KR101607422B1 - 안정된 미셀을 위한 블록 공중합체 - Google Patents

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    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

본 발명은, 중합체 화학의 분야 및 보다 특히 멀티블록 공중합체(multiblock copolymers) 및 이를 포함하는 미셀에 관한 것이다. 본원에서 조성물은 약물-전달 적용에 유용하다.

Description

안정된 미셀을 위한 블록 공중합체{BLOCK COPOLYMERS FOR STABLE MICELLES}
관련된 출원에 대한 상호 참조
본 출원은, 이의 전체가 각각 본원에 의해 참고문헌으로 포함되는, 2012년 4월 11일에 출원된, 미국 가출원 시리즈 번호 61/622,755, 및 2012년 6월 14일에 출원된 미국 가출원 시리즈 번호 61/659,841에 대한 우선권을 청구한다.
본 발명의 분야
본 발명은 중합체 화학의 분야 및 보다 특히 멀티블록 공중합체(multiblock copolymers) 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 배경 기술
신규한 치료학적 제제의 개발은, 다양한 질환으로부터 고통받는 환자의 삶의 질 및 생존률을 극적으로 향상시킨다. 그러나, 이들 치료의 성공률을 개선하기 위해 약물 전달 혁신(drug delivery innovations)이 필요하다. 구체적으로, 치료학적 제제의 이른 배출(premature excretion) 및/또는 대사를 효과적으로 최소화하고, 질병에 걸린 세포에 특이적으로 이러한 제제를 전달하여 건강한 세포에 대한 이들의 독성을 감소시키는 이러한 제제를 전달하는 전달 시스템을 여전히 필요로 한다.
합리적으로 고안된, 나노스코픽 약물 캐리어(nanoscopic drug carriers), 또는 "나노벡터(nanovectors)"는 다수의 생물학적 장벽을 극복하기 위한 이들의 내재적 능력에 기인하여 이들 목적을 달성하는 유망한 접근법을 제공한다. 게다가, 이들의 멀티-작용성(multi-functionality)은 세포-타겟팅 기(cell-targeting groups), 진단학적 제제(diagnostic agents), 및 단독 전달 시스템에서 다수의 약물의 도입을 가능하게 하였다. 작용성, 양쪽성(amphiphilic) 블록 공중합체의 상기 분자 배열에 의해 형성된, 중합체 미셀은 멀티작용성 나노벡터 중 하나의 중요한 타입을 나타낸다.
중합체 미셀은, 여러 가지의 약물(예를 들어, 소 분자, 단백질 및 DNA/RNA 치료학적 제제)의 큰 적재(large payloads)을 수송하는 이들의 능력, 그 밖의 콜로이드성 담체(예를 들어, 리포솜)과 비교된 바와 같은 이들의 향상된 생체내 안정성, 및 향상된 투과 및 지연(EPR) 효과에 의해, 고형 종양과 같은 질병에 걸린 조직에 수동적인 축적(passive accumulation)을 가능하게 하는 이들의 나노크기(nanoscopic size)로 인하여, 특히 매력적이다. 적절한 표면 기능성을 사용하여, 중합체 미셀은, 개선된 세포-특이적인 전달을 결과적으로 나타내는 세포의 입장에서 도움이되고, 활동적으로 타겟 질병걸린 세포를 타겟팅할 수 있는, 침투 증진제(permeation enhancer) 및 세포-타겟팅 기와 추가적으로 꾸며진다(decorated).
자가 조립(self assembly)이 나노벡터의 상향식 설계(bottom-up design)에 대해 통상적인 방법을 나타내면서, 중합체 미셀의 조립을 추진하고 지속하는 힘은, 농도 의존적이고, 내재적으로 가역성(reversible)이다. 임상적인 적용에서, 중합체 미셀은 투여된 다음에 빠르게 희석되고, 미셀-불안정성 혈액 구성성분(예를 들어, 단백질, 지질 및 인지질)의 높은 농도와 함께, 이의 가역성은, 활성 또는 수동적인 타겟팅을 효과적으로 성취되기 전에 상기 약물-로딩된 미셀의 조기 분해를 유도한다. 이들의 세포-타겟팅 잠재력을 완전히 도달하고, 이들의 계획된 멀티-작용성을 이용하기 위한 중합체 미셀을 위해, 생체내 순환 시간이 개선되어야 한다. 생물학적 장벽[예를 들어, 세망내피계(reticuloendothelial system, RES) 흡수]를 피할 수 있고, 고형의 종양과 같은 질병에 걸린 조직에서 마주치는 생리학적 환경에 반응하는 약물을 전달할 수 있는, 약물 전달 비히클(Drug delivery vehicles)이 필요하다.
1. 일반적인 설명:
하나의 실시형태에 따라, 본 발명은, 소수성 D,L-혼합된 폴리(아미노산) 블록, 및 중합체성 친수성 블록(polymeric hydrophilic block), 임의적으로 교차결합 가능한 또는 교차결합된 폴리(아미노산 블록)을 포함하는 멀티블록 공중합체를 포함하는 미셀을 제공하고, 상기 미셀은 내부 코어(inner core), 임의적으로 교차결합 가능한 또는 교차결합된 외부 코어, 및 친수성 셀(hydrophilic shell)을 가지는 것을 특징으로 한다. 상기 중합체성 친수성은 상기 친수성 셀에 대응하고, 상기 임의적으로 교차결합 가능한 또는 교차결합된 폴리(아미노산 블록)은 임의적으로 교차결합된 외부의 코어에 대응하고, 상기 소수성 D,L-혼합된 폴리(아미노산) 블록은 상기 내부의 코어에 대응함이 예측될 것이다.
본원에 기재된 바와 같은, 상기 "소수성 D,L-혼합된 폴리(아미노산)" 블록은, 모이어티의 캡슐화를 가능하게 하도록, D 및 L 거울상 이성질체의 혼합물로 이루어져 있다. 단일 입체이성질체로 이루어진, 아미노산의 동종 중합체(homopolymers) 및 공중합체가 α-헬릭스 및 β-시트와 같은 이차 구조를 나타낼 수도 있음을 잘 확립되어 있다. a- Aminoacid -N- Caroboxy - Anhydrides and Related Heterocycles, H.R. Kricheldorf, Springer-Verlag, 1987를 참고하라. 예를 들어, 폴리(L-벤질 글루타메이트)는 α-나선형 배열(α-helical conformation)을 일반적으로 나타내고; 그러나, 이러한 이차 구조는 용매 또는 온도의 변화에 의해 지장을 받을 수 있다(Advances in Protein Chemistry XVI, P. Urnes and P. Doty, Academic Press, New York 1961을 참고하라). 상기 이차 구조는, 불규칙 나선 형태와 함께 폴리(아미노산)을 결과적으로 나타내는, 다른 입체 화학(dissimilar stereochemistry)(예를 들어, D 및 L 입체이성질체의 혼합물)과 아미노산의 결합을 통해, 또는 β-시트 형성하는 아미노산(예를 들어, 프롤린)과 같은 구조적으로 다른 아미노산의 결합에 의해 또한 방해될 수 있다. Sakai, R.; Ikeda; S.; Isemura, T. Bull Chem . Soc . Japan 1969, 42, 1332-1336, Paolillo, L.; Temussi, P.A.; Bradbury, E.M.; Crane-Robinson, C. Biopolymers 1972, 11, 2043-2052, and Cho, I.; Kim, J.B.; Jung, H.J. Polymer 2003, 44, 5497-5500를 참고하라.
폴리(아미노산)의 2차 구조에 영향을 주는 방법이 얼마전부터 공지되고 있고, 이는 불규칙 나선 형태를 포함하는 블록 공중합체가, 나선의 부분(helical segment)을 포함하는 유사한 블록 공중합체와 비교한 경우에, 소수성 분자 및 나노입자의 캡슐화를 위해 특히 유용함이 놀랍게도 발견하였다. US 특허 출원 2008-0274173를 참고하라. 어떠한 특정한 이론에 얽매이지 않고, 코일-코일 배열을 갖는 제공된 블록 공중합체가 상기 미셀 코어 내로 소수성 모이어티의 로딩 및 효율적인 패킹(efficient packing)을 가능하게 하지만, 나선-포함하는 블록 공중합체에 대한 로드-코일 형태(rod-coil conformation)의 입체적인 요구가 더 적은 효과적인 캡슐화를 결과적으로 나타낸다.
중합체 미셀 및 리포솜과 같은, 콜로이드성 약물 캐리어의 수성 조립체를 유도하는 소수성 작용은, 상대적으로 약하고, 이러한 조립된 구조는, 상기 중요한 미셀 농도(critical micelle concentration, CMC)로서 알려진 한정된 농도 이하로 분리된다. 중합체 미셀의 상기 CMC 수치는, 약물-로딩된 콜로이성 담체가 투여 후에 혈류에서 희석되고, 상기 CMC (μM 또는 미만)에 빠르게 도달하기 때문에, 임상적인 적용에서 매우 중요한 것이다. 이러한 희석 효과는 상기 타겟팅 영역의 외부에 미셀 분리 및 약물 방출을 유도할 것이고, 어떠한 이익은 상기 미셀 크기(EPR 효과)와 연관되거나 또는 유효 타겟팅(active targeting)은 잃게 될 것이다. 1990 년대를 통한 연구의 상당한 성과가 매우-낮은 CMC 수치(nM 또는 미만)를 갖는 중합체 미셀을 확인하는 것에 집중되어 있으면서, Maysinger (Savic et. al., Langmuir, 2006, p3570-3578) 및 Schiochet (Lu et. al., Macromolecules, 2011, p6002-6008)에서는, 염분(saline)에서 상기 CMC 수치가 혈청이 있고 없는 경우에, 중합체 미셀에 대한 상기 CMC 수치가 두 자릿수(two orders of magnitude)로 이동됨을 나타내는 생물학적으로 관련된 CMC의 개념이 재정의되었다.
이들의 코어-셀 형태학에 더하여, 중합체 미셀은, 현재 및 미래의 치료학적 제제의 이익을 최대화하기 위해, 수동적이고 활동적인 세포-타겟팅을 가능하게 하도록 변형될 수 있다. 약물-로딩된 미셀은 일반적으로 20 nm 초과의 직경을 가지기 때문에, 이들은, 신장 청소(renal clearance)의 최소화로 인하여, 독립형의 약물(stand-alone drugs)과 비교한 경우에, 극적으로 증가된 순환 시간을 나타낸다. 나노벡터 및 중합체성 약물의 이러한 독특한 특징은, 증진된 침투 및 유지 효과("EPR")로 인하여, 질병이 걸린 조직, 특히 암 조직(cancerous tissue) 에서 선택적인 축적을 유도한다. 상기 EPR 효과는, 상기 종양 부위에서 중합체의 치료학 및 약물 유지의 증가된 투과성을 결과적으로 나타내는, 상기 종양 맥관구조(tumor vasculature)의 조직파괴된 성질(disorganized nature)의 결과이다. 상기 EPR 효과에 의해 수동적인 세포 타겟팅에 더하여, 미셀은 상기 미셀 주변에 타겟팅 기의 화학적인 부착을 통해 종양 세포를 유효하게 타겟팅하도록 설계되었다. 이러한 기의 결합은, 화학적인 접합 기술을 사용하여 상기 친수성 블록의 말단-기 작용화(end-group functionalization)를 통해 주로 성취된다. 바이러스성 입자처럼, 타겟팅 기로 작용화된 미셀은, 투여 후에 상기 미셀의 공간의 분포를 통제하고, 추가적으로 치료법의 세포-특이적인 전달을 증진시키는, 수용체-리간드 상호작용을 이용한다. 암 치료에서, 타겟팅 기는, 폴산(folic acid), 올리고펩티드, 당, 및 모노클로날 항체와 같은 정상의 조직과 비교하여 암 조직에서 과잉-발현되는 수용체와 상호작용하도록 설계된 것이다. Pan, D.; Turner, J. L.; Wooley, K. L. Chem. Commun . 2003, 2400-2401; Gabizon, A.; Shmeeda, H.; Horowitz, A.T.; Zalipsky, S. Adv . Drug Deliv . Rev . 2004, 56, 1177-1202; Reynolds, P. N.; Dmitriev, I.; Curiel, D. T. Vector. Gene Ther. 1999, 6, 1336-1339; Derycke, A. S. L.; Kamuhabwa, A.; Gijsens, A.; Roskams, T.; De Vos, D.; Kasran, A.; Huwyler, J.; Missiaen, L.; de Witte, P. A. M. T J. Nat . Cancer Inst . 2004, 96, 1620-30; Nasongkla, N., Shuai, X., Ai, H.,; Weinberg, B. D. P., J.; Boothman, D. A.; Gao, J. Angew . Chem . Int . Ed . 2004 , 43, 6323-6327; Jule, E.; Nagasaki, Y.; Kataoka, K. Bioconj . Chem . 2003 , 14, 177-186; Stubenrauch, K.; Gleiter, S.; Brinkmann, U.; Rudolph, R.; Lilie, H. Biochem . J. 2001, 356, 867-873; Kurschus, F. C.; Kleinschmidt, M.; Fellows, E.; Dornmair, K.; Rudolph, R.; Lilie, H.; Jenne, D. E. FEBS Lett . 2004, 562, 87-92; and Jones, S. D.; Marasco, W. A. Adv . Drug Del . Rev . 1998 , 31, 153-170를 참고하라.
미셀 약물 캐리어에서 많은 양의 작업에도 불구하고, 작은 노력이 희석에 대한 이들의 생체내 안정성을 개선하는데 초점이 맞춰져 있다. 체내에서 미셀 희석의 진정한 효과가, 보다 큰 동물 연구에서 활용될 때까지 완전하게 실현화되지 않음이 하나의 잠재적인 이유이다. 마우스의 대사가 보다 큰 동물보다 더 크기 때문에, 이들은, 랫 또는 개와 같은 보다 큰 동물과 비교한 경우에 상당히 보다 높은 투여량의 독성 약물을 받아들일 수 있다. 따라서, 약물 로딩된 미셀이 투여되고, 상기 전체적인 혈액량을 통해 완전하게 희석된 경우에, 상기 이에 해당하는 중합체 농도가 상기 마우스 모델에서 항상 가장 높을 것이다. 따라서, 생물학적 배지 내에 희석에 대한 안정화되는(교차결합되는) 미셀을 제조하는 것이 매우 바람직할 것이다.
본 발명에서, 상기 임의적으로 교차결합 가능한 또는 교차결합된 폴리(아미노산 블록)은 금속 이온과 강하게 결합하거나 배위결합하는 화학적인 작용성으로 이루어져 있다[the optionally crosslinkable or crosslinked poly(amino acid block) is comprised of chemical functionality that strongly binds or coordinates with metal ions]. 하나의 특정한 예는 히드록삼산 및 철(III)이다. 또 다른 예는 철과 함께 오르토-치환된 디히드록시 벤젠 기(ortho-substituted dihydroxy benzene groups)[catechols(카테콜)]이다. 히드록삼산 및 카테콜 모이어티 둘 다는, 사이드로포어(siderophore)에서 일반적인, 미생물에 의해 생성된 높은-친화력 철 킬레이트제이다. 게다가, 히드록삼산 변형된 폴리(아크릴레이트)가 철(III)과 함께 처리된 후에 교차결합된 겔을 형성할 수 있음이 보고되어 있다(Rosthauser and Winston, Macromolecules, 1981, p538-543). 어떠한 특정한 이론에 얽매이지 않고, 상기 미셀의 외부 코어에서 히드록삼산 및 카테콜과 같은 높은 친화력의 금속 킬레이트 기(metal chelating group)의 결합한 후에, 금속 이온으로 처리하여 생물학적 배지 내에 분포가 안정적인 미셀이 결과적으로 나타날 것으로 여겨진다.
이전의 작업은, 미셀 안정성을 제공하도록, 금속 이온과 상호작용하도록 카르복실산을 사용하였다. US 특허 출원 2006-0240092를 참고하라. 히드록삼산-변형된 중합체의 사용이 생물학적 배지 내에 분포에 대해 상기 중합체 미셀을 가역적으로 안정화시키는데 효과적임을 놀랍게도 발견하였다. 이러한 히드록삼산 화학은, 철(예를 들어, 카르복실산)과 결합하는 것으로 알려진 하나 또는 그 이상의 화학적인 작용성을 소유하는 약물을 캡슐화한 경우에, 특히 효과적임이 입증되었다. 어떠한 특정한 이론에 얽매이지 않고, 상기 미셀을 안정화하는데 사용된 상기 금속 이온이, 안정화된 미셀을 결과적으로 나타내는, 히드록삼산 및 카테콜과 같은 높은 친화력의 금속 킬레이트 기(metal chelating group)에 우선적으로 결합할 것으로 보인다. 게다가, 철(III)과 히드록삼산 모이어티 사이의 킬레이트화 반응이, 빠른 교차결합 단계를 가능하게 하도록, 몇 초 내에 진행된다.
2. 정의:
본 발명의 화합물은 상기 일반적으로 기재된 것들을 포함하고, 실시형태, 하부-실시형태, 및 여기에 기재된 종들에 의해 추가적으로 설명된다. 다른 방식으로 언급하지 않는 한, 본원에 사용되는 바와 같이, 하기의 정의가 적용될 것이다. 본 발명을 설명하기 위해, 화학 원소는 Handbook of Chemistry and Physics, 75th Ed, CAS 버전, 원소의 주기율표에 따라 확인된다. 추가적으로 유기 화학의 일반적인 원리는, 이의 전체 내용이 참고문헌으로 본원에 포함된, "Organic Chemistry", Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999, and "March's Advanced Organic Chemistry", 5th Ed., Ed.: Smith, M.B. and March, J., John Wiley & Sons, New York: 2001에 기재되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "연속적인 중합반응(sequential polymerization)" 및 이의 변형은, 공정이 결과적인 멀티-블록 공중합체 내로 추가적인 아미노산 블록을 도입하도록 유사한 방식으로 지속될 수도 있는, 첫 번째 단량체(예를 들어, NCA, 락탐, 또는 이미드)가 상기 중합체 내에 포함된 후에, 이와같이 아미노산 "블록(block)" 두 번째 단량체(예를 들어, NCA, 락탐, 또는 이미드)가 두 번째 아미노산 블록을 형성하기 위해 상기 반응에 첨가되는 반응을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "멀티블록 공중합체(multiblock copolymer)"는, 하나의 합성 중합체의 일부 및 2개 이상의 폴리(아미노산) 일부를 포함하는 중합체를 나타낸다. 이러한 멀티-블록 공중합체는 서식 W-X-X'을 갖는 것들을 포함하고, 이 식에서, W는 합성 중합체 일부이고, X와 X'는 폴리(아미노산) 사슬 또는 "아미노산 블록"이다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 멀티블록 공중합체는 트리블록 공중합체이다. 본원에 기재된 바와 같이, 하나 또는 그 이상의 아미노산 블록은, 이들 블록이 아미노산 단량체의 혼합물을 함유하여 본 발명의 멀티블록 공중합체를 생성할 수 있는 것을 의미하는 "혼합된 블록(mixed blocks)"일 수도 있다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 멀티블록 공중합체는 혼합된 아미노산 블록을 포함하고, 테트라블록 공중합체(tetrablock copolymer)이다.
본 분야의 숙련자는, 단량체 반복 단위가 반복 단량체 단위 주변에 의해 정의됨을 인지할 것이다. 괄호의 보다 작은 오른쪽에서의 숫자(또는 숫자 범위를 나타내는 문자)는 중합체 사슬에 존재하는 단량체 단위의 수를 나타낸다. 오직 하나의 단량체가 블록(예를 들어, 동종중합체)을 나타내는 경우에, 상기 블록은 괄호에 의해 단독으로 표시될 것이다. 혼합된 블록의 경우에, 다수 단량체들은 단독, 연속 블록을 포함한다. 브래킷(brackets)이 일부 또는 블록을 정의할 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 하나의 블록은 4개의 개별적인 단량체로 이루어질 수도 있고, 괄호의 이들의 자체의 개별적인 세트 및 반복 단위의 수가 존재한다. 괄호의 모두 네 가지의 세트가 브래킷의 세트에 의해 둘러싸질(enclosed) 것이고, 혼합된 블록을 포함하기 위해, 임의적인, 또는 거의 임의로(near random) 조합되는 것을 의미한다. 명확하게 하기 위해서, [BCADDCBADABCDABC]의 임의로 혼합된 블록은 [(A)4(B)4(C)4(D)4]의 약칭으로 나타낼 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 본원에 기재된 상기 단량체 반복 단위는, 상기 중합체 사슬을 포함하는 단량체 단위의 평균 수를 나타내는 절대값(numerical value)이다. 예를 들어, (A)10에 의해 나타낸 중합체는, 함께 연결된 10 개의 "A" 단량체 단위로 이루어진 중합체에 해당한다. 본 분야의 숙련자는, 이러한 경우에 숫자 10이 평균 10 과 함께 숫자의 분포를 나타낼 것임을 인지할 것이다. 이러한 분포의 폭은 다분산지수(polydispersity index, PDI)에 의해 나타낸 것이다. 1.0의 PDI는 각각의 사슬의 길이가 정확하게 동일한(예를 들어, 단백질) 것인 중합체를 나타낸다. 2.0의 PDI는 상기 사슬 길이가 가우스 분포를 가지는 중합체를 나타낸다. 본 발명의 중합체는 일반적으로 1.20 미만(less than)의 PDI를 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "트리블록 공중합체(triblock copolymer)"는 하나의 합성 중합체 일부 및 2 개의 폴리(아미노산) 일부를 포함하는 중합체를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "테트라블록 공중합체"는 하나의 합성 중합체 일부 및 2 개의 폴리(아미노산) 일부를 포함하는 중합체를 나타내고, 1 개의 폴리(아미노산) 일부는, 하나의 합성의 중합체 일부 및 세 개의 폴리(아미노산) 일부를 포함하는 중합체 또는 혼합된 블록이다.
본원에 사용된 바와 같은, 본 발명의 미셀에 적용되는 바와 같은 "내부 코어(inner core)"는, 소수성 D,L-혼합된 폴리(아미노산) 블록에 의해 형성되는 미셀의 중앙을 나타낸다. 본 발명에 따라, 상기 내부 코어는 교차 결합되지 않는다. 설명을 통해, 상기 기재된 바와 같이 서식 W-X'-X"의 트리블록 중합체에서, 상기 내부 코어는 X" 블록에 상응한다.
본원에 사용된 바와 같은, 본 발명의 미셀에 적용되는 용어 "외부 코어(outer core)"는, 제1 폴리(아미노산) 블록에 의해 형성된 층을 나타낸다. 상기 외부의 코어는 상기 내부의 코어 및 친수성 셀 사이에 놓여있다. 본 발명에 따른, 상기 외부 코어는 교차결합될 수 있거나 교차-결합된 것이다. 설명에 의해, 상기에 기재된 바와 같이, 상기 서식 W-X'-X"의 트리블록 중합체에서, 상기 외부의 코어는 상기 X' 블록에 대응한다. 상기 X' 블록은 혼합된 블록일 수 있음을 고려한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약물-로딩된(drug-loaded)" 및 "캡슐화된(encapsulated)" 및 그 파생어들은 상호 교환되어 사용된다. 본 발명에 따라, "약물-로딩된" 미셀은, 미셀의 코어 내부에 위치하는, 약물(drug) 또는 치료학적 제제(therapeuctic agent)를 갖는 미셀을 나타낸다. 특정의 예에서, 상기 약물 또는 치료학적 제제는 코어와 친수성 코로노아(coronoa) 사이 계면(interface)에 위치한다. 또한, 이러한 것은, 상기 미셀 내로 "캡슐화됨"것인, 약물 또는 치료학적 제제로서 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "중합체성 친수성 블록(polymeric hydrophilic block)"은, 폴리(아미노산)이 아니고, 본래 친수성인 중합체를 나타낸다. 이러한 친수성 중합체는 공지 기술로 널리 알려져 있고, 폴리에틸렌옥시드(polyethyleneoxide)(폴리에틸렌글리콜 또는 PEG로서 나타냄) 및 이의 유도체, 폴리(N-비닐-2-피롤리돈), 및 이의 유도체, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드), 및 이의 유도체, 폴리(히드록시에틸아크릴레이트), 및 이의 유도체, 폴리(히드록실에틸 메타크릴레이트)(poly(hydroxylethyl methacrylate)), 및 이의 유도체, 및 N-(2-히드록시프로포일)메타크릴아미드(N-(2-hydroxypropoyl)methacrylamide)(HMPA) 및 이의 유도체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리(아미노산)(poly(amino acid))" 또는 "아미노산 블록(amino acid block)"은, 공유 결합된 아미노산 사슬을 나타내고, 각각의 단량체는 아미노산 단위이다. 이러한 아미노산 단위는 천연 및 비천연 아미노산을 포함한다. 특정 실시형태에서, 임의적으로 교차결합 가능한 또는 교차결합되는 폴리(아미노산 블록)의 각각의 아미노산 단위는 L-형상(L-configuration)이다. 이러한 폴리(아미노산)은 적합하게 보호된 작용기(functional groups)를 갖는 것을 포함한다. 예를 들어, 아미노산 단량체는, 적절하게 히드록실 보호기(hydroxyl protecting group) 또는 아민 보호기(amine protecting group)에 의해 임의적으로 보호되는, 히드록실 또는 아미노 모이어티(moieties)를 가질 수도 있다. 이러한 적당한 히드록실 보호기 및 아민 보호기는 하기에 보다 자세히 설명된다. 본원에 사용된 바와 같이, 아미노산 블록은 하나 이상의 단량체 또는 2 개 이상의 단량체 세트를 포함한다. 특정 실시형태에서, 아미노산 블록은, 상기 전체적인 블록이 친수성이도록 하나 이상의 단량체를 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 아미노산 블록은 임의의 아미노산 블록, 즉, 아미노산 잔기의 혼합물을 포함하는 블록을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "D,L-혼합된 폴리(아미노산) 블록"은, 폴리(아미노산) 블록을 나타내고, 상기 폴리(아미노산)은 D- 및 L-형태 둘 다로 아미노산의 혼합물로 이루어진 것이다. 특정한 실시형태에 있어서, 상기 D,L-혼합된 폴리(아미노산) 블록은 소수성이다. 다른 실시형태에 있어서, D,L-혼합된 폴리(아미노산) 블록은, 상기 전체적인 폴리(아미노산) 블록이 소수성이 되도록, D-형태 소수성 아미노산 및 L-형태 친수성 아미노산 곁-사슬기(side-chain group)의 혼합물로 이루어진다.
대표적인 폴리(아미노산)은 폴리(벤질 글루타메이트), 폴리(벤질 아스파르테이트), 폴리(L-류신-코-티로신)(poly(L-leucine-co-tyrosine)), 폴리(D-류신-코-티로신, 폴리(L-페닐알라닌-코-티로신), 폴리(D-페닐알라닌-코-티로신), 폴리(L-류신-코아스파르산), 폴리(D-류신-코-아스파르산), 폴리(L-페닐알라닌-코-아스파르산), 폴리(D-페닐알라닌-코-아스파르산)을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 구절 "천연 아미노산 곁-사슬 기(natural amino acid side-chain group)"는, 단백질에서 자연적으로 발생되는 20개의 아미노산 중 임의의 곁사슬 기를 나타낸다. 명확성을 위해, 상기 곁사슬 기 -CH3는 상기 아미노산 알라닌을 나타낼 것이다. 이러한 천연 아미노산은 비극성, 또는 소수성 아미노산, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 및 프롤린을 포함한다. 시스테인은 때로 비극성 또는 소수성으로 분류되지만, 때로는 극성으로 분류된다. 또한, 천연 아미노산은 또한, 예를 들어 티로신, 세린, 트레오닌, 아스파르산(전하된(charged) 경우에, 아스파르테이트로도 알려짐), 글루탐산(전하된 경우에, 글루타메이트로도 알려짐), 아스파라진, 및 글루타민과 같은 극성, 또는 친수성 아미노산을 포함한다. 특정한 극성, 또는 친수성 아미노산은 전하된 곁-사슬을 갖는다. 이러한 전하된 아미노산은 또한 리신, 아르기닌, 및 히스티딘을 포함한다. 본 분야의 숙련자는 극성 또는 친수성 아미노산 곁-사슬의 보호가 아미노산이 비극성이 되도록 한다는 것을 인지할 것이다. 예를 들어, 적합하게 보호된 티로신 히드록실기는 히드록실기를 보호하기 때문에 티로신이 비극성이고 소수성이 되게 할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 구절 "비천연 아미노산 곁사슬 기(unnatural amino acid side-chain group)"는, 상기 기재된 바와 같은, 단백질 중 자연적으로 발생하는 20 개의 아미노산 리스트에 포함되지 않는 아미노산을 나타낸다. 이러한 아미노산은 20 개의 자연적으로 발생하는 아미노산 중 D-이성질체를 포함한다. 또한, 비천연 아미노산은 호모세린(homoserine), 오르니틴, 및 티록신(thyroxine)을 포함한다. 다른 비천연 아미노산 곁-사슬은 본 분야의 숙련자에게 널리 알려져 있고, 비천연 지방족 곁사슬을 포함한다. 다른 비천연 아미노산은, N-알킬화된(N-alkylated), 고리화된(cyclized), 인산화, 아세틸화(acetylated), 아미드화(amidated), 아지딜화(azidylated), 표지된(labelled) 등의 것들을 포함하는, 변형된 아미노산을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "입체규칙성(tacticity)"은, 폴리(아미노산) 소수성 블록의 입체 화학(stereochemistry)을 나타낸다. 단일 입체 이성질체(stereoisomer)(예를 들어, 모두 L 이성질체)로 이루어진 폴리(아미노산) 블록을 "동일배열(isotactic)"로서 나타낸다. D 및 L 아미노산 단량체의 임의의 도입으로 이루어진 폴리(아미노산)은 "혼성배열(atactic)" 중합체로서 나타낸다. 다른 입체화학(예를 들어, ...DLDLDL...)을 갖는 폴리(아미노산)은 "규칙성 교대배열(syndiotactic)" 중합체로서 나타낸다. 중합체 입체규칙성은, 이의 전체가 본원의 참고문헌으로 포함되는, "Principles of Polymerization", 3rd Ed., G. Odian, John Wiley & Sons, New York: 1991에 더욱 자세히 기재되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 상기 구절 "존재하는 중합체 사슬-말단(living polymer chain-end)"은, 추가적인 단량체 또는 중합 종결(polymerization terminator)과 추가적으로 반응하기 위한 능력을 유지하는, 중합 반응을 결과적으로 나타내는 말단(terminus)을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "말단(termination)"은, 적절한 화합물과 존재하는 중합체의 반응에 의해 중합체 사슬-말단으로 말단 기(terminal group)를 부착하는 것을 나타낸다. 대체적으로, 상기 용어 "말단"은, 상기 중합체 사슬의, 아민 또는 히드록실 말단, 또는 이의 유도체에 말단기(terminal group)가 부착되는 것을 나타낼 수도 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어 "중합 종결인자(polymerization terminator)"은 용어 "중합 종결 제제(polymerization terminating agent)"와 서로 교환가능하게 사용되고, 말단기(terminal group)와 함께 중합체를 제공하기 위해, 존재하는 중합체 사슬-말단과 함께 반응하는 화합물을 나타낸다. 대체적으로, 상기 용어 "중합 종결인자"는, 말단기와 함께 중합체를 제공하기 위해, 상기 중합체 사슬의, 아민 또는 히드록실 말단, 또는 이의 유도체와 반응하는 화합물을 나타낼 수도 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "중합 개시인자(polymerization initiator)"는, 음이온 또는 프리 베이스 형태(free base form)가, 단량체의 중합을 결과적으로 나타내는 방식으로, 원하는 단량체와, 반응하는 화합물을 나타낸다. 특정 실시형태에서, 상기 중합 개시인자는, 폴리알킬렌 산화 블록(polyalkylene oxide block)을 제공하도록, 알킬렌 산화물과 반응하는 화합물이다. 다른 실시형태에서, 상기 중합 개시인자는 본원에 기재된 바와 같이 아민 염(amine salt)이다. 특정 실시형태에서, 상기 중합 개시인자는 트리플루오로 아세트산 염이다.
본원에 사용된 바와 같은, "지방족(aliphatic)" 또는 지방족기(aliphatic group)"는, 직쇄(straight-chain)[즉, 가지치지 않음(branched)], 가지쳐진(branched), 또는 고리형(cyclic)[융합된(fused), 브릿징(bridging), 및 스피로-융합된 폴리시클릭(spiro-fused polycyclic)을 포함함]일 수도 있고, 완전히 포화되거나 방향족인 아니지만, 불포화된 하나 이상의 단위를 포함할 수도 있는, 탄화수소 모이어티를 나타낸다. 다른 방식으로 나타내지 않는다면, 지방족기는 1 내지 20개의 탄소원자를 함유한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 지방족기는 1 내지 10개의 탄소원자를 함유한다. 다른 실시형태에 있어서, 지방족기는 1 내지 8개의 탄소원자를 함유한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 지방족기는 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하고, 또 다른 실시형태에서 지방족기는 1 내지 4개의 탄소원자를 함유한다. 지방족기는, 선형(linear) 또는 가지형(branched), 알킬, 알케닐, 및 알키닐기, 및 (시클로알킬)알킬, (시클로알케닐)알킬 또는 (시클로알킬)알케닐과 같은 이들의 하이브리드(hybrids)를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
용어 "헤테로원자"는, 하나 또는 그 이상의 산소, 황, 질소, 인, 또는 실리콘(silicon)을 의미한다. 이는 질소, 황, 인, 또는 실리콘의 어떠한 산화된 형태(oxidized form), 어떠한 기초 질소의 사중의 형태(quaternized form of any basic nitrogen), 또는 3,4-디히드로-2H-피롤릴로서 =N-, 피롤리디닐로서 -NH-, 또는 N-치환된 피롤리디닐을 포함하는 헤테로사이클릭 고리의 치환가능한 질소를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "불포화된(unsaturated)"은, 모이어티가 불포화의 하나 또는 그 이상의 단위를 갖는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "이가, 포화된 또는 불포화된, 직쇄 또는 가지쇄 C1 -12 탄화수소 사슬(bivalent, saturated or unsaturated, straight or branched C1 -12 hydrocarbon chain)"은, 본원에 정의된 바와 같은, 직쇄 또는 가지쇄인, 이가 알킬렌(bivalent alkylene), 알케닐렌(alkenylene), 알키닐렌 사슬을 나타낸다.
단독으로 또는 "아랄킬", "알랄콕시" 또는 "아릴옥시알킬"으로서 보다 큰 모이어티의 일부로서 사용된 용어 "아릴"은, 전체 5 내지 14 개 고리 원(ring members)을 갖는 모노사이클릭, 비사이클릭, 및 트리사이클릭 고리 시스템을 나타내고, 상기 시스템에서 적어도 하나의 고리는 방향족이고, 상기 시스템에서 각각의 고리는 3 내지 7 개의 고리 원을 포함한다. 상기 용어 "아릴"은 용어 "아릴 고리"와 교환하여 사용될 수도 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 화합물은 "임의적으로 치환된" 모이어티를 포함할 수 있다. 보통, 용어 "임의적으로"가 앞에 있거나 없든지 간에, 용어 "치환된"은, 하나 또는 그 이상의 수소의 지정된 모이어티(designated moiety)가 적절한 치환기로 교체됨을 의미한다. 다른 방식으로 나타내지 않는 한, "임의적으로 치환된" 기는 기(group)의 각각의 치환가능한 위치(substitutable position)에서 적절한 치환기를 가질 수 있고, 모든 주어진 구조에서의 하나 이상의 위치는 특정한 기로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 치환된 경우에, 상기 치환기는 모든 위치에서 동일하거나 상이할 수 있다. 본 발명에 의해 구상된 치환기의 조합(Combination)은 안정되거나 화학적으로 실현가능한 화합물의 형성을 야기하는 것들이 바람직하다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "안정된(stable)"은, 이들의 생산(production), 탐지(detection), 및 특정 실시형태에서 이들의 회복, 정제, 및 본원에서 나타낸 목적의 하나 또는 그 이상의 용도(use)를 가능하게 하기 위해서 조건에 처했을 경우에(when subjected to conditions), 실질적으로 바뀌지 않는 화합물을 나타낸다.
"임의적으로 치환된" 기의 치환가능한 탄소 원자에서의 적절한 일가 치환기(monovalent substituents)는 독립적으로, 할로겐; -(CH2)0-4R○; -(CH2)0-4OR○; -O-(CH2)0-4C(O)OR○; -(CH2)0-4CH(OR○)2 ; -(CH2)0-4SR○ ; R○로 치환될 수 있는 -(CH2)0-4Ph; R○로 치환될 수 있는 -(CH2)0-4O(CH2)0-1Ph ; R○로 치환될 수 있는 -CH=CHPh; -NO2 ; -CN ; -N3 ; -(CH2)0-4N(R○)2; -(CH2)0-4N(R○)C(O)R○ ; -N(R○)C(S)R○ ; -(CH2)0-4N(R○)C(0)NR○ 2 ; -N(R○)C(S)NR○ 2 ; -(CH2)0-4N(R○)C(O)OR○ ; -N(R○)N(R○)C(O)R○ ; -N(R○)N(R○)C(O)NR○ 2 ; -N(R○)N(R○)C(O)OR○ ; -(CH2)0-4C(O)R○ ; -C(S)R○ ; -(CH2)0-4C(O)OR○ ; -(CH2)0-4C(O)SR○ ; -(CH2)0-4C(O)OSiR○ 3 ; -(CH2)0-4OC(O)R○ ; -OC(O)(CH2)0-4SR-, SC(S)SR○ ; -(CH2)0-4SC(O)R○ ; -(CH2)0-4C(O)NR○ 2 ; -C(S)NR○ 2 ; -C(S)SR○ ; -SC(S)SR○ , -(CH2)0-4OC(O)NR○ 2 ; -C(O)N(OR○)R○ ; -C(O)C(O)R○ ; -C(O)CH2C(O)R○ ; -C(NOR○)R○ ; -(CH2)0-4SSR○ ; -(CH2)0-4S(O)2R○ ; -(CH2)0-4S(O)2OR○ ; -(CH2)0-4OS(O)2R○ ; -S(O)2NR○ 2 ; -(CH2)0-4S(O)R○ ; -N(R○)S(O)2NR○ 2 ; -N(R○)S(O)2R○ ; -N(OR○)R○ ; -C(NH)NR○ 2 ; -P(O)2R○ ; -P(O)R○ 2 ; -OP(O)R○ 2 ; -OP(O)(OR○)2 ; -SiR○ 3 ; -[C1 -4 직쇄 또는 가지쇄 알킬렌(straight or branched alkylene)]O-N(R○)2 ; 또는 -(C1 -4 직쇄 또는 가지쇄 알킬렌)C(O)O-N(R○)2 이고, 이 식에서 R○ 각각은 하기에 나타낸 바와 같이 치환될 수 있고, 독립적으로 수소, C1 -6 지방족, -CH2Ph, -O(CH2)0-1Ph, -CH2-(5 내지 6 원 헤테로아릴 고리), 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 선택된 독립적으로 0 내지 4의 헤테로원자를 갖는 5 내지 6 원의 포화된, 부분적으로 불포화된, 아릴 고리(5-6 membered saturated, partially unsaturated, or aryl ring having 0-4 heteroatoms independently selected from nitrogen, oxygen, or sulfur)이고, 또는 상기에 나타낸 바에도 불구하고, 이들의 두 개의 독립된 R○의 존재(two independent occurrences of R○)는, 이들의 매개 원자(intervening atom)와 함께, 하기에 나타낸 바와 같이 치환될 수도 있는, 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4 의 헤테로원자(heteroatoms)를 갖는 3 내지 12 원의 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 모노- 또는 비사이클릭 고리(3-12 membered saturated, partially unsaturated, or aryl mono- or bicyclic ring)를 형성한다.
R○에서의 일가 치환기[또는 이들의 매개 원자와 함께 두 개의 독립된 R○의 존재에 의해 형성된 고리(the ring formed by taking two independent occurrences of R○ together with their intervening atoms)]는, 독립적으로 할로겐, -(CH2)0-2R●, -(할로R●), -(CH2)0-2OH, -(CH2)0-2OR●, -(CH2)0-2CH(OR●)2; -O(할로R●), -CN, -N3, -(CH2)0-2C(O)R●, -(CH2)0-2C(O)OH, -(CH2)0-2C(O)OR●, -(CH2)0-2SR●, -(CH2)0-2SH, -(CH2)0-2NH2, -(CH2)0-2NHR●, -(CH2)0-2NR● 2, -NO2, -SiR● 3, -OSiR● 3, -C(O)SR●, -(C1 -4 직쇄 또는 가지쇄 알킬렌)C(O)OR●, 또는 -SSR● 이고, 이 식에서 각각의 R●은 치환되지 않거나, "할로(halo)"에 앞선 곳(where preceded by "halo")이 하나 또는 그 이상의 할로겐만으로 치환되고, 이는 C1 -4　지방족(aliphatic), -CH2Ph, -O(CH2)0-1Ph, 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4 의 헤테로원자를 갖는 5 내지 6 원의 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 고리로부터 독립적으로 선택된 것이다. R○ 의 포화된 탄소 원자에서의 이가 치환기(divalent substituents)는 =O 및 =S 를 포함한다.
"임의적으로 치환된" 기의 포화된 탄소 원자에서의 이가 치환기(divalent substituents)는 하기를 포함한다: =O, =S, =NNR* 2, =NNHC(O)R*, =NNHC(O)OR*, =NNHS(O)2R*, =NR*, =NOR*, -O(C(R* 2))2-3O-, 또는 -S(C(R* 2))2-3S-, 이 식에서, 각각의 두 개의 독립된 R*의 존재는 하기에 나타낸 바와 같이 치환될 수 있는 수소, C1 -6 지방족, 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4 의 헤테로원자를 갖는 치환되지 않은 5 내지 6 원의 포화된, 부분적으로 불포화된 또는 아릴 고리로부터 선택된 것이다. "임의적으로 치환된"기의 인접한 치환가능한(vicinal substitutable) 탄소에 결합하는 이가 치환기는 -O(CR* 2)2-3O- 을 포함하고, 이 식에서, 각각의 독립된 R*의 존재는, 수소, 하기에 나타낸 바와 같이 치환될 수 있는 C1 -6 지방족, 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4 의 헤테로원자를 갖는 치환되지 않은 5 내지 6 원의 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 고리로부터 선택된 것이다. "임의적으로 치환된" 기의 부근의 치환가능한 메틸렌 탄소에 결합하는 4가 치환기(tetravalent substituent)는, 이를 포함하는 메틸렌을 그린 경우에
Figure 112014095982417-pct00001
에 의해 나타내는 디코벨트 헥사카르보닐 클러스터(dicobalt hexacarbonyl cluster)이다.
R* 의 지방족 기에서의 적절한 치환기는, 할로겐, -R●, -(할로R●), -OH, -OR●, -O(할로R●), -CN, -C(O)OH, -C(O)OR●, -NH2, -NHR●, -NR● 2, 또는 -NO2을 포함하고, 이 식에서 각각의 R● 은 치환되지 않거나, "할로(halo)"에 앞선 곳(where preceded by halo)이 하나 또는 그 이상의 할로겐만으로 치환되고, 이는 C1-4　지방족(aliphatic), -CH2Ph, -O(CH2)0-1Ph, 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4 의 헤테로원자를 갖는 5 내지 6 원의 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 고리이다.
"임의적으로 치환된" 기의 치환가능한 질소에서의 적절한 치환기는 -R†, -NR† 2, -C(O)R†, -C(O)OR†, -C(O)C(O)R†, -C(O)CH2C(O)R†, -S(O)2R†, -S(O)2NR† 2, -C(S)NR† 2, -C(NH)NR† 2, 또는 -N(R†)S(O)2R† 을 포함하고; 이 식에서, 각각의 R†은 독립적으로, 수소, 하기에 나타낸 바와 같은 치환될 수도 있는 C1 -6 지방족, 치환되지 않은 -OPh, 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4 의 헤테로원자를 갖는 치환되지 않은 5 내지 6 원의 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 고리이거나, 또는 상기에 나타낸 바에도 불구하고, 이들의 두 개의 독립된 R†의 존재(two independent occurrences of R†)는, 이들의 매개 원자(intervening atom)와 함께, 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4 의 헤테로원자를 갖는 치환되지 않은 3 내지 12 원의 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 모노- 또는 비사이클릭 고리를 형성한다.
R† 의 지방족 기에서의 적절한 치환기는 독립적으로, 할로겐, -R●, -(할로R●), -OH, -OR●, -O(할로R●), -CN, -C(O)OH, -C(O)OR●, -NH2, -NHR●, -NR● 2, 또는 -NO2 을 포함하고, 이 식에서 각각의 R● 은 치환되지 않거나, "할로(halo)"에 앞선 곳(where preceded by halo)이 하나 또는 그 이상의 할로겐만으로 치환되고, 이는 C1 -4　지방족(aliphatic), -CH2Ph, -O(CH2)0-1Ph, 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4 의 헤테로원자를 갖는 5 내지 6 원의 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 고리이다.
보호된 히드록실기는 본원에 널리 알려져 있고, 이의 전체가 본원의 참고문헌으로 포함된, Protecting Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene and P. G. M. Wuts, 3rd edition, John Wiley & Sons, 1999에 상세하게 기재되어 있는 것을 포함한다. 적절하게 보호된 히드록실기의 예는, 에스테르, 카르보네이트, 술포네이트 알릴 에테르(sulfonates allyl ethers), 에테르, 실릴 에테르(silyl ethers), 알킬 에테르, 아릴알킬 에테르, 및 알콕시알킬 에테르를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 적절한 에스테르의 예는, 포르메이트(formates), 아세테이트, 프로피오네이트, 펜타노에이트(pentanoates), 크로토네이트(crotonates), 및 벤조에이트(benzoates)를 포함한다. 적절한 에스테르의 특정한 예는, 포르메이트, 벤조일 포르메이트, 클로로아세테이트(chloroacetate), 트리플루오로아세테이트, 메톡시아세테이트, 트리페닐메톡시아세테이트, p-클로로페녹시아세테이트, 3-페닐프로피오네이트, 4-옥소펜타노에이트, 4,4-(에틸렌디티오)펜타노에이트, 피말로에이트(트리메틸아세테이트), 크로토네이트(crotonate), 4-메톡시-크로노테이트, 벤조에이트, p-베닐벤조에이트(benylbenzoate), 2,4,6-트리메틸벤조에이트를 포함한다. 카르보네이트의 예는, 9-플루오레닐메틸, 에틸, 2,2,2-트리클로로에틸, 2-(트리메틸실릴)에틸, 2-(페닐술포닐)에틸, 비닐, 알릴, 및 p-니트로벤질 카르보네이트를 포함한다. 실릴 에테르의 예는, 트리메틸실릴, 트리에틸실릴, t-부틸디메틸실릴, t-부틸디페닐실릴, 트리이소프로필실릴 에테르, 및 그 밖의 트리알킬실릴 에테르를 포함한다. 알킬 에테르의 예는, 메틸, 벤질, p-메톡시벤질, 3,4-디메톡시벤질, 트리틸(trityl), t-부틸, 및 알릴 에테르, 또는 이의 유도체를 포함한다. 알콕시알킬 에테르는, 메톡시메틸, 메틸티오메틸, (2-메톡시에톡시)메틸, 벤질옥시메틸, 베타-(트리메틸실릴)에톡시메틸, 및 테트라히드록피란-2-일 에테르와 같은 아세탈(acetals)을 포함한다. 아릴알킬 에테르의 예는, 벤질, p-메톡시벤질(MPM), 3,4-디메톡시벤질, O-니트로벤질, p-니트로벤질, p-할로벤질(halobenzyl), 2,6-디클로로벤질, p-시아노벤질, 2- 및 4-피콜릴 에테르를 포함한다.
보호된 아민은 본 분야에서 널리 알려져 있고, Greene (1999)에 상세하게 기재된 것들을 포함한다. 모노-보호된 아민은 추가적으로, 아랄킬아민(aralkylamines), 카르바메이트, 알릴 아민(allyl amines), 아미드 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 모노-보호된 아미노 모이어티의 예는, t-부틸옥시카르보닐아미노(-NHBOC), 에틸옥시카르보닐아미노, 메틸옥시카르보닐아미노, 트리클로로에틸옥시카르보닐아미노, 알릴옥시카르보닐아미노(-NHAlloc), 벤질옥소카르보닐아미노(-NHCBZ), 알릴아미노, 벤질아미노(-NHBn), 플루오레닐메틸카르보닐(-NHFmoc), 포름아미도(formamido), 아세트아미도(acetamido), 클로로아세트아미도, 디클로로아세트아미도, 트리클로로아세트아미도, 페닐아세트아미도, 트리플루오로아세트아미도, 벤즈아미도, t-부틸디페닐실릴 등을 포함한다. 디-보호된 아민은, 모노-보호된 아민으로서 상기에 기재된 것들을 독립적으로 선택된 두 개의 치환기로 치환된 아민을 포함하고, 추가적으로 프탈이미드, 말레이미드, 숙신이미드 등과 같은 시클릭 이미드(cyclic imides)를 포함한다. 디-보호된 아민은 또한 피롤 및 2,2,5,5-테트라메틸-[1,2,5]아자디실로리딘(azadisilolidine) 등 및 아지드를 또한 포함한다.
보호된 알데히드는 본 분야에 널리 알려져 있고, Greene (1999)에 상세하게 기재된 것들을 포함한다. 보호된 알데히드는 추가적으로, 비고리형 아세탈(acyclic acetals), 고리형 아세탈(cyclic acetals), 히드라존(hydrazones), 이민(imines) 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 이러한 기의 예는, 디메틸 아세탈, 디에틸 아세탈, 디이소프로필 아세탈, 디벤질 아세탈, 비스(2-니트로벤질)아세탈, 1,3-디옥산(dioxanes), 1,3-디옥솔란(dioxolanes), 세미카르바존(semicarbazones), 및 이의 유도체를 포함한다.
보호된 카르복실산은 본 분야에서 널리 알려져 있고, Greene (1999)에 상세하게 기재된 것들을 포함한다. 보호된 카르복실산은 추가적으로, 임의적으로 치환된 C1 -6 지방족 에스테르, 임의적으로 치환된 아릴 에스테르, 실릴 에스테르, 활성화된 에스테르, 아미드, 히드라지드(hydrazides) 등을 추가적으로 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 이러한 에스테르 기의 예는, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 벤질, 페닐 에스테르를 포함하고, 각각의 기는 임의적으로 치환된다. 추가적인 보호된 카르복실산은 옥사졸린 및 오르토 에스테르(ortho esters)를 포함한다.
보호된 티올은 본 분야에서 널리 알려져 있고, Greene (1999)에 상세하게 기재된 것들을 포함한다. 보호된 티올은 추가적으로, 이황화물(disulfides), 티오에테르, 실릴 티오에테르, 티오에테르, 티오카르보네이트(thiocarbonates), 및 티오카르바메이트(thiocarbamates) 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 이러한 기의 예는, 몇가지를 들면, 알킬 티오에테르, 벤질 및 치환된 벤질 티오에테르, 트리페닐메틸 티오에테르, 및 트리클로로에톡시카르보닐 티오에테르를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
또한, 다른 방식으로 언급하지 않는다면, 본원에 설명된 구조는 상기 구조의 모든 이성질체(isomer)[예를 들어, 거울상 이성질체(enantiomeric), 편좌우 이성질체(diastereomeric), 및 기하(또는 형태)] 형태를 포함하는 것을 의미한다; 예를 들어, 각각의 비대칭 중심의 R 및 S 형태, Z 및 E 이중 결합 이성질체, 및 Z 및 E 형태 이성질체. 따라서, 단독 입체화학 이성체 이외에 본 화합물의 거울상 이성질체, 편좌우 이성체, 및 기하(또는 형태) 혼합물은 본 발명의 범위 내이다. 달리 언급하지 않으면, 본 발명의 화합물의 모든 호변이성질체 형태는 본 발명의 범위 내이다. 또한, 달리 언급하지 않으면, 여기에 설명되는 구조는 하나 이상의 동위원소 농축 원자(isotopically enriched atom)의 존재만이 다른 화합물들을 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 중수소 또는 삼중수소에 의한 수소 치환, 또는 13C- 또는 14C-풍부한 탄소에 의한 탄소의 치환을 제외하고 본 구조를 갖는 화합물은 본 발명의 범위 내이다. 이러한 화합물은, 예를 들어 중성자 산란 실험(neutron scattering experiment), 생물학적 분석의 분석 도구 또는 프로브(probes)로서 유용하다.
본원에 사용되는, "검출 가능한 모이어티(detectable moiety)"는 "표지(label)"라는 용어와 상호 교체하여 사용되고, 검출할 수 있는[예를 들어, 일차 표지(primary labels) 및 이차 표지(secondary labels)] 어떠한 모이어티와 관련된 것이다. "검출 가능한 모이어티" 또는 "표지"는 검출 가능한 화합물의 라디칼이다.
"일차" 표지는 방사성 동위원소-함유 모이어티(예를 들어, 32P, 33P, 35S, 또는 14C를 함유하는 모이어티), 메스-테그(mass-tag), 및 형광 표지(fluorescent label)를 포함하고, 추가적인 변형 없이 검출될 수 있는 단독-생성 리포터 기(signal-generating reporter group)이다.
다른 일차 표지는, 방사성 동위 원소(예를 들어, 18F) 또는 바운드(bound) 방사성 금속(예를 들어, 62Cu)을 갖는 리간드를 함유하는 분자를 포함하는 양전자방출 단층 촬영술(positron emission tomography)에 유용한 것들을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 일차 표지는, 가돌리늄(gadolinium), 가돌리늄 킬레이트(gadolinium chelates), 또는 산화철(예를 들어, Fe3O4 및 Fe2O3) 입자와 같은, 자기 공명영상 검사(magnetic resonance imaging)의 콘트라스트 촉진제(contrast agent)이다. 유사하게, 반도체 나노입자[예를 들어, 카드뮴 셀레나이드(cadmium selenide), 카드뮴 설파이드(cadmium sulfide), 카드뮴 텔루라이드(cadmium telluride)]가 형광 표지로서 유용하다. 다른 금속 나노입자[예를 들어, 콜로이드성 금(colloidal gold)] 또한 일차 표지로 작용한다.
"이차" 표지는, 검출가능한 신호를 생산하기 위해, 두 번째 화합물(second compound)의 존재를 필요로 하는, 비오틴, 또는 단백질 항원과 같은 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 비오틴 레벨의 경우에, 상기 이차 화합물은 스트렙타비딘-효소 접합체(streptavidin-enzyme conjugates)를 포함할 수도 있다. 항원 레벨의 경우에, 상기 두 번째 화합물은 항체-효소 접합체를 포함할 수도 있다. 추가적으로, 특정한 형광기(fluorescent groups)는, 검출된 상기 신호를 발생하기 위해, 상기 이차 화합물 또는 기를 발생하는, 비방사성 형광 공명 에너지 전달(fluorescent resonance energy transfer, FRET)의 공정에서 다른 화합물 또는 기에 에너지를 전달함으로써 이차 표지로서 작용할 수 있다.
다른 방식으로 나타내지 않는다면, 방사성 동위 원소-함유 모이어티는, 적어도 하나의 방사성 동위 원소를 함유하는, 임의적으로 치환된 탄화수소기이다. 다른 방식으로 나타내지 않는다면, 방사성 동위 원소-함유 모이어티는 1 내지 40개의 탄소원자 및 하나의 방사성 동위 원소를 함유한다. 특정한 실시형태에서, 방사성 동위 원소-함유 모이어티는 1 내지 20개의 탄소 원자 및 하나의 방사성 동위 원소를 함유한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "형광 표지(fluorescent label)", "형광기(fluorescent group)", "형광 화합물", "형광 염료(fluorescent dye)" 및 "형광물질(fluorophore)"는, 정의된 여기(excitation) 파장에서 광 에너지를 흡수하고, 다른 파장에서 광 에너지를 방출하는 화합물 또는 모이어티를 나타낸다. 형광 화합물의 예로는, Alexa Fluor 염료(Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 660 및 Alexa Fluor 680), AMCA, AMCA-S, BODIPY 염료 (BODIPY FL, BODIPY R6G, BODIPY TMR, BODIPY TR, BODIPY 530/550, BODIPY 558/568, BODIPY 564/570, BODIPY 576/589, BODIPY 581/591, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665), 카르복시로다민(Carboxyrhodamine) 6G, 카르복시-X-로다민(ROX), Cascade Blue, Cascade Yellow, 쿠마린 343, 시아닌 염료(Cy3, Cy5, Cy3.5, Cy5.5), 단실(Dansyl), 다폭실(Dapoxyl), 디알킬아미노쿠마린(Dialkylaminocoumarin), 4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시-플루오레세인, DM-NERF, 에오신(Eosin), 에리스로신(Erythrosin), 플루오레세인(Fluorescein), FAM, 히드록시쿠마린(Hydroxycoumarin), IRDyes (IRD40, IRD 700, IRD 800), JOE, 리스아민 로다민 B, Marina Blue, 메톡시쿠마린(Methoxycoumarin), 나프토플루오레세인(Naphthofluorescein), Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Pacific Blue, PyMPO, 피렌(Pyrene), 로다민 B, 로다민 6G, 로다민 그린, 로다민 레드, Rhodol Green, 2',4',5',7'-테트라-브로모술폰-플루오레세인, 테트라메틸-로다민 (TMR), 카르복시테트라메틸로다민 (TAMRA), 텍사스 레드(Texas Red), 텍사스 레드(Texas Red-X)를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "기질(substrate)"은, 블록 공중합체의 작용화된 말단-기가 부착될 수 있는 어떠한 물질 또는 거대분자 복합체를 나타낸다. 일반적으로 사용된 기질의 예는, 유리 표면, 실리카 표면, 플라스틱 표면(plastic surfaces), 금속 표면, 금속성 또는 화학적 코팅을 포함하는 표면, 막[예를 들어, 나일론, 폴리술폰, 실리카], 마이크로-비드(micro-beads)[예를 들어, 라텍스, 폴리스티렌, 또는 다른 중합체), 다공성 중합체 매트릭스[예를 들어, 폴리아크릴아미드 겔, 다당류, 폴리메타크릴레이트(polymethacrylate)], 거대분자 복합체(예를 들어, 단백질, 다당류)를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 히드록삼산은, 히드록산삼 (-CO-NH-OH) 작용기를 포함하는 모이어티를 나타낸다. 상기 구조된 것(The structured)은,
Figure 112014095982417-pct00002
에 의해 나타내고, 또한
Figure 112014095982417-pct00003
로 나타내질 수도 있다. 본 분야의 숙련자는, 점 찍힌 결합이 상기 분자의 나머지에 대한 부착 점을 나타냄을 인지할 것이다(One skilled in the art would recognize that the dotted bond represents the attachment point to the rest of the molecule).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 히드록사메이트(hydroxamate)는, 히드록산삼 또는 N-치환된 히드록산삼을 함유하는 모이어티를 나타낸다. 상기 N-치환으로 인하여, 두 개의 분리된 위치는, 여기
Figure 112014095982417-pct00004
에서 R 및 R' 기에 의해 나타낸 바와 같이, 화학적인 부착을 위해 존재한다. 히드록사메이트는 본원에
Figure 112014095982417-pct00005
으로 또한 나타낼 수도 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 카테콜은, 치환된 오르토-디히드록시벤젠 유도체를 나타낸다. 두 개의 상이한 이성질체의 형태는,
Figure 112014095982417-pct00006
에 의해 나타낸다. 카테콜은 피로카테콜(pyrocatechol) 및 벤젠-1,2-디올로 또한 알려져 있다.
도 1. 본 발명의 트리블록 공중합체(triblock copolymer) 및 중합체 미셀을 나타내는, 도식도.
도 2. 약물 로딩된 미셀(drug loaded micelles)의 제조를 나타내는 도식도.
도 3. 금속 이온과 약물 로딩된 미셀의 교차결합을 나타내는 도식도.
도 4. 본 발명의 상기 교차결합된, 약물 로딩된 미셀을 나타내는 도식도.
도 5. 인산 완충용액 pH 8에 대해 6 시간 동안 20 mg/ml (black bar) 및 0.2 mg/mL (white bar)에서 교차결합되지 않는 제형의 투석에 의한 다우노루비신(daunorubicin)의 캡슐화의 확인.
도 6. 6 시간 동안 인산 완충용액 pH 8에서 0.2 mg/mL으로 투석하여 철-의존적인 교차결합 확인(Iron-dependent crosslinking verification).
도 7. 6 시간 동안 인산 완충용액 pH 8에서 0.2 mg/mL으로 투석하여 철-매게된 교차결합(iron-mediated crosslinking)에서 시간-의존의 확인.
도 8. 상기 교차결합되지 않는 샘플은, 철-매개된 교차결합의 pH 의존성을 결정하기 위해, 3, 4, 5, 6, 7, 7.4 및 8로 조절된 pH 및 20 mg/ml에서의 재구성되었다. 상기 샘플은 0.2 mg/mL로 희석되었고, 6 시간 동안 10 mM 인산 완충용액에 대해 투석되었다(dialyzed against 10 mM phosphate buffer pH 8 for 6 hours).
도 9. 6 시간 동안 3, 4, 5, 6, 7, 7.4 및 8로 조절된 pH 10 mM 인산 완충용액에 대해 투석된 교차결합된 다우노루비신 제형의 pH-의존적인 방출(pH-dependent release of crosslinked daunorubicin formulation dialyzed against 10 mM phosphate buffer pH adjusted to 3, 4, 5, 6, 7, 7.4 and 8 for 6 hours).
도 10. 0, 10, 50, 100, 200, 300, 400 또는 500 mM의 NaCl 농도와 함께, 10 mM 인산 완충용액에 대해 투석된 0.2 mg/mL에서 상기 교차결합된 다우노루비신 제형의 염-의존적인 방출(Salt-dependent release).
도 11. 교차결합된 아미노프테린 제형(aminopterin formulation)에 대한 입자 크기 분포를 나타내는 DLS 히스토그램.
도 12. CMC 이하[0.2 mg/mL, 흰색 바(white bar)] 및 이상 (20 mg/mL, 검은색 바)의 상기 제형의 투석에 의해 캡슐화의 확인.
도 13. 6 시간 이상의 10 mM 인산 완충용액에서 투석에 의해 0.2 mg/mL에서 아미노프테린 제형의 교차결합 및 pH-의존적인 방출의 확인.
도 14. 프리 아미노프테린(free aminopterin), 교차결합되지 않은 아미노프테린, 교차결합된 아미노프테린 제형, 교차결합되지 않는 비어있는 미셀 비히클 및 교차결합된 비어있는 미셀 비히클로 처리된 A549 폐 암 세포에 대한 세포 생존능력.
도 15. 프리 아미노프테린, 교차결합되지 않은 아미노프테린 제형, 교차결합된 아미노프테린 제형, 교차결합되지 않는 비어있는 미셀 비히클 및 교차결합된 비어있는 미셀 비히클로 처리된 OVCAR3 난소 암 세포에 대한 세포 생존능력.
도 16. 프리 아미노프테린, 교차결합되지 않은 아미노프테린 제형, 교차결합된 아미노프테린 제형, 교차결합되지 않는 비어있는 미셀 비히클 및 교차결합된 비어있는 미셀 비히클로 처리된 PANC-1 췌장(엽산 수용체 +) 암 세포에 대한 세포 생존능력.
도 17. 프리 아미노프테린, 교차결합되지 않은 아미노프테린 제형, 교차결합된 아미노프테린 제형, 교차결합되지 않는 비어있는 미셀 비히클 및 교차결합된 비어있는 미셀 비히클로 처리된 BxPC3 췌장의 (엽산 수용체 -) 암 세포에 대한 세포 생존능력.
도 18. 10 mg/kg에서 IT-141(Asp; 127E) 제형과 비교된 IT-141 (NHOH; 127C) 제형으로부터의 랫의 혈장 구획(plasma compartment)에서 SN-38의 농도.
도 19. SN-38 제형의 랫 약물동력학.
도 20. 6 시간 동안 3, 4, 5, 6, 7, 7.4 및 8로 조절된 pH 10 mM 인산 완충용액에 대해 투석된 교차결합된 카비자탁셀(cabizataxel)의 pH-의존적인 방출.
도 21. 랫에서 약물동력학적 프리 다우노루비신 및 다우노루비신 제형.
도 22. 교차결합된 카비자탁셀 제형 및 프리 카비자탁셀의 투여 후의 카비자탁셀의 랫 혈장 레벨.
도 23. HCT-116 이종이식 모델(xenograft model)에서 교차결합된 SN-38 제형의 항-종양 효능.
도 24. OVCAR-3 이종이식 모델에서 교차결합된 아미노프테린 제형으로부터 아미노프테린의 생물학적 분배(Biodistribution).
도 25. MFE-296 이종이식 모델에서 교차결합된 아미노프테린 제형의 항-종양 효능.
본 발명의 특정한 실시형태의 상세한 설명
3. 대표적인 실시형태의 설명:
A.멀티블록 공중합체
특정한 실시형태에서, 상기 멀티블록 공중합체는, 친수성 폴리(에틸렌 글리콜) 블록, 히드록삼산-함유하는 폴리(아미노산) 블록, 및 소수성 폴리(아미노산) 블록을 포함하고, 결과적으로 생성된 미셀은, 내부 코어, 히드록삼산-함유하는 외부 코어, 및 친수성 셀을 갖는 것을 특징으로 한다. 상기 친수성 폴리(에틸렌 글리콜) 블록이 상기 친수성 셀에 대응하고, 안정화시키는 히드록삼산-함유하는 폴리(아미노산) 블록은 상기 히드록삼산-함유하는 외부 코어에 대응하고, 상기 소수성 폴리(아미노산) 블록은 상기 내부 코어에 대응함을 인식할 것이다(It will be appreciated that the hydrophilic poly(ethylene glycol) block corresponds to the hydrophilic shell, stabilizing hydroxamic acid-containing poly(amino acid) block corresponds to the hydroxamic acid-containing outer core, and the hydrophobic poly(amino acid) block corresponds to the inner core).
다른 실시형태에서, 상기 멀티블록 공중합체는, 친수성 폴리(에틸렌 글리콜) 블록, 카테콜-함유하는 폴리(아미노산)블록, 및 소수성 폴리(아미노산) 블록을 포함하고, 상기 결과적으로 생성된 미셀은 내부 코어, 카테콜-함유하는 외부 코어 및 친수성 셀을 갖는 것을 특징으로 한다. 상기 친수성 폴리(에틸렌 글리콜) 블록이 상기 친수성 셀에 대응하고, 안정화시키는 카테콜-함유하는 폴리(아미노산) 블록은 상기 카테콜-함유하는 외부 코어에 대응하고, 상기 소수성 폴리(아미노산) 블록은 상기 내부 코어에 대응함을 인식할 것이다.
특정한 실시형태에서, 상기 멀티블록 공중합체는, 친수성 폴리(에틸렌 글리콜) 블록, 히드록사메이트-함유하는 폴리(아미노산)블록, 및 소수성 폴리(아미노산) 블록을 포함하고, 상기 결과적으로 생성된 미셀은 내부 코어, 히드록사메이트-함유하는 외부 코어, 및 친수성 셀을 갖는 것을 특징으로 한다. 상기 친수성 폴리(에틸렌 글리콜) 블록이 상기 친수성 셀에 대응하고, 안정화시키는 히드록사메이트-함유하는 폴리(아미노산) 블록은 상기 히드록사메이트-함유하는 외부 코어에 대응하고, 상기 소수성 폴리(아미노산) 블록은 상기 내부 코어에 대응함을 인식할 것이다.
특정한 실시형태에서, 상기 멀티블록 공중합체는, 친수성 폴리(에틸렌 글리콜) 블록, 히드록삼산-함유하는 폴리(아미노산)블록, 및 소수성 D,L 혼합된 폴리(아미노산) 블록을 포함하고, 상기 결과적으로 생성된 미셀은 내부 코어, 히드록삼산-함유하는 외부 코어, 및 친수성 셀을 갖는 것을 특징으로 한다. 상기 친수성 폴리(에틸렌 글리콜) 블록이 상기 친수성 셀에 대응하고, 안정화시키는 히드록삼산-함유하는 폴리(아미노산) 블록은 상기 히드록삼산-함유하는 외부 코어에 대응하고, 상기 소수성 D,L 혼합된 폴리(아미노산) 블록은 상기 내부 코어에 대응함을 인식할 것이다.
다른 실시형태에서, 상기 멀티블록 공중합체는, 친수성 폴리(에틸렌 글리콜) 블록, 카테콜-함유하는 폴리(아미노산)블록, 및 소수성 D,L 혼합된 폴리(아미노산) 블록을 포함하고, 상기 결과적으로 생성된 미셀은 내부 코어, 카테콜-함유하는 외부 코어, 및 친수성 셀을 갖는 것을 특징으로 한다. 상기 친수성 폴리(에틸렌 글리콜) 블록이 상기 친수성 셀에 대응하고, 안정화시키는 카테콜-함유하는 폴리(아미노산) 블록은 상기 카테콜-함유하는 외부 코어에 대응하고, 상기 소수성 D,L 혼합된 폴리(아미노산) 블록은 상기 내부 코어에 대응함을 인식할 것이다.
특정한 실시형태에서, 상기 멀티블록 공중합체는, 친수성 폴리(에틸렌 글리콜) 블록, 히드록사메이트-함유하는 폴리(아미노산)블록, 및 소수성 D,L 혼합된 폴리(아미노산) 블록을 포함하고, 상기 결과적으로 생성된 미셀은 내부 코어, 히드록사메이트-함유하는 외부 코어, 및 친수성 셀을 갖는 것을 특징으로 한다. 상기 친수성 폴리(에틸렌 글리콜) 블록이 상기 친수성 셀에 대응하고, 안정화시키는 히드록사메이트-함유하는 폴리(아미노산) 블록은 상기 히드록사메이트-함유하는 외부 코어에 대응하고, 상기 소수성 D,L 혼합된 폴리(아미노산) 블록은 상기 내부 코어에 대응함을 인식할 것이다.
특정한 실시형태에서, 본 발명은 화학식 Ⅰ의 트리블록 공중합체를 제공한다 :
[화학식 Ⅰ]
Figure 112014095982417-pct00007

