CN106011140B - 反义microRNA-25及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及反义microRNA‑25、含有反义microRNA‑25碱基序列的载体、含有反义microRNA‑25的组合物，以及反义microRNA‑25的组合物作为干预关键氧化应激相关因子表达的药物的应用。与现有技术相比，本发明提供的反义microRNA‑25及其相应载体或组合物能够多靶点干预关键氧化应激相关因子表达，可用于抗氧化损伤、抗肿瘤、心衰、年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病等氧化应激相关疾病治疗或预防药物中。

Description

反义microRNA-25及其应用
技术领域
本发明涉及一种氧化应激相关分子，尤其是涉及反义microRNA-25及其应用。
背景技术
能够造成视力不可逆损伤的年龄相关性黄斑变性(Age Related MacularDegeneration，AMD)是一个复杂的多因性疾病，目前缺乏有效的针对病因的治疗措施。氧化应激是AMD的主要发病机制之一，视网膜色素上皮(Retinal Pigment Epithelium，RPE)细胞为其始发病变细胞。但是目前缺少对RPE细胞氧化损伤作用机制的研究。
发明内容
本发明的目的就是为了提供反义microRNA-25及其应用。
本发明在探究microRNA-25在RPE细胞的氧化损伤中的作用及机制的时候，发现以氯化钴(CoCl2)和糖氧剥夺模型(Oxygen Glucose Deprivation，OGD)两种手段模拟体外缺氧/氧化应激条件，分别研究两种形式的氧化损伤对原代RPE细胞和人RPE细胞系的microRNA-25表达的影响，在体外水平，明确氧化损伤对microRNA-25在RPE细胞中的诱导效应。以小鼠氧诱导的视网膜病变(Oxygen Induced Retinopathy，OIR)为体内缺氧/氧化应激模型，通过qRT-PCR方法检测神经视网膜以及RPE/脉络膜复合体的microRNA-25在常氧组和缺氧组的表达差异，通过体内实验进一步证实缺氧/氧化应激对microRNA-25的诱导效应。通过双荧光素酶报告实验验证与靶基因的体外相互作用，通过功能获得和缺失实验了解microRNA-25对下游靶基因的调控作用，通过人血管内皮的成管实验和RPE细胞的吞噬实验，探究microRNA-25在缺氧/氧化应激诱导的异常血管发生和RPE细胞吞噬功能损害中的影响，并通过对OIR小鼠模型的实验性治疗来进一步探究microRNA-25在氧化损伤中的作用。通过以上研究明确microRNA-25在RPE细胞氧化损伤中的作用和机制，分析其在AMD的发生发展中的功能。
基于以上研究，本发明提供一种反义microRNA-25，其为microRNA-25的反义RNA，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示，microRNA-25的序列如SEQ ID NO.2所示。
该反义microRNA-25可以采用人工合成的方法得到，该合成方法为常规技术手段。
本发明第二方面提供所述反义microRNA-25在制备抑制microRNA-25上调的药物中的应用。
本发明第三方面提供含有所述反义microRNA-25碱基序列的载体。
本发明第四方面提供含有所述反义microRNA-25的组合物。
本发明第五方面提供含有所述反义microRNA-25的组合物作为干预关键氧化应激相关因子表达的药物的应用。具体而言，含有反义microRNA-25的组合物用于制备预防和/或治疗抗氧化损伤、抗肿瘤、心衰、年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病的药物。
