｓ９画分を使用することによって達成した。殺菌効果または静菌効果による偽陰性を防ぐために、Ａｍｅｓゆらぎアッセイと並行して細菌細胞毒性アッセイを行った。
ヒスチジン変異の復帰により細菌成長を示したウェル（ＯＤ４３０／ＯＤ５７０の比率が１．０より大きいことで判断）をカウントし、陽性カウントとして記録した。処理（試験化合物の存在下）と対照（試験化合物の非存在下）との間の陽性カウントの有意性は、片側フィッシャーの直接確率検定を使用して計算した。
この研究で得られた結果は、Ａｍｅｓ試験で有意な効果を示さなかったため、ＡｐＴＯＬＬ投与後の直接的なＤＮＡ変異は同定されなかった（図３６および図３７）。
インビトロ小核アッセイ：このアッセイは、ＡｐＴＯＬＬが二本鎖ＤＮＡ切断を導入するか、または有糸分裂細胞分裂に影響を与えることによって染色体損傷を引き起こす可能性があるかどうかを評価するために実施した。小核形成は遺伝子毒性の特徴であり、小核アッセイは、遺伝子毒性スクリーニングの重要な構成要素である。小核は、有糸分裂時に娘細胞核に組み込まれなかった断片または染色体全体をも表すクロマチン含有体である。アッセイの目的は、間期細胞における小核の誘導につながる染色体損傷を誘導する薬剤を検出することであった。
インビトロ小核アッセイは、ＣＨＯ－Ｋ１細胞で行った。細胞を９６ウェルプレートに播種し、試験化合物で２４時間（Ｓ９なし）および４時間（Ｓ９あり）処理した。細胞質分裂ブロッカーであるサイトカラシンＢを２４時間後に添加し、細胞をさらに２４時間インキュベートした後、細胞を固定し、小核のスコアを付けた。小核細胞のパーセントを計算した。細胞質分裂阻害増殖指数（ＣＢＰＩ）細胞毒性％は、（ＣＢＰＩ）の修正バージョンを使用する。この方法は、細胞毒性が細胞周期停止を誘導することが非常に多いという事実を利用しており、これは、サイトカラシンＢを使用した場合の二核細胞と単核細胞との比率の低下に反映される。ＣＢＰＩが１の場合、１００％の細胞毒性に相当する。
このアッセイで得られた結果は、小核の誘導を示さなかった（図３８）。
局所耐性
Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットにおける予備毒性研究
研究されたＡｐＴＯＬＬの濃度では、注射部位に毒性関連の徴候は検出されなかった。
ラットにおける２週間の毒性研究とそれに続く１週間の回復期間
全体として、注射部位に局所的な徴候はなかった。しかしながら、５日目から７日目まで、２匹の雄（群４）が尾に紅斑を示した。
カニクイザルにおける予備的な７日間の静脈内（ボーラス）毒性研究
注射部位のあざが記録された。他の局所的な変化は観察されなかった。
静脈内経路によるカニクイザルの１４日間の反復用量毒性研究とそれに続く１週間の回復期間
静脈注射部位のうちのいくつかで見られた暗い領域は、対照群を含む肉眼検査で記録された。顕微鏡評価の結果、４つの投与部位（血管周囲線維症および皮下線維症）で治療関連の所見が得られた。ビヒクルは、線維症の主な誘発因子とみなされ、これは、１日２回の注射手順によってもたらされた。１週間の回復期間後の動物の評価は、４つの投与部位で部分的な回復を実証した。
実施例８．心筋梗塞後の左心室リモデリングにおけるＡｐＴＯＬＬの有効性
心筋梗塞後の左心室リモデリングにおけるＡｐＴＯＬＬの影響を評価するために、左前下行枝（ＬＡＤ）の結紮による心筋虚血再灌流傷害のモデルをラットで実施した。手短に言えば、虚血を実施するためのＬＡＤ冠状動脈の結紮を３０分間維持した。次いで、再灌流を可能にするために結紮を取り除いた。ＡｐＴＯＬＬの単一用量（０．４５ｍｇ／ｋｇ）を、再灌流の１０分後に単回ボーラス投与で静脈内注射した。１ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＰＢＳの溶液を、対照（ビヒクル）として使用した。心エコーパラメーターの駆出率および短縮率は、基礎状態および梗塞後７２時間で記録した。
結果：グラフに示されているように、駆出率および短縮率は、虚血再灌流傷害後に劇的に影響を受けた。しかしながら、ＡｐＴＯＬＬの単一用量（０．４５ｍｇ／Ｋｇ）の投与は、それぞれ１８．３％および２３．８％の回復を示した（図４０）。これらすべてのデータをまとめると、ＡｐＴＯＬＬは心筋梗塞後の心臓の筋肉収縮を保護する効果があり、この効果によって心臓の機能が維持される可能性がある。
実施例９．実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）マウスモデルにおけるＡｐＴＯＬＬの有効性
９．１．０．９１ｍｇ／ｋｇのＡｐＴＯＬＬによるアッセイ
多発性硬化症（ＭＳ）の炎症性成分におけるＡｐＴＯＬＬの潜在的な神経保護効果を評価するために、ＥＡＥマウスモデルでアッセイを行った。このモデルは、ヒトの炎症性脱髄疾患であるＭＳで最も一般的に使用されている実験モデルである。