이 식에서:
n 은 20 내지 500 이고;
x 는 3 내지 50이고;
y 는 5 내지 100이고;
Rx 는 히드록사메이트 또는 카테콜을 함유하는 모이어티(hydroxamate or catechol containing moiety)이고;
Ry 는, 상기 전체적인 블록이 소수성이 되도록 하나 또는 그 이상의 천연 또는 비천연 아미노산 곁사슬 기로부터 선택된 것이고;
R1 은 -Z(CH2CH2Y)p(CH2)tR3이고, 이 식에서:
Z 는 -O-, -NH-, -S-, -C≡C-, 또는 -CH2-이고;
Y 각각은 독립적으로 -O- 또는 -S-이고;
p 는 0 내지 10이고;
t 는 0 내지 10이고; 및
R3 는, 수소, -N3, -CN, -NH2, -CH3,
Figure 112014095982417-pct00008
,
Figure 112014095982417-pct00009
,
Figure 112014095982417-pct00010
, 스트레인된 사이클로옥틴 모이어티, 모노-보호된 아민, 디-보호된 아민, 임의적으로 보호된 알데히드, 임의적으로 보호된 히드록실, 임의적으로 보호된 카르복실산, 임의적으로 보호된 티올, 또는 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4 헤테로원자를 갖는, 5 내지 8 원 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 고리, 지방족, 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 5 헤테로원자를 갖는, 8 내지 10 원 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 비사이클릭 고리로부터 선택된 임의적으로 치환된 기, 또는 검출가능한 모이어티이고 (R3 is hydrogen, -N3, -CN, -NH2, -CH3,
Figure 112014095982417-pct00011
,
Figure 112014095982417-pct00012
,
Figure 112014095982417-pct00013
, a strained cyclooctyne moiety, a mono-protected amine, a di-protected amine, an optionally protected aldehyde, an optionally protected hydroxyl, an optionally protected carboxylic acid, an optionally protected thiol, or an optionally substituted group selected from aliphatic, a 5-8 membered saturated, partially unsaturated, or aryl ring having 0-4 heteroatoms independently selected from nitrogen, oxygen, or sulfur, an 8-10 membered saturated, partially unsaturated, or aryl bicyclic ring having 0-5 heteroatoms independently selected from nitrogen, oxygen, or sulfur, or detectable moiety);
Q 는 원자가 결합 또는 이가(bivalent), 포화된 또는 불포화된, 직쇄 또는 가지쇄 C1 -12 탄수화물 사슬이고, 여기서, Q의 0 내지 6의 메틸렌 단위는 독립적으로, -Cy-, -O-, -NH-, -S-, -OC(O)-, -C(O)O-, -C(O)-, -SO-, -SO2-, -NHSO2-, -SO2NH-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -OC(O)NH-, 또는 -NHC(O)O로 대체되고, 이 식에서:
-Cy-는, 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4 헤테로원자를 갖는, 임의적으로 치환된 5 내지 8 원 이가, 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 고리, 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 5 헤테로원자를 갖는, 임의적으로 치환된 8 내지 10 원 이가 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 비사이클릭 고리이고;
R2는 모노-보호된 아민, 디-보호된 아민, -N(R4)2, -NR4C(O)R4, -NR4C(O)N(R4)2, -NR4C(O)OR4, 또는 -NR4SO2R4이고; 및
R4 각각은 독립적으로, 수소 또는 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4 헤테로원자를 갖는, 5 내지 8 원 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 고리, 지방족, 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 5 헤테로원자를 갖는, 8 내지 10 원 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 비사이클릭 고리로부터 선택된 임의적으로 치환된 기, 또는 검출가능한 모이어티이거나, 또는:
동일한 질소 원자에서 두 개의 R4 는, 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4 헤테로원자를 갖는, 임의적으로 치환된 4 내지 7 원의 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 고리를 형성하도록, 상기 질소 원자와 함께 취해진다.
또 다른 실시형태에 따라, 본 발명은, 상기에 기재된 바와 같이, 화학식 Ⅰ의 화합물을 제공하고, 상기 화합물은 1.0 내지 1.2의 다분산지수(polydispersity index, "PDI")를 갖는다. 또 다른 실시형태에 따라, 본 발명은, 상기에 기재된 바와 같이, 화학식 Ⅰ의 화합물을 제공하고, 상기 화합물은 1.01 내지 1.10의 다분산지수("PDI")를 갖는다. 또 다른 실시형태에 따라, 본 발명은, 상기에 기재된 바와 같이, 화학식 Ⅰ의 화합물을 제공하고, 상기 화합물은 1.10 내지 1.20의 다분산지수("PDI")를 갖는다. 또 다른 실시형태에 따라, 본 발명은, 상기에 기재된 바와 같이, 화학식 Ⅰ의 화합물을 제공하고, 상기 화합물은 1.10 미만의 다분산지수("PDI")를 갖는다.
상기에 일반적으로 정의된 바와 같이, n 은 20 내지 500 이다. 특정한 실시형태에서, 본 발명은 화합물을 제공하고, 이 식에서 n 은 225이다. 다른 실시형태에서, n 은 40 내지 60 이다. 다른 실시형태에서, n 은 60 내지 90 이다. 다른 실시형태에서, n 은 90 내지 150 이다. 다른 실시형태에서, n 은 150 내지 200 이다. 몇몇 실시형태에서, n 은 200 내지 300, 300 내지 400, 또는 400 내지 500 이다. 다른 실시형태에서, n 은 250 내지 280이다. 다른 실시형태에서, n 은 300 내지 375이다. 다른 실시형태에서, n 은 400 내지 500이다. 특정한 실시형태에서, n 은 50±10로부터 선택된 것이다. 다른 실시형태에서, n 은 80±10, 115±10, 180±10, 225±10, 또는 275±10로부터 선택된 것이다.
특정한 실시형태에서, x 는 3 내지 50 이다. 특정한 실시형태에서, x 는 10 이다. 특정한 실시형태에서, x 는 20 이다. 또 다른 실시형태에서, x 는 15 이다. 다른 실시형태에서, x 는 5 이다. 다른 실시형태에서 x 는 5±3, 10±3, 10±5, 15±5, 또는 20±5로부터 선택된 것이다.
특정 실시형태에서, y 는 5 내지 100이다. 특정 실시형태에서, y 는 10이다. 특정 실시형태에서, y 는 20이다. 또 다른 실시형태에 따라, y 는 15이다. 또 다른 실시형태에 따라, y 는 30이다. 다른 실시형태에 따라, y 는 10±3, 15±3, 17±3, 20±5, 또는 30±5로부터 선택된 것이다.
특정한 실시형태에서, 화학식 Ⅰ의 R1 기의 R3 모이어티는 -N3이다.
다른 실시형태에서, 화학식 Ⅰ의 R1 기의 R3 모이어티는 -CH3이다.
몇몇 실시형태에서, 화학식 Ⅰ의 R1 기의 R3 모이어티는 수소이다.
특정 실시형태에서, 화학식 Ⅰ의 R1 기의 R3 모이어티는 임의적으로 치환된 지방족 기이다. 예는, 메틸, t-부틸, 5-노르보넨(norbornene)-2-일, 옥탄-5-일, 아세틸레닐(acetylenyl), 트리메틸실릴아세틸레닐(trimethylsilylacetylenyl), 트리이소프로필실릴아세틸레닐, 및 t-부틸디메틸실릴아세틸레닐을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 R3 모이어티는 임의적으로 치환된 알킬기이다. 다른 실시형태에서, 상기 R3 모이어티는 임의적으로 치환된 알키닐 또는 알케닐기이다. 상기 R3 모이어티가 치환된 지방족 기인 경우에, R3에서 치환기는, CN, N3, 트리메틸실릴, 트리이소프로필실릴, t-부틸디메틸실릴, N-메틸 프로피올아미도(methyl propiolamido), N-메틸-4-아세틸렌닐아닐리노(acetylenylanilino), N-메틸-4-아세틸렌벤조아미도(acetylenylbenzoamido), 비스-(4-에티닐-벤질)-아미노, 디프로파르길아미노(dipropargylamino), di-hex-5-ynyl-아미노, di-pent-4-ynyl-아미노, di-but-3-ynyl-아미노, 프로파르길옥시(propargyloxy), hex-5-ynyloxy, pent-4-ynyloxy, di-but-3-ynyloxy, N-메틸-프로파르길아미노, N-메틸-hex-5-ynyl-아미노, N-메틸-pent-4-ynyl-아미노, N-메틸-but-3-ynyl-아미노, 2-hex-5-ynyldisulfanyl, 2-pent-4-ynyldisulfanyl, 2-but-3-ynyldisulfanyl, 및 2-프로파르길디술파닐(propargyldisulfanyl)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 R1 기는 2-(N-메틸-N-(에티닐카르보닐(ethynylcarbonyl))아미노)에톡시, 4-에티닐벤질옥시, 또는 2-(4-에티닐페녹시)에톡시이다.
특정 실시형태에서, 화학식 Ⅰ의 상기 R1 기의 상기 R3 모이어티는, 임의적으로 치환된 아릴기이다. 예는, 임의적으로 치환된 페닐 및 임의적으로 치환된 피리딜을 포함한다. 상기 R3 모이어티가 치환된 아릴기인 경우에, R3 에서의 치환기는 CN, N3, NO2, -CH3, -CH2N3, -CH=CH2, -C≡CH, Br, I, F, 비스-(4-에티닐-벤질)-아미노, 디프로파르길아미노, di-hex-5-ynyl-아미노, di-pent-4-ynyl-아미노, di-but-3-ynyl-아미노, 프로파르길옥시(propargyloxy), hex-5-ynyloxy, pent-4-ynyloxy, di-but-3-ynyloxy, 2-hex-5-ynyloxy-에틸디술파닐(ethyldisulfanyl), 2-pent-4-ynyloxy-에틸디술파닐, 2-but-3-ynyloxy-에틸디술파닐, 2-프로파르길옥시-에틸디술파닐, 비스-벤질옥시-메틸, [1,3]디옥솔란(dioxolan)-2-일, 및 [1,3]디옥산(dioxan)-2-일을 포함한다.
다른 실시형태에서, 화학식 Ⅰ의 상기 R1 기의 상기 R3 모이어티는 보호된 알데히드 기이다. 특정 실시형태에서, 상기 R3 의 상기 보호된 알데히도 모이어티(protected aldehydo moiety)는, 비고리형 아세탈(acyclic acetal), 고리형 아세탈(cyclic acetal), 히드라존, 또는 이민이다. 대표적인 R3 기는, 디메틸 아세탈, 디에틸 아세탈, 디이소프로필 아세탈, 디벤질 아세탈, 비스(2-니트로벤질) 아세탈, 1,3-디옥산, 1,3-디옥솔란, 및 세미카르바존(semicarbazone)을 포함한다. 특정 실시형태에서, R3 은 비고리형 아세탈 또는 고리형 아세탈이다. 다른 실시형태에서, R3 는 디벤질 아세탈이다.
다른 실시형태에서, 화학식 Ⅰ의 상기 R1 기의 상기 R3 모이어티는, 보호된 카르복실산 기이다. 특정 실시형태에서, R3 의 상기 보호된 카르복실산 모이어티는, C1 -6 지방족 또는 아릴, 또는 실릴 에스테르, 활성화된 에스테르, 아미드, 또는 히드라지드(hydrazide)로부터 선택된 임의적으로 치환된 에스테르이다. 이러한 에스테르 기의 예는, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 벤질, 및 페닐 에스테르를 포함한다. 다른 실시형태에서, R3 의 상기 보호된 카르복실산은 옥사졸린 또는 오르토 에스테르이다. 이러한 보호된 카르복실산 모이어티의 예는, 옥사졸린-2-일 및 2-메톡시-[1,3]다이옥신(dioxin)-2-일을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 R1 기는 옥사졸린-2-일메톡시 또는 2-옥사졸린-2-일-1-프로폭시이다.
다른 실시형태에서, 화학식 Ⅰ의 R1 기의 상기 R3 모이어티는 검출가능한 모이어티이다. 본 발명의 하나의 측면에 따라, 화학식 Ⅰ의 R1 기의 상기 R3 모이어티는 형광 모이어티(fluorescent moiety)이다. 이러한 형광 모이어티는 본 분야에 널리 알려져 있고, 몇 가지만을 말하면, 쿠머린(coumarins), 퀴놀론(quinolones), 벤조이소퀴놀론(benzoisoquinolones), 호스타솔(hostasol), 및 로다민 염료(Rhodamine dyes)를 포함한다. R1의 상기 R3 기의 대표적인 형광 모이어티는, 안트라센-9-일, 피렌-4-일, 9-H-카르바졸(carbazol)-9-일, 로다민 B의 상기 카르복실레이트, 및 쿠마린 343의 상기 카르복실레이트를 포함한다. 특정 실시형태에서, 화학식 Ⅰ의 R1 기의 상기 R3 모이어티는, 하기로부터 선택된 검출가능한 모이어티이다:
Figure 112014095982417-pct00014
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특정 실시형태에서, 화학식 Ⅰ의 R1 기의 상기 R3 모이어티는, 클릭(Click) 화학에 적합한 기이다. 클릭 반응은, 넓은 범위의 선택적인 결합-형성하는 사건에 대해 제공하는 상승, 잘-정의된 반응 좌표(well-defined reaction coordinates)와 함께 높은-에너지["스프링-로딩된(spring-loaded)"] 지시약을 포함하는 경향이 있다(Click reactions tend to involve high-energy ("spring-loaded") reagents with well-defined reaction coordinates, giving rise to selective bond-forming events of wide scope). 예는, 스트레인된-고리 친전자체의 친핵 트래핑(the nucleophilic trapping of strained-ring electrophiles)[에폭시드(epoxide), 아지리딘(aziridines), 아지리디늄 이온(aziridinium ions), 에피술포니움 이온(episulfonium ions)], 카르보닐 반응성(carbonyl reactivity)의 특정한 형태(예를 들어, 알데히드 및 히드라진 또는 히드록시아민), 및 몇몇 타입의 고리화 첨가 반응을 포함한다. 상기 아지드-알킨 1,3-디폴라 고리화 첨가반응은 하나의 이러한 반응이다. 클릭 화학은 본 분야에 널리 알려져 있고, 본 분야의 숙련자는, 본 발명의 특정한 R3 모이어티가 클릭 화학에 대해 적절할 수 있음을 인식할 것이다.
클릭 화학에 적합한 화학식 I의 화합물의 R3기는, 몇 가지만을 말하면, 단백질, 바이러스, 및 세포와 같은 생물학적 시스템 또는 거대분자에 대한 상기 화합물을 접합(conjugating)하는데 유용하다. 클릭 반응(Click reaction)은 생리적 조건하에서 빠르고 선택적으로 진행되는 것으로 알려져 있다. 이와 대조적으로, 대부분의 접합 반응은, 단백질(예를 들어, 리신 또는 단백질 말단기)상에 1 차 아민 작용성을 사용하여 행해진다. 대부분의 단백질이 다수의 리신 및 아르기닌을 함유하기 때문에, 이러한 접합은 단백질 상에 다수의 부위에서 통제 불가능하게 발생한다. 이는, 리신 또는 아르기는이 효소 또는 다른 생체분자의 활성 부위(active site) 주변에 위치하는 경우에 특히 문제가 있다. 따라서, 본 발명의 다른 실시형태는 클릭 화학을 통해 거대분자에 대한 화학식 I의 화합물의 R1 기를 접합하는 방법을 제공한다. 본 발명의 또 다른 실시형태는 R1 기를 통해 화학식 I의 화합물에 접합된 거대분자를 제공한다.
하나의 실시형태에 따라, 화학식 Ⅰ의 상기 R1 기의 상기 R3 모이어티는, 아지드-함유하는 기이다. 다른 실시형태에 따라, 화학식 Ⅰ의 상기 R1 기의 상기 R3 모이어티는, 알킨-함유하는 기이다. 특정 실시형태에서, 화학식 Ⅰ의 상기 R1 기의 상기 R3 모이어티는, 말단 알킨 모이어티이다. 다른 실시형태에서, 화학식 Ⅰ의 상기 R1 기의 상기 R3 모이어티는, 전자를 잡아당기는 기(electron withdrawing group)를 갖는 알킨 모이어티이다. 이에 따라서, 이러한 실시형태에서, 화학식 Ⅰ의 상기 R1 기의 상기 R3 모이어티는
Figure 112014095982417-pct00015
이고, 이 식에서, E 는 전자를 잡아당기는 기이고, y 는 0 내지 6 이다. 이러한 전자를 잡아당기는 기는 본 분야의 숙련자에게 알려져 있다. 특정 실시형태에서, E 는 에스테르이다. 다른 실시형태에서, 화학식 Ⅰ의 상기 R1 기의 상기 R3 모이어티는,
Figure 112014095982417-pct00016
이고, 이 식에서 E는 -C(O)O-기와 같은 전자를 잡아당기는 기이고, y 는 0 내지 6 이다.
특정한 금속-프리 클릭 모이어티(Certain metal-free click moieties)는 문헌에서 알려져 있다. 예는, 4-디벤조시클로옥티놀(dibenzocyclooctynol)(DIBO)
Figure 112014095982417-pct00017
(from Ning et. al; Angew Chem Int Ed, 2008, 47, 2253); 디플루오르화된 시클로옥틴(difluorinated cyclooctynes)(DIFO 또는 DFO)
Figure 112014095982417-pct00018
(from Codelli, et. al.; J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 11486-11493.); 비아릴아자시클로옥티노네(biarylazacyclooctynone)(BARAC)
Figure 112014095982417-pct00019
(from Jewett et. al.; J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 3688.); 또는 비시클로노니네(bicyclononyne, BCN)
Figure 112014095982417-pct00020
(From Dommerholt, et. al.; Angew Chem Int Ed, 2010, 49, 9422-9425)를 포함한다. 금속 프리 클릭 PEG 유도체의 제조는, 이의 전체가 본원에 의해 참고문헌으로 포함되는, US 특허 출원 번호 13/601,606에 기재되어 있다.
하나의 실시형태에 따라, 화학식 Ⅰ의 상기 R1기의 상기 R3 모이어티는 금속 프리 클릭 모이어티이다. 다른 실시형태에서, 화학식 Ⅰ의 상기 R1기의 상기 R3 모이어티는 임의적으로 치환된 스트레인된 시클로옥틴 모이어티이다. 특정 실시형태에서, 화학식 Ⅰ의 상기 R1기의 상기 R3 모이어티는 하기로부터 선택된 금속 프리 클릭 모이어티이다:
Figure 112014095982417-pct00021
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상기에 일반적으로 정의된 바와 같이, Q 는 원자가 결합 또는 이가(bivalent), 포화된 또는 불포화된, 직쇄 또는 가지쇄 C1 -12 탄수화물 사슬이고, 여기서, Q의 0 내지 6의 메틸렌 단위는 독립적으로, -Cy-, -O-, -NH-, -S-, -OC(O)-, -C(O)O-, -C(O)-, -SO-, -SO2-, -NHSO2-, -SO2NH-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -OC(O)NH-, 또는 -NHC(O)O-로 대체되고, 이 식에서, -Cy-는, 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4 헤테로원자를 갖는, 임의적으로 치환된 5 내지 8 원 이가, 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 고리, 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 5 헤테로원자를 갖는, 임의적으로 치환된 8 내지 10 원 이가 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 비사이클릭 고리이다. 특정한 실시형태에서, Q 는 원자가 결합이다. 다른 실시형태에서, Q 는 원자가 결합 또는 이가(bivalent), 포화된 C1 -12 알킬렌 사슬이고, 여기서, Q의 0 내지 6의 메틸렌 단위는 독립적으로, -Cy-, -O-, -NH-, -S-, -OC(O)-, -C(O)O-, 또는 -C(O)-로 대체되고, 이 식에서, -Cy-는, 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4 헤테로원자를 갖는, 임의적으로 치환된 5 내지 8 원 이가, 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 고리, 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 5 헤테로원자를 갖는, 임의적으로 치환된 8 내지 10 원 이가 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 비사이클릭 고리이다.
특정 실시형태에서, Q 는 -Cy-이고(즉, C1 알킬렌 사슬, 이 식에서 상기 메틸렌 단위는 -Cy-로 대체된다), 이 식에서, -Cy-는, 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4 헤테로원자를 갖는, 임의적으로 치환된 5 내지 8 원 이가, 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 고리이다. 본 발명의 하나의 측면에 따라, -Cy-는 임의적으로 치환된 이가 아릴 기이다. 본 발명의 또 다른 측면에 따라, -Cy-는 임의적으로 치환된 이가 페닐 기이다. 다른 실시형태에서, -Cy- 는 임의적으로 치환된 5 내지 8 원 이가, 포화된 카르보사이클릭 고리이다. 다른 실시형태에서, -Cy-는, 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 2 헤테로원자를 갖는, 임의적으로 치환된 5 내지 8 원 이가, 포화된 헤테로사이클릭 고리이다. 대표적인 -Cy- 기는, 페닐, 피리딜, 피리미디닐, 시클로헥실, 시클로펜틸, 또는 시클로프로필로부터 선택된 이가 고리를 포함한다.
상기에 정의된 바와 같이, Rx는 히드록사메이트 또는 카테콜 함유하는 모이어티이다. 특정 실시형태에서, Rx 는 히드록삼산 함유하는 모이어티이다. 다른 실시형태에서, Rx 는 카테콜 함유하는 모이어티이다. 특정 실시형태에서, Rx 는
Figure 112014095982417-pct00022
로부터 선택된 것이다. 특정 실시형태에서, Rx 는 하기로부터 선택된 것이다:
Figure 112014095982417-pct00023
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상기에 정의된 바와 같이, Ry 는, 상기 전체적인 블록이 소수성이 되도록, 하나 또는 그 이상의 천연 또는 비천연 아미노산 곁사슬 기로부터 선택된 것이다. 이러한 소수성 아미노산 곁-사슬 기는, 임의적으로 보호된 티로신 곁-사슬, 임의적으로 보호된 세린 곁-사슬, 임의적으로 보호된 트레오닌 곁-사슬, 페닐알라닌, 알라닌, 발린, 류신, 트립토판, 프롤린, 벤질 및 알킬 글루타메이트, 또는 벤질 및 알킬 아스파르테이트 또는 이의 혼합물을 포함한다. 본 분야의 숙련자는, 극성 또는 친수성 아미노산 곁-사슬은, 아미노산이 비극성이 되게 할 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들어, 적절하게 보호된 티로신 히드록실 기는, 상기 히드록실기의 보호에 의해 티로신 비극성 및 소수성으로 되게 할 수 있다(a suitably protected tyrosine hydroxyl group can render that tyrosine nonpolar and hydrophobic by virtue of protecting the hydroxyl group). 상기 히드록실, 아미노, 및 티올에 대한 보호하는 기는, Ry 의 카르보일레이트 작용성 기가 본원에 기재된 바와 같다. 게다가, 본 분야의 숙련자는, 상기 전체적인 블록이 소수성이 되도록, 친수성 및 소수성 아미노산 곁사슬이 결합될 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들어, 대부분의 류신 곁사슬 기는, 소수의 아스파르트산 곁사슬 기와 결합될 수 있고, 결과적으로 나타낸 블록은 순 소수성(net hydrophobic)이다. 아미노산 곁-사슬 기의 이러한 혼합물은, 티로신 및 페닐알라닌, 세린 및 페닐알라닌, 아스파르트산 및 페닐알라닌, 글루탐산 및 페닐알라닌, 티로신 및 벤질 글루타메이트, 세린 및 벤질 글루타메이트, 아스파르트산 및 벤질 글루타메이트, 글루탐산 및 벤질 글루타메이트, 아스파르트산 및 류신, 및 글루탐산 및 류신을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, Ry는, 상기 전체적인 블록이 소수성이 되도록, 세 개의 천연 또는 비천연 아미노산 곁사슬 기의 혼합물로 이루어져 있다. 아미노산 곁-사슬 기의 이러한 세 개의 혼합물(Such ternary mixtures)은, 류신, 티로신, 및 아스파르트산; 류신, 티로신 및 글루탐산; 페닐알라닌, 티로신, 및 아스파르트산; 또는 페닐알라닌, 티로신, 및 글루탐산을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
다른 실시형태에 따라서, Ry기는, Ry 를 포함하는 상기 전체적인 폴리(아미노산) 블록이 소수성이고, D- 및 L-배열된 아미노산(D- and L-configured amino acids)의 혼합물이 되도록, D-소수성 및 L-친수성 아미노산 곁사슬 기의 혼합물로 이루어져 있다. 아미노산 곁사슬 기의 이러한 혼합물은, L-티로신 및 D-류신, L-티로신 및 D-페닐알라닌, L-세린 및 D-페닐알라닌, L-아스파르산 및 D-페닐알라닌, L-글루탐산 및 D-페닐알라닌, L-티로신 및 D-벤질 글루타메이트, L-티로신 및 D-벤질 아스파르테이트, L-세린 및 D-벤질 글루타메이트, L-세린 및 D-벤질 글루타메이트, L-아스파르산 및 D-벤질 글루타메이트, L-글루탐산 및 D-벤질 아스파르테이트, L-아스파르산 및 D-류신, 또한 L-글루탐산 및 D-류신을 포함한다. 이러한 혼합물의 비율(D-소수성 대 L-친수성)은 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4; 1:5, 및 1:6 중의 어떠한 것을 포함한다.
상기에 일반적으로 정의된 바와 같이, 화학식 Ⅰ의 상기 R2 기는, 모노-보호된 아민, 디-보호된 아민(di-protected amine), -NHR4, -N(R4)2, -NHC(O)R4, -NR4C(O)R4, -NHC(O)NHR4, -NHC(O)N(R4)2, -NR4C(O)NHR4, -NR4C(O)N(R4)2, -NHC(O)OR4, -NR4C(O)OR4, -NHSO2R4, 또는 -NR4SO2R4이고, 이 식에서, R4 각각은 독립적으로, 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4 헤테로원자를 갖는, 5 내지 8 원 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 고리, 지방족, 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 5 헤테로원자를 갖는, 8 내지 10 원 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 비사이클릭 고리로부터 선택된 임의적으로 치환된 기, 또는 검출가능한 모이어티이고, 또는 상기 동일한 질소 원자에서 두 개의 R4 는, 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4 헤테로원자를 갖는, 임의적으로 치환된 4 내지 7 원의 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 고리를 형성하도록, 상기 질소 원자와 함께 취해진다.
특정 실시형태에서, 화학식 Ⅰ의 R2 기는 -NHR4 또는 -N(R4)2 이고, 이 식에서 R4 각각은, 임의적으로 치환된 지방족기이다. R4 기의 예로는 5-노르보르넨-2-일-메틸(5-norbornen-2-yl-methyl)이다. 본 발명의 또 다른 측면에 따라서, 화학식 I의 R2a기는 -NHR4이고, 이 식에서 R4 는 N3으로 치환된 C1 -6 지방족기이다. 예는 -CH2N3을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, R4는 임의적으로 치환된 C1 -6 알킬기이다. 예로는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 2-(테트라히드로피란-2-일옥시)에틸), 피리딘-2-일디술파닐메틸, 메틸디술파닐메틸, (4-아세틸레닐페닐)메틸((4-acetylenylphenyl)methyl), 3-(메톡시카르보닐)-프로프-2-이닐(3-(methoxycarbonyl)-prop-2-ynyl), 메톡시카르보닐메틸, 2-(N-메틸-N-(4-아세틸레닐페닐)카르보닐아미노)-에틸, 2-프탈이미도에틸(2-phthalimidoethyl), 4-브로모벤질(4-bromobenzyl), 4-클로로벤질, 4-플루오로벤질, 4-요오드벤질(4-iodobenzyl), 4-프로파르길옥시벤질, 2-니트로벤질, 4-(비스-4-아세틸렌벤질)아미노메틸-벤질, 4-프로파르길옥시-벤질(4-propargyloxy-benzyl), 4-디프로파르길아미노-벤질, 4-(2-프로파르길옥시-에틸디술파닐)벤질, 2-프로파르길옥시-에틸, 2-프로파르길디술파닐-에틸, 4-프로파르길옥시-부틸, 2-(N-메틸-N-프로파르길아미노)에틸), 및 2-(2-디프로파르길아미노에톡시)에틸을 포함한다. 다른 실시형태에서, R4는 임의적으로 치환된 C2 -6 알케닐기이다. 예는 비닐, 알릴, 크로틸(crotyl), 2-프로페닐, 및 부트-3-에닐(but-3-enyl)을 포함한다. R4기가 치환된 지방족기인 경우에, R4에서 치환기는 N3, CN, 및 할로겐을 포함한다. 특정 실시형태에서, R4는 -CH2CN, -CH2CH2CN, -CH2CH(OCH3)2, 4-(비스벤질옥시메틸)페닐메틸 등이다.
본 발명의 다른 측면에 따라서, 화학식 Ⅰ의 R2 기는 -NHR4이고, 이 식에서 R4는 임의적으로 치환된 C2 -6 알키닐 기이다. 예는 -CC≡CH, -CH2C≡CH, -CH2C≡CCH3, 및 -CH2CH2C≡CH을 포함한다.
특정 실시형태에서, 화학식 Ⅰ의 R2기는 -NHR4이고, 이 식에서 R4는 임의적으로 치환된 5 내지 8 원 아릴 고리이다. 특정 실시형태에서, R4는 임의적으로 치환된 페닐 또는 임의적으로 치환된 피리딜이다. 예는 페닐, 4-t-부톡시카르보닐아미노페닐, 4-아지도메틸페닐, 4-프로파르길옥시페닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 및 4-피리딜을 포함한다. 특정 실시형태에서, R2a는 4-t-부톡시카르보닐아미노페닐아미노, 4-아지도메틸펜아미노, 또는 4-프로파르길옥시페닐아미노이다.
특정 실시형태에서, 화학식 Ⅰ의 R2a기는 -NHR4이고, 여기서 R4는 임의적으로 치환된 페닐환이다. R4 페닐 고리에서 적당한 치환기는 할로겐; -(CH2)0-4R°; -(CH2)0-4OR°; -(CH2)0-4CH(OR°)2; -(CH2)0-4SR°; R°로 치환될 수 있는 -(CH2)0-4Ph; R°로 치환될 수 있는 -(CH2)0-4O(CH2)0-1Ph; R°로 치환될 수 있는 -CH=CHPh; -NO2; -CN; -N3; -(CH2)0-4N(R°)2; -(CH2)0-4N(R°)C(O)R°; -N(R°)C(S)R°; -(CH2)0-4N(R°C(O)NR°2; -N(R°)C(S)NR°2; -(CH2)0-4N(R°)C(O)OR°; -N(R°)N(R°)C(O)R°; -N(R°)N(R°)C(O)NR°2; -N(R°)N(R°)C(O)OR°; -(CH2)0-4C(O)R°; -C(S)R°; -(CH2)0-4C(O)OR°; -(CH2)0-4C(O)SR°; -(CH2)0-4C(O)OSiR°3; -(CH2)0-4OC(O)R°; -(CH2)0-4SC(O)R°; -(CH2)0-4C(O)NR°2; -C(S)NR°2; -(CH2)0-4OC(O)NR°2; -C(O)N(OR°)R°; -C(O)C(O)R°; -C(O)CH2C(O)R°; -C(NOR°)R°; -(CH2)0-4SSR°; -(CH2)0-4S(O)2R°; -(CH2)0-4S(O)2OR°; -(CH2)0-4OS(O)2R°; -S(O)2NR°2; -(CH2)0-4S(O)R°; -N(R°)S(O)2NR°2; -N(R°)S(O)2R°; -N(OR°)R°; -C(NH)NR°2; -P(O)2R°2; -P(O)R°2; -OP(O)R°2; SiR°3; 여기서 각각의 R°의 독립적인 발생은 여기에 기재된 바와 같다. 다른 실시형태에 있어서, 식 I의 R2a기는 -NHR4이고, 여기서 R4는 하나 이상 임의적으로 치환된 C1 -6 지방족기로 치환된 페닐이다. 또 다른 실시형태에 있어서, R4는 비닐, 알릴, 아세틸레닐, -CH2N3, -CH2CH2N3, -CH2C=CCH3, 또는 -CH2C=CH로 치환된 페닐이다.
특정 실시형태에서, 화학식 Ⅰ의 R2 기는 -NHR4이고, 이 식에서 R4는 N3, N(R°)2, CO2R°, 또는 C(O)R°로 치환된 페닐이고, 여기서 각각의 R°는 독립적으로 상기에 정의된 바와 같다.
특정 실시형태에서, 화학식 Ⅰ의 R2기는 -N(R4)2이고, 이 식에서, R4 각각은 독립적으로, 지방족, 페닐, 나프틸, 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 갖는, 5 내지 6 원 아릴 고리, 또는 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 5 헤테로원자를 갖는, 8 내지 10 원 비사이클릭 아릴 고리로부터 선택된 임의적으로 치환된 기, 또는 검출가능한 모이어티이다.
다른 실시형태에서, 화학식 Ⅰ의 R2 기는 -N(R4)2이고, 이 식에서, 상기 2 개의 R4 기는 임의적으로 치환된 4 내지 7원 포화, 부분적으로 불포화, 또는 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4 헤테로원자를 갖는, 임의적으로 치환된 4 내지 7 원 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 고릴를 형성하기 위해, 상기 질소 원자와 함께 취해진다. 다른 실시형태에 따라, 두 개의 R4 기는 하나의 질소를 갖는 5 내지 6 원 포화 또는 부분적으로 불포화된 고리를 형성하기 위해 함께 취해지고, 상기 고리는, 1 개 또는 2 개의 옥소기(oxo group)로 치환된다. 이러한 R2 기는, 프탈이미드, 말레이미드 및 숙신이미드를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서, 화학식 Ⅰ의 R2 기는 모노-보호된 또는 디-보호된 아미노기이다. 특정 실시형태에서, R2a는 모노-보호된 아민이다. 특정 실시형태에서, R2a는 아랄킬아민(aralkylamines), 카르바메이트(carbamates), 알릴 아민, 또는 아미드로부터 선택된 모노-보호된 아민이다. 대표적인 모노-보호된 아미노 모이어티는, t-부틸옥시카르보닐아미노, 에틸옥시카르보닐아미노, 메틸옥시카르보닐아미노, 트리클로로에틸옥시-카르보닐아미노, 알릴옥시카르보닐아미노, 벤질옥소카르보닐아미노, 알릴아미노, 벤질아미노, 플루오레닐메틸카르보닐, 포름아미도, 아세트아미도, 클로로아세트아미도(chloroacetamido), 디클로로아세트아미도, 트리클로로아세트아미도, 페닐아세트아미도, 트리플루오로아세트아미도, 벤즈아미도, 및 t-부틸디페닐실릴아미노를 포함한다. 다른 실시형태에서, R2a는 디-보호된 아민이다. 대표적인 디-보호된 아미노 모이어티는, 디-벤질아미노, 디-알릴아미노, 프탈이미드, 말레이미도, 숙신이미도, 피롤로, 2,2,5,5-테트라메틸-[1,2,5]아자디실로리디노, 및 아지도를 포함한다. 특정 실시형태에서, R2a 모이어티는 프탈이미도이다. 다른 실시형태에서, 상기 R2a 부위는 모노- 또는 디-벤질아미노 또는 모노- 또는 디-알릴아미노이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 화학식 Ⅱ의 트리블록 공중합체를 제공한다 :
[화학식 Ⅱ]
Figure 112014095982417-pct00024

이 식에서:
n 은 20 내지 500이고;
m 은 0, 1, 또는 2 이고;
x 는 3 내지 50 이고;
y 는 5 내지 100 이고;
Ry 는, 상기 전체적인 블록이 소수성이 되도록, 하나 또는 그 이상의 천연 또는 비천연 아미노산 곁사슬로부터 선택된 것이고;
R1 은 -Z(CH2CH2Y)p(CH2)tR3이고, 이 식에서:
Z 는 -O-, -NH-, -S-, -C≡C-, 또는 -CH2- 이고;
Y 각각은 독립적으로 -O- 또는 -S- 이고;
p 는 0 내지 10 이고;
t 는 0 내지 10 이고; 및
R3 은, 수소, -N3, -CN, -NH2, -CH3,
Figure 112014095982417-pct00025
,
Figure 112014095982417-pct00026
,
Figure 112014095982417-pct00027
, 스트레인된 사이클로옥틴 모이어티, 모노-보호된 아민, 디-보호된 아민, 임의적으로 보호된 알데히드, 임의적으로 보호된 히드록실, 임의적으로 보호된 카르복실산, 임의적으로 보호된 티올, 또는 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4 헤테로원자를 갖는, 5 내지 8 원 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 고리, 지방족, 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 5 헤테로원자를 갖는, 8 내지 10 원 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 비사이클릭 고리로부터 선택된 임의적으로 치환된 기, 또는 검출가능한 모이어티이다.
특정 실시형태에서, 화학식 Ⅱ의 트리블록 공중합체는 표 1에 나타낸 하기의 대표적인 화합물로부터 선택된 것이다:
Figure 112014095982417-pct00028
이 식에서, n 은 20 내지 500 이고, x 는 3 내지 50 이고, y'는 3 내지 50 이고, y"는 3 내지 50 이다.
[표 1]
Figure 112014095982417-pct00029
Figure 112014095982417-pct00030

Figure 112014095982417-pct00031

Figure 112014095982417-pct00032
Figure 112014095982417-pct00033

Figure 112014095982417-pct00034
Figure 112014095982417-pct00035
Figure 112014095982417-pct00036

특정 실시형태에서, 화학식 Ⅱ의 트리블록 공중합체는 하기와 같다 :
[화학식 Ⅱ]
Figure 112014095982417-pct00037
.
특정 실시형태에서, 화학식 Ⅱ의 트리블록 공중합체는 하기와 같다 :
[화학식 Ⅱ]
Figure 112014095982417-pct00038
.
특정 실시형태에서, 화학식 Ⅱ의 트리블록 공중합체는 하기와 같다 :
[화학식 Ⅱ]
Figure 112014095982417-pct00039
.
특정 실시형태에서, 본 발명은 화학식 Ⅲ의 트리블록 공중합체를 제공한다:
[화학식 Ⅲ]
Figure 112014095982417-pct00040

이 식에서:
n 는 20 내지 500 이고;
m 은 0, 1, 또는 2 이고;
x 는 3 내지 50 이고;
y 는 5 내지 100 이고;
Ry 는, 상기 전체적인 블록이 소수성이 되도록, 하나 또는 그 이상의 천연 또는 비천연 아미노산 곁사슬 기로부터 선택된 것이고;
R1 는 -Z(CH2CH2Y)p(CH2)tR3 이고, 이 식에서:
Z 는 -O-, -NH-, -S-, -C≡C-, 또는 -CH2-이고;
Y 각각은 독립적으로 -O- 또는 -S- 이고;
p 는 0 내지 10 이고;
t 는 0 내지 10 이고; 및
R3 는, 수소, -N3, -CN, -NH2, -CH3,
Figure 112014095982417-pct00041
,
Figure 112014095982417-pct00042
,
Figure 112014095982417-pct00043
, 스트레인된 사이클로옥틴 모이어티, 모노-보호된 아민, 디-보호된 아민, 임의적으로 보호된 알데히드, 임의적으로 보호된 히드록실, 임의적으로 보호된 카르복실산, 임의적으로 보호된 티올, 또는 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4 헤테로원자를 갖는, 5 내지 8 원 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 고리, 지방족, 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 5 헤테로원자를 갖는, 8 내지 10 원 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 비사이클릭 고리로부터 선택된 임의적으로 치환된 기, 또는 검출가능한 모이어티이다.
특정 실시형태에서, 화학식 Ⅲ의 트리블록 공중합체는, 표 2 에 나타낸 하기의 대표적인 화합물로부터 선택된 것이다 :
[화학식 Ⅲ]
Figure 112014095982417-pct00044
.
이 식에서, n 은 20 내지 500 이고, x 는 3 내지 50 이고, y'은 3 내지 50 이고, y"은 3 내지 50이다.
[표 2]
Figure 112014095982417-pct00045
Figure 112014095982417-pct00046
Figure 112014095982417-pct00047

