JP6232544B2 - サイトメガロウイルスの治療のための組成物及び方法 - Google Patents

Description

[0002]ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、β−ヘルペスウイルスは、遍在的に存在する病原体である。免疫が保たれている人では、ＨＣＭＶ感染は、普通は気づかれない、せいぜい軽度の非特異的な症状を有する。それに反して、特定のリスク群、例えば、ＡＩＤＳ患者又は移植レシピエントなどの免疫抑制患者、また出生前感染後では、ＨＣＭＶ感染は、重篤な徴候を有する（Ｓｔａｒａｓ ＳＡら、２００６年 Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ４３巻（９号）：１１４３〜５１頁；Ｈｅｂａｒｔ Ｈら、２００４年 Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６５巻（５号）：４３２〜６頁；Ｒｏｗｓｈａｎｉ ＡＴら、２００５年 Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ７９巻（４号）：３８１〜６頁）。既存の治療として、免疫グロブリン及びガンシクロビル及びその誘導体などの抗ウイルス剤の使用が挙げられ、これらは、リスク集団において予防的に、又は感染の間の極めて初期に使用された場合に最も有効である。しかし、既存の治療は、相当な毒性及び特に、遅発型疾患に対する限定された有効性を特徴とし（Ｂｏｅｃｋｈ Ｍ．、２００４年 Ｐｅｄｉａｔｒ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ８（付録５）：１９〜２７頁；Ｌｉｍａｙｅ ＡＰ．、２００４年 Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ７８巻（９号）：１３９０〜６頁）、それらは、先天性ＨＣＭＶ疾患に対して影響を有していなかった。ＨＣＭＶ疾患に対して防御するための有効なワクチンの開発は、重要な公衆衛生の優先事項として認識されている（Ａｒｖｉｎ ＡＭら、２００４年Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ３９巻（２号）：２３３〜９頁）。

[0003]とりわけ、本発明は、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）感染の予防、治療及び／又は研究にとって有用な方法及び組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、１種又は複数のモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）コアタンパク質を含み、１種又は複数のＨＣＭＶエピトープ、例えば、ＨＣＭＶエンベロープ糖タンパク質ｇＢ及び／若しくはｇＨ並びに／又は外被タンパク質ｐｐ６５に由来するものなどを含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供する。とりわけ、本発明は、抗原（例えば、エンベロープ糖タンパク質及び構造タンパク質）の組み合わせが、例えば、体液性応答（例えば、中和抗体の製造）及び細胞応答（例えば、Ｔ細胞活性化）の両方を含む有益な免疫応答の改善された誘導につながり得るという認識を包含する。提供されるＶＬＰは、ウイルスＤＮＡを含有しない、非感染性であることを特徴とし得る。

[0004]いくつかの実施形態では、提供されるＶＬＰは、ウイルス中和抗体の誘導において役割を果たす抗原である、ウイルスエンベロープ糖タンパク質（例えば、ｇＢ及び／又はｇＨ）に由来する１種又は複数のエピトープを所望により含有してもよい脂質膜によって囲まれている。

[0005]いくつかの実施形態では、提供されるＶＬＰは、細胞性免疫応答（例えば、Ｔ細胞応答）の誘導において役割を果たす抗原である、ウイルス構造タンパク質（例えば、ｐｐ６５）に由来する１種又は複数のエピトープを含有する。いくつかの実施形態では、利用されるウイルス構造タンパク質（例えば、ｐｐ６５）は、ヘルパーＴ細胞の形成を刺激し、またＨＣＭＶに対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）も誘導する。

[0006]いくつかの実施形態では、本発明は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質（例えば、ｇＢ及び／又はｇＨ）の変異体を提供する。いくつかの実施形態では、変異体ウイルスエンベロープ糖タンパク質は、融合タンパク質であるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、ウイルス糖タンパク質の変異体は、異種タンパク質ドメイン（例えば、異なるタンパク質に由来する膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス構造タンパク質の変異体は、異種抗原又はエピトープを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、ウイルス構造タンパク質の変異体を含むＶＬＰを提供する。いくつかの実施形態では、ウイルス構造タンパク質の変異体は、融合タンパク質であるか、又はそれを含む。

[0007]本出願において使用されるように、用語「約」及び「およそ」は、同等物として使用される。約／およそとともに、又はそれを伴わずに本出願において使用される任意の数表示は、関連技術分野の当業者によって理解される任意の正常な変動を対象とすることを意味する。

[0008]本発明のその他の特徴、目的及び利点は、以下の詳細な説明において明らかである。しかし、詳細な説明は、本発明の実施形態を示すが、単に例示として示されるのであって制限ではないと理解されなければならない。本発明の範囲内の種々の変更及び改変は、詳細な説明から当業者には明らかである。

[0009]図面は、単に例示目的のものであって、制限のためではない。

ＤＮＡ発現プラスミドマップ（Ａ）及び例示的組換え発現プラスミドの構築（Ｂ）を示す図である。 ＨＥＫ２９３パッケージング細胞における例示的異種表面抗原のＦＡＣＳ解析（Ａ）及び例示的ＶＬＰ組成物における異種抗原発現のウエスタンブロット解析（Ｂ）を示す図である。 ＨＥＫ２９３パッケージング細胞における例示的異種表面抗原のＦＡＣＳ解析（Ａ）及び例示的ＶＬＰ組成物における異種抗原発現のウエスタンブロット解析（Ｂ）を示す図である。 ２種の例示的ＶＬＰ組成物の粒径決定及び多分散指数を示す図である。 ２種の例示的ＶＬＰ組成物の粒径決定及び多分散指数を示す図である。 例示的ｇＢ／ｐｐ６５（Ａ）、ｇＨ−Ｇ／ｐｐ６５（Ｂ）又はｇＢ／ｇＨ−Ｇ／ｐｐ６５（Ｃ）ＶＬＰ組成物を用いて処置したマウスにおけるＥＬＩＳＡ力価を示す図である。 例示的ｇＢ／ｐｐ６５（Ａ）、ｇＨ−Ｇ／ｐｐ６５（Ｂ）又はｇＢ／ｇＨ−Ｇ／ｐｐ６５（Ｃ）ＶＬＰ組成物を用いて処置したマウスにおけるＥＬＩＳＡ力価を示す図である。 例示的ｇＢ／ｐｐ６５（Ａ）、ｇＨ−Ｇ／ｐｐ６５（Ｂ）又はｇＢ／ｇＨ−Ｇ／ｐｐ６５（Ｃ）ＶＬＰ組成物を用いて処置したマウスにおけるＥＬＩＳＡ力価を示す図である。 例示的ＶＬＰ組成物を用いて処置されたマウスにおける中和抗体活性（ヒト線維芽細胞においてアッセイされた）を示す図である。 例示的ＶＬＰ組成物を用いて処置されたマウスにおける中和抗体活性（ヒト上皮細胞においてアッセイされた）を示す図である。 例示的ＶＬＰ組成物対組換えｇＢタンパク質を用いて処置されたマウスにおける中和抗体活性（ヒト線維芽細胞においてアッセイされた）を示す図である。 ＣＦＳＥ崩壊、ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞でのゲートの開閉に基づくＣＴＬ頻度（Ａ）又は増殖するｐｐ６５特異的ＣＴＬの頻度（Ｂ）として表される、ＨＥＫ２９３細胞において発現された例示的ＶＬＰ組成物を用いて処置されたマウスにおける抗原特異的ＣＴＬ反応を示す図である。 ＨＥＫ２９３細胞において発現された例示的ＶＬＰ組成物を用いて処置されたウサギにおける抗ｇＢ及び中和抗体力価（ヒト線維芽細胞においてアッセイされた）を示す図である。 ＨＥＫ２９３細胞において発現された例示的ＶＬＰ組成物を用いて処置されたウサギにおける中和抗体力価（ヒト上皮細胞においてアッセイされた）を示す図である。 （Ａ）タンジェンシャルフロー濾過（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）（ＴＦＦ）又は（Ｂ）陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーによって精製された、ＣＨＯ細胞において発現された例示的ＶＬＰ組成物の陰性染色電子顕微鏡（ＥＭ）画像を示す図である。 ＣＨＯ細胞において発現され、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）及び陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーによって精製された、例示的ＶＬＰ組成物を用いて処置されたウサギにおける中和抗体力価（ヒト線維芽細胞においてアッセイされた）を示す図である。 タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）及び陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーによって精製された、ＣＨＯ細胞において発現された例示的ＶＬＰ組成物を用いて処置されたウサギにおける中和抗体力価（ヒト上皮細胞においてアッセイされた）を示す図である。 ＣＨＯ細胞において発現され、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）及び陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーによって精製された例示的ＶＬＰ組成物を用いて処置されたウサギにおいて産生された抗体の結合活性指数を示す図である。

[0024]本発明がより容易に理解されるために、特定の用語をまず以下に定義する。以下の用語及びのその他の用語のさらなる定義が、本明細書の全体を通して示されている。

[0025]アミノ酸：本明細書において使用されるように、用語「アミノ酸」とは、その広い意味で、ポリペプチド鎖に組み込まれ得る任意の化合物及び／又は物質を指す。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、一般構造Ｈ_２Ｎ−Ｃ（Ｈ）（Ｒ）−ＣＯＯＨを有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、合成アミノ酸であり；いくつかの実施形態では、アミノ酸は、ｄ−アミノ酸であり；いくつかの実施形態では、アミノ酸は、ｌ−アミノ酸である。「標準アミノ酸」とは、天然に存在するペプチド中によく見られる２０種の標準ｌ−アミノ酸のいずれかを指し、「非標準アミノ酸」とは、合成によって調製されるか、天然供給源から得られるかに関わらず、標準アミノ酸以外の任意のアミノ酸を指す。本明細書において、「合成アミノ酸」とは、限定されるものではないが、塩、アミノ酸誘導体（アミドなど）、及び／又は置換を含めた化学的に修飾されたアミノ酸を包含する。ペプチド中の、カルボキシ−及び／又はアミノ−末端アミノ酸を含めたアミノ酸は、メチル化、アミド化、アセチル化、保護基及び／又はその活性に悪影響を及ぼすことなくペプチドの循環半減期を変更し得るその他の化学基との置換によって修飾され得る。アミノ酸は、ジスルフィド結合に関与し得る。アミノ酸は、１種又は複数の化学成分（例えば、メチル基、アセテート基、アセチル基、リン酸基、ホルミル部分、イソプレノイド基、硫酸塩基、ポリエチレングリコール部分、脂質部分、炭水化物部分、ビオチン部分など）と関連しているものなどの１種又は翻訳後修飾を含み得る。用語「アミノ酸」は、「アミノ酸残基」と同義的に使用され、遊離アミノ酸及び／又はペプチドのアミノ酸残基を指すこともある。遊離アミノ酸を指すか、又はペプチドの残基を指すかは、この用語が使用される文脈から明らかとなる。

[0026]抗原：本明細書において、用語「抗原」とは、抗体によって認識される１種又は複数のエピトープ（直鎖、立体構造のいずれか、又は両方）を含有する物質を指す。特定の実施形態では、抗原は、ウイルス又はウイルスのポリペプチドであるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、用語「抗原」とは、サブユニット抗原を指す（すなわち、天然に抗原が関連している全ウイルスから分離された、個別の抗原；例えば、ウイルス様粒子と関連している抗原）。或いは、又はさらに、いくつかの実施形態では、用語「抗原」とは、死滅した、弱毒化された、又は不活化されたウイルスを指す。特定の実施形態では、抗原は、「免疫原」である。

[0027]およそ又は約：本明細書において使用されるように、用語「およそ」又は「約」とは、１種又は複数の注目する値に適用されるように、記載された参照値と同様である値を指す。特定の実施形態では、用語「およそ」又は「約」とは、別に記載されない限り、又は文脈から別であると明確でない限り、記載された参照値のいずれかの方向に（より多いか、又はより少ない）２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％又はそれ以下内に入る値の範囲を指す（このような数が、可能性ある値の１００％を超える場合を除く）。

[0028]回復：本明細書において使用されるように、用語「回復」とは、状況の予防、低減若しくは寛解又は対象の状況の改善を意味する。回復は、疾患、障害又は状態（例えば、ＨＣＭＶ感染）の完全な回復又は完全な予防を含むが、これを必要とはしない。用語「予防」とは、疾患、障害又は状態の発症の遅延を指す。予防は、疾患、障害又は状態の発症が、所定の期間遅延された場合に完全と考えられ得る。