基于上述研究，可知反义microRNA-25可以抑制microRNA-25上调，而microRNA-25上调主要体现在氧化应激的条件下，因此，反义microRNA-25或含有反义microRNA-25序列的载体或含有反义microRNA-25的组合物可以作为干预关键氧化应激相关因子表达的药物使用，主要应用于治疗抗氧化损伤、抗肿瘤、心衰、年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病等疾病的预防和/或治疗药物。
与现有技术相比，本发明提供的反义microRNA-25及其相应载体或组合物能够多靶点干预关键氧化应激相关因子表达，可用于抗氧化损伤、抗肿瘤、心衰、年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病等氧化应激相关疾病治疗或预防药物中。
附图说明
图1为RPE细胞氧化应激与microRNA-25表达结果示意图；
图2为OIR小鼠模型中，microRNA-25在神经视网膜和RPE/脉络膜复合体中的表达结果示意图；
图3为OIR小鼠模型中，PEDF和VEGF在RPE/脉络膜复合体中的表达结果示意图；
图4为在PEDF的3'UTR区miR-25的靶向序列在几个物种中高度保守示意图；
图5为荧光素酶报告实验验证PEDF和ITGAV均为miR-25的可能靶基因；
图6为RPE细胞过表达miR-25后，PEDF和ITGAV的表达量变化示意图；
图7为反义miR-25预处理对OGD引起的ITGAV和PEDF改变的影响的示意图；
图8为反义miR-25预处理对OGD引起的吞噬抑制的影响示意图；
图9为反义miR-25预处理对OGD引起的成管能力增加的影响示意图；
图10为反义miR-25预处理对OIR模型中的新生血管渗漏增加的影响示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
一种反义microRNA-25，其为microRNA-25的反义RNA，其为microRNA-25的反义RNA，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示，microRNA-25的序列如SEQ ID NO.2所示。
该反义microRNA-25可以采用人工合成的方法得到，该合成方法为常规技术手段。
实施例2
本实施例以氯化钴(CoCl2)和糖氧剥夺模型(OxygenGlucoseDeprivation，OGD)两种手段模拟体外缺氧/氧化应激条件，分别研究两种形式的氧化损伤对原代RPE细胞和人RPE细胞系的microRNA-25表达的影响。
原代RPE细胞糖氧剥夺12，16，18，20小时，复氧2小时，通过qRT-PCR检测miR-25的表达，发现随糖氧时间剥夺的延长，miR-25表达增加。
原代RPE细胞以不同浓度的氯化钴溶液处理12小时后，通过qRT-PCR检测miR-25的表达，发现随着处理浓度的增加，miR-25表达上调。
原代RPE细胞以200μM的氯化钴溶液处理不同时间，通过qRT-PCR检测miR-25的表达，发现随着处理时间的延长，miR-25表达上调。
两种形式的缺氧/氧化应激(CoCl2和OGD)均能诱导原代RPE细胞中的microRNA-25上调。但人RPE细胞中的microRNA-25只能被OGD模型诱导(结果未列出)，可能是细胞系与原代细胞的差异或者是CoCl2和OGD的差异。
如图1所示，在RPE细胞氧化应激能够增加microRNA-25表达。(图1A的横坐标表示糖氧剥夺的时间，纵坐标表示miR-25在RPE细胞中的相对表达量；图1B的横坐标表示不同浓度的氯化钴溶液，ctr表示未处理组即正常对照组，纵坐标表示miR-25在RPE细胞中的相对表达量；图1C的横坐标表示200μM的氯化钴溶液处理不同时间，纵坐标表示miR-25在RPE细胞中的相对表达量)
实施例3
以小鼠氧诱导的视网膜病变(OxygenInducedRetinopathy，OIR)为体内缺氧/氧化应激模型，通过qRT-PCR方法检测神经视网膜以及RPE/脉络膜复合体的microRNA-25在常氧组和缺氧组的表达差异，通过体内实验进一步证实缺氧/氧化应激对microRNA-25的诱导效应。