７週齢の麻酔をかけた雌のＣ５７／ＢＬ６マウスを、結核菌を含む不完全フロイントアジュバント中のＭＯＧ３５－５５ペプチドで皮下的に免疫付与した。次いで、免疫化時および４８時間後に、マウスに百日咳毒素を尾静脈に注射することにより静脈内投与した。ＡｐＴＯＬＬの単一用量（０．９１ｍｇ／Ｋｇ）を、ＥＡＥの最初の徴候（発症）時に単回ボーラスで尾に静脈内投与した。１ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＰＢＳの溶液を、対照（ビヒクル）として使用した。以下の臨床スコア基準を使用して、発症以来およびすべてのアッセイ時間中、マウスの神経学的症状を毎日検査した：０、検出可能な徴候なし；０．２５、尾端が落ちた；０．５、尾の半分が落ちた；０．７５、基部を除いて尾が落ちた；１、たるんだ尾；１．５、部分的な後肢脱力を伴うたるんだ尾；２、明らかな後肢の脱力；２．５、片側の部分的な後肢麻痺；３、完全な両側後肢麻痺；３．５、部分的な前肢の衰弱を伴う完全な後肢麻痺；４、完全な両側前肢麻痺；５、死。
結果：ＡｐＴＯＬＬの投与は、ビヒクルと比較した場合、症状のピーク（発症後４日）で臨床スコアの２７％の低減を示し、アッセイの終わりでさらに高い低減（６６％）を示した（図４１）。このデータは、疾患の炎症性成分に影響を与えるＡｐＴＯＬＬの神経保護効果を示した。
９．２．疾患発症から２４時間後に投与されたＡｐＴＯＬＬの有効性
独立したアッセイを行い、ＡｐＴＯＬＬ（０．９１ｍｇ／Ｋｇ）の単一用量を、ＥＡＥの最初の徴候（発症）の２４時間後に単回ボーラス投与で静脈内投与した。
結果：発症から２４時間後にＡｐＴＯＬＬを注射すると、臨床スコアの明らかな低下が観察された（図４４）。
９．３．異なる用量のＡｐＴＯＬＬによるアッセイ：０．４５、０．９１、１．８２、３．６ｍｇ／ｋｇ
アッセイは、セクション９．１のように行った。
組織処理：神経組織の抽出および処理は、発症後１０日（薬物投与時）に実行した。安楽死用量のＤＯＬＥＴＨＡＬ（登録商標）、経心臓灌流を実施し、それにより、蠕動ポンプを使用して、循環系を介して組織を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定した。次いで、組織、この場合は脳および脊髄を得た。次に、組織をＰＢで１０分間数回洗浄し、ＰＢ中のスクロース濃度を上げながら３回連続して凍結保護し、最後にＯＣＴで凍結し、異なる部分（脳、小脳、頸髄、胸髄の２つの部分（Ｔ１およびＴ２）ならびに腰髄）に分離した。Ｔ１をこの研究に使用し、横断面で２０マイクロメートルの厚さのクリオスタットで切断した。
エリオクロムシアニン染色：ＣＮＳ脱髄の分析のために、エリオクロム－シアニン（ＥＣ）染色を実施した。組織切片を室温（ＲＴ）で２時間、３７℃のストーブでさらに２時間乾燥させた。スライドを室温で５分間冷アセトンに浸し、アセトンを蒸発させるために３０分間通気させた。続いて、切片を、蒸留水中の０．２％エリオクロム－シアニン（Ｓｉｇｍａ）、０．５％硫酸（Ｈ２ＳＯ４、Ｓｉｇｍａ）および４％第二鉄アルミニウム（Ｓｉｇｍａ、蒸留水中で１０％調製）を含む染色溶液に室温で３０分間浸漬した。過剰な染料を除去し、切片を蒸留水中の５％第二鉄アルミニウム（Ｓｉｇｍａ）の水溶液に室温で１０分間浸漬して、染色された組織を区別した。過剰の染料を再び水で除去し、それらをホウ砂－フェロシアン化物の溶液に室温で１０分間浸漬した。水で洗浄した後、染色の正しい分化を明視野顕微鏡で確認した（有髄領域が青色および白色または黄色がかった脱髄領域で染色された）。その保存のために、切片を７０、８０、９０、９６および１００％エタノールで濃度を増加させたエタノール溶液で脱水し、２つの１００％キシレン浴ですすぎ、封入剤で封入した。
免疫組織化学：切片に存在する抗原を検出するために、それらを解凍し、ＲＴで１時間乾燥させた。次いで、０．１Ｍ ＰＢ（リン酸緩衝液）中の１０％メタノールによる前処理を、ＲＴで１５分間、撹拌しながら実施した。０．１ＭのＰＢおよび１ＸのＰＢＳをそれぞれ１０分間２回洗浄した後、非特異的結合を回避するためにブロッキング溶液（１×ＰＢＳ中の５％の通常のロバ血清（ＮＤＳ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）および０．０２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ））中で１時間、暗く湿ったチャンバーにおいて室温で実行した。この後、切片を、対応するブロッキング溶液中の一次抗体の混合物（ＭＢＰ（ラット、Ｓｅｒｏｔｅｃ）、ＮＦＨ（ウサギ、Ａｂｃａｍ）、Ｉｂａ１（モルモット、Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍ）、Ｏｌｉｇ２（ウサギ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＣＣ１（マウス、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＰＤＧＦＲα（ヤギ、Ｒｄ））中で１２時間、４℃で、加湿チャンバー内でインキュベートし、ブロッキング溶液中の二次蛍光抗体を１：１０００の濃度で使用することによって、室温で１時間発達させた。次いで、ＰＢＳ中のストック（１００μｇ／ｍｌのビスベンズイミド、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ｍｉｌｌｉＱ水中）に対して１：１０の濃度で、１０分間室温で暗所および加湿チャンバーにおいて、コア発達のために切片をＨＯＥＣＨＳＴ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ）で染色した。最後に、切片をＰＢＳで洗浄し、ＦＬＵＯＲＯＭＯＮＴ（登録商標）封入剤（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）のカブスライドで封入した。