[0029]特徴的な部分：本明細書において使用されるように、用語、物質の「特徴的な部分」とは、広い意味で、未変化の物質と、指定された程度の構造的同一性を共有するものである。特定の実施形態では、特徴的な部分は、未変化の物質と少なくとも１種の機能的特徴を共有する。例えば、タンパク質又はポリペプチドの「特徴的な部分」は、一緒になってタンパク質又はポリペプチドの特徴となる、連続した一続きのアミノ酸又は連続した一続きのアミノ酸の収集物を含有するものである。いくつかの実施形態では、このような連続した一続きは各々、一般に、少なくとも２、５、１０、１５、２０、５０個又はそれを超えるアミノ酸を含有する。一般に、物質の（例えば、タンパク質、抗体などの）特徴的な部分とは、上記で指定された配列及び／又は構造的同一性に加えて、関連する未変化の物質と少なくとも１つの機能的特徴を共有するものである。いくつかの実施形態では、特徴的な部分は、生物学的に活性であり得る。

[0030]特徴的な配列：「特徴的な配列」とは、ポリペプチド又は核酸のファミリーのすべてのメンバーにおいて見られ、したがって、ファミリーのメンバーを定義するために当業者によって使用され得る配列である。

[0031]細胞質ドメイン：当技術分野で公知のように、ポリペプチドは、膜貫通、細胞質及び／又は細胞外ドメインを有することもある。一般に、「細胞質ドメイン」とは、本明細書において使用されるように、細胞質中に存在するという特質を有するドメインを指す。理解されるように、細胞質ドメイン中のどのアミノ酸も、細胞質中に存在するということは必要ではない。例えば、いくつかの実施形態では、細胞質ドメインは、タンパク質の指定された一続き又は部分が、実質的に細胞質中に位置することを特徴とする。当技術分野で周知であるように、タンパク質細胞内局在性（例えば、細胞質局在性）を予測するために、種々のアルゴリズムを使用してアミノ酸又は核酸配列が解析され得る。例示的なこのようなプログラムとして、中でも、ｐｓｏｒｔ（ＰＳＯＲＴ．ｏｒｇ）、Ｐｒｏｓｉｔｅ（ｐｒｏｓｉｔｅ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）が挙げられる。

[0032]剤形：本明細書において使用されるように、用語「剤形」及び「単位剤形」とは、治療される患者の治療薬の物理的に別個の単位を指す。各単位は、所望の治療効果をもたらすよう算出された活性材料の所定量を含有する。しかし、組成物の総投与量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることが理解される。

[0033]投与計画：「投与計画」（又は「治療計画」）は、その用語が本明細書において使用されるように、一般に、期間によって分かれている、対象に個々に投与される一連の単位用量（一般に、２以上）である。いくつかの実施形態では、所与の治療薬は、１つ又は複数の用量を含み得る推奨される投与計画を有する。いくつかの実施形態では、投与計画は、各々が同一の長さの期間によって互いに分かれている複数の用量を含み；いくつかの実施形態では、投与計画は、複数の用量及び個々の用量を分ける少なくとも２種の異なる期間を含む。

[0034]発現：本明細書において使用されるように、核酸配列の「発現」とは、以下の事象のうち１つ又は複数を指す：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡ鋳型の製造（例えば、転写による）；（２）ＲＮＡ転写物のプロセシング（例えば、スプライシング、エディティング、５’キャップ形成及び／又は３’末端形成による）；（３）ＲＮＡのポリペプチド又はタンパク質への翻訳；及び／又は（４）ポリペプチド又はタンパク質の翻訳後修飾。

[0035]細胞外ドメイン：当技術分野で公知であるように、ポリペプチドは、膜貫通、細胞質及び／又は細胞外ドメインを有することもある。一般に、「細胞外ドメイン」とは、本明細書において使用されるように、細胞の外側に存在するという特質を有するドメインを指す。理解されるように、細胞外ドメイン中のどのアミノ酸も、細胞の外側に存在するということは必要ではない。例えば、いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、タンパク質の指定された一続き又は部分が、実質的に細胞外に位置することを特徴とする。当技術分野で周知であるように、タンパク質細胞内局在性（例えば、細胞外局在性）を予測するために、種々のアルゴリズムを使用してアミノ酸又は核酸配列が解析され得る。例示的なこのようなプログラムとして、中でも、ｐｓｏｒｔ（ＰＳＯＲＴ．ｏｒｇ）、Ｐｒｏｓｉｔｅ（ｐｒｏｓｉｔｅ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）が挙げられる。

[0036]融合タンパク質：本明細書において使用されるように、用語「融合タンパク質」とは、一般に、各々が、（１）天然に存在する、及び／又は（２）ポリペプチドの機能的ドメインを表すペプチド部分に対して高度のアミノ酸同一性を示す、少なくとも２つのセグメントを含むポリペプチドを指す。通常、少なくとも２つのこのようなセグメントを含有するポリペプチドは、２つのセグメントが、（１）同一ペプチド中に天然には含まれない、及び／又は（２）単一ポリペプチドに互いにこれまでは連結していなかった、及び／又は（３）人の手の作用によって互いに連結された部分である場合に融合タンパク質であると考えられる。

[0037]遺伝子：本明細書において使用されるように、用語「遺伝子」は、当技術分野で理解されるような意味を有する。用語「遺伝子」は、遺伝子調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）及び／又はイントロン配列を含み得るということは、当業者には理解される。遺伝子の定義は、タンパク質をコードしないが、ｔＲＮＡ、ＲＮＡｉ誘導物質などといった機能的ＲＮＡ分子をコードする核酸への言及を含むということもさらに理解される。明確にするために、本発明者らは、本出願において使用されるように、用語「遺伝子」は、一般に、タンパク質をコードする核酸の部分を指し、この用語は、当業者には文脈から明確であるように、所望により、調節配列を包含し得るということを注記する。この定義は、用語「遺伝子」の非タンパク質をコードする発現ユニットへの適用を排除することを意図するものではなく、ほとんどの場合、この用語は、本文書において使用されるように、タンパク質をコードする核酸を指すことを明確にすることを意図するものである。

[0038]遺伝子産物又は発現産物：本明細書において使用されるように、用語「遺伝子産物」又は「発現産物」とは、一般に、遺伝子から転写されたＲＮＡ（プロセシング前及び／又はプロセシング後）又は遺伝子から転写されたＲＮＡによってコードされるポリペプチド（修飾前及び／又は修飾後）を指す。

[0039]異種：本明細書において使用されるように、タンパク質又はポリペプチドに関して、用語「異種」とは、レトロウイルス又はＶＬＰなどの特定の生物において天然に存在しないタンパク質又はポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、異種タンパク質又はポリペプチドは、特定のレトロウイルスビリオンにおいて、天然に存在しない。本明細書において使用されるように、タンパク質ドメインに関して用語「異種」とは、一般に、特定のタンパク質では天然に存在しないタンパク質ドメインを指す。

[0040]免疫原性：本明細書において使用されるように、用語「免疫原性」とは、非宿主実体（例えば、ＨＣＭＶ抗原）に対して宿主動物において免疫応答を生じさせることができることを意味する。特定の実施形態では、この免疫応答は、特定の感染性生物（例えば、ＨＣＭＶ）に対するワクチンによって誘発される感染防御免疫の基礎を形成する。

[0041]免疫応答：本明細書において使用されるように、用語「免疫応答」とは、動物において誘発された応答を指す。免疫応答は、細胞性免疫、体液性免疫を指し得、又は両方を含み得る。免疫応答はまた、免疫系の一部に限定され得る。例えば、特定の実施形態では、免疫原性組成物は、ＩＦＮｙ応答の増大を誘導し得る。特定の実施形態では、免疫原性組成物は、粘膜ＩｇＡ応答（例えば、鼻腔及び／又は直腸洗浄において測定されるような）を誘導し得る。特定の実施形態では、免疫原性組成物は、全身性ＩｇＧ応答（例えば、血清において測定されるような）を誘導し得る。特定の実施形態では、免疫原性組成物は、ウイルス中和抗体又は中和抗体応答を誘導し得る。

[0042]改善、増大又は低減：本明細書において、用語「改善」、「増大」又は「低減」又は文法上の同等物は、本明細書に記載された治療の開始前の同一個体における測定値又は本明細書に記載された治療の非存在下での対照個体（又は複数の対照個体）における測定値などのベースライン測定値に対する値を示す。

[0043]個体、対象、患者：本明細書において使用されるように、用語「対象」、「個体」又は「患者」とは、ヒト又は非ヒト哺乳類対象を指す。いくつかの実施形態では、治療されている個体（「患者」又は「対象」とも呼ばれる）は、疾患、例えば、ＨＣＭＶ感染を患っている個体（胎児、乳児、小児、青年又は成体）である。いくつかの実施形態では、対象は、ＨＣＭＶ感染のリスクにある。いくつかの実施形態では、対象は、免疫抑制対象である。例えば、いくつかの実施形態では、免疫抑制対象は、ＨＩＶ感染した対象、ＡＩＤＳ患者、移植レシピエント、小児対象及び妊娠中の対象からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、対象は、ＨＣＭＶ感染に曝露されている。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。

[0044]単離：本明細書において使用されるように、用語「単離」とは、（１）最初に製造されたときに（天然に、及び／又は実験的設定においてに関わらず）関連していた成分の少なくとも一部から分離されている、及び／若しくは（２）人の手によって製造された、調製された、及び／若しくは作製された物質並びに／又は実体を指す。単離された物質及び／又は実体は、最初に関連しているその他の成分のうち約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％ｏ、約９７％、約９８％、約９９％又は約９９％超から分離され得る。いくつかの実施形態では、単離された作用物質は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は約９９％超純粋である。本明細書において使用されるように、物質は、その他の成分を実質的に含まない場合に「純粋」である。本明細書において使用されるように、単離された物質及び／又は実体の純度パーセントの算出は、賦形剤（例えば、バッファー、溶媒、水など）を含んではならない。

[0045]リンカー：本明細書において使用されるように、用語「リンカー」とは、例えば、融合タンパク質中の、天然タンパク質において特定の位置に現れるもの以外の適当な長さの、一般に可動性であること及び／又はα−ヘリックスなどの構造を２種のタンパク質部分の間に挿入されることが設計されているアミノ酸配列を指す。一般に、リンカーは、融合タンパク質の２種以上のドメインが、各ドメインの生物活性の５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれ以上を保持することを可能にする。リンカーはまた、スペーサーと呼ばれることもある。

[0046]核酸：本明細書において使用されるように、用語「核酸」は、広い意味で、オリゴヌクレオチド鎖であるか、又はそれに組み込まれ得る任意の化合物及び／又は物質を指す。いくつかの実施形態では、核酸は、オリゴヌクレオチド鎖であるか、ホスホジエステル結合を介してそれに組み込まれ得る化合物及び／又は物質である。いくつかの実施形態では、「核酸」とは、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチド及び／又はヌクレオシド）を指す。いくつかの実施形態では、「核酸」とは、個々の核酸残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を指す。本明細書において使用されるように、用語「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は、同義的に使用され得る。いくつかの実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡ並びに一本鎖及び／又は二本鎖ＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡを包含する。さらに、用語「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」及び／又は同様の用語は、核酸類似体、すなわち、ホスホジエステル主鎖以外を有する類似体を含む。例えば、当技術分野で公知であり、主鎖中に、リン酸ジエステル結合の代わりにペプチド結合を有する、いわゆる「ペプチド核酸」は、本発明の範囲内と考えられる。用語「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重型である、及び／又は同一アミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質及び／又はＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含み得る。核酸は、天然供給源から精製され得る、組換え発現系を使用して製造され、所望により、精製され得、化学合成などされ得る。必要に応じて、例えば、化学合成された分子の場合には、核酸は、化学的に修飾された塩基又は糖、主鎖修飾などを有する類似体などのヌクレオシド類似体を含み得る。核酸配列は、特に断りのない限り５’から３’方向に提示される。用語「核酸セグメント」は、本明細書において、長い核酸配列の一部である核酸配列を指すよう使用される。多数の実施形態では、核酸セグメントは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える残基を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン及びデオキシシチジン）；ヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピニル−シチジン、Ｃ−５プロピニル−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、０（６）−メチルグアニン及び２−チオシチジン）；化学的に修飾された塩基；生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化塩基）；介在塩基；修飾された糖（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース及びヘキソース）；及び／又は修飾されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエート及び５’−Ｎ−ホスホルアミダイト結合）であるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、送達を促進又は達成するよう化学的に修飾されていない核酸（例えば、ヌクレオチド及び／又はヌクレオシドを含む、ポリヌクレオチド及び残基）を意味する「修飾されていない核酸」を具体的に対象とする。

[0047]医薬上許容される：本明細書において使用されるように、用語「医薬上許容される」とは、過度の毒性、刺激作用、アレルギー反応又はその他の問題若しくは合併症を伴わず、妥当なリスク・ベネフィット比に釣り合った、健全な医学的判断の範囲内で、ヒト及び動物の組織との接触において使用するのに適している物質を指す。

[0048]ポリペプチド：本明細書において使用されるように、「ポリペプチド」は、一般的に言えば、ペプチド結合によって互いに結合している一連の少なくとも２個のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、各々が少なくとも１つのペプチド結合によって別のものと結合している、少なくとも３〜５個のアミノ酸を含み得る。当業者ならば、ポリペプチドは、ポリペプチド鎖に組み込まれることができるかどうかに関わらず、「非天然」アミノ酸又はその他の実体を所望により含むこともあるということは理解する。