OIR小鼠模型的构建方法：
将模型组小鼠于生后第7d时，随同2只哺乳母鼠放置到连接测氧仪的动物实验舱中，以1.5L/min的流量通入氧气(O2)，使氧浓度稳定控制在75％±2％。日光照明。每天定时规律地打开氧舱清扫、换敷料(保持干燥)、换食加水，并将在正常环境的哺乳母鼠与舱内母鼠更替。至小鼠生后第12d时将模型组小鼠及其哺乳母鼠返回正常空气环境(21％O2)中，以诱导小鼠视网膜新生血管产生。正常组小鼠始终放置在正常空气中喂养。
qRT-PCR方法：
1.总RNA抽提：
视网膜或脉络膜组织用匀浆仪进行匀浆处理后加入TRIzol，单层培养细胞直接在培养皿中加入TRIzol，用移液器吸打几次。
每使用1mlTRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。
4℃10000×g离心15分钟。
把水相转移到新管中，用同体积异丙醇沉淀RNA，室温放置10分钟。
4℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。
用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1mlTRIzol至少加1ml75℅乙醇。4℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清。晾5-10分钟，加DEPC水充分溶解后nanodrop测浓度。
2.具体逆转录方法参考Prime-ScriptRTreagentKit(D6110A.Takara)说明书。简述如下：首先配置A，B两个混合物，A混合物终体积为4μl，不足时用DEPC水不足，过量时，减少RNA用量，然后A混合物70℃10min，置于冰上2-3min，加入3μlB混合物，混匀，然后放入PCR仪，程序设定为30℃10min，42℃1hr，70℃15min，4℃，随机9具体引物可商品化购得，miR-25的特异性逆转录茎环引物由本实验室自行设计。
A混合物中，总RNA0.5μg，10μM随机引物2.5μl，5μM茎环引物1μl。
B混合物中，5×buffer 2μl，10mM dNTP 0.5μl，RTase 0.5μl。
3.实时荧光定量PCR
用SYBN-GREEN相对定量法，miRNA逆转录产物以u6作为内参基因，扩增普通的基因(即非miRNA)时，使用通用引物的逆转录产物，扩增miRNA及其内参基因时，使用由茎环引物和随机引物同时逆转录出来的产物，二者的反应体系略有不同，反应程序一致，具体如下：
miRNA逆转录产物的qPCR:
扩增miRNA的反应体系：
2×mix10μl
10μM上游引物3μl
10μM下游引物1.4μl
ddH2O3.6μl
cDNA2μl
扩增u6的反应体系，同扩增其它非miRNA基因一样。
目的基因相对表达量的计算，与扩增其它基因一样，采用2-△CT，或2-△△CT法，只与内参基因比较，最后获得相对内参基因的表达量的方法为2-△CT，而如果与内参基因比较后，再同对照组比较，最后获得的是相对于对照组的相对表达量的方法为2-△△CT法。
图2所示，在OIR小鼠模型，不论是RPE/脉络膜复合体还是神经视网膜，缺氧组microRNA-25的表达都显著高于常氧组，更进一步证实缺氧/氧化应激对microRNA-25的诱导效应。图2为qRT-PCR检测OIR模型小鼠，不同时间microRNA-25在视网膜(左侧图)的表达，以及在RPE/脉络膜复合体(右侧图)的表达，每组数据都表达为均数±标准误差，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01，NS表示无显著差异。(图2中，横坐标：采样时间点；纵坐标：miR-25在RPE/脉络膜复合体中的相对表达量：pd12：出生后12天；pd15：出生后15天；pd17：出生后17天；pd21：出生后21天；黑色柱形图：OIR(氧诱导的视网膜病变模型组)；白色柱形图：CTR(正常对照组)。