画像および分析：Ｌｅｉｃａ ＳＰ－５共焦点顕微鏡を使用して、脊髄切片の画像を撮影した。動物ごとに３枚の写真（モザイク）を、４０倍の倍率および５１２×５１２ピクセルの解像度で３μｍの平面間の間隔で撮影した。ＮＦＨ、Ｉｂａ１、ＭＢＰの領域、およびシアニンエリオクロム染色の脱髄領域の分析には、Ｉｍａｇｅ Ｊアプリケーションを使用した。３Ｄおよび４Ｄイメージング用のＩＭＡＲＩＳソフトウェアを使用して、ミクログリア細胞および核をカウントした。
結果：図４５および４６に見られるように、０．４５ｍｇ／ｋｇの用量で、ＥＡＥ－ＡｐＴＯＬＬ群の臨床スコアに改善が見られた。０．９１ｍｇ／ｋｇのＡｐＴＯＬＬ用量で、ＥＡＥの臨床経過は、症状の発症時にＡｐＴＯＬＬの注射後４日で有意に改善された。１．８２ｍｇ／ｋｇのＡｐＴＯＬＬ用量では、ビヒクル群と比較して、ＡｐＴＯＬＬの注射後５日で臨床スコアが大幅に改善した。３．６ｍｇ／ｋｇのＡｐＴＯＬＬ用量では、臨床スコアは、ビヒクルよりもＥＡＥ－ＡｐＴＯＬＬ群においてわずかに高くなる。したがって、特に０．９１ｍｇ／Ｋｇおよび１．８２ｍｇ／Ｋｇの用量での治療は、ＥＡＥ臨床経過曲線の傾きの有意な低減をもたらした。動物が到達したスコアのこの差異は、ビヒクルの群に関して、０．９１ｍｇ／Ｋｇの用量の場合は開始後４日で、１．８２ｍｇ／Ｋｇの用量の場合は５日で実験の終了まで有意であった。０．９１ｍｇ／Ｋｇおよび１．８２ｍｇ／Ｋｇの用量を受けたマウスの脊髄の組織学的分析を実施して、この化合物の再ミエリン化および神経保護効果を研究し、両方の濃度を比較した。
脊髄切片の脱髄領域をエリオクロム－シアニン染色（図４７）によって分析し、ＡｐＴＯＬＬで処置した動物よりもビヒクル群の白質の脱髄領域（図示せず）の割合が高いことを観察した。したがって、ＡｐＴＯＬＬは、ビヒクルよりも脱髄領域％が少ないため、ＥＡＥ中の脱髄プロセスから保護する。
次に、ＡｐＴＯＬＬがこのモデルで持つ可能性のある神経保護効果を研究するために、処置群とビヒクルとの間の差異が大きい２つの用量（０．９１ｍｇ／ｋｇおよび１．８２ｍｇ／ｋｇ）で異なるマーカーを分析した。脊髄の白質に存在するミエリンの領域をＭＢＰマーカー（ミエリン塩基性タンパク質）を使用して研究し、神経軸索損傷をＮＦＨマーカー（神経膠細胞重ポリペプチドタンパク質、軸索損傷のマーカー）を使用して研究し、犠牲時に生じた炎症のレベルは、活性化されたミクログリア細胞のマーカー（Ｉｂａ１、ミクログリアに特異的なカルシウム結合タンパク質）を使用して研究した。両方の用量において、ＥＡＥ－ＡｐＴＯＬＬ群においてより高いパーセンテージのＭＢＰおよびＮＦＨの両方が観察され、ビヒクル群と比較してＩｂａ１の有意な減少が観察された（図４８）。これは、これら２つの濃度のＡｐＴＯＬＬが、炎症性成分を伴うＭＳのこの動物モデルで神経保護効果を有することを示した。
ＡｐＴＯＬＬの最適濃度を決定するために、選択した２つの用量間の（再）ミエリン化、神経保護および炎症の比率を計算した。結果は、１．８２ｍｇ／ｋｇの用量よりも０．９１ｍｇ／ｋｇの用量で改善された用量効果を示した。
ＡｐＴＯＬＬがミエリン形成細胞の増殖および分化を改善したかどうかを判断するために、乏突起膠細胞系統の組織学的研究を実行した。それぞれの用量について、ビヒクル処置群（図４９）に関して、ＥＡＥ－ＡｐＴＯＬＬ群において、より大量の前駆オリゴデンドロサイト（ＰＤＧＦＲα＋細胞、増殖マーカー）および成熟オリゴデンドロサイト（ＣＣ１＋細胞、分化マーカー）が観察され、ミエリンマーカーＭＢＰを使用することによって以前に観察された再ミエリン化効果を確認した。
結論：ＭＳの動物モデルＥＡＥにおいてＡｐＴＯＬＬの４つの異なる用量を試験することによるＡｐＴＯＬＬの用量反応研究は、そのような処置のための最適用量が０．９１ｍｇ／ｋｇであり、第２のオプションが１．８２ｍｇ／ｋｇであり得ることを示した。ＥＡＥモデルにおける症状の出現の時点で、ＡｐＴＯＬＬ投与は、ビヒクル群の動物と比較して、処置された動物においてかなりの体重回復および臨床経過の有意な低減をもたらした。さらに、ＡｐＴＯＬＬの投与は、軸索の損傷および炎症を大幅に軽減することに加えて、組織の再ミエリン化に明らかな影響を及ぼした。これら２つの用量の投与は、ビヒクルとは異なり、脱髄領域の低減、ならびに有髄領域およびニューロフィラメントの量の増加をもたらした。
９．４．この研究で使用されたＡｐＴｏｌｌ
Figure 2022533966000012
実施例１０．ラットのオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）のインビトロモデルにおけるミエリン形成促進に対するＡｐＴＯＬＬの有効性
この研究は盲検的に行い、７日齢のラットから抽出されたＯＰＣに対するＡｐＴＯＬＬの潜在的なミエリン形成促進効果を分析した。この目的のために、ＡｐＴＯＬＬによる処置後のＯＰＣの生存、増殖、および分化を測定した。