[0049]ポリタンパク質：本明細書において使用されるように、用語「ポリタンパク質」とは、一般に、合成後に、切断されて、いくつかの機能的に別個のポリペプチドを生じ得るタンパク質を指す。ポリタンパク質は、通常、単一アミノ酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、切断されていないポリタンパク質は、その成分部分の生物活性を保持する。いくつかのウイルスは、機能的ポリタンパク質として保持され得るか、又はいくつかの機能的に別個のポリペプチドにプロセシングされ得る、このようなポリタンパク質、例えば、Ｇａｇポリタンパク質を産生する。Ｇａｇポリタンパク質は、機能的には、３つのドメイン：Ｇａｇポリタンパク質を細胞膜にターゲッティングする膜結合ドメイン；Ｇａｇ重合を促進する相互作用ドメイン；及び宿主細胞からの新生ビリオンの放出を促進するレイトドメインに分けられる。一般に、ウイルス粒子組み立てを媒介するＧａｇタンパク質の形態は、ポリタンパク質である。

[0050]自己組織化部分：一般に、「自己組織化部分」とは、本明細書において使用されるように、外部供給源からの手引き又は管理なしに定義された配置に適応する実体の関連する一続きを指す。いくつかの実施形態では、実体はタンパク質である。いくつかの実施形態では、実体は、ポリタンパク質である。いくつかのこのような実施形態では、関連する一続きは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００個又はそれを超える残基である。自己組織化は、例えば細胞の関連の中（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ）で示され得る。或いは、又はさらに、自己組織化は、細胞の関連の外（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で示され得る。自己組織化は、分子内（例えば、フォールディング）及び／又は分子間であり得る。いくつかの実施形態では、自己組織化は、高分子的であり得、それによって、実体は、複雑な及び／又は広大な高分子構造に自己組織化する。自己組織化された実体は、それだけには限らないが、粒子、繊維、シート及びリボンを含めた幅広い構造モチーフを示し得る。いくつかの実施形態では、実体の自己組織化は、実体の生物学的機能にとって重要である。例えば、いくつかの実施形態では、脂質の自己組織化は、細胞膜構造の形成につながる。いくつかの実施形態では、細胞の関連におけるタンパク質（例えば、ウイルス構造タンパク質）の自己組織化は、粒子構造（例えば、ウイルス粒子構造）の形成につながる。例えば、ウイルスの構造ポリタンパク質は、その局在性をその宿主細胞の細胞膜（例えば、原形質膜、エンドソームなど）に向けることができるターゲッティング配列を含有し得、宿主細胞の細胞膜から、ウイルスの構造ポリタンパク質が芽を出し、ウイルスの構造ポリタンパク質の周りに宿主細胞膜材料を含有するＶＬＰを形成し得る。

[0051]実質的相同性：語句「実質的相同性」とは、本明細書において、アミノ酸又は核酸配列間の比較を指すよう使用される。当業者には理解されるように、一般に、２種の配列は、それらが、対応する位置において相同な残基を含有する場合に、「実質的に相同である」と考えられる。相同な残基は、同一残基であってもよい。或いは、相同な残基は、適宜同様の構造的及び／又は機能的特徴を有する非同一残基であってもよい。例えば、当業者には周知であるように、特定のアミノ酸は、通常、「疎水性」又は「親水性」アミノ酸として、及び／又は「極性」又は「非極性」側鎖を有するとして分類される。あるアミノ酸の、同一種類の別のものとの置換は、「相同」置換と考えられ得ることが多い。

[0052]この技術分野では周知であるように、アミノ酸又は核酸配列は、ヌクレオチド配列のためのＢＬＡＳＴＮ及びアミノ酸配列のためのＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなどの市販のコンピュータプログラム中で入手可能なものを含めた種々のアルゴリズムのいずれかを使用して比較され得る。例示的なこのようなプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ、２１５巻（３号）：４０３〜４１０頁、１９９０年；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６巻：４６０〜４８０頁（１９９６年）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、「Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ： ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５巻：３３８９〜３４０２頁、１９９７年；Ｂａｘｅｖａｎｉｓら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｗｉｌｅｙ、１９９８年；及びＭｉｓｅｎｅｒら（編）、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１３２巻）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、１９９９年に記載されている。上記のプログラムは、相同配列を同定することに加えて、通常、相同性の程度の指標を提供する。いくつかの実施形態では、２種の配列は、対応する残基のうち、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上が、残基の関連する一続きにわたって相同である場合に、実質的に相同であると考えられる。いくつかの実施形態では、関連する一続きは、完全配列である。いくつかの実施形態では、関連する一続きは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００個又はそれを超える残基である。

[0053]実質的同一性：語句「実質的同一性」とは、本明細書において、アミノ酸又は核酸配列間の比較を指すよう使用される。当業者には理解されるように、２種の配列は、一般に、対応する位置に同一残基を含有する場合に「実質的に同一である」と考えられる。当技術分野では周知であるように、アミノ酸又は核酸配列は、ヌクレオチド配列のためのＢＬＡＳＴＮ及びアミノ酸配列のためのＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなどの市販のコンピュータプログラム中で入手可能なものを含めた種々のアルゴリズムのいずれかを使用して比較され得る。例示的なこのようなプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ、２１５巻（３号）：４０３〜４１０頁、１９９０年；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６巻：４６０〜４８０頁（１９９６年）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５巻：３３８９〜３４０２頁、１９９７年；Ｂａｘｅｖａｎｉｓら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｗｉｌｅｙ、１９９８年；及びＭｉｓｅｎｅｒら（編）、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１３２巻）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、１９９９年に記載されている。上記のプログラムは、同一配列を同定することに加えて、通常、同一性の程度の指標を提供する。いくつかの実施形態では、２種の配列は、対応する残基のうち、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上が、残基の関連する一続きにわたって同一である場合に、実質的に同一であると考えられる。いくつかの実施形態では、関連する一続きは、完全配列である。いくつかの実施形態では、関連する一続きは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００個又はそれを超える残基である。

[0054]患っている：疾患、障害又は状態（例えば、ＨＣＭＶ感染）を「患っている」個体は、疾患、障害又は状態の１種又は複数の症状を有すると診断されている、及び／又は示す。

[0055]に対して感受性がある：疾患、障害又は状態（例えば、ＨＣＭＶ感染）「に対して感受性がある」個体は、疾患、障害又は状態を発症するリスクにある。いくつかの実施形態では、疾患、障害又は状態に対して感受性がある個体は、疾患、障害又は状態の任意の症状を示さない。いくつかの実施形態では、疾患、障害又は状態に対して感受性がある個体は、疾患、障害及び／又は状態を有すると診断されていない。いくつかの実施形態では、疾患、障害又は状態に対して感受性がある個体は、疾患、障害又は状態の発症と関連する条件に曝露された個体である（例えば、個体は、ＨＣＭＶに曝露されている）。

[0056]症状が低減される：本発明によれば、特定の疾患、障害又は状態の１種又は複数の症状の規模（例えば、強度、重篤度など）又は頻度が低減される場合に「症状が低減される」。明確にするために、特定の症状の発生の遅延は、その症状の頻度の低減の１つの形態と考えられる。本発明が、症状が排除される症例のみに制限されることは意図されない。本発明は、１種又は複数の症状が、完全に排除されなくとも、低減される（それによって対象の状態が「改善される」）ような治療を明確に考慮する。

[0057]治療上有効な量：本明細書において使用されるように、用語「治療上有効な量」とは、任意の医学的処置に適用できる妥当なリスク・ベネフィット比で、治療された対象に治療効果を付与するのに十分な量を指す。治療効果は、客観的なもの（すなわち、何らかの試験又はマーカーによって測定可能）である場合も、主観的なもの（すなわち、対象が、効果の指標を与えるか、効果を感じる）である場合もある。特に、「治療上有効な量」とは、疾患と関連する症状を回復させること、疾患の発症を予防又は遅延させること及び／又は疾患の症状の重篤度若しくは頻度を減少させることなどによって、所望の疾患又は状態を治療する、回復させる、若しくは予防するのに、又は検出可能な治療又は予防効果を示すのに有効な治療用タンパク質又は組成物の量を指す。治療上有効な量は、複数の単位用量を含み得る投与計画で一般に投与される。任意の特定の免疫原性組成物については、治療上有効な量（及び／又は有効な投与計画内の適当な単位用量）は、例えば、投与経路に応じて、その他の医薬品との組合せに応じて変わり得る。また、任意の特定の患者のための特定の治療上有効な量（及び／又は単位用量）は、治療されている障害及び障害の重篤度；使用される特定の医薬品の活性；使用される特定の組成物；患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別及び食事；投与時間、投与経路及び／又は使用される特定の免疫原性組成物の排泄若しくは代謝の速度；治療期間；及び医学の技術分野において周知である同様の因子を含めた種々の因子に応じて変わり得る。

[0058]膜貫通ドメイン：当技術分野で公知のように、ポリペプチドは、膜貫通、細胞質及び／又は細胞外ドメインを有することもある。一般に、「膜貫通ドメイン」は、本明細書において使用されるように、膜中に存在するという特質を有するドメインを指す（例えば、細胞膜の一部又はすべてにわたる）。理解されるように、膜貫通ドメイン中のどのアミノ酸も膜中に存在することは必要ではない。例えば、いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、タンパク質の指定された一続き又は部分が、実質的に膜中に位置することを特徴とする。当技術分野で周知であるように、タンパク質細胞内局在性（例えば、膜貫通局在性）を予測するために、種々のアルゴリズムを使用してアミノ酸又は核酸配列が解析され得る。例示的なこのようなプログラムとして、中でも、ｐｓｏｒｔ（ＰＳＯＲＴ．ｏｒｇ）、Ｐｒｏｓｉｔｅ（ｐｒｏｓｉｔｅ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）が挙げられる。

[0059]治療：本明細書において使用されるように、用語「治療」（また、「治療する」又は「治療している」）とは、特定の疾患、障害及び／又は状態（例えば、ＨＣＭＶ感染）の１種若しくは複数の症状若しくは特徴又は疾患への素因を、部分的若しくは完全に緩和する、回復させる、軽減する、阻害する、その発症を遅延させる、その重篤度を低減する及び／又はその罹患率を低減する免疫原性組成物の任意の投与を指す。このような治療は、関連疾患、障害及び／又は状態の徴候を示さない対象のもの、及び／又は疾患、障害、及び／又は状態の早期徴候のみを示す対象のものであり得る。或いは、又はさらに、このような治療は、関連疾患、障害及び／又は状態の１種又は複数の確立された徴候を示す対象のものであり得る。特定の実施形態では、用語「治療している」とは、患者のワクチン接種を指す。

[0060]ワクチン接種：本明細書において使用されるように、用語「ワクチン接種」とは、例えば、疾患を引き起こす物質（例えば、ＨＣＭＶ）に対する免疫応答を生じさせるよう意図される組成物の投与を指す。本発明の目的上、ワクチン接種は、疾患を引き起こす作用物質に対する曝露の前、その間及び／又はその後に、特定の実施形態では、作用物質に対する曝露の前、その間及び／又はそのすぐ後に投与され得る。いくつかの実施形態では、ワクチン接種は、ワクチン接種組成物の、適宜、時間間隔のあいた複数回の投与を含む。

[0061]ベクター：本明細書において使用されるように、「ベクター」とは、結合している別の核酸を輸送できる核酸分子を指す。いくつかの実施形態では、ベクターは、真核細胞及び／又は原核細胞などの宿主細胞において、連結された核酸を染色体外複製及び／又は発現できる。作動可能に連結している遺伝子の発現を指示できるベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。
［特定の実施形態の詳細な説明］

[0062]とりわけ、本発明は、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）感染の予防、治療及び／又は研究にとって有用である方法及び組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、１種又は複数のモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）コアタンパク質を含み、１種又は複数のＨＣＭＶエピトープ、例えば、ＨＣＭＶエンベロープ糖タンパク質ｇＢ及び／又はｇＨ及び／又は外被タンパク質ｐｐ６５に由来するものなどを含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供する。とりわけ、本発明は、抗原（例えば、エンベロープ糖タンパク質及び構造タンパク質）の組合せが、例えば、体液性応答（例えば、中和抗体の製造）及び細胞性応答（例えば、Ｔ細胞活性化）の両方を含む有益な免疫応答の改善された誘導につながり得るという認識を包含する。提供されるＶＬＰは、ウイルスのＲＮＡ又はＤＮＡを含有せず、非感染性であることを特徴とし得る。いくつかの実施形態では、提供されるＶＬＰは、ウイルスのＲＮＡ又はＤＮＡを含有し、感染性である。いくつかのこのような実施形態では、提供されるＶＬＰは、ＤＮＡワクチンとして有用である。