Figure 112014095982417-pct00048

Figure 112014095982417-pct00049

Figure 112014095982417-pct00050

Figure 112014095982417-pct00051
Figure 112014095982417-pct00052

특정 실시형태에서, 본 발명은 화학식 Ⅳ의 트리블록 공중합체를 제공한다:
[화학식 Ⅳ]
Figure 112014095982417-pct00053

이 식에서:
n 은 20 내지 500 이고;
m 은 0, 1, 또는 2 이고;
x 는 3 내지 50 이고;
y 는 5 내지 100 이고;
Ry 는, 상기 전체적인 블록이 소수성이 되도록, 하나 또는 그 이상의 천연 또는 비천연 아미노산 곁사슬 기로부터 선택된 것이고;
R1 는 -Z(CH2CH2Y)p(CH2)tR3이고, 이 식에서:
Z 는 -O-, -NH-, -S-, -C≡C-, 또는 -CH2-이고;
Y 각각은 독립적으로 -O- 또는 -S- 이고;
p 는 0 내지 10이고;
t 는 0 내지 10 이고; 및
R3 는, 수소, -N3, -CN, -NH2, -CH3,
Figure 112014095982417-pct00054
,
Figure 112014095982417-pct00055
,
Figure 112014095982417-pct00056
, 스트레인된 사이클로옥틴 모이어티, 모노-보호된 아민, 디-보호된 아민, 임의적으로 보호된 알데히드, 임의적으로 보호된 히드록실, 임의적으로 보호된 카르복실산, 임의적으로 보호된 티올, 또는 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4 헤테로원자를 갖는, 5 내지 8 원 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 고리, 지방족, 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 5 헤테로원자를 갖는, 8 내지 10 원 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 비사이클릭 고리로부터 선택된 임의적으로 치환된 기, 또는 검출가능한 모이어티이다.
B. 타겟팅 기 부착( Targeting Group Attachment )
클릭 화학에 적합한 R3 모이어티를 갖는 화학식 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, 및 Ⅳ의 어떠한 것의 화합물은, 몇 가지로 말하면 펩티드, 단백질, 바이러스, 및 세포와 같은 생물학적 시스템 또는 거대분자에 상기 화합물을 접합하기(conjugating) 위해 유용하다. 상기 클릭 반응은, 생리학적 조건 하에서 빠르고 선택적으로 진행하기 위해 알려져 있다. 대조적으로, 대부분의 접합 반응(conjugation reactions)은, 단백질(예를 들어, 리신 또는 단백질 말단-기)에 일차 아민 작용성(primary amine functionality)을 사용하여 수행한다. 대부분의 단백질은 다수의 리신 및 아르기닌(multitude of lysines and arginines)을 함유하기 때문에, 이러한 접합은, 상기 단백질에서 다수의 부위에서 제어할 수 없게 발생한다. 리신 또는 아르기닌이 효소 또는 그 밖의 생체분자의 활성 부위(active site) 주위에 위치된 경우에, 이는 보다 특히 문제가 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 실시형태는, 클릭 화학을 통해 거대 분자에 화학식 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ 및 Ⅳ의 어떠한 것의 화합물의 R1 기를 접합하는 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 실시형태는, R1 기를 통해 화학식 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ 및 Ⅳ의 어떠한 것의 화합물에 접합된 거대분자를 제공한다.
본 발명의 상기 멀티-블록 공중합체 내로 상기 폴리 (아미노산) 블록 일부를 포함시켜, 결과적으로 상기 서식 W-X-X'의 멀티 블록 공중합체를 결과적으로 나타낸 후에, 화학식 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, 및 Ⅳ의 어떠한 것의 상기 R1 모이어티에 대응하는, 다른 말단-기 작용성(other end-group functionality)은, 단백질, 올리고펩티드(oliogopeptides), 항체, 단당류(monosaccarides), 올리고당, 비타민, 또는 그 밖의 작은 생체 분자를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 세포 특이적인 전달을 위한 타겟팅 기(targeting groups)를 부착하는데 사용될 수 있다. 이러한 타겟팅 기는, 모노클로날 및 폴리클로날 항체(예를 들어, IgG, IgA, IgM, IgD, IgE 항체), 당류(예를 들어, 만노스, 만노스-6-포스페이트, 갈락토스), 단백질(예를 들어, 트랜스페린(Transferrin)), 올리고펩티드(oligopeptides)(예를 들어, 고리형 및 비고리형 RGD-함유하는 올리고펩티드), 및 비타민(예를 들어, 폴레이트(folate))을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 대체적으로, 화학식 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, 및 Ⅳ의 어떠한 것의 상기 R1 모이어티는 생체분자, 약물, 세포, 또는 그 밖의 기질에 결합된다.
다른 실시형태에서, 화학식 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, 및 Ⅳ의 어떠한 것의 상기 R1 모이어티는, 세포 출입(cell entry) 및/또는 엔도좀의 탈출(endosomal escape)을 촉진하는 생체분자에 결한된다. 이러한 생체분자는, HIV Tat 펩티드 서열(GRKKRRQRRR) 또는 올리고아르기닌(RRRRRRRRR)과 같은 단백질 형질도입 도메인(protein transduction domains)을 포함하는 올리고펩티드를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 이러한 올리고히스티딘(HHHHH)과 같은 다양한 pH 환경에서 구조적인 변화(conformational change)를 받는 올리고펩티드는 세포 출입 및 엔도좀의 탈출을 또한 촉진한다.
다른 실시형태에서, 화학식 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, 및 Ⅳ의 어떠한 것의 상기 R1 모이어티는, 방사성 금속(예를 들어, 62Cu)와 결합된 리간드 또는 방사성 동위원소(예를 들어, 18F)를 포함하는 분자를 포함하는 양성자 방출 단층촬영을 위한, 형광 염료 또는 표시(labels)와 같은, 검출가능한 모이어티에 결합된다. 다른 실시형태에서, 화학식 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, 및 Ⅳ의 어떠한 것의 상기 R1 모이어티는, 가둘리늄, 가둘리늄 킬레이트(gadolinium chelates), 또는 산화철(예를 들어, Fe3O4 및 Fe2O3) 입자와 같은 자기 공명 영상을 위한 조영제(contrast agent)에 결합된다. 다른 실시형태에서, 화학식 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, 및 Ⅳ의 어떠한 것의 상기 R1 모이어티는, 셀렌화 카드뮴, 황화 카드뮴, 또는 텔루르화 카드뮴(cadmium telluride)과 같은 반도체 나노입자에 결합되거나, 또는 콜로이드성 금(colloidal gold)과 같은 그 밖의 금속 나노입자에 결합된다. 다른 실시형태에서, 화학식 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, 및 Ⅳ의 어떠한 것의 상기 R1 모이어티는, 천연 또는 합성 표면, 세포, 바이러스, 염료, 약물, 킬레이트제(chelating agents)에 결합되거나 또는 히드로겔 또는 그 밖의 조직 스캐폴드(tissue scaffolds) 내로 포함하기 위해 사용된다.
하나의 실시형태에서, 화학식 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, 및 Ⅳ의 어떠한 것의 상기 R1 모이어티는, 상호 보완적인 아지드-함유하는 분자 및 생체분자(complementary azide-bearing molecules and biomolecules)와 함께 [3+2] 고리화 첨가 반응을 할 수 있는 알킨 또는 말단 알킨 유도체이다. 다른 실시형태에서, 화학식 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, 및 Ⅳ의 어떠한 것의 상기 R1 모이어티는, 상호 보완적인 알킨-함유하는 분자 및 생체분자(즉, 클릭 화학)와 함께 [3+2] 고리화 첨가 반응을 할 수 있는 아지드 또는 아지드 유도체이다.
클릭 화학은, 심지어 생물학적 배지에서도 이의 높은 반응성 및 선택성으로 인하여, 생체접합(bioconjugation)의 통속적인 방법이 되고 있다. Kolb, H.C.; Finn, M.G.; Sharpless, K.B. Angew . Chem . Int . Ed . 2001, 40, 2004-2021; and Wang, Q.; Chan, T. R.; Hilgraf, R.; Fokin, V. V.; Sharpless, K. B.; Finn, M. G. J. Am . Chem . Soc . 2003, 125, 3192-3193를 참고하라. 게다가, 현재 이용가능한 재조합 기술은, 전시 단백질(display proteins) 또는 이로 이루어진, 단백질, 세포, 바이러스, 박테리아, 및 그 밖의 생물학적 독립체(biological entities) 내로 아지드 및 알킬-함유하는 비-표준 아미노산(zides and alkyne-bearing non-canonical amino acids)의 도입을 허용한다. Link, A. J.; Vink, M. K. S.; Tirrell, D. A. J. Am . Chem . Soc . 2004, 126, 10598-10602; Deiters, A.; Cropp, T. A.; Mukherji, M.; Chin, J. W.; Anderson, C.; Schultz, P. G. J. Am . Chem . Soc. 2003 , 125, 11782-11783를 참고하라.
다른 실시형태에서, 아지드 또는 아세틸렌-함유하는 나노벡터 및 컴플리멘터리 아지드 또는 아세틸렌-함유하는 생체분자의 상기 [3+2] 고리화첨가 반응은, 촉진된 전이 금속이다(the [3+2] cycloaddition reaction of azide or acetylene-bearing nanovectors and complimentary azide or acetylene-bearing biomolecules are transition metal catalyzed). "클릭" 반응을 촉매 작용하는 구리-함유하는 분자는, 구리 브롬화물(CuBr), 염화구리(CuCl), 황산구리(CuSO4), 요오드화 구리(CuI), [Cu(MeCN)4](OTf), 및 [Cu(MeCN)4](PF6)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 유기 및 무기 금속-결합하는 리간드는, 금속 촉매와 접합에서 사용될 수 있고, 아스코르브산 나트륨, 트리스(트리아졸릴)아민 리간드, 트리스(카르복시에틸)포스핀(TCEP), 및 술폰화된 바소페난트롤린 리간드(sulfonated bathophenanthroline ligands)를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
다른 실시형태에서, 화학식 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, 및 Ⅳ의 어떠한 것의 상기 R1 모이어티는, 히드라존 결합을 형성하기 위해, 알데히드 또는 케톤을 함유하는 생체분자와 반응시킬 수 있는 히드라진 또는 히드라지드 유도체(hydrazide derivative)이다. 다른 실시형태에서, 화학식 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, 및 Ⅳ의 어떠한 것의 상기 R1 모이어티는, 히드라존 결합을 형성하기 위해, 히드라진 또는 히드라지드 유도체를 함유하는 생체분자와 반응할 수 있는 알데히드 또는 케톤 유도체이다.
다른 실시형태에서, 화학식 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, 및 Ⅳ의 어떠한 것의 상기 R1 모이어티는, 알데히드 또는 케톤을 포함하는 생체분자와 반응할 수 있는 히드록실아민 유도체(hydroxylamine derivative)이다. 다른 실시형태에서, 화학식 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, 및 Ⅳ의 어떠한 것의 상기 R1 모이어티는, 히드록실아민, 또는 히드록실아민 유도체를 포함하는 생체분자와 반응할 수 있는 알데히드 또는 케톤이다.
다른 실시형태에서, 화학식 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, 및 Ⅳ의 어떠한 것의 상기 R1 모이어티는, 이민 결합을 형성하기 위해, 일차 또는 이차 이민을 포함하는 생체분자와 반응할 수 있는 알데히드 또는 케톤 유도체이다. 다른 실시형태에서, 화학식 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, 및 Ⅳ의 어떠한 것의 상기 R1 모이어티는, 이민 결합을 형성하기 위해, 알데히드 또는 케논 작용성을 함유하는 생체분자와 반응할 수 있는 일차 또는 이차 아민이다. 이민 결합이 환원제(reducing agent)[예를 들어, 수소화 알루미늄리튬, 수소화 붕소 나트륨, 시안화 수소화 붕소 나트륨(sodium cyanoborohydride) 등]과 처리에 의해 안정한 아민 결합으로 추가적으로 변환할 수 있음이 예측될 것이다.
또 다른 실시형태에서, 화학식 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, 및 Ⅳ의 어떠한 것의 상기 R1 모이어티는, 아미드 또는 에스테르 결합을 형성하기 위해, 활성화된 에스테르(예를 들어, 4-니트로페놀 에스테르, N-히드록시숙신이미드, 펜타플루오로페닐 에스테르, 오르토-피리딜티오에스테르를 함유하는 생체분자와 반응할 수 있는 알코올 또는 아민(일차 또는 이차)이다. 다른 실시형태에서, 화학식 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, 및 Ⅳ의 어떠한 것의 상기 R1 모이어티는, 아미드 또는 에스테르 결합을 형성하기 위해, 아민(일차 또는 이차) 또는 알코올을 보유하는 생체분자와 반응할 수 있는 활성화된 에스테르이다.
또 다른 실시형태에서, 화학식 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, 및 Ⅳ의 어떠한 것의 상기 R1 모이어티는, 커플링제(coupling agent)를 사용하여 카르복실산 작용기와 생체분자에 결합된 아민 또는 알코올이다. 또 다른 실시형태에서, 화학식 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, 및 Ⅳ의 어떠한 것의 상기 R1 모이어티는, 커플링제를 사용하여 아민 또는 알코올 작용성을 함유하는 생체분자에 결합된 카르복실산 작용성(carboxylic acid functionality)이다. 이러한 커플링제는, 카르보디이미드(예를 들어, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드(EDC), 디이소프로필 카르보디이미드(DIC), 디시클로헥실 카르보디이미드(DCC)), 아미니움(aminium) 또는 포스포늄 유도체(phosphonium derivatives)(예를 들어, PyBOP, PyAOP, TBTU, HATU, HBTU), 또는 1-히드록시벤조트라아졸(HOBt) 및 아미니움(aminium) 또는 포스포늄 유도체의 조합(combination)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
다른 실시형태에서, 화학식 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, 및 Ⅳ의 어떠한 것의 상기 R1 모이어티는, 티올 또는 아민을 함유하는 생체분자와 반응할 수 있는, 말레이미드(maleimide), 말레이미드 유도체, 또는 브로모아세트아미드 유도체(bromoacetamide derivative)와 같은 친전자체이다. 다른 실시형태에서, 화학식 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, 및 Ⅳ의 어떠한 것의 상기 R1 모이어티는, 말레이미드, 말레이미드 유도체, 또는 브로모아세트아미드 유도체와 같은 친전자성 작용성(electrophilic functionality)을 함유하는 생체분자와 반응 또는 반응할 수 있는 아민 또는 티올과 같은 친핵체이다.
다른 실시형태에서, 화학식 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, 및 Ⅳ의 어떠한 것의 상기 R1 모이어티는, 티올 작용성을 함유하는 생체분자와 이황화물 교환을 받는 오르토-피리딜 이황화물 모이어티(ortho-pyridyl disulfide moiety)이다. 다른 실시형태에서, 화학식 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, 및 Ⅳ의 어떠한 것의 상기 R1 모이어티는, 오르토-피리딜 이황화물 모이어티를 함유하는 생체분자와 이황화물 교환을 하는 티올 또는 티올 유도체이다. 이러한 교환 반응이, 환원제(예를 들어, 글루타티온, 디티오트레이톨(DTT) 등)의 존재에서 가역적인, 이황화물 결합을 결과적으로 나타냄을, 인지할 것이다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 미셀은, 화학식 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, 및 Ⅳ의 하나 또는 그 이상의 화합물을 포함하는 혼합된 미셀이다. 본원에 기재된 바와 같은 상이한 R1 기를 갖는 혼합된 미셀이, 많은 다른 화합물 및/또는 거대분자와 접합할 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들어, 본 발명의 혼합된 미셀은, 다양한 커플링 반응(coupling reacions)을 통해 공유 부착(covalent attachment)에 적합한 또 다른 R1 기 및 클릭 화학에 적합한 하나의 R1 기를 가질 수 있다. 이러한 혼합된 미셀은, 이러한 상이한 R1 기를 통해 상이한 화합물 및/또는 거대분자에 접합될 수 있다. 이러한 접합 반응은 본 분야의 숙련자에게 널리 알려져 있고, 본원에 기재된 것을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 화학식 Ⅴ의 트리블록 공중합체를 제공한다:
[화학식 Ⅴ]
Figure 112014095982417-pct00057
이 식에서, Q, x , y, n, Rx, Ry 및 R2 각각은 상기에 정의된 바와 같고, 둘 다 개별적으로 및 조합으로, 본원에 분류(classes) 및 하부분류(subclasses)로 기재된 바와 같고;
J 는 독립적으로, 원자가 결합 또는 이가, 포화된 또는 불포화된, 직쇄 또는 가지쇄 C1 -12 탄화수소 사슬이고, 여기서, Q의 0 내지 6 메틸렌 단위는 독립적으로 -Cy-, -O-, -NH-, -S-, -OC(O)-, -C(O)O-, -C(O)-, -SO-, -SO2-, -NHSO2-, -SO2NH-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -OC(O)NH-, 또는 -NHC(O)O-로 대체되고, 이 식에서:
-Cy- 는, 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4 헤테로원자를 갖는, 임의적으로 치환된 5 내지 8 원 이가, 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 고리, 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 5 헤테로원자를 갖는, 임의적으로 치환된 8 내지 10 원 이가 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 비사이클릭 고리이고;
T 각각은 독립적으로 타겟팅 기이다.
상기에 일반적으로 기재된 바와 같이, T는 타겟팅 기이다. 이러한 타겟팅 기는, 이의 전체가 참고문헌으로 본원에 의해 포함된, 2009년 4월 30일에 공개된, 미국 특허 출원 공개 번호 2009/0110662에 상세히 기재되어 있다. 추가적인 타겟팅 기는, 이의 전체가 참고문헌으로 본원에 의해 포함된, 2012년 3월 9일에 공개된, 미국 특허 출원 번호 13/415,910에 상세히 기재되어 있다.
특정 실시형태에서, 상기 J 기는 상기에 기재된 바와 같이 원자가 결합이다. 특정 실시형태에서, 상기 J 기는 메틸렌 기이다. 다른 실시형태에서, 상기 J 기는 카르보닐 기이다. 특정 실시형태에서 화학식 Ⅴ의 상기 J 기는 원자가 결합이다. 다른 실시형태에서, 상기 J 기는 표 3에서 모이어티에 의해 나타내었다.
[표 3]
Figure 112014095982417-pct00058
Figure 112014095982417-pct00059

C. 미셀의 형성
본원에 기재된 바와 같이, 양쪽성 멀티블록 공중합체는, 나노- 및 마이크론-크기된 구조를 형성하기 위해, 수용액에서 자가-조립할 수 있다. 물에서, 이러한 양쪽성 멀티블록 공중합체는, 임계의 미셀 농도(critical micelle concentration, CMC) 이상의 용액에 존재한 경우에, 멀티-분자 미셀화(multi-molecular micellization)에 의해 조립된다. 어떠한 특정한 이론에 의해 얽매이지 않고, 상기 공중합체의 상기 소수성 폴리(아미노산) 일부 또는 "블록"은 상기 미셀의 코어(micellar core)를 형성하기 위해 붕괴되면서, 상기 친수성 PEG 블록은, 주변의 코로나(peripheral corona)를 형성하고, 수용성(water solubility)을 부여하는 것으로 알려져 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명에 따른 상기 멀티블록 공중합체는, 미셀을 형성하는 분명한 소수성 및 친수성 세그먼트를 소유한다. 게다가, 이러한 멀티블록 중합체는 임의적으로, 교차결합을 위해 작용성을 함유하는 폴리(아미노산) 블록을 임의적으로 포함한다. 이러한 작용성이 이에 대응하는 아미노산 곁사슬에서 발견됨을 인지할 것이다.
D. 약물 로딩( Drug Loading )
하나의 실시형태에 따라, 본 발명은, 중합체성 친수성 블록, 임의적으로 교차결합 가능한 또는 교차결합된 폴리(아미노산 블록), 및 소수성 D,L-혼합된 폴리(아미노산) 블록을 포함하는 트리블록 공중합체를 포함하는 미셀을 제공하고, 상기 미셀은 내부의 코어, 임의적으로 교차결합 가능한 또는 교차결합된 외부의 코어, 및 친수성 셀을 갖는 것을 특징으로 한다. 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 미셀은 치료학적 제제를 캡슐화하기 위해 특히 유용하다. 특정 실시형태에서, 상기 치료학적 제제는 소수성이다.
어떠한 특정한 이론에 얽매이지 않고, 본 발명의 미셀 내의 구조적으로 다양한 치료학적 제제의 순응(accomodation)은, 상기 소수성 D,L-혼합된 폴리(아미노산) 블록, 즉 Ry 를 포함하는 상기 블록을 조절함으로써 달성되는 것으로 여겨진다. 상기에 기재된 바와 같이, D 및 L 입체이성질체의 상기 소수성 혼합물은, 무작위의 코일 배열을 갖는 폴리(아미노산) 블록을 제공하고, 이로 인하여 소수성 약물의 캡슐화를 증진시킨다.
본 발명의 미셀 내로 로딩에 적절한 소수성 작은 분자 약물은 본 분야에 널리 알려져 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같이 약물-로딩된 미셀을 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같이 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 약물은, 하기에, 본원에 기재된 것들로부터 선택된 소수성 약물이다.
본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어 소수성 작은 분자 약물, 작은 분자 약물, 치료학적 제제, 및 소수성 치료학적 제제는 모두 상호교환적이다.
다른 실시형태에 따라, 본 발명은, 화학식 Ⅰ의 트리블록 공중합체 및 치료학저 제제를 포함하는 약물-로딩된 미셀을 제공한다.
다른 실시형태에 따라, 본 발명은 화학식 Ⅰ의 트리블록 공중합체 및 소수성 치료학적 제제를 포함하는 약물-로딩된 미셀을 제공한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은, 화학식 Ⅰ의 트리블록 공중합체 및 소수성 치료학적 제제를 포함하는 시스템을 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은, 단독으로 또는 조합으로, 화학식 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ 및 Ⅳ 중 어떠한 것의 트리블록 공중합체, 및 소수성 치료학적 제제를 포함하는 시스템을 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은, 화학식 Ⅱ의 트리블록 공중합체 및 소수성 치료학적 제제를 포함하는 시스템을 제공한다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명은, 화학식 Ⅰ의 멀티블록 공중합체 및 화학식 Ⅴ의 멀티블록 공중합체를 포함하는, 이에 캡슐화된 적절한 소수성 치료학적 제제를 갖는, 미셀을 제공하고, 여기서, 화학식 Ⅰ 및 화학식 Ⅴ의 각각은 상기에 정의된 바와 같고, 본원에 기재되어 있고, 화학식 Ⅰ 대 화학식 Ⅴ의 비율은 1000 : 1 과 1 : 1 사이이다. 다른 실시형태에서, 상기 비율은 1000 : 1, 100 : 1, 50 : 1, 33 : 1, 25 : 1, 20 : 1, 10 : 1, 5 : 1, 또는 4 : 1 이다. 다른 실시형태에서, 상기 비율은 100 : 1과 25 : 1 사이이다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명은, 화학식 Ⅱ의 멀티블록 공중합체 및 화학식 Ⅴ의 멀티블록 공중합체를 포함하는, 이에 캡슐화된 소수성 치료학적 제제를 갖는, 미셀을 제공하고, 여기서, 화학식 Ⅱ 및 화학식 V 각각은 상기에 정의된 바와 같고, 본원에 기재되어 있고, 화학식 Ⅱ 대 화학식 V의 비율은 1000 : 1과 1 : 1 사이이다. 다른 실시형태에서, 상기 비율은 1000:1, 100:1, 50:1, 33:1, 25:1, 20:1, 10:1, 5:1, 또는 4:1이다. 다른 실시형태에서, 상기 비율은 100:1과 25:1 사이이다.
화학식 Ⅰ의 R1, R2a, Q, Rx, Ry, n, m, 및 m' 기의 각각에 대한 실시형태는, 본원에, 개별적으로 및 조합으로, 다양한 분류 및 하부분류에 기재된 바와 같다.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 기재된 바와 같이, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 약물은 탁산이다.
탁산은 문헌에서 널리 공지되어 있고, 상기 속 주목( Taxus )의 식물에 의해 생산되는 천연 생산물이다. 작용의 매커니즘은 미세소관 안정화(microtubule stabilization)이고, 따라서 유사분열(mitosis)을 저해한다. 많은 탁산은 물에 좋지 못한 가용성 또는 거의 완전한게 불용성이다. 대표적인 에포틸론(epothilones)이 하기에 기재되어 있다.
Figure 112014095982417-pct00060

에포틸론은, 파클리탁셀과 유사한 메커니즘, 미세소관 안정화제인 것으로 나타내고 있는 분자의 그룹이다(Bollag DM et al. Cancer Res. 1995, 55, 2325-2333). 생화학적 연구는, 에포틸론이 튜불린으로부터 파클리탁셀을 대체할 수 있고, 이들은 동일한 부위에 대해 경쟁함을 제시한다(Kowalski RJ, Giannakakou P, Hamel E. J Biol Chem. 1997, 272, 2534-2541). 상기 에포틸론의 하나의 장점은, 이들이 파클리탁셀과 비교된 PGP 과잉발현하는 세포에서 보다 높은 세포 독성 효과를 행사하는 것이다. 대표적인 에포틸론은 하기에 나타낸 것이다.
Figure 112014095982417-pct00061
Figure 112014095982417-pct00062
.
특정 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같이, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 약물은 파클리탁셀이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같이, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 약물은 도세탁셀(docetaxel)이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같이, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 약물은 카바지탁셀(cabazitaxel)이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같이, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 약물은 에포틸론이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같이, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 약물은 에포틸론 B 또는 에포틸론 D이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같이, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 약물은 에포틸론 A 또는 에포틸론 C이다.
빈카 알카로이드(vinca alkaloid)는 본 문헌에 널리 공지되어 있고, 항-유사분열 제제의 세트이다. 빈카 알카로이드는, 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 빈데신(vindesine), 및 비노렐빈(vinorelbine)을 포함하고, 미세소관의 형성하는 것을 예방하는 역할을 한다. 대표적인 빈카 알카로이드는 하기에 나타낸 것이다.
Figure 112014095982417-pct00063
Figure 112014095982417-pct00064
.
특정 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같이, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 약물은 빈카 알카로이드이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같이, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 약물은 비노렐빈이다.
베르베린(Berberine)은 문헌에 널리 알려져 있고, 항균성 및 종양학 적용을 포함하는 적용의 범위에서 약제학적 효과를 나타낸다. 상기 베르베린 및 관련된 유도체의 항-종양 활성도는 Hoshi, et.al. Gann, 1976, 67, 321-325에 기재되어 있다. 명확하게, 베르베린 및 베르베린의 에스테르 유도체는 베르베린에 대한 증가된 항-종양 활성도를 갖는 것으로 보여준다. 베르베린 및 베르베르루빈(berberrubine)의 구조는 하기에 기재되어 있다.
Figure 112014095982417-pct00065
.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 기재된 바와 같이, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 약물은 베르베린이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 기재된 바와 같이, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 약물은 베르베르루빈이다.
상기 항종양 식물 알칼로이드 캄토테신(alkaloid camptothecin, CPT)은, DNA 토포이소머라아제 Ⅰ(DNA topoisomerase I)를 타겟하는, 폭넓은 효능을 지닌 항암제이다. CPT가 생체외 및 생체내에서 항종양 활성도를 약속하는 것을 나타낼지라도, 이는 이의 낮은 치료학적 효능 및 심각한 톡성으로 인하여 임상적으로 사용되지 않는다. CPT 유사체 중에서, 이리노테칸 염산염(irinotecan hydrochloride, CPT-11)는, 결장, 폐, 및 난소 암에 대항하는 활성을 갖는 것을 최근에 나타내었다. CPT-11 이 자체는 프로드러그이고, 생체 내 카르복실에스테라아제(carboxylesterases)에 의해, CPT-11의 생물학적 활성 대사물질, 7-에틸-10-히드록시-CPT(SN-38로서 알려짐)로 변환된다. 다수의 캠토테신은 개발되고 있고, 이의 구조가 하기에 기재되어 있다.
Figure 112014095982417-pct00066
Figure 112014095982417-pct00067
Figure 112014095982417-pct00068
.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 기재된 바와 같이, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 약물은 캠토테신이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 기재된 바와 같이, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 약물은 SN-38이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 기재된 바와 같이, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 약물은 S39625이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 기재된 바와 같이, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 약물은 안트라사이클린(anthracycline)이다.
몇몇의 안트라사이클린 유도체가 생산되고 있고, 백혈병, 호지킨 림프종, 뿐만 아니라 방광, 유방, 위, 폐, 난소, 갑상성의 암, 및 연부조직 육종(soft tissue sarcoma)의 치료를 위한 진료에서의 용도가 발견되고 있다. 이러한 안트라사이클린 유도체는, 다우노루비신(daunorubicin)[다우노마이신(Daunomycin) 또는 다우노마이신 세루비딘(daunomycin cerubidine)로서 또한 알려짐], 독소루비신[DOX, 히드록시다우노루비신, 또는 아드리아마이신(adriamycin)로서 또한 알려짐], 에피루비신(epirubicin)[엘렌스(Ellence) 또는 파모루비신(Pharmorubicin)으로서 또한 알려짐], 이다루비신(idarubicin)[4-데메톡시다우노루비신, 자베도스(Zavedos), 또는 이다마이신(Idamycin)으로서 또한 알려짐], 및 발루비신(valrubicin)[N-트리플루오로아세틸아드리아마이신-14-발레레이트(N-trifluoroacetyladriamycin-14-valerate) 또는 발스타(Valstar)로서 또한 알려짐]을 포함한다. 안트라사이클린은, 물 수용성(water solubility)을 개선하기 위해 암모늄 염(예를 들어, 염화수소 염)으로서 일반적으로 제공되고, 투여를 용이하게 할 수 있다.
Figure 112014095982417-pct00069
Figure 112014095982417-pct00070
.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 기재된 바와 같이, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 약물은 다우노마이신이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 기재된 바와 같이, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 약물은 독소루비신이다.
아미노프테린은 문헌에 널리 알려져 있고, 항신생 제제(antineoplastic agent)인 폴산의 유사체이다. 아미노프테린은, 효소 디히드로폴레이트 환원효소(enzyme dihydofolate reductase)의 상기 폴레이트 결합 부위에 대해 경쟁함으로써 효소 억제제로서 작용한다. 아미노프테린의 구조는 하기에 기재되어 있다.
Figure 112014095982417-pct00071
.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 기재된 바와 같이, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 약물은 아미노프테린이다.
플래티늄 기초된 치료학(Platinum based therapeutics)은 문헌에 널리 알려져 있다. 플래티늄 치료는 종양학에서 널리 사용되었고, 세포 사열(아포토시스)를 결과적으로 나타내는 DNA를 교차결합하도록 작용한다. 카르보플라틴(Carboplatin), 피코플라틴(picoplatin), 시스플라틴(cisplatin), 및 옥사플라틴(oxaliplatin)은 대표적인 플래티늄 치료학이고, 상기 구조는 하기에 기재된 바와 같다.
Figure 112014095982417-pct00072
.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 기재된 바와 같이, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 약물은 피코플라틴(picoplatin)이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 기재된 바와 같이, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 약물은 플래티늄 치료제(platinum therapeutic)이다.
본 발명의 미셀 내로 로딩하기에 적절한 작은 분자 약물은 본 분야에 널리 알려져 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같이 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 약물은, 진통제(analgesics), 항-염증제(anti-inflammatory agents), HDAC 저해제, 유사분열 저해제(mitotic inhibitors), 미세소관 안정화제, DNA 인터칼라토르스(DNA intercalators), 토이포이소머라아제 저해제(topoisomerase inhibitors), 항기생충제(antihelminthics), 항-부정맥제, 항-세균성 제제, 항-바이러스성 제제, 항-응고제, 항-진정제(anti-depressants), 항-당뇨병 약(anti-diabetics), 항-간질약(anti-epileptics), 항-균류 제제(anti-fungal agents), 항-통풍 제제(anti-gout agents), 항-고혈압 제제, 항-말라리아 약, 항-편두통 제제(anti-migraine agents), 항-무스카린 제제(anti-muscarinic agents), 항-신생성 제제(anti-neoplastic agents), 발기 부전 개선 제제, 면역억제제, 항-원생동물의 제제(anti-protozoal agents), 항-갑상선 제제, 불안완화제(anxiolytic agents), 진정제, 최면제(hypnotics), 신경이완제(neuroleptics), 베타-차단제(β-blockers), 심근 수축제(cardiac inotropic agents), 코르티코스테로이드, 이뇨제(diuretics), 항-파킨슨 제제(anti-parkinsonian agents), 위장 제제(gastro-intestinal agents), 히스타민 수용체 길항제(histamine receptor antagonists), 케라톨리프틱스(keratolyptics), 지질 조절제(lipid regulating agents), 항-협심증제(anti-anginal agents), Cox-2 저해제, 류코트리엔 저해제(leukotriene inhibitors), 마크로라이드(macrolides), 근육이완제, 영양제(nutritional agents), 오피오드 진통제(opiod analgesics), 프로테아제 저해제, 성 호르몬, 촉진제(stimulants), 근육 이완제, 항-골다공증 제제(anti-osteoporosis agents), 항-비만 제제, 인지 증진제(cognition enhancers), 항-요실금 제제, 항-전립선 비대증 제제, 필수 지방산, 비-필수 지방산, 및 이의 혼합물로부터 선택된 소수성 약물이다.
다른 실시형태에서, 상기 소수성 약물은, 하나 또는 그 이상의 진통제, 항-세균성 제제, 항-바이러스성 제제, 항-염증성 제제, 항-진정제, 항-당뇨병 약, 항-간질약, 항-고혈압 제제, 항-편두통 제제, 면역 억제제, 불안완화제, 진정제, 최면제, 신경 이완제, 베타-차단제, 위장 제제, 지질 조절제, 항-협심증제, Cox-2 저해제, 류코트리엔 저해제, 마크로라이드, 근육이완제, 오피오드 진통제, 프로테아제 저해제, 성 호르몬, 인지 증진제, 항-요실금 제제, 및 이의 혼합물로부터 선택된 것이다.
하나의 측면에 따라, 본 발명은, 엑세메스테인(Exemestance)(aromasin), 캄포사르(Camptosar)(irinotecan), 엘렌스(Ellence)(epirubicin), 페마라(Femara)(Letrozole), 글레박(Gleevac)(imatinib mesylate), 렌타론(Lentaron)(formestane), 시타드렌/오리메텐(Cytadren/Orimeten)(aminoglutethimide), 테모다르(Temodar), 프로스카르(Proscar)(finasteride), 비아두르(Viadur)(leuprolide), 네사바르(Nexavar)(Sorafenib), 카이트릴(Kytril)(Granisetron), 탁소텔(Taxotere)(Docetaxel), 탁솔(Taxol)(paclitaxel), 키아트릴(Kytril)(Granisetron), 베사노이드(Vesanoid)(tretinoin)(레틴 A), XELODA(Capecitabine), 아리미덱스(Arimidex)(Anastrozole), 카소덱스/코수덱스(Casodex/Cosudex)(Bicalutamide), 파슬로덱스(Faslodex)(Fulvestrant), 이레사(Iressa)(Gefitinib), 놀바덱스(Nolvadex), 이스투발(Istubal), 발로덱스(Valodex)(tamoxifen citrate), 토무덱스(Tomudex)(Raltitrexed), 졸라덱스(Zoladex)(goserelin acetate), 류스타틴(Leustatin)(Cladribine), 벨카데(Velcade)(bortezomib), 밀로타르그(Mylotarg)(gemtuzumab ozogamicin), 알림타(Alimta)(pemetrexed), 젬자르(Gemzar)(gemcitabine hydrochloride), 리툭산(Rituxan)(rituximab), 레블리미드(Revlimid)(lenalidomide), 탈로마이드(Thalomid)(thalidomide), 알케란(Alkeran)(melphalan), 및 이의 유도체로부터 선택된 소수성 약물로 로딩된, 본원에 기재된 바와 같은, 미셀을 제공한다.
E. 교차결합 화학( Crosslinking Chemistries )
특정 실시형태에서, 본 발명은, pH 7.4 (혈액)에서 소수성 및 이온성 치료학적 제제를 효과적으로 캡슐화하지만, 5.0(엔도좀의 pH) 내지 6.8(세포외 종양 pH) 사이의 범위에서 타겟된, 산성의 pH 수치에서 상기 약물을 방출하고, 분해하는, 교차결합된 미셀을 제공한다. 다른 실시형태에서, 상기 pH 수치는 4.0 내지 7.4 사이로 조절될 수 있다. 이러한 pH-타겟된 나노벡터는, 항암화학 제제의 암-특이적인 전달을 극적으로 향상시키고, 잠재적인 화학 요법 약물과 공통으로 접하는 해로운 부작용을 최소화할 것이다. 게다가, pH 수치의 범위를 가로질러 분해하도록 조절할 수 있는 화학의 이용은, 약물 저항(drug resistant)이 되는 고형 종양 및 악성 종양을 치료하는데 적용될 수 있는 이러한 약물-로딩된 미셀을 제조한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 트리블록 공중합체를 포함하는 약물 로딩된 미셀을 제공하고, 상기 미셀은 약물 로딩된 내부 코어, 교차결합된 외부 코어, 및 소수성 셀을 가지고, 상기 트리블록 공중합체는 화학식 Ⅵ의 것이다(the triblock copolymer is of formula VI):
[화학식 Ⅵ]
Figure 112014095982417-pct00073

이 식에서,
Q, J, T, x , y, n, Rx, Ry 및 R2 각각은 상기에 정의된 바와 같고, 개별적으로 또는 조합으로, 본원에 분류 및 하부분류에 기재된 바와 같고;
M 은 금속 이온이고;
RT 각각은 독립적으로, -J-T 또는 -Z(CH2CH2Y)p(CH2)tR3으로부터 선택된 것이고, 이 식에서:
Z 는 -O-, -S-, -C≡C-, 또는 -CH2- 이고;
Y 각각은 독립적으로 -O- 또는 -S-이고;
p 는 0 내지 10이고;
t 는 0 내지 10이고; 및
R3는, 수소, -N3, -CN, 모노-보호된 아민, 디-보호된 아민, 보호된 알데히드, 보호된 히드록실, 보호된 카르복실산, 보호된 티올, 9 내지 30 원 크라운 에테르(crown ether), 또는 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4 헤테로원자를 갖는, 5 내지 8 원 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 고리, 지방족, 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 5 헤테로원자를 갖는 8 내지 10 원 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 비사이클릭 고리로부터 선택된 임의적으로 치환된 기, 또는 검출가능한 모이어티이고;
Q 는 원자가 결합 또는 이가, 포화된 또는 불포화된, 직쇄 또는 가지쇄 C1 -12 탄수화물 사슬이고, 여기서, Q의 0 내지 6의 메틸렌 단위는 독립적으로, -Cy-, -O-, -NH-, -S-, -OC(O)-, -C(O)O-, -C(O)-, -SO-, -SO2-, -NHSO2-, -SO2NH-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -OC(O)NH-, 또는 -NHC(O)O-로 대체되고, 이 식에서:
-Cy-는, 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4 헤테로원자를 갖는 임의적으로 치환된 5 내지 8 원 이가, 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 고리, 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 5 헤테로원자를 갖는, 임의적으로 치환된 8 내지 10 원 이가 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 비사이클릭 고리이다.
특정 실시형태에서, M 은 철이다. 다른 실시형태에서, M 은 아연이다. 다른 실시형태에서, M 은 니켈, 코발트, 구리 또는 플래티늄이다. 다른 실시형태에서, M은 칼슘 또는 알루미늄이다. 다른 실시형태에서, M 은, 스트론튬, 망간, 플래티늄, 팔라디늄(palladium), 은, 금, 카드뮴, 인듐 또는 납이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 트리블록 공중합체를 포함하는 약물 로딩된 미셀을 제공하고, 상기 미셀은 약물-로딩된 내부 코어, 교차결합된 외부 코어, 및 친수성 셀을 가지고, 상기 트리블록 공중합체는 화학식 Ⅶ의 것이다:
[화학식 Ⅶ]
Figure 112014095982417-pct00074
이 식에서,
Q, J, T, M, m, y, n, Ry 및 RT 각각은, 상기에 정의된 바와 같고, 개별적으로 또는 조합으로 본원에 분류 및 하부분류에 기재된 바와 같고;
x1 는 1 내지 20 이고;
x2 는 0 내지 20 이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 트리블록 공중합체를 포함하는 약물 로딩된 미셀을 제공하고, 상기 미셀은 약물-로딩된 내부 코어, 교차결합된 외부 코어, 및 친수성 셀을 가지고, 상기 트리블록 공중합체는 화학식 Ⅷ의 것이다:
[화학식 Ⅷ]
Figure 112014095982417-pct00075

이 식에서,
Q, J, T, M, m, y, n, Ry 및 RT 각각은, 상기에 정의된 바와 같고, 개별적으로 또는 조합으로 본원에 분류 및 하부분류에 기재된 바와 같다.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 트리블록 공중합체를 포함하는 약물 로딩된 미셀을 제공하고, 상기 미셀은 약물-로딩된 내부 코어, 교차결합된 외부 코어, 및 친수성 셀을 가지고, 상기 트리블록 공중합체는 화학식 Ⅸ의 것이다:
[화학식 Ⅸ]
Figure 112014095982417-pct00076

이 식에서,
M, x1, x2, 및 n 각각은, 상기에 정의된 바와 같고, 개별적으로 또는 조합으로 본원에 분류 및 하부분류에 기재된 바와 같고;
y1 은 5 내지 30 이고;
y2 는 10 내지 40 이다.
본 발명의 상기 약물 로딩된, 교차결합된 미셀이 수십에서 수백의 중합체 사슬로 이루어진 것임이 본 분야의 숙련자에게 명백할 것이다. 금속 이온에 의해 결합된 오직 두 개의 중합체 사슬이 화학식 Ⅵ, Ⅶ, Ⅷ, 또는 Ⅸ의 어떠한 것에 나타낸 것인 사실에도 불구하고, 상기 중합체 미셀이, 제시의 용이함으로 나타내지 않은, 많은 그 보다 많은 중합체 사슬로 이루어짐을 이해할 것이다.
다른 실시형태에서, 본 발명은, 화학식 Ⅰ의 트리블록 공중합체, 소수성 치료학적 제제, 및 금속 이온을 포함하는 시스템을 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은, 개별적으로 또는 조합으로, 화학식 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, 및 Ⅳ 중 어떠한 것의 트리블록 공중합체, 치료학적 제제, 및 금속 이온을 포함하는 시스템을 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은, 화학식 Ⅱ의 트리블록 공중합체, 소수성 치료학적 제제, 및 금속 이온을 포함하는 시스템을 제공한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은, 화학식 Ⅵ의 트리블록 공중합체 및 소수성 치료학적 제제를 포함하는 시스템을 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은, 개별적으로 또는 조합으로, 화학식 Ⅵ, Ⅶ, Ⅷ, 및 Ⅸ 중 어떠한 것의 트리블록 공중합체 및 소수성 치료학적 제제를 포함하는 시스템을 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은, 화학식 Ⅶ의 트리블록 공중합체 및 소수성 치료학적 제제를 포함하는 시스템을 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은, 개별적으로 또는 조합으로, 화학식 Ⅸ 의 트리블록 공중합체 및 소수성 치료학적 제제를 포함하는 시스템을 제공한다.
금속-매개된 교차결합의 궁극적인 목표는, 혈액(pH 7.4)에서 희석된 다음에, 종양 환경에서 발견되는 것과 같은 한정된 pH 변화에 대한 반응으로 빠른 용해 및 약물 방출을 하는 경우, 미셀 안정성을 보장하게 하는 것이다.
본 발명의 하나의 측면에서, 약물-로딩된 미셀은, 히드록삼산 모이어티를 통해 교차결합된다. 상기에 기재된 바와 같이 히드록삼산, Rosthauser et. al. Macromolecules 1981, 14, 538-543 and in Miller Chemical Reviews 1989, 89, 1563-1579 (이하에 "Miller")에 기재된 바와 같은 킬레이트 특정한 금속. 이러한 킬레이션 화학(chelation chemistry)은 도식 1에 기재되어 있다.
도식 1
Figure 112014095982417-pct00077
Figure 112014095982417-pct00078

이에 따라, 본 발명의 약물 로딩된 미셀에 금속 이온의 첨가는, 교차결합된, 약물 로딩된 미셀을 제공하는, 상기 히드록삼산에 의해 상기 금속 이온의 킬레이트화(chelation)를 결과적으로 나타낼 것이다. 금속 이온은, 철, 니켈, 코발트, 아연, 칼슘, 구리, 스트론튬, 백금, 팔라듐, 바나듐, 망간 및 타타늄을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 것으로부터 선택된 것이다.
화학식 Ⅵ, Ⅶ, 또는 Ⅷ의 상기 M 기가, 이가 또는 삼가 금속 이온(trivalent metal ion)일 수도 있음을 본 분야의 숙련자는 인식할 것이다. 명확성을 위해, 화학식 Ⅵ, Ⅶ, 또는 Ⅷ의 상기 구조식이 이가 금속 이온을 사용하여 나타냄을 또한 인지할 것이다. 도식 1에 기재된 바와 같은 삼가 금속 이온의 경우에, 단일 금속 이온에 결합된 세 개의 히드록삼산 또는 카테콜 기가 있음을 이해할 것이다.
본 발명의 하나의 측면에서, 약물-로딩된 미셀은 카테콜 모이어티를 통해 교차결합된다. 상기에 기재된 바와 같이, 카테콜, 복합 금속 이온은 도식 2에 기재되어 있다. 금속 이온을 갖는 카테콜의 킬레이트화는 Miller에 또한 기재되어 있다. 이에 따라, 본 발명의 약물 로딩된 미셀에 금속 이온의 첨가가 교차결합된, 약물 로딩된 미셀을 제공하는, 상기 히드록삼산에 의해 상기 금속 이온의 킬레이트화를 결과적으로 나타낼 것이다. 금속 이온은, 철, 니켈, 코발트, 아연, 칼슘, 구리, 스트론튬, 바나듐, 망간 및 티타늄을 포함하지만 이로 제한되지 않는 것으로부터 선택된 것이다.
도식 2
Figure 112014095982417-pct00079
Figure 112014095982417-pct00080

특정 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 기재된 바와 같이, 교차결합된, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 중합체는 하기이다:
Figure 112014095982417-pct00081
.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 기재된 바와 같이, 교차결합된, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 중합체는 하기이다:
Figure 112014095982417-pct00082
.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 기재된 바와 같이, 교차결합된, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 중합체는 하기이다:
Figure 112014095982417-pct00083
.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 기재된 바와 같이, 교차결합된, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 약물은 탁산이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 기재된 바와 같이, 교차결합된, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 약물은 파클리탁셀이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 기재된 바와 같이, 교차결합된, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 약물은 도세탁셀이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 기재된 바와 같이, 교차결합된, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 약물은 카바지탁셀이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 기재된 바와 같이, 교차결합된, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 약물은 에포틸론이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 기재된 바와 같이, 교차결합된, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 약물은 에포틸론 B 또는 에포틸론 D 이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 기재된 바와 같이, 교차결합된, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 약물은 에포틸론 A 또는 에포틸론 C이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 기재된 바와 같이, 교차결합된, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 약물은 빈카알카로이드이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 기재된 바와 같이, 교차결합된, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 약물은 비노렐빈(vinorelbine)이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 기재된 바와 같이, 교차결합된, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 약물은 베르베린이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 기재된 바와 같이, 교차결합된, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 약물은 베르베르루빈이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 기재된 바와 같이, 교차결합된, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 약물은 캠토테신이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 기재된 바와 같이, 교차결합된, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 약물은 SN-38이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 기재된 바와 같이, 교차결합된, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 약물은 S39625이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 기재된 바와 같이, 교차결합된, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 약물은 안트라사이클린이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 기재된 바와 같이, 교차결합된, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 약물은 다우노마이신(daunorubicin)이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 기재된 바와 같이, 교차결합된, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 약물은 독소루비신이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 기재된 바와 같이, 교차결합된, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 약물은 아미노프테린이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 기재된 바와 같이, 교차결합된, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 약물은 피코플라틴(picoplatin)이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 기재된 바와 같이, 교차결합된, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 약물은 플래티늄 치료제(platinum therapeutic)이다.
4. 본 발명의 화합물을 제공하기 위한 일반적인 방법
본 발명의 멀티블록은 본 분야의 숙련자에게 알려진 방법에 의해 제조된다. 일반적으로, 이러한 멀티블록 공중합체는, 말단 아민(terminal amine)을 갖는 소수성 중합체 내로 하나 또는 그 이상의 사이클릭 아미노산 단량체(cyclic amino acid monomers)를 순차적으로 중합함으로써 제조되고, 상기 중합은 상기 아민에 의해 개시된다. 특정 실시형태에서, 상기 중합은, 상기 사이클릭 아미노산 단량체의 고리-오프닝 중합(ring-opening polymerization)에 의해 발생한다. 다른 실시형태에서, 상기 사이클릭 아미노산 단량체는 아미노산 NCA, 락탐(lactam), 또는 이미드이다.
도식 3
Figure 112014095982417-pct00084

도식 3은, 본 발명의 멀리블록 중합체를 제조하기 위한 일반적인 방법을 나타낸다. 화학식 A의 마이크로개시인자(macroinitiator)는, 제1 아미노산 블록을 가지는 화학식 B의 화합물을 형성하기 위해 제1 아미노산 NCA로 처리되었다. 상기 제2 아미노산 NCA는, 두 개의 상이한 아미노산 블록을 가지는 화학식 C의 트리블록 공중합체를 제공하기 위해 화학식 B의 존재하는 중합체(the living polymer)에 첨가되었다. 도식 3에 나타낸 R1, R2, n, Q, Rx, Ry, x, 및 y 기 각각은, 본원에, 개별적으로 및 조합으로, 분류 및 하부분류에 기재되고 정의된 바와 같다.
화학식 Ⅰ의 화합물의 제조에서 하나의 단계는, 화학식 Ⅰ의 화합물을 제공하기 위해, 중합 종결인자(polymerization terminator)를 갖는 화학식 C의 화합물의 존재하는 중합체 사슬-말단을 종결시키는 것을 포함한다. 상기 중합 종결인자는 화학식 Ⅰ의 상기 R2 기를 제공하는 것을 본 분야의 숙련자는 인식할 것이다. 이에 따라서, 상기에 기재되고 본원에 기재된 바와 같은, 화학식 Ⅰ의 상기 R2 기를 유도하는 실시형태는, 이 자체로 또한 중합 종결인자에 관한 것이고, 유사하게, 본원 및 상기에 기재된 바와 같은, 상기 중합 종결인자에 관한 실시형태는, 또한 화학식 Ⅰ의 R2 기에 관한 것이다.
상기에 기재된 바와 같이, 화학식 Ⅰ의 화합물은, 종결시키는 제제( terminating agent)의 처리에 의해 화학식 C의 화합물로부터 제조되었다. 화학식 Ⅰ의 화합물이 또한 화학식 C의 화합물로부터 직접적으로 쉽게 제조됨을 본 분야의 숙련자는 인지할 것이다. 화학식 Ⅰ의 화합물을 제조하기 위한 상기 방법이, 화학식 Ⅰ의 R2 기를 포함하도록 상기 존재하는 중합체 사슬-말단을 이용하는 화학식 Ⅰ의 화합물의 "원-포트(one-pot)" 합성으로서 실행될 수도 있음을 본 분야의 숙련자는 또한 인지할 것이다. 대체적으로, 화학식 Ⅰ의 화합물은, 다수-단계 방식으로 또한 제조될 수도 있다. 예를 들어, 화학식 C의 상기 존재하는 중합체 사슬-말단은, 화학식 Ⅰ의 화합물을 제공하기 위해, 공지된 방법에 따라, 추가적으로 유도체합성될 수도 있는, 아미노 기를 제공하기 위해 퀀칭될 수도 있다(the living polymer chain-end of a compound of formula C may be quenched to afford an amino group which may then be further derivatized, according to known methods, to afford a compound of formula I).
본 분야의 숙련자는, 다양한 중합 종결 제제(polymerization terminating agents)가 본 발명에 있음을 인지할 것이다. 이러한 중합 종결 제제는, 화학식 Ⅰ의 화합물을 수득하기 위해, 화학식 C의 화합물의 상기 존재하는 중합체 사슬-말단, 또는 화학식 C의 상기 프리-기초된 아미노 기(the free-based amino group)와 반응할 수 있는 어떠한 R2-함유하는 기를 포함한다. 따라서, 중합 종결하는 제제는, 친핵 이동(nucleophilic displacement)을 받는 남아있는 기 LG를 포함하는, 무수물(anhydride), 및 그 밖의 아실화 제제(acylating agents), 및 기를 포함한다.
대체적으로, 화학식 C 의 화합물은, 이의 아미드를 형성하기 위해, 카르복실산-함유하는 기에 결합될 수도 있다. 따라서, 화학식 C 의 상기 아민 기가 화학식 Ⅰ의 화합물을 제공하기 위해, 카르복실산 모이어티와 결합될 수도 있음을 포함하고, R2 는 -NHC(O)R4이다. 이러한 커플링 반응(coupling reactions)은 본 분야에 널리 알려져 있다. 특정 실시형태에서, 상기 커플링은 커플링 시약과 달성된다. 이러한 지시약은 본 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 그 밖의 것들 중에서, DCC 및 EDC를 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 카르복실산 모이어티는 상기 커플링 반응에서 사용을 위해 활성화된다. 이러한 활성화는, 무카이야마 지시약(Mukaiyama reagent)의 사용, 할로겐화 아실(acyl halide)의 형성을 포함한다. 이러한 방법, 및 그 밖의 것들은, 예를 들어, "Advanced Organic Chemistry," Jerry March, 5th Ed., pp. 351-357, John Wiley and Sons, N.Y에서 본 분야의 숙련자에게 알려져 있다.
친핵 이동(nucleophilic displacement)을 받은 "적절한 탈리기(leaving group)"는, 원하는 유입하는 화학 모이어티(desired incoming chemical moiety)에 의해 쉽게 대체되는 화학 기(chemical group)이다. 적절한 탈리기는, 예를 들어 March에서, 본 분야에서 널리 공지되어 있다. 이러한 탈리기는 할로겐, 알콕시, 술포닐옥시(sulphonyloxy), 임의적으로 치환된 알킬술포닐옥시, 임의적으로 치환된 알케닐술포닐옥시, 임의적으로 치환된 아릴술포닐옥시, 및 디아조늄 모이어티(diazonium moieties)를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 적절한 탈리기의 예는, 클로로, 요오드, 브로모, 플루오로, 메탄술포닐옥시(메실옥시), 토실옥시, 트리플릴옥시, 니트로-페닐술포닐옥시[노실옥시(nosyloxy)], 및 브로모-페닐술포닐옥시[브로실옥시(brosyloxy)]을 포함한다,
대체 실시형태에 따라, 상기 탈리기는 상기 반응 매체(reaction medium) 내에 원 위치에서 발생될 수도 있다. 예를 들어, 탈리기는 그러한 화합물의 전구체로부터 원위체에서 발생될 수도 있고, 상기 전구체가 원위치에서 상기 탈리기에 의해 쉽게 대체되는 기를 함유한다.
대체적으로, 화학식 Ⅰ의 상기 R2 기는, 모노- 또는 디-보호된 아민이고, 상기 보호기(들)(protecting group)는 제거되고, 작용기(functional group)가 상이한 보호기로 보호되거나 유도체화될 수도 있다. 화학식 Ⅰ의 상기 R2 기의 어떠한 보호기의 제거가 그러한 보호기에 대한 방법에 의해 실행됨을 인지될 것이다. 이러한 방법은 Green에 상세하게 기재되어 있다.
다른 실시형태에서, 화학식 Ⅰ의 R2 기는, 임의적으로 적절한 염기의 존재에서, 무수물 커플링(anhydride coupling)을 통해, 화학식 C의 상기 아미노 기의 유도체화(derivatization)에 의해 포함된다. 본 분야에서 숙련자는, 아지드, 알데히드, 히드록실, 알킨, 및 그 밖의 기, 또는 이의 보호된 형태를 포함하는 무수 중합 종결 제제가, 화학식 Ⅰ의 화합물의 R2 기 내로 상기 아지드, 상기 알데히드, 상기 보호된 히드록실, 상기 알킨, 및 그 밖의 기를 포함하도록 사용될 수도 있다. 이러한 무수물 중합 종결시키는 제제가 화학식 C의 상기 존재하는 중합체 사슬-말단, 또는 이의 프리베이스(freebase)를 종결시키기 위해 적합함을 또한 인지할 것이다. 이러한 무수 중합 종결시키는 제제(anhydride polymerization terminating agents)는 하기의 표 3에 기재된 것을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
[표 3]
대표적인 무수 중합체 종결시키는 제제
Figure 112014095982417-pct00085

특정 실시형태에서, 상기 친수성 중합체 블록은, 말단 아민["PEG 마크로개시인자(PEG macroinitiator)"]를 갖는 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)이다. 이러한 PEG 마크로개시인자는, 본 발명의 멀티블록 공중합체를 제공하기 위해, NCAs의 중합을 개시한다(initiates). 말단 아민기를 갖는 이러한 합성 중합체는 본 분야에 널리 알려져 있고, PEG-아민을 포함한다. PEG-아민은 적절하게 보호된 PEG-아민의 탈보호(deprotection)에 의해 수득될 수도 있다. 이러한 적절하게 보호된 PEG-아민의 제조, 및 이를 탈보호하는 방법은, 이의 전체가 참고문헌으로 본원에 포함되는, 2006년 6월 29일에 US 20060142506, 및 2005년 10월 24일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 11/256,735에 상세하게 기재되어 있다.
US 20060142506에 기재된 바와 같이, 적절하게 보호된 PEG-아민은, 적절하게 보호된 아민을 포함하는 종결시키는 제제(terminating agent)를 갖는 PEG의 상기 존재하는 중합체 사슬 말단을 종결시킴으로써 형성될 수도 있다. 이에 따라서, 다른 실시형태에서, 상기 종결시키는 제제는 적절하게 보호된 아미노기를 가지고, 상기 보호기는 불안정한 산(acid-labile)이다.
대체적으로, 말단 아민을 갖는 합성 중합체는, 알려진 합성 경로에 의해 아민으로 변환될 수도 있는, 말단 작용기를 함유하는 합성의 중합체로부터 제조될 수도 있다. 특정 실시형태에서, 상기 말단의 작용기를 상기 아민으로의 전환은 단일 합성 단계에서 처리된다. 다른 실시형태에서, 상기 말단의 작용기를 상기 아민으로의 전환은, 다수의 단계 연속적인 사건(multi-step sequence)에 의해 달성된다. 다른 실시형태에서, 보호된 아민 개시인자는, 화학식 Ⅰ의 R1 기를 형성하기 위해, 적절한 작용기와 함께 종결되는 에틸렌 옥사이드(ethylene oxide)를 중합하는데 사용될 수 있다(a protected amine initiator can be used to polymerize ethylene oxide then terminated with an appropriate functional group to form the R1 group of Formula I). 상기 보호된 아민 개시인자는 그리고 난 다음에, 차후의 중합에 대한 프리 아민(free amine)을 제공하기 위해 탈보호될 수 있다. 아민 또는 보호된 아민을 제공하는 작용기 형질전환(transformation)은, 본원에 널리 공지되고, Larock, R.C., "Comprehensive Organic Transformations", John Wiley & Sons, New York, 1999에 기재된 것들을 포함한다.
도식 4
Figure 112014095982417-pct00086

상기 도식 4 는, 본 발명의 멀티블록 공중합체를 제조하는데 사용된 상기 이작용기의 PEGs를 제조하기 위한 하나의 대표적인 방법을 나타낸다. 단계 (a) 에서, 상기 중합 개시인자 E는 F를 형성하기 위해 염기로 처리된다. 다양한 염기는, 단계 (a)의 반응에 적절하다. 이러한 염기는, 칼륨 나트탈레나이드(potassium naphthalenide), 디페닐메틸 칼륨(diphenylmethyl potassium), 트리페닐메틸 칼륨, 및 수소화칼륨(potassium hydride)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 단계 (b)에서, 상기 결과적으로 생성된 음이온(anion)은, 상기 중합체 G를 형성하기 위해 에틸렌 산화물로 처리된다. 중합체 G는 그리고 난 다음에, 중합체 H의 R1 기를 형성하기 위해, 단계 (c)에서 종결 제제(termination agent)로 퀀칭된다(quenched). 중합체 G에 대한 대표적인 종결 제제는 표 4 에서 발견될 수 있다. 중합체 H 는, 수소첨가(hydrogenation)에 의해 디벤질 아민기를 탈보호함으로써 화학식 A의 화합물에 단계 (d)에서 변형될 수 있다(transformed).
[표 4]
대표적인 PEG 종결 제제
Figure 112014095982417-pct00087

다른 실시형태에 따라, 본 발명은, 중합체성 친수성 블록, 임의적으로 교차결합 가능한 또는 교차결합된 폴리(아미노산 블록), 및 소수성 폴리(아미노산) 블록을 포함하는, 멀티블록 공중합체를 포함하는 미셀을 제조하기 위한 방법을 제공하고, 상기 미셀은 내부 코어, 임의적으로 교차결합 가능한 또는 교차결합된 외부 코어, 및 친수성 셀을 가지는 것을 특징으로 하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:
(a) 화학식 Ⅰ의 멀티블록 공중합체를 제공하는 단계로서,
[화학식 Ⅰ]
Figure 112014095982417-pct00088