生存アッセイ：対照、ビヒクル（１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＰＢＳ）、ＡｐＴＯＬＬ（２０ｎＭ～２００ｎＭ）、およびＨ２Ｏ２との死の陽性対照による処置の２４時間前にＯＰＣをプレーティングした。２４時間のインキュベーション後、細胞生存率をＭＴＴキットによって製造元の仕様に従って測定し、シグナルを５９５ｎｍで測定した。
増殖アッセイ：対照、ビヒクル（１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＰＢＳ）、およびＡｐＴＯＬＬ（２０ｎＭ～２００ｎＭ）による処置の２４時間前にＯＰＣをプレーティングした。次いで、ＢｒｄＵパルスを６時間細胞に与えた。２４時間後に細胞をパラホルムアルデヒド溶液で固定し、免疫細胞化学は、一次抗体としてＢｒｄＵおよびＯｌｉｇ２を使用して行った。増殖中の細胞を定量化するために、画像を共焦点顕微鏡によって可視化した。
分化アッセイ：ＯＰＣをプレーティングし、２４時間成長させた。次いで、培地を成長因子（ＰＤＧＦ－α ｙＦＧＦ２）で補足された培地に置き換え、対照（成長因子を含まない培地）、ビヒクル（１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＰＢＳ）、ＡｐＴＯＬＬ（２０ｎＭ～２００ｎＭ）、および甲状腺ホルモン（Ｔ３）による分化の陽性対照で処理した。細胞をパラホルムアルデヒド溶液で固定して、一次抗体ＭＢＰおよびＯｌｉｇ２で免疫細胞化学を実施した。増殖中の細胞を定量化するために、画像を共焦点顕微鏡によって可視化した。
ＡｐＴＯＬＬによる処理は、ＯＰＣの増殖および分化に対して用量依存的な効果を示した。２００ｎＭのＡｐＴＯＬＬ処理条件では、細胞増殖および分化は、それぞれ４３．２％および５３．６％増加した。しかしながら、細胞生存への影響は観察されなかった（図４２）。これらのデータは、ＭＳモデルのミエリン形成促進につながるプロセスにおけるＡｐＴＯＬＬの役割を示した。そのような効果は、虚血性脳卒中、出血性変化、出血性脳卒中、または心筋梗塞などの他のＴＬＲ－４媒介性状態と関連した神経組織損傷の治療にも有益である可能性がある。
実施例１１．出血性脳卒中または出血性変化を治療するためのＡｐＴＯＬＬの有効性
出血性脳卒中および出血性変化は、同じ組織（脳組織）の虚血性脳卒中においても観察される生理学的変化に関連しており、ＴＬＲ－４媒介性の状態であることも知られている。したがって、虚血性脳卒中に対する本開示のアプタマーの効果を特性評価するための上で開示された実験方法、および当該技術分野で知られている他の方法を使用して、出血性脳卒中および出血性変化、ならびにそれらの症状および後遺症を治療する本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の効果を決定する。
出血性脳卒中または出血性変化を有する対象への本開示のアプタマー（例えば、ＡｐＴＯＬＬ）の投与は、（ｉ）損傷した組織の低減、（ｉｉ）炎症の低減、（ｉｉｉ）予後および転帰の改善、（ｉｖ）炎症性バイオマーカー（例えば、インターフェロン－γ、インターロイキン－１２ｐ７０、ＴＮＦα、ＩＬ－６、もしくはそれらの任意の組み合わせ）のレベルの低下、（ｖ）生活の質の向上、（ｖｉ）機能スコアの改善、例えば、運動スコア（例えば、可動性の改善）、（ｖｉｉ）生存率の増加、または（ｖ）それらの任意の組み合わせをもたらすであろう。
実施例１２．ブタにおける虚血および冠状動脈再灌流の実験手順による心筋梗塞後の心機能および組織損傷に対するＡｐＴＯＬＬ治療の効果の研究
試験項目：ＡｐＴＯＬＬを、凍結乾燥した単一用量バイアルとして製剤化し、事前にＰＢＳ＋１ｍＭのＣｌ２Ｍｇに溶解し、構造化した。
Figure 2022533966000013
ビヒクル：ＰＢＳ＋１ｍＭのＣｌ２Ｍｇの溶液を、ビヒクルとして調製した。投与量（０．０７８ｍｇ／ｋｇ）は、動物の体重に応じて計算された。
材料：ヘマトキシリン－エオシン、トリクロームマッソン染色試薬、ＴＴＣ、エバンスブルー、およびウシ胎児血清はＳｉｇｍａから入手した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）でコンジュゲートした抗マウス二次抗体および液体３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）基質は、Ｄａｋｏから入手した。抗ＭＭＰ－９抗体およびヒト心臓トロポニン１シンプルステップＥＬＩＳＡキット（ａｂ２０００１６）はＡｂｃａｍから、プロテオームプロファイラーアレイ（ＡＲＹ００５Ｂ）はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍから、ケタミンはＰｆｉｚｅｒから、ミダゾラムはＢｒａｕｎから、イソフルランはＡｂｂｖｉｅから、プロポコールはＦｒｅｓｅｎｉｕｓから、フェンタニルはＫｅｒｎ Ｐｈａｒｍａから、ジアゼパムはＲｏｃｈｅから、アミオダロンはＳａｎｏｆｉ Ａｖｅｎｔｉｓから入手した。すべてのカテーテルはＣｏｒｄｉｓから入手した。以下は、この研究に使用される最も一般的な機器のリストである：５４１５Ｒ冷蔵遠心分離器は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。化学発光イメージングシステムＦｕｓｉｏｎ Ｓｏｌｏ－Ｓおよび画像解析ソフトウェアＦｕｓｉｏｎ－Ｃａｐｔは、Ｖｉｌｂｅｒ－Ｌｏｕｒｍａｔ（Ｅｂｅｒｈａｒｄｚｅｌｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。