[0063]いくつかの実施形態では、対象における体液性免疫応答は、少なくとも約１カ月、少なくとも約２カ月、少なくとも約３カ月、少なくとも約４カ月、少なくとも約５カ月、少なくとも約６カ月、少なくとも約７カ月、少なくとも約８カ月、少なくとも約９カ月、少なくとも約１０カ月、少なくとも約１１カ月、少なくとも約１２カ月、少なくとも約１３カ月、少なくとも約１４カ月、少なくとも約１５カ月、少なくとも約１６カ月、少なくとも約１７カ月、少なくとも約１８カ月、少なくとも約１９カ月、少なくとも約２０カ月、少なくとも約２１カ月、少なくとも約２２カ月、少なくとも約２３カ月、少なくとも約２４カ月、少なくとも約２８カ月、少なくとも約３２カ月、少なくとも約３６カ月、少なくとも約４０カ月、少なくとも約４４カ月、少なくとも約４８カ月又はそれより長く持続される。いくつかの実施形態では、対象における細胞性免疫応答は、少なくとも約１カ月、少なくとも約２カ月、少なくとも約３カ月、少なくとも約４カ月、少なくとも約５カ月、少なくとも約６カ月、少なくとも約７カ月、少なくとも約８カ月、少なくとも約９カ月、少なくとも約１０カ月、少なくとも約１１カ月又は少なくとも１２カ月持続される。

[0064]いくつかの実施形態では、提供されるＶＬＰは、ウイルス中和抗体の誘導において役割を果たす抗原であるウイルスのエンベロープ糖タンパク質（例えば、ｇＢ及び／又はｇＨ）に由来する１種又は複数のエピトープを所望により含有する脂質膜によって囲まれている。

[0065]いくつかの実施形態では、提供されるＶＬＰは、細胞性免疫応答（例えば、Ｔ細胞応答）の誘導において役割を果たす抗原であるウイルス構造タンパク質（例えば、ｐｐ６５）に由来する１種又は複数のエピトープを含有する。いくつかの実施形態では、利用されるウイルス構造タンパク質（例えば、ｐｐ６５）は、ＨＣＭＶに対して、ヘルパーＴ細胞（Ｔ_Ｈ）の形成を刺激し、また細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）も誘導する。

[0066]いくつかの実施形態では、本発明は、ウイルスのエンベロープ糖タンパク質（例えば、ｇＢ及び／又はｇＨ）の変異体を提供する。いくつかの実施形態では、変異体ウイルスのエンベロープ糖タンパク質は、融合タンパク質であるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスの糖タンパク質の変異体は、異種タンパク質ドメイン（例えば、異なるタンパク質に由来する膜貫通及び／又は細胞質ドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス構造タンパク質の変異体は、異種抗原又はエピトープを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、ウイルス構造タンパク質の変異体を含むＶＬＰを提供する。いくつかの実施形態では、ウイルス構造タンパク質の変異体は、融合タンパク質であるか、又はそれを含む。

Ｉ．ウイルス様粒子（ＶＬＰ）
[0067]レトロウイルスは、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）に属するエンベロープ型ＲＮＡウイルスである。レトロウイルスによる宿主細胞の感染後、逆転写酵素によってＲＮＡがＤＮＡに転写される。次いで、インテグラーゼ酵素によってＤＮＡが宿主細胞のゲノムに組み込まれ、その後、宿主細胞のＤＮＡの一部として複製する。レトロウイルス科は、以下の属、アルファレトロウイルス（Ａｌｐｈａｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、ベータレトロウイルス（Ｂｅｔａｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、ガンマレトロウイルス（Ｇａｍｍｍｅａｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、デルタレトロウイルス（Ｄｅｌｔａｒｅｔｏｒｏｖｉｒｕｓ）、イプシロンレトロウイルス（Ｅｐｓｉｌｏｎｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、レンチウイルス（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）及びスプーマウイルス（Ｓｐｕｍａｖｉｒｕｓ）を含む。この科のレトロウイルスの宿主は、一般に、脊椎動物である。レトロウイルスは、宿主細胞膜に由来する脂質二重層によって囲まれた、球状のヌクレオカプシド（ウイルス構造タンパク質との複合体中のウイルスのゲノム）を含有する感染性ビリオンを製造する。

[0068]レトロウイルスベクターを使用して、感染性であり、複製可能であるか、又は複製に欠陥のあるかのいずれかであるエンベロープ型ビリオンを作製できる。複製可能感染性レトロウイルスベクターは、ビリオン合成に必要な遺伝子のすべてを含有し、ひとたび宿主細胞の感染が起こると、それ自体で増殖し続ける。複製に欠陥のある感染性レトロウイルスベクターは、最初の感染後に広がらない。これは、レトロウイルスのコーディング領域のほとんどの、移行される遺伝子又はヌクレオチド配列での置換によって達成され、その結果、ベクターは、複製のさらなるラウンドに必要なタンパク質を作製できない。

[0069]或いは、又はさらに、レトロウイルスベクターを使用して、レトロウイルス由来のゲノムを欠き、非感染性及び非複製性の両方であるウイルス様粒子（ＶＬＰ）を作製できる。ＶＬＰの有利な特性のために、ＶＬＰは、抗原送達系として利用され得る。さらに、ＶＬＰは、非感染性であるので、免疫原性組成物（例えば、ワクチン）として安全に投与され得る。ＶＬＰは、一般に、上記のエンベロープ型ビリオンと構造的に類似しているが、レトロウイルス由来ゲノムを欠き、そのため、ウイルスの複製が起こる可能性が低くなる。一部のウイルス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）などのマウス白血病ウイルス）のカプシドタンパク質（例えば、Ｇａｇ）の発現は、対応する天然ウイルスと同様の粒子への自己組織化につながり、この粒子はウイルスの遺伝物質を含まない。

[0070]さまざまなＶＬＰが調製されている。例えば、エンベロープタンパク質及び／又は表面糖タンパク質を含むか、又は含まない単一又は複数のカプシドタンパク質を含むＶＬＰが調製されている。いくつかの場合には、ヘパドナウイルス（例えば、Ｅｎｇｅｒｉｘ（商標）、ＧＳＫ ａｎｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｖａｘ ＨＢ（商標）、Ｍｅｒｃｋ）、パピローマウイルス（例えば、Ｃｅｒｖａｒｉｘ（商標）、ＧＳＫ ａｎｄ Ｇａｒｄａｓｉｌ（商標）、Ｍｅｒｃｋ）、パルボウイルス（ｐａｒｏｖｉｒｕｓ）又はポリオーマウイルスから調製されたＶＬＰについて示されるように、ＶＬＰは、非エンベロープ型であり、１つの主要なカプシドタンパク質のみの発現によって組み立てられる。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、エンベロープ型であり、対応する天然ウイルスに見られる複数の抗原タンパク質を含み得る。ＶＬＰは、通常、その対応する天然ウイルスに似ており、多価粒子構造であり得る。いくつかの実施形態では、抗原タンパク質は、ＶＬＰ構造の成分としてＶＬＰ内で内部で、及び／又はＶＬＰの表面で提示され得る。本発明は、ＶＬＰとの関連での抗原の提示は、その他の形態の抗原提示、例えば、ＶＬＰと関連していない可溶性抗原と比較して、抗原に対する中和抗体の誘導にとって有利であるという認識を包含する。中和抗体は、ほとんどの場合、三次又は四次構造を認識し、これは、その天然ウイルスコンホメーションにおいてエンベロープ糖タンパク質のような抗原性タンパク質を提示することを必要とすることが多い。或いは、又はさらに、ＶＬＰは、細胞性免疫（例えば、Ｔ細胞応答）を誘導する状況において、抗原の提示にとって有用であり得る。本発明は、ＶＬＰ系における抗原の組み合わせの使用は、改善された免疫応答を生じさせ得るという見識をさらに包含する。

Ａ．構造タンパク質
[0071]いくつかの実施形態では、本発明は、１種又は複数のレトロウイルス構造タンパク質（例えば、Ｇａｇ）からなるＶＬＰを利用する。いくつかの実施形態では、本発明に従って使用するための構造タンパク質は、アルファレトロウイルス（例えば、トリ白血病ウイルス）、ベータレトロウイルス（マウス乳癌ウイルス）、ガンマレトロウイルス（マウス白血病ウイルス）、デルタレトロウイルス（ウシ白血病ウイルス）、イプシロンレトロウイルス（ウォールアイ皮膚肉腫ウイルス（Ｗａｌｌｅｙ Ｄｅｒｍａｌ Ｓａｒｃｏｍａ Ｖｉｒｕｓ）、レンチウイルス（ヒト免疫不全ウイルス１）又はスプーマウイルス（チンパンジー泡沫状ウイルス）構造タンパク質である。特定の実施形態では、構造ポリタンパク質は、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）構造タンパク質である。これらのレトロウイルスのゲノムは、データベースにおいて容易に入手可能である。これらのレトロウイルスのすべてのＧａｇ遺伝子は、全体的な構造類似性を有し、レトロウイルスの各群内では、アミノ酸レベルで保存されている。レトロウイルスのＧａｇタンパク質は、ウイルスの組み立てにおいて主に機能する。ポリタンパク質の形態のＧａｇ遺伝子は、ＶＬＰのコア構造タンパク質を生じさせる。ＭＬＶ Ｇａｇ遺伝子は、成熟ビリオンにおいて、ＭＬＶプロテアーゼによって４つの構造タンパク質（Ｍａｔｒｉｘ（ＭＡ）；ｐ１２；カプシド（ＣＡ）；及びヌクレオカプシド（ＮＣ））にタンパク質分解的に切断される６５ｋＤａのポリタンパク質前駆体をコードする。レトロウイルスは、未成熟ウイルス粒子の構造タンパク質としてＧａｇを用い、Ｇａｇポリペプチドから形成されたＧａｇポリタンパク質からなるが、ウイルスのプロテアーゼのようなその他のウイルス要素を欠く未成熟カプシドを組み立てる。Ｇａｇポリタンパク質は、機能的には、３つのドメイン、すなわち、Ｇａｇポリタンパク質を細胞膜にターゲッティングする膜結合ドメイン、Ｇａｇ重合を促進する相互作用ドメイン、及び宿主細胞からの新生ビリオンの放出を促進するレイトドメインに分けられる。ウイルス粒子組み立てを媒介するＧａｇタンパク質の形態は、ポリタンパク質である。

[0072]いくつかの実施形態では、本発明に従って使用するためのレトロウイルス構造タンパク質は、Ｇａｇポリペプチドである。本明細書において使用されるように、用語「Ｇａｇポリペプチド」とは、本明細書に記載されたＶＬＰの形成を担うレトロウイルス由来構造ポリペプチドであり、そのアミノ酸配列が、Ｇａｇの少なくとも１つの特徴的配列を含むポリペプチド配列を指す。種々のレトロウイルスに由来するさまざまなＧａｇ配列が、当技術分野で公知であり、このような配列を参照した当業者ならば、全般的にＧａｇタンパク質に、及び／又は特定のＧａｇポリペプチドに特徴的である配列を容易に同定できる。

[0073]本発明に従って使用するための例示的Ｇａｇポリペプチドは、以下に配列番号１として示されている。いくつかの実施形態では、適したＧａｇポリペプチドは、既知レトロウイルスＧａｇポリペプチドと実質的に相同である。例えば、Ｇａｇポリペプチドは、野生型又は天然に生じるＧａｇポリペプチド（例えば、配列番号１）と比較して、１つ又は複数のアミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を含有するが、実質的な自己組織化活性を保持する修飾されたレトロウイルスＧａｇポリペプチドであり得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明に適したＧａｇポリペプチドは、ＭＭＬＶ Ｇａｇポリペプチド（配列番号１）と実質的に相同である。いくつかの実施形態では、本発明に適したＧａｇポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上相同なアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に適したＧａｇポリペプチドは、ＭＭＬＶ Ｇａｇポリペプチド（配列番号１）に対して実質的に同一である。いくつかの実施形態では、本発明に適したＧａｇポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一であるアミノ酸を有する。
ＭＭＬＶ Ｇａｇアミノ酸配列（配列番号１）

（配列番号１）
ＭＭＬＶ Ｇａｇヌクレオチド配列（配列番号２）

（配列番号２）
コドン最適化ＭＭＬＶ Ｇａｇヌクレオチド配列（配列番号３）

（配列番号３）
コドン最適化ＭＭＬＶ Ｇａｇヌクレオチド配列（配列番号２１）

（配列番号２１）

[0074]一般に、天然に、Ｇａｇタンパク質は、レトロウイルスのプロテアーゼ、逆転写酵素及びインテグラーゼ酵素活性を含有し得る、大きなＣ末端伸長を含む。しかし、ＶＬＰの組み立ては、一般に、このような成分の存在を必要としない。いくつかの場合には、レトロウイルスのＧａｇタンパク質は単独で（例えば、Ｃ末端伸長を欠く、ゲノムＲＮＡ、逆転写酵素、ウイルスのプロテアーゼ又はエンベロープタンパク質のうち１種又は複数を欠く）、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方で、自己組織化して、ＶＬＰを形成し得る（Ｓｈａｒｍａ Ｓら、１９９７年 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４巻：１０８０３〜８頁）。レトロウイルスのＧａｇポリタンパク質は単独で、オリゴマー形成して、ＶＬＰに組み立てられ得る。