이 식에서,
화학식 Ⅰ의 R1, R2, Q, Rx, Ry, n, x, 및 y 기 각각은, 본원에, 개별적으로 또는 조합으로, 다양한 분류 및 하부분류에 기재된 바와 같은 것인, 단계;
(b) 화학식 Ⅰ의 화합물과 치료학적 제제를 결합시키는 단계; 및
(c) Rx 를 교차결합하기 위해, 교차결합 시약(crosslinking reagent)으로 상기 결과적으로 생성된 미셀을 처리하는 단계.
하나의 실시형태에서, 약물은, 포함되도록, 상기 약물에 물에서 공중합체 용액의 앨리쿼트(aliquot)를 첨가함으로써 상기 미셀 내부 코어 내로 로딩된다. 예를 들어, 극성 유기 용매에서 상기 약물의 원액(stock solution)이 제조되었고, 증발시키는 것을 가능하게 하고, 그 다음에 상기 공중합체/수용액이 첨가되었다. 또 다른 실시형태에서, 상기 약물은 물 에멀젼 기술(water emulsion technique)에서 오일을 사용하여 혼합된다. 이러한 경우에, 상기 용액은 유기 용매에 용해되고, 물에서 상기 미셀 용액에 한 방울씩 첨가되었고, 상기 약물은 용매 증발 동안에 상기 미셀 내로 포함되었다. 다른 실시형태에서, 상기 약물은, 공통의 극성 유기 용매에서 상기 공중합체로 용해되고, 물 또는 그 밖의 수성의 배지(another aqueous medium)에 대해 투석되었다. Allen, C.; Maysinger, D.; Eisenberg A. Colloid Surface B 1999, 16, 3-27를 참고하라.
5. 용도, 방법 및 조성물
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 미셀은, 다양한 질병을 치료하기 위해 유용한 다양한 치료학적 제제를 캡슐화할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 기재된 바와 같이, 약물-로딩된 미셀을 제공하고, 상기 미셀은 상기 약물이 처리되는 것으로 알려진 질병을 치료하는데 유용하다. 하나의 실시형태에 따라, 본 발명은, 중합체성 친수성 블록, 임의적으로 교차결합 가능한 또는 교차결합된 폴리(아미노산 블록), 및 소수성 D,L-혼합된 폴리(아미노산 블록)을 포함하는 멀티블록 공중합체를 포함하는 미셀을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 통증(pain), 염증, 부정맥(arrhythmia), 관절염(arthritis)(류마티스성 또는 골관절염), 죽상동맥경화증, 재협착증(restenosis), 세균 감염(bacterial infection), 바이러스 감염, 우울증(depression), 당뇨병, 간질(epilepsy), 균류 감염(fungal infection), 통풍, 고혈압, 말라리아, 편두통, 암 또는 그 밖의 증식하는 질환, 발기 부전, 갑상선 질환, 신경 질환(neurological disorders) 및 호르몬-관련된 질병, 파킨슨 병, 헌팅턴 병, 알츠하이머 병, 위장 질환(gastro-intestinal disorder), 천식 또는 건선, 알레르기, 골다골증, 비만 및 공병(comorbidities)과 같은 자가면역 질환(autoimmune disorder), 인지 질환, 뇌졸증, AIDS-관련된 치매, 근위축성 측색 경화증(ALS, 루게릭병), 다발성 경화증(MS), 정신분열병(schizophrenia), 불안감(anxiety), 조울증(bipolar disorder), 타우오포시(tauopothy), 척수 또는 말초신경 손상, 심근경색(myocardial infarction), 심장 근육 세포 비대(cardiomyocyte hypertrophy), 녹내장, 주의 결핍 장애(ADD 또는 ADHD), 수면 질환, 재관류/허혈(reperfusion/ischemia), 신생혈관성 질환(angiogenic disorder), 또는 요실금으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 질환을 치료하기 위한 방법을 제공하고, 상기 미셀은 약물-로딩된 내부 코어, 임의적으로 교차결합 가능한 또는 교차결합된 외부 코어, 및 친수성 셀을 가지고, 상기 미셀은 상기 질환을 치료하기 위해 적절한 치료학적 제제를 캡슐화한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은, 중합체성 친수성 블록, 임의적으로 교차결합 가능한 또는 교차결합된 폴리(아미노산 블록), 및 소수성 D,L-혼합된 폴리(아미노산 블록)을 포함하는, 멀리블록 공중합체를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 질병, 염증성 질병, 대사성 질환, 정신 질환(psychiatric disorder), 당뇨병, 신생혈관성 질환, 타우오포시, 신경 또는 신경변성 질환(neurological or neurodegenerative disorder), 척수 손상, 녹내장, 대머리(baldness), 또는 심혈관계 질병(cardiovascular disease)으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 질환을 치료하기 위한 방법을 제공하고, 상기 미셀은, 약물-로딩된 내부 코어, 임의적으로 교차결합 가능한 또는 교차결합된 외부 코어, 및 소수성 셀을 가지고, 상기 미셀은 상기 질환을 치료하기 위한 적절한 치료학적 제제를 캡슐화하는 것을 특징으로 한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 약물-로딩된 미셀은 암을 치료하기 위해 유용하다. 이에 따라서, 본 발명의 또 다른 측면은, 중합체성 친수성 블록, 임의적으로 교차결합 가능한 또는 교차결합된 폴리(아미노산 블록), 및 소수성 D,L-혼합된 폴리(아미노산 블록)을 포함하는, 멀티블록 공중합체를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 암을 치료하기 위한 방법을 제공하고, 상기 미셀은 약물-로딩된 내부 코어, 임의적으로 교차결합 가능한 또는 교차결합된 외부 코어, 및 친수성 셀을 가지는 것을 특징으로 하고, 상기 미셀은 화학치료제(chemotherapeutic agent)를 캡슐화한다. 다른 실시형태에 따라, 본 발명은, 본 발명에 따른 미셀을 투여하는 것을 포함하는, 유방, 난소, 자궁경부, 전립선, 고환(testis), 비뇨 생식관(genitourinary tract), 식도(esophagus), 후두(larynx), 교모세포종(glioblastoma), 신경아세포종(neuroblastoma), 위, 피부, 케라토아칸토마(keratoacanthoma), 폐, 표피암(epidermoid carcinoma), 대세포암(large cell carcinoma), 작은 세포 암(small cell carcinoma), 폐선암(lung adenocarcinoma), 뼈, 결장, 선종(adenoma), 췌장, 선암종(adenocarcinoma), 갑상선(thyroid), 여포암(follicular carcinoma), 미분화암(undifferentiated carcinoma), 유두암(papillary carcinoma), 정상피종(seminoma), 악성 흑색종(melanoma), 육종(sarcoma), 방광종(bladder carcinoma), 간종(liver carcinoma) 및 담도 통로(biliary passages), 신장종(kidney carcinoma), 골수 장애(myeloid disorders), 림프 장애(lymphoid disorders), 호지킨(Hodgkin's), 모발 세포(hairy cell), 구강(buccal cavity) 및 인두(pharynx)(구강), 입술, 혀, 입, 인두, 소장, 결장-직장, 대장, 직장(rectum), 뇌 및 중추 신경계 및 백혈병으로부터 선택된 암을 치료하는 방법에 관한 것이고, 상기 미셀은 상기 암을 치료하기에 적절한 화학요법 제제를 캡슐화한다.
P-글리코프로테인[Pgp, 다중 약물 내성 단백질(multidrug resistance protein)이라고도 함]은 높은 진핵생물의 원형질막에서 발견되고, 이는 소수성 분자의 ATP 가수분해-유도된-확산(hydrolysis-driven export) 때문이다. 동물에서, Pgp는, 암세포의 원형질 막에서 발현되는 경우에, 환경적 독소로부터 배설 및 보호의 중요한 작용을 하고, 소수성 화학요법 약물이 세포 내부에 이의 타겟을 도달하는 것으로부터 화학요법 약물을 방지함으로써 화학요법이 실패할 수 있다. Pgp는 종양 세포 이외에 소수성 화학요법적 약물을 수송하는 것으로 알려져 있다. 하나의 측면에 따라서, 본 발명은, 소수성 화학요법 약물로 로딩된 본 발명의 멀티블록 중합체를 포함하는 약물-로딩된 미셀을 투여하는 것을 포함하는, 상기 화학요법 약물의 Pgp 배출을 예방하거나 또는 줄이면서, 암 세포에 대한 소수성 화학요법 약물을 전달하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 소수성 화학요법 약물은 본 분야에 널리 공지되어 있고, 본원에 기재된 것들을 포함한다.
조성물
다른 실시형태에 따라, 본 발명은, 본 발명의 미셀 또는 약제학적으로 허용가능한 이의 유도체 및 약제학적으로 허용되는 캐리어(carrier), 아쥬반트(adjuvant), 또는 비히클(vehicle)을 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 이러한 조성물을 필요로 하는 환자에 투여하기 위해 제형화된다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 환자에 경구 투여하기 위해 제형화된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "환자"는, 동물, 바람직하게는 포유류, 가장 바람직하게는 인간을 의미한다.
용어 "약제학적으로 허용되는 캐리어, 아쥬반트, 또는 비히클(pharmaceutically acceptable carrier, adjuvant, or vehicle)"는 제형화되는 화합물의 약리학적 활성을 파괴하지 않는, 비독성 캐리어, 아쥬반트, 또는 비히클을 나타낸다. 본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 캐리어, 아쥬반트 또는 비히클은, 그것에 한정되지 않지만, 이온 교환제(ion exchangers), 알루미나(alumina), 알루미늄 스테아레이트(aluminum stearate), 레시틴(lecithin), 혈청 프로테인(serum proteins), 예를 들어, 인간 혈청 알부민, 완충제 물질, 예를 들어 포스페이트(phosphates), 글리신, 소르브산(sorbic acid), 포타슘 소르베이트(potassium sorbate), 포화 식물성 지방산의 부분 글리세라이드 혼합물(partial glyceride mixtures of saturated vegetable fatty acids), 물, 염 또는 전해질(electrolytes), 예를 들어 프로타민 설페이트(protamine sulfate), 디소듐 하이드로겐 포스페이트(disodium hydrogen phosphate), 포타슘 하이드로겐 포스페이트(potassium hydrogen phosphate), 소듐 클로라이드(sodium chloride), 아연염(zinc salts), 콜로이드 실리카(colloidal silica), 마그네슘 트리실리케이트(magnesium trisilicate), 폴리비닐 피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 셀룰로오스계 물질(cellulose-based substances), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 소듐 카르복시메틸셀룰로오스(sodium carboxymethylcellulose), 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 공중합체, 폴리에틸렌글리콜 및 양모지(wool fat)를 들 수 있다.
본 발명의 화합물의 약제학적으로 허용되는 염은 약제학적으로 허용되는 무기 및 유기산 염기로부터 유래된 것들을 포함한다. 적당한 산 염(acid salt)의 예로는 아세테이트(acetate), 아디페이트(adipate), 알기네이트(alginate), 아스파르테이트(aspartate), 벤조에이트(benzoate), 벤젠술포네이트(benzenesulfonate), 비술페이트(bisulfate), 부티레이트(butyrate), 시트레이트(citrate), 캠포레이트(camphorate), 캠포술포네이트(camphorsulfonate), 시클로펜탄프로피오테이트(cyclopentanepropionate), 디글루코네이트(digluconate), 도데실술페이트(dodecylsulfate), 에탄술포네이트(ethanesulfonate), 포르메이트(formate), 푸마레이트(fumarate), 글루코헵타노에이트(glucoheptanoate), 글리세로포스페이트(glycerophosphate), 글리콜레이트(glycolate), 헤미술페이트(hemisulfate), 헵타노에이트(heptanoate), 헥사노에이트(hexanoate), 히드로클로라이드(hydrochloride), 히드로브로마이드(hydrobromide), 히드로요오드(hydroiodide), 2-히드록시에탄술포네이트, 락테이트, 말레이트, 말로네이트(malonate), 메탄술포네이트(methanesulfonate), 2-나프탈렌술포네이트, 니코티네이트(nicotinate), 니트레이트(nitrate), 옥살레이트(oxalate), 팔모에이트(palmoate), 펙티네이트(pectinate), 퍼술페이트(persulfate), 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트(picrate), 피발레이트(pivalate), 프로피오네이트(propionate), 살리실레이트(salicylate), 숙시네이트(succinate), 설페이트(sulfate), 타르트레이트(tartrate), 티오시아네이트(thiocyanate), 토실레이트(tosylate) 및 운데카노에이트(undecanoate)를 들 수 있다. 그 자체로 약제학적으로 허용되지 않는, 다른 산, 예를 들어 옥살릭(oxalic)은, 본 발명의 화합물 및 약제학적으로 허용되는 산 첨가 염을 얻기 위해 중간체(intermediates)로서 유용한 염의 제조에 채용될 수 있다.
적절한 염기로부터 유도된 염은 알칼리 금속(예를 들어, 소듐 및 포타슘), 알칼리 토금속(예를 들어, 마그네슘), 암모늄 및 N+(C1-4 알킬)4 염을 포함한다. 또한, 본 발명은, 본원에 기재된 화합물의 어떠한 염기성 질소-함유하는 기의 4 차화(quaternization)를 예상할 수 있다. 물 또는 오일-가용성 또는 분산시킬 수 있는 생산물(dispersible product)은 이러한 4 차화에 의해 획득될 수도 있다.
본 발명의 조성물은 흡입 스프레이(inhalation spray), 국소적으로, 직장으로(rectally), 비강으로(nasally), 구강으로(buccally), 질로(vaginally) 또는 이식된 저장소(reservoir)를 통해, 경구, 비경구(parenterally)로 투여될 수 있다. 본원에 사용되는 "비경구(parenteral)"는 피하(subcutaneous), 정맥내(intravenous), 근육내(intramuscular), 관절내(intra-articular), 활액막내(intra-synovial), 흉골내(intrasternal), 척추강내(intrathecal), 간내(intrahepatic), 병변내(intralesional) 및 두개내 주입(intracranial injection) 또는 융합 기술을 포함한다. 바람직하게, 조성물은 경구, 복막내 또는 정맥내에 투여된다. 본 발명의 조성물의 살균된 주사가능한 형태는 수성 또는 기름이 많이 함유된 서스펜션(oleaginous suspension)일 수 있다. 이들 서스펜션은 적당한 분산(dispersing) 또는 습윤제(wetting agent) 및 서스펜션화제(suspending agent)를 사용하여, 공지 기술에 알려진 기술에 따라 제형될 수 있다. 또한, 살균된 주사가능한 제제는 비독성 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매, 예를 들어 1,3-부탄디올의 용액에서 살균된 주사가능한 용액 또는 서스펜션일 수 있다. 채용될 수 있는 허용되는 비히클 및 용매는 물, 링거 용액 및 이소토닉 소듐 클로라이드 용액(isotonic sodium chloride solution)이다. 또한, 살균, 고정된 오일은 용매 또는 서스펜션화 매질(suspending medium)로서 통상적으로 사용되었다.
이러한 목적을 위해, 임의의 혼합 고정된 오일은 합성 모노- 또는 디-글리세라이드를 포함하여 채용될 수 있다. 지방산, 예를 들어 올레산 및 이들의 글리세라이드 유도체는 천연의 약제학적으로 허용되는 오일, 예컨데 올리브 오일 또는 피마자유, 특히 폴리옥시에틸화된 버전과 같은, 주사가능한 것의 제조에 유용하다. 또한, 이들 오일 용액 또는 서스펜션은 긴-사슬 알콜 희석제(long-chain alcohol diluent) 또는 분산제(dispersant), 예를 들어 카르복시메틸 셀룰로오스 또는 에멀젼 및 서스펜션을 포함하는 약제학적으로 허용되는 복용 형태의 제형에 일반적으로 사용되는 유사한 분산제를 포함할 수 있다. 또한, 다른 일반적으로 사용되는 계면활성제, 예를 들어 트윈스(Tweens), 스팬스(Spans) 및 다른 에멀젼화제 또는 약제학적으로 허용되는 고체, 액체, 또는 다른 복용 형태의 제조에 일반적으로 사용되는 생체 이용 가능 증진제는 제형화(formulation)의 목적을 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 약제학적으로 허용되는 조성물은, 그것에 한정되지 않지만, 캡슐, 타블렛(tablets), 수성 서스펜션 또는 용액을 포함하는 임의의 경구적으로 허용되는 복용 형태로 경구 투여될 수 있다. 경구 용도의 타블렛의 경우에 있어서, 일반적으로 사용되는 캐리어는 락토오스 및 옥수수 전분을 포함한다. 윤활제, 예를 들어 마그네슘 스테아레이트 또한 일반적으로 첨가된다. 캡슐 형태로 경구 투여시, 유용한 희석제는 락토오스 및 건조된 옥수수 전분을 포함한다. 수성 서스펜션이 경우 용도에 요구되는 경우에, 활성 재료는 에멀전화 및 서스펜션화제와 조합된다. 필요에 따라, 소정의 감미료, 착향제 또는 착색제 또한 첨가될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 약제학적으로 허용되는 조성물은 장용 코팅되어 있다(enterically coated).
대체적으로, 본 발명의 약제학적으로 허용되는 조성물은 직장 투여에 있어서 좌약(suppositories)의 형태로 투여될 수 있다. 이들은 실온에서 고체이지만, 직장 환경에서 액체인 적당한 무자극성 부형제(non-irritating excipient)와 제제를 혼합함으로써 제조하여, 직장에서 융해되어 약물을 방출할 것이다. 이러한 물질들은 코코아 버터, 밀랍(beeswax) 및 폴리에틸렌글리콜을 포함한다.
본 발명의 약제학적으로 허용되는 조성물은 또한, 국소적으로, 특히 치료의 표적이 눈, 피부 또는 소장관(lower intestinal tract)의 질병을 포함하는, 국소적 적용에 의해 쉽게 접근 가능한 부위 또는 기관을 포함하는 경우에, 투여될 수 있다. 적당한 국소적 제형은 이들 부위 또는 기관에 대해 쉽게 제조된다.
소장관에 대한 국소적 적용은 직장 좌약 제형(상기 참조) 또는 적당한 관장(enema) 제형에 효과적일 수 있다. 국소적-경피성 패치(Topically-transdermal patches)가 또한 사용될 수도 있다.
국소적 적용에서, 약제학적으로 허용되는 조성물은 하나 이상의 캐리어에 서스팬션되거나 용해된 활성 성분을 함유하는 적당한 연고(ointment)로 제형될 수 있다. 본 발명의 화합물의 국소적 투여를 위한 캐리어는, 그것에 한정되지 않지만, 미네랄 오일(mineral oil), 액체 페트로라텀(liquid petrolatum), 백색 페트로라텀(white petrolatum), 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리옥시에틸렌(polyoxyethylene), 폴리옥시프로필렌 화합물(polyoxypropylene compound), 에멀전화 왁스(emulsifying wax) 및 물을 들 수 있다. 또한, 약제학적으로 허용되는 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 캐리어에 서스펜션되거나 용해된 활성 성분을 함유하는 적당한 로션 또는 크림으로 제형될 수 있다. 적당한 캐리어는, 그것에 한정되지 않지만, 미네랄 오일, 소르비탄 모노스테아레이트(sorbitan monostearate), 폴리소르베이트(polysorbate) 60, 세틸 에스테르 왁스(cetyl esters wax), 세테아릴 알콜(cetearyl alcohol), 2-옥틸도데카놀(octyldodecanol), 벤질 알콜 및 물을 들 수 있다.
안구적 용도에서, 약제학적으로 허용되는 조성물은, 등장성, pH 조절된 멸균 염분에 미분화된 서스펜션(micronized suspension), 또는 바람직하게는 보존제, 예를 들어 벤질알코늄 클로라이드(benzylalkonium chloride)를 사용하거나 사용하지 않는, 등장성, pH 조절된 살균 염분에 용액으로 제형화될 수도 있다. 또한, 안구적 용도에서, 약제학적으로 허용되는 조성물은 페트로락텀(petrolatum)와 같은 연고로 제형화될 수도 있다.
본 발명의 약제학적으로 허용되는 조성물은 또한, 비강 에어로졸 또는 흡입에 의해 투여될 수도 있다. 이러한 조성물은 약제학적 제형의 분야에서의 널리-알려진 기술에 따라 제조되고, 벤질 알콜 또는 다른 적당한 보존제, 생체 이용 적합성을 향상시키기 위해 흡수 촉진제(absorption promoter), 플루오로카본(fluorocarbon), 및/또는 종래의 가용화제 또는 분산제를 사용하여 염분에 용액으로서 제조될 수도 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 약제학적으로 허용되는 조성물은 경구 투여를 위해 제형화된다.
단일 복용 형태로 조성물을 생산하기 위해 상기 캐리어 물질과 조합될 수도 있는, 본 발명의 화합물의 양은, 치료될 호스트, 투여의 특정 형태에 따라 달라질 것이다. 바람직하게는, 약물의 0.01 내지 100 mg/kg 몸무게/일의 복용량이 이들 조성물을 수용하는 환자에 투여될 수 있도록 상기 조성물은 제형화되어야 한다.
캡슐화된 약물에 일반적으로 사용되는 복용량은 본 발명에 의해 고려됨이 인식될 것이다. 특정 실시형태에서, 환자에게 본 발명의 약물-로딩된 미셀이 투여되고, 상기 약물의 복용량은 이 약물이 일반적으로 투여되는 정도와 동등하다. 다른 실시형태에서, 환자는 본 발명의 약물-로딩 미셀이 투여되고, 상기 약물의 복용량은 이러한 약물이 일반적으로 투여되는 것보다 적다.
또한, 어떠한 특정한 환자에 대한 특정 복용량 및 치료 요법은, 사용된 특정 화합물의 활성, 나이, 체중, 일반적인 건강 상태, 성별, 식이요법, 투여 시간, 배설률, 약물 조합, 및 치료하는 의사의 판단 및 치료할 특정 질병의 중증도를 포함하는 각종 요소에 따라 달라진다는 것을 또한 이해해야 한다. 조성물 중 본 발명의 화합물의 양은 조성물에서 특정 화합물에 따라 달라질 것이다.
본원에 기재된 본 발명을 보다 충분히 이해할 수 있게 하기 위해서, 하기의 실시예가 기재되어 있다. 이들 실시예는 단지 설명의 목적을 위해서이고, 임의의 방법으로 본 발명을 한정하는 것으로 이해하지 않아야 함을 이해할 것이다.
예시( EXEMPLIFICATION )
상기에 일반적으로 기재된 바와 같이, 본 발명의 멀티블록 공중합체는, 본원, 및 이의 전체가 본원에 의해 참고문헌으로 포함되는, 2006년 06월 29일에 발행된 US 20060142506 로서 공개되고, 2006년 05월 04일에 WO 2006/047419로서 공개된, 2005년 10월 24일에 출원된 미국 특허 출원 시리얼 번호 11/256,735에 기재된 이종이작용성 PEGs(heterobifunctional PEGs)를 사용하여 제조하였다. 본 발명에 따른 상기 멀티블록 중합체의 제조는, 이의 전체가 본원의 참고문헌으로 포함된, 2006년 08월 03일에 US 20060172914로서 공개되고, 2006년 07월 13일에 WO2006/74202로서 공개되고, 2006년 01월 04일에 출원된 미국 특허 출원 시리얼 번호 11/325,020에 상세하게 기재된 것을 포함하는, 본 분야에서 널리 알려진 방법에 의해 수행되었다.
하기의 각각의 실시예에서, 아미노산 또는 이에 상응하는 NCA 는 "D"를 나타낸 경우에, 아미노산 또는 이에 상응하는 NCA 는 D-입체배치이다. 이러한 지정이 없을 때에는, 그 아미노산 또는 이에 상응하는 NCA 는 L-입체배치이다.
일반적인 방법:
입자 크기 분석. 와이어트 다이나프로 플레이트 리더기(Wyatt Dynapro plate reader)와 함께 동적 광 산란(Dynamic light scattering)은, 교차결합되지 않고, 교차결합된 제형의 상기 입자 크기를 결정하기 위해 사용되었다. 상기 제형의 용액은 150 mM NaCl에서 1 mg/mL로 제조되었다. 상기 샘플은 5 분 동안 2000 RPM으로 원심분리되었고, 분석을 위해 세 배로(in triplicate) 96-웰 플레이트의 웰에 첨가되었다. 30-초 인수 시간을 갖는 웰 당 10개의 습득물 및 레이저 오토-감쇠가 데이터를 수집하게 위해 사용되었다(10 acquisitions per well with 30-second acquisition times and laser auto-attenuation were used to collect the data).
캡슐화 확인 투석( Encapsulation Verification Dialysis ). 상기 교차결합되지 않은 제형은, 0.2 mg/mL, 및 20 mg/mL으로, 3.5 mL의 10 mM 인산 완충용액 pH 8에 용해되었다. 3 mL의 상기 샘플은 3500 분자량-cut-off 투석 백(3500 molecular weight-cutoff dialysis bags)에 첨가되었고, 상기 남아있는 0.5 mL는 상기 예비 투석 샘플에 대해 HPLC 바이알(HPLC vials)에 첨가되었다. 상기 투석 백은, 300 mL의 10 mM PB pH 8에 두었고, 6 시간 동안 교반시켰다. 앨리쿼트는 그리고 난 다음에 상기 투석 백 내로부터 취해졌고, HPLC 분석은 상기 예비 투석 및 투석 후 샘플로부터 약물의 피크 영역을 결정하기 위해 사용되었다. 그리고 난 다음에, 상기 영역은 투석 후에 남아있는 % 약물을 계산하기 위해 사용되었다(The areas were then used to calculate the % drug remaining post dialysis).
철-의존적인 교차결합 및 분석. 상기 교차결합되지 않은 제형은, 0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 2.5, 5, 7.5 or 10 mM 염화 제3철(Ⅲ)[iron (III) chloride]로 20 mg/mL에서 물에서 재구성되었고, 실온에서 밤새 교반시키는 것을 가능하게 한다. 상기 샘플은, 그리고 난 다음에, 5 mL의 최종 부피(final volume)로, 10 mM 인산 완충용액 pH 8에서 0.2 mg mL로 희석되었다. 1.5 mL의 앨리쿼트는 HPLC 분석을 위해 예비-투석 샘플로서 취해진 다음에, 3 mL의 각각의 샘플은 3500 MWC cut-off 투석 백에 첨가되었고, 6 시간 동안 10 mM 인산 완충용액 pH 8에 대해 투석되었다. 6 시간 후에, 상기 샘플은 상기 투석 백 내로부터 제거되고 HPLC에 의해 분석되었다. 각각의 샘플에 대한 상기 투석-후 피크 영역은 상기 예비-투석 피크 영역에 의해 나눠지고, 100을 곱하여 남아있는 퍼센트로 변환된다(The post-dialysis peak area for each sample was divided by the pre-dialysis peak areas and multiplied by 100 to converted to percent remaining).
시간-의존적인 교차결합 및 분석. 상기 교차결합되지 않은 제형은 20 mg/mL으로 물에서 재구성되었고, 50 μL는 상기 교차결합된 샘플에 대해 4.95 mL 내로 희석되었다. 그리고 난 다음에, 염화 제3철의 500 mM의 원액은, 10 mM 염화 제3철의 최종 농도를 위해 상기 교차결합되지 않은 용액에 첨가되었다. 이는 상기 원액 교차결합된 용액으로서 사용되었고, 50 μL의 앨리쿼트는 5 분, 30 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간 및 16 시간에서 채취되었고, 5 mL의 최종 부피를 갖는, 10 mM 인산 완충용액 pH 8에서 0.2 mg mL으로 희석되었다. 1.5 mL의 앨리쿼트는 HPLC 분석을 위해 예비-투석 샘플로서 채취된 다음에, 3 mL의 각각의 샘플은 3500 MWC cut-off 투석 백에 첨가되었고, 6 시간 동안 10 mM 인산 완충용액 pH 8에 대해 투석되었다. 6 시간 후에, 상기 샘플은 상기 투석 백 내로부터 제거되고 HPLC에 의해 분석되었다. 각각의 샘플에 대한 상기 투석 후 피크 영역은 상기 예비 투석 피크 영역으로 나눠지고, 100을 곱하여, 남아있는 퍼센트로 전환된다.
pH -의존적인 교차결합 및 분석. 상기 교차결합되지 않은 제형은 pH 3, 4, 5, 6, 7, 7.4 및 8에서 10 mM의 염화 제3철로 재구성되었다. 상기 샘플은, 10 분 동안 배양된 다음에 재구성되고 pH 조절된 다음에, 5 mL의 최종 부피로, 10 mM 인산 완충용액 pH 8에서 0.2 mg mL로 희석되었다. 1.5 mL의 앨리쿼트는 HPLC 분석을 위해 예비-투석 샘플로서 채취된 다음에, 3 mL의 각각의 샘플은 3500 MWC cut-off 투석 백에 첨가되었고, 6 시간 동안 10 mM 인산 완충용액 pH 8에 대해 투석되었다. 6 시간 후에, 상기 샘플은 상기 투석 백로부터 제거되었고, HPLC에의 분석되었다. 각각의 샘플에 대한 상기 투석-후 피크 영역은 상기 예비 투석 피크 영역으로 나눠지고, 100을 곱하여, 남아있는 퍼센트로 전환된다.
교차결합된 제형의 pH -의존적인 방출. 상기 교차결합되지 않은 제형은, NaOH로, 8.0 으로 조절된 pH, 10 mM의 염화 제3철로 20 mg/mL에서 물에서 재구성되었고, 이를 실온에서 밤새 교반시켰다(The uncrosslinked formulation was reconstituted in water at 20 mg/mL with 10 mM iron (III) chloride, pH adjusted to 8.0 with NaOH and allowed to stir over night at room temperature). 그 다음 날에, 상기 샘플은, 각 샘플 당 5 mL의 최종 부피로, pH 3, 4, 5, 6, 7, 7.4 및 8에서 10 mM 인산 완충용액으로 0.2 mg/mL로 희석되었다. 1.5 mL의 앨리쿼트는 HPLC 분석을 위해 예비-투석 샘플로서 채취된 다음에, 3 mL의 각각의 샘플은 3500 MWC cut-off 투석 백에 첨가되었고, 6 시간 동안 10 mM 인산 완충용액 pH 8에 대해 투석되었다. 6 시간 후에, 상기 샘플은 상기 투석 백 내로부터 제거되었고, HPLC에 의해 분석되었다. 각각의 샘플에 대한 상기 투석-후 피크 영역은 상기 예비 투석 피크 영역으로 나눠지고, 100을 곱하여, 남아있는 퍼센트로 전환된다.
교차결합되지 않는 제형의 pH -의존적인 방출. 상기 교차결합되지 않은 제형은, NaOH로 8.0으로 조절된 pH, 20 mg/mL로 물에서 재구성되었고, 실온에서 밤새 교반시켰다. 그 다음 날에, 상기 샘플은, 각 샘플 당 5 mL의 최종 부피로, pH 3, 4, 5, 6, 7, 7.4 및 8에서 10 mM 인산 완충용액에서 0.2 mg/mL로 희석되었다. 1.5 mL의 앨리쿼트는 HPLC 분석에 대해 예비-투석 샘플로서 채취된 다음에 3 mL의 각각의 샘플은 3500 MWC cut-off 투석 백에 첨가되었고, 6 시간 동안 10 mM 인산 완충용액 pH 8에 대해 투석되었다. 6 시간 후에, 상기 샘플은 상기 투석 백 내로부터 제거되었고, HPLC에 의해 분석되었다. 각각의 샘플에 대해 상기 투석-후 피크 영역은 상기 예비 투석 피크 영역으로 나눠지고, 100을 곱하여, 남아있는 퍼센트로 전환된다.
교차결합된 제형의 염-의존적인 방출. 상기 교차결합되지 않은 제형은, NaOH로, 8.0 으로 조절된 pH, 10 mM의 염화 제3철로 20 mg/mL에서 물에서 재구성되었고, 10 분 동안 교반시켰다. 상기 샘플은 그리고 난 다음에, 샘플 당 5 mL의 최종 농도로 0 to 10, 50, 100, 200, 300, 400 and 500 mM로부터 NaCl 농도를 증가시키면서 10 mM 인산 완충용액 pH 8에서 0.2 mg/mL로 희석되었다. 1.5 mL의 앨리쿼트는 HPLC 분석 전에 예비-투석 샘플로서 채취된 다음에 3 mL의 각각의 샘플은 3500 MWC cut-off 투석 백에 첨가되었고, 6 시간 동안 이에 대응하는 염 농도로 10 mM 인산 완충용액 pH 8에 대해 투석되었다. 6 시간 후에, 상기 샘플은 상기 투석 백 내로부터 제거되었고, HPLC에 의해 분석되었다. 각각의 샘플에 대해 상기 투석-후 피크 영역은 상기 예비 투석 피크 영역으로 나눠지고, 100을 곱하여, 남아있는 퍼센트로 전환된다.
아미노프테린 제형의 생체외 세포 독성. ATCC (A549, Panc-1, OVCAR3, 및 BXPC-3)로부터 원래 구매된 세포는, 24 시간에 의해 50 %의 융합이 되도록, 96 웰 조직 배양 플레이트에 시드되었다[Cells originally purchased from ATCC (A549, Panc-1, OVCAR3, and BXPC-3) were seeded in 96 well tissue culture plates to be 50 % confluent by 24 hours]. 세포는 5.0 % CO2로 37 ℃에서 배양되었다. 세포는, 플레이트 시딩(plate seeding) 후 24 시간에, 프리 아미노프테린(Free aminopterin), 교차결합된 아미노프테린, 교차결합되지 않은 아미노프테린 제형, 및 비 약물-로딩된 메셀 제형의 에스칼라딩 투여량(escalading doses)으로 처리되었다. 프리 아미노프테린은 DMSO에 용해되었고, 0.0025 %이하로 DMSO의 최종 부피로 세포에 대해 투여되었다(Free aminopterin was dissolved in DMSO and administered to cells with a total volume of DMSO equal to or less than 0.0025 %). 미셀 제형은 생물 등급 물(biology grade water)에서 재-현탁되었다. 희석은, 교체된 부피와 동등하게 세포 배양물 및 물 또는 DMSO(프리 아미노프테린에 대해서 만)으로 깊은 웰 플레이트에서 실행되었다[Dilutions were done in deep well plates with cell media and water or DMSO (for free aminopterin only) equalizing displaced volume]. 배양 배지는 96 웰 플레이트로부터 흡입되었고(aspirated), 100 mL의 각각의 희석물은 세 배로 웰에 첨가되었고, 5.0 % CO2와 함께, 37 ℃에서 72 시간 동안 배양되었다. 교차결합되고 교차결합되지 않는 비-약물-로딩된 미셀 제형은 4 가지의 가장 높은 투여량으로 투여되었고, 전달 비히클의 약물-로딩된 미셀 농도로 비교를 통한 mg/ml 농도에서 계산되었다. 72 시간 배양 후에, 플레이트는 실온에서 냉각시켰고, 25 ml의 세포 타이터-그로(cell titer-glo)가 각각의 웰에 첨가되었다. 플레이트는 혼합시키 위해 잠시 교반되었고, 발광 리딩(luminescence readings)은 플레이트 리더기에서 판독되었다. 트리플리케이트 투여량의 발광 리딩은 평균을 내고, 투여량 당 생균수의 % 를 계산하기 위해, 상기 샘플 플레이트에서 처리되지 않는 세포로부터 평균 발광 리딩으로 나누었다(Luminescence reading for triplicate doses are averaged and divided by average luminescence readings from untreated cells on the same plate to calculate the % of viable cells per dose).
제형화 방법 A. 중합체는 대략 30 분 동안 40 섭씨 온도로 가열하고, 교반시킴으로써 5 mg/mL의 농도로 물에서 용해되었다. 수크로오스는 5 mg/mL로 상기 중합체 용액에 첨가된 다음에, 균질화될 때까지 실온에서 교반되었다. 상기 용액은 실온으로 냉각시키면서 교반시켰다. 상기 활성 약제학적 성분(API)은 용해도의 한계 이하로 바로 유기 용매에서 용해되었다. 상기 API/유기 용액은, 상기 중합체/수크로오스 용액에 첨가되면서, 대략 30 초 동안, 또는 결과적으로 균질환된 에멀젼이 나타낼 때까지, 10,000 RPM에서 교반 혼합되었다. 상기 용액은, 얼음 물 배스에 의해 냉각된 배출 증기(outlet stream)로 대략 23,000 PSI의 작동 압력으로 미세유동화기(microfluidizer)를 통해 단일 통과로 진행되었다. 상기 용액은 0.22 미크론 데드-엔드 필터를 통해 통과된 다음에, 전체의 4-배가 될 때까지, 접선 유동 필터레이션을 사용하여 초미세여과에 의해 진행되고, 수크로오수 완충용액의 원래의 부피가 교환되고, 용액에서 중합체의 최종의 농도가 대략 20 mg/mL이다(The solution was then passed through a 0.22 micron dead-end filter, and then processed by ultrafiltration using tangential flow filtration until a total of 4-times the original volume of sucrose buffer was exchanged and the final concentration of polymer in solution was approximately 20 mg/mL). 그리고 난 다음에, 염화 제3철은 10 mM의 최종 농도에 대한 상기 제형에 첨가되었다. 상기 용액의 pH는 NaOH 로 6.0으로 조절된 다음에 4 시간 동안 실온에서 교반되었다. 20 mg/mL에서 냉동보관 제제를 함유하는 완충용액의 하나의 부피가 상기 용액에 첨가된 다음에, 대략 20 mg/mL 중합체 농도로 농축되었다(One volume of buffer containing a cryopreservative agent at 20 mg/mL was then added to the solution, and then concentrated back down to approximately 20 mg/mL polymer concentration). 상기 용액은 - 40 섭씨온도로 냉동되고 동결건조되었다.
제형화 방법 B. 중합체는 대략 30 분 동안에 40 섭씨 온도로 가열되고, 교반됨으로써 2 mg/mL의 농도로 물에서 용해되었다. 상기 용액은 교반시키면서 실온에서 냉각되었다. 상기 활성 약제학적 성분(API)은 용해도의 한계 이하로 바로 유기 용매에서 용해되었다. 상기 API/유기 용액은 그리고 난 다음에 대략 30 초 동안, 또는 결과적으로 균질화된 에멀젼이 나타낼 때까지, 10,000 RPM에서 교반 혼합하면서, 상기 중합체/수크로오스 용액에 첨가되었다. 상기 용액은 유기 용액을 증발시키는 것을 가능하게 하기 위해, 흄 후드(fume hood)에서 밤새 교반되었다. 그 다음날, 상기 용액은 0.22 미크론 데드-엔드 필터(dead-end filter)를 통해 통과된 다음에, 2 mg/mL에서 대략 20 mg/mL까지 샘플을 농축시키기 위해 접선 유동 필터레이션을 사용하여 초미세여과에 의해 진행되었다. 그리고 난다음에, 염화 제3철은, 10 mM의 최종 농도에 대해 상기 제형에 첨가되었다. 상기 용액의 pH는 NaOH로 6.0 까지 조절된 다음에, 4 시간 동안 실온에서 교반되었다. 상기 용액은 - 40 섭씨 온도로 냉동되고 동결건조되었다.
SN -38 제형 중량 로딩 분석( Formulation Weight Loading Analysis ). 중량 로딩은 HPLC 분석에 의해 제형의 알려진 농도에 대해 SN38의 표준 곡선을 포함함으로써 결정되었다. SN38은 30 ㎍/mL에서 150 ㎍/mL까지의 범위에서 메탄올에 용해되었고, 상기 제형은 메탄올에 5 mg/mL로 용해되었다. 상기 제형에서 SN-38의 양은 그리고 난 다음에 사용된 제형의 알려진 양(즉, 5 mg/mL)을 기초로 % 로 변환되었다(The amount of SN-38 in the formulation is then converted to % based on the known quantity of formulation used).
다우노마이신 제형 중량 로딩 분석. 중량 로딩은 HPLC 분석에 의해 제형의 알려진 농도에 대해 다우노마이신의 표준 곡선을 비교함으로써 결정되었다. 다우노마이신은 40 ㎍/mL에서 200 ㎍/mL까지의 범위에서 메탄올에 용해되었고, 상기 제형은 메탄올에서 2 mg/mL에 용해되었다. 상기 제형에서 다우노마이신의 양은 사용된 제형의 알려진 양(즉, 2 mg/mL)을 기초로 % 로 변환되었다.
아미노프테린 제형 중량 로딩 분석. 중량 로딩은 HPLC 분석에 의해 제형의 알려진 농도에 대해 아미노프테린의 표준 곡선을 비교함으로써 결정되었다. 아미노프테린은,
Figure 112014095982417-pct00089
의 범위로, HPLC 이동상(60 % 아세토니트릴, 40 % 10 mM 인산 완충용액 pH 8)에서 용해되었고, 상기 제형은 HPLC 이동상에서 5 mg/mL로 용해되었다. 상기 제형에서 아미노프테린의 양은 그리고 난 다음에 사용된 제형의 알려진 양(즉, 5 mg/mL)을 기초로 %로 변환되었다.
베르베린 제형 중량 로딩 분석. 중량 로딩은 HPLC 분석에 의해 제형의 알려진 농도에 대해 베르베린의 표준 곡선을 비교함으로써 결정되었다. 베르베린은, 40 ㎍/mL에서 200 ㎍/mL 까지의 범위에서 메탄올에 용해되었고, 상기 제형은 메탄올에서 5 mg/mL로 용해되었다. 상기 제형에서 베르베린의 양은 그리고 난 다음에, 사용된 제형의 알려진 양(즉, 5 mg/mL)을 기초로 %로 변환되었다.
카바지탁셀 제형 중량 로딩 분석. 중량 로딩은 HPLC 분석에 의해 제형의 알려진 농도에 대해 카바지탁셀의 표준 곡선을 비교함으로써 결정되었다. 카바지탁셀은, 40 ㎍/mL에서 200 ㎍/mL 까지의 범위에서 메탄올에 용해되었고, 상기 제형은 메탄올에서 10 mg/mL로 용해되었다. 상기 제형에서 카바지탁셀의 양은 그리고 난 다음에, 사용된 제형의 알려진 양(즉, 10 mg/mL)을 기초로 %로 변환되었다.
에포틸론 D 제형 중량 로딩 분석. 중량 로딩은 HPLC 분석에 의해 제형의 알려진 농도에 대해 에포틸론 D의 표준 곡선을 비교함으로써 결정되었다. 카바지탁셀은, 40 ㎍/mL에서 200 ㎍/mL 까지의 범위에서 메탄올에 용해되었고, 상기 제형은 메탄올에서 10 mg/mL로 용해되었다. 상기 제형에서 에포틸론 D의 양은 그리고 난 다음에, 사용된 제형의 알려진 양(즉, 10 mg/mL)을 기초로 %로 변환되었다.
일반적인 랫의 약동학적 실험. 중심 정맥 카테터로 수술적으로 변형된 스피라구에-다웰리 랫(Sprague-Dawly rats surgically modified with jugular vein catheters)은, Harlan Laboratories, Dublin, VA로부터 구매하였다. 제형은,대략 1 분을 초과하여 JVC를 통해 1 mL 볼루스 주사를 위해, 동물 몸무게 kg 당 일반적으로 10 mg API의 최종 농도를 위해 150 mM NaCl로 물에서 용해된 다음에, 대략
Figure 112014095982417-pct00090
헤파린화된 염분으로 씻어내었다(followed by a flush of approximately
Figure 112014095982417-pct00091
heparinized saline). 테스트 물품 투여 후에 혈액 수집을 위한 시점은 하기와 같이 1, 5, 15 분, 1, 4, 8 및 24 시간이다. 시점 당 대략 250 μL의 혈액은, K3-EDTA 혈액 수집 튜브 내로 JVC에 의해 수집된 다음에, 대략 250μL 헤파린화된 염분으로 씻어내었다. 그리고 난 다음에, 혈액은 플라즈마(plasma)를 분리하기 위해 5 분 동안 2000 RPM에서 원심분리되었다. 그리고 난 다음에 플라즈마가 수집되고, HPLC 분석을 위해 진행될 때까지 스냅 냉동되었다(Plasma was then collected and snap frozen until processed for HPLC analysis). 샘플은 실온에서 상기 플라즈마 샘플을 첫 번째로 해동시킴으로써 분석을 위해 제조되었다. 50 μL 플라즈마는 추출 용액의 2 mL 에펜도르프 튜브 150 μL에 첨가되었다(메탄올에서 0.1 % 인산, 5 ㎍/mL 내부 표준). 그리고 난 다음에, 샘플은 10 분 동안 볼텍스되었고(vortexed), 13,000 RPM에서 10 분 동안 원심분리되었다. 상청액은 HPLC 바이알 내로 이동된 다음에 HPLC에 의해 분석되었다. API의 양은, 각각의 시점에서 랫으로부터 수집된 샘플과 비교된 랫 샘플에서 API 제형의 표준 곡선을 사용하여 결정되었다.
실시예 1
Figure 112014095982417-pct00092
디벤질아미노 에탄올 염화 벤질(Benzyl chloride)(278.5 g, 2.2 mol), 에탄올 아민(60 mL, 1 mol), 탄산칼륨(283.1 g, 2.05 mol) 및 에탄올(2 L)은, 오버헤드 교반기, 응축기 및 유리 플러그(glass plug)에 적합한, 3L 3-neck 플라스크에서 함께 혼합되었다. 상기 장치는, 배지 프리트(medium frit)를 통해 상기 불용성 용액이 여과된 후에, 36 hr 동안 환류시키기 위해 가열되었다. 상기 여과액은 회복되었고, 에탄올은 회전 증발에 의해 제거되었다. 상기 점성액은 에테르에서 재용해되었고, 상기 용액 현탁액은 여과에 의해 제거되었고, 물에 대한 두 번 추출되었다. 상기 에테르 용액이 유지되었고, 상기 수성 층은 디클로로메탄으로 두 번 추출되었다(2 x 400 mL). 상기 분획물(fraction)은 재조합되었고, MgSO4 상에서 건조되었고, 15 min 동안 카본 블랙 상에서 교반되었고, 셀라이트 패드(celite pad)를 통해 여과되었다. 디클로로메탄은 제거되었고, 상기 용액은 에테르의 최소량 내로 재용해되었다[첫 번째 에테르 분획과 300 mL의 결합조합된 부피, 300 mL(combined volume of 300 mL with the first ether fraction, 300 mL)]. 헥산(1700 mL)은 첨가되었고, 상기 용액은 상기 생산물이 완전히 분해될 때까지 서서히 가열되었다. 상기 용액은 그리고 난 다음에 서서히 냉각되었고, 냉장고에 밤새 두었고(+ 4 ℃), 백색 결정이 수득되었다. 상기 재결정은 두 번째 시간(second time)에 실행되었다. 166.63g, 69 % 수득률. 1H NMR (d6-DMSO) δ 7.39-7.24 (10H), 4.42 (1H), 3.60 (4H), 3.52 (2H), 2.52 (2H).
실시예 2
Figure 112014095982417-pct00093
디벤질아미노 - PEG - 메톡시 유리 자기 교반 막대(glass magnetic stirring bar) 및 단열된 피복된 추가적인 깔때기(thermally-insulated jacketed addition funnel)가 갖춰진 4 L 피복된 3-necked 중합 플라스크로 이루어진 장치는 10 mTorr로 진공처리된 다음에 아르곤으로 다시 채워졌다. 상기 반응 플라스크는, 아르곤 가스의 온화한 증기(gentle stream) 하에서 파라핀 왁스(1.70 g, 21.2 mmol)에서 N,N-디벤질아미노에탄올(4.28 g, 17.7 mmol) 및 50 % KH 고형물로 로딩되었다. 무수의 THF, 대략 2 L는 상기 반응 플라스크 내로 도입되었고, 상기 혼합물은 16 h 동안 주위 온도에서 아르곤 하에서 교반되었다. 상기 결과적으로 생성된 슬러리는 10 ℃로 냉각되었고, 진공 하에서 상기 추가적인 깔때기는 - 30 ℃로 냉각되었다. 에틸렌 옥사이드 가스는, 225 mL(4.8 mol)의 액체 EO가 수집될 때까지, 상기 냉각된 배출된 깔대기(chilled evacuated funnel) 내로 응결되었다. 상기 응결 깔때기에서 상기 액체 에틸렌 옥사이드는 상기 반응 혼합물 내로 하나의 일부에 첨가되었다. 상기 반응 혼합물은, 6 시간 동안 10 ℃에서 그 다음에 16 시간 동안 20 ℃에서 밀폐된 플라스크에서 교반되었다. 상기 중합은, 16 시간 동안 30 ℃로, 그리고 난 다음에 2 일 동안 40 ℃로 온도를 증가시킴으로써 완료되었다. 상기 반응 혼합물은 25 ℃로 냉각된 다음에, 아이오딘화 메틸(methyl iodide)(1.6 mL)이 한 번 첨가되고, 상기 혼합물은 10 시간 동안 25 ℃에서 교반되었다. 반응하지 않은 수소화 칼륨의 초과량(excess)은 그리고 난 다음에, 에탄올(99%, 100 mL)의 첨가에 의해 파괴되었다. 30 min 후에, 상기 퀀칭된 반응 혼합물은 보다 큰 비커 내로 이동되었고, 상기 중합체 생산물은 에틸 에테르(8 L)의 첨가에 의해 침전되었다. 상기 침전된 생산물은 보다 큰 Buchner 깔때기에서 여과에 의해 수집된 다음에, 진공에서(in vacuo) 건조되었다. 상기 수득량은 백색 고형물의 215.1 g이었다. 수성의 GPC는 12.0kDa의 Mn 및 1.01의 PDI를 나타낸다. 1H-NMR (d 6 -DMSO, 400MHz): 7.344 (m, 8H), 7.225 (m, 4H), 3.681 (m, 8H), 3.507 (m, approx. 1000H), 3.320 (m, 6H + 물 신호(water signal)), 3.237 (s, 3H), 2.551 (t, 6.0Hz, 2H).
실시예 3
Figure 112014095982417-pct00094
mPEG - amine 상기 mPEG-디벤질아미노 생산물 실시예 3(214.0 g)은, 탈이온수(1 L)에 용해되었다. 탈이온수(150 mL)에서 Pearlman's 촉매 13.2g[탄소상 20 % Pd 수산화물(20% Pd hydroxide on carbon), Aldrich] 슬러리는, 주위 온도에서 수소 풍선(hydrogen balloon) 하에서 교반에 의해 활성화되었다. 상기 플라스크에서 상기 수소는 질소로 교체되었고, 디벤질아미노 mPEG 출발 물질의 상기 용액은 상기 촉매 슬러리에 첨가되었고, 상기 플라스크는 비워지고(evacuated), 그리고 난 다음에 수소로 다시 채워졌다(3 번 반복). 상기 수소 첨가는 그리고 난 다음에, 벤질 신호의 완전한 소실을 나타내는 포인트 1H-NMR에서 2 ½ 일 동안 수소 풍선 하에서 주위 온도에서 유지되었다. 염화 나트륨(350 g) 고형물은 상기 반응 혼합물에 첨가되었고, 상기 혼합물은 질소 하에서 한나절(half a day) 동안 교반되었고, 상기 이용된 촉매가 여과에 의해 제거되고, 브라인(brine)으로 세척되었다. 상기 결합된 여과물은, 1 M NaOH의 작은 부피의 첨가에 의해 제조된 알칼리성(대략 pH 11로)이고, 디클로로메탄(4 x 0.7 L)으로 추출되었다. 상기 결합된 추출물은 무수 탄산나트륨으로 건조되었고, 여과되었고, 약 0.75 L 전체 부피로 로토베이프(rotovap)에서 농축된 다음에, 초과량의 에테르(8 L)를 첨가하여 지체없이 침전되었다. 상기 침전된 생산물은 여과에 의해 수집되었고, 진공에서 건조되어, 202.5 g의 아주 큰 눈처럼 하얀 고형물이 제공되었다. 1H-NMR (d 6 -DMSO, 400MHz): 3.681 (m, 8H), 3.507 (m, approx. 1000H), 3.341 (m, 4H + 물 신호(water signal)), 3.238 (s, 3H), 2.634 (t, 5.7Hz, 2H).
실시예 4
Figure 112014095982417-pct00095
D-류신 NCA H-D-Leu-OH(100g, 0.76 mol)는, 1 L의 무수 THF에서 현탁되었고, 심하게 교반되면서 50 ℃로 가열되었다. 포스젠(Phosgene)(톨루엔에서 20 %)(500 mL, 1 mol)은, 상기 아미노산의 현탁액에 첨가되었다. 1 h 20 min 후에, 상기 아미노산이, 맑은 용액을 형성하여, 용해되었다. 상기 용액은 로토베이프(rotovap)에서 농축되었고, 비커로 이동되고, 헥산은 상기 생산물을 침전하기 위해 첨가되었다. 상기 백색 고형물은 여과에 의해 분리되었고, 작은 양의 THF (~ 60 mL)로 톨루엔(~ 700 mL)에서 용해되었다. 상기 용액은, 어떠한 불용성 물질을 제거하기 위해, 셀라이트의 베드 상에서 여과되었다. 과량의 헥산(~ 4 L)은 상기 생산물을 침전하기 위해 상기 여과물에 첨가되었다. 상기 NCA는 여과에 의해 분리되었고, 진공 상에서 건조되었다. (91 g, 79 % 수득률) D-Leu NCA는 백색, 결정질 고형물로서 분리되었다. 1H NMR (d6-DMSO) δ 9.13 (1H), 4.44 (1H), 1.74 (1H), 1.55 (2H), 0.90 (6H) ppm.
실시예 5
Figure 112014095982417-pct00096
tert -부틸 아스파르테이트 NCA H-Asp(OBu)-OH(120 g, 0.63 mol)는, 1.2 L의 무수 THF에서 현탁되었고, 심하게 교반시키면서 50 ℃로 가열되었다. 포스젠(톨루엔에서 20 %)(500 mL, 1 mol)은, 상기 아미노산의 현탁액에 첨가되었다. 1 h 30 min 후에, 상기 아미노산이, 맑은 용액을 형성하여, 용해되었다. 상기 용액은 로토베이프(rotovap)에서 농축되었고, 비커로 이동되고, 헥산은 상기 생산물을 침전하기 위해 첨가되었다. 상기 백색 고형물은 여과에 의해 분리되었고, 무수 THF에서 용해되었다. 상기 용액은, 어떠한 불용성 물질을 제거하기 위해, 셀라이트의 베드 상에서 여과되었다. 과량의 헥산은 상기 생산물을 침전하기 위해 첨가되었다. 상기 NCA는 여과에 의해 분리되었고, 진공 상에서 건조되었다. 93 g (68 %의 Asp(OBu) NCA 는 백색, 결정질 고형물로서 분리되었다. 1H NMR (d6-DMSO) δ 8.99 (1H), 4.61 (1H), 2.93 (1H), 2.69 (1H), 1.38 (9H) ppm.
실시예 6
Figure 112014095982417-pct00097
벤질 티로신 NCA H-Tyr(OBzl)-OH (140g, 0.52 mol)는 1.5 L의 무수 THF에서 현탁되었고, 심하게 교반시키면서 50 ℃로 가열되었다. 포스젠(톨루엔에서 20 %)(500 mL, 1 mol)은, 배관삽입(cannulation)을 통해 상기 아미노산의 현탁액에 첨가되었다. 대략 1 h 30 min의 과정 상에서, 상기 아미노산이, 옅은 노란색 용액을 형성하여, 용해되었다. 상기 용액은, 현탁액에 여전히 존재하는 어떠한 입자를 제거하기 위해, 와트만지 #1에 적합한 Buchner를 통해 첫 번째로 여과되었다. 그리고 난 다음에, 상기 용액은 회전 증발에 의해 농축되었고, 비커로 이동되고, 헥산은 상기 생산물을 침전하기 위해 첨가되었다. 상기 황백색 고형물은 여과에 의해 분리되었고, 무수 THF(~ 600 mL)에서 용해되었다. 상기 용액은, 어떠한 불용성 물질을 제거하기 위해, 셀라이트의 베드 상에서 여과되었다. 과량의 헥산(~ 6 L)은 상기 생산물을 침전하기 위해 상기 여과물에 첨가되었다. 상기 NCA는 여과에 의해 분리되었고, 진공 상에서 건조되었다. 114.05 g, 74.3 %의 Tyr(OBzl) NCA는 황백색 분말로서 분리되었다. 1H NMR (d6-DMSO) δ 9.07 (1H), 7.49-7.29 (5H), 7.12-7.07 (2H), 6.98-6.94 (2H), 5.06 (2H), 4.74 (1H), 3.05-2.88 (2H) ppm.
실시예 7
Figure 112014095982417-pct00098
페닐알라닌 NCA H-L-Phe-OH (20.0 g, 132 mmol)는 300 mL의 무수 THF에서 현탁되었고, 50 ℃로 가열되었다. 포스젠(톨루엔에서 20 %)(90 mL, 182 mmol)은, 상기 아미노산의 현탁액에 첨가되었고, 상기 아미노산은 탁한 용액을 형성하는, 대략 1 hr의 과정 상에서 용해되었다. 상기 용액은 종이 필터(Whatman #1)를 통해 여과되었고, 회전 증발에 의해 농축되었고, 비커에 이동되었고, 헥산은 상기 생상물을 침전시킥 위해 첨가되었다. 상기 백색 고형물을 여과에 의해 분리되었고, 무수 THF에서 용해되었다. 상기 용액은 어떠한 불용성 물질을 제거하기 위해 셀라이트의 베드 상에서 여과되었다. 과량의 헥산은, 주걱(spatula)으로 교반하면서 상기 여과물에 첨가되었다. 상기 NCA는 여과에 의해 분리되었고, 진공 상에서 건조되었다. 20.0 g(86 % 수득률)의 D-PheNCA는, 백색, 결정질 고형물로서 분리되었다. 1H NMR (d6-DMSO) δ 9.09 (1H), 7.40-7.08 (5H), 4.788 (1H), 3.036 (2H) ppm.
실시예 8
Figure 112014095982417-pct00099
L- 벤질글루타메이트 NCA 진공-건조된 H-Glu(OBn)-OH (71.2 g, 300.0 mmol)는, 무수 THF의 900 mL에서 현탁되었다. 포스젠(톨루엔에서 20 %)(500 mL, 1 mol)은, 실온에서 상기 아미노산 현탁액에 첨가되었고, 10 분 후에, 상기 혼합물은 50 ℃로 가열되었다. 상기 대략 1 hr의 과정 상에서 상기 아미노산이, 맑은 용액을 형성하며, 용해되었다. 상기 용액은 약간 냉각되었고, 상기 로토베이프(rotovap)에서 농축되었다. 신선한 무수 THF (400 mL)는 상기 잔여물에 첨가되었고, 상기 용액은, 300 mL 무수 THF에 용해되고, 4 L 비커에 이동시키고, 1.5 L의 무수 헵탄의 느린 첨가에 의해 침전되는, 무색의 고형물을 제공하기 위해 상기 로토베이프(rotovap)에서 재-증발되었다. 상기 순수한 NCA는 흡인 여과에 의해 분리되었고, 진공에서 건조되었다. 75.31 g(95.4 % 수득률)의 Glu(OBn) NCA는 무색, 결정질 고형물로서 분리되었다. 1H NMR (CDCl3) δ 7.36 (5H), 6.40 (1H), 5.14 (2H), 4.40 (1H), 2.60 (2H), 2.22 (2H).
실시예 9
Figure 112014095982417-pct00100
D- 벤질글루타메이트 NCA 출발 물질로서 치환하는 H-d-Glu(OBn)-OH, 실시예 8의 반응 규모 및 동일한 방법을 사용하여, 50 ℃에서 1.25 시간 동안 포스젠과 함께 반응은, 무색, 결정질 고형물로서 d-Glu(OBn) NCA의 75.53 g (수득률 = 95.6 %)을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3): 실시예 8과 동일함.
실시예 10
Figure 112014095982417-pct00101
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( OBn ) 5 - co - Glu ( OBn ) 5 )- b - Poly ( Tyr ( OBn ) 30 - co -d- Phe 10 )-Ac m-PEG12k-NH2,(119.7 g, 10.0 mmol)는, 톨루엔(1 L)에 용해된, 오븐-건조된, 2L-둥근-바닥 플라스크 내로 중량을 달았고(weighed), 공비증류(azeotropic distillation)에 의해 건조되었다. 건조시키기 위해 증류 후에, 상기 중합체는 3 시간 동안 진공 하에 두었다. 상기 플라스크는 순차적으로 N2 로 다시 채우고, 환산 압력 하에서 다시 비워지고, 건조 N-메틸피롤리돈(NMP)(1100 mL)은 카눌라에 의해 도입되었다. 상기 혼합물은, 용해를 신속하게 처리하기 위해, 40 ℃로 잠시 가열된 다음에, 25 ℃로 재냉각되었다. Glu(OBn)NCA(13.16 g, 50.0 mmol) 및 d-Glu(OBn)NCA(13.16 g, 50.0 mmol)는 상기 플라스크에 첨가되었고, 상기 반응 혼합물은 질소 가스 하에서 주위 실온에서 16 시간 동안 교반시켰다. 그리고 난 다음에, d-Phe NCA (19.12 g, 100 mmol) 및 Tyr (OBn) NCA (89.19 g, 300 mmol)는 첨가되었고, 상기 용액은, 반응이 완료되는 시점(GPC, DMF/0.1% LiBr)에 48 시간 동안 35 ℃에서 교반되었다. 상기 용액은 실온으로 냉각되었고, 아세트산 무수물(10.21 g, 100 mmol, 9.45 mL), N-메틸모르폴린(NMM)(11.13 g, 110 mmol, 12.1 mL) 및 디메틸아미노피리딘(DMAP)(1.22 g, 10.0 mmole)이 첨가되었다. 교반시키는 것은 실온에서 1 일 동안 유지되었다. 상기 중합체는 디에틸 에테르(14 L) 내로 침전되었고, 여과에 의해 분리되었고, 디에틸 에테르의 신선한 500 mL 일부로 세척되었고, 진공 하에서 건조되어, 미세한 거의 무색의 분말로서 상기 블록 공중합체를 수득하였다(214.7 g, 수득률 = 92.3 %). 1H NMR (d6-DMSO) δ 8.42-7.70 (theo. 50H, obs'd. 47H), 7.30 (theo. 250H, obs'd. 253H), 6.95 (theo. 120H, obs'd. 122H), 5.10-4.85 (theo. 80H, obs'd. 80H), 4.65-4.20 ((theo. 50H, obs'd. 56H), 3.72-3.25 (theo. 1087H, obs'd. 1593H), 3.05-2.45 (theo. 80H, obs'd. 83H), 2.44-1.60 (theo. 40H, obs'd. 42H).
실시예 11
Figure 112014095982417-pct00102
mPEG12K - b - Poly -[d- Glu ( OBn ) 5 - co -Glu( OBn ) 5 ]- b - Poly ( Tyr ( OH ) 30 - co -d- Phe 10 )- Ac 실시예 10 으로부터 mPEG12K-b-Poly-(d-Glu(OBn)5-co-Glu(OBn)5)-b-폴리 (Tyr(OBn)30-co-d-Phe10)-Ac(151.3 g, 6.5 mmol) 및 펜타메틸벤젠(86.1 g, 0.58 mole)은, 1400 mL의 트리플루오로아세트산(TFA) 내로 용해되었다. 상기 반응은 실온에서 6 시간 동안 빠르게 교반되었다. 상기 TFA는 35 ℃를 초과하지 않는 물 수조 온도와 함께 회전 증발기에서 제거되었다. 상기 결과적으로 생성된 스티프 페이스트(stiff paste)는 800 mL의 건조 THF에 용해되었고, 상기 정제되지 않는 생산물은 12 L 디에틸 에테르 내로 침전되면서 - 30 ℃로 냉각되었다. 상기 결과적으로 생성된 고형물은 여과에 의해 수집되었고, 500 mL의 건조 THF에 재용해되었고, 3 L 디에틸 에테르 내로 재침전되었다. 거의 무색, 무취, 거품같은 중합체가 진공에서 밤새 상기 생산물을 건조시킨 후에 수득되었다(126.0 g, 수득률 = 94.2 %). 1H NMR (d6-DMSO) δ 9.09 (theo. 30H, obs'd. 29.4H), 8.50-7.75 (theo. 50H, obs'd. 52.7H), 7.40-6.45 (theo. 220H, obs'd. 220H), 5.04 (theo. 20H, obs'd. 17.5H), 4.70-4.20 (theo. 50H, obs'd. 54.5H), 3.91-3.05 (theo. 1087H, obs'd. 1391H), 3.03-2.10 (theo. 80H, obs'd. 91H), 2.09-1.50 (theo. 40H, obs'd. 46H).
실시예 12
Figure 112014095982417-pct00103
mPEG12K - b - Poly -[d- Glu ( NHOH ) 5 - co -Glu( NHOH ) 5 ]- b - Poly ( Tyr ( OH ) 30 - co -d- Phe 10 )-Ac mPEG12K-b-Poly-[d-Glu(OBn)5-co-Glu(OBn)5]-b-Poly(Tyr(OH)30-co-d-Phe10)-Ac(113.3 g, 5.5 mmol)는 1130 mL의 건조 THF에서 용해되었고, 히드록시아민 용액(50% aqueous, 2.20 mole, 146 mL) 및 1,5,7-triazabicyclo [4.4.0]dec-5-ene (TBD, 2.30 g, 16.5 mmol)으로 처리되었다. 상기 결과적으로 약간 혼탁한 용액은, N2 하에서 19 시간 동안 50 ℃로 교반되었고, 실온으로 냉각되었고, 1130 mL MeOH로 희석되었다. 상기 정제되지 않은 생산물은, - 30 ℃으로 냉각시키면서, 8 L 디에틸 에테르로부터 침전되었다. 상기 결과적으로 생성된 고형물은 여과에 의해 수집되었고, 250 mL of 건조 THF 및 125 mL 아세톤의 혼합물에 재용해되었고, 아세트산(4.72 g, 79 mmol, 4.5 mL)으로 처리되었고, 5 분 동안 환류시키기 위해 가열된 다음에, 1.5 시간 동안 주위 온도에서 교반되었다. 상기 생산물은 2 L 디에틸 에테르의 첨가에 의해 침전되었고, 흡인 여과에 의해 수집되었고, 디에틸 에테르의 신선한 일부로 세척되엇고, 진공 하에서 밤새 건조시켜, 106.3 g (수득률 = 97.5 %)의 거의 무색, 거품같은(fluffy) 중합체를 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO δ 9.12 (theo. 30H, obs'd. 30H), 8.80-7.75 (theo. 50H, obs'd. 38.4H), 7.15 (theo. 50H, obs'd. 50H), 6.80 (theo. 120H, obs'd. 120H), 4.65-4.05 (theo. 50H, obs'd. 50.4H), 3.80-3.15 (theo. 1087H, obs'd. 1360H), 3.00-2.20 (theo. 80H, obs'd. 79H), 2.15-1.60 (theo. 40H, obs'd. 40H).
실시예 13
Figure 112014095982417-pct00104
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( OBn ) 5 - co - Glu ( OBn ) 5 )- b -Poly(d- Leu 5 - co - Asp ( OtBu ) 10 -co-Tyr(OBn) 25 )-Ac 실시예 10 으로부터 상세한 일반적인 프로토콜을 사용하고, 적절한 NCA 출발 물질을 치환하여, 12 부피의 디에틸 에테르로 침전되고, 디클로로메탄/디에틸 에테르 : 1, 12로부터 재침전된 정제되지 않는 중합체를 수득하였다(Using the general protocol detailed in Example 10 and substituting the appropriate NCA starting materials afforded a crude polymer that was precipitated with 12 volumes of diethyl ether, then reprecipitated from dichloromethane/diethyl ether: 1,12). 여과하고 진공에서 건조시킨 후에, 상기 표제 화합물(title compound)(수득률 = 93.9%)은, 미세한, 무색, 무취의 고형물로서 수득되었다.
실시예 14
Figure 112014095982417-pct00105
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( OBn ) 5 - co - Glu ( OBn ) 5 )- b -Poly(d- Leu 5 - co - Asp ( OH ) 10 - co -Tyr(OH) 25 )-Ac 실시예 11의 방법을 사용하고, 출발 물질로서 mPEG12K-b-Poly-(d-Glu(OBn)5-co-Glu(OBn)5)-b-Poly(d-Leu5-co-Asp(OtBu)10-co-Tyr(OBn)25)-Ac치환하여, 3 시간 동안 및 실온에서 15 분 동안의 반응은, 거품같은, 무색, 무취 중합체로서 상기 표제 생산물(수득률 = 97.0 %)을 수득하였다.
실시예 15
Figure 112014095982417-pct00106
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( NHOH ) 5 - co - Glu ( NHOH ) 5 )- b -Poly(d- Leu 5 - co -Asp(OH) 10 -co-Tyr(OH) 25 )-Ac mPEG12K-b-Poly-(d-Glu(OBn)5-co-Glu(OBn)5)-b-Poly(d-Leu5-co-Asp(OH)10-co-Tyr(OH)25)-Ac(20.81 g, 1.0 mmol)가 210 mL의 THF에 용해되엇고, 히드록실아민 용액(50% aqueous, 0.80 mole, 53.0 mL) 및 1,5,7-트리아자비시클로(triazabicyclo)[4.4.0]dec-5-ene(TBD, 0.84 g, 6.0 mmol)으로 처리되었다. 결과적으로 생성된 혼탁한 용액은 N2 하에서 17 시간 동안 50 ℃로 교반되었고, 실온으로 냉각되었고, 210 mL의 MeOH로 희석되었다. 상기 정제되지 않는 생산물은, 미세한, 무색 중합체로서, 1 L 디에틸에테르로 침전되었고, 여과되었고, 디에틸 에테르의 신선한 일부로 세척되었고, 진공 상에서 밤새 건조되었다(수득률 = 93.3 %, 히드록실아민 염).
실시예 16
Figure 112014095982417-pct00107
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( OBn ) 5 - co - Glu ( OBn ) 5 )- b - Poly (d- Leu 30 - co - Asp ( OtBu ) 10 )-Ac 실시예 10 에서 상세한 일반적인 프로토콜을 사용하고, 적절한 NCA 출발 물질로 치환하여, 30 부피의 디에틸 에테르/헵탄 : 6, 1 로 침전되었고, 그리고 난 다음에 디클로로메탄/디에틸 에테르: 1, 20으로부터 재침전되어 정제되지 않는 중합체를 수득하였다. 여과하고 진공 상에서 건조한 후에, 상기 표제 화합물(수득률 = 90.7 %)은 크림색의 무취의 고성물로서 수득되었다.
실시예 17
Figure 112014095982417-pct00108
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( OBn ) 5 - co - Glu ( OBn ) 5 )- b - Poly (d- Leu 30 - co - Asp ( OH ) 10 )- Ac 실시예 11의 방법을 사용함으로써, 출발물질로서 mPEG12K-b-Poly-(d-Glu(OBn)5-co-Glu(OBn)5)-b-Poly(d-Leu30-co-Asp(OtBu)10)-Ac로 치환하고, PMB를 생략하여, 실온에서 2 시간 동안 반응은, 거품 같은, 무취 중합체로서 상기 표제 화합물(수득률 = 97.4 %)를 수득하였다.
실시예 18
Figure 112014095982417-pct00109
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( NHOH ) 5 - co - Glu ( NHOH ) 5 )- b - Poly (d- Leu 30 - co - Asp ( OH ) 10 )-Ac 실시예 12의 방법을 사용하고, 출발 물질로서 mPEG12K-b-Poly-(d-Glu(OBn)5-co-Glu(OBn)5)-b-Poly(d-Leu30-co-Asp(OH)10)-Ac를 치환함으로써, 50 ℃에서 17 시간 동안 반응은, 미세한, 무색 중합체로서 상기 표제 화합물(수득률 = 96.4 %, 히드록실아민 염)을 수득하였다.
실시예 19
Figure 112014095982417-pct00110
mPEG12K - b - Poly -( Glu ( OBn ) 10 )- b - Poly (d- Phe 20 - co - Tyr ( OBz ) 20 )- Ac 실시예 10에서의 상세한 일반적인 프로토콜을 사용하고, 상기 적절한 NCA 출발 물질을 치환하여, 9 부피의 디에틸 에테르로 침전되고, 디클로로메탄/디에틸 에테르: 1, 14로부터 재침전된, 정제되지 않는 중합체를 수득하였다. 여과하고 진공 상에서 건조한 후에, 상기 표제 화합물(수득률 = 89 %)가 크림색의 무취 고형물로서 수득되었다.
실시예 20
Figure 112014095982417-pct00111
mPEG12K - b - Poly -( Glu ( OBn ) 10 )- b - Poly (d- Phe 20 - co - Tyr 20 )- Ac 실시예 11의 방법을 사용하고, 출발 물질로서 mPEG12K-b-Poly-(Glu(OBn)10)-b-Poly(d-Phe20-co-Tyr(OBz)20)-Ac를 치환하고, 실온에서 4 시간 동안 반응하여, 거품같은, 무색 중합체로서 상기 표제 생산물(수득률 = 87 %)를 수득하였다.
실시예 21
Figure 112014095982417-pct00112
mPEG12K - b - Poly -( Glu ( NHOH ) 10 )- b - Poly (d- Phe 20 - co - Tyr 20 )- Ac 실시예 12의 방법을 사용하고, 출발 물질로서 mPEG12K-b-Poly-(Glu(OBn)10)-b-Poly(d-Phe20-co-Tyr20)-Ac를 치환하고, 50 ℃에서 17 시간 동안 반응은, 미세한, 무색 중합체로서 상기 표제 화합물 (수득률 = 94 %, 히드록실아민 염)를 수득하였다.
실시예 22
Figure 112014095982417-pct00113
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( OBn ) 5 - co - Glu ( OBn ) 5 )- b - Poly ( Tyr ( OBn ) 30 - co -d- Phe 10 )-Ac의 합성 m-PEG10k-NH2 (119.7 g, 10.0 mmol, 실시예 3)은, 오븐-건조된, 2 L-둥근-바닥 플라스크 내로 중량을 달고(weighed), 톨루엔(1 L)에 용해되고, 공비 증류에 의해 건조되었다. 건조를 위해 증류한 후에, 상기 중합체는 3 시간 동안 진공 하에 두었다. 상기 플라스크는 N2로 그 다음에 다시 채워지고, 환산 압력 하에서 다시 비워지고, 건조 N-메틸피롤리돈(NMP)(1100 mL)은 카눌라에 의해 도입되었다. 상기 혼합물은, 용해를 신속하게 처리하기 위해 40 ℃로 잠시 가열된 다음에 25 ℃로 재냉각되었다. Glu(OBn) NCA (13.16 g, 50.0 mmol) 및 d-Glu(OBn) NCA (13.16 g, 50.0 mmol)는 상기 플라스크에 첨가되고, 상기 반응 혼합물은 질소 가스 하에서 주위 실온에서 16 시간 동안 교반시켰다. 그리고 난 다음에, d-Phe NCA (19.12 g, 100 mmol) and Tyr (OBn) NCA (89.19 g, 300 mmol)가 첨가되었고, 상기 용액은 상기 반응이 완료되는 시점(GPC, DMF/0.1% LiBr)에서 48 시간 동안 35 ℃에서 교반되었다. 상기 용액은 실온으로 냉각되었고, 아세트산 무수물(10.21 g, 100 mmol, 9.45 mL), N-메틸모르폴린(NMM)(11.13 g, 110 mmol, 12.1 mL) 및 디메틸아미노피리딘(DMAP)(1.22 g, 10.0 mmole)이 첨가되었다. 실온에서 1 일 동안 지속적으로 교반시켰다. 상기 중합체는 디에틸 에테르(14 L)로 침전되었고, 여과에 의해 분리되고, 신선한 500 mL 일부의 디에틸 에테르로 세척되고, 진공 상에서 건조되어, 미세한, 거의 무색 분말로서 상기 블록 공중합체(214.7 g, 수득률 = 92.3%)가 수득되었다. 1H NMR (d6-DMSO) δ 8.42-7.70 (theo. 50H, obs'd. 47H), 7.30 (theo. 250H, obs'd. 253H), 6.95 (theo. 120H, obs'd. 122H ), 5.10-4.85 (theo. 80H, obs'd. 80H), 4.65-4.20 ((theo. 50H, obs'd. 56H), 3.72-3.25 (theo. 1087H, obs'd. 1593H), 3.05-2.45 (theo. 80H, obs'd. 83H), 2.44-1.60 (theo. 40H, obs'd. 42H).
실시예 23
Figure 112014095982417-pct00114
mPEG12K - b - Poly -[d- Glu ( OBn ) 5 - co -Glu( OBn ) 5 ]- b - Poly -( Tyr ( OH ) 30 - co -d- Phe 10 )-Ac의 합성 mPEG12K-b-Poly-[d-Glu(OBn)5-co-Glu(OBn)5]-b-Poly-(Tyr(OBn)30-co-d-Phe10)-Ac (151.3 g, 6.5 mmol) 및 펜타메틸벤젠(86.1 g, 0.58 mole)는 1400 mL의 트리플루오르아세트산(TFA) 내에 용해되었다. 상기 반응은 실온에서 6 시간 동안 빠르게 교반되었다. 상기 TFA는, 35 ℃를 초과하지 않는 물 수조 온도를 갖는 회전 증발기 상에서 제거되었다. 상기 결과적으로 생성된 스티프 페이스트는 800 mL의 건조 THF에서 용해되었고, 상기 정제되지 않는 생산물은, - 30 ℃로 냉각시키면서, 12 L의 디에틸 에스테르 내로 침전되었다. 상기 결과적으로 생성된 고형물은 여과에 의해 수집되었고, 500 mL의 건조 THF에서 재용해되었고, 3 L 디에틸 에테르 내로 재침전되었다. 거의 무색, 무취, 거품 같은 중합체는 진공 상에서 밤새 상기 생산물을 건조시킨 후에 수득되었다(126.0 g, 수득률 = 94.2 %). 1H NMR (d6-DMSO) δ 9.09 (theo. 30H, obs'd. 29.4H), 8.50-7.75 (theo. 50H, obs'd. 52.7H), 7.40-6.45 (theo. 220H, obs'd. 220H), 5.04 (theo. 20H, obs'd. 17.5H), 4.70-4.20 (theo. 50H, obs'd. 54.5H), 3.91-3.05 (theo. 1087H, obs'd. 1391H), 3.03-2.10 (theo. 80H, obs'd. 91H), 2.09-1.50 (theo. 40H, obs'd. 46H).
실시예 24
Figure 112014095982417-pct00115
mPEG12K - b - Poly -[d- Glu ( NHOH ) 5 - co -Glu( NHOH ) 5 ]- b - Poly -( Tyr ( OH ) 30 - co -d-Phe 10 )-Ac의 합성 mPEG12K-b-Poly-[d-Glu(OBn)5-co-Glu(OBn)5]-b-Poly-(Tyr(OH)30-co-d-Phe10)-Ac (113.3 g, 5.5 mmol)는 1130 mL의 건조 THF에서 용해되었고, 히드록실아민 용액(50 % 수성, 2.20 mole, 146 mL) 및 1,5,7-트리아비시클로[4.4.0]dec-5-ene (TBD, 2.30 g, 16.5 mmol)을 처리되었다. 상기 결과적으로 혼탁한 용액은 N2 하에서 19 시간 동안 50 ℃에서 교반되었고, 실온으로 냉각되고, 1130 mL MeOH로 희석되었다. 상기 정제되지 않는 생산물은, - 30 ℃로 냉각시키면서 8 L 디에틸 에테르로부터 침전되었다. 상기 결과적으로 생성된 고형물은 여과에 의해 수집되었고, 250 mL의 건조 THF 및 125 mL 아세톤의 혼합물에 재용해되었고, 아세트산으(4.72 g, 79 mmol, 4.5 mL)로 처리되었고, 5 분 동안 환류시키기 위해 가열되었고, 그 다음에 1.5 시간 동안 주위 온도에서 교반시켰다. 상기 생산물은 2 L의 디에틸 에테르의 첨가에 의해 침전되었고, 흡인 여과에 의해 수집되었고, 디에틸 에테르의 신선한 일부로 세척되었고, 진공 상에서 밤새 건조시켜, 거의 무색, 거품같은 중합체의 106.3 g(수득률 = 97.5 %)을 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO δ 9.12 (theo. 30H, obs'd. 30H), 8.80-7.75 (theo. 50H, obs'd. 38.4H), 7.15 (theo. 50H, obs'd. 50H), 6.80 (theo. 120H, obs'd. 120H), 4.65-4.05 (theo. 50H, obs'd. 50.4H), 3.80-3.15 (theo. 1087H, obs'd. 1360H), 3.00-2.20 (theo. 80H, obs'd. 79H), 2.15-1.60 (theo. 40H, obs'd. 40H).
실시예 25
Figure 112014095982417-pct00116
mPEG12K - b - Poly -( Asp ( OtBu ) 10 - b - Poly -( Tyr ( OBn ) 20 - co -d- Glu ( OBn ) 20 - Ac 의 합성 실시예 22에 기재된 상기 프로토콜을 사용하고, 상기 NMP 용매를 디클로로메탄: DMF: 10,1로 대체하고, 상기 적절한 NCA 출발물질을 치환하여, 상기 표제 화합물(수득률 = 93.9 %)는, 미세한, 무색, 무취의 고형물로서 제조되었다. 1H NMR (d6-DMSO) δ 8.42-7.85 (theo. 50H, obs'd. 51H), 7.30 (theo. 200H, obs?.198H), 6.98 (theo. 80H, obs'd. 72H ), 5.15-4.85 (theo. 80H, obs'd. 80H), 4.68-4.20 (theo. 50H, obs'd. 46H), 3.72-3.25 (theo. 1087H, obs'd. 1415H), 3.05-1.50 (theo. 120H, obs'd. 114H), 1.35 (theo. 90H, obs'd. 76H).
실시예 26
Figure 112014095982417-pct00117
mPEG12K - b - Poly -( Asp ( OH ) 10 - b - Poly -( Tyr ( OH ) 20 - co -d- Glu ( OBn ) 20 - Ac 의 합성 실시예 23의 방법을 사용하고, 출발 물질로서 mPEG12K-b-Poly-(Asp(OtBu)10-b-Poly-(Tyr(OBn)20-co-d-Glu(OBn)20-Ac를 치환하고, 3 시간 및 실온에서 15 분 동안 반응하고, 디클로로메탄, 디에틸 에테르 : 1, 8.5의 혼합물로부터 침전하여, 미세한, 무색, 무취 중합체로서 상기 표제 화합물(수득률 = 98.9%)을 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO) δ 12.38 (theo. 10H, obs'd. 9H), 9.13 (theo. 20H, obs'd. 17H), 8.40-7.80 (theo. 50H, obs'd. 43H), 7.32 (theo. 100H, obs'd. 82H), 6.80 (theo. 80H, obs'd. 83H), 5.04 (theo. 40H, obs'd. 34.2H), 4.60-4.20 (theo. 50H, obs'd. 55H), 3.80-3.20 (theo. 1087H, obs'd. 1100H), 2.95-1.45 (theo. 140H, obs'd. 154.6H).
실시예 27
Figure 112014095982417-pct00118
mPEG12K - b - Poly -( Asp ( OH ) 10 - b - Poly -( Tyr ( OH ) 20 - co -d- Glu ( NHOH ) 20 - Ac 의 합성 mPEG12K-b-Poly-(Asp(OH)10-b-Poly-(Tyr(OH)20-co-d-Glu(OBn)20-Ac(20.81 g, 1.0 mmol)는 210 mL의 THF에서 용해되었고, 히드록실아민 용액(50 % 수성, 0.80 mole, 53.0 mL) 및 1,5,7-트리아자비시클로[4.4.0]dec-5-ene (TBD, 0.84 g, 6.0 mmol)으로 처리되었다. 상기 결과적으로 생성된 혼탁한 용액은 N2 하에서 17 시간 동안 50 ℃로 교반되었고, 실온으로 냉각되고, 210 mL의 MeOH으로 희석되었다. 상기 정제되지 않은 생산물은, 1 L 디에틸 에테르로 침전되었고, 여과되고, 디에틸 에테르의 신선한 일부로 세척되고, 진공 상에서 밤새 건조시켜, 히드록실아민 염으로서 19.68 g(수득률 = 98.5 %)의 무색, 거품같은 중합체를 수득하였다. 상기 히드록시아민 염의 일부(10.0 g)가 1 L의 30 % tert-부틸 알코올/물에 용해되었고, 탄산 암모늄(3.33 g)으로 처리되었고, 동결 건조시켜, 무색, 무취, 거품같은 고형물로서 천연의(native) 카르복실산 염 형태[정량 수득률(quantitative yield)]이 수득되었다. 1H NMR (d6-DMSO, 히드록실아민 염) δ 9.08 (theo. 20H, obs'd. 10H), 6.80 (theo. 80H, obs'd. 80H), 4.60-4.02 (theo. 50H, obs'd. 54.7H), 3.80-3.15 (theo. 1087H, obs'd. 1211H), 2.90 (theo. 40 H, obs'd. 45H), 2.80-1.50 (theo. 100H, obs'd. 120H). 스펙트럼은 상기 업필드 영역에서 통합에 영향을 미치는 소량의 용매를 나타내었다(Spectrum showed traces of solvent that affected integration in the upfield region).
실시예 28
Figure 112014095982417-pct00119
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( OBn ) 5 - co - Glu ( OBn ) 5 )- b -Poly(d- Leu 5 - co - Asp ( OtBu ) 10 -c-Tyr(OBn) 25 )-Ac의 합성 실시예 22에 상세히 기재된 일반적인 프로토콜을 사용하고, 상기 적절한 NCA 출발 물질을 치환하여, 12 부피의 디에틸 에테르로 침전된 다음에, 디클로로메탄/디에틸 에테르: 1,12로부터 재침전된, 정제되지 않은 중합체를 수득한다. 여과하고 진공 상에서 건조시킨 후에, 상기 표제 화합물(수득률 = 89.2 %)은, 미세한, 무색, 무취 고형물로서 수득되었다. 1H NMR (d6-DMSO) δ 8.52-7.75 (theo. 50H, obs's. 49H), 7.35 (theo. 175H, obs's. 198H), 7.11 (theo. 50 H, obs's. 49H), 6.80 (theo. 50H, obs's. 50H ), 5.10-4.75 (theo. 70 H, obs's. 75H), 4.70-4.15 (theo. 50H, obs's. 56H), 3.72-3.25 (theo. 1087H, obs's. 1580H), 3.05-1.65 (theo. 110H, obs's. 144H), 1.58-0.55 (theo. 135H, obs's. 155H).
실시예 29
Figure 112014095982417-pct00120