但是如图3所示，色素上皮衍生因子(PEDF)下降，血管内皮生长因子(英文：vascularendothelialgrowthfactor，简称：VEGF)。图3为qRT-PCR检测OIR模型小鼠，不同时间PEDF在视网膜(左侧图)的表达，以及VEGF在视网膜(右侧图)的表达，每组数据都表达为均数±标准误差，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01，NS表示无显著差异。
图3是通过qRT-PCR方法检测PEDF和VEGF在不同时间点，在正常对照组和OIR模型组中小鼠的RPE/脉络膜复合体中的相对表达量。
图3的左侧图中，横坐标：采样时间点；纵坐标：PEDF在RPE/脉络膜复合体中的相对表达量：pd12：出生后12天；pd15：出生后15天；pd17：出生后17天；pd21：出生后21天；黑色柱形图：OIR(氧诱导的视网膜病变模型组)；白色柱形图：CTR(正常对照组)
图3的右侧图中，横坐标：采样时间点；纵坐标：VEGF在RPE/脉络膜复合体中的相对表达量：pd12：出生后12天；pd15：出生后15天；pd17：出生后17天；pd21：出生后21天；黑色柱形图：OIR(氧诱导的视网膜病变模型组)；白色柱形图：CTR(正常对照组)
microRNA-25能够同时靶向色素上皮衍生因子(PEDF)和ITGAV。microRNA-25的种子序列与ITGAV的靶序列有10个碱基完全互补因此能够在mRNA水平上抑制ITGAV，而PEDF的3’UTR区只有6个碱基与microRNA-25种子序列互补(图4)，microRNA-25对PEDF的调控可能更多的存在于蛋白水平。PEDF是microRNA-25的靶基因目前尚无文献报道。经过荧光素酶报道分析，验证PEDF是microRNA-25的靶基因(图5)。在RPE细胞过表达能够引起PEDF和ITGAV降低(图6)
双荧光素酶报告实验的具体步骤:
1.3'UTR报告质粒的构建
首先设计大鼠PEDF的3’UTR引物，然后提取大鼠组织RNA，逆转录后PCR扩增：RNA提取和逆转录方法同前。将回收的DNA产物及psiCHECK-2各自用Not1，xoh1双酶切，体系如下：Not1，xoh1各1μl，10×H缓冲液2μl，0.1％BSA2μl，0.1％Triton-1002μl，DNA≤2μl，其余用ddH2O补足。2.5μgpsiCHECK-2质粒，酶切提示同DAN产物的酶切体系，酶切37℃，3小时，酶切结束后过柱纯化。酶切后的DNA片段和psiCHECK-2连接，体系如下：10×T4连接酶缓冲液2.5μl，DNA片段和载体DNA片段的摩尔比例控制在3～10：1，1μlT4连接酶，ddH2O补足。16℃连接过夜。连接产物转化：取100μl感受态，加10μl连接产物，轻轻混匀后放置冰上30min，放入42℃水浴中90s进行热休克，期间不要摇动试管；冰浴2min；向管中加入800μl的LB培养基(不含抗菌素)轻轻混匀，37℃摇床(100-150r/min)，温和震荡45min；将菌液离心，弃上清，留100μl上清，加至含100ug/mlAmp的LB平板培养皿中，用火焰灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。将其放置在37℃恒温培养箱中30-60min直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜；次日挑单克隆，摇菌，测序。阳性克隆，保种后大提质粒
2.双荧光素酶报告实验