[0075]いくつかの実施形態では、本発明に従って使用するためのＧａｇポリペプチドは、Ｃ末端伸長を欠き、及び／又は修飾されたＣ末端伸長を含有する。Ｇａｇポリペプチドは、所望により、１種又は複数のさらなるポリペプチド（例えば、異種抗原）を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｇａｇポリペプチドは、異種抗原と同時発現される（例えば、別個のプロモーター下で及び／又は別個のタンパク質として）。いくつかの実施形態では、Ｇａｇポリペプチドは、異種抗原との融合タンパク質として発現される。Ｇａｇポリペプチドを、異種抗原と連結し、Ｇａｇ機能を変更することなく融合タンパク質を作製できる。例えば、異種抗原のコード配列は、Ｇａｇポリペプチドコード配列中に、例えば、Ｇａｇポリペプチドコード配列の３’末端にスプライスされ得る。いくつかの実施形態では、異種抗原のコード配列は、Ｇａｇポリペプチドコード配列中にインフレームでスプライスされ得る。いくつかの実施形態では、Ｇａｇポリペプチドコード配列及び異種抗原は、単一のプロモーターによって発現され得る。いくつかの実施形態では、異種抗原は、ＧａｇポリペプチドのＣ末端に挿入される（例えば、それと融合される）。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、自己組織化Ｇａｇポリペプチドの、異種抗原との融合によって、修飾されていないＧａｇとして作用する融合タンパク質が生じ、結果として、抗原が、得られるＶＬＰの構造成分中に組み込まれることを可能にすると考えられる。いくつかの実施形態では、ＶＬＰ構造成分は、有効な免疫源（例えば、細胞性免疫応答の誘導のための）として働く。例えば、提供されるＶＬＰは、レトロウイルスのＧａｇポリペプチド（例えば、ＭＭＬＶ Ｇａｇ）及びＨＣＭＶ（例えば、ｐｐ６５）の構造成分を含み得る。いくつかのこのような実施形態では、ｐｐ６５は、ＶＬＰ中に組み込まれ、ＨＣＭＶに対する免疫応答を誘発するための抗原として働く。

[0076]本発明に従って使用するための例示的Ｇａｇ−ｐｐ６５融合ポリペプチドは、以下の配列番号４に示されている。いくつかの実施形態では、適したＧａｇポリペプチド融合タンパク質は、既知レトロウイルスのＧａｇポリペプチドと実質的に相同であるＧａｇポリペプチドのすべて又は一部及び既知ｐｐ６５ポリペプチドと実質的に相同であるｐｐ６５ポリペプチドのすべて又は一部を含む。例えば、Ｇａｇ−ｐｐ６５ポリペプチド融合タンパク質は、野生型又は天然に存在するＧａｇポリペプチド及び／又はｐｐ６５ポリペプチドと比較して、１つ又は複数のアミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を含有するが、実質的自己組織化活性を保持し得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明に適したＧａｇ−ｐｐ６５ポリペプチド融合タンパク質は、配列番号４に対して実質的に相同である。いくつかの実施形態では、本発明に適したＧａｇ−ｐｐ６５ポリペプチド融合タンパク質は、配列番号４に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上相同なアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に適したＧａｇ−ｐｐ６５ポリペプチド融合タンパク質は、配列番号４に対して実質的に同一である。いくつかの実施形態では、本発明に適したＧａｇ−ｐｐ６５ポリペプチド融合タンパク質は、配列番号４に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一であるアミノ酸配列を有する。
ＭＭＬＶ Ｇａｇ−ＣＭＶ ｐｐ６５アミノ酸配列（配列番号４）

（配列番号４）（ＭＭＬＶ Ｇａｇアミノ酸配列は太字である）
ＭＭＬＶ Ｇａｇ−ＣＭＶ ｐｐ６５ヌクレオド配列（配列番号５）

（配列番号５）（ＭＭＬＶ Ｇａｇヌクレオチド配列は太字である）
コドン最適化ＭＭＬＶ Ｇａｇ−ＣＭＶ ｐｐ６５ヌクレオチド配列（配列番号６）

（配列番号６）（ＭＭＬＶ Ｇａｇヌクレオチド配列は太字である）
コドン最適化ＭＭＬＶ Ｇａｇ−ＣＭＶ ｐｐ６５ヌクレオチド配列（配列番号２２）

（配列番号２２）（ＭＭＬＶ Ｇａｇヌクレオチド配列は太字である）

[0077]いくつかの実施形態では、本発明は、Ｇａｇポリペプチド又はＧａｇポリペプチドの特徴的な部分をコードする核酸を提供する。特定の実施形態では、核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得、一本鎖又は二本鎖であり得る。いくつかの実施形態では、本発明の核酸は、１種又は複数の非天然ヌクレオチドを含み得、その他の実施形態では、本発明の核酸は、天然ヌクレオチドのみを含む。

Ｂ．エンベロープタンパク質
[0078]いくつかの実施形態では、本発明は、ＨＣＭＶに由来する１種又は複数のエンベロープポリペプチド（例えば、ｇＢ及び／又はｇＨ）からなるＶＬＰを利用する。本明細書において使用されるように、用語「エンベロープポリペプチド」とは、そのアミノ酸配列が、エンベロープ糖タンパク質の少なくとも１種の特徴的な配列を含むポリペプチド配列を指す。それだけには限らないが、ＨＣＭＶを含めた種々のウイルスに由来するさまざまなエンベロープ糖タンパク質配列は、当技術分野で公知であり、このような配列を参照した当業者は、全般的に、エンベロープ糖タンパク質に、及び／又は特定のエンベロープ糖タンパク質に特徴的である配列を容易に同定できる。いくつかの実施形態では、エンベロープポリペプチドは、細胞質、膜貫通及び／又は細胞外部分又はドメインを含む。

[0079]いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶに由来するエンベロープポリペプチドは、ＨＣＭＶタンパク質において天然には見られない膜貫通及び細胞質ドメインを含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶに由来するエンベロープポリペプチドは、別のＨＣＭＶタンパク質（例えば、ｇＢ又はｇＨ）に由来する膜貫通及び細胞質ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶに由来するエンベロープポリペプチドは、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）において天然に見られる膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含む。当技術分野で公知のように、ポリペプチドは、膜貫通、細胞質及び／又は細胞外ドメインを有することもある。一般に、「膜貫通ドメイン」とは、本明細書において使用されるように、膜中に存在するという特質を有するドメインを指す（例えば、細胞膜の一部又はすべてにわたる）。理解されるように、膜貫通ドメイン中のどのアミノ酸も膜中に存在することは必要ではない。例えば、いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、タンパク質の指定された一続き又は部分が、実質的に膜中に位置することを特徴とする。当技術分野で周知であるように、タンパク質細胞内局在性（例えば、膜貫通局在性）を予測するために、種々のアルゴリズムを使用してアミノ酸又は核酸配列が解析され得る。例示的なこのようなプログラムとして、中でも、ｐｓｏｒｔ（ＰＳＯＲＴ．ｏｒｇ）、Ｐｒｏｓｉｔｅ（ｐｒｏｓｉｔｅ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）が挙げられる。一般に、「細胞質ドメイン」とは、本明細書において使用されるように、細胞質中に存在するという特質を有するドメインを指す。理解されるように、細胞質ドメイン中のどのアミノ酸も細胞質中に存在することは必要ではない。例えば、いくつかの実施形態では、細胞質ドメインは、タンパク質の指定された一続き又は部分が、実質的に細胞質中に位置することを特徴とする。当技術分野で周知であるように、タンパク質細胞内局在性（例えば、細胞質局在性）を予測するために、種々のアルゴリズムを使用してアミノ酸又は核酸配列が解析され得る。例示的なこのようなプログラムとして、中でも、ｐｓｏｒｔ（ＰＳＯＲＴ．ｏｒｇ）、Ｐｒｏｓｉｔｅ（ｐｒｏｓｉｔｅ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）が挙げられる。

[0080]ＶＳＶ−Ｇの膜貫通ドメインは、ウイルスの糖タンパク質を細胞膜にターゲッティングするよう機能する（Ｃｏｍｐｔｏｎ Ｔら、１９８９年 Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６巻：４１１２〜４１１６頁）。タンパク質を細胞膜に向けるために、天然タンパク質が、天然にはこれを行わないか、又はこれを達成するために補助的な同時発現されるタンパク質を必要とする場合に、ＶＳＶ−Ｇの膜貫通及び細胞質ドメインを、別のタンパク質の膜貫通及び細胞質ドメインと交換することが利用された（Ｇａｒｒｏｎｅ Ｐら、２０１１年 Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ９４：）。

[0081]とりわけ、本発明は、ウイルス（例えば、ＭＬＶ）の構造成分及び１種又は複数の異種表面抗原（例えば、エンベロープタンパク質）を含有するＶＬＰは、抗原送達及び異種抗原に対する免疫応答の誘導に特に有効であるという認識を包含する。

Ｃ．異種抗原
[0082]中和抗体は、一般に、感染を防ぐことができるので、糖タンパク質ｇＢ及びｇＨなどのＨＣＭＶのエンベロープタンパク質は、ＨＣＭＶに対する中和抗体の製造のための重要な標的である。ｇＢサブユニットワクチンなどのＨＣＭＶ感染の治療が開発され、実験動物及び臨床研究において試験された。しかし、このような研究の結果は、ヒトでは、抗体応答は、長く続かず、すべての場合においてＨＣＭＶの治療にとって十分に有効ではないということを実証した。もっぱらＨＣＭＶのｇＢに基づくサブユニットワクチンの制限された有効性について示唆された理由は、順に、免疫応答における株特異的変動、細胞性免疫応答の不十分な誘導及びエピトープがコンホメーション依存性であると考えられる使用された抗原の構造的制限である。本発明者らは、ＶＬＰの表面でその天然コンホメーションで提示される１種又は複数のエンベロープポリペプチド抗原を含むＨＣＭＶワクチンの開発は、中和抗体の誘導（例えば、体液性免疫応答による）につながり、１種又は複数の構造タンパク質抗原（例えば、外被タンパク質ｐｐ６５）を含むＨＣＭＶワクチンは、ヘルパーＴ細胞（Ｔ_Ｈリンパ球）及び細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）（例えば、細胞媒介性免疫応答による）の誘導につながると認識した。中和抗体は、一般に、ウイルスのエンベロープタンパク質に対して、特に、ＨＣＭＶ糖タンパク質ｇＢ及びｇＨに対して形成される。Ｔ_Ｈ細胞は、例えば、ＨＣＭＶ ｐｐ６５（ｐｐＵＬ８３）などのウイルスの外被構造タンパク質によって刺激される。さらに、ｐｐ６５は、ＨＣＭＶに対するＣＴＬ反応の誘導において重要な役割を果たす。

[0083]当然のことではあるが、提供されたＶＬＰは、ＨＣＭＶに由来する異種抗原を含めた任意の異種抗原を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、本発明に従うＶＬＰは、１種又は複数のＨＣＭＶエンベロープポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本発明に従うＶＬＰは、１種又は複数のＨＣＭＶ構造ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本発明に従うＶＬＰは、１種又は複数のＨＣＭＶエンベロープポリペプチド及び１種又は複数のＨＣＭＶ構造ポリペプチドを含む。例示的であるが、限定されないＨＣＭＶ抗原の一覧を、以下に提供する。
ｇＢ−糖タンパク質複合体（ｇＣ）Ｉ

[0084]ＨＣＭＶの最も十分に特性決定された糖タンパク質複合体は、ｇＢ複合体である（ｇＢ；ＵＬ５５）。ＣＭＶ血清陽性個体から得られた血清は、ｇＢに対する抗体を含有し、回復期患者血清における中和抗体反応の最大７０％が、ｇＢ特異的であることが実証されている（Ｍａｒｓｈａｌｌ ＧＳら、１９９４年 Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ ４３巻：７７〜８３頁）。

[0085]例示的ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドアミノ酸及び核酸配列が、それぞれ、配列番号７及び配列番号８として、以下に示されている。いくつかの実施形態では、適したｇＢポリペプチドは、既知のＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドに対して実質的に相同である。例えば、ｇＢポリペプチドは、野生型又は天然に存在するｇＢポリペプチド（例えば、配列番号７）と比較して、１つ又は複数のアミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を含有する修飾されたＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドであり得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明に適したｇＢポリペプチドは、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチド（配列番号７）に対して実質的に相同である。いくつかの実施形態では、本発明に適したＨＣＭＶポリペプチドは、配列番号７に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上相同なアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に適したｇＢポリペプチドは、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチド（配列番号７）に対して実質的に同一である。いくつかの実施形態では、本発明に適したｇＢポリペプチドは、配列番号７に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一であるアミノ酸配列を有する。
ＨＣＭＶ ｇＢアミノ酸配列（配列番号７）