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( OBn ) 5 - co - Glu ( OBn ) 5 )- b -Poly(d- Leu 5 - co - Asp ( OH ) 10 - co -Tyr(OH) 25 )-Ac의 합성 실시예 23의 방법을 사용하고, 출발 물질로서 mPEG12K-b-Poly-(d-Glu(OBn)5-co-Glu(OBn)5)-b-Poly(d-Leu5-co-Asp(OtBu)10-co-Tyr(OBn)25)-Ac를 치환하고, 실온에서 3 시간, 15 분 동안 반응하고, 디클로로메탄, 디에틸 에테르: 1,24의 혼합물로부터 침전시키고, 디클로로메탄, 디에틸 에테르: 1,12으로 침전시켜, 거품같은, 무색, 무취 중합체로서 상기 표제 화합물(수득률 = 97.0%) 을 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO) ) δ 9.4-8.5 (theo. 35H, obs'd. 34H), 8.40-7.75 (theo. 50H, obs'd. 61H), 7.35-7.15 (theo. 50H, obs'd. 43H), 6.98 (theo. 50 H, obs'd. 49H), 6.60 (theo. 50H, obs'd. 50H ), 5.04 (theo. 20H, obs'd. 18H), 4.65-4.10 (theo. 50H, obs'd. 58H), 3.80-3.20 (theo. 1087H, obs'd. 1367H, contains masked H2O peak), 3.00-2.15 (theo. 90H, obs'd. 95H), 2.05-1.70 (theo. 20H, obs'd. 26H), 1.63-0.57 (theo. 45 H, obs'd. 45H).
실시예 30
Figure 112014095982417-pct00121
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( OBn ) 5 - co - Glu ( OBn ) 5 )- b -Poly(d- Leu 5 - co - Asp ( OH ) 10 - co -Tyr(OH) 25 )-Ac의 합성 실시예 27의 방법을 사용하고, 출발 물질로서 mPEG12K-b-Poly-(d-Glu(OBn)5-co-Glu(OBn)5)-b-Poly(d-Leu5-co-Asp(OH)10-co-Tyr(OH)25)-Ac를 치환하고, 50 ℃에서 12 시간 동안 반응하여, 미세한, 무색 중합체로서 상기 표제 화합물(수득률 = 93.3 %, 히드록실아민 염)을 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO) δ 9.4-8.5 (theo. 35H, obs'd. 34H), 8.60-7.75 (theo. 50H, obs'd. 43H), 7.2-6.85 (theo. 50H, obs'd. 55H), 6.60 (theo. 50 H, obs'd. 50H), 4.60-4.00 (theo. 50H, obs'd. 41H), 3.80-3.00 (theo. 1087H, obs'd. 1174H, contains masked H2O peak), 3.00-1.65 (theo. 110H, obs'd. 124H), 1.63-0.57 (theo. 45 H, obs'd. 40H).
실시예 31
Figure 112014095982417-pct00122
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( OBn ) 5 - co - Glu ( OBn ) 5 )- b - Poly (d- Leu 30 - co - Asp ( OtBu ) 10 )-Ac의 합성 실시예 22에 기재된 일반적인 프로토콜을 사용하고, 적절한 NCA 출발 물질을 치환하여, 30 부피의 디에틸 에테르/헵탄: 6,1로 침전되었고, 그 다음에 디클로로메탄/디에틸 에테르: 1,20로 재침전된 정제되지 않는 중합체를 수득하였다. 정제 및 진공 상에서 건조시킨 후에, 상기 표제 화합물(수득률 = 90.7 %)은, 크림색, 무취 고형물로서 수득되었다. 1H NMR (d4 -MeOH) δ 7.31 (theo. 50H, obs'd. 66H), 5.04 (theo. 20H, obs'd. 20H), 4.45-3.97 (theo. 50H, obs'd. 37H), 3.95-3.25 (theo. 1087H, obs'd. 1876H), 3.05-0.80 (theo. 420H, obs'd. 313H).
실시예 32
Figure 112014095982417-pct00123
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( NHOH ) 5 - co - Glu ( NHOH ) 5 )- b -Poly(d- Leu 5 - co - Asp ( OH ) 10 -co-Tyr(OH) 25 )-Ac의 합성 실시예 27의 방법을 사용하고, 출발 물질로서 mPEG12K-b-Poly-(d-Glu(OBn)5-co-Glu(OBn)5)-b-Poly(d-Leu5-co-Asp(OH)10-co-Tyr(OH)25)-Ac를 치환하고, 50 ℃에서 12 시간 동안 반응시켜, 미세한, 무색 중합체로서 상기 표제 생산물(수득률 = 93.3 %, 히드록실아민 염)을 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO) δ 9.4-8.5 (theo. 35H, obs'd. 34H), 8.60-7.75 (theo. 50H, obs'd. 43H), 7.2-6.85 (theo. 50H, obs'd. 55H), 6.60 (theo. 50 H, obs'd. 50H), 4.60-4.00 (theo. 50H, obs'd. 41H), 3.80-3.00 (theo. 1087H, obs'd. 1174H, contains masked H2O peak), 3.00-1.65 (theo. 110H, obs'd. 124H), 1.63-0.57 (theo. 45 H, obs'd. 40H).
실시예 33
Figure 112014095982417-pct00124
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( OBn ) 5 - co - Glu ( OBn ) 5 )- b - Poly (d- Leu 30 - co - Asp ( OH ) 10 )- Ac 의 합성 실시예 23의 방법을 사용하고, 출발 물질로서 mPEG12K-b-Poly-(d-Glu(OBn)5-co-Glu(OBn)5)-b-Poly(d-Leu30-co-Asp(OtBu)10)-Ac를 치환하고, PMB를 생략하여, 실온에서 2 시간 동안 반응하고, 디클로로메탄, 디에틸 에테르: 1, 13로부터 침전시켜, 거품같은, 무색 중합체로서 상기 표제 화합물(수득률 = 97.4 %)을 수득하였다. 1H NMR (d4 -MeOH) δ 7.31 (theo. 50H, obs'd. 61H), 5.04 (theo. 20H, obs'd. 20H), 4.45-3.97 (theo. 50H, obs'd. 29H), 3.95-3.25 (theo. 1087H, obs'd. 1542H), 3.05-0.80 (theo. 330H, obs'd. 258H).
실시예 34
Figure 112014095982417-pct00125
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( NHOH ) 5 - co - Glu ( NHOH ) 5 )- b - Poly (d- Leu 30 - co - Asp ( OH ) 10 )-Ac의 합성 실시예 27의 방법을 사용하고, 출발 물질로서 mPEG12K-b-Poly-(d-Glu(OBn)5-co-Glu(OBn)5)-b-Poly(d-Leu30-co-Asp(OH)10)-Ac를 치환하여, 50 ℃에서 17 시간 동안 반응하여, 미세한, 무색 중합체로서 상기 표제 생산물(수득률 = 96.4 %, 히드록실아민 염)을 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO) δ 8.8-7.2 (theo. 70H, obs'd. 67H), 4.55-3.85 (theo. 50H, obs'd. 50H), 3.80-3.30 (theo. 1087H, obs'd. 1520H), 3.29-2.60 (theo. 60H, obs'd. 80 H),
2.42-0.70 (theo. 270H, obs'd. 278H).
실시예 35
Figure 112014095982417-pct00126
mPEG12K - b - Poly -[d- Glu ( NHOH ) 5 - co -Glu( NHOH ) 5 ]- b - Poly -( Tyr ( OH ) 30 - co -d-Phe 10 )-Ac의 합성 mPEG12K-b-Poly-[d-Glu(OBn)5-co-Glu(OBn)5]-b-Poly-(Tyr(OH)30-co-d-Phe10)-Ac(30.86 g, 1.50 mmol)는 310 mL의 건조 THF에서 용해되었고, 히드록실아민 용액(50 % aqueous, 0.60 mole, 39.7 mL) 및 1,5,7-트리아자비시클로 [4.4.0]dec-5-ene (TBD, 626.4 mg, 4.5 mmol)으로 처리되었다. 결과적으로 생성된 혼탁한 용액은 N2 하에서 69 시간 동안 실온에서 교반되었고, 310 mL MeOH로 희석되었다. 상기 정제되지 않는 생산물은, -30 ℃로 냉각시키면서, 3 L 디에틸 에테르로부터 침전되었다. 결과적으로 생성된 고형물을 여과에 의해 수집되었고, 150 mL의 건조 THF 및 100 mL 아세톤의 혼합물에 재용해되었고, 아세트산(1.26 g, 21.0 mmol, 1.2 mL)으로 처리되었고, 그리고 난 다음에 2 시간 동안 주위 온도에서 교반되었다. 상기 생산물은 1.5 L 디에틸 에테르의 첨가에 의해 침전되었고, 흡인 여과에 의해 수집되었고, 디에틸 에테르의 신선한 일부로 세척되었고, 진공 상에서 밤새 건조되어, 거의 무색, 거품같은 중합체의 29.41 g(수득률 = 98.9 %)를 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO): 실시예 24와 동일함.
실시예 36
Figure 112014095982417-pct00127
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( OBn ) 5 - co - Glu ( OBn ) 5 )- b - Poly -( Tyr ( OBn ) 25 - co -d- Phe 15 )-Ac의 합성 실시예 24에 기재된 프로토콜을 사용하고, 적절한 NCA 출발 물질을 치환하여, 10 부피의 디에틸 에테르로 침전하는 정제되지 않는 중합체를 수득하였다. 여과 및 진공 상에서 건조시킨 후에, 상기 표제 화합물(수득률 = 83.6 %)은, 미세한, 무색, 무취 고형물로서 수득되었다. 1H NMR (d6-DMSO) δ 8.42-7.80 (theo. 50H, obs'd. 43H), 7.42-6.68 (theo. 350H, obs'd. 350H), 5.10-4.80 (theo. 70H, obs'd. 73H), 4.65-4.20 (theo. 50H, obs'd. 50H), 3.75-3.25 (theo. 1087H, obs'd. 1755H), 3.01-2.30 (theo. 80H, obs'd. 85H), 2.02-1.60 (theo. 40H, obs'd. 38H).
실시예 37
Figure 112014095982417-pct00128
mPEG12K - b - Poly -[d- Glu ( OBn ) 5 - co -Glu( OBn ) 5 ]- b - Poly -( Tyr ( OH ) 25 - co -d- Phe 15 )-Ac의 합성 실시예 23에 기재된 방법을 사용하고, 출발 물질로서 mPEG12K-b-Poly-[d-Glu(OBn)5-co-Glu(OBn)5]-b-Poly-(Tyr(OBn)25-co-d-Phe15)-Ac를 치환하여, 실온에서 5.25 시간 동안 반응시켜, 미세한, 무색, 무취 중합체로서 상기 표제 화합물(수득률 = 99.3%)이 수득되었다. 1H NMR (d6-DMSO) δ 9.09 (theo. 25H, obs'd. 22H), 8.40-7.75 (theo. 50H, obs'd. 49H), 7.40-6.50 (theo. 225H, obs'd. 225H), 5.04 (theo. 20H, obs'd. 21H), 4.65-4.20 (theo. 50H, obs'd. 54H), 3.81-3.20 (theo. 1087H, obs'd. 1613H), 3.05-2.10 (theo. 80H, obs'd. 90H), 2.05-1.63 (theo. 40H, obs'd. 38H).
실시예 38
Figure 112014095982417-pct00129
mPEG12K - b - Poly -[d- Glu ( NHOH ) 5 - co -Glu( NHOH ) 5 ]- b - Poly -( Tyr ( OH ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 mPEG12K-b-Poly-[d-Glu(OBn)5-co-Glu(OBn)5]-b-Poly-(Tyr(OH)25-co-d-Phe15)-Ac (51.23 g, 2.50 mmol)는 515 mL의 건조 THF에 용해되었고, 히드록실아민 용액(50 % 수성, 1.00 mole, 66.3 mL, 40 equiv./Bn 에스테르 모이어티) 및 1,5,7-트리아자비시클로[4.4.0]dec-5-ene (TBD, 1.044 g, 7.5 mmol, 0.3 equiv.)으로 처리되었다. 상기 결과적으로 생성된 혼탁한 용액은 N2 하에서 108 시간 동안 실온에서 교반되었고, 515 mL의 IPA로 희석되었다. 상기 정제되지 않는 생산물은 6 L의 디에틸 에테르로부터 침전되었다. 상기 결과적으로 생성된 고형물은 여과에 의해 수집되었고, 300 mL의 건조 THF 및 200 mL 아세톤의 혼합물에 재용해되엇고, 아세트산(2.25 g, 37.5 mmol, 2.15 mL)으로 처리되었고, 그 다음에 2.5 시간 동안 주위 온도에서 교반되었다. 상기 생성물은 3 L의 디에틸 에테르의 첨가에 의해 침전되었고, 흡인 여과에 의해 수집되었고, 디에틸 에테르의 신선한 부분으로 세척되었고, 진공 상에서 밤새 건조되어, 아세트산의 약간의 냄새가 나는, 거의 무색, 거품같은 중합체로서 45.16 g(수득률 = 91.5 %)의 상기 표제 화합물을 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO) δ 9.35-8.85 (theo. 45H, obs'd. 28H), 8.42-7.75 (theo. 50H, obs'd. 37H), 7.37-6.46 (theo. 175H, obs'd. 164H), 4.65-4.00 (theo. 50H, obs'd. 50H), 3.82-3.07 (theo. 1087H, obs'd. 1708H, contains masked H2O peak), 3.05-2.20 (theo. 80H, obs'd. 84H), 2.18-1.63 (theo. 40H, obs'd. 68H, contains trace of HOAc).
실시예 39
Figure 112014095982417-pct00130
mPEG12K - b - Poly -[d- Glu ( NHOH ) 5 - co -Glu( NHOH ) 5 ]- b - Poly -( Tyr ( OH ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 실시예 38의 방법을 사용하고, 상기 히드록실아민 농도(80 equiv./Bn ester)를 증가시키고, 실온에서 65 시간 동안 반응시키고, 상기와 같이 워크-업(work-up as above)은, 아세트산의 냄새를 갖는, 미세한, 무색 중합체로서 상기 표제 화합물(수득률 = 87.8%)을 수득하였다(By using the method of Example 38 and increasing the hydroxylamine concentration, reaction for 65 hours at room temperature and work-up as above afforded the title product as a fine, colorless polymer with a slight odor of acetic acid). 1H NMR (d6-DMSO): 실시예 38 과 동일함.
실시예 40
Figure 112014095982417-pct00131
mPEG12K - b - Poly -[d- Glu ( NHOH ) 5 - co -Glu( NHOH ) 5 ]- b - Poly -( Tyr ( OH ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 실시예 39의 방법을 사용하고, TBD를 2-히드록시피리딘(0.3 equiv.)으로 치환하고, 실온에서 137 시간 동안 반응하고, 상기와 같이 워크-업은, 아세트산의 냄새를 갖는, 미세한, 무색 중합체로서 상기 표제 화합물(수득률 = 91.2 %)을 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO): 실시예 38 과 동일함.
실시예 41
Figure 112014095982417-pct00132
mPEG12K - b - Poly -[d- Glu ( NHOH ) 5 - co -Glu( NHOH ) 5 ]- b - Poly -( Tyr ( OH ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 실시예 38의 방법을 사용하고, TBD를 2-히드록시피리딘(0.3 equiv.)으로 치환하고, 50 ℃에서 24.5 시간 동안 반응하고, 상기와 같이 워크-업하여, 아세트산의 냄새를 갖는, 미세한, 무색 중합체로서 상기 표제 화합물(수득률 = 91.2 %)을 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO): 실시예 38 과 동일함.
실시예 42
Figure 112014095982417-pct00133
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( OBn ) 5 - co - Glu ( OBn ) 5 )- b - Poly -( Tyr ( OBn ) 25 - co -d- Phe 15 )-Ac의 합성 실시예 36에서의 상세한 프로토콜을 사용하고, 적절한 NCA 출발 물질을 치환하여, 5 부피의 이소프로판올으로 침전시킨 정제되지 않는 중합체를 수득하였다. 여과시키고 진공 상에서 건조시킨 후에, 상기 표제 화합물(수득률 = 84.2 %)은, 미세한, 무색, 무취 고형물로서 수득되었다. 1H NMR (d6-DMSO): 실시예 36과 동일함.
실시예 43
Figure 112014095982417-pct00134
mPEG12K - b - Poly -[d- Glu ( OBn ) 5 - co -Glu( OBn ) 5 ]- b - Poly -( Tyr ( OH ) 25 - co -d- Phe 15 )-Ac의 합성 실시예 37의 방법을 사용하고, 실온에서 4 시간 동안 TFA에서 PMB와 mPEG12K-b-Poly-[d-Glu(OBn)5-co-Glu(OBn)5]-b-Poly-(Tyr(OBn)25-co-d-Phe15)-Ac의 반응 및 클로로부탄(chlorobutane), TBME: 1,3의 혼합물로부터 침전으로, 미세한, 무색, 무취 중합체로서 상기 표제 화합물(수득률 = 93.1%)을 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO): 실시예 37과 동일함.
실시예 44
Figure 112014095982417-pct00135
mPEG12K - b - Poly -[d- Glu ( NHOH ) 5 - co -Glu( NHOH ) 5 ]- b - Poly -( Tyr ( OH ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 mPEG12K-b-Poly-[d-Glu(OBn)5-co-Glu(OBn)5]-b-Poly-(Tyr(OH)25-co-d-Phe15)-Ac (4.10 g, 0.20 mmol)는 41 mL의 건조 THF에서 용해되었고, 히드록실아민 용액(50 % 수성, 40.0 mmol, 2.65 mL, 20 equiv./Bn 에스테르 모이어티) 및 수산화리튬 모노하이드레이(lithium hydroxide monohydrate)(84.0 mg, 2.0 mmol, 1.0 equiv./Bn 에스테르 모이어티)로 처리되었다. 상기 결과적으로 생성된 맑은 옅은 황색 용액은 N2 하에서 22 시간 동안 실온에서 교반되었고, 41 mL의 IPA로 희석되었다. 상기 정제되지 않는 생산물은 빠른 교반과 함께 160 mL의 TBME로부터 침전되었다. 상기 결과적으로 생성된 고형물은 여과에 의해 수집되었고, 진공에서 건조되었고, 24 mL 건조 THF 및 16 mL 아세톤의 혼합물에 재용해되었다. 상기 용액은 아세트산(0.18 g, 3.00 mmol, 0.17 mL)으로 처리되었고, 환류시키기 위해 잠시 가열되었고, 15 시간 동안 주위 온도에서 교반시켰다. 상기 생산물은 TBME의 첨가에 의해 침전되었고, 흡인 여과에 의해 수집되었고, TBME의 신선한 일부로 세척되었고, 진공 상에 밤새 건조되어, 거의 무색, 거품같은 중합체로서 3.62 g(수득률 = 91.7%)의 상기 표제 화합물을 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO): 실시예38과 동일함.
실시예 45
Figure 112014095982417-pct00136
mPEG12K - b - Poly -[d- Glu ( NHOH ) 5 - co -Glu( NHOH ) 5 ]- b - Poly -( Tyr ( OH ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 실시예 44에서 상기에 기재된 방법을 사용하여, mPEG12K-b-Poly-[d-Glu(OBn)5-co-Glu(OBn)5]-b-Poly-(Tyr(OH)25-co-d-Phe15)-Ac가, 수산화 리튬 모노하이드레이트(2.0 equiv./Bn 에스테르 모이어티)를 사용하여 상기 표제 화합물로 전환되었다. 반응 시간은 18 시간이었다. 상기 정제되지 않는 생산물은 16 부피의 IPA로부터 침전되었고, 상기 결과적으로 생성된 고형물은, 실시예 44에 상세하게 기재된 바와 같은, THF, 아세톤 및 아세트산으로 처리되었다. 두 부피의 TBME로부터의 침전, 여과 및 진공 상의 건조 후에, 상기 표제 화합물(수득률 = 96.2 %)은, 미세한, 무색 고형물로서 수득되었다. 1H NMR (d6-DMSO): 실시예 38과 동일함.
실시예 46
Figure 112014095982417-pct00137
mPEG12K - b - Poly -[d- Glu ( NHOH ) 5 - co -Glu( NHOH ) 5 ]- b - Poly -( Tyr ( OH ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 mPEG12K-b-Poly-[d-Glu(OBn)5-co-Glu(OBn)5]-b-Poly-(Tyr(OH)25-co-d-Phe15)-Ac(2.05 g, 0.10 mmol)는 21 mL의 메탄올로 용해되었고, 히드록실아민 용액(50 % 수성, 20.0 mmol, 1.32 mL, 20 equiv./Bn 에스테르 모이어티) 및 1M 수산화리튬 용액(1.0 mL, 1.0 mmol, 1.0 equiv./Bn 에스테르 모이어티)으로 처리되었다. 상기 결과적으로 생성된 옅은 황색 용액은 N2 하에서 22 시간 동안 실온에서 교반되었고, 1 M 수산화리튬 용액의 추가적인 일부(1.0 mL, 1.0 mmol, 1.0 equiv./Bn 에스테르 모이어티)가 첨가되었다. 추가적인 24 시간 후에, 상기 정제되지 않는 생산물은 160 mL의 TBME로부터 침전되었다. 상기 결과적으로 생성도니 고형물은 여과에 의해 수집되었고, 진공 상에서 건조되었고, 12 mL 건조 THF 및 8 mL의 아세톤의 혼합물에서 재용해되었다. 상기 용액은 아세트산(0.21 g, 3.50 mmol, 0.20 mL)으로 처리되었고, 환류시키기 위해 잠시 가열하고, 16 시간 동안 주위 온도에서 교반시켰다. 상기 생성물은 40 mL TBME의 첨가에 의해 침전되었고, 흡인 여과에 의해 수집되고, TBME의 신선한 일부로 세척되고, 진공 상에서 밤새 건조되어, 거의 무색, 거품같은 중합체로서 1.87 g(수득률 = 94.9%)의 상기 표제 화합물을 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO): 실시예 38과 동일함.
실시예 47
Figure 112014095982417-pct00138
mPEG12K - b - Poly -[d- Glu ( NHOH ) 5 - co -Glu( NHOH ) 5 ]- b - Poly -( Tyr ( OH ) 25 - co -d- Phe 15 )-Ac의 합성 실시예 44에서 상기에 기재된 방법을 사용하여, mPEG12K-b-Poly-[d-Glu(OBn)5-co-Glu(OBn)5]-b-Poly-(Tyr(OH)25-co-d-Phe15)-Ac가, 수산화 리튬 용액(0.5 equiv./Bn 에스테르 모이어티)을 사용하여 상기 표제 화합물로 변환되었다. 반응 시간은 72 시간이었다. 상기 용액은 1 부피의 IPA로 희석되었고, 상기 정제되지 않는 생산물은 2 부피의 TBME로부터 침전되었다. 상기 결과적으로 생성된 고형물은, 실시예 44에 상세하게 기재된 바와 같이, THF, 아세톤, 및 아세트산으로 처리되었다. 두 부피의 TBME로부터의 침전, 여과, 및 진공상의 건조 후에, 상기 표제 화합물(수득률 = 91.1%)은, 미세한, 무색 고형물로서 수득되었다. 1H NMR (d6-DMSO): 실시예 38과 동일함.
실시예 48
Figure 112014095982417-pct00139
mPEG12K - b - Poly -[d- Glu ( NHOH ) 5 - co -Glu( NHOH ) 5 ]- b - Poly -( Tyr ( OH ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 실시예 47에서 상기에 기재된 상기 방법을 사용하여, mPEG12K-b-Poly-[d-Glu(OBn)5-co-Glu(OBn)5]-b-Poly-(Tyr(OH)25-co-d-Phe15)-Ac는, 1 M 수산화칼륨 용액(2.0 equiv./Bn 에스테르 모이어티)를 사용하여 상기 표제 화합물로 변환되었다. 반응 시간은 6 시간이었다. 워크업(Workup)은, 미세한, 무색 고형물로서 표제 화합물(수득률 = 92.4 %)를 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO): 실시예 38과 동일함.
실시예 49
Figure 112014095982417-pct00140
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( OBn ) 3.5 - co - Glu ( OBn ) 3.5 )- b - Poly ( Tyr ( OBn ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 m-PEG10k-NH2, (59.86 g, 5.0 mmol)는 오븐-건조된, 1 L-둥근-바닥 플라스크로 중량측정되었고, 톨루엔(450 mL)에 용해되었고, 공비 증류에 의해 건조되었다. 건조시키기 위해 증류 후에, 상기 중합체는 16 시간 동안 진공 하에서 두었다. 상기 플라스크는 그 다음에 N2로 다시 채웠고, 환산 압력 하에서 다시 비워지고, 건조 N-메틸피롤리돈(NMP, 250 mL) 및 그리고 난 다음에 디클로로메탄(250 mL)은 카눌라에 의해 도입되었다. 상기 혼합물은, 용해를 더 신속하게 처리하기 위해 40 ℃로 잠시 가열하고, 그리고 난 다음에 25 ℃로 다시 냉각되었다. Glu(OBn) NCA (4.61 g, 17.5 mmol) 및 d-Glu(OBn) NCA (4.61 g, 17.5 mmol)는 상기 플라스크에 첨가되었고, 상기 반응 혼합물은 질소 가스 하에서 주위 실온에서 24 시간 동안 교반시켰다. 그리고 난 다음에, d-Phe NCA (14.34 g, 75.0 mmol) and Tyr (OBn) NCA (37.16 g, 125.0 mmol)가 첨가되었고, 상기 용액은 3 일 동안 실온에서 교반시켰고, 상기 반응이 완료되는 시점(GPC, DMF/0.1% LiBr)에서 7 시간 동안 35 ℃로 가열되었다. 상기 용액은 실온으로 냉각되었고, 아세트산 무수물(5.11 g, 50.0 mmol, 4.80 mL), N-메틸모르폴린(NMM)(5.56 g, 55.0 mmol, 6.1 mL) 및 디메틸아미노피리딘(DMAP)(0.61 g, 5.0 mmole)가 첨가되었다. 교반시키는 것은 실온에서 18 시간 동안 유지되었고, 상기 디클로로메탄은 회전 증발기에서 제거되었다. 상기 중합체는 이소프로판올(2.6 L) 내로 침전되었고, 여과에 의해 분리되었고, 이소프로판올의 신선한 500 mL 일부로 세척하고, 진공 상에서 건조되어, 미세한, 거의 무색의 분말(102.40 g, 수득률 = 92.6%)로서 상기 블록 공중합체를 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO) δ 8.42-7.80 (theo. 47H, obs'd. 44H), 7.35 (theo. 75H, obs'd. 75H), 7.28-6.65 (theo. 125H, obs'd. 125H), 5.10-4.84 (theo. 64H, obs'd. 59H), 4.64-4.20 (theo. 47H, obs'd. 39H), 3.72-3.25 (theo. 1087H, obs'd. 16713H), 3.00-2.20 (theo. 80H, obs'd. 88H), 2.03-1.60 (theo. 28H, obs'd. 27H).
실시예 50
Figure 112014095982417-pct00141
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( OBn ) 3.5 - co - Glu ( OBn ) 3.5 )- b - Poly ( Tyr ( OBn ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 용매로서 건조 N-메틸피롤리돈(NMP, 125 mL) 및 디클로로메탄(375 mL)과 함께, 실시예 49에 상세하게 기재된 상기 프로토콜을 사용하여, 5 부피의 이소프로판올로 침전된 정제되지 않는 중합체를 수득하였다. 여과 및 진공 상에서 건조시킨 후에, 상기 표제 화합물(수득률 = 96.5 %)은, 미세한, 무색, 무취 고형물로서 수득되었다. 1H NMR (d6-DMSO): 실시예 49와 동일함.
실시예 51
Figure 112014095982417-pct00142
mPEG12K - b - Poly -[d- Glu ( NHOH ) 5 - co -Glu( NHOH ) 5 ]- b - Poly -( Tyr ( OH ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 mPEG12K-b-Poly-[d-Glu(OBn)5-co-Glu(OBn)5]-b-Poly-(Tyr(OH)25-co-d-Phe15)-Ac (4.10 g, 0.20 mmol)는 41 mL의 THF에서 용해되었고, 히드록실아민 용액(2.65 mL, 40.0 mmol) 및 1 M 수산화칼륨(2.0 mL, 2.0 mmol, 1.0 equiv./Bn 에스테르 모이어티)으로 처리되었다. 상기 결과적으로 생성된 약간 흐릿한 핑크색 용액(The resultant slightly hazy pink solution)은 N2 하에서 42 시간 동안 실온에서 교반된 다음에, 아세톤(58.1 g, 1.0 mol, 74 mL)으로 희석되었다. 아세트산(2.40 g, 40.0 mmol, 2.3 mL)은 첨가되었고, 상기 용액은 환류시키기 위해 잠시 가열되었고, 그리고 난 다음에 4 시간 동안 실온에서 교반되었다. 상기 생산물은, 활발한 교반을 사용하여 TBME (300 mL)로 침전되었다. 추가적인 30 분에 교반시킨 후에, 여과 및 진공 상의 건조는, 미세한, 무색 고형물(수득률 = 92.9%)로서 상기 표제 화합물을 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO): 실시예 38과 동일함.
실시예 52
Figure 112014095982417-pct00143
mPEG12K - b - Poly -[d- Glu ( NHOH ) 5 - co -Glu( NHOH ) 5 ]- b - Poly -( Tyr ( OH ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 실시예 51에 상기에 기재된 방법을 사용하여, mPEG12K-b-Poly-[d-Glu(OBn)5-co-Glu(OBn)5]-b-Poly-(Tyr(OH)25-co-d-Phe15)-Ac는, 1 M 수산화 리튬 용액(2.0 equiv./Bn 에스테르 모이어티)을 사용하여 상기 표제 화합물로 변환되었다. 반응 시간은 6 시간이었다. 상기한 바와 같이 워크업 및 IPA(1 volume)와 희석하고, TBME (3 volumes)로 침전한 다음에, 미세한, 무색 고형물로서 상기 표제 화합물(수득물 = 90.6%)을 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO): 실시예 38과 동일함.
실시예 53
Figure 112014095982417-pct00144
mPEG12K - b - Poly -[d- Glu ( NHOH ) 5 - co -Glu( NHOH ) 5 ]- b - Poly -( Tyr ( OH ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 실시예 52에서 상기에 기재된 방법을 사용하여, mPEG12K-b-Poly-[d-Glu(OBn)5-co-Glu(OBn)5]-b-Poly-(Tyr(OH)25-co-d-Phe15)-Ac는, 고형의 수소화리튬 모노하이드레이트(2.0 equiv./Bn 에스테르 모이어티)를 사용하여, 상기 표제 화합물로부터 변환되었다. 반응 시간은 6 시간이다. 워크업은 미세한, 무색 고형물로서 상기 표제 화합물(수득률 = 99.2%)을 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO): 실시예 38과 동일함.
실시예 54
Figure 112014095982417-pct00145
mPEG12K - b - Poly -[d- Glu ( OBn ) 3.5 - co - Glu ( OBn ) 3.5 ]- b - Poly -( Tyr ( OH ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 실시예 37의 방법을 사용하여, 실온에서 3.5 시간 동안 TFA에서 PMB와 mPEG12K-b-Poly-[d-Glu(OBn)3.5-co-Glu(OBn)3.5]-b-Poly-(Tyr(OBn)25-co-d-Phe15)-Ac의 반응 및 디클로로메탄, TBME: 1,7의 혼합물로부터의 침전은, 미세한, 무색, 무취 중합체로서 상기 표제 화합물(수득률 = 96.1%)를 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO) δ 9.09 (theo. 25H, obs'd. 22H), 8.46-7.79 (theo. 47H, obs'd. 48H), 7.40-6.45 (theo. 210H, obs'd. 229H), 5.04 (theo. 14H, obs'd. 13H), 4.65-4.20 (theo. 47H, obs'd. 47H), 3.81-3.15 (theo. 1087H, obs'd. 1308H), 3.03-2.10 (theo. 80H, obs'd. 78H), 2.06-1.62 (theo. 40H, obs'd. 27H).
실시예 55
Figure 112014095982417-pct00146
mPEG12K - b - Poly -[d- Glu ( NHOH ) 5 - co -Glu( NHOH ) 5 ]- b - Poly -( Tyr ( OH ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 실시예 51에서 상기에 기재된 방법을 사용하여, mPEG12K-b-Poly-[d-Glu(OBn)5-co-Glu(OBn)5]-b-Poly-(Tyr(OH)25-co-d-Phe15)-Ac는, 4 M 수소화나트륨 용액(2.0 equiv./Bn 에스테르 모이어티)를 사용하여 상기 표제 화합물로 전환되었다. 반응 시간은 4 시간이다. 상기 용액은, 아세톤(전체 반응 혼합물 부피를 기초로 0.30 부피)으로 희석되었고, 아세트산(1.0 equiv./히드록실아민)이 첨가되었다. 14 시간 후에, 상기 정제되지 않은 생산물은 3 부피의 TBME로부터 침전되었고, 3 일 동안 교반되었고 여과되었다. 상기 여과 케이크(filter cake)가 TBME (50 mL), TBME, IPA:20,1 (50 mL)로 세척되었고, 진공 상에서 건조시켜, 약간의 아세트산 냄새를 갖는 미세한, 무색 고형물로서, 상기 표제 화합물(수득률 = 93.5%)를 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO): 실시예 38과 동일함.
실시예 56
Figure 112014095982417-pct00147
mPEG12K - b - Poly -[d- Glu ( NHOH ) 3.5 - co - Glu ( NHOH ) 3.5 ]- b - Poly -( Tyr ( OH ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 실시예 52에서 상기에 기재된 방법을 사용하여, mPEG12K-b-Poly-[d-Glu(OBn)3.5-co-Glu(OBn)3.5]-b-Poly-(Tyr(OH)25-co-d-Phe15)-Ac가, 고형의 수산화리튬 모노하이드레이트(2.0 equiv./Bn 에스테르 모이어티)를 사용하여 상기 표제 화합물로 변환되었다. 반응 시간은 6 시간이다. 워크업은, 약간의 아세트산 냄새를 갖는 미세한, 무색 고형물로서, 상기 표제 화합물(수득률 = 94.9 %)를 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO) δ 10.2-9.2 (theo. 25H, obs'd. 19H), 8.52-7.90 (theo. 47H, obs'd. 38H), 7.40-6.49 (theo. 175H, obs'd. 175H), 4.63-4.00 (theo. 47H, obs'd. 42H), 3.84-3.11 (theo. 1087H, obs'd. 1496H, contains masked H2O peak), 3.00-2.20 (theo. 80H, obs'd. 78H), 2.16-1.60 (theo. 28H, obs'd. ~26H, contains overlapping HOAc peak at δ 1.69).
실시예 57
Figure 112014095982417-pct00148
mPEG12K - b - Poly -[d- Glu ( NHOH ) 3.5 - co - Glu ( NHOH ) 3.5 ]- b - Poly -( Tyr ( OH ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 실시예 52에서 상기에 기재된 방법을 사용하여, mPEG12K-b-Poly-[d-Glu(OBn)3.5-co-Glu(OBn)3.5]-b-Poly-(Tyr(OH)25-co-d-Phe15)-Ac가, 10M 수산화나트륨 용액(2.0 equiv./Bn 에스테르 모이어티)를 사용하여 상기 표제 화합물로 변환되었다. 반응 시간은 6 시간이다. 워크업은, 약간의 아세트산 냄새를 갖는 미세한, 무색 고형물로서, 상기 표제 화합물(수득률 = 85.8 %)를 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO): 실시예 56과 동일함.
실시예 58
Figure 112014095982417-pct00149
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( OBn ) 5 - co - Glu ( OBn ) 5 )- b -Poly(d- Phe 15 - co - Asp ( OtBu ) 5 -co-Tyr(OBn) 20 )-Ac의 합성 용매로서 무수 디클로로메탄[2 일부(2 parts)] 및 N,N-디메틸아세트아미드(DMAC, 1 일부)와 실시예 49에 상세하게 기재된 상기 방법을 사용하고, 상기 적절한 NCA 빌딩 블록(building blocks)을 치환하여, 5 부피의 이소프로판올로 침전된 정제되지 않는 중합체를 수득하였다. 여과 및 진공 상에서 건조시킨 후에, 상기 표제 화합물(수득률 = 95.4 %)은, 미세한, 무색, 무취 고형물로서 수득되었다. 1H NMR (d6-DMSO) δ 8.57-7.75 (theo. 50H, obs'd. 47H), 7.41-6.67 (theo. 305 H, obs'd. 305H), 5.10-4.85 (theo. 60 H, obs'd. 59H), 4.70-4.18 (theo. 50H, obs'd. 49H), 3.72-3.25 (theo. 1087H, obs'd. 1131H), 3.05-2.20 (theo. 80H, obs'd. 100H), 2.05-1.58 (theo. 40H, obs'd. 25H), 1.38-1.20 (theo. 45H, obs'd. 40H).
실시예 59
Figure 112014095982417-pct00150
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( OBn ) 5 - co - Glu ( OBn ) 5 )- b - Poly -(d- Leu 15 - co - Asp ( OtBu ) 5 -co-Tyr(OBn) 20 )-Ac 실시예 58에서 상세하게 기재된 방법을 사용하고, 상기 적절한 NCA 빌딩 블록을 치환하여, 5 부피의 이소프로판올로 침전된 정제되지 않는 중합체를 수득하였다. 여과하고 진공 상에서 건조시킨 후에, 상기 표제 화합물(수득률 = 95.5%)은, 미세한, 무색, 무취 고형물로서 수득되었다. 1H NMR (d6-DMSO) δ 8.45-7.78 (theo. 50H, obs'd. 47H), 7.45-6.67 (theo. 230H, obs'd. 230H), 5.10-4.80 (theo. 60 H, obs'd. 59H), 4.65-4.00 (theo. 50H, obs'd. 52H), 3.70-3.25 (theo. 1087H, obs'd. 1196H), 3.05-2.55 (theo. 40H, obs'd. 41H), 2.48-2.30 (theo. 40H, obs'd. 33H), 2.05-1.71 (theo. 40H, obs'd. 25H), 1.69-1.02 (theo. 60H, obs'd. 65H), 0.95-0.55 (theo. 90H, obs'd. 83H).
실시예 60
Figure 112014095982417-pct00151
mPEG12K - b - Poly -[d- Glu ( NHOH ) 3.5 - co - Glu ( NHOH ) 3.5 ]- b - Poly -( Tyr ( OH ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 실시예 57에서 상기에 기재된 방법을 사용하여, mPEG12K-b-Poly-[d-Glu(OBn)3.5-co-Glu(OBn)3.5]-b-Poly-(Tyr(OH)25-co-d-Phe15)-Ac는 4 M 수소화나트륨 용액(2.0 equiv./Bn 에스테르 모이어티)을 사용하여 상기 표제 화합물로 변환되었다. 반응 시간은 16 시간이었다. 세 번의 워크업과 함께, 상기 정상 부피의 IPA 다음에, TBME로 침전시켜, 약간의 아세트산 냄새와 함께 미세한, 옅은 크림색, 고형물로서 상기 표제 화합물(수득률 = 92.7 %)을 수득하였다.
실시예 61
Figure 112014095982417-pct00152
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( OBn ) 5 - co - Glu ( OBn ) 5 )- b - Poly -(d- Tyr ( OBn ) 20 - co -Tyr(OBn) 20 )-Ac의 합성 실시예 58에서 상세하게 기재된 상기 혼합된 반응 용매 방법을 사용하고, 상기 적절한 NCA 빌딩 블록으로 치환하여, 9 부피의 이소프로판올로 침전된 정제되지 않는 중합체를 수득하였다. 여과 및 진공 상에서 건조시킨 후에, 상기 표제 화합물(수득률 = 96.6%)은, 미세한, 무색, 무취 고형물로서 수득되었다. 1H NMR (d6-DMSO) δ 8.44-7.80 (theo. 50H, obs'd. 47H), 7.40-6.75 (theo. 410H, obs'd. 410H ), 5.11-4.84 (theo. 100H, obs'd. 94H), 4.60-4.20 (theo. 50H, obs'd. 52H), 3.70-3.25 (theo. 1087H, obs'd. 1605H), 3.00-2.28 (theo. 80H, obs'd. 95H), 2.03-1.60 (theo. 40H, obs'd. 31H).
실시예 62
Figure 112014095982417-pct00153
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( OBn ) 5 - co - Glu ( OBn ) 5 )- b - Poly -(d- Leu 15 - co - Asp ( OH ) 5 - co -Tyr(OH) 20 )-Ac의 합성 실시예 54의 방법을 사용함으로써, 실온에서 3.5 시간 동안 TFA에서 PMB와 mPEG12K-b-Poly-(d-Glu(OBn)5-co-Glu(OBn)5)-b-Poly-(d-Leu15-co-Asp(OtBu)5-co-Tyr(OBn)20)-Ac의 반응 및 디클로로메탄, TBME: 1,6의 혼합물로부터의 침전은, 미세한, 무색, 무취 중합체로서 상기 표제 화합물(수득률 = 95.5 %)을 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO) δ 9.15 (theo. 20H, obs'd. 18H), 8.43-7.60 (theo. 50H, obs'd. 47H), 7.40-6.45 (theo. 130H, obs'd. 130H), 5.04 (theo. 20H, obs'd. 13H), 4.65-4.00 (theo. 50H, obs'd. 48H), 3.85-3.15 (theo. 1087H, obs'd. 1334H), 3.01-2.10 (theo. 80H, obs'd. 80H), 2.05-1.65 (theo. 40H, obs'd. 42H), 1.63-0.55 (theo. 90H, obs'd. 75H).
실시예 63
Figure 112014095982417-pct00154
mPEG12K - b - Poly -[d- Glu ( NHOH ) 5 - co -Glu( NHOH ) 5 ]- b - Poly -( Tyr ( OH ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 실시예 47에서 상기에 기재된 방법을 사용하여, mPEG12K-b-Poly-[d-Glu(OBn)5-co-Glu(OBn)5]-b-Poly-(Tyr(OH)25-co-d-Phe15)-Ac가 상기 히드록시아민 용액에서 예비-용해된(pre-dissolved) 고형의 수산화칼륨(2.0 equiv./Bn 에스테르 모이어티)을 사용하여 상기 표제 화합물로 변환되었다. 반응 시간은 5.5 시간이었다. 워크업은, 약간 아세트산 냄새를 갖는, 미세한 무색 고형물로서 상기 표제 화합물(수득률 = 74.0 %)을 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO): 실시예 38과 동일함.
실시예 64
Figure 112014095982417-pct00155
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( OBn ) 5 - co - Glu ( OBn ) 5 )- b - Poly -(d- Tyr ( OH ) 20 - co -Tyr(OH) 20 )-Ac의 합성 실시예 54의 방법을 사용함으로써, 실온에서 4.5 시간 동안 TFA에서 PMB와 mPEG12K-b-Poly-(d-Glu(OBn)5-co-Glu(OBn)5)-b-Poly-(d-Tyr(OBn)20-co-Tyr(OBn)20)-Ac의 반응 및 디클로로메탄, TBME: 1,5의 혼합물로부터의 침전은, 미세한, 무색, 무취 고형물로서 상기 표제 생산물(수득률 = 97.7%)을 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO) δ 9.1 (theo. 40H, obs'd. 33H), 8.36-7.77 (theo. 50H, obs'd. 52H), 7.40-6.45 (theo. 210H, obs'd. 234H), 5.04 (theo. 20H, obs'd. 17H), 4.60-4.20 (theo. 50H, obs'd. 50H), 4.02-3.15 (theo. 1087H, obs'd. 1384H, contains obscured water peak), 3.00-2.10 (theo. 80H, obs'd. 78H), 2.06-1.62 (theo. 40H, obs'd. 39H).
실시예 65
Figure 112014095982417-pct00156
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( NHOH ) 5 - co - Glu ( NHOH ) 5 )- b - Poly -(d- Leu 15 - co - Asp ( OH ) 5 -co-Tyr(OH) 20 )-Ac의 합성 실시예 52에서 상기에 기재된 방법을 사용하여, mPEG12K-b-Poly-(d-Glu(OBn)5-co-Glu(OBn)5)-b-Poly-(d-Leu15-co-Asp(OH)5-co-Tyr(OH)20)-Ac는 수산화리튬 모노하이드레이트(2.0 equiv./Bn 에스테르 모이어티)를 사용하여 상기 표제 화합물로 변환되었다. 반응 시간은 15 시간이었다. 워크업한 다음에 IPA로 침전하고, TBME는, 아세트산의 약간의 냄새를 갖는, 미세한, 무색의 고형물로서, 상기 표제 화합물[수득률 = 정량(quantitative)]을 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO) δ 10.2-9.0 (theo. 40H, obs'd. 31H), 8.65-7.75 (theo. 50H, obs'd. 37H), 7.27-6.50 (theo. 80H, obs'd. 80H), 4.61-4.00 (theo. 50H, obs'd. 58H), 3.90-3.15 (theo. 1087H, obs'd. 1356H), 3.02-2.20 (theo. 80H, obs'd. 100H), 2.40-1.70 (theo. 40H, obs'd. ~47H, contains overlapping HOAc peak at δ 1.69), 1.63-0.55 (theo. 105H, obs'd. 96H).
실시예 66
Figure 112014095982417-pct00157
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( NHOH ) 5 - co - Glu ( NHOH ) 5 )- b - Poly -(d- Tyr ( OH ) 20 - co -Tyr(OH) 20 )-Ac의 합성 실시예 52에서 상기에 기재된 방법을 사용하여, mPEG12K-b-Poly-(d-Glu(OBn)5-co-Glu(OBn)5)-b-Poly-(d-Tyr(OH)20-co-Tyr(OH)20)-Ac는, 수산화리튬 모노하이드레이트(2.0 equiv./Bn 에스테르 모이어티)를 사용하여 상기 표제 화합물로 변환되었다. 반응 시간은 5.5 시간이다. 워크업하고 IPA로 침전한 다음에, TBME는 약간의 아세트산 냄새를 갖는, 미세한, 무색 고형물로서 상기 표제 화합물(수득률 = 93.2%)을 수득하였다(Workup followed by precipitation with IPA, TBME afforded the title compound as a fine, colorless solid with a slight odor of acetic acid). 1H NMR (d6-DMSO) δ 9.55 (theo. 40H, obs'd. 26H), 8.45-7.90 (theo. 50H, obs'd. 34H), 7.37-6.51 (theo. 160H, obs'd. 166H), 4.55-4.10 (theo. 50H, obs'd. 50H), 3.80-3.20 (theo. 1087H, obs'd. 1269H, contains obscured water peak), 3.00-2.20 (theo. 80H, obs'd. 108H), 2.18-1.60 (theo. 40H, obs'd. 39H, contains overlapping HOAc peak at δ 1.69).
실시예 67
Figure 112014095982417-pct00158
mPEG12K - b - Poly -[d- Glu ( OBn ) 5 - co -Glu( OBn ) 5 ]- b - Poly -( Tyr ( OH ) 25 - co -d- Phe 15 )-Ac의 합성 실시예 43의 방법을 사용하여, 실온에서 3.5 시간 동안 TFA에서 PMB와 mPEG12K-b-Poly-[d-Glu(OBn)5-co-Glu(OBn)5]-b-Poly-(Tyr(OBn)25-co-d-Phe15)-Ac의 반응은, 디클로로메탄(2 부피)로 용해되고, TBME(5 부피)로부터 침전된, 정제되지 않는 생산물을 수득하였다. 여과 및 진공상의 건조는, 미세한, 무색, 무취 고형물로서 상기 표제 생산물(수득률 = 93.1%)을 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO): 실시예 37과 동일함.
실시예 68
Figure 112014095982417-pct00159
mPEG12K - b - Poly -[d- Glu ( NHOH ) 5 - co -Glu( NHOH ) 5 ]- b - Poly -( Tyr ( OH ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 mPEG12K-b-Poly-[d-Glu(OBn)5-co-Glu(OBn)5]-b-Poly-(Tyr(OH)25-co-d-Phe15)-Ac(38.94 g, 1.90 mmol)는 390 mL의 THF에 용해되었고, 히드록실아민 용액(25.2 mL, 380.0 mmol) 및 4 M 수산화 칼륨 용액(9.5 mL, 38.0 mmol, 2.0 equiv./Bn 에스테르 모이어티)으로 처리되었다. 상기 결과적으로 생성된 혼탁한 옅은 황색 용액은 N2 하에서 5.5 시간 동안 실온에서 교반된 다음에, 아세톤(220.7 g, 3.8 mol, 280 mL)으로 희석되었다. 아세트산(22.82 g, 380.0 mmol, 21.7 mL)이 첨가되었고, 상기 용액은 환류시키기 위해 잠깐 가열된 다음에, 18 시간 동안 실온에서 교반되었다. 상기 용액은 280 mL의 아세톤으로 희석되었고, 상기 생산물은 격렬한 기계적인 교반을 사용하여 TBME (5 L) 및 디에틸 에테르(1 L)의 첨가에 의해 침전되었다. - 25 ℃로 냉각시키고, 추가적인 30 분 동안 교반시킨 후에, 여과 및 진공 상에서 건조시켜, 약간의 아세트산 냄새를 갖는, 미세한, 무색 고형물로서 상기 표제 화합물(35.98 g, 수득률 = 87.3 %)을 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO): 실시예 38과 동일함.
실시예 69
Figure 112014095982417-pct00160
mPEG11K - b - Poly -(d- Glu ( OBn ) 5 - co - Glu ( OBn ) 5 )- b - Poly -(d- Phe 15 - co - Tyr(OBn) 25 )-Ac의 합성 디클로로메탄을 사용하여, m-PEG11k-NH2 (1.10 kg, 100.0 mmol) 및 상기 적절한 NCA 빌딩 블록과 실시예 58에 상세하게 기재된 DMAC 공동-용매 방법(DMAC co-solvent method)은, 8 부피의 이소프로판올으로 침전된 DMAC에서 정제되지 않는 중합체 용액이 수득되었다. 여과한 후에, 상기 정제되지 않는 생산물은, 2 시간 동안 5 부피의 이소프로판올에서 교반되었다. 상기 결과적으로 생성된 고형물은 여과되었고, 신선한 IPA/Et2O, Et2O로 세척되었고, 거의 무색, 무취 고형물로서 2130 g (97.8% 수득률)의 생산물을 수득하기 위해, 밤새 진공 오븐 건조되었다(The resultant solid was filtered, washed with fresh IPA/Et2O, Et2O and then vacuum oven dried overnight to afford 2130 g (97.8% yield) of product as a nearly colorless, odorless solid). 1H-NMR (d6-DMSO) δ 8.45-7.85 (theo. 50H, obs'd. 50H), 7.45-6.60 (theo. 350H, obs'd. 350H), 5.10-4.84 (theo. 70H, obs'd. 68H), 4.65-4.20 (theo. 50H, obs'd. 48H), 3.72-3.25 (theo. 1000H, obs'd. 1120H), 3.05-2.55 (theo. 50H, obs'd. 49H), 2.44-1.60 (theo. 70H, obs'd. 68H).
실시예 70
Figure 112014095982417-pct00161
mPEG12K - b - Poly -[d- Glu ( OBn ) 5 - co -Glu( OBn ) 5 ]- b - Poly -( Tyr ( OH ) 25 - co -d- Phe 15 )-Ac의 합성 실시예 37의 방법을 사용함으로써, 실온에서 3 시간 동안 TFA에서 PMB와 mPEG12K-b-Poly-[d-Glu(OBn)5-co-Glu(OBn)5]-b-Poly-(Tyr(OBn)25-co-d-Phe15)-Ac의 반응 및 디클로로메탄, TBME: 1, 5의 혼합물로부터 침전은, 미세한, 무색, 무취 중합체로서 상기 표제 생산물(수득률 = 92.7%)을 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO) 실시예 37과 동일함.
실시예 71
Figure 112014095982417-pct00162
mPEG12K - b - Poly -[d- Glu ( NHOH ) 5 - co -Glu( NHOH ) 5 ]- b - Poly -( Tyr ( OH ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 실시예 52에 기재된 방법을 사용하여, mPEG12K-b-Poly-[d-Glu(OBn)5-co-Glu(OBn)5]-b-Poly-(Tyr(OH)25-co-d-Phe15)-Ac가, 히드록실아민 용액(5 equiv./에스테르 모이어티) 및 4 M 수소화칼륨 용액(2.0 equiv./Bn ester moiety)를 사용하여 상기 표제 화합물로 변환되었다. 반응 시간은 5.25 시간이었다. 아세톤/아세트산 워크업, IPA, TBME: 1, 2로의 침전, 및 IPA, TBME: 1, 2와 상기 여과 케이크의 추가적인 분쇄 및 진공 건조는, 약간의 아세트산 냄새를 갖는 크림색 고형물로서 상기 표제 화합물(수득률 = 89.9%)을 수득하였다(Acetone/acetic acid workup, precipitation with IPA, TBME: 1, 2 and further trituration of the filter cake with IPA, TBME: 1, 2 and vacuum drying afforded the title compound as a cream-colored solid with a slight odor of acetic acid). 1H NMR (d6-DMSO): 실시예 38과 동일함.
실시예 72
Figure 112014095982417-pct00163
mPEG12K - b - Poly -[d- Glu ( NHOH ) 5 - co -Glu( NHOH ) 5 ]- b - Poly -( Tyr ( OH ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 실시예 71에 기재된 방법을 사용하여, mPEG12K-b-Poly-[d-Glu(OBn)5-co-Glu(OBn)5]-b-Poly-(Tyr(OH)25-co-d-Phe15)-Ac는, 히드록시아민 용액(10 equiv./에스테르 모이어티) 및 4 M 수산화 칼륨 용액(2.0 equiv./Bn 에스테르 모이어티)를 사용하여 상기 표제 화합물로 변환되었다. 반응 시간은 5.5 시간이었다. 아세톤/아세트산 워크업, IPA, TBME: 1, 4로 침전 및 진공 건조는, 약간의 아세트산 냄새를 갖는 미세한, 무색 고형물로서 상기 표제 화합물(수득률 = 82.9%)을 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO): 실시예 38과 동일함.
실시예 73
Figure 112014095982417-pct00164
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( OBn ) 5 - co - Glu ( OBn ) 5 )- b - Poly ( Tyr ( OBn ) 10 - co -d- Phe 20 - co- Asp(oTbu) 10 -Ac의 합성 실시예 3에서의 상기 동일한 방식으로 제조된 mPEG12K-NH2는, 깨끗한 500 mL 둥근 바닥 플라스크 내로 (30g, 2.5 mmol) 중량을 달았고, 톨루엔에 완전하게 용해되었고, 공비증류에 의해 건조되었다. 톨루엔은, 단순한 유리 다리(simple glass bridge)를 통해, 질소로 냉각된 두 번째 500 mL의 둥근 바닥 플라스크 내로 수집되었다. 그 결과로 생성된 고형물은 3 시간 동안 완전하게 건조되었다. 상기 건조된 고형물에, 갓 증류된 N-메틸피롤리딘이 카눌라 및 진공 이동(vacuum transfer)을 통해 첨가되었다. 이러한 혼합물은 상기 NCA의 첨가 전에 완전하게 용해되었다. 실시예 8 및 실시예 9로부터 제조된 바와 같은 상기 NCA는 이에 따라, 깨끗한 두 개의 목 둥근 바닥 플라스크 Glu(oBn) NCA (2.87g) d-Glu(oBn) NCA (2.87g) 내로 중량을 달았고(weighed out), 이러한 고형물이 NMP에서 완전하게 용해되기 전에 1 시간 동안 비워지고, 그리고 난 다음에, 상기 PEG를 함유하는 상기 플라스크 내로 카눌라 삽입되었다. 이러한 중합은 실온에서 교반되었고, 완성되는 것을 보장하기 위해(약 16 hrs), GPC (DMF, .1% LiBr)에 의해 모니터되었다. NCA의 이러한 첫 번째 블록의 중합이 완성된 때에, NCA의 상기 두 번째 첨가는, 첫 번째와 동일한 방식으로 실행되었고, 실시예 7 로부터의 d-Phe(9.5g), 실시예 6으로부터의 Tyr(oBn)(7.4g), 및 실시예 5로부터의 Asp(otBu)(5.38g)로 이루어져 있다. 이는 2 시간 동안 실온에서 중합화되었고, 완성될 때까지(약 24 hrs) 35 ℃로 가열되었다. GPC에 의해 확인된 경우에, N-메틸-모르폴린(2.5 g, 2.7 mL, 25 mmol), DMAP (.3 g, 2.5 mmol), 및 아세트산 무수물(2.5 g, 2.36 mL, 25 mmol)가 상기 반응 용액에 첨가되었고, 밤새 교반되었다. 이러한 반응 혼합물은 자기 교반-막대와 2 리터 비커 내로 부어졌고, 디에틸 에테르는 백색 침전물이 관찰될 때까지 서서히 첨가되었다. 이러한 고형물은 여과되었고, 중간의 다공도 소결된 유리 프리트(medium porosity sintered glass frit) 상에서 세척되었다. 이러한 고형물은 진공 상에서 건조되었고, 1H NMR 및 GPC로 특징화되었다(수득률 = 74.8 %, 40 그램). 1H NMR (d6-DMSO) δ 8.42-7.70 , 7.30, 6.95, 5.10-4.9, 4.65-4.20, 3.77-3.25, 3.05-2.45, 2.44-1.60, 1.38-1.22.
실시예 74
Figure 112014095982417-pct00165
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( OBn ) 5 - co - Glu ( OBn ) 5 )- b -Poly( Tyr 10 - co -d- Phe 20 - co - Asp 10 -Ac의 합성 상기 보호된 트리블록 공-중합체(실시예 73)는 깨끗한 500 mL의 비커 내로 무게를 달았고(30 g, 1.4 mmol), 트리플루오로아세트산에 용해되었다. 펜타메틸벤젠(4 g, 26.98 mmol)은 첨가되었고, 자기 스터-막대(magnetic stir-bar)로 교반되었다. 반응 혼합물은 2 시간 동안 교반되었고, 아스파르테이트 상에서 티로신 및 t-부틸 기에서 벤질 보호기(benzylic protecting groups)의 완전한 제거를 위해 NMR에 의해 모니터되었다. 이러한 탈보호(deprotection)의 완료 후에, 상기 용액은 차가운 디에틸 에테르에서 침전되었다. 이러한 고형물은 중간 소결된 유리 프리트(medium sintered glass frit)에서 여과된 다음에, 염화 메틸렌에서 용해되었고, 차가운 에테르에 또다시 침전되었고 여과되었다. 이러한 고형물(24.7 g, 수득률= 88.4 %)은 진공 상에서 건조되었고, 특징지어진다. 1H NMR (d6-DMSO) δ 9.09, 8.50-7.75, 7.40-6.45, 5.03, 4.70-4.20, 3.91-3.05, 3.03-2.10, 2.09-1.50.
실시예 75
Figure 112014095982417-pct00166
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( oBn ) 5 - co - Glu ( oBn 5 )- b - Poly ( Tyr ( OBn ) 10 - co -d- Leu 20 - co- Asp(oTbu) 10 -Ac의 합성 실시예 73으로부터의 일반적인 프로토콜을 사용하고, 상기 정제되지 않는 중합체를 결과적으로 나타내는 적절한 NCA 출발 물질을 치환하여, 이는 약 10 부피의 디에틸 에테르로 침전되었다. 여과시킨 후에, 상기 표제 화합물(수득률 = 80.2 %)을 건조시켜 무색 고형물로서 수집되었다. 1H NMR (d6-DMSO) δ 8.50-7.75, 7.40-6.6, 5.03, 4.70-4.20, 3.69-3.09, 3.03-2.10, 2.09-1.50, 1.43-1.25, 0.85-0.62.
실시예 76
Figure 112014095982417-pct00167
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( oBn ) 5 - co - Glu ( oBn ) 5 - b - Poly ( Tyr ( OBn ) 10 - co -d- Leu 20 - co- Asp(oTbu) 10 )-Ac의 합성 34 그램의 상기 보호된 트리블록 중합체(실시예 75)는 깨끗한 500 mL 비커 내로 중량을 달았고, 트리플루오로아세트산(500 mL)에 용해되었다. 이러한 용액(4 g, 27 mmol)에 펜타메틸-벤젠이 첨가되었고, 자기 교반-막대로 교반되었다. 펜타메틸-벤젠을 첨가한 후 30 분에, 침전물은 용액에 관찰되었다. 상기 반응 혼합물은 2.5 시간 동안 교반되었고, 아스파르테이트에서 티로신 및 t-부틸 기에서 벤질 보호기의 완전한 제거를 위해 NMR에 의해 모니터되었다. 이러한 탈보호의 완료 후에, 상기 용액은 두꺼운 페이스트(thick paste)로 로토베이프되었고(rotovapped), 염화 메틸렌에 재용해된 다음에, 차가운 디에틸 에테르에 침전되었다. 이러한 고형물은 중간 소결된 유리 프리트에서 여과된 다음에, 염화 메틸렌에 재용해되었고, 차가운 에테르에 다시 침전되었고, 여과되었다. 이러한 고형물은 진공 하에서 건조되었고, 특징지어졌다. 1H NMR (d6-DMSO) δ 9.09, 8.50-7.75, 7.45-6.55, 5.03, 4.65-4.00, 3.69-3.09, 3.03-2.10, 2.09-1.50, 0.85-0.55.
실시예 77
Figure 112014095982417-pct00168
mPEG12K - b -(d- Glu ( NHOH ) 5 - co - Glu ( NHOH )- b - Poly ( Tyr ( OH ) 10 - co -d- Leu 20 - co - Asp 10 )-Ac의 합성 트리블록 에스텔(실시예 76)은 깨끗한 500 mL의 둥근 바닥 플라스크 내로 무게를 달았고(20 g, 0.96 mmol), 200 mL의 테트라히드로푸란이 첨가되었고, 완전하게 용해되었다. 이러한 용액에 30 당량의 히드록실아민(1.9 mL, 28 mmol) 및 0.5 g의 TBD 촉매가 밤새 50 ℃에서 질소 하에서 교반되었다. 완료는 1H NMR에 의해 확인되었다. 이러한 용액은 100 mL 메탄올로 혼합되엇고, 디에틸 에테르(약 7 부피)로 침전되었다. 이러한 백색 고형물은 여과에 의해 수집되었고, 신선한 디에틸 에테르로 세척되었다. 상기 수집된 고형물은 그리고 난 다음에 아세톤에 용해되었고, 아세트산의 촉매량(catalytic amount)은 밤새 교반되었다. 상기 용액은 깨끗한 2 리터 비커 내로 부어졌고, 디에틸 에테르가 교반과 함께 상기 용액에 서서히 첨가되었다. 1H NMR (d6-DMSO) δ 9.4-8.6, 8.51-7.77 , 7.44-7.57, 6.96, 6.56, 4.52-4.00 , 3.75-3.29, 3.03-2.45 , 2.08-1.21, 0.95-0.57.
실시예 78
Figure 112014095982417-pct00169
mPEG12K - b -(d- Glu ( OBn ) 5 - co - Glu ( OBn ) 5 )- b - Poly ( Tyr ( OBn ) 30 - co -d- Phe 10 )- Ac 의 합성 상기 공중합체의 상기 첫 번째 블록은, 실시예 73으로서 동일한 규모 및 절차를 사용하여 제조되었다. NCA의 이러한 첫 번째 블록이 완료된 때에, 실시예 6에서 상기 절차로부터 Tyr(oBn) NCA(22.29 g, 75 mmol)의, 및 d-Phe NCA (4.78 g, 25 mmol)의 NCA의 두 번째 첨가가 실시예 7로서 동일한 방식으로 제조되었다[Upon completion of this first block of NCA a second addition of NCA of d-Phe NCA (4.78 g, 25 mmol) prepared in the same manner as example 7, and of Tyr(oBn) NCA (22.29 g, 75 mmol) from the procedure in example 6]. 이러한 용액은 2 시간 동안 실온에서 중합된 다음에, 완료될 때까지(약 48 hrs) 35 ℃로 가열되었다. GPC에 의해 확인된 때에, N-메틸-모르폴린(2.5 g, 2.7 mL, 25 mmol), DMAP(.3 g, 2.5 mmol), 및 아세트산무수물(2.5 g, 2.36mL, 25 mmol)가 상기 반응 용액에 첨가되었고, 밤새 교반되었다. 이러한 캡핑된 중합체는 실시예 73에서 동일한 방식으로 워크업되었다(worked up). (수득률 = 79.6 %) 약 40 그램. 1H NMR (d6-DMSO) δ 8.46-7.72, 7.44-6.57, 5.10-4.80, 4.62-4.13, 3.74-3.23, 3.03-2.77, 2.62-2.21, 2.02-1.56 (용매 불순물).
실시예 79
Figure 112014095982417-pct00170
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( oBn ) 5 - co - Glu ( oBn ) 5 - b - Poly ( Tyr ( OH ) 30 - co -d- Phe 10 )- Ac 의 합성 상기 보호된 트리블록 공-중합체(실시예 78로부터)가 깨끗한 500 mL 비커 내로 중량을 달았고(34 g, 1.46 mmol), 트리플루오로아세트산(500 mL)에 용해되었다. 이러한 용액(4 g, 27 mmol)에 펜타멘틸-벤젠이 첨가되었고, 자기 교반-막대로 교반되었다. 펜타메틸-벤젠의 첨가 후 30 분에, 침전물이 용액에서 관찰되었다. 상기 반응 혼합물은 2.5 시간 동안 교반되었고, 티로신에서 벤질 보호기의 완전한 제거를 위해, NMR에 의해 모니터되었다. 이러한 탈보호의 완료(3hrs) 후에, 상기 용액은 두꺼운 페이스트로 로토베이프되었고, 염화 메틸렌에 재용해되었고, 그 다음에 차가운 디에틸 에테르에 침전되었다. 이러한 고형물은 중간 소결된 유리 프리트에서 여과된 다음에, 염화 메틸렌에 재-용해되었고, 차가운 에테르에 또 다시 침전되었고, 여과되었다. 이러한 고형물은 진공 상에서 건조되었고, 특징지어졌다. 1H NMR (d6-DMSO) δ 9.10, 8.38-7.77, 7.39-6.73, 6.59, 5.03, 4.64-3.79, 3.71-3.30, 2.98-2.56, 2.02-1.62.
실시예 80
Figure 112014095982417-pct00171
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( NHOH ) 5 - co - Glu ( NHOH ) 5 )- b - Poly ( Tyr ( OH ) 30 - co -d-Phe 10 )-Ac의 합성 20 g의 트리블록 에스테르(실시예 79로부터)는 깨끗한 500 mL의 둥근 바닥 플라스크 내로 중량을 달았고, 200 mL의 테트라히드로푸란이 첨가되었고, 완전하게 용해되었다. 이러한 용액에, 10 당량의 히드록실아민, 및 1,5,7-트리아자비시클로[4.4.0]dec-5-ene (TBD, .5g, 3.5 mmol)는, 실온에서 질소 하에서 교반되었다. 완성은 1H NMR (48 Hrs)에 의해 확인되었다. 이러한 용액은 100 mL의 메탄올과 혼합되었고, 이러한 용액은 깨끗한 2 리터 비커 내로 부어졌다. 메틸tert부틸 에테르(Methyltertbutyl ether)(약 5 부피)가 교반과 함께 상기 용액에 서서히 첨가되었다. 상기 결과적으로 생성된 백색 고형물은 중간 프리트 상에서 수집된 다음에, 진공 상에서 건조되었다. (17.34 g, 수득률 = 90%). 1H NMR (d6-DMSO) δ 9.10-8.65, 8.39-7.78, 7.28-6.75, 6.80, 6.59, 4.59-4.31, 3.75-3.13, 3.00-2.57, 2.16-1.57.
실시예 81
Figure 112014095982417-pct00172
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( OBn ) 1.5 - co - Glu ( OBn ) 1.5 )- b -Poly( Tyr ( OBn ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 실시예 3으로서 상기 동일한 방식으로 제조된 mPEG12KNH2 (25 g, 2.08 mm)는, 깨끗한, 오븐 건조된, 1000 mL, 두 개의 목, 둥근 바닥 플라스크 내로 중량을 달았고, 가열과 함께 톨루엔(300 mL)에 용해되었고, 공비증류에 의해 건조되었다. 건조시키기 위해 증류한 후에, 상기 중합체는 3 시간 동안 진공 하에 두었다. 상기 플라스크는 N2 로 다음에 다시 채워졌고, 환산 압력 하에서 다시 비워지고, 건조 N-메틸피롤리돈(NMP)(250 mL)가 카눌라에 의해 도입되었다. 상기 혼합물은 용해를 신속하게 처리하기 위해 40 ℃로 잠시 가열된 다음에 25 ℃로 냉각되었다. Glu(OBn) NCA (.82 g, 3.1 mmol)는 실시예 8로서의 동일한 방식으로 제조되었고, 실시예 9로부터 d-Glu(OBn) NCA (.82 g, 3.1 mmol)가 상기 플라스크에 직접적으로 첨가되었고, 상기 반응 혼합물은 질소 가스 하에서 실온에서 18 시간 동안 교반시켰다. 그리고 난 다음에, 실시예 7로부터의 d-Phe NCA (5.97 g, 31.25 mmol), 및 Tyr(OBn) NCA (15.49 g, 52.08 mmol)가 실시예 6으로부터 제조되었고, 상기 용액에 첨가된 다음에, 2 시간 동안 교반되었고, 상기 반응이 완료된 시점(GPC, DMF/0.1% LiBr)에 48 시간 동안 35 ℃으로 가열되었다. 상기 용액은 실온으로 냉각되었고, 무수 아세트산(2.04 g, 20 mmol, 1.88 mL), N-메틸모르폴린(NMM)(2.23 g, 22 mmol, 2.47 mL) 및 디메틸아미노피리딘(DMAP)(.24 g, 2.0 mmole)이 첨가되었다. 교반시키는 것은 실온에서 1 일 동안 유지되었다. 상기 중합체는 디에틸 에테르:헵탄 10:1 (2.5 L) 내로 침전되었고, 여과에 의해 분리되었고, 디에틸에테르의 신선한 100 mL 일부로 세척되고, 진공 상에서 건조시켜, 미세한, 황백색의 분말로서 상기 블록 공중합체(39.81 g, 수득률 = 90.3%)가 수득되었다. 1H NMR (d6-DMSO) δ 9.26-9.04, 8.36-7.75, 7.41-7.25, 6.97, 6.60, 5.04, 4.59-4.13, 3.81-3.13, 2.96-2.76, 2.75-2.57, 2.43-2.12, 2.00-1.45.
실시예 82
Figure 112014095982417-pct00173
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( OBn ) 1.5 - co - Glu ( OBn ) 1.5 )- b - Poly ( Tyr ( OH ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 실시예 81로부터의 상기 중합체는, 화학량론(stoichometry)으로 조절된 실시예 74로부터의의 상기 일반적인 방법을 사용하여 탈보호되었다. 완료된 때(3 hrs)에, 상기 용액은 두꺼운 페이스트로 로토베이프되었고, 그 다음에 디클로로메탄에서 재용해되었고, 차가운 디에틸 에테르에서 침전되었고, 여과에 의해 수집되고, 진공 상에서 건조되었다. 이러한 반응으로 22 g의 건조 물질이 수득되었다(수득률 = 76.92 %). 1H NMR (d6-DMSO) δ 9.09, 8.50-7.75, 7.35-6.45, 5.04, 4.70-4.20, 3.91-3.05, 3.03-2.10, 2.09-1.50.
실시예 83
Figure 112014095982417-pct00174
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( NHOH ) 1.5 - co - Glu ( NHOH ) 1.5 )- b - Poly ( Tyr ( OH ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 실시예 82로부터의 상기 중합체(13.2g, 0.705 mmol)는, 가열과 함께, 160 mL의 THF에서 완전하게 용해되었고, 이러한 용액은, 1,5,7-트리아자비시클로 [4.4.0]dec-5-ene (TBD, 0.3 g, 2.2 mmol)가 첨가되기 전에 실온으로 냉각되었고, 그 다음에 히드록실아민(50 % 수용액, 25 mL, 378 mmol)을 첨가하였고, 이러한 용액은 24 시간 동안 실온에서 교반되었다. 메탄올(80 mL)은 첨가되었고, 메틸tert부틸 에테르로 침전되었고, 여과에 의해 수집되었고, 아세톤에서 용해되었다. 아세트산은 상기 아세톤 용액에 첨가되었고, 5 시간 동안 교반되었다. 상기 용액은 거의 건조될 때까지 증발되었고, 염화 메틸렌에 재용해되었고, MTBE에서 침전되고, 여과에 의해 수집되고, 진공 상에서 건조되었다(12.1 g, 수득률= 92.8%). 1H NMR (d6-DMSO) δ 9.11, 8.34-7.75, 7.37-7.05, 6.92, 6.58 4.60-4.32, 3.81-3.12, 2.99-2.57, 2.49-2.32, 2.10-1.73.
실시예 84
Figure 112014095982417-pct00175
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( OBn ) 2.5 - co - Glu ( OBn ) 2.5 )- b -Poly( Tyr ( OBn ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 실시예 3으로부터 동일한 방법으로부터 제조된 mPEG12KNH2(25 g, 2.08 mm) 은 깨끗한, 오븐 건조된, 1000 mL, 두 개의 목, 둥근 바닥 플라스크 내로 중량을 달았고, 가열과 함께 톨루엔(300 mL)에서 용해되었고, 공비 증류에 의해 건조되었다. 건조시키기 위해 증류한 후에, 상기 중합체는 3 시간 동안 진공 하에서 두었다. 상기 플라스크는 N2로 그 다음에 다시 채워졌고, 환산 압력 하에서 다시 비워졌고, 건조 N-메틸피롤리돈(NMP) (250 mL)은 카눌라에 의해 도입되었다. 상기 혼합물은 용해를 신속하게 처리하기 위해 40 ℃로 가열되었고, 그 다음에 25 ℃로 냉각되었다. Glu(OBn) NCA (1.37 g, 5.2 mmol) 및 d-Glu(OBn) NCA (1.37 g, 5.2 mmol)은 상기 플라스크에 첨가되었고, 상기 반응 혼합물은 질소 가스 하에 실온에서 18 시간 동안 교반시켰다. NCA의 첫 번째 블록을 완료시킨 후에, d-Phe NCA (5.97 g, 31.25 mmol)는 실시예 79로서 동일한 방식으로 제조되었고, 실시예 6 으로부터의 Tyr (OBn) NCA (15.49 g, 52.08 mmol)가 첨가되었고, 상기 용액은, 상기 반응이 완료된 시점(GPC, DMF/0.1% LiBr)에, 48 시간 동안 35 ℃에서 2 시간 동안 실온에서 교반되었다. 상기 용액은 실온으로 냉각되었고, 아세트산 무수물(2.04 g, 20 mmol, 1.88 mL), N-메틸모르폴린(NMM)(2.23 g, 22 mmol, 2.47 mL) 및 디메틸아미노피리딘(DMAP)(.24 g, 2.0 mmole)이 첨가되었다. 교반시키는 것은 실온에서 1 일 동안 유지되었다. 상기 중합체는 디에틸 에테르:헵탄 10:1 (2.5 L) 내로 제조되었고, 여과에 의해 분리되었고, 디에틸 에테르의 신선한 100 mL 일부로 세척되었고, 진공 상에서 건조시켜, 미세한, 황백색 분말로서 상기 블록 공중합체(36 g, 수득률 = 80 %)를 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO) δ 9.10 8.37-7.83, 7.39-7.21, 6.95, 6.56, 5.02, 4.61-4.34, 4.32-4.20,3.71-3.25, 2.94-2.59 , 2.40-2.10, 1.96-1.45.
실시예 85
Figure 112014095982417-pct00176
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( OBn ) 2.5 - co - Glu ( OBn ) 2.5 )- b -Poly( Tyr ( OH ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 실시예 74로부터의 상기 일반적인 방법을 사용하고, 화학량론을 조절하여, 실시예 84로부터의 상기 중합체가 탈보호되었다(32 g, 1.65 mmol). 완료한 때(3 Hrs.)에, 상기 용액은 두꺼운 페이스트로 로토베이프되었고, 그 다음에 DCM에서 재용해되었고, 차가운 디에틸 에테르에서 침전되었고, 여과에 의해 수집되었고, 진공 상에서 건조되었다. 이러한 반응으로 27 g의 건조 물질(94.2 %)을 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO) δ 9.09, 8.50-7.75, 7.35-6.45, 5.04, 4.70-4.20, 3.91-3.05, 3.03-2.10, 2.09-1.50.
실시예 86
Figure 112014095982417-pct00177
mPEG12K - b - Poly-(d- Glu ( NHOH ) 2.5 - co - Glu ( NHOH ) 2.5 )- b -Poly( Tyr ( OH ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 실시예 85로부터의 중합체(20 g, 1 mmol)는 가열과 함께 160 mL의 THF에서 완전하게 용해되었고, 이러한 용액은 1,5,7-트리아자비시클로 [4.4.0]dec-5-ene (TBD, .5 g, 3.6 mmol), 그 다음에 히드록실아민(50 % 수용액, 30 mL, 545 mmol)이 첨가되기 전에, 실온으로 냉각되었고, 이러한 용액은 24 시간 동안 실온에서 교반되었다. 메탄올(80 mL)은 첨가되었고, 그 다음에 메틸tert부틸 에테르로 침전되었고, 여과에 의해 수집되었고, 아세톤에서 용해되었다. 아세트산은 상기 아세톤 용액에 첨가되었고, 5 시간 동안 교반된 다음에, 이러한 용액은 거의 건조될 때까지 로토베이프되었고, 메틸렌클로라이드에서 재용해되었고, MTBE에서 침전되었고, 여과에 의해 수집되었고, 진공 상에서 건조되었다(18 g, 수득률 = 91.7%). 1H NMR (d6-DMSO) δ 9.11, 8.34-7.75, 7.15, 6.80, 4.60-4.32, 3.81-3.12, 2.99-2.32, 1.93-1.83).
실시예 87
Figure 112014095982417-pct00178
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( OBn ) 3.5 - co - Glu ( OBn ) 3.5 )- b -Poly( Tyr ( OBn ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 실시예 3 으로서 동일한 방식으로 제조된 mPEG12KNH2(25 g , 2.08 mm)는, 깨끗한, 오븐 건조된, 1000 mL, 두 개의 목, 둥근 바닥 플라스크 내로 중량을 달았고, 톨루엔(300 mL)에서 용해되었다. 이러한 중합체는 실시예 1 로서 동일한 방식으로 제조되었다. 실시예 8로부터의 Glu(OBn) NCA (1.92 g, 7.3 mmol) 및 실시예 9로부터의 d-Glu(OBn) NCA (1.92 g, 7.3 mmol)가 상기 플라스크에 첨가되었고, 상기 반응 혼합물은, 질소 가스 하에서 주위 실온에서 18 시간 동안 교반시켰다. 그리고 난 다음에, 실시예 7로부터의 d-Phe NCA (5.97 g, 31.25 mmol) 및 실시예 6 으로서 동일한 방식으로 제조된 Tyr (OBn) NCA (15.49 g, 52.08 mmol)가 첨가되었고, 상기 용액은 2 시간 동안 실온에서 교반되었고, 그리고 난 다음에 상기 반응이 완료된 시점(GPC, DMF/0.1% LiBr)에 48 시간 동안 35 ℃로 가열되었다. 상기 용액은 실온으로 냉각되었고, 아세트산 무수물(2.04 g, 20 mmol, 1.88 mL), N-메틸모르폴린(NMM) (2.23 g, 22 mmol, 2.47 mL) 및 디메틸아미노피리딘(DMAP)(.24 g, 2.0 mmole)가 첨가되었다. 교반시키는 것은 실온에서 1 일 동안 지속되었다. 상기 중합체는 디에틸 에테르:헵탄 10:1 (2.5 L) 내로 침전되었고, 여과에 의해 분리되었고, 디에틸 에테르의 신선한 100 mL의 일부로 세척되었고, 진공 상에서 건조되어, 미세한, 거의 무색의 분말로서 상기 블록 공중합체를 수득하였다(37.0 g, 수득률 = 80.6 %). 1H NMR (d6-DMSO) δ 9.08 8.42-7.70, 7.29, 6.96, 6.58, 5.10-4.85, 4.65-4.20, 3.71-3.25, 2.94-2.59, 2.40-2.10, 1.97-1.50.
실시예 88
Figure 112014095982417-pct00179
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( OBn ) 3.5 - co - Glu ( OBn ) 3.5 )- b -Poly( Tyr ( OH ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 실시예 87로부터의 상기 중합체는, 화학량론을 조절하여(32 g, 1.61 mmol) 실시예 74로부터의 일반적인 방법을 사용하여 탈보호되었다. 완료된 때(3 Hrs.)에, 상기 용액은 두꺼운 페이스트로 로토베이프되었고, DCM에서 재용해되었고, 차가운 디에틸 에테르에서 침전되었고, 여과에 의해 수집되었고, 진공 상에서 건조되었다. 이러한 반응은 23 g의 건조 물질(80 %)을 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO) δ9.09 , 8.50-7.75, 7.35-6.45, 5.04, 4.70-4.20, 3.91-3.05, 3.03-2.10, 2.09-1.50.
실시예 89
Figure 112014095982417-pct00180