ＴＣＳ－ＳＰ５共焦点顕微鏡はＬｅｉｃａ（Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。マイクロプレートリーダーはＢｉｏｔｅｋ（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）から入手した。ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅ分光光度計は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から入手した。ガイディングカテーテル、血管形成バルーンおよびカテーテル導入器は、Ｃｏｒｄｉｓ（Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）から入手した。診断用および操縦可能なガイドワイヤーは、Ｂｏｓｔｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓ（Ｍａｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）から入手し、バルーン膨張装置はＢｒａｕｎ（Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。
プロトコル：動物および心原性ショック（ＣＳ）手順
ヨークシャーの雌ブタ（３７．８±５．２ｋｇ）に、筋肉内ケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ、Ｐｆｉｚｅｒ）およびミダゾラム（０．５ｍｇ／ｋｇ、Ｂｒａｕｎ）を事前投薬した。麻酔は、吸入イソフルラン（Ａｂｂｖｉｅ Ｓｐａｉｎ ＳＬＵ）によって誘導し、プロポフォール（２ｍｌ／ｋｇ／ｈ、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ）、フェンタニル（５０μｇ／ｋｇ／ｈ、Ｋｅｒｎ Ｐｈａｒｍａ）およびジアゼパム（１０μｇ／ｋｇ／ｈ、Ｒｏｃｈｅ）の持続注入で維持した。動物に挿管し、１００％酸素飽和度で換気した。動物は、カテーテルの血液凝固および悪性心不整脈を回避するために、それぞれ５０００ＩＵのヘパリンおよびアミオダロン（２ｍｇ／ｋｇ／ｈ、Ｓａｎｏｆｉ Ａｖｅｎｔｉｓ）を受けた。
虚血／再灌流は、ＪＬ３ ６Ｆカテーテルおよび血管形成バルーン（８気圧の圧力まで膨張）を使用して、左前下行枝（ＬＡＤ）を４５分間閉塞することによって誘導した。心室細動／心室頻脈が発生した場合は、直接手動胸部圧迫と組み合わせた二相性ＤＣショック（１０～２０ジュール）を投与した。ＬＡＤ閉塞の４５分後、動脈の遮断を解除し、再灌流の１０分後、治療を静脈内投与した。治療を盲検投与し、１０匹の動物をＡｐＴＯＬＬで処置し、１０匹を対照ビヒクルで処置した。１０ｍＬの動脈血を以下の時点で大腿動脈から採取した：ＡＭＩ前、ＡＭＩ後５０分、７５分、２時間、８時間、２４時間、３日および７日。収集後すぐに、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって血漿を単離し、実験前にすべての試料を－８０℃に保ち、将来の調査のために保管した。
心エコー検査：１．９～４ＭＨｚの走査ヘッドを備えたＶｉｖｉｄ Ｑ超音波システム（ＧＥヘルスケア）を使用して、心エコー検査によってブタの心臓を可視化した。麻酔をかけた動物では、心臓の傍胸骨短軸像をＢモードで記録し、心室中隔および左心室の後壁に垂直な傍胸骨短軸像にカーソルを置くことによってＭモードの記録を可能にした。これらの記録から、オンサイトソフトウェア心臓パッケージを使用して、次のパラメーターを決定した：収縮期および拡張期の心室間中隔の厚さ（ＩＶＳ）、収縮期および拡張期の左心室内径（ＬＶＩＤ）、収縮期および拡張期の左心室後壁の厚さ（ＬＶＰＷ）、左心室駆出率（ＥＦ）、左心室短縮率（ＦＳ）、心拍出数（ＨＲ）、および心拍出量（ＣＯ）。
二重エバンスブルー／ＴＴＣ染色：心筋梗塞の拡大は、エバンスブルー灌流およびＴＴＣ染色によって評価した。７日目までに、カテーテルを０日目と同じ位置で膨らませて、危険な領域の下流でエバンスブルー灌流を回避し、ピッグテールカテーテルを大腿動脈から挿入し、左心室まで配置して、エバンスブルー灌流を全身循環に挿入した。灌流の１分後、塩化カリウム溶液の注射によって動物を犠牲にし、次いで心臓を単離し、生理食塩水緩衝液で３回洗浄し、－２０℃で１２時間凍結し、基部から頂点まで０．５ｃｍスライスに細断した。スライスを生理食塩水緩衝液に溶解した１％ ＴＴＣ染料とともに３７℃で２０分間インキュベートし、次いで１０％パラホルムアルデヒドで２０分間洗浄した。画像は共焦点顕微鏡によって取得し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアで分析して、危険な領域からの健康な領域と薄い壊死領域とを区別し、危険な領域に対するパーセンテージとして壊死の領域を計算した。