（配列番号７）（ＴＭ及びＣＤに下線が引かれている）
ＨＣＭＶ ｇＢヌクレオチド配列（配列番号８）

（配列番号８）（ＴＭ及びＣＤに下線が引かれている）
コドン最適化ＨＣＭＶ ｇＢヌクレオチド配列（配列番号９）

（配列番号９）（ＴＭ及びＣＤに下線が引かれている）

[0086]いくつかの実施形態では、本発明に従って使用するためのｇＢポリペプチドは、膜貫通ドメイン及び／若しくは細胞質ドメイン欠失、並びに／又は膜貫通ドメイン及び／若しくは細胞質ドメインの修飾を含有する。ｇＢポリペプチドは、１種又は複数のさらなるポリペプチド（例えば、異種膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインポリペプチド）を所望により含んでもよい。いくつかの実施形態では、ｇＢポリペプチドは、異種ポリペプチドとの融合タンパク質として発現される。ｇＢポリペプチドを、異種ポリペプチドと連結し、ｇＢ機能及び／又は抗原性を変更することなく融合タンパク質を作製できる。例えば、異種ポリペプチドのコード配列は、ｇＢポリペプチドコード配列中に、例えば、ｇＢポリペプチドコード配列の３’末端にスプライスされ得る。いくつかの実施形態では、異種ポリペプチドのコード配列は、ｇＢポリペプチドコード配列中にインフレームでスプライスされ得る。いくつかの実施形態では、ｇＢポリペプチドコード配列及び異種ポリペプチドは、単一のプロモーターによって発現され得る。いくつかの実施形態では、異種ポリペプチドは、ｇＢポリペプチドのＣ末端に挿入される（例えば、それと融合される）。

[0087]いくつかの実施形態では、異種ポリペプチドは、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）において見られる膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインであるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインを欠くｇＢが、ＶＳＶに由来する膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインと融合される。本発明に従って使用するための例示的ｇＢ−ＶＳＶ融合ポリペプチドは、配列番号１０として以下に示されている。いくつかの実施形態では、適したｇＢ−ＶＳＶポリペプチド融合タンパク質は、既知のｇＢポリペプチドに対して実質的に相同であるｇＢポリペプチドのすべて又は一部及び既知のＶＳＶポリペプチドに対して実質的に相同であるＶＳＶポリペプチドのすべて又は一部を含む。例えば、ｇＢ−ＶＳＶポリペプチド融合タンパク質は、野生型又は天然に存在するｇＢ及び／又はＶＳＶポリペプチドと比較して、１つ又は複数のアミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を含有し得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明に適したｇＢ−ＶＳＶポリペプチド融合タンパク質は、配列番号１０に対して実質的に相同である。いくつかの実施形態では、本発明に適したｇＢ−ＶＳＶポリペプチド融合タンパク質は、配列番号１０に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上相同なアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に適したｇＢ−ＶＳＶポリペプチド融合タンパク質は、配列番号１０に対して実質的に同一である。いくつかの実施形態では、本発明に適したｇＢ−ＶＳＶ ポリペプチド融合タンパク質は、配列番号１０に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一であるアミノ酸配列を有する。本明細書において、「ｇＢ−Ｇ」とは、ＨＭＣＶ ｇＢ−ＶＳＶ ＴＭ／ＣＴＤ融合タンパク質を指す。
ＨＣＭＶ ｇＢ−Ｇアミノ酸配列（配列番号１０）

（配列番号１０）（ＴＭ及びＣＴＤに下線が引かれている）
ＨＣＭＶ ｇＢ−Ｇヌクレオチド配列（配列番号１１）

（配列番号１１）（ＴＭ及びＣＴＤに下線が引かれている）
コドン最適化ＨＣＭＶ ｇＢ−Ｇヌクレオチド配列（配列番号１２）

（配列番号１２）（ＴＭ及びＣＴＤに下線が引かれている）

ｇＨ−糖タンパク質複合体（ｇＣ）ＩＩＩ
[0088]ｇｃ ＩＩＩ複合体は、糖タンパク質ｇＨ（ＵＬ７５）、ｇＬ（ＵＬ１１５）及びｇＯ（ＵＬ７４）を含有する（Ｕｒｂａｎ Ｍら、１９９６年 Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７７巻：１５３７〜４７頁）。ｇＢと同様に、ｇＨは、ヒト病原性ヘルペスウイルスの間で保存されており、ＨＣＭＶ複製の間のいくつかの段階において重要な役割を果たす。ＨＣＭＶは、２種のｇＨ／ｇＬ複合体：ｇＨ／ｇＬ／ｇＯ及びｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１複合体をコードする（Ｗａｎｇ Ｄ及びＳｈｅｎｋ Ｔ ２００５年 Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ ＵＳＡ １０２巻：１８１５３〜８頁）。ｇＯを含有する複合体は、一般に、ＨＣＭＶでの線維芽細胞感染に十分であるが、ＨＣＭＶが内皮及び上皮細胞に感染するには、ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１を含有する複合体が必要とされる（Ｗａｎｇ Ｄ及びＳｈｅｎｋ Ｔ ２００５年 Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７９巻１０３３０〜８頁）。ＨＣＭＶでの自然感染は、一般に、上皮細胞侵入に特異的な高力価中和抗体を誘発し、ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１エピトープに対する抗体は、この活性の重要な成分を含み得るということが実証されている（Ｍａｃａｇｎｏ Ａら、２０１０年 Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８４巻：１００５〜１３頁）。ｇＨに関する免疫学的研究は、哺乳類細胞では、正しいプロセシング及び細胞膜への輸送のために、タンパク質が、さらなるポリペプチド（ｇＬなど）を必要とすることを実証した（Ｕｒｂａｎ Ｍら、１９９６年 Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７７巻：１５３７〜１５４７頁）。ｇＨは、単独で発現される場合には、細胞質及び／又は核膜中にもっぱら見られる（Ｃｒａｎａｇｅ ＭＰら、１９８８年 Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６２巻：１４１６〜１４２２頁）。

[0089]例示的ＨＣＭＶ ｇＨポリペプチドアミノ酸及び核酸配列は、それぞれ、配列番号１３及び配列番号１４として以下に示されている。いくつかの実施形態では、適したｇＨポリペプチドは、既知のＨＣＭＶ ｇＨポリペプチドに対して実質的に相同である。例えば、ｇＨポリペプチドは、野生型又は天然に存在するｇＨポリペプチド（例えば、配列番号１３）に対して、１つ又は複数のアミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を含有する修飾されたＨＣＭＶ ｇＨポリペプチドであり得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明に適したｇＨポリペプチドは、ＨＣＭＶ ｇＨポリペプチド（配列番号１３）に対して実質的に相同である。いくつかの実施形態では、本発明に適したＨＣＭＶ ｇＨポリペプチドは、配列番号１３に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上相同なアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に適したｇＨポリペプチドは、ＨＣＭＶ ｇＨポリペプチド（配列番号１３）に対して実質的に同一である。いくつかの実施形態では、本発明に適したｇＨポリペプチドは、配列番号１３に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一であるアミノ酸配列を有する。
ＨＣＭＶ ｇＨアミノ酸配列（配列番号１３）

（配列番号１３）（ＴＭ及びＣＴＤに下線が引かれている）
ＨＣＭＶ ｇＨヌクレオチ配列（配列番号１４）

（配列番号１４）（ＴＭ及びＣＴＤに下線が引かれている）
コドン最適化 ＨＣＭＶ ｇＨヌクレオチド配列（配列番号１５）

（配列番号１５）（ＴＭ及びＣＴＤに下線が引かれている）

[0090]いくつかの実施形態では、本発明に従って使用するためのｇＨポリペプチドは、膜貫通ドメイン及び／若しくは細胞質ドメインの欠失、並びに／又は膜貫通ドメイン及び／若しくは細胞質ドメインの修飾を含有する。ｇＨポリペプチドは、１種又は複数のさらなるポリペプチド（例えば、異種膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインポリペプチド）を所望により含んでもよい。いくつかの実施形態では、ｇＨポリペプチドは、異種ポリペプチドとの融合タンパク質として発現される。ｇＨポリペプチドを、異種ポリペプチドと連結して、ｇＨ機能及び／又は抗原性を変更することなく融合タンパク質を作製できる。例えば、異種ポリペプチドのコード配列は、ｇＨポリペプチドコード配列中に、例えば、ｇＨポリペプチドコード配列の３’末端にスプライスされ得る。いくつかの実施形態では、異種ポリペプチドのコード配列は、ｇＨポリペプチドコード配列中にインフレームでスプライスされ得る。いくつかの実施形態では、ｇＨポリペプチドコード配列及び異種ポリペプチドは、単一のプロモーターによって発現され得る。いくつかの実施形態では、異種ポリペプチドは、ｇＨポリペプチドのＣ末端に挿入される（例えば、それと融合される）。

[0091]いくつかの実施形態では、異種ポリペプチドは、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）において見られる膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインであるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインを欠くｇＨが、ＶＳＶに由来する膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインと融合される。本発明に従って使用するための例示的ｇＨ−ＶＳＶ融合ポリペプチドは、配列番号１６として以下に示されている。いくつかの実施形態では、適したｇＨ−ＶＳＶポリペプチド融合タンパク質は、既知のＨＣＭＶ ｇＨポリペプチドに対して実質的に相同であるｇＨポリペプチドのすべて又は一部及び既知のＶＳＶポリペプチドに対して実質的に相同であるＶＳＶポリペプチドのすべて又は一部を含む。例えば、ｇＨ−ＶＳＶポリペプチド融合タンパク質は、野生型又は天然に存在するｇＨ及び／又はＶＳＶポリペプチドと比較して、１つ又は複数のアミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を含有し得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明に適したｇＨ−ＶＳＶポリペプチド融合タンパク質は、配列番号１６に対して実質的に相同である。いくつかの実施形態では、本発明に適したｇＨ−ＶＳＶポリペプチド融合タンパク質は、配列番号１６に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上相同であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に適したｇＨ−ＶＳＶポリペプチド融合タンパク質は、配列番号１６に対して実質的に同一である。いくつかの実施形態では、本発明に適したｇＨ−ＶＳＶポリペプチド融合タンパク質は、配列番号１６に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一であるアミノ酸配列を有する。本明細書において使用されるように、「ｇＨ−Ｇ」とは、ＨＭＣＶ ｇＨ−ＶＳＶ ＴＭ／ＣＴＤ融合タンパク質を指す。
ＨＣＭＶ ｇＨ−Ｇアミノ酸配列（配列番号１６）

（配列番号１６）（ＴＭ及びＣＴＤに下線が引かれている）
ＨＣＭＶ ｇＨ−Ｇヌクレオチド配列（配列番号１７）

（配列番号１７）（ＴＭ及びＣＴＤに下線が引かれている）
コドン最適化ＨＣＭＶ ｇＨ−Ｇヌクレオチド配列（配列番号１８）

（配列番号１８）（ＴＭ及びＣＴＤに下線が引かれている）

[0092]いくつかの実施形態では、ｇＨポリペプチドは、ｇＢに見られる膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインを含む。本発明に従って使用するためのＨＣＭＶ ｇＨ−ＨＣＭＶ ｇＢ ＴＭ／ＣＴＤ融合ポリペプチドをコードする例示的ヌクレオチドは、配列番号２０として以下に示されている。いくつかの実施形態では、本発明に適したＨＣＭＶ ｇＨ−ＨＣＭＶ ｇＢ ＴＭ／ＣＴＤポリペプチドは、配列番号２０によってコードされるポリペプチドと実質的に相同である。いくつかの実施形態では、本発明に適したＨＣＭＶ ｇＨ−ＨＣＭＶ ｇＢ ＴＭ／ＣＴＤポリペプチドは、配列番号２０によってコードされるポリペプチドと少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上相同であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に適したＨＣＭＶ ｇＨ−ＨＣＭＶ ｇＢ ＴＭ／ＣＴＤポリペプチドは、配列番号２０によってコードされるポリペプチドと実質的に同一である。いくつかの実施形態では、本発明に適したＨＣＭＶ ｇＨ−ＨＣＭＶ ｇＢ ＴＭ／ＣＴＤ ポリペプチドは、配列番号２０によってコードされるポリペプチドと少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一であるアミノ酸配列を有する。
ＨＣＭＶ ｇＨ−ＨＣＭＶ ｇＢ ＴＭ／ＣＴＤヌクレオチド配列（配列番号２０）