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( NHOH ) 3.5 - co - Glu ( NHOH ) 3.5 )- b - Poly ( Tyr ( OH ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 실시예 88로부터의 상기 중합체(20 g, 1 mmol)는 가열과 함께 160 mL의 THF에서 완전하게 용해되었고, 이러한 용액은, 1,5,7-트리아자비사이클로 [4.4.0]dec-5-ene (TBD, .5 g, 3.6 mmol), 그 다음에 히드록실아민(50 % 수용액, 30 mL, 545 mmol)이 첨가되기 전에, 실온으로 냉각되고, 이러한 용액은 24 시간 동안 실온에서 교반되었다. 메탄올(80 mL)은 첨가되었고, 그 다음에 메틸tert부틸 에테르로 침전되었고, 여과에 의해 수집되었고, 아세톤에서 용해되었다. 아세트산은 상기 아세톤 용액에 첨가되었고, 밤새 교반되었다. 상기 용액은 거의 건조될 때까지 로토베이프되었고(rotovapped), 염화 메틸렌에 재용해되었고, MTBE에서 침전되었고, 여과에 의해 수집되었고, 진공 상에서 건조되었다(18.1 g, 수득률 = 92.9%). 1H NMR (d6-DMSO) δ 9.11, 8.34-7.75, 7.15, 6.80, 4.60-4.32, 3.81-3.12, 2.99-2.32, 1.93-1.83.
실시예 90
Figure 112014095982417-pct00181
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( OBn ) 5 - co - Glu ( OBn ) 5 )- b - Poly ( Tyr ( OBn ) 25 - co -d- Phe 15 )-Ac의 합성 실시예 3으로서 상기 동일한 방법에 의해 제조된 mPEG12KNH2는, 깨끗한, 오븐 건조된, 1000 mL, 두 개의 목, 둥근 바닥 플라스크 내로 중량을 달았고(25 g , 2.08 mm), 톨루엔(300mL)에 용해되었다. 이러한 중합체는 실시예 73으로서 동일한 방식으로 제조되었다. 그리고 난 다음에, 실시예 8로서 상기 동일한 방식으로 제조된 Glu(OBn) NCA (2.74 g, 10.4 mmol), 및 실시예 9로서 상기 동일한 방식으로 제조된 d-Glu(OBn) NCA (2.74 g, 10.4 mmol)는, 상기 플라스크에 첨가되었고, 상기 반응 혼합물은 질소 가스 하에서 주위 실온에서 18 시간 동안 교반되었다. 그리고 난 다음에, 실시예 7로부터의 d-Phe NCA (5.97 g, 31.25 mmol) 및 실시예 6 에서 방법으로부터 제조된 Tyr (OBn) NCA (15.49 g, 52.08 mmol)가 첨가되고, 상기 용액은 2 시간 동안 실온에서 교반시킨 다음에, 상기 반응이 완료된 시점(GPC, DMF/0.1% LiBr)에 48 시간 동안 35 ℃로 가열되었다. 상기 용액은 실온으로 냉각되었고, 아세트산 무수물(2.04 g, 20 mmol, 1.88 mL), N-메틸모르폴린(NMM)(2.23 g, 22 mmol, 2.47 mL) 및 디메틸아미노피리딘(DMAP)(.24 g, 2.0 mmole)가 첨가되었다. 교반시키는 것은 실온에서 1 일 동안 유지되었다. 상기 중합체는 디에틸 에테르:헵탄 10:1 (2.5 L) 내로 침전되었고, 여과에 의해 분리되었고, 디에틸 에테르의 신선한 100 mL 일부로 세척되었고, 진공 상에서 건조되어, 미세한, 거의 무색 분말로서 상기 블록 공중합체를 수득하였다(38.48 g, 수득률 = 81.4 %). 1H NMR (d6-DMSO) δ 9.08 8.42-7.70, 7.29, 6.97, 5.11-4.84, 4.65-4.20, 3.72-3.25, 3.05-2.45, 2.44-1.59.
실시예 91
Figure 112014095982417-pct00182
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( OBn ) 5 - co - Glu ( OBn ) 5 )- b - Poly ( Tyr ( OH ) 25 - co -d- Phe 15 )-Ac의 합성 단지 화학량론을 조절하여 실시예 74로부터의 일반적인 방법을 사용하여, 상기 중합체(32 g, 1.56 mmol)는 탈보호되었다. 완료된 때(3 Hrs.)에, 상기 용액은 두꺼운 페이스트로 로토베이프되었고, DCM에서 재용해되었고, 차가운 디에틸 에테르에서 침전되었고, 여과에 의해 수집되었고, 진공 상에서 건조되었다. 이러한 반응은 27 g의 건조 물질(93.6 %)을 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO) δ9.09 , 8.50-7.75, 7.35-6.45, 5.04, 4.70-4.20, 3.91-3.05, 3.03-2.10, 2.09-1.50.
실시예 92
Figure 112014095982417-pct00183
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( NHOH ) 3.5 - co - Glu ( NHOH ) 3.5 )- b - Poly ( Tyr ( OH ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 실시예 91로부터의 상기 중합체(18 g, .88 mmol)는 가열과 함께 160 mL의 THF에서 완전하게 용해되었고, 이러한 용액은, 1,5,7-트리아자비시클로 [4.4.0]dec-5-ene (TBD, 0.5 g, 3.6 mmol)가 첨가되기 전에 실온에서 냉각되었고, 그 다음에 히드록실아민(50 % 수용액, 30 mL, 545 mmol)이 첨가되었고, 이러한 용액은 24 시간 동안 실온에서 교반되었다(this solution was allowed to cool to room temp before 1,5,7-triazabicyclo [4.4.0]dec-5-ene was added, followed by Hydroxylamine this solution was stirred at room temperature for 24 hours). 메탄올(80 mL)이 첨가되었고, 그 다음에 메틸tert부틸 에테르로 침전되었고, 여과에 의해 수집되었고, 아세톤에서 용해되었다. 아세트산은 상기 아세톤 용액에 첨가되었고 5 시간 동안 교반되었고 그리고 난 다음에 워크업 되었다. 상기 용액은 거의 건조될 때까지 로토베이프되었고, 염화 메틸렌에서 재용해되었고, MTBE에서 침전되었고, 여과에 의해 수집되었고, 진공 상에서 건조되었다(16.7 g, 수득률 = 96.3%).
실시예 93
Figure 112014095982417-pct00184
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( OBn ) 7.5 - co - Glu ( OBn ) 7.5 )- b - Poly ( Tyr ( OBn ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 실시예 3 으로서 동일한 방식으로 제조된 mPEG12KNH2(25 g, 2.08 mm)는, 깨끗한, 오븐 건조된, 1000 mL, 두 개의 목, 둥근 바닥 플라스크 내로 중량을 달았고, 톨루엔(300 mL)에서 용해되었다. 이러한 중합체는 실시예 1로서 상기 동일한 방식으로 제조되었다. 실시예 8로서 동일한 방식으로 제조된 Glu(OBn) NCA (2.74 g, 10.4 mmol) 및 실시예 9로부터의 d-Glu(OBn) NCA (2.74 g, 10.4 mmol)는 상기 플라스크에 첨가되었고, 상기 반응 혼합물은 질소 가스 하에서 실온에서 18 시간 동안 교반시켰다. 그리고 난 다음에, 실시예 7로부터의 d-Phe NCA (5.97 g, 31.25 mmol) 및 실시예 6으로부터의 Tyr (OBn) NCA (15.49 g, 52.08 mmol)가 첨가되었고, 상기 용액은 2 시간 동안 실온에서 교반된 다음에, 상기 반응이 완료되는 시점(GPC, DMF/0.1% LiBr)에 48 시간 동안 35 ℃로 가열되었다. 상기 용액은 실온으로 냉각되었고, 아세트산 무수물(2.04 g, 20 mmol, 1.88 mL), N-메틸모르폴린(NMM)(2.23 g, 22 mmol, 2.47 mL) 및 디메틸아미노피리딘(DMAP)(.24 g, 2.0 mmole)이 첨가되었다. 교반시키는 것은 실온에서 밤새 지속되었다. 상기 중합체는 디에틸 에테르:헵탄 10:1 (2.5 L) 내로 침전되었고, 여과에 의해 분리되었고, 디에틸 에테르의 신선한 100 mL 일부로 세척되었고, 진공 상에서 건조시켜, 거의 무색 분말로서 상기 블록 공중합체(37.0 g, 수득률 = 74.66 %)를 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO) δ 9.10 8.42-7.71, 7.27, 6.97, 5.11-4.85, 4.65-4.20, 3.72-3.25, 3.05-2.45, 2.45-1.60.
실시예 94
Figure 112014095982417-pct00185
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( OBn ) 7.5 - co - Glu ( OBn ) 7.5 )- b - Poly ( Tyr ( OH ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 단지 화학량론을 조절하여, 실시예 74로부터의 상기 일반적인 방법을 사용하여, 상기 중합체는 탈보호되었다(32 g, 1.48 mmol). 완료한 후(3 Hrs.)에, 상기 용액은 두꺼운 페이스트로 로토베이프되었고, 그 다음에 DCM에서 재용해되었고, 차가운 디에틸 에테르에서 침전되었고, 여과에 의해 수집되었고, 진공 상에서 건조되었다. 이러한 반응은 24 g의 건조 물질로 수득되었다(82.8 %). 1H NMR (d6-DMSO) δ 9.09, 8.50-7.75, 7.35-6.45, 5.04, 4.70-4.20, 3.91-3.05, 3.03-2.10, 2.09-1.50.
실시예 95
Figure 112014095982417-pct00186
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( NHOH ) 3.5 - co - Glu ( NHOH ) 3.5 )- b - Poly ( Tyr ( OH ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 실시예 94 에서 제조된 상기 중합체(19 g,.88 mmol)는 가열하면서 160 mL의 THF에서 완전하게 용해되었고, 이러한 용액은 1,5,7-트리아자비시클로 [4.4.0]dec-5-ene (TBD, .5 g, 3.6 mmol)가 첨가되기 전에, 실온으로 냉각되었고, 그 다음에 히드록실아민(50 % 수용액, 30 mL, 545 mmol)가 첨가되었고, 상기 용액은 24 시간 동안 실온에서 교반되었다. 메탄올(80 mL)은 첨가되었고, 그 다음에 메틸tert부틸 에테르로 침전되었고, 여과에 의해 수집되었고, 아세톤에서 용해되었다. 아세트산은 이러한 아세톤 용액에 첨가되었고, 5 시간 동안 교반되었다. 상기 용액은 거의 건조될 때까지 로토베이프되었고(rotovapped), 염화 메틸렌에 재용해되었고, MTBE에서 침전되었고, 여과에 의해 수집되었고, 진공 상에서 건조되었다(16.4 g, 수득률 = 91.1%). 1H NMR (d6-DMSO) δ 9.11, 8.34-7.75, 7.15, 6.80, 4.60-4.32, 3.81-3.12, 2.99-2.32, 1.93-1.83.
실시예 96
Figure 112014095982417-pct00187
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( OBn ) 10 - co - Glu ( OBn ) 10 )- b - Poly ( Tyr ( OBn ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 실시예 3 으로서 상기 동일한 방식으로 제조된 mPEG12KNH2 (25g, 2.08 mm)는, 깨끗한, 오븐 건조된, 1 L, 두 개의 목, 둥근 바닥 플라스크 내로 중량을 달았고, 톨루엔(300 mL)에서 용해되었다. 이러한 중합체는 실시예 1로서 상기 동일한 방식으로 제조되었다. 실시예 8로서 상기 동일한 방식으로 제조된 Glu(OBn) NCA (5.48 g, 20.8 mmol), 및 실시예 9에서 방법에 의해 제조된 d-Glu(OBn) NCA (5.48 g, 20.8 mmol)는 상기 플라스크에 직접적으로 첨가되었고, 상기 반응 혼합물은 질소 가스 하에서 주위 실온에서 16 시간 동안 교반시켰다. 그리고 난 다음에, 실시예 7로부터의 d-Phe NCA (5.97 g, 31.25 mmol) 및 실시예 6으로부터의 Tyr (OBn) NCA (15.49 g, 52.08 mmol)가 상기 용액에 첨가되었고, 2 시간 동인 실온에서 교반되었고, 그리고 난 다음에 상기 반응이 완료된 시점(GPC, DMF/0.1% LiBr)에, 48 시간 동인 35 ℃로 가열되었다. 상기 용액은 실온으로 냉각되었고, 아세트산 무수물(2.04 g, 20 mmol, 1.88 mL), N-메틸모르폴린(NMM)(2.23 g, 22 mmol, 2.47 mL) 및 디메틸아미노피리딘(DMAP)(.24 g, 2.0 mmole)가 첨가되었다. 교반시키는 것은 실온에서 1 일 동안 유지되었다. 상기 중합체는 디에틸 에테르:헵탄 10:1 (2.5 L) 내로 침전되었고, 여과에 의해 분리되었고, 디에틸 에테르의 신선한 100 mL 일부로 세척되었고, 진공 상에서 건조시켜, 미세한, 거의 무색 분말로서 상기 블록 공중합체를 수득하였다(38.9 g, 수득률 = 75.23 %). 1H NMR (d6-DMSO) δ 9.08, 8.40-7.65, 7.35-7.25, 6.99, 6.76, 5.10-4.85, 4.65-4.20, 3.72-3.25, 3.06-2.45, 2.34-1.59.
실시예 97
Figure 112014095982417-pct00188
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( OBn ) 10 - co - Glu ( OBn ) 10 )- b - Poly ( Tyr ( OH ) 25 - co -d- Phe 15 )-Ac의 합성 화학량론 만을 조절하여 실시예 74로부터의 일반적인 방법을 사용하여, 상기 중합체는 탈보호되었다(32 g, 1.41 mmol). 완료된 시점(3 Hrs.)에, 상기 용액은 두꺼운 페이스트로 로토베이프되었고(rotovapped), 여과에 의해 수집되었고, 진공 상에서 건조되었다. 이러한 반응은 27 g의 건조 물질(92.8 %)로서 수득되었다. 1H NMR (d6-DMSO) δ 9.09, 8.50-7.75, 7.35-6.45, 5.04, 4.70-4.20, 3.91-3.05, 3.03-2.10, 2.09-1.50.
실시예 98
Figure 112014095982417-pct00189
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( NHOH ) 10 - co - Glu ( NHOH ) 10 )- b - Poly ( Tyr ( OH ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 실시예 98로부터의 상기 중합체(20 g, 0.88 mmol)는 가열하면서 160 mL의 THF에서 완전하게 용해되었고, 이러한 용액은, 1,5,7-트리아자비사이클로 [4.4.0]dec-5-ene (TBD, .5 g, 3.6 mmol)가 첨가되기 전에, 실온으로 냉각되었고, 그 다음에 히드록실아민(50 % 수용액, 30 mL, 545 mmol)가 첨가되고, 이러한 용액은 24 시간 동안 실온에서 교반되었다. 메탄올(80 mL)은 첨가되었고, 그 다음에 메틸tert부틸 에테르로 침전되었고, 여과에 의해 수집되었고, 아세톤에서 용해되었다. 아세트산은 이러한 아세톤 용액에 첨가되었고, 5 시간 동안 교반되었고, 그 다음에 워크업되었다. 상기 용액은 거의 건조될 때까지 로토베이프되었고, 메틸렌클로라이드에서 재용해되었고, MTBE에서 침전되었고, 여과에 의해 수집되었고, 진공 상에서 건조되었다(17.2 g, 수득률 = 92.1 %). 1H NMR (d6-DMSO) δ 9.11, 8.33-7.69, 7.15, 6.98, 6.79, 5.06-4.85, 4.60-4.32, 3.81-3.19, 2.99-2.32, 2.03-1.59.
실시예 99
Figure 112014095982417-pct00190
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( OBn ) 3.5 - co - Glu ( OBn ) 3.5 )- b - Poly ( Tyr ( OBn ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 실시예 3 에 기재된 상기 동일한 방법으로 제조된 mPEG12KNH2 (45.34 g , 3.78 mmol)가, 깨끗한, 오븐 건조된, 1000 mL, 두 개의 목, 둥근 바닥 플라스크 내로 중량을 달았고, 톨루엔(300 mL)으로 용해되었다. 상기 중합체는 실시예 73으로서 상기 동일한 방식으로 제조되었다. 실시예 8에 상세하게 기재된 방법으로부터 Glu(OBn) NCA (3.5 g, 13.29 mmol) 및 실시예 9에 상세하게 기재된 방법으로부터 d-Glu(OBn) NCA (3.5 g, 13.29 mmol)는, 상기 플라스크에 첨가되었고, 상기 반응 혼합물은, 질소 가스 하에서 주위 실온에서 16 시간 동안 교반시켰다. 그리고 난 다음에, 실시예 7로부터 상세하게 기재된 상기 방법으로부터 d-Phe NCA (10.89 g, 56.9 mmol), 및 실시예 6으로부터 상세하게 기재된 방법으로부터 Tyr (OBn) NCA (28.24 g, 94.98 mmol)가 첨가되었고, 상기 용액은 상기 반응이 완료되는 시점(GPC, DMF/0.1% LiBr)에 48 시간 동안 35 ℃에서 교반되었다. 상기 용액은 실온으로 냉각되었고, 아세트산 무수물(3.88 g, 37.8 mmol, 3.58 mL), N-메틸모르폴린(NMM)(3.76 g, 37.8 mmol, 4.16 mL) 및 디메틸아미노피리딘(DMAP) (0.47 g, 3.8 mmole)가 첨가되었다. 교반시키는 것은 실온에서 1 일 동안 유지되었다. 상기 중합체는 디에틸 에테르:헵탄 10:1 (2.5 L) 내로 침전되었고, 여과에 의해 분리되었고, 디에틸 에테르의 신선한 100 mL 일부로 세척되었고, 진공 상에서 건조되어, 미세한, 거의 무색 분말로서 상기 블록 공중합체를 수득하였다(68.22 g, 수득률 = 82.2 %). 1H NMR (d6-DMSO) δ 8.43-7.84, 7.30, 6.98, 6.97-6.65, 5.04, 4.98-4.80, 4.66-4.16, 3.72-3.21, 3.01-2.76, 2.74-2.56, 2.41-2.26, 2.23-2.10, 2.01-1.58.
실시예 100
Figure 112014095982417-pct00191
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( OBn ) 3.5 - co - Glu ( OBn ) 3.5 )- b - Poly ( Tyr ( OH ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 단지 화학량론만을 조절하여, 실시예 74로부터의 일반적인 방법을 사용하여, 이러한 중합체는 탈보호되었다(60 g, 2.73 mmol). 완성된 때(5 Hrs.)에, 상기 용액은 두꺼운 페이스트로 로토베이트프되었고(rotovapped), 그 다음에 DCM에서 재용해되었고, 차가운 디에틸 에테르에서 침전되고, 여과에 의해 수집되고, 차가운 디에틸 에테르의 신선한 200 mL 일부로 몇 번 세척하고, 진공 상에서 건조되었다. 이러한 반응은 43.8 g의 건조 물질(81.4 %)을 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO) δ 9.04, 8.38-7.73, 7.38-6.73, 5.04, 4.62-4.19, 3.82-3.27, 3.02-2.76, 2.75-2.56, 2.42-2.26, 2.20-1.61, 1.08 (용매, 에테르).
실시예 101
Figure 112014095982417-pct00192
mPEG12K - b - Poly -(d- Glu ( NHOH ) 3.5 - co - Glu ( NHOH ) 3.5 )- b - Poly ( Tyr ( OH ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 실시예 100으로부터의 상기 중합체(40 g, 1 mmol)는 가열하면서 700 mL의 THF에서 완전하게 용해되었고, 이러한 용액은, 1,5,7-트리아자비사이클로 [4.4.0]dec-5-ene (TBD, 1.5 g, 10.8 mmol)가 첨가되기 전에, 실온으로 냉각되었고, 그 다음에 히드록실아민(50 % 수용액, 45 mL, 817.5 mmol)이 첨가되고, 이러한 용액은 24 시간 동안 실온에서 교반되었다. 이소프로판올(200 mL)은 첨가되었고, 그리고 난 다음에 메틸tert부틸 에테르로 침전되었고, 여과에 의해 수집되었고, 아세톤(500 mL)에서 용해되었다. 아세트산(5 mL)은 이러한 아세톤 용액에 첨가되었고, 밤새 교반되었다. 상기 용액은 거의 건조될 때까지 로토베이프되었고(rotovapped), 메틸렌클로라이드에서 재용해되었고, MTBE에서 침전되었고, 여과에 의해 수집되었고, 진공 상에서 건조되었다(33.5 g, 수득률 = 86 %). 1H NMR (d6-DMSO) δ 9.03, 8.37-7.70, 7.36-6.72, 6.68-6.42, 4.64-4.14, 3.73-3.10, 3.00-2.76, 2.71-2.56, 2.42-2.27, 2.21-1.61.
실시예 101
Figure 112014095982417-pct00193
mPEG11 .5K- b - Poly -(d- Glu ( OBn ) 3.5 - co - Glu ( OBn ) 3.5 )- b - Poly ( Tyr ( OBn ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 분자량을 제외하고 실시예 3으로서 상기 동일한 방법으로 제조된 mPEG11.5KNH2 (15 g , 1.3 mmol)는, 깨끗한, 오븐 건조된, 1000 mL, 두 개의 목, 둥근 바닥 플라스크 내로 중량을 달았고, 톨루엔(300 mL)에서 용해되었다. 이러한 중합체는 실시예 73으로서 동일한 방식으로 제조되었다. 실시예 8로서 동일한 방법으로 제조된 Glu(OBn) NCA (1.2 g, 4.56 mmol), 및 실시예 9로서 동일한 방법으로 제조된 d-Glu(OBn) NCA (1.2 g, 4.56 mmol)는 상기 플라스크에 첨가되었고, 상기 반응 혼합물은 질소 가스 하에서 주위 실온에서 16 시간 동안 교반되었다. 그리고 난 다음에, 실시예 7로서 상기 동일한 방법으로 제조된 d-Phe NCA (2.88 g, 19.56 mmol), 및 실시예 6으로서 상기 동일한 방법으로 제조된 Tyr (OBn) NCA (8.26 g, 32.60 mmol)가 상기 용액에 직접적으로 첨가되었고, 2 시간 동안 실온에서 교반되었고, 그 다음에 상기 반응이 완료되는 시점(GPC, DMF/0.1% LiBr)에 48 시간 동안 35 ℃로 가열되었다. 상기 용액은 실온으로 냉각되었고, 아세트산 무수물(1.34 g, 13 mmol, 1.23 mL), N-메틸모르폴린(NMM)(1.3 g, 13 mmol, 1.43 mL) 및 디메틸아미노피리딘(DMAP)(0.16 g, 1.3 mmole)가 첨가되었다. 교반시키는 것은 실온에서 16 시간 동안 유지되었다. 상기 중합체는 디에틸 에테르:헵탄 10:1 (2.5 L) 내로 침전되었고, 여과에 의해 분리되었고, 디에틸 에테르의 신선한 100 mL의 일부로 세척되었고, 진공 상에서 건조시켜, 미세한, 거의 무색 분말로서 상기 블록 공중합체를 수득하였다(26 g, 수득률 = 82.2 %). 1H NMR (d6-DMSO) δ 8.40-7.83, 7.27, 7.16-6.98, 6.83-6.64, 5.06-4.79, 4.62-4.18, 3.71-3.21, 2.98-2.78 , 2.75-2.58, 2.42-2.25, 2.22-2.13, 1.99-1.70.
실시예 102
Figure 112014095982417-pct00194
mPEG11 .5K- b - Poly -(d- Glu ( OBn ) 3.5 - co - Glu ( OBn ) 3.5 )- b - Poly ( Tyr ( OBn ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 분자량을 제외하고, 실시예 3에서의 동일한 방법으로 제조된 mPEG11.5KNH2 (15 g, 1.3 mmol)는, 깨끗한, 오븐 건조된, 1000 mL, 두 개의 목, 둥근 바닥 플라스크 내로 중량을 달았고, 가열과 함께 톨루엔(300 mL)에서 용해되었고, 공비 증류에 의해 건조되었다. 건조시키 위해 증류한 후에, 상기 중합체는 3 시간 동안 진공 하에 두었다. 상기 플라스크는 그 다음에 N2 로 다시 채워졌고, 환산 압력 하에서 다시 채워졌고, 건조 NMP:DCM (1:1) (450 mL)가 카눌라에 의해 도입되었다. 실시예 8로서 상기 동일한 방법으로 제조된 Glu(OBn) NCA(1.2 g, 4.56 mmol) 및 실시예 9로서 상기 동일한 방법으로 제조된 d-Glu(OBn) NCA(1.2 g, 4.56 mmol)는 상기 플라스크에 첨가되었고, 상기 반응 혼합물은 질소 가스 하에서 주위 실온에서 48 시간 동안 교반되었다. 그리고 난 다음에, 실시예 7로서 상기 동일한 방법으로 제조된 d-Phe NCA (2.88 g, 19.56 mmol) 및 실시예 6으로서 상기 동일한 방법으로 제조된Tyr (OBn) NCA (8.26 g, 32.60 mmol)이 첨가되었고, 상기 용액은 2 시간 동안 실온에서 교반시켰고, 그 다음에 상기 반응이 완료된 시점(GPC, DMF/0.1% LiBr)에, 48 시간 동안 35 ℃로 가열되었다. 상기 용액은 실온으로 냉각되었고, 아세트산 무수물(1.34 g, 13 mmol, 1.23 mL), N-메틸모르폴린(NMM)(1.3 g, 13 mmol, 1.43 mL) 및 디메틸아미노피리딘(DMAP)(.16 g, 1.3 mmole)이 첨가되었다. 교반시키는 것은 실온에서 16 시간 동안 유지되었다. 상기 중합체는 디에틸 에테르: 헵탄 10:1 (2.5 L) 내로 침전되었고, 여과에 의해 분리되었고, 디에틸 에테르의 신선한 100 mL로 세척되었고, 진공 상에서 건조시켜, 미세한, 거의 무색 분말로서 상기 블록 공중합체를 수득하였다(25 g, 수득률 = 82.2 %). 1H NMR (d6-DMSO) δ 8.38-7.80, 7.42-7.18, 6.75, 5.02, 4.97-4.80, 4.66-4.16, 3.75-3.20, 3.02-2.80 , 2.76-2.56, 2.44-2.25, 2.00-1.59.
실시예 103
Figure 112014095982417-pct00195
mPEG11 .5K- b - Poly -(d- Glu ( OBn ) 3.5 - co - Glu ( OBn ) 3.5 )- b - Poly ( Tyr ( OBn ) 25 - co -d-Phe 15 )-Ac의 합성 분자량을 제외하고, 실시예 3으로서 상기 동일한 방법으로 제조된 mPEG11.5KNH2 (15 g, 1.3 mmol)는, 깨끗한, 오븐 건조된, 1000 mL, 두 개의 목, 둥근 바닥 플라스크 내로 중량을 달았고, 가열과 함께 톨루엔(300mL)에 용해되었고, 공비 증류에 의해 건조되었다. 건조시키기 위해 증류한 후에, 상기 중합체는 3 시간 동안 진공 하에서 두었다. 상기 플라스크는 그 다음에 N2 로 다시 채워졌고, 환산 압력 하에서 다시 비워졌고, 건조 (NMP) 및 DCM (1:3 ratio)(450 mL)은 카눌라에 의해 도입되었다. 실시예 8로서 상기 동일한 방법으로 제조된 Glu(OBn) NCA (1.2 g, 4.56 mmol), 및 실시예 9로서 상기 동일한 방법으로 제조된 d-Glu(OBn) NCA (1.2 g, 4.56 mmol)가 상기 플라스크에 첨가되었고, 상기 반응 혼합물은 질소 가스 하에서 주위 실온에서 48 시간 동안 교반되었다. 그리고 난 다음에, 실시예 7로서 상기 동일한 방법으로 제조된 d-Phe NCA (2.88 g, 19.56 mmol), 및 실시예 6으로서 상기 동일한 방법으로 제조된 Tyr (OBn) NCA (8.26 g, 32.60 mmol)가 상기 용액에 직접적으로 첨가되었고 2 시간 동안 실온에서 교반된 다음에, 상기 반응이 완료되는 시점(GPC, DMF/0.1% LiBr)에, 48 시간 동안 35 ℃로 가열시켰다. 상기 용액은 실온으로 냉각되었고, 아세트산 무수물(1.34 g, 13 mmol, 1.23 mL), N-메틸모르폴린(NMM)(1.3 g, 13 mmol, 1.43 mL) 및 디메틸아미노피리딘(DMAP)(.16 g, 1.3 mmole)가 첨가되었다. 교반시키는 것은 실온에서 16 시간 동안 유지되었다. 상기 중합체는 디에틸 에테르:헵탄 10:1 (2.5 L) 내로 침전되었고, 여과에 의해 분리되었고, 디에틸 에테르의 신선한 100 mL 일부로 세척되었고, 진공 상에서 건조시켜, 미세한, 거의 무색 분말로서 상기 블록 공중합체를 수득하였다(26 g, 수득률 = 82.2 %). 1H NMR (d6-DMSO) δ 8.46-7.85, 7.48-6.95, 6.84-6.61, 5.02, 4.97-4.79, 4.66-4.16, 3.75-3.21, 3.00-2.79, 2.76-2.56, 2.43-2.25, 2.00-1.57.
실시예 104
Figure 112014095982417-pct00196
mPEG11 .6K- b - Poly -(d- Glu ( oBn ) 5 - co - Glu ( oBn 5 )- b - Poly ( Tyr ( OBn ) 10 - co -d- Leu 10 - co- Asp(oTbu) 10 -Ac의 합성 실시예 73으로부터의 일반적인 프로토콜을 사용하고, 적절한 NCA 출발 물질을 치환하고, NMP:DCM의 1 : 1 비율은 상기 정제되지 않는 중합체를 결과적으로 나타내었고, 이는 약 10 부피 디에틸 에테르로 침전되었다. 여과 및 건조 후에 상기 표제화합물은, 무색 고형물로서 수집되었다(30.5 g, 수득률 = 87.1%). 1H NMR (d6-DMSO) δ 8.39-7.94, 7.41-7.17, 7.15-7.02, 6.82, 5.01, 4.60-4.16, 3.72-3.30, 2.70, 2.42-2.26 2.02-1.71, 1.33, 0.9-0.55.
실시예 105
Figure 112014095982417-pct00197
mPEG11 .6K- b - Poly -(d- Glu ( oBn ) 5 - co - Glu ( oBn 5 )- b - Poly ( Tyr ( OH ) 10 - co -d- Leu 20 -co-Asp 10 )-Ac의 합성 실시예 104로부터의 상기 트리블록 공중합체는 깨끗한 500 mL 비커 내로 중량을 달았고(29 g, 1.38 mmol), 트리플루오로아세트산에서 용해되었다. 이러한 용액에, 펜타멘틸-벤젠(6.14 g, 41.4 mmol)이 첨가되었고, 자기 교반-막대로 교반되었다. 펜타멘틸-벤젠의 첨가 후 30 분에, 침전물이 용액에서 관찰되었다. 상기 반응 혼합물은 2 시간 동안 교반되었고, 아스파르테이트에서 티로신 및 t-부틸 기에서 벤질 보호 기의 완전한 제거를 위해 NMR에 의해 모니터되었다. 이러한 탈보호의 완성(5 Hrs) 후에, 상기 용액은 두꺼운 페이스트로 로토베이프되었고, 염화 메틸렌으로 재용해되었고, 그리고 난 다음에 차가운 디에틸 에테르에서 침전되었고, 여과에 의해 수집되었다. 이러한 고형물은 차가운 에테르로 100 mL 일부로 세 번 세척되었고, 진공 상에서 건조되고 특징지어졌다. (26 g, 수득률 = 96.6 %) 1H NMR (d6-DMSO) δ 9.09, 8.44-7.58, 7.35-6.89, 6.96, 6.58, 5.03, 4.62-4.16, 3.71-3.22, 2.75-2.64, 2.40-2.26, 2.23-2.04, 0.92-0.54.
실시예 106
Figure 112014095982417-pct00198
mPEG11 .6K- b - Poly -(d- Glu ( NHOH ) 5 - co - Glu ( NHOH )- b - Poly ( Tyr ( OH ) 10 - co -d- Leu 20 - co- Asp 10 )-Ac의 합성 실시예 105로부터의 트리블록 에스테르는 깨끗한 500 mL 둥근 바닥 플라스크 내로 중량을 달았고(25 g, 1.38 mmol), 상기 중합체는 200 mL의 테트라히드로푸란에서 완전하게 용해되었다. 이러한 용액에, 30 당량의 히드록실아민(1.9 mL, .028 mmol) 및 수소화 리튬 모노하이드레이트(1.16 g, 27.6 mmol)가 밤새 실온에서 질소 하에서 교반되었다. 반응의 완료는 1H NMR에 의해 확인되었다. 이러한 용액은 100 mL 메탄올로 혼합되었고, 디에틸 에테르(약 7 부피)로 침전되었다. 이러한 백색 고형물은 여과에 의해 수집되었고, 신선한 디에틸 에테르로 세척되었다. 상기 수집된 고형물은 아세토에서 용해된 다음에, 아세트산의 촉매량은 밤새 교반되었다. 상기 용액은 깨끗한 2 리터 비커 내로 부어졌고, 디에틸 에테르가 교반되면서 상기 용액에 서서히 첨가되었다. 이러한 백색 고형물은 여과에 의해 수집되었고, 진공 상에서 건조되었다. 수득된 22 g (92 %). 1H NMR (d6-DMSO)) δ 9.4-8.5, 8.40-7.71, 7.40-7.11, 6.93, 6.57, 5.10, 4.53-3.99, 3.86-3.02, 2.99-2.87, 2.09-1.19, 1.6-1.2, 1.01-0.5.
실시예 107
Figure 112014095982417-pct00199
mPEG11 .5K- b - Poly -(d- Glu ( oBn ) 5 - co - Glu ( oBn 5 )- b - Poly ( Tyr ( OBn ) 10 - co -d- Phe 10 - co- Asp(otBu) 10 )-Ac의 합성 분자량을 제외하고, 실시예 3으로서 상기 동일한 방법에 의해 제조된 mPEG11.5KNH2(31 g , 2.7 mmol)는, 깨끗한, 오븐 건조된, 1000 mL, 두 개의 목, 둥근 바닥 플라스크 내로 중량을 달았고, 가열하면서 톨루엔(400 mL)으로 용해되었고, 공비 증류에 의해 건조되었다. 건조시키기 위해 증류한 후에, 상기 중합체는 3 시간 동안 진공 하에 두었다. 상기 플라스크는 그 다음에 N2로 다시 채워졌고, 환산 압력 하에서 다시 비워지고, 1:2 비율의 디메틸아세트아미드 : 염화 메틸렌은 카눌라에 의해 도입되었고, 완전하게 용해되었다. 실시예 8에서 동일한 방법에 의해 제조된 Glu(OBn) NCA (3.4 g, 12.9 mmol), 및 실시예 9에서 동일한 방법에 의해 제조된d-Glu(OBn) NCA (3.4 g, 12.9 mmol)는 깨끗한 500 mL 둥근 바닥 플라스크 내로 중량을 달았고, 2 시간 동안 비우고, N2 로 다시 채운 다음에, DMAC에서 용해되었고, PEG를 함유하는 상기 플라스크 내로 카눌라 삽입되었다. 이러한 반응 혼합물은 질소 가스 하에서 주위 실온에서 14 시간 동안 교반되었다. 그리고 난 다음에, 실시예 7로서 상기 동일한 방법에 의해 제조된 d-Phe NCA (5.15 g, 26.9 mmol) 및 실시예 6으로서 상기 동일한 방법에 의해 제조된 Tyr (OBn) NCA (7.99 g, 26.9 mmol)는 상기에 언급된 바와 같은 동일한 방식으로 첨가되었고, 상기 용액은 2 시간 동안 실온에서 교반시킨 다음에, 상기 반응이 완료되는 시점(GPC, DMF/0.1% LiBr)에, 26 시간 동안 35 ℃로 가열되었다. 상기 용액은 실온으로 냉각되었고, 아세트산 무수물(2.77 g, 269 mmol, 2.46 mL), N-메틸모르폴린(NMM)(2.69 g, 269 mmol, 1.43 mL) 및 디메틸아미노피리딘(DMAP)(.33 g, 2.7 mmole)가 첨가되었다. 교반시키는 것은 실온에서 1 일 동안 유지되었다. 상기 반응 용액은, 상기 염화 메틸렌을 제거하기 위해 로토베이프되었고(rotovapped), 그 다음에 상기 중합체는 이소프로판올(3.5 L) 내로 침전되었고, 여과에 의해 분리도엇고, 이소프로판올의 신선한 100 mL 일부로 세척되었고, 진공 상에서 건조되어, 거의 무색 분말로서 상기 블록 공중합체(44.5 g, 수득률 = 83.1 %)를 수득하였다. 1H NMR (d6-DMSO) δ 8.59-7.86, 7.45-7.25, 7.10, 6.79, 5.12-4.79, 4.69-4.17, 3.84-3.23, 3.02-2.58, 2.40-2.23, 2.04-1.71, 1.33.
실시예 108
Figure 112014095982417-pct00200
mPEG11 .5K- b - Poly -(d- Glu ( oBn ) 5 - co - Glu ( oBn 5 )- b - Poly -( Tyr ( OH ) 10 - co -d- Phe 10 - co- Asp(OH) 10 )-Ac의 합성 규모만을 조절하여 실시예 74로부터 상기 일반적인 방법을 사용하여, 이러한 중합체는 탈보호되었다(30 g, 1.54 mmol). 완료한 때(3 Hrs.)에, 상기 용액은 두꺼운 페이스트로 로토베이프되었고(rotovapped), 그 다음에 DCM에서 재용해되었고, MTBE에서 침전되었고, 여과에 의해 수집되었고, MTBE의 신선한 100 mL 일부로 몇 번 세척하고, 진공 상에서 건조되었다. 이러한 반응으로 24 g의 건조 물질(86.9 %)이 수득되었다. 1H NMR (d6-DMSO) δ 9.07, 8.50-7.80, 7.40-7.28, 6.98, 6.62, 5.04, 4.69-4.17, 3.72-3.23, 3.02-2.76, 2.73-2.57, 2.42-2.27, 2.23-1.59.
실시예 109
Figure 112014095982417-pct00201
mPEG11 .5K- b - Poly -(d- Glu ( NHOH ) 5 - co - Glu ( NHOH ) 5 - b - Poly ( Tyr ( OH ) 10 - co -d-Phe 10 - co- Asp(OH) 10 )-Ac의 합성 실시예 108로부터의 상기 중합체(22 g, 1.2 mmol)는 가열과 함께 200 mL의 THF에서 완전하게 용해되었다. 이러한 용액은, 10M KOH 용액이 첨가되기 전(2 mL,1.5 g, 10.8 mmol)에, 실온으로 냉각된 다음에, 히드록실 아민(50 % 수용액, 6 mL, 3.6g, 108 mmol)을 첨가하였고, 이러한 용액은 24 시간 동안 실온에서 교반되었다. 아세톤 20 mL 및 아세트산(2 mL)가 이러한 반응 용액에 첨가되었고 4 시간 동안 교반되었다. 상기 용액은 거의 건조될 때까지, 로토베이프되었고, 염화 메틸렌에서 재용해되었고, MTBE에서 침전되었고, 여과에 의해 수집되었고, 진공 상에서 건조되었다(20 g, 수득률 = 94.9 %). 1H NMR (d6-DMSO) δ 8.61-7.90, 7.50-6.29, 5.38-5.01, 4.63-4.12, 3.78-3.22, 2.17, 2.11, 1.81-1.63.
실시예 110
Figure 112014095982417-pct00202
mPEG12K - b - Poly -( Asp ( Ot - Bu ) 10 )- b - Poly -(d- Leu 20 - co - Tyr ( OBn ) 20 )- Ac 의 합성 실시예 3(360 g , 30.0 mmol)으로부터의 mPEG12KNH2 는, 깨끗한, 오븐 건조된, 5000 mL, 세 개의 목, 둥근 바닥 피복된 플라스크(jacketed flask) 내로 중량을 달았고, 55 내지 60 ℃에서 오일 수조(oil bath)에서 가열과 함께 톨루엔(3000 mL)에 용해되었고, 공비 진공 증류에 의해 건조되었다. 약 30 %의 상기 톨루엔이 제거된 후에, 상기 증류는 중단되었고, 디플루오로아세트산(DFA)이 상기 DFA 염을 형성하기 위해 주사기(2.26 mL, .036 mmol)에 의해 첨가되었다. 상기 용액은 30 분 동안 교반되었고, 그 다음에 상기 공비혼합물은 또 다시 출발되었고, 완전하게 건조되었다. 상기 중합체 염은 밤새 진공 하에 두었다. 상기 플라스크는 N2로 그 다음에 다시 채워졌고, 환산 압력 하에서 다시 비워지고, 건조 N-메틸프롤리돈(NMP) (3500 mL)이 카눌라에 의해 도입되었다. 상기 혼합물은 용해를 신속하게 처리하기 위해 40 ℃로 잠시 가열된 다음에, 25 ℃로 냉각되었다. Asp(OtBu) NCA (64.56 g, 300 mmol)는 깨끗한 1 L, 두 개의 목 RBF 내로 중량을 달았고, 신선하게 증류된 NMP가 상기 플라스크 내로 카눌라 도입되기 전에 1 시간 동안 비워지고, 상기 NCA를 완전하게 용해되었다. 이러한 용액은 그리고 난 다음에 상기 PEG 플라스크 내로 카눌라 도입된 다음에, 질소 가스 하에서 48 시간 동안 실온에서 교반되었다. 그리고 난 다음에, d-Leu NCA (94.30 g, 600 mmol) 및 Tyr (OBn) NCA (178.39 g, 600 mmol)는 상기 기재된 바와 같이 상기 동일한 방법에 의해 상기 용액에 첨가되었고, 상기 결과적으로 생성된 용액은 상기 반응이 완료된 것으로 여겨진 시점(GPC, DMF/0.1% LiBr)에 48 시간 동안 35 ℃에서 교반되었다. 상기 용액은 실온으로 냉각되었고, 아세트산 무수물(45.9 g, 0.45 mol, 42.5 mL), 피리딘(59.3 g, 0.75 mol, 60.7 mL) 및 디에틸아미노피리딘(DMAP)(0.37 g, 3.0 mmole)이 첨가되었다. 교반시키는 것은 실온에서 1 일 동안 유지되었다. 상기 중합체는 5 부피의 디에틸 에테르(15 L)로 침전되었고, 여과에 의해 분리되었고, 신선한 300 mL 일부의 디에틸 에테르로 세척되었고, 진공 상에서 건조시켜, 미세한, 황백색 분말로서 상기 블록 공중합체를 수득하였다(434.9 g, 수득률 = 69.0 %). 1H NMR (d6-DMSO) δ 8.50-7.90, 7.60-7.30, 7.25-6.77, 5.10-4.85, 4.65-4.10, 3.72-3.25, 3.05-2.45, 2.44-1.60, 1.40-1.25, 0.90-0.50.
실시예 111
Figure 112014095982417-pct00203
mPEG12K - b - Poly -( Asp ( OH ) 10 )- b - Poly -(d- Leu 20 - co - Tyr ( OH ) 20 )- Ac 의 합성 실시예 110으로부터의 mPEG12K-b-Poly-(Asp(Ot-Bu)10)-b-Poly-(d-Leu20-co-Tyr(OBn)20)-Ac(314.5 g, 14.9 mmol) 및 펜타메틸벤젠(141.4 g, 0.954 mole)은 2.2 L의 트리플루오로아세트산(TFA) 내로 용해되었다. 상기 반응은 주위 실온에서 14 시간 동안 빠르게 교반되었다. 상기 TFA는, 35 ℃를 초과하지 않는 물 수조 온도를 갖는 회전증발기(rotary evaporator)에서 제거되었다. 상기 결과적으로 생성된 푸티-유사 고형물(The resultant putty-like solid)은 1.4 L의 디클로로메탄에서 용해되었고, 12 L 튜브(tub)로 이동되었고, 빠른 기계적인 교반을 사용하여 5.6 L의 디에틸 에테르의 느린 첨가에 의해 침전되었다. 상기 결과적으로 생성된 슬러리는 30 분 동안 교반되었고, 고형물은 여과에 의해 수집되었고, 신선한 디에틸 에테르의 2 x 1 L 일부로 세척되었고, 진공 건조되었다. 상기 고형물은 900 mL의 디클로로메탄에 재용해되었고, 10 L의 디에틸 에테르의 첨가의 침전되었다. 여과 및 진공 건조로 무색, 거품같은 고형물로서 생산물이 제공되었다(254.4 g, 수득률 = 91.3 %). 1H NMR (d6-DMSO) δ 12.4, 9.09, 8.50-7.80, 7.05-6.45, 4.65-4.0, 3.85-3.1, 3.03-2.45, 2.44-1.63, 1.58-0.95, 0.90-0.50.
실시예 112
다우노루비신의 제형 - 실시예 18로부터의 트리블록 공중합체(330 mg)는, 10 분 동안 ~ 50 ℃에서 교반에 의해 1.65 mg/mL에서 물에서 용해되었다. 상기 용액은 냉각시켰고, 상기 pH는 0.1 N NaOH로 7.0으로 조절되었다. 상기 제형의 다우노루비신 공급 속도는, 10 %의 상기 중합체 중량이었다. 초음파 처리된 수조에서 상기 용액을 두고, 그 다음에 가열 및 볼텍싱함으로써, 유기 용액(20 % 메탄올, 80 % 디클로로메탄)은, 8.25 mg/mL로 33 mg 다우노루비신을 용해시키는데 사용되었고, 투명한, 붉은 용액이 지속될 때까지 반복되었다. 상기 유기 용액은 실온으로 냉각되었고, 그 다음에 17 μL의 트리에틸아민이 첨가되었다. 상기 유기 용액은, ~ 1 분 동안 10,000 RPM에서 교반 혼합하면서, 상기 중합체 용액에 첨가되었다. 탁한, 붉은 용액인 상기 결과적으로 생성된 에멀젼은, 밤새 흄 후드(fume hood)에서 교반되었다. 상기 유기 용매가 증발되면서, 상기 용액은 보다 덜 탁하게 되고, 색깔은 보다 붉어졌다. 그 다음날, 상기 용액은 0.22 미크론, 데드 말단 필터(dead end filter)를 통해 여과되었다. 10 kD cutoff 필터가 갖춰진 접선 유동 필터레이션 장치는, 200 mL에서 대략 50 mL까지 상기 샘플을 농축시키는데 사용되었다. 상기 제형은 그리고 난 다음에 - 70 ℃로 냉동되었고, 동결 건조되었다. 다우노루비신의 제형은 88 % 수득률을 결과적으로 나타내었다. 중량 로딩(Weight loading)은, HPLC 분석에 의해 알려진 농도의 제형에 대한 다우노루비신의 표준 곡선을 비교함으로써 측정되었다. 다우노루비신은 40 ㎍/mL에서 200 ㎍/mL까지의 범위로 메탄올에 용해되었고, 상기 제형은 메탄올에서 2 mg/mL로 용해되었다. 상기 제형에서 다우노루비신의 양은 그 다음에, 사용된 제형(즉, 2 mg/mL)의 알려진 양을 기초로 % 로 변환되었다. 이러한 제형은 10 % 공급으로부터 7.8 %의 중량 로딩을 나타내었고: 69 %의 효율 공정을 나타냄. 동적 광 산란에 의해 상기 교차결합되지 않은 제형의 입자 크기 분석은 75 nm의 평균 직경을 결과적으로 나타내었다. 다우노루비신의 캡슐화는, 20 mg/mL로 상기 임계 미셀 농도(critical micelle concentration, CMC) 이상, 및 0.2 mg/mL로 상기 CMC 이하로 상기 교차결합되지 않는 제형의 투석에 의해 확인되었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 상기 CMC 이상으로 투석된 상기 제형은 다우노루비신의 대략 88 % 유지를 결과적으로 나타내면서, 상기 CMC 이하의 투석은 다우노루비신의 대략 15 % 유지를 결과적으로 나타내었다. 이러한 결과는, 상기 다우노루비신이 높은 농도(CMC 이상)에서 상기 미셀에서 효과적으로 캡슐화되고, 상기 미셀은 상기 CMC 이하로 희석된 경우에 무너짐을 나타내었다(This result shows that the daunorubicin is effectively encapsulated in the micelle at high concentrations (above the CMC) and that the micelle falls apart when diluted below the CMC).
실시예 113
다우노루비신 로딩된 미셀의 교차결합 실시예 112의 상기 다우노루비신 로딩된 미셀은, 대략 16 시간 동안 0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 2.5, 5, 7.5 또는 10 mM의 염화 제3철과 함께 20 mg/mL로 물에 있었다. 9 개의 분리된 샘플의 각각은 0.2 mg/mL로 희석되었고, 교차결합의 정도를 결정하기 위해, 인산 완충용액 pH 8에 대한 6 시간 동안 투석되었다. 본 실험의 상기 결과는 도 6에 기재되어 있다. 이러한 결과는, 다우노루비신 로딩된 미셀이, 염화 제3철로 처리된 경우에, 5 mM 이상의 염화 제3철의 농도에서 수득된 상기 좋은 결과와 함께, 희석(교차결합됨)에 대한 안정성이 있음을 나타낸다.
실시예 114
교차결합 시간의 최적화 실시예 112의 상기 다우노루비신 로딩된 미셀은 20 mg/mL으로 10 mM 염화 제3철에 있었다. 상기 샘플의 앨리쿼트는, 5 분에 철이 없는 교차결합되지 않는 샘플과 함께, 5 분, 30 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간 및 16 시간에 채취되었고, 0.2 mg/mL로 희석되었고, 6 시간 동안 10 mM 인산 완충용액 pH 8에 대해 투석되었다. 상기 시간-의존적인 교차결합에 대한 투석 후 남아있는 상기 % 다우노루비신(The % daunorubicin remaining post dialysis for the time-dependent crosslinking)은, 도 7에 기재되어 있다. 도 3을 기초로, 상기 CMC 이하로 희석 전에, 염화 제3철 용액과 함께 상기 샘플의 5 분 배양 후에 남아있는 상기 다우노루비신의 거의 70 %의 유지와 함께, 상기 샘플의 교차결합은 빠르게 발생되었다(Based on figure 3 the crosslinking of the sample occurred rapidly, with nearly 70 % retention of the daunorubicin remaining after just 5 minutes incubation of the sample with the iron (III) chloride solution prior to dilution below the CMC).
실시예 115
교차결합 pH 의 최적화 실시예 112의 상기 다우노루비신 로딩된 미셀은, 20 mg/mL로 10 mM 염화 제3철에 있고, 희석된 수소화 나트륨으로 pH 3, 4, 5, 6, 7, 7.4 및 8 로 조절된 이 용액을 앨리쿼트하고, 10 분 동안 교반시켰다. 각각의 샘플은 그리고 난 다음에 0.2 mg/mL로 희석되었고, 6 시간 동안 10 mM 인산 완충용액 pH 8에 대해 희석되었다. 10 mM 인산 완충용액 pH 8에 대한 투석 후에 남아있는 % 다우노루비신은, 도 8에 기재되어 있다. 이러한 결과는, 교차결합을 위해 최적의 pH가 7.4인 것을 나타내었다.
실시예 116
교차결합된 미셀로부터의 다우노루비신의 pH 의존적인 방출 실시예 11의 상기 다우노ㄹ비신 로딩된 미셀은, 20 mg/mL로 10 mM 염화 제3철에 있었고, 희석된 수소화 나트륨으로 pH 7.4로 조절되었고, 10 분 동안 교반되었다. 이러한 샘플은 0.2 mg/mL로 희석된 다음에, 6 시간 동안 pH 3, 4, 5, 6, 7, 7.4 및 8에서 10 mM 인산 완충용액에 대해 투석되었다. pH의 작용으로서 10 mM 인산 완충용액에 대해 투석 후에 남아있는 % 다우노루비신은, 도 9에 기재되어 있다. 이러한 결과는 교차결합된 미셀로부터의 약물의 pH 의존적인 방출을 나타낸다.
실시예 117
교차결합된 미셀로부터의 다우노루비신의 염 의존적인 방출( Salt Dependent Release) 실시예 112의 상기 다우노루비신 로딩된 미셀은 20 mg/mL로 10 mM 염화 제3철에 있었고, 그 다음에 희석된 수산화 나트륨으로 pH 7.4로 조절되었고, 10 분 동안 교반되었다. 각각의 샘플은 0.2 mg/mL로 희석된 다음에, 6 시간 동안 0 내지 500 mM NaCl의 범위의 농도로 pH 8에서 10 mM 인산 완충용액에 대해 투석되었다. 염 농도의 작용으로서 10 mM 인산 완충용액에 대해 투석 후 남아있는 % 다우노루비신은 도 10에 기재되어 있다. 이러한 결과는, 교차결합된 미셀로부터의 약물의 염 의존적인 방출을 나타내었다.
실시예 118
아미노프테린의 캡슐화 - 실시예 18로부터의 트리블록 공중합체(800 mg)는 30 분 동안 ~ 50 ℃에서 교반시킴으로써 2 mg/mL로 물에 용해되었다. 상기 용액은 냉각되었고, pH 는 0.1 N NaOH로 7.0 으로 조절되었다. 제형에 대한 아미노프테린 공급은 상기 중합체 중량의 4 % 이었다. 유기 용액[20 % 메탄올, 80 % 디클로로메탄, 15 mg/mL 파라-톨루엔술폰산(para-toluenesufonic acid)]은, 초음파처리된 물에 상기 용액을 둔 다음에, 가열하고 볼텍싱(vortexing)하고, 맑고, 황색 용액이 지속될 때까지 반복함으로써, 3.2 mg/mL로 32 mg 아미노프테린을 용해시키는데 사용되었다. 상기 유기 용매가 냉각된 때에, 이는, ~ 1 분 동안 10,000 RPM에서 교반 혼합되면서, 상기 중합체 용액에 첨가되었다. 탁한, 황색 용액인 상기 결과적으로 나타낸 에멀젼은, 밤새 흄 후드에서 교반되었다. 상기 유기 용매가 증발되면서, 상기 용액은 보다 덜 탁하게 되었고, 보다 황색이 되었다. 그 다음 날에, 상기 용액은 NaOH로 7.0 으로 pH 조절되었고, 0.22 미크론, 데드 엔드 필터(0.22 micron, dead end filter)를 통해 여과되었다. 10 kD cutoff 필터가 갖춰진 접선 유동 필터레이션 장치는, 캡슐화되지 않은 아미노프테린 및 소량의 용매매를 제거하기 위해, 3 배 완충용액 교환과 함께 디아필터레이션(diafiltration)을 위해 사용되었다. 상기 제형은 그리고 난 다음에 - 70 ℃로 냉동되었고, 동결건조되었다. 상기 트리블록 공중합체와 아미노프테린의 제형은, 85 % 수득률의 생산물을 결과적으로 나타내었다. 중량 로딩(Weight loading)은, HPLC 분석에 의해 제형의 알려진 농도로 아미노프테린의 표준 곡선을 비교함으로써 결정되었다. 아미노프테린은 40 ㎍/mL에서 200 ㎍/mL까지의 범위에서, HPLC 이동 상(60 % 아세토니트릴, 40 % 10 mM 인산 완충용액 pH 8)에서 용해되었고, 상기 제형은 HPLC 이동상에서 5 mg/mL로 용해되었다. 상기 제형에서 아미노프테린의 양은 그리고 난 다음에,사용된 제형의 알려진 양(즉, 5 mg/mL)을 기초로 % 로 변환되었다. 상기 아미노프테린-로딩된 미셀은, 4 % 공급으로부터 2.5 % 중량 로딩의 로딩을 가진 것으로, 53 %의 효율을 결과적으로 나타내는 것을 발견되었다. 상기 교차결합된 제형의 입자 크기는, 도 11에 나타낸 바와 같이, 대략 70 nm의 단일 분포 평균 입자 크기(single distribution average particle size)를 나타내었다.
실시예 119
아미노프테린 캡슐화의 확인 실시예 118로부터의 상기 아미노프테린 로딩된 미셀은, 10 mM 인산 완충용액 pH 8에서 20 mg/mL로 용해되었다. 상기 교차결합되지 않은 제형은 또한 CMC (0.2 mg/mL) 이하로 희석되었고, 6 시간 동안 10 mM 인산 완충용액 pH 8에 대해 투석되었다. 도 12에 나타낸 상기 막대 그래프는, 6 시간 이상의 상기 투석 백 내부에 남아있는 75 % 초과의 상기 아미노프테린을 갖는, 20 mg/mL에서 상기 교차결합되지 않는 제형의 안정성을 나타내었다. 그러나, 0.2 mg/mL로 희석된 경우에, 10 % 미만의 상기 아미노프테린은 6 시간 후에 상기 투석 백에 두었다. 이러한 결과는, 상기 아미노프테린이 높은 농도로 상기 미셀을 효과적으로 캡슐화되고(상기 CMC 이상), 상기 미셀은 상기 CMC 이하로 희석된 경우에 무너짐을, 나타내었다.
실시예 120
교차결합된 미셀로부터의 아미노프테린의 pH 의존적인 방출 실시예 118로부터의 상기 아미노프테린 로딩된 미셀은 10 mM 염화 제3철에서 20 mg/mL로 용해되었고, 10 분 동안 교반되었다. 이러한 샘플은 0.2 mg/mL로 희석된 다음에, 6 시간 동안 pH 3, 4, 5, 6, 7, 7.4 및 8에서 10 mM 인산 완충용액에 대해 투석되었다. pH의 작용으로서 10 mM 인산 완충용액에 대해 투석 후 남아있는 % 아미노프테린은, 도 13에 기재되어 있다. 이러한 결과는, 교차결합된 미셀로부터 아미노프테린의 pH 의존적인 방출을 나타내었다.
실시예 121
아미노프테린 로딩된 교차결합된 미셀의 세포 독성( Cytotoxicity ) 실시예 118 및 실시예 120으로부터 상기 아미노프테린 로딩된 미셀은, A549 폐, OVCAR3 난소(ovarian), PANC-1 [엽산 수용체 +(folate receptor +)] 췌장 및 BxPC3 (엽산 수용체 -) 췌장 암 세포주(cell lines)에 대한, 프리 아미노프테린(free aminopterin) 및 상기 교차결합된 및 교차결합되지 않은 비 약물-로딩된 미셀 제형(실시예 18로부터의 중합체)와 비교된 세포독성에 대해 테스트되었다. 각각의 세포주에 대한 각각의 처리를 위한 상기 세포독성 프로파일은 도 14(A549 폐), 도 15 (OVCAR3 난소), 도 16 (PANC-1 췌장), 및 도 17(BxPC3 췌장)에 기재되어 있다. 아미노프테린은, A549 및 PANC-1 세포에서 낮은 나노몰랄 범위(~ 7 내지 25 nM)에서 50 % (IC50)에 의해 세포 생존능력을 저해하였지만, 어떠한 IC50도 OVCAR3 or BxPC3 세포에 대해서 획득되지 않았다. 이와 마찬가지로, 상기 교차결합되지 않고 교차결합된 제형은, OVCAR3 또는 BxPC3 세포에서, 50 % 저해에 도달하지 않고, A549 및 PANC-1 세포에 대한 보다 낮은 나노몰랄 범위(~ 20 내지 70 nM)에서 IC50 수치를 나타내었다. 교차결합되지 않고, 교차결합된 비 약물-로딩된 미셀 둘 다의 처리는, 테스트된 모든 세포에 대한 80 % 초과의 생존 능력과 함께, 잘 용인되었다.
실시예 122
베르베린의 캡슐화 - 실시예 18로부터의 트리블록 공중합체(300 mg)는, 10 분 동안 ~ 50 ℃에서 교반시킴으로써 2 mg/mL에서 물에 용해되었다. 상기 용액은 냉각되었고, pH 는 0.1 N NaOH로 7.0 으로 조절되었다. 유기 용액(20 % 메탄올, 80 % 디클로로메탄)은, 맑고, 황색 용액이 지속될 때까지, 볼텍싱에 의해 6 mg/mL로 15 mg의 베르베린을 용해시키는데 사용되었다. 상기 유기 용액은, ~ 1 분 동안 10,000 RPM에서 교반 혼합하면서, 상기 중합체 용액에 첨가되었다. 혼탁하고, 황색 용액인, 상기 결과적으로 생성된 에멀젼은, 밤새 흄 후드에서 교반되었다. 상기 유기 용매가 증발됨으로써, 상기 용액은 보다 덜 혼탁해지고, 보다 황색이 되었다. 그 다음 날에, 상기 용액은 0.22 미크론, 데드 엔드 필터를 통해 여과되었다. 10 kD cutoff 필터가 갖춰진 접선 유동 플터레이션 장치는 200 mL에서 대략 50 mL로 상기 샘플을 농축하는데 사용되었다. 상기 제형은 그리고 난 다음에 - 70 ℃로 냉장되었고, 동결건조되었다. 중량 로딩은, HPLC 분석에 의해 제형의 알려진 농도에 대한 베르베린의 표준 곡선을 비교함으로써 결정되었다. 베르베린은40 ㎍/mL에서 200 ㎍/mL까지의 범위에서 메탄올에 용해되었고, 상기 제형은 메탄올에서 5 mg/mL로 용해되었다. 상기 제형에서 베르베린의 양은 그리고 난 다음에, 사용된 제형의 알려진 양(즉, 5 mg/mL)을 기초로 %로 변환되었다. 상기 베르베린 제형의 중량 로딩은, 상기 프리 약물(free drug)의 표준 곡선에 대해 비교된 상기 제형의 HPLC 분석에 의해 결정된 바와 같이, 5 % 공급으로부터의 4 % 이었다. 상기 제형의 캡슐화 효율은 72 % 이었다. 동적 광 산란(dynamic light scattering)에 의해 입자 크기 분석은, 상기 교차결합되지 않는 샘플에 대한 72.5 nm의 평균 입자 크기를 결과로 나타내었다. 캡슐화 투석은, 베르베린이 상기 미셀에서 효과적인 캡슐화를 나타내는, 53 % 보유(retention)를 나타내었다.
실시예 123
상기 베르베린 로딩된 미셀의 교차결합 - 실시예 122로부터의 상기 동결건조된 교차결합되지 않느 분말은, 20 mg/mL로 물에서 재구성되었다. 염화 제3철은 5 mM의 최종 농도에 대해 상기 용액에 첨가되었고, ~ 30 분 동안 교반되었다. 상기 제형은 그리고 난 다음에 - 70 ℃로 냉동되었고, 동결건조되었다. 교차결합을 확인하기 위해, 교차결합되지 않고 교차결합된 샘플은 0.2 mg/mL로 희석되었고, 6 시간 동안 투석되었다. 상기 교차결합되지 않는 미셀은 5 %의 보유된 베르베린을 나타내면서, 상기 교차결합된 샘플은 43 %의 남아있는 베르베린을 나타내었다. 이러한 결과는, 상기 베르베린 미셀이 철의 첨가에 의해 안정화됨을 나타낸다.
실시예 124
파클리탁셀의 캡슐화 - 실시예 18(300 mg)로부터의 상기 트리블록 공중합체는, 10 분 동안 ~ 50 ℃에서 교반시킴으로써 2 mg/mL에서 물에 용해되었다. 상기 용액은 냉각되었고, 0.1 N NaOH로 pH 가 7.0 으로 조절되었다. 상기 제형의 파클리탁셀 공급 비율(Paclitaxel feed rate)은, 상기 중합체 중량의 1 % 이었다. 유기 용액(20 % 메탄올, 80 % 디클로로메탄)은, 맑고, 무색 용액이 지속될 때까지, 볼텍싱함으로써 3 mg/mL로 3 mg의 파클리탁셀을 용해시키는데 사용되었다. 그 다음에, 상기 유기 용액은, ~ 1 분 동안 10,000 RPM에서 교반 혼합하면서 상기 중합체 용액에 첨가되었다. 상기 결과적으로 생성된 에멀젼은 밤새 흄 후드에서 교반되었다. 그 다음에, 상기 용액은 0.22 미크론, 데드 엔드 필터를 통해 여과되었다. 그 다음에 상기 제형은 - 70 ℃로 냉동되고 동결건조되었다. 상기 파클리탁셀 제형의 중량 로딩은, 상기 프리 약물의 표준 곡선과 비교된 상기 제형의 HPLC 분석에 의해 결정된 바와 같은, 1 % 공급으로부터 0.78 % 이었다. 동적 광 산란에 의해 입자 크기 분석은, 상기 교차결합되지 않는 샘플에 대한 45.7 nm의 평균 입자 크기를 결과적으로 나타내었다. 상기 임계 미셀 농도(20 mg/mL) 초과의 캡슐화 확인 투석은, 투석 후 상기 파클리탁셀의 52 % 유지를 결과적으로 나타내었다.
실시예 125
SN -38의 캡슐화 - 실시예 18로부터의 트리블록 공중합체(1 g)는, 10 분 동안 ~ 50 ℃에서 교반시킴으로써 물에서 5 mg/mL로 용해되었다. 수크로오스(1 g)는 상기 중합체 용액에 첨가된 다음에, 완전히 용해될 때까지 교반되었다. 상기 용액은 실온으로 냉각시키고, 0.1 N NaOH로 pH가 6.0 으로 조절되었다. 상기 제형에 대한 SN-38 공급은 상기 중합체 중량의 3 % 이었다. DMSO는, 맑고, 황색 용액이 지속될 때까지, 가열, 볼텍싱 및 초음파처리된 물 수조에서 상기 용액을 둠으로써, 80 mg/mL로 30 mg SN-38을 용해시키는데 사용되었다. 상기 유기 용액은 실온으로 냉각시키고, ~ 1 분 동안 10,000 RPM에서 교반 혼합하면서 상기 중합체 용액에 첨가되었다. 혼탁하고, 엷은 황색 용액인, 결과적으로 생성된 에멀젼은 그리고 난 다음에, 마이크로플루이다이저(microfluidizer)의 공급 챔버로 이동되었다. 상기 용액은 미세 유체의 M110Y 마이크로플루이다이저를 통한 단일 통과(single pass)로 진행되었다. 상기 마이크로플루이다이저 배출 증기(microfluidizer outlet stream)는 얼음 수조로 냉각되었다. 상기 용액은 그리고 난 다음에, 0.22 micron 데드-엔드 필터를 통해 여과되었고, 상기 결과적으로 생성된 용액은, Spectrum Labs KrosFlo 접선 유동 필터레이션 시스템 및 10 kDa 디아필터레이션 시스템으로 초미세여과(ultrafiltration)되었다. 상기 용액은 200 mL에서 ~ 50 mL로 농축되었고, 3 mg/mL의 수크로오스와 150 mL의 물이 첨가되었고, ~ 50 mL로 다시 농축되었다. 상기 초미세여과는, 원래 부피의 완충용액이 교환되도록(800 mL) 전체 4 번이 될 때까지 반복되었다. 상기 결과적으로 생성된 용액은 - 70 ℃에서 냉동되었고, 동결건조되었다.
실시예 126
SN -38 미셀의 교차결합 - 실시예 125로부터의 SN-38 미셀은, 수성 10 mM FeCl3에서 20 mg/mL로 용해되었다. 그리고 난 다음에, 상기 용액은 희석된 NaOH로 6.8 로 조절되었다. 상기 용액은 실온에서 1 h 동안 교반된 다음에 동결건조되었다. 이러한 교차결합된, SN-38 로딩된 미셀은, 1.75 %의 중량 로딩을 갖는, 갈색의 분말로서 분리되었고, 81.4 % 효율 공정을 나타내었다. 동적 광 산란에 의해 입자 크기 분석은, 70 nm의 평균 직경을 결과적으로 나타내었다.
실시예 127
제조 및 교차결합 SN -38 미셀 - 제형은 하기와 같은 중합체로 실행되었다 : 127A = 실시예 81로부터, mPEG12k-b-p[Glu(NHOH)2]-b-p[Phe15-co-Tyr25]-Ac; 127B = 실시예 56로부터, mPEG12k-b-p[Glu(NHOH)7]-b-p[Phe15-co-Tyr25]-Ac; 127C = 실시예 38로부터, mPEG12k-b-p[Glu(NHOH)10]-b-p[Phe15-co-Tyr25]-Ac; 127D = 실시예 98로부터, mPEG12k-b-p[Glu(NHOH)20]-b-p[Phe15-co-Tyr25]-Ac; 및 127E = 실시예 111로부터 mPEG12k-b-p[Asp10]-b-p[Leu20-co-Tyr20]-Ac. 트리블록 공중합체(1 g)는 30 분 동안 ~ 40 ℃에서 교반시킴으로써 물에서 5 mg/mL에 용해되었다. 1 g의 수크로오스는 상기 중합체 용액에 첨가된 다음에, 완전히 용해될 때까지 교반되었다. 상기 용액은 실온으로 냉각되었고, NaOH로 pH가 6.0 으로 조절되었다. 상기 제형에 대한 SN38 공급 비율은 상기 중합체 중량의 5 % 이었다. DMSO는, 맑고, 황색 용액이 지속될 때까지, 초음파 처리한 물 수조에서 가열, 볼텍싱 및 상기 용액을 둠으로써 80 mg/mL로 50 mg SN-38을 용해시키는데 사용되었다. 상기 유기 용액은 실온으로 냉각시켰고, 그 다음에 1 분 동안 10,000 RPM로 교반 혼합하면서 상기 중합체 용액에 첨가되었다. 혼탁한, 엷은 황색 용액인, 상기 결과적으로 생성된 에멀젼은 그 다음에, 마이크로플루이다이저의 공급 챔버로 이동되었다. 상기 용액은 상기 마이크로플루이다이저를 통해 단일 통과로 진행되었다. 상기 마이크로플루이다이저 배출 증기는 얼음 물 수조로 냉각되었다. 상기 용액은 0.22 미크론 데드-엔드 필터를 통해 여과된 다음에, 상기 결과적으로 나타낸 용액은, Spectrum Labs KrosFlo 접선 유동 필터레이션 시스템 및 10 kDa 디아필터레이션 막으로 초미세여과되었다. 상기 용액은 200 mL에서 ~ 50 mL로 농축된 다음에, 5 mg/mL 수크로오스와 150 mL의 물이 첨가되었고, 다시 ~ 50 mL로 농축되었다. 상기 초미세여과는 상기 최초의 부피의 완충용액이 교환되는(800 mL) 전체 4-번이 될 때까지 반복되었다. 염화 제3철은 그리고 난 다음에, 10 mL의 최종 농도에 대해 상기 제형에 첨가되었다. 상기 용액의 pH는 NaOH 로 6.0으로 조절된 다음에, 4 시간 동안 실온에서 교반되었다. 20 mg/mL에서 수크로오스를 함유하는 하나의 부피의 완충용액이 그리고 난 다음에 상기 용액에 첨가되었고, 대략 20 mg/mL 중합체 농도로 다시 농축되었다. 그리고 난 다음에, 상기 용액은 - 40 섭씨 온도에서 냉동되었고, 동결건조되었다. 트리블록 공중합체를 갖는 SN-38의 제형은, 3.5 %의 중량 로딩을 갖는 생산물의 85 %의 평균 수득률을 결과적으로 나타내었다. 실질적인 중량 로딩: A = 3.4 %, B = 3.2 %, C = 3.6 %, D = 3.6 %, E = 3.2 %. 동적 광 산란에 의한 입자 크기 분석은, 90 nm의 평균 직경을 결과적으로 나타내었다. 실질적인 입자 크기 : A = 84 nm, B = 88 nm, C = 89 nm, D = 110 nm, E = 91 nm.
실시예 128
교차결합된 SN -38 미셀의 약물 동태학 - 목 정맥 카테터로 외과적으로 변형된 Sprague-Dawly 랫은, Harlan Laboratories, Dublin, VA로부터 구매되었다. SN-38 교차결합된 제형(실시예 127C 및 127E)는, 대략 1 분 이상 JVC를 통한 2 mL 볼루스 주사를 위한 10 mg SN-38 per kg 동물 몸무게의 최종 농도를 위해 150 mM NaCl로 물에서 용해되었고, 그 다음에 대략 250 mL의 헤파린처리된 염분으로 플러쉬되었다(SN-38 crosslinked formulations were dissolved in water with 150 mM NaCl for a final concentration of 10 mg SN-38 per kg animal body weight for 2 mL bolus injection via JVC over approximately 1 minute, followed by a flush of approximately 250 mL heparinized saline). 테스트 물품의 투여 후의 혈액 수집을 위한 시점은 하기와 같다: 1, 5, 15 분, 1, 4, 및 24 시간. 시점 당 대략 250 μL의 혈액이 K3-EDTA 혈액 수집 튜브 내로 JVC에 의해 수집된 다음에, 대략 200μL 헤타린화된 염분으로 플리쉬되었다. 혈액은 그리고 난 다음에, 플라즈마(plasma)를 분리하기 위해 5 분 동안 2000 RPM으로 원심분리되었다. 플라즈마는 그리고 난 다음에 수집되었고, HPLC 분석을 위해 처리될 때까지 동결되었다. 샘플은 실온에서 상기 플라즈마 샘플을 첫 번째로 해동하여 분석을 위해 제조되었다. 50 μL 플라즈마는 150 μL의 추출 용액(메탄올에서 0.1% 인산, 5 ㎍/mL 캠토테신 내부 표준)을 2 mL 에프펜도르프 튜브(eppendorf tube)에 첨가되었다. 샘플은 그리고 난 다음에 10 분 동안 볼텍싱되었고, 13,000 RPM에서 10 분 동안 원심분리되었다. 상청액은 HPLC 바이알 내로 이동된 다음에 HPLC에 의해 분석되었다. SN-38의 정량(Quantitation)은, 각각의 시점에서 랫으로부터 수집된 샘플과 비교된 랫 플라즈마에서 SN-38 제형의 표준 곡선을 사용하여 결정되었다. 이러한 실험의 결과는 도 18에 나타내었다. IT-141 (NHOH; 127C)로부터의 상기 플라즈마에서 SN-38의 CMax 는 투여 후에 결전된 1 분, 304.5 ㎍/mL이었다. 상기 히드록삼산 제형에 의해 전돌된 상기 플라즈마 구획에 대한 SN-38의 노출은 111.5 ㎍*h/mL이었다. IT-141 (Asp; 127E) 로부터 상기 플라즈마 구획에 대한 SN-38의 노출은, 156.0 ㎍/mL의 CMax와 함께, 31.6 ㎍*h/mL이었다.
실시예 129
랫 약물동태학에 의해 결정된 최적의 교차결합 블록 길이의 결정 실시예 128의 절차를 사용하여, 실시예 127A, 127B, 및 127D의 제형은 10 mg/kg로 상기 랫에 투여되었다. 실시예 127D로부터의 상기 플라즈마에서의 SN-38의 CMax는, 투여 후 결정된 1 분, 292.9 ㎍/mL이었다. 상기 제형에 의해 전달된 농도 대 시간 곡선 하의 상기 영역에 의해 결정된 바와 같은 상기 플라즈마 구획에 대한 SN-38의 노출은 85.7 ㎍*h/mL이었다. 실시예 127B(NHOH-7)로부터의 상기 플라즈마 구획에 대한 SN-38의 노출은, 투여 후 1 분에 결정된 256.9 ㎍/mL의 CMax와 함께, 71.3 ㎍*h/mL이었다. 실시예 127A (NHOH-2)로부터의 상기 플라즈마에서의 SN-38의 CMax는, 투여 후 결정된 1 분, 267.7 ㎍/mL이었다. 상기 제형에 의해 전달된 상기 농도 대 시간 곡선 하의 상기 영역에 의해 결정된 바와 같은, 상기 플라즈마 구획에 대한 SN38의 노출은, 41.8 ㎍*h/mL이었다. 상기 결과는 도 19에 나타내었다. 실시예 127C가 상기 최적의 교차결합 결과를 나타냄이 확인되었다.
실시예 130
다우노루비신 로딩된 미셀의 제조 실시예 111로부터의 트리블록 공중합체(아스파르트 산 코어 블록) 및 물(2 L)는 4 L 비커에 첨가되었고, 균질 용액(homogeneous solution)이 존재할 때까지 교반되었다. 다우노루비신 염산염(Daunorubicin hydrochloride)(301 mg)는 4:1 디클로로메탄:메탄올(60 mL)에 현탁된 다음에, 트리에틸아민(82 uL)을 첨가하였다. 결과적으로 생성된 다우노루비신 현탁액은 수용액에 빠르게 교반되면서 한방울씩 첨가되었다. 상기 결과적으로 생성된 용액은 박(foil)으로 덮히고, 추가적인 8 시간 동안 교반되었다. 상기 용액은 0.22 mm 필터를 통해 여과된 다음에, 동결건조되어, 붉은 분말로서 2.95 g (89 % 수득률)가 수득되었다. 이러한 물질의 일부가 5mM FeCl3로 보충된 pH 7.5, 20 mM 트리스에서 25 mg/mL 중합체 농도에서 용해되었다. 균질화된 용액이 존재할 때에, 상기 용액은 1 N NaOH로 8.0 으로 조절된 다음에 밤새 교반되었다. 상기 용액은 냉동되었고, 동결건조되어, 암적색 분말로서 수득되었다.
실시예 131
아미노프테린 미셀의 제조 실시예 30 mPEG12k-b-p[Glu(NHOH)10]-b-p[Asp5-co-Leu15-co-Tyr20]-Ac (800 mg)으로부터의 트리블록 공중합체는, 30 분 동안 ~ 40 ℃에서 교반시킴으로써 2 mg/mL로 물에서 용해되었다. 상기 용액은 냉각시켰고, pH 는 NaOH로 7.0 으로 조절되었다. 상기 제형에 대한 아미노프테린 공급 비율은, 상기 중합체 중량의 4 % 이었다. 유기 용액(20 % 메탄올, 80 % 디클로로메탄, 25 mg/mL 파라-톨루엔술폰산)가 초음파처리된 물 수조에서 상기 용액을 둠으로써 3.2 mg/mL 로 32 mg 아미노프테린을 용해시키는데 사용된 다음에, 가열 및 볼텍싱하고, 맑은, 황색 용액이 지속될 때까지 반복하였다. 상기 유기 용액이 냉각된 경우에, 이는 ~ 1 분 동안 10,000 RPM에서 교반 혼합하면서 상기 중합체 용액에 첨가되었다. 혼탁한, 황색 용액인, 상기 결과적으로 생성된 에멀젼은, 밤새 흄 후드에서 교반되었다. 상기 유기 용매가 증발됨으로써, 상기 용액은 보다 덜 탁하고 보다 황색이 되었다. 그 다음에, 상기 용액은 NaOH로 pHrk 7.0으로 조절되었고, 0.22 미크론 데드-엔드 필터를 통해 여과되었고, 상기 결과적으로 생성된 용액은 그리고 난 다음에, Spectrum Labs KrosFlo 접선 유동 필터레이션 및 10 kDa 디아필터레이션 막과 함께 초미세 여과되었다. 상기 용액은 2 mg/mL 중합체 농도에서 대략 20 mg/mL 중합체 농도로 농축되었고, 염화 제3철은, 10 mM의 최종 농도를 위해 상기 제형에 첨가되었다. 상기 용액의 pH 는 NaOH로 7.0으로 조절된 다음에 4 시간 동안 실온에서 교반되었다. 상기 용액은 물과 5 mg/mL 중합체 농도로 조절된 다음에, 초미세여과에 의해 대략 20 mg/mL로 농축되었다. 상기 용액은 - 40 섭씨온도로 냉동된 다음에 동결건조되었다. 상기 트리블록 공중합체와 아미노프테린의 제형은, 4 % 공급으로부터 2.5 % 중량 로딩으로, 85 % 수득률의 생산물을 결과적으로 나타내었고, 53 %의 효율적인 공정을 결과적으로 나타내었다. 상기 교차결합되지 않고 교차결합된 제형의 입자 크기는, 대략 70 nm의 단일 분포 평균 입자 크기를 나타내었다.
실시예 132
카비자탁셀 미셀의 제조 실시예 38 mPEG12k-b-p[Glu(NHOH)10]-b-p[Phe15-co-Tyr25]-Ac (300 mg)로부터의 트리블록 공중합체는 30 분 동안 ~ 40 섭씨온도에서 교반에 의해 2 mg/mL로 물에 용해되었다. 상기 용액은 냉각되었고, 상기 pH 는 NaOH로 7.0 으로 조절되었다. 상기 제형에 대한 카바지탁셀의 공급 비율은 상기 중합체 중량의 1.5 %이었다. 유기 용액(20 % 메탄올, 80 % 디클로로메탄)은, 맑고, 무색 용액이 유지될 때까지, 볼텍싱에 의해 2 mg/mL로 4.5 mg 카바지탁셀을 용해시키는데 사용되었다. 상기 유기 용액은 ~ 1 분 동안 10,000 RPM에서 교반 혼합하여 상기 중합체 용액에 첨가되었다. 상기 결과적으로 생성된 에멀졀은, 밤새 흄 후드에서 교반되었다. 그 다음날, 상기 용액은 0.22 미크론 데드 엔드 필터를 통해 여과되었고, 결과적으로 생성된 용액은, Spectrum Labs KrosFlo 접선 유동 필터레이션 시스템 및 10 kDa 디아필터레이션 막으로 초미세여과되었다. 상기 용액은 2 mg/mL 중합체 농도에서 대략 20 mg/mL 중합체 농도로 농축되었고, 염화 제3철은 10 mM의 최종 농도에 대해 상기 제형에 첨가되었다. 상기 용액의 pH 는 NaOH로 7.0 으로 조절되었고, 4 시간 동안 실온에서 교반되었다. 상기 용액은 물로 5 mg/mL 중합체 농도로 조절된 다음에, 초미세여과에 의해 대략 20 mg/mL로 농축되었다. 상기 용액은 - 40 섭씨온도로 냉동되었고, 동결건조되었다. 상기 카바지탁셀 제형에 대한 중량 로딩은 1.5 % 공급으로부터 1 % 이었다. 상기 제형의 입자 크기는 직경에서 62 nm이었다. 상기 교차결합되지 않은 제형의 캡슐화 투석은, 20 mg/mL에서 상기 CMC 초과에서 68 % 유지, 및 상기 교차결합된 제형이 0.2 mg/mL로 희석된 경우에, 72 % 유지를 결과적으로 나타내었다. 도 20은, 교차결합된 카바자탁셀 미셀에 대한 pH 의존적인 교차결합 투석의 결과를 나타내었다.
실시예 133
에포틸론 D 미셀의 제조 실시예 98 mPEG12k-b-p[Glu(NHOH)20]-b-p[Phe15-co-Tyr25]-Ac (300 mg)로부터의 트리블록 공중합체는, 30 분 동안 ~ 40 섭씨 온도에서 교반시킴으로써 2 mg/mL로 물에 용해되었다. 상기 용액은 냉각되었고, pH는 NaOH로 7.0 으로 조절되었다. 상기 제형에 대한 에포틸론 D 공급 비율은 상기 중합체 중량의 2 % 이었다. 유기 용액(20 % 메탄올, 80 % 디클로로메탄)은, 맑고, 무색 용액이 지속될 때까지, 볼텍싱에 의해 2 mg/mL에서 6 mg 에포틸론 D를 용해시키는데 사용되었다. 그리고 난 다음에, 상기 유기 용액은 ~ 1 분 동안 10,000 RPM에서 교반 혼합하면서 상기 중합체 용액에 첨가되었다. 상기 결과적으로 생성된 에멀젼은 밤새 흄 후드에서 교반되었다. 그 다음날에, 상기 용액은 0.2 미크론 데드 엔드 필터를 통해 여과되었고, 상기 결과적으로 생성된 용액은, Spectrum Labs KrosFlo 접선 유동 필터레이션 시스템 및 10 kDa 디아필터레이션 막으로 초미세여과되었다. 상기 용액은 2 mg/mL 중합체 농도에서 대략 20 mg/mL 중합체 농도로 농축되었고, 염화 제3철은 10 mM의 최종 농도에 대해 상기 제형에 첨가되었다. 상기 용액의 pH 는 NaOH로 6.0 으로 조절되었고, 4 시간 동안 실온에서 교반되었다. 상기 용액은 물로 5 mg/mL 중합체 농도로 조절된 다음에, 초미세여과에 의해 대략 20 mg/mL로 농축되었다. 상기 용액은 - 40 섭씨온도로 냉동되었고, 동결건조되었다. 상기 카바지탁셀 제형에 대한 중량 로딩은 2 % 공급으로부터 1.5 %의 중량 로딩을 갖는 71 % 효율 공정을 결과적으로 나타내었다. 상기 제형의 입자 크기는 직경에서 82 nm이었다. 상기 교차결합되지 않은 제형의 캡슐화 투석은, 20 mg/mL에서 상기 6 시간 초과에서 에포틸론 D의 88 % 유지를 결과적으로 나타내었다. 상기 교차결합되지 않은 제형의 캡슐화 투석은 20 mg/mL에서 6 시간 초과로 에포틸론 D의 88 % 유지를 결과적으로 나타내었고, 0.2 mg/mL의 희석은 6 시간 초과의 상기 약물의 10 % 유지를 결과적으로 나타내었다.
실시예 134
베르베린 미셀의 제조 실시예 98 mPEG12k-b-p[Glu(NHOH)10]-b-p[Asp5-co-Leu15-co-Tyr20]-Ac(300 mg)로부터의 트리블록 공중합체는, 30 분 동안 ~ 40 섭씨 온도에서 교반시킴으로써 2 mg/mL로 물에서 용해되었다. 상기 용액은 냉각시켰고, pH는 0.1 N NaOH로 7.0 으로 조절되었다. 상기 제형에 대한 베르베린 공급 비율은 상기 중합체 중량의 5 % 이었다. 유기 용액(20 % 메탄올, 80 % 디클로로메탄)은, 맑고, 황색 용액이 지속될 때까지, 볼텍싱에 의해 6 mg/mL에서 15 mg 베르베린을 용해시키는데 사용되었다. 그리고 난 다음에, 상기 유기 용액은 ~ 1 분 동안 10,000 RPM에서 교반 혼합하면서 상기 중합체 용액에 첨가되었다. 혼탁한, 황색 용액인, 상기 결과적으로 생성된 에멀젼은 밤새 흄 후드에서 교반되었다. 상기 유기 용매가 증발됨으로써, 상기 용액은 덜 혼탁하고, 보다 황색이 되었다.그 다음날에, 상기 용액은 0.2 미크론 데드 엔드 필터를 통해 여과되었고, 상기 결과적으로 생성된 용액은, Spectrum Labs KrosFlo 접선 유동 필터레이션 시스템 및 10 kDa 디아필터레이션 막으로 초미세여과되었다. 상기 용액은 2 mg/mL 중합체 농도에서 대략 20 mg/mL 중합체 농도로 농축되었고, 염화 제3철은 10 mM의 최종 농도에 대해 상기 제형에 첨가되었다. 상기 용액의 pH 는 NaOH로 7.0으로 조절되었고, 4 시간 동안 실온에서 교반되었다. 상기 용액은 물로 5 mg/mL 중합체 농도로 조절된 다음에, 초미세여과에 의해 대략 20 mg/mL로 농축되었다. 상기 용액은 - 40 섭씨온도로 냉동되었고, 동결건조되었다. 상기 베르베린 제형에 대한 중량 로딩은, 상기 프리 약물의 표준 곡선에 대해 비교된 상기 제형의 HPLC 분석에 의해 결정된 바와 같이, 5 % 공급으로부터 4 %이었다. 상기 제형의 캡슐화 효율은 72 % 이었다. 동적 광 산란에 의한 입자 크기 분석은, 상기 교차결합된 샘플에 대한 직경에서 66.7 nm, 및 상기 교차결합되지 않는 샘플에 대한 72.5 nm의 평균 입자 크기를 결과적으로 나타내었다.
실시예 135
비노렐빈 미셀의 제조 실시예 38로부터의 트리블록 공중합체(300 mg)는, 30 분 동안 ~ 40 섭씨 온도에서 교반됨으로써 2 mg/mL로 물에 용해되었다. 상기 용액은 냉각되었고, pH는 0.1 N NaOH로 7.0 으로 조절되었다. 상기 제형에 대한 비노렐빈 공급 비율은 상기 중합체 중량의 5 % 이었다. 유기 용액(20 % 메탄올, 80 % 디클로로메탄)은, 맑고, 무색 용액이 지속될 때까지, 볼텍싱에 의해 6 mg/mL에서 15 mg 비노렐빈을 용해시키는데 사용되었다. 그리고 난 다음에, 상기 유기 용액은 ~ 1 분 동안 10,000 RPM에서 교반 혼합하면서 상기 중합체 용액에 첨가되었다. 혼탁한 용액인 상기 결과적으로 생성된 에멀전은 밤새 흄 후드에서 교반되었다. 상기 유기 용매가 증발됨으로써, 상기 용액은 보다 덜 혼탁하고 무색이 되었다. 그 다음날에, 상기 용액은 0.2 미크론 데드 엔드 필터를 통해 여과되었고, 상기 결과적으로 생성된 용액은, Spectrum Labs KrosFlo 접선 유동 필터레이션 시스템 및 10 kDa 디아필터레이션 막으로 초미세여과되었다. 상기 용액은 2 mg/mL 중합체 농도에서 대략 20 mg/mL 중합체 농도로 농축되었고, 염화 제3철은 10 mM의 최종 농도에 대해 상기 제형에 첨가되었다. 상기 용액의 pH 는 NaOH로 7.0으로 조절되었고, 4 시간 동안 실온에서 교반되었다. 상기 용액은 물로 5 mg/mL 중합체 농도로 조절된 다음에, 초미세여과에 의해 대략 20 mg/mL로 농축되었다. 상기 용액은 - 40 섭씨온도로 냉동되었고, 동결건조되었다.
실시예 136
에베로리 ( Everolimus ) 미셀의 제조 실시예 38로부터의 트리블록 공중합체는, 30 분 동안 ~ 40 섭씨 온도에서 교반시킴으로써 2 mg/mL로 물에 용해되었다. 상기 용액은 냉각되었고, pH는 0.1N NaOH로 7.0 으로 조절되었다. 상기 제형에 대한 에베로리 공급 비율은 상기 중합체 중량의 5 % 이었다. 유기 용액(20 % 메탄올, 80 % 디클로로메탄)은, 맑고, 무색 용액이 지속될 때까지, 볼텍싱에 의해 6 mg/mL에서 15 mg 에베로리를 용해시키는데 사용되었다. 그리고 난 다음에, 상기 유기 용액은 ~ 1 분 동안 10,000 RPM에서 교반 혼합하면서 상기 중합체 용액에 첨가되었다. 상기 결과적으로 생성된 에멀젼은 밤새 흄 후드에서 교반되었다. 상기 유기 용매가 증발됨으로써, 상기 용액은 보다 덜 혼탁하고 무색이 되었다. 그 다음날에, 상기 용액은 0.2 미크론 데드 엔드 필터를 통해 여과되었고, 상기 결과적으로 생성된 용액은, Spectrum Labs KrosFlo 접선 유동 필터레이션 시스템 및 10 kDa 디아필터레이션 막으로 초미세여과되었다. 상기 용액은 2 mg/mL 중합체 농도에서 대략 20 mg/mL 중합체 농도로 농축되었고, 염화 제3철은 10 mM의 최종 농도에 대해 상기 제형에 첨가되었다. 상기 용액의 pH 는 NaOH로 7.0으로 조절되었고, 4 시간 동안 실온에서 교반되었다. 상기 용액은 물로 5 mg/mL 중합체 농도로 조절된 다음에, 초미세여과에 의해 대략 20 mg/mL로 농축되었다. 상기 용액은 - 40 섭씨온도로 냉동되었고, 동결건조되었다.
실시예 137
프리 다우노루비신과 비교된 다우노루비신 미셀의 랫 약물동력학 목 정맥 카테터를 소유하는 Fisher 랫은, 2 mL의 주사 용량으로 패스트 Ⅳ 볼루스(fast IV bolus)에 의해 10 mg/kg의 프리 다우노루비신, 교차결합된(히드록삼산) 다우노루비신 미셀(실시예 113에 따라 제조됨) 및 카르복실산 교차결합된 다우노루비신 로딩된 미셀(실시예 130에 따라 제조됨)으로 주사되었다. 약물 투여를 위한 상기 전달 비히클은 등장액(isotonic saline)이었다. 랫 혈액은, 1 분, 5분, 15 분, 1 시간, 4 시간, 8 시간 및 24 시간의 시점에서 심장 구멍(heart puncture)에 의해 K2-EDTA 튜브 내로 상기 카테터로부터 수집되었다. 플라즈마는 5 분 동안 1000 RPM에서 원심분리에 의해 분리되었고, 150 uL의 추출 용액(얼음 냉각 메탄올/100 ng/mL 다우노루비신 내부 표준)이 50 uL의 각각의 플라즈마 샘플에 첨가되었다. 샘플은 그리고 난 다음에 10 분 동안 볼텍스되었고, 10 분 동안 13,000 RPM 로 원심분리되었고, 150 uL의 상청액은 분석을 위해 HPLC 바이알로 이동되었다. 샘플은 2475 형광 검출기(Ex = 470 nm; Em = 580)가 갖춰진 Waters Alliance 2695상에서 분석되었다. 5 mL 샘플 주사는, 10 mM 인산 완충용액(pH=1.4), 메탄올 및 아세토니트릴(완충용액/메탄올/아세토니트릴에 대한 70/10/20에서 40/10/50까지의 기울기는 8 분을 초과하여 제조되었음)의 분 당 0.750 mL의 유동 속도를 갖는 30 ℃에서 Waters 4 ㎛ Nova Pak C18 (3.9 x 150 mm) 내로 제조되었다. 이러한 조건 하에서 5.9 분에서 용리분리된 분석물은 상기 내부 표준에 대해 정상화되었고, 7 개의 표준으로 구성된 표준 곡선을 사용하여 양을 평가하였다. 상기 약동학적 파라미터는 하기의 표에 요약되어 있고, 상기 곡선은 도 21에 기재되어 있다. 히드록삼산 제형에 의해 전달된 상기 농도 대 시간 곡선(AUC) 하의 영역에 의해 결정된 바와 같은 상기 플라즈마 구획에 대한 다우노루비신의 노출은, 383.6 ㎍*h/mL이었다. 상기 제형에 의해 상기 플라즈마로 전달된 다우노루비신의 말단 (제거) 반감기는 3.9 시간이었다. 이는, 2.4 시간의 반감기 및 51.8 ㎍*h/mL의 AUC를 나타낸 상기 카르복실산 제형 뿐만 아니라, 3.4 시간의 반감기 및 1.3 ㎍*h/mL의 AUC를 나타내는 상기 프리 약물에 대해 비교되었다. 따라서, 상기 카르복실산 교차결합된 제형은, 프리 약물보다 40 배 더 높은 노출을 가지고, 상기 히드록삼산 제형은 상기 프리 약물보다 295 배 더 높은 노출을 가지고 있다(the carboxylic acid crosslinked formulations had an exposure of 40 times higher than free drug, and the hydroxamic acid formulation had an exposure of 295 times better than the free drug).
Figure 112014095982417-pct00204