共焦点顕微鏡：パラフィン包埋０．５μｍ心臓切片を抗ＭＭＰ－９（ＰＢＳ １．５％ ＢＳＡで１：５００に希釈）一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、スライドをＡＬＥＸＡ－ＦＬＵＯＲ－６４７（商標）でコンジュゲートした二次抗体とともに室温で１時間インキュベートした。スライドをＰＢＳで３回洗浄し、核の可視化のためにＨＯＥＣＨＳＴ（商標）を含むＰＢＳ培地にマウントした。Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５共焦点顕微鏡を使用して画像を撮影した。条件ごとに少なくとも３つの異なるフィールドを取得した。
測定。トロポニンＩの血漿レベルの測定：血漿トロポニンＩは、製造元の指示に従って、Ａｂｃａｍの市販キットヒト心筋トロポニン１ ＳＩＭＰＬＥＳＴＥＰ（商標）ＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。
組織学および免疫組織蛍光：エオシン－ヘマトキシリン染色によって心臓の形態を可視化し、マッソンのトリクローム染色によってコラーゲン沈着を検出した。ＭＭＰ－９の免疫組織化学的検出は、試料を対応する一次および二次抗体とインキュベートし、共焦点顕微鏡によって結合した蛍光標識二次抗体を検出することによって実施した。シグナルのデンシトメトリーによる測定は、非商用ソフトウェアＩｍａｇｅＪを使用することによって評価した。
統計分析：すべての値は、平均±標準偏差として与えられた。有意性は、５％レベルで報告される。共通の対照と比較するときはいつでも、ダネットのｔ検定の修正によって差異の有意性を試験した。
結果：
ＡｐＴＯＬＬは、再灌流後２４時間でトロポニンＩレベルを低減した。心筋トロポニンＩ（ＴｐｎＩ）は、虚血性損傷の検出に高い感度および特異性を有するため、伝えられるところでは狭心症の胸痛の研究に非常に役立ち、これは、それが急性冠症候群１を以前に診断されたまたは診断されていない患者において日常的に使用される理由である。ＴｐｎＩ値は、８時間の手順後、両方の動物群で等しく高かったが、２４時間後、ＡｐＴＯＬＬで処置した群では２９．５％の有意な減少があった（図５０）。
ＡｐＴＯＬＬは、再灌流後７日目までに心機能の回復を誘導した。再灌流の３日後および７日後に心機能が影響を受けたかどうかを評価するために、麻酔をかけたブタの心エコー検査によって以下のパラメーターを測定した。
ＩＶＳＤ：拡張末期の心室中隔の厚さ。
ＬＶＩＤＤ：拡張末期の左心室の内径。
ＬＶＰＷＤ：拡張末期の左心室後壁の厚さ。
ＩＶＳＳ：収縮末期の心室中隔の厚さ。
ＬＶＩＤＳ：収縮末期の左心室の内径。
ＬＶＰＷＳ：収縮末期の左心室後壁の厚さ。
ＥＦ：左心室駆出率。
ＦＳ：短縮率。
ＨＲ：心拍数。
ＣＯ：心拍出量。
再灌流後３日でのＡｐＴＯＬＬ投与に応答して差異は見られなかった（データは示されていない）。しかしながら、７日目までに、ＥＦおよびＦＳは、ＡｐＴＯＬＬに応答して有意に増加した（図５１）。
ＡｐＴＯＬＬは、再灌流後７日目までに左心室の壊死および線維症を低減した。この試験では、ＡｐＴＯＬＬが心筋壊死を効果的に低減できるかどうかを評価した。心臓の健康な灌流領域（健康な領域）、リスクのある灌流領域（リスクのある領域）、および梗塞の非灌流領域（壊死領域）を検出するために、外科的手順を実施した。この外科的アプローチにより、危険域を梗塞領域のパーセンテージとして使用することができ、それぞれの心臓のサイズおよび冠状閉塞が行われた特定の領域による差異を回避することができた。
治療の７日後、動物は二重カテーテル挿入を受け、一方の大腿動脈を通して０日目と同じ時点で前下行冠状動脈にアクセスして閉塞し、もう一方の大腿動脈を通して「ピッグテール」カテーテルで左心室にアクセスした。冠状動脈が０日目と同じ領域で閉塞されると、「エバンスブルー」染料をピッグテールカテーテルを通して左心室に注入し、それを動物に灌流することを目的とした。このようにして、特に心臓では、冠状動脈がバルーンによって閉塞されたときに危険にさらされている領域を除いて、組織の健康な領域が青色に染色された。最後に、動物を犠牲にした後、（塩化カリウムの注射によって）心臓を拡張期に単離し、厚さ０．５ｃｍの切片に横方向に細断した。切片を、非壊死細胞に内在化されたＴＴＣ試薬とインキュベートし、それらを赤色で染色し（危険域）、壊死細胞は染色に抵抗性であった（梗塞域、白色）。手順が実行されると、ＡｐＴＯＬＬで処置した動物において（危険な領域に関して）およそ２８％の梗塞領域の有意な低減を検出することが可能であった（図５２、左パネル）。図５２の右パネルは、ＡｐＴＯＬＬで観察された梗塞領域が、ビヒクルのみを使用した場合に観察されたものより４２％小さいことを示している。
心臓の心筋線維の完全性を可視化し、虚血およびその後の冠状動脈再灌流に応答した炎症の病巣の存在を評価するために、エオシン－ヘマトキシリン染色のために心臓を０．５ミクロンの断面にスライスし、浸潤物の数の低減とともに、ＡｐＴＯＬＬによる処置がどのように心筋組織の完全性を維持するかを検出した（図５３、パネルＡ）。マッソンのトリクローム染色は、プラセボ処置した動物の心臓における有意な心筋線維症を明らかにした（図５３、パネルＢ）。
ＡｐＴＯＬＬは、再灌流後７日目までにＭＭＰ－９の発現を阻害した。細胞外マトリックスの分解は、心筋のリモデリングおよび修復中の重要なステップである。有害なリモデリングのマーカーであるマトリックスメタロプロテアーゼ９（ＭＭＰ－９）は、細胞外マトリックス成分を分解するため、このプロセスで重要な役割を果たす。ＡｐＴＯＬＬで処置されたブタでは、再灌流後７日目までのＭＭＰ－９の発現は、特定の抗ＭＭＰ－９抗体を使用した共焦点顕微鏡免疫蛍光法により、前述の同じ心臓切片で検出されたように、プラセボ群と比較して４０％有意に低減した（図５４）。