（配列番号２０）（ｇＨペプチドシグナルに下線が引かれている；ｇＢ ＴＭ−ＣＴＤは太字である）

その他（ｇＮ及びｇＭ糖タンパク質複合体（ｇＣ）ＩＩを含む）
[0093]ｇＢ及びｇＨに加えて、その他のエンベロープ糖タンパク質が、ワクチン開発において有用であり得る。例えば、ｇＮ（ＵＬ７３）及びｇＭ（ＵＬ１００）を含有するｇｃＩＩ複合体は、特に注目される。ＨＣＭＶビリオンのプロテオミクス解析によってウイルス粒子中でｇｃＩＩが最も豊富に発現される糖タンパク質であることが実証され、これは、感染防御免疫における潜在的な重要性を強調する（Ｖａｒｎｕｍ ＳＭら、２００５年 Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １６巻：１１４３〜５０頁）。ＨＣＭＶ感染は、血清陽性の個体の大部分においてｇｃＩＩ特異的抗体反応を誘発し（Ｓｈｉｍａｍｕｒａ Ｍら、２００６年 Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８０巻：４５９１〜６００頁）、ｇｃＩＩ抗原ｇＭ及びｇＮを含有するＤＮＡワクチンは、ウサギ及びマウスにおいて、中和抗体反応を誘発するとわかった（Ｓｈｅｎ Ｓら、２００７年 Ｖａｃｃｉｎｅ ２５巻：３３１９〜２７頁）。

ｐｐ６５
[0094]ＨＣＭＶに対する細胞性免疫応答は、その多くがウイルスの外被、エンベロープとヌクレオカプシドの間にあるウイルス粒子の領域に見られる、いくつかのウイルス抗原に対する、ＭＨＣクラスＩＩに制限されたＣＤ４^＋及びＭＨＣクラスＩに制限された、細胞傷害性ＣＤ８^＋Ｔリンパ球応答を含む。例えば、ＨＣＭＶ ｐｐ６５タンパク質（ＵＬ８３）は、ＨＣＭＶ感染後に、相当なＣＤ８^＋Ｔリンパ球応答を誘発するとわかっている。（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ−Ｔａｙｌｏｒ Ｅ １９９４年 Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ ４３巻：１０３〜１０頁）。この６５ｋＤａのウイルスタンパク質は、ＨＣＭＶの最も豊富に発現される構造タンパク質の１種である。例示的ｐｐ６５配列は、本明細書に記載されている。

その他（ＩＥ１、ｐｐ１５０を含む）
[0095]Ｔリンパ球応答を誘発するその他のタンパク質として、最初期１（ＩＥ１）タンパク質（ＵＬ１２３）及びｐｐ１５０（ＵＬ３２）が挙げられる（Ｇｉｂｓｏｎ Ｌら、２００４年 Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７２巻：２２５６〜６４頁；Ｌａ Ｒｏｓａ Ｃら、２００５年 Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６６巻：１１６〜２６頁）。

[0096]上記のように、Ｇａｇポリペプチドは、１種又は複数のさらなるポリペプチド（例えば、異種抗原）を所望により含んでもよい。いくつかの実施形態では、Ｇａｇポリペプチドは、異種抗原と同時発現される（例えば、別個のプロモーター下で、及び／又は別個のタンパク質として）。Ｇａｇポリペプチドは、Ｇａｇ機能を変更することなく異種抗原と同時発現され得る。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、自己組織化Ｇａｇポリペプチドの異種エンベロープ抗原との同時発現は、抗原が、得られたＶＬＰのエンベロープ又は脂質二重層中に組み込まれるのを可能にすると考えられる。いくつかの実施形態では、ＶＬＰエンベロープ成分は、有効な免疫原として働く（例えば、体液性免疫応答の誘導のための）。いくつかの実施形態では、Ｇａｇポリペプチドは、異種抗原との融合タンパク質として発現される。例えば、異種抗原のコード配列は、Ｇａｇポリペプチドコード配列中に、例えば、Ｇａｇポリペプチドコード配列の３’末端でスプライスされ得る。いくつかの実施形態では、異種抗原のコード配列は、Ｇａｇポリペプチドコード配列中にインフレームでスプライスされ得る。いくつかの実施形態では、Ｇａｇポリペプチドコード配列及び異種抗原は、単一のプロモーターによって発現され得る。いくつかの実施形態では、異種抗原は、ＧａｇポリペプチドのＣ末端に挿入される（例えば、それと融合される）。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、自己組織化Ｇａｇポリペプチドの異種抗原との融合によって、抗原が、得られたＶＬＰの構造成分中に組み込まれることが可能になると考えられる。いくつかの実施形態では、ＶＬＰ構造成分は、有効な免疫原として働く（例えば、細胞性免疫応答の誘導のための）。例えば、提供されるＶＬＰは、レトロウイルスのｇａｇポリペプチド（例えば、ＭＬＶ ｇａｇ）及びＨＣＭＶの構造成分（例えば、ｐｐ６５）を含み得る。いくつかのこのような実施形態では、ｐｐ６５は、ＶＬＰ中に組み込まれ、ＨＣＭＶに対する免疫応答を誘発するための抗原として働く。

[0097]提供されるＶＬＰは、自己組織化して、ＶＬＰを形成し、ＶＬＰ内部に位置するよう配置され、構築される構造レトロウイルスタンパク質（例えば、Ｇａｇポリペプチド）を含有し得る。いくつかの実施形態では、提供されるＶＬＰは、エンベロープタンパク質の１種又は複数のエピトープ（例えば、ｇＢ及び／又はｇＨ）が、ＶＬＰ表面上に位置するように、配置され、構築されるエンベロープタンパク質（例えば、ｇＢ及び／又はｇＨ）を含有する。いくつかの実施形態では、提供されるＶＬＰは、構造タンパク質の１種又は複数のエピトープ（例えば、ｐｐ６５）が、ＶＬＰ内部に位置するように、配置され、構築される融合構造タンパク質（例えば、Ｇａｇ／ｐｐ６５）を含有する。

ＩＩ．ＶＬＰの製造
[0098]当然のことではあるが、ＶＬＰを含む組成物は、通常、さまざまな大きさを有するＶＬＰの混合物を含む。以下に列挙される直径の値は、混合物内の最も頻度の高い直径に対応するということは理解されなくてはならない。いくつかの実施形態では、組成物中のベシクルの９０％超が、最も頻度の高い値の５０％内にある直径を有する（例えば、１０００±５００ｎｍ）。いくつかの実施形態では、分布は、より狭いものであり得、例えば、組成物中のベシクルの９０％超が、最も頻度の高い値の４０、３０、２０、１０又は５％内にある直径を有し得る。いくつかの実施形態では、ＶＬＰ形成を促進するため、及び／又はＶＬＰの大きさを変更するために、音波処理又は超音波処理が使用され得る。いくつかの実施形態では、ＶＬＰの大きさ分布を調整するために、濾過、透析及び／又は遠心分離が使用され得る。

[0099]一般に、本開示内容の方法に従って製造されたＶＬＰは、任意の大きさであり得る。特定の実施形態では、組成物は、約２０ｎｍ〜約３００ｎｍの範囲の直径を有するＶＬＰを含み得る。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ｎｍの下限によって境界され、３００、２９０、２８０、２７０、２６０、２５０、２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９０、１８０又は１７０ｎｍの上限によって境界される範囲内の直径を有することを特徴とする。いくつかの実施形態では、集団内のＶＬＰは、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ｎｍの下限によって境界され、３００、２９０、２８０、２７０、２６０、２５０、２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９０、１８０又は１７０ｎｍの上限によって境界される範囲内の平均直径を示す。いくつかの実施形態では、集団中のＶＬＰは、０．５未満（例えば、０．４５未満、０．４未満又は０．３未満）である多分散指数を有する。いくつかの実施形態では、ＶＬＰ直径は、ナノ化によって決定される。いくつかの実施形態では、ＶＬＰ直径は、電子顕微鏡によって決定される。

Ａ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ／Ｅｘ ｖｉｖｏ ＶＬＰ製造
[0100]本発明に従って提供されるＶＬＰは、当業者に公知の一般法に従って調製され得る。例えば、種々の核酸分子、ゲノム又は再構成されたベクター又はプラスミドは、既知ウイルスの配列を使用して調製され得る。このような配列は、バンクから入手可能であり、材料は、種々の収集物、公開されたプラスミドなどから入手され得る。これらの要素は、当業者に周知の技術を使用して単離及び操作され得るか、又は当技術分野で入手可能であるプラスミドから単離され得る。種々の合成又は人工配列はまた、コンピュータ解析から、又はライブラリーの（ハイスループット）スクリーニングによって製造され得る。ＶＬＰのポリペプチドの組換え発現は、１種又は複数のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とする。１種又は複数のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが得られると、ポリペプチドの製造のためのベクターが、当技術分野で公知の技術を使用する組換えＤＮＡ技術によって製造され得る。本発明に従って使用され得る発現ベクターとして、それだけには限らないが、中でも、哺乳類発現ベクター、バキュロウイルス発現ベクター、植物発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））、プラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）が挙げられる。

[0101]本発明に従って使用され得る例示的ＶＬＰ発現プラスミドは、配列番号１９として以下に示されている：
Ｐｒｏｐｏｌ ＩＩ発現プラスミドヌクレオチド配列（配列番号１９）

（配列番号１９）

[0102]提供されるＶＬＰは、当技術分野で公知の技術に従って調製され得る。例えば、いくつかの実施形態では、提供されるＶＬＰは、任意の利用可能なタンパク質発現系において製造され得る。通常、発現ベクターは従来技術によって宿主細胞に移され、次いで、ＶＬＰを製造するためにトランスフェクトされた細胞が従来技術によって培養される。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、細胞の一過性のトランスフェクションを使用して製造される。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、安定にトランスフェクトされた細胞を使用して製造される。ＶＬＰ製造のために利用され得る通常の細胞株として、それだけには限らないが、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３、ＷＩ３８、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、サル腎臓（ＣＯＳ）、ＨＴ１０８０、Ｃ１Ｏ、ＨｅＬａ、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、３Ｔ３、Ｃ１２７、ＣＶ−１、ＨａＫ、ＮＳ／Ｏ及びＬ−９２９細胞などの哺乳類細胞株が挙げられる。特定の限定されない例として、それだけには限らないが、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫株（ＮＳＯ／１、ＥＣＡＣＣ番号８５１１０５０３）；ヒト網膜芽細胞腫（ＰＥＲ．Ｃ６（ＣｒｕＣｅｌｌ、Ｌｅｉｄｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））；ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚性腎臓株（２９３細胞又は懸濁培養での増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ、３６巻：５９号（１９７７年））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、７７巻：４２１６頁（１９８０年））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ．、２３巻：２４３〜２５１頁（１９８０年））；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１ ５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ． Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、３８３巻：４４〜６８頁（１９８２年））；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝細胞腫株（Ｈｅｐ Ｇ２）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＶＬＰ製造のために利用され得る細胞株として、昆虫（例えば、Ｓｆ−９、Ｓｆ−２１、Ｔｎ−３６８、Ｈｉ５）又は植物（例えば、マメ科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａ）、穀類又はタバコ）細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、特に、グリコシル化がタンパク質機能にとって重要である場合には、タンパク質発現及び／又はＶＬＰ製造にとって哺乳類細胞が好ましいことが理解される（例えば、Ｒｏｌｄａｏ Ａら、２０１０年 Ｅｘｐｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９巻：１１４９〜７６頁参照のこと）。

[0103]当然のことではあるが、挿入された配列の発現を調節するか、又は遺伝子産物を特定の方法で修飾及びプロセシングする細胞株が選択され得る。タンパク質産物のこのような修飾（例えば、グリコシル化）及びプロセシング（例えば、切断又は膜への輸送）は、ＶＬＰの作製又はＶＬＰポリペプチド若しくはさらなるポリペプチド（例えば、アジュバント又はさらなる抗原）の機能にとって重要であり得る。異なる細胞は、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後プロセシング及び修飾の特徴及び特定の機序を有する。発現される外来タンパク質の正確な修飾及びプロセシングを確実にするために、適当な細胞株又は宿主系が選択され得る。一般に、一次転写物の適切なプロセシング、グリコシル化及び遺伝子産物のリン酸化のための適当な細胞機構を有する適当な真核細胞の宿主細胞（パッケージング細胞とも呼ばれる（例えば、２９３Ｔヒト胚性腎臓細胞）が、本発明に従って使用され得る。

[0104]ＶＬＰは、中でも、遠心分離、勾配、スクロース勾配超遠心、タンジェンシャルフロー濾過及びクロマトグラフィー（例えば、イオン交換（陰イオン及び陽イオン）、親和性及びサイジングカラムクロマトグラフィー）又は差次的溶解度などの公知の技術に従って精製され得る。或いは又はさらに、細胞上清は、精製工程を用いず直接使用され得る。精製ＶＬＰに、さらなる抗原又はアジュバントなどのさらなる実体が付加され得る。