실시예 138
교차결합된 카비자탁셀 미셀의 랫 약물동태학 목 정맥 카테터를 소유하는 Fisher 랫은, 2 mL의 주사 용량으로 패스트 Ⅳ 볼루스(fast IV bolus)에 의해 5 mg/kg의 프리 카비자탁셀, 교차결합된 카비자탁셀 미셀(실시예 132에 따라 제조됨) 및 카르복실산 교차결합된 다우노루비신 로딩된 미셀(실시예 130에 따라 제조됨)으로 주사되었다. 약물 투여를 위한 상기 전달 비히클은 등장액이었다. 랫 혈액은, 1 분, 5분, 15 분의 시점에서 심장 구멍(heart puncture)에 의해 K2-EDTA 튜브 내로 상기 카테터로부터 수집되었다. 플라즈마는 5 분 동안 1000 RPM에서 원심분리에 의해 분리되었고, 150 uL의 추출 용액(이 50 uL의 각각의 플라즈마 샘플에 첨가되었다. 샘플은 그리고 난 다음에 10 분 동안 볼텍스되었고, 10 분 동안 13,000 RPM 로 원심분리되었고, 150 uL의 상청액은 분석을 위해 HPLC 바이알로 이동되었다. 도 22 는, 테스트 물품 투여 후에 첫 번째 15 분 동안에 상기 랫 플라즈마에서 카바지탁셀의 농도를 나타내었다. 15 분을 초과하여 상기 플라즈마 구획에 대한 카바지탁셀의 노출은, 1.2 ㎍/mL의 CMax와 함께, 상기 프리 약물에 대한 0.2 ㎍*h/mL 노출과 비교된, 44.5 ㎍/mL의 CMax를 갖는, 10 ㎍*h/mL이었다.
실시예 139
SN -38 미셀의 항-종양 효능 HCT-116 대장암 세포는, 티로신 배양에 의해 채취된 ATCC 가이드라인에 따라 배양되었고, 주사를 위해 0.1 mL 당 2 백만 세포의 농도로 재현탁되었다. 마우스는, 상기 마우스의 오른쪽 측면 내로 피하로 0.1 mL(즉, 2 백만 세포) 주사함으로써 접종되었다. 종양이 대략 100 mm3 에 도달한 때에, 상기 마우스는, 처리군(treatment groups) 내로 임의적으로 추출되었다. 각각의 그룹은 각 그룹 당 8 마리의 마우스로 이루어져 있다. 처리 군은, 염분 대조군; 35 mg/kg에서의 이리노테칸; 및 20, 35, 및 50 mg/kg에서의 실시예127C로부터의 SN-38 제형을 포함한다. 마우스는 꼬리 혈관 내로 패스트 Ⅳ 볼루스에 의해 투여되었고; 상기 주사 부피는 0.2 mL 이었다. 종량은 디지털 캘리퍼(digital caliper)에 의해 측정되었고, 부피(mm3)는 서식 V=(W2xL)/2를 사용하여 계산되었고, 이 식에서, 너비(W)는 가장 큰 직경 측정이고, 길이(L)은 상기 너비에 수직인 직경 측정이다. 복용 스케줄은 3 주 동안 일주일에 한번이었다(3xQW). 중합체 전달을 위한 상기 비히클은 등장액이었다. 상기 연구 동안에 임상적인 관찰은, 마우스 몸 무게, 아픈 마우스 증후군의 형태학적 관찰(탈수, 척추의 만곡, 및 눈, 생식기, 또는 피부 발진의 기회 감염), 및 상기 실험의 종료 상의 검시(necropsies)에 의해 측정된 전체 병리학상의 변화를 포함한다. 상기 성장 속도의 그래프는 도 23에 기재되어 있다. 상기 데이터는, 하루 당 46.8 mm3의 평균 성장 속도를 갖는, 상기 염분 대조군에 대해 종양 부피에서 6 배 증가를 나타내었다. 상기 중합체 대조군은, 하루 당 43.7mm3의 평균 성장 속도 및 부피에서 5.5-배 증가를 갖는, 상기 염분 대조군과 비교된 종양 성장에서의 어떠한 통계학적 차이를 나타내지 않았다(The polymer control group saw no statistical difference in tumor growth compared to the saline control group, with a 5.5-fold increase in volume and a mean growth rate of 43.7mm3 per day). 50 mg/kg 프리 약물 대조군에서의 상기 이리노데칸은, 하루에 18.9 mm3의 평균 성장 속도 및 부피에서 2.7 배 증가를 갖는, 염분과 비교된 종양 부피에서의 40 % 감소(reduction)를 나타내었다. 20 mg/kg SN-38 제형군은, 하루에 13.6 mm3의 평균 성장 속도 및 염분 대조군과 비교된 종양 부피에서 71 % 저해를 나타내었다. 35 mg/kg SN-38 제형 그룹은, 하루 당 -2.4 mm3의 평균 종양 퇴화 속도(mean tumor regression rate) 및 크기에서 1.5 배 감소를 갖는 종양 부피에서 30 % 퇴행을 나타내었다. 50 mg/kg SN-38 제형은, 하루 당 -3.8 mm3의 평균 종양 퇴화 속도 및 크기에서 2.1 배의 감소를 갖는 종양 부피에서 47.6 % 퇴행을 나타내었다.
실시예 140
교차결합된 아미노프테린 미셀의 약물 동태학 및 생물분류( Biodistribution ) 암컷 무흉선 마우스(Female athymic nude mice)는 Harlan (Indianapolis, IN)에 의해 제공되었다. 마우스는 무게에서 12 내지 15, 4 내지 5 주의 나이에서 받았다. 상기 마우스는 마이크로아이이솔레이터(microisolator)에서 거주하였고, 특정한 병원균-프리 조건 하에서 유지되었다. 연구 암컷 마우스는, OVCAR-3 종양 세포의 현탁액(대략 5.0 x 106 세포/마우스)을 포함하는 0.1 ml의 50% RPMI/50% MatrigelTM(BD Biosciences, Bedford, MA) 혼합물과 함께 오른쪽 측면에 피하주사로 접종되었다. 종양은 캘리퍼를 사용하여 측정되었고, 종양 무게는 서식 V=(W2xL)/2를 사용하여 계산되었고, 이 식에서, 너비(W)는 가장 큰 직경 측정이고, 길이(L)은 상기 너비에 수직인 직경 측정이다. 연구 개시 일은, 종양에서의 다양한 성장 패턴으로 인한 그룹에 의해 시차를 두었다(staggered). 동물은, 종양 부피가 150 내지 250 mm3로 도달한 경우에, 20 mg/kg로 테스트 물질, 실시예 131로부터의 아미노프테린 미셀을 투여되었다. 처리 후(시점 당 4 마리의 마우스) 5 분, 15 분, 1, 4, 12, 24, 및 48 시간에서 각각의 마우스를 안락사시키고, 플라즈마, 종양, 비장, 간 및 폐 표본이 수집되었다. 헤파린처리된 마우스 플라즈마 및 조직 샘플(간, 폐, 비장 및 종양)은, 텐덤 질량 스펙트럼 검출(tandem mass spectral detection)(LC-MS/MS)로 고압력 액체 크로마토그래피 검정을 사용하여 분석되었다. 캘리브레이터(Calibrator) 및 품질 관리(QC) 샘플은, 소듐 헤타린처리된 인간 플라즈마 내로 아미노프테린을 섞음으로써 제조되었다. 조직 샘플은 50% 메탄올에서 균질화되었고, 분석될 때까지 - 80 ℃로 냉동 보관되었다. 각각의 연구 매트릭스 타입은, 사본의 캘리브레이션 및 QC 샘플에 따라 분리 분석적인 배치에서 분석되었다(Each study matrix type was analyzed in a separate analytical batch along with duplicate calibration and QC samples). 100 μL 앨리쿼트의 상기 캘리브레이터, QC, 블랭크(blank), 또는 연구 샘플(플라즈마 또는 조직 세포분쇄액)은, 단백질을 침전시키기 위해, 마이크로원심분리 튜브(microcentrifuge tube)에서, 50.0 uL의 희석 완충용액 [0.1% 폴산을 포함하는 1.0 mM 암모늄 포르메이트(ammonium formate)]과 혼합되었고, 그 다음에 내부 표준(IS; 메트로트렉세이트 50.0 ng/ml)을 함유하는 400 μL의 아세토니트릴을 혼합하였다. 상기 튜브는 덮혔고, 볼텍싱되었고, 5 분 동안 분해되었고, 5 분 동안 4 ℃ 및 14,000 rpm에서 원심분리되었다. 상기 상청액의 100 uL 앨리쿼트는, 1.5 mL의 희석 완충용액으로 희석되었고, 혼합 볼텍싱 되었고, 20 uL는 상기 LC-MS/MS 시스템 내로 주입되었다. 각각의 샘플의 상기 농도는 표준 곡선에 대해 비교에 의해 비교함으로써 결정되었다. 각각의 구획에 대한 농도-시간 곡선이 구성되었고, 약물동력학 데이터는 각각의 구획에 대해 계산되었다. 상기 평균 플라즈마 및 조직 PK 프로파일은 도 24에 기재될 수 있다. 플라즈마 NCA는 37.65 시간이 되도록 아미노프테린의 평균 반감기를 결정되었다. 상기 플라즈마에서 상기 평균 AUC0-48hr는 12571 ng*hr/ml인 것으로 발견된었다. 종양, 폐 및 비장에서 아미노프레틴의 상기 평균 반감기가, 각각 9.65, 11153및 51.87 시간인 것으로 결정되었다. 상기 간의 농도의 상기 말단 기울기는, 48 시간에서, 상기 농도가 12 및 24 시간에서 보다 더 높았기 때문에, 반-감기 계산에 대해 가능하지 않았다(The terminal slope of the liver concentrations did not allow for a half-life calculation since at 48 hours the concentration was higher than at 12 and 24 hours). 종양, 폐, 비장 및 간의 상기 평균 AUC0-48hr는 각각 9559, 4276, 4586, and 9909 ng*hr/g이 된 것으로 발견되었다.
실시예 141
교차결합된 아미노프테린 미셀의 항-종양 효율 상기 MFE-296 인간 자궁내막 종양 세포주는, ATCC로부터 받았고, ATCC에 따라 배양되었다. 암컷 무흉선 NCR 마우스(athymic NCR nude mice)(CrTac:NCr-Foxn1nu)가 Taconic에 의해 제공되었다. 암컷 무흉선 마우스는, MFE-296 종양 세포의 현탁액(대략 1 x 107 세포/마우스)을 함유하는 0.1 ml의 a 50% RPMI 1640 / 50% MatrigelTM(BD Biosciences, Bedford, MA) 혼합물과 함께 오른쪽 측면에 피하주사로 접종되었다. 접종 후의 20 일에, 종양은 캘리퍼를 사용하여 측정되었고, 종양 무게는 서식 V=(W2xL)/2를 사용하여 계산되었고, 이 식에서, 너비(W)는 가장 큰 직경 측정이고, 길이(L)은 상기 너비에 수직인 직경 측정이다. 80내지 257 mm3의 종양 크기를 가는 50 마리의 마우스는, 임의적인 평형화에 의해 대략 143 mm3의 평균을 갖는 각각의 10 마리의 마우스의 5 개의 군으로 임의추출되었다. 상기 마우스가 임의추출화된 경우에 몸무게가 기록되었고, 종양 측정과 함께 이후에 일주일 당 두 번 채취되었다. 처리 군(Treatment groups)은, 중합체 대조군, 1.5 mg/kg에서의 프리 아미노프테린, 1.5 mg/kg 및 7.5 mg/kg에서의 실시예 131로부터 아미노프테린 미셀을 포함한다. 처리는, 꼬리 혈관 정맥내 투여에 의해 3 주 동안 일주일에 한 번, 1 일, 8 일 및 15 일에 수행되었다. 주사는 0.2 mL이었고, 상기 비히클은 등장액이었다. 각각의 군에 대한 상기 종양 성장의 그래프는 도 25에 기재되어 있다. 상기 중합체 대조군은 28일에 973.9 mg의 평균 종양 중량에 도달되었다. 이러한 군은 상기 연구 동안에 주목할 만한 몸무게 손실을 경험하지 않았다. 어떠한 부작용도 관찰되지 않았다. 1.5 mg/kg에서 아미노프테린 제형으로 처리는, 28일에 1330.4 mg의 평균 종양 몸무게를 결과적으로 나타내었다. 28일에 비히클 대조와 비교된 경우에, 이러한 그룹은 어떠한 보고할 수 있는 저해를 생산하지 않았다. 이러한 군은 상기 연구 동안에 주목할 만한 몸무게 손실을 나타내지 않았다. 어떠한 부작용의 투여 반응도 관찰되지 않았다. 상기 아미노프테린 제형 7.5 mg/kg으로의 처리는 28 일에 599.7 mg의 평균 종양 무게를 결과적으로 나타내었다. 이러한 그룹은 28 일에 상기 비히클 대조와 비교된 경우에 44.8%의 저해를 생산하였다. 이러한 그룹은 4 일에 4.3 %의 최대를 갖는 가벼운 손실을 경험하였다. 몸무게는 15 일에 완전하게 회복되었다. 어떠한 부작용 투여 반응도 관찰되지 않았다. 프리 아미노프테린 1.5 mg/kg과의 처리는, 28 일에 1115.1 mg의 평균 중량 무게를 결과적으로 나타내었다. 이러한 그룹은 28일에 상기 비히클 대조군과 비교한 경우에, 어떠한 보고할 수 있는 저해를 생산하지 않았다. 종양 무게에서의 어떠한 현저한 차이도, 28일에 상기 비히클 대조군과 비교된 경우에 관찰되지 않았다. 이러한 군은 상기 연구 동안에 어떠한 보고할 수 있는 몸무게 손실을 경험하지 않았다.