293T细胞铺24孔板，细胞长至70％汇合时，用脂质体lipo2000，共转染ago-miR-25(miR-25激动剂)和psiCHECK-PEDF-3'UTR，ago-miR-25的终浓度为10nM，psiCHECK-PEDF-3'UTR终浓度为1nM，设置4个复孔，同样ago-miR-25和psiCHECK-ITGAV-3'UTR共转染，设置4个复孔，以psiCHECK-2的空载体作为阴性对照。转染后6小时，吸出转染液，更换为完全培养基(高糖DMEM，10％FBS)，48小时后，按双荧光素酶报告系统说明书操作，简介如下：每孔加100μl1×PLB裂解液，室温，温和摇15分钟，收裂解液，离心收取上清。白色不透光的96孔酶标板中每孔加刚刚裂解的上清液10μL，加入100μL预先混好的LARII，2s后测数据。每孔添加100μμL预先混好的Stop&Glo试剂，静止2s后，测数据。
图4表示在PEDF的3'UTR区miR-25的靶向序列(加亮区)在几个物种中高度保守。mmu:小家鼠，rno:大鼠，cfa:家犬，cpo：豚鼠
图5表示通过荧光素酶报告实验分析，PEDF(左侧图)和ITGAV(右侧图)是miR-25的靶基因。左侧图横坐标表示实验分组：psiCHECK-PEDF-3’UTR表示转染插入了PEDF的3’UTR序列的质粒组，psiCHECK表示转染空载体的对照组。黑色柱状图表示共转染miR-25序列组，白色柱状图表示共转染无关序列的阴性对照组。该结果提示与其它各组相比，只有同时转染miR-25和psiCHECK-PEDF-3’UTR的细胞的荧光素比值才会显著下降，提示二者存在相互作用。纵坐标表示相对荧光素酶活性。
右侧图横坐标表示实验分组：psiCHECK-ITGAV-3’UTR表示转染插入了ITGAV的3’UTR序列的质粒组，psiCHECK表示转染空载体的对照组。黑色柱状图表示共转染miR-25序列组，白色柱状图表示共转染无关序列的阴性对照组。该结果提示与其它各组相比，只有同时转染miR-25和psiCHECK-ITGAV-3’UTR的细胞的荧光素比值才会显著下降，提示二者存在相互作用。纵坐标表示相对荧光素酶活性。
图6表明RPE细胞过表达miR-25后，通过qRT-PCR方法检测，miR-25表达量明显上调，PEDF和ITGAV的表达量显著下降，提示miR-25能同时调节PEDF和ITGAV的表达。图6横坐标表示三种基因(miR-25，PEDF，ITGAV)，纵坐标表示三种基因的相对表达量。
在RPE细胞中抑制microRNA-25能够对抗OGD氧化损伤引起的PEDF分泌减少和ITGAV表达下降(图7)以及吞噬功能抑制(图8)。
图7左侧图表示qRT-PCR检测抑制miR-25对OGD引起的ITGAV下调的影响。每组数据都表达为均数±标准误；**表示和对照组相比P<0.01。横坐标表示三个分组，第一组为正常对照组(RPE细胞用阴性对照的无关序列转染预处理48小时，不给予OGD处理)，第二组为OGD处理组(RPE细胞用阴性对照的无关序列转染预处理48小时，给予OGD处理)，第三组为反义miR-25预处理组(RPE细胞用反义miR-25转染预处理48小时后，给予OGD处理)，纵坐标表示ITGAV的相对表达量。
图7左侧图实验步骤：首先根据实验分组，对RPE细胞转染相应的序列，使用(lifetechnology的lipo2000试剂)，转染48小时候，施加OGD处理，然后提总RNA，通过qRT-PCR检测ITGAV的相对表达量。
图7右侧图表示ELISA检测抑制miR-25对OGD引起的PEDF分泌减少的影响。每组数据都表达为均数±标准误；**表示和对照组相比P<0.01。横坐标表示三个分组，第一组为正常对照组(RPE细胞用阴性对照的无关序列转染预处理48小时，不给予OGD处理)，第二组为OGD处理组(RPE细胞用阴性对照的无关序列转染预处理48小时，给予OGD处理)，第三组为反义miR-25预处理组(RPE细胞用反义miR-25转染预处理48小时后，给予OGD处理)，纵坐标表示PEDF的含量，单位为ng/mL。分别收集三组细胞的转染阶段和OGD处理阶段的细胞培养基，通过ELISA试剂盒检测培养液中PEDF的含量，通过实验发现，OGD引起的PEDF分泌减少能够被反义miR-25预处理矫正。