[0105]いくつかの実施形態では、提供されるポリヌクレオチド配列は、コドン最適化される。コドン最適化は、当技術分野で周知であり、高レベルのタンパク質が製造されるようなコドン使用の修飾を含む。

Ｂ． Ｉｎ ｖｉｖｏ ＶＬＰ製造
[0106]本発明に従う提供されるＶＬＰは、当技術分野で周知の方法に従うＤＮＡワクチンとして調製され得る。例えば、いくつかの実施形態では、１種又は複数のベクター又はプラスミド、例えば、上記のものなどが、レシピエント細胞が、ベクター又はプラスミドによってコードされるポリペプチドを発現するように対象に投与される。いくつかの実施形態では、このようなポリペプチドを発現するレシピエント細胞は、ポリペプチドを含むＶＬＰを製造する。

Ｃ．一価、二価、三価ｅＶＬＰ
[0107]本発明に従って、細胞は、本明細書に記載されるような単一発現ベクターでトランスフェクトされ得る。いくつかの実施形態では、単一発現ベクターは、ＶＬＰの２種以上の要素（例えば、２種以上の構造ポリタンパク質、ＣＭＶ外被ポリペプチド、ＣＭＶ糖タンパク質など）をコードする。例えば、いくつかの実施形態では、単一発現ベクターは、ＶＬＰの２種以上の要素をコードする。いくつかの実施形態では、単一発現ベクターは、ＶＬＰの３種以上の要素をコードする。

[0108]いくつかの実施形態では、細胞は、２種以上の発現ベクターでトランスフェクトされる。例えば、いくつかの実施形態では、細胞は、Ｇａｇポリペプチドをコードする第１のベクター及びＨＣＭＶエンベロープ糖タンパク質（例えば、ｇＢ又はｇＢ−Ｇ又はｇＨ−Ｇ）をコードする第２のベクターでトランスフェクトされる。いくつかのこのような実施形態では、ＨＣＭＶエンベロープ糖タンパク質（例えば、ｇＢ又はｇＢ−Ｇ又はｇＨ−Ｇ）を含む「一価」ＶＬＰが製造される。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｇａｇポリペプチドをコードする第１のベクター、ＨＣＭＶエンベロープ糖タンパク質（例えば、ｇＢ又はｇＢ−Ｇ又はｇＨ−Ｇ）をコードする第２のベクター及び別のＨＣＭＶエンベロープ糖タンパク質（例えば、ｇＢ又はｇＢ−Ｇ又はｇＨ−Ｇ）をコードする第３のベクターでトランスフェクトされる。いくつかのこのような実施形態では、２種のＨＣＭＶエンベロープ糖タンパク質（例えば、ｇＢ及びｇＨ−Ｇ又はｇＢ−Ｇ及びｇＨ−Ｇ）を含む「二価」ＶＬＰが製造される。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｇａｇ−ｐｐ６５融合ポリペプチドをコードする第１のベクター及びＨＣＭＶエンベロープ糖タンパク質（例えば、ｇＢ又はｇＢ−Ｇ又はｇＨ−Ｇ）をコードする第２のベクターでトランスフェクトされる。いくつかのこのような実施形態では、ＨＣＭＶ構造タンパク質及びＨＣＭＶエンベロープ糖タンパク質（例えば、ｇＢ又はｇＢ−Ｇ又はｇＨ−Ｇ）を含む「二価」ＶＬＰが製造される。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｇａｇ−ｐｐ６５融合ポリペプチドをコードする第１のベクター、ＨＣＭＶエンベロープ糖タンパク質（例えば、ｇＢ又はｇＢ−Ｇ又はｇＨ−Ｇ）をコードする第２のベクター及び別のＨＣＭＶエンベロープ糖タンパク質（例えば、ｇＢ又はｇＢ−Ｇ又はｇＨ−Ｇ）をコードする第３のベクターでトランスフェクトされる。いくつかのこのような実施形態では、ＨＣＭＶ構造タンパク質及び２種のＨＣＭＶエンベロープ糖タンパク質（例えば、ｇＢ及びｇＨ−Ｇ又はｇＢ−Ｇ及びｇＨ−Ｇ）を含む「三価」ＶＬＰが製造される。

[0109]いくつかの実施形態では、一価、二価又は三価ＶＬＰが混合される。例えば、いくつかの実施形態では、三価ＶＬＰ混合物を形成するために一価及び二価ＶＬＰが混合される。いくつかの実施形態では、三価ＶＬＰ混合物を形成するために２種の二価ＶＬＰが混合される。

ＩＩＩ．ＨＣＭＶ感染及び治療
[0110]ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、β−ヘルペスウイルスは、普遍的に生じる病原体である。一般に、細胞へのヘルペスウイルスの侵入は、吸着及び受容体結合と、それに続く、ウイルスエンベロープの細胞膜との融合によって開始される複雑なプロセスである。融合は、一般に、原形質膜又はエンドソーム膜のいずれかで起こる。ＨＣＭＶは、ｉｎ ｖｉｖｏで、上皮細胞、内皮細胞及び線維芽細胞を含めた複数の細胞種に感染する（Ｐｌａｃｈｔｅｒ Ｂら、１９９６年 Ａｄｖ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ ４６巻：１９５〜２６１頁）。線維芽細胞の原形質膜と融合し（Ｃｏｍｐｔｏｎ Ｔら、１９９２年 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９１巻 ：３８７〜３９５頁）、エンドサイトーシスによって網膜色素上皮細胞及び臍帯静脈内皮細胞に侵入する（Ｂｏｄａｇｈｉ Ｂら、１９９９年 Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６２巻：９５７〜９６４頁；Ｒｙｃｋｍａｎ ＢＪら、２００６年 Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８０巻：７１０〜７２２頁）。ヘルペスウイルスがその侵入経路を選択する機序は、依然としてわかっていない。一般に、侵入経路は主に宿主細胞によって決定されると考えられているが、ビリオン糖タンパク質の向性の役割の証拠がある（Ｗａｎｇ Ｘら、１９９８年 Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２巻：５５５２〜５５５８頁）。先に記載されたように、ＨＣＭＶは、２種のｇＨ／ｇＬ複合体：ｇＨ／ｇＬ／ｇＯ及びｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１をコードする。ｇＯ含有複合体は、線維芽細胞感染にとって十分であるのに対し、ｐＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１含有複合体は、内皮及び上皮細胞のＨＣＭＶ感染にとって重要である。

[0111]ＨＣＭＶは、４０歳までに成人の５０〜８５％に感染する（Ｇｅｒｓｈｏｎ ＡＡら、１９９７年 Ｖｉｒａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎｓ、第４版、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ：２２９〜２５１頁）。誕生後にＨＣＭＶを獲得するほとんどの健常な個体は、あるとしても、２、３の症状しか発症しない。しかし、造血細胞移植（ＨＣＴ）及び実質臓器移植（ＳＯＴ）のレシピエントなどの免疫無防備状態の個体では、ＨＣＭＶ疾患は、相当な罹病率及び死亡率の原因である（Ｐａｓｓ ＲＦ ２００１ Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ． Ｉｎ Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．第４版、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ； Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｅｎｓ：２６７５〜２７０５頁）。ＳＯＴ又はＨＣＴ集団では、ＨＣＭＶ疾患は、ドナー臓器若しくはＨＣＴから伝染した新規感染から起こり得るか、又はレシピエントにおける潜在性ウイルスの再活性化の結果として再発し得る。ＨＩＶ感染個体では、ＨＣＭＶ感染は、抗レトロウイルス治療の有効性にかかわらず、ＡＩＤＳ及び死亡への進行を加速する（Ｄｅａｙｔｏｎ ＪＲら、２００４年 Ｌａｎｃｅｔ ３６３巻：２１１６−２１２１）。さらに、米国では、ＨＣＭＶは、最もよくある子宮内感染であり、毎年、およそ８０００人の乳児（幼児）において、死亡又は聴覚消失及び精神遅滞を含めた重篤な先天的欠損症をもたらす先天性の異常を引き起こす（Ｓｔａｇｏｎ Ｓら、１９８６年 ＪＡＭＡ ２５６巻：１９０４〜１９０８頁）。

[0112]ＨＣＭＶを制御する免疫応答は、不完全にしか理解されていない。その他のヒトヘルペスウイルスに対する類似性によって、細胞性及び体液性免疫応答の両方とも、重要な役割を果たすと考えられ得る（Ｋｏｈｌ Ｓ １９９２年 Ｃｕｒｒｅｎｔ ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７９巻：７５〜８８頁）。マウスＣＭＶについて、細胞傷害性Ｔ細胞応答又は中和抗体の受動的移動は、致死的な抗原曝露から防御するのに十分であるということがわかった（Ｒａｐｐ Ｍら、１９９３年 Ｍｕｌｔｉｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ：３２７〜３３２頁； Ｒｅｄｄｅｈａｓｅ ＭＪら、１９８ Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６１巻：３１０２〜３１０８頁）。

[0113]免疫無防備状態の人におけるＣＭＶの制御は、主に細胞性免疫応答と関連している；ＣＤ８^＋及びＣＤ４^＋Ｔリンパ球の両方が、ＣＭＶ疾患に対する防御にとって重要である（Ｇａｍａｄｉａ ＬＥら、２００３年 Ｂｌｏｏｄ １０１巻：２６８６〜２６９２頁；Ｃｏｂｂｏｌｄ Ｍら、２００５年 Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０２巻：３７９〜３８６頁）。ＣＭＶに対する細胞性免疫応答は、ウイルスの外被、エンベロープとカプシドの間のウイルス粒子の領域中に見られるいくつかの抗原に対する、ＣＤ４^＋ヘルパーＴリンパ球及びＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔリンパ球応答を含む。健常なドナーから得たＣＭＶ特異的ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞の最近の研究は、一連のＣＭＶオープンリーディングフレームから得た重複するペプチドを使用して、ＣＭＶ感染後に認識される抗原を同定した（Ｓｙｌｗｅｓｔｅｒ ＡＷら、２００５年 Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０２巻：６７３〜６８５頁）。ＣＭＶ外被ホスホタンパク質６５（ｐｐ６５）及び表面糖タンパク質ｇＢが、ＣＤ４^＋Ｔ細胞によって最も頻繁に認識される抗原であり、ｐｐ６５もまた、ＣＤ８^＋Ｔ細胞によって最も頻繁に認識される抗原の１種であった。

[0114]移植の状況とは対照的に、ウイルスに対する母系的体液性免疫応答は、新生児においてＨＣＭＶ疾患を予防するのに重要であると思われる。表面糖タンパク質、特に、ｇＢに対する抗体は、ＣＭＶの母系的胎児移動に対する防御にとって決定的であると思われる（Ｆｏｗｌｅｒ ＫＢら、２００３年ＪＡＭＡ ２８９巻：１００８〜１０１１頁）。さらに、以前のワクチン接種研究において、再感染からの防御は、中和抗体と相関関係があるということがわかった（Ａｄｌｅｒ ＳＰら、１９９５年 Ｊ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ １７１巻：２６〜３２頁）。ＣＭＶに対する体液性免疫応答は、ウイルス粒子の外側エンベロープ中に存在するウイルスのエンベロープ糖タンパク質（例えば、ｇＢ及びｇＨ）に対する応答によって支配されている。

[0115]ＨＣＭＶの場合には、ウイルスが厳密に種特異的であり、動物モデル系が利用可能ではないので、免疫学的エフェクター機能の直接評価は困難である。しかし、マウスＣＭＶ及びモルモットＣＭＶは、これらの宿主種におけるワクチン戦略を評価するために使用されている。

[0116]防御的Ｔ細胞及び中和抗体応答の両方を誘導するＣＭＶワクチンは、感染を防ぐか、又は先天性感染若しくは移植によるＣＭＶ疾患を回復させる可能性を有する。

[0117]ヒトにおいて試験された第１の生存する弱毒化ＨＣＭＶワクチン候補は、実験室に適応したＡＤ１６９株に基づいていた。別の実験室に適応した臨床単離物、Ｔｏｗｎｅ株を用いるその後の試験によって、生存する弱毒化ワクチンは、中和抗体並びにＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔリンパ球応答を誘発し得るということが確認された。Ｔｏｗｎｅワクチンの有効性は、腎移植レシピエントにおける一連の研究において評価された。Ｔｏｗｎｅワクチンは、ＨＣＭＶ疾患に対する防御的影響を提供したが、移植後のＨＣＭＶ感染を防ぐことはできなかった（Ｐｌｏｔｋｉｎ ＳＡら、１９８４年 Ｌａｎｃｅｔ １巻：５２８〜５３０頁）。Ｔｏｗｎｅワクチンはまた、そのＨＣＭＶ感染小児からの感染の獲得から防ぐことができなかった、小児担当グループデイケアを受ける血清陰性母体のプラセボ対照試験においても評価された（Ａｄｌｅｒ