Claims (14)

  1. 트리블록 공중합체를 포함하는 미셀(micelle)로서,
    상기 미셀은 약물-로딩된 내부 코어, 교차결합된 외부 코어, 및 친수성 셀(hydrophilic shell)을 가지고, 상기 트리블록 공중합체는 화학식 Ⅶ의 것이고:
    [화학식 Ⅶ]
    Figure 112015125833024-pct00252


    이 식에서,
    n 은 20 내지 500 이고;
    m 은 1 또는 2 이고;
    x1 은 1 내지 20 이고;
    x2 는 0 내지 20 이고;
    y 는 5 내지 100 이고;
    Ry 는, 티로신, 페닐알라닌, 세린, 아스파르트산, 글루탐산, 류신 및 벤질 글루타메이트로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 천연 또는 비천연 아미노산 곁사슬 기로부터 선택된 것이고;
    M 은 금속 이온이고;
    RT 는 -Z(CH2CH2Y)p(CH2)tR3 이고, 여기서:
    Z 는 -O-, -S-, -C≡C-, 또는 -CH2-이고;
    각각의 Y 는 독립적으로 -O- 또는 -S-이고;
    p 는 0 내지 10 이고;
    t 는 0 내지 10 이고;
    각각의 R3 은 독립적으로, -N3, -CN, 모노-보호된 아민, 디-보호된 아민, 보호된 알데히드, 보호된 히드록실, 보호된 카르복실산, 보호된 티올, 9 내지 30 원 크라운 에테르, 또는 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4 헤테로원자를 갖는, 지방족, 5 내지 8 원 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 고리, 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 5 헤테로원자를 갖는, 8 내지 10 원 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 비시클릭 고리로부터 선택된 임의적으로 치환된 기로부터 선택된 것이고; 및
    상기 약물은 7-에틸-10-히드록시-캄토테신인 것인, 미셀.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 트리블록 공중합체는 화학식 Ⅶ의 것인, 미셀:
    Figure 112015072238462-pct00253
    .
  3. 트리블록 공중합체를 포함하는 미셀로서,
    상기 미셀은 약물-로딩된 내부 코어, 교차결합된 외부 코어, 및 친수성 셀을 가지고, 상기 트리블록 공중합체는 화학식 Ⅶ의 것이고:
    [화학식 Ⅶ]
    Figure 112015125833024-pct00254


    이 식에서,
    n 은 20 내지 500 이고;
    m 은 1 또는 2 이고;
    x1 은 1 내지 20 이고;
    x2 는 0 내지 20 이고;
    y 는 5 내지 100 이고;
    Ry 는, 티로신, 페닐알라닌, 세린, 아스파르트산, 글루탐산, 류신 및 벤질 글루타메이트로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 천연 또는 비천연 아미노산 곁사슬 기로부터 선택된 것이고;
    M 은 금속 이온이고;
    RT 는 -Z(CH2CH2Y)p(CH2)tR3 이고, 여기서:
    Z 는 -O-, -S-, -C≡C-, 또는 -CH2-이고;
    각각의 Y 는 독립적으로 -O- 또는 -S-이고;
    p 는 0 내지 10 이고;
    t 는 0 내지 10 이고;
    각각의 R3은 독립적으로, -N3, -CN, 모노-보호된 아민, 디-보호된 아민, 보호된 알데히드, 보호된 히드록실, 보호된 카르복실산, 보호된 티올, 9 내지 30 원 크라운 에테르, 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4 헤테로원자를 갖는, 지방족, 5 내지 8 원 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 고리, 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 5 헤테로원자를 갖는, 8 내지 10 원 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 비시클릭 고리로부터 선택된 임의적으로 치환된 기로부터 선택된 것이고; 및
    상기 약물은 아미노프테린인 것인, 미셀.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 트리블록 공중합체는 화학식 Ⅶ의 것인, 미셀:
    Figure 112015072238462-pct00255
    .
  5. 트리블록 공중합체를 포함하는 미셀로서,
    상기 미셀은, 약물-로딩된 내부 코어, 교차결합된 외부 코어, 및 친수성 셀을 가지고, 상기 트리블록 공중합체는 화학식 Ⅶ의 것이다:
    [화학식 Ⅶ]
    Figure 112015125833024-pct00256


    이 식에서,
    n 은 20 내지 500 이고;
    m 은 1 또는 2 이고;
    x1 은 1 내지 20 이고;
    x2 는 0 내지 20 이고;
    y 는 5 내지 100 이고;
    Ry 는, 티로신, 페닐알라닌, 세린, 아스파르트산, 글루탐산, 류신 및 벤질 글루타메이트로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 천연 또는 비천연 아미노산 곁사슬 기로부터 선택된 것이고;
    M 은 금속 이온이고;
    RT 는 -Z(CH2CH2Y)p(CH2)tR3 이고, 여기서:
    Z 는 -O-, -S-, -C≡C-, 또는 -CH2-이고;
    각각의 Y 는 독립적으로 -O- 또는 -S-이고;
    p 는 0 내지 10 이고;
    t 는 0 내지 10 이고;
    각각의 R3 은 독립적으로, -N3, -CN, 모노-보호된 아민, 디-보호된 아민, 보호된 알데히드, 보호된 히드록실, 보호된 카르복실산, 보호된 티올, 9 내지 30 원 크라운 에테르, 또는 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4 헤테로원자를 갖는, 지방족, 5 내지 8 원 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 고리, 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 5 헤테로원자를 갖는, 8 내지 10 원 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 비시클릭 고리로부터 선택된 임의적으로 치환된 기로부터 선택된 것이고; 및
    상기 약물은 에포틸론 D 인 것인, 미셀.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 트리블록 공중합체는 화학식 Ⅶ의 것인, 미셀:
    Figure 112015072238462-pct00257
    .
  7. 트리블록 공중합체를 포함하는 미셀로서,
    상기 미셀은, 약물-로딩된 내부 코어, 교차결합된 외부 코어, 및 친수성 셀을 가지고, 상기 트리블록 공중합체는 화학식 Ⅶ의 것이고:
    [화학식 Ⅶ]
    Figure 112015125833024-pct00258


    이 식에서,
    n 은 20 내지 500 이고;
    m 은 1 또는 2 이고;
    x1 은 1 내지 20 이고;
    x2 는 0 내지 20 이고;
    y 는 5 내지 100 이고;
    Ry 는, 티로신, 페닐알라닌, 세린, 아스파르트산, 글루탐산, 류신 및 벤질 글루타메이트로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 천연 또는 비천연 아미노산 곁사슬 기로부터 선택된 것이고;
    M 은 금속 이온이고;
    RT 는 -Z(CH2CH2Y)p(CH2)tR3 이고, 여기서:
    Z 는 -O-, -S-, -C≡C-, 또는 -CH2-이고;
    각각의 Y 는 독립적으로 -O- 또는 -S- 이고;
    p 는 0 내지 10 이고;
    t 는 0 내지 10 이고;
    각각의 R3은 독립적으로, -N3, -CN, 모노-보호된 아민, 디-보호된 아민, 보호된 알데히드, 보호된 히드록실, 보호된 카르복실산, 보호된 티올, 9 내지 30 원 크라운 에테르, 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4 헤테로원자를 갖는, 지방족, 5 내지 8 원 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 고리, 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 5 헤테로원자를 갖는, 8 내지 10 원 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 비시클릭 고리로부터 선택된 임의적으로 치환된 기로부터 선택된 것이고; 및
    상기 약물은 다우노루비신인 것인, 미셀.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 트리블록 공중합체는 화학식 Ⅶ의 것인, 미셀:
    Figure 112015072238462-pct00259
    .
  9. 트리블록 공중합체를 포함하는 미셀로서,
    상기 미셀은 약물-로딩된 내부 코어, 교차결합된 외부 코어, 및 친수성 셀을 가지고, 상기 트리블록 공중합체는 화학식 Ⅶ의 것이고:
    [화학식 Ⅶ]
    Figure 112015125833024-pct00260

    이 식에서,
    n 은 20 내지 500 이고;
    m 은 1 또는 2 이고;
    x1 은 1 내지 20 이고;
    x2 는 0 내지 20 이고;
    y 는 5 내지 100 이고;
    Ry 는, 티로신, 페닐알라닌, 세린, 아스파르트산, 글루탐산, 류신 및 벤질 글루타메이트로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 천연 또는 비천연 아미노산 곁사슬 기로부터 선택된 것이고;
    M 은 금속 이온이고;
    RT 는 -Z(CH2CH2Y)p(CH2)tR3 이고, 여기서:
    Z 는 -O-, -S-, -C≡C-, 또는 -CH2-이고;
    각각의 Y 는 독립적으로 -O- 또는 -S-이고;
    p 는 0 내지 10 이고;
    t 는 0 내지 10 이고;
    각각의 R3 은 독립적으로, -N3, -CN, 모노-보호된 아민, 디-보호된 아민, 보호된 알데히드, 보호된 히드록실, 보호된 카르복실산, 보호된 티올, 9 내지 30 원 크라운 에테르, 또는 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4 헤테로원자를 갖는, 지방족, 5 내지 8 원 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 고리, 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 5 헤테로원자를 갖는, 8 내지 10 원 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 비시클릭 고리로부터 선택된 임의적으로 치환된 기로부터 선택된 것이고; 및
    상기 약물은 베르베린인 것인, 미셀.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 트리블록 공중합체는 화학식 Ⅶ의 것인, 미셀:
    Figure 112015072238462-pct00261
    .
  11. 트리블록 공중합체를 포함하는 미셀로서,
    상기 미셀은 약물-로딩된 내부 코어, 교차결합된 외부 코어, 및 친수성 셀을 가지고, 상기 트리블록 공중합체는 화학식 Ⅶ의 것이고:
    [화학식 Ⅶ]
    Figure 112015125833024-pct00262


    이 식에서,
    n 은 20 내지 500 이고;
    m 은 1 또는 2 이고;
    x1 은 1 내지 20 이고;
    x2 는 0 내지 20 이고;
    y 는 5 내지 100 이고;
    Ry 는, 티로신, 페닐알라닌, 세린, 아스파르트산, 글루탐산, 류신 및 벤질 글루타메이트로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 천연 또는 비천연 아미노산 곁사슬 기로부터 선택된 것이고;
    M 은 금속 이온이고;
    RT 는 -Z(CH2CH2Y)p(CH2)tR3 이고, 여기서:
    Z 는 -O-, -S-, -C≡C-, 또는 -CH2-이고;
    각각의 Y 는 독립적으로 -O- 또는 -S-이고;
    p 는 0 내지 10 이고;
    t 는 0 내지 10 이고; 및
    각각의 R3 은 독립적으로, -N3, -CN, 모노-보호된 아민, 디-보호된 아민, 보호된 알데히드, 보호된 히드록실, 보호된 카르복실산, 보호된 티올, 9 내지 30 원 크라운 에테르, 또는 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4 헤테로원자를 갖는, 지방족, 5 내지 8 원 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 고리, 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 5 헤테로원자를 갖는, 8 내지 10 원 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 비시클릭 고리로부터 선택된 임의적으로 치환된 기로부터 선택된 것이고; 및
    상기 약물은 카바지탁셀인 것인, 미셀.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 트리블록 공중합체는 화학식 Ⅶ의 것인, 미셀:
    Figure 112015072238462-pct00263
    .
  13. 트리블록 공중합체를 포함하는 미셀로서,
    상기 미셀은 약물-로딩된 내부 코어, 교차결합된 외부 코어, 및 친수성 셀을 가지고, 상기 트리블록 공중합체는 화학식 Ⅶ의 것이고:
    [화학식 Ⅶ]
    Figure 112015125833024-pct00264


    이 식에서,
    n 은 20 내지 500 이고;
    m 은 1 또는 2 이고;
    x1 은 1 내지 20 이고;
    x2 는 0 내지 20 이고;
    y 는 5 내지 100 이고;
    Ry 는, 티로신, 페닐알라닌, 세린, 아스파르트산, 글루탐산, 류신 및 벤질 글루타메이트로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 천연 또는 비천연 아미노산 곁사슬 기로부터 선택된 것이고;
    M 은 금속 이온이고;
    RT 는 -Z(CH2CH2Y)p(CH2)tR3 이고, 여기서:
    Z 는 -O-, -S-, -C≡C-, 또는 -CH2-이고;
    각각의 Y 는 독립적으로 -O- 또는 -S-이고;
    p 는 0 내지 10 이고;
    t 는 0 내지 10 이고;
    각각의 R3 은 독립적으로, -N3, -CN, 모노-보호된 아민, 디-보호된 아민, 보호된 알데히드, 보호된 히드록실, 보호된 카르복실산, 보호된 티올, 9 내지 30 원 크라운 에테르, 또는 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4 헤테로원자를 갖는, 지방족, 5 내지 8 원 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 고리, 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 5 헤테로원자를 갖는, 8 내지 10 원 포화된, 부분적으로 불포화된, 또는 아릴 비시클릭 고리로부터 선택된 임의적으로 치환된 기로부터 선택된 것이고; 및
    상기 약물은 도세탁셀인 것인, 미셀.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 트리블록 공중합체는 화학식 Ⅶ의 것인, 미셀:
    Figure 112015072238462-pct00265
    .
KR1020147028330A 2012-04-11 2013-03-15 안정된 미셀을 위한 블록 공중합체 KR101607422B1 (ko)

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