图8表示通过吞噬实验检测抑制miR-25对OGD引起的吞噬抑制的影响。标尺为25μm，蓝色代表细胞核，紫色为紧密连接蛋白(ZO-1)，绿色表示RPE细胞内吞的外节，黄色为结合在RPE细胞膜上的外节。a图:RPE细胞用阴性对照的无关序列转染预处理48小时，不给予OGD处理；b:RPE细胞用阴性对照的无关序列转染预处理48小时，给予OGD处理；c:RPE细胞用阴性对照的无关序列转染预处理48小时，给予OGD处理。本实验结果提示，OGD引起的RPE细胞内吞和结合的外节减少可以被反义miR-25预处理矫正。
吞噬实验步骤：
首先制备猪外节，然后用NHS-LC-LC-生物素标记猪外节，将其按一定浓度与完全培养基混合，在OGD处理的复氧阶段，将原来的培养基更换为含有猪外节的培养基，孵育3－4小时，PBS洗3次，每次5分钟，然后用4％PFA，室温固定10分钟，然后PBS洗，充分去除残余的PFA，用1％BSAPBS溶液封闭10分钟，然后抗小鼠的Rhodopsin室温孵育半小时，PBS洗3次每次15分钟，彻底清楚残留的Rhodopsin，然后孵育抗兔的ZO-1，4℃过夜。次日，PBS洗3次，然后用0.1％TritonX-100PBS溶液透膜5-10分钟，然后与CY5-抗兔，CY3-抗小鼠和FITC－AVIDIN一起室温孵育1小时。DAPI染核，然后封片，激光共聚焦显微镜拍照。内吞进RPE细胞的外节发绿光，而结合在RPE细胞表面的外节由于结合了Rhodopsin可以发红光，同时外节标记的生物素又能与FITC-AVIDIN结合而发绿光。因此重叠图像显示，RPE细胞外的POS为黄色，而内吞进RPE的POS为绿色。RPE细胞的边缘，被ZO-1染出，带CY5荧光，人肉眼无法分辨，但激光共聚焦显微镜可以分辨出来。这样根据外节的位置及其所显示的颜色也能判断是内吞还是结合的外节。选择有代表性的视野，每个样本至少数50个细胞，计数总的吞噬外节数(绿色)，和结合的外节数(黄色)，但是由于专利附图为黑白图，在图中显示不到绿色和黄色，二者之差即为内吞的外节数。最后以每个细胞平均结合的外节数和内吞的外节数为指标来衡量，不同组的吞噬功能的差异。
OGD处理的RPE细胞，如果该组细胞未提前抑制microRNA-25，则其来源的条件培养基6小时生成的血管数量明显多于microRNA-25抑制组。这一结果提示，缺氧/氧化应激引起的促新生血管功能可能是microRNA-25部分依赖的，由于microRNA-25在缺氧/氧化应激中上调，通过靶向，抑制PEDF，发挥促新生血管的作用。使用IMAGEJ软件计数每组至少5-6个视野的血管分支数。
图9A，通过成管实验检测抑制miR-25对OGD引起的促新生血管作用。a:条件培养基来自第一组为正常对照组(RPE细胞用阴性对照的无关序列转染预处理48小时，不给予OGD处理)；b:条件培养基来自第二组为OGD处理组(RPE细胞用阴性对照的无关序列转染预处理48小时，给予OGD处理)；c:条件培养基来自第三组为反义miR-25预处理组(RPE细胞用反义miR-25转染预处理48小时后，给予OGD处理)。×10倍。
图9B，生成血管的统计，该图横坐标表示用来自3个实验组条件培养基培养人视网膜微血管内皮细胞，三个实验组分别为第一组为正常对照组(RPE细胞用阴性对照的无关序列转染预处理48小时，不给予OGD处理)，第二组为OGD处理组(RPE细胞用阴性对照的无关序列转染预处理48小时，给予OGD处理)，第三组为反义miR-25预处理组(RPE细胞用反义miR-25转染预处理48小时后，给予OGD处理)。收集三组细胞的转染阶段和OGD处理阶段的细胞培养基做为成管实验的条件培养基。纵坐标表示平均每个视野的血管分支数，值越大，代表成管能力越强。本结果提示，只转染阴性无关序列，然后给予OGD处理RPE细胞后收集的条件培养基具有较强的成管能力，但预先转染miR-25的反义序列，在给予OGD处理，该组条件培养基的成管能力显著下降，可能与PEDF的分泌量恢复(图7右侧图)有关。
图9成管实验具体方法：