結論：全体として、これらの結果は、ＡｐＴＯＬＬがＡＭＩの治療に好適な治療薬であることを示している。他の結果は、ＴＬＲ４が急性心筋梗塞（ＡＭＩ、心臓発作）の悪い転帰と相関していることを示していた。本研究は、ＡｐＴＯＬＬによる治療が、（ｉ）炎症プロセスを下方調節し、（ｉｉ）細胞外マトリックスの分解を低減し、したがって心筋リモデリングを改善し、心室の解剖学的構造および心機能を維持し、（ｉｉｉ）梗塞の進行を低減することによって心保護作用を誘導する。
実施例１３．ｑＰＣＲによるＡｐＴＯＬＬの組織分布
ＨＩＬＹＴＥ（商標）ＦＬＵＯＲ ４８８染料（０．４５ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルで標識されたＡｐＴＯＬＬを、異なる組織、すなわち心臓、肺、腎臓、脾臓、肝臓、小腸、大腸、膵臓、胸腺および上衣脂肪におけるアプタマーを定量化するために、Ｗｉｓｔａｒ雄ラット（８～１０週齢）に静脈内投与した。次の群を分析した。
－ＮＶ：ビヒクルで処置されたナイーブラット（ｎ＝２）。
－Ｎ－１ｈラット：ＡｐＴＯＬＬで処置されたナイーブラット（ｎ＝２）。注射後１時間で組織を収集した。
－Ｎ－２４ｈラット：ＡｐＴＯＬＬで処置されたナイーブラット（ｎ＝２）。注射後２４時間で組織を収集した。
－Ｉ－１ｈラット：閉塞の１０分後にＡｐＴＯＬＬで処置された虚血ラット（電気凝固によるｐＭＣＡＯ、ｎ＝２）。注射後１時間で組織を収集した。
－Ｉ－２４ｈラット：閉塞の１０分後にＡｐＴＯＬＬで処置されたナイーブラット（電気凝固によるｐＭＣＡＯ、ｎ＝２）。注射後２４時間で組織を収集した。
脳におけるＡｐＴＯＬＬ評価の特定の場合では、６匹の虚血性ラット（Ｗ１～６）および１匹のナイーブラットにＡｐＴＯＬＬを注射し（０．４５ｍｇ／ｋｇ、静脈内、閉塞後１０分）、１時間後に脳を収集した。すべての動物は、心臓灌流によって記載された時間に麻酔し、安楽死させた。組織を生理食塩水注入で洗浄し、収集し、すぐに－８０℃で凍結した。
研究の第２部では、それぞれの臓器の組織を解凍して重量を測定した。胸腺および心臓（心房）を除いて、それぞれの組織のおよそ１００ｍｇを１ｍＬのヌクレオゾール（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）で処理し、およそ５０ｍｇの重量で、５００μｌのヌクレオゾールを使用してＲＮＡを得た。すべての抽出について、ＲＮＡレベルを測定し、１．２％アガロースゲルでそれらの完全性を確認した。
ある量のＲＮＡ（２５μｌ）をＲＮＡｓｅ Ａで３０分間処理し、ＡｐＴＯＬＬレベルを、適切なプライマーを用いたｑＰＣＲによって、およびリアルタイムサーマルサイクラーＯｎｅ Ｓｅｐ Ｐｌｕｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）におけるキット「ＡｃｅＱ ｑＰＣＲ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、Ｖａｚｙｍｅ」を使用して測定した。漸増濃度のＡｐＴＯＬＬ－ＨＩＬＹＴＥ－４８８（０．００１～１０ｆｍｏｌｅ）を、標準パターンとして使用した。アプタマーの量／組織のｇを計算した。
結果および結論：
１．ＡｐＴＯＬＬは、ナイーブラットおよび虚血ラットの両方において、注射後１時間で主に腎臓、脾臓および肝臓に存在した。しかしながら、注射後２４時間で、ＡｐＴＯＬＬレベルはほとんど検出できなかった（図５５、パネルＡ、Ｂ）。
２．脳では、ＡｐＴＯＬＬは虚血性ラット（主に同側半球）で検出可能であったが、ナイーブラットでは検出できず、生理学的条件下でＡｐＴＯＬＬがＢＢＢを通過できなかったことを確認した（図５５、パネルＣ）。
概要および要約セクションではなく、詳細な説明セクションが、特許請求の範囲を解釈するために使用されることを意図していることを理解されたい。概要および要約のセクションは、発明者によって企図される本開示のすべてではないが１つ以上の例示的な実施形態を記載することができ、したがって、本開示および添付の特許請求の範囲をいかようにも限定することを意図しない。
本開示は、指定された機能の実装およびそれらの関係を説明する機能的構成要素の助けを借りて上で説明されてきた。これらの機能的構成要素の境界は、説明の便宜のために本明細書で任意に定義されている。指定された機能およびそれらの関係が適切に実施される限り、代替境界を定義することができる。
特定の実施形態の前述の説明は、他者が当業者の技術の範囲内で知識を適用することによって、過度の実験なしに、本開示の一般的な概念から逸脱することなく、特定の実施形態などの様々な用途に容易に修正および／または適合できるように、開示の一般的な性質を完全に明らかにするであろう。したがって、そのような適合および修正は、本明細書に提示される教示およびガイダンスに基づいて、開示された実施形態の同等物の意味および範囲内にあることが意図されている。本明細書における表現または用語は、説明を目的とするものであり、限定ではなく、本明細書の用語または表現は、教示およびガイダンスに照らして当業者によって解釈されるものであることが理解されるべきである。
本開示の幅および範囲は、上記の例示的な実施形態のうちのいずれによっても限定されるべきではなく、以下の特許請求の範囲およびそれらの同等物によってのみ定義されるべきである。

Claims (15)

  1. 急性心筋梗塞の少なくともある症状または後遺症の寛解または改善における使用のためのアプタマーであって、
    （ａ）前記アプタマーが、４０～１００ヌクレオチドの長さを有し、配列番号１、２、３、および４からなる群から選択され、
    （ｉ）前記アプタマーが、ＴＬＲ－４の細胞外ドメイン上のエピトープに特異的に結合し、
    （ｉｉ）前記エピトープへの前記アプタマーの結合が、ＴＬＲ－４活性化を低減および／もしくは阻害するか、または
    （ｂ）前記アプタマーが、配列番号１、２、３、もしくは４に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する前記（ａ）のアプタマーの機能的に同等の変異体であり、前記機能的に同等の変異体が、配列番号１、２、３、もしくは４から誘導され、ＴＬＲ－４に特異的に結合し、その活性化を低減および／もしくは阻害する能力を維持し、
    前記アプタマーが、前記急性心筋梗塞の最中、前、または直後に投与される、アプタマー。
  2. 前記アプタマーの前記投与が、梗塞領域の低減を引き起こす、請求項１に記載のアプタマー。
  3. 前記アプタマーの前記投与が、対照条件と比較して、少なくとも２５％の梗塞領域の低減を引き起こす、請求項２に記載のアプタマー。
  4. 前記アプタマーの前記投与が、前記急性心筋梗塞によって引き起こされる線維症および／または壊死の減少を引き起こす、請求項１に記載のアプタマー。
  5. 前記アプタマーの前記投与が、
    （ｉ）心機能の改善、
    （ｉｉ）細胞外マトリックスの分解の低減、
    （ｉｉｉ）心臓リモデリングの改善、
    （ｉｖ）心室の解剖学的構造の保存、
    （ｖ）前記梗塞の進行の低減、または
    （ｖｉ）それらの任意の組み合わせをもたらす、請求項１に記載のアプタマー。
  6. 神経筋または神経変性の疾患または状態の少なくともある症状または後遺症の寛解または改善における使用のためのアプタマーであって、
    （ａ）前記アプタマーが、４０～１００ヌクレオチドの長さを有し、配列番号１、２、３、および４からなる群から選択され、
    （ｉ）前記アプタマーが、ＴＬＲ－４の細胞外ドメイン上のエピトープに特異的に結合し、
    （ｉｉ）前記エピトープへの前記アプタマーの結合が、ＴＬＲ－４活性化を低減および／もしくは阻害するか、または
    （ｂ）前記アプタマーが、配列番号１、２、３、もしくは４に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する前記（ａ）のアプタマーの機能的に同等の変異体であり、前記機能的に同等の変異体が、配列番号１、２、３、もしくは４から誘導され、ＴＬＲ－４に特異的に結合し、その活性化を低減および／もしくは阻害する能力を維持し、
    前記アプタマーが、前記神経筋または神経変性の疾患もしくは状態の発症の最中、前、または後に投与される、アプタマー。
  7. 前記アプタマーの投与が、
    （ｉ）脱髄の低減、
    （ｉｉ）軸索損傷の低減、または
    （ｉｉｉ）それらの組み合わせを引き起こす、請求項６に記載のアプタマー。
  8. 前記アプタマーの前記投与が、対照条件（例えば、プラセボの投与）と比較して、少なくとも２０～８０％の脱髄の阻害を引き起こす、請求項７に記載のアプタマー。
  9. 前記アプタマーの前記投与が、対照条件（例えば、プラセボの投与）と比較して、少なくとも１０～３０％の軸索損傷の低減（すなわち、それに対する保護）を引き起こす、請求項７に記載のアプタマー。
  10. 前記アプタマーが、ＡｐＴＯＬＬである、請求項１または６に記載のアプタマー。
  11. 前記アプタマーが、約０．５ｍｇ／用量～約１０ｍｇ／用量の用量範囲で投与される、請求項１または６に記載のアプタマー。
  12. 前記アプタマーが、用量当たり約０．００７ｍｇ／ｋｇ～用量当たり約０．１４ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される、請求項１または６に記載のアプタマー。
  13. 前記アプタマーが、塩化マグネシウム六水和物を含み、任意選択でＡ－トレハロース二水和物を含む、ＰＢＳ（塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸水素二ナトリウム二水和物、およびリン酸二水素カリウム）ｐＨ７．４で製剤化される、請求項１または６に記載のアプタマー。
  14. 前記アプタマーが、注入によって静脈内投与される、請求項１または６に記載のアプタマー。
  15. 前記神経筋または神経変性の疾患または状態が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、および血管性認知症疾患からなる群から選択される、請求項６に記載のアプタマー。
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