1.人视网膜微血管内皮细胞(HumanRetinalMicrovascularEndothelialCells，HRMEC)的培养。该原代细胞购于Angio-Proteomie(MA，USA)，培养基为ECM，5％FBS，1％P/S，在铺细胞之前，培养皿要用1-5μg/cm2的牛血浆纤连蛋白包被，37℃孵育2小时后，回收纤连蛋白溶液，再用ddH2O冲洗一遍，然后即可铺细胞，包被好的培养皿不能储存留待以后用。回收的纤连蛋白溶液，放于4℃保存，可重复用1－2次。
2.matrigel基质胶，4℃融化，按150μl/孔，均匀包被预冷过的48孔板，37℃放置1小时后，备用。
3.HRMEC胰酶消化，用完全培养基重悬，按2-3×104/孔的浓度铺板，细胞培养箱孵育1小时后，将完全培养基替换为条件培养基，每隔2小时观察一次，以便及时发现处理组和对照组的差别。
图10中上排的三幅图表示通过视网膜铺片观察抑制miR-25对OIR引起的新生血管渗漏的影响。a：常氧组+注射阴性对照病毒；b:OIR组+注射阴性对照病毒；c：OIR组+注射lenti-anti-miR-25。×5倍。
图10下排的两幅图表示利用PHOTOSHOP3.0标记新生血管渗漏区。b:OIR组+注射阴性对照病毒；c：OIR组+注射lenti-anti-miR-25，×5倍。
图10具体实验步骤：
构建OIR小鼠模型，出生后12天时进行视网膜下腔注射lenti-anti-miR-25和阴性对照病毒(可从公司购买也可以自己制备)，左右眼自身对照；常氧注射阴性对照病毒。5天后小鼠进行心脏灌注，做视网膜铺片。观察视网膜缺血，新生血管等情况。
视网膜下腔注射：
刚出氧舱的OIR小鼠(pd12)，立刻用1％avertin(用0.9％的生理盐水配置)，按0.1ml/10g的剂量腹腔注射麻醉，然后进行视网膜下腔注射浓缩的Lenti-anti-miR-25，以及阴性对照Lenti-anti-ctr，各2μl，左右眼自身对照。处理后的小鼠注意保温，pd12小鼠尚未完全睁眼，所以需要小心剪开连着的眼睑，注意避免出血，阻碍注射视野并伤害小鼠。
心脏灌注，视网膜铺片：
首先将5％葡萄糖溶液和PBS缓冲液按4：1的体积比混合，并过滤，配置成细胞膜红色荧光探针(Dil)溶解液。
按每100mgDil加16.7ml的100％乙醇的比例，配置Dil的储存液，避光室温，温和摇床过夜。要灌注之前将Dil的储存液用溶解液50倍稀释，配置成工作液。
将小鼠用avertin麻醉，四肢固定，剪开胸腔，进行左心室灌注，先用PBS灌注，待物血液流出时，灌注Dil工作液(每只小鼠5ml灌注液)，然后再灌注4％PFA。灌注后，取下眼球，可以泡在PBS中4℃存放，也可以马上在体视显微镜下，去除眼前节，小心取出视网膜，在载玻片上剪成6瓣，然后用加抗猝灭的封片剂封片，拍照。一旦视网膜铺片完成，就要马上在荧光显微镜下观察，不能4℃存放，防止染料泄露。
一定程度的氧化损伤通过上调microRNA-25促进RPE细胞异常增殖，减少PEDF的分泌，抑制RPE细胞的吞噬功能，从而促进了AMD的发生和发展。靶向RPE的抗microRNA-25的干预方法可能是个有效的针对病因的AMD治疗手段。靶向microRNA-25也是治疗异常新生血管的一个策略。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种含有反义microRNA-25的组合物在制备预防和/或治疗年龄相关性黄斑变性的药物的应用，其特征在于，所述microRNA-25的反义RNA的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种含有反义microRNA-25碱基序列的载体在制备干预年龄相关性黄斑变性的药物的应用，其特征在于，所述microRNA-25的反义RNA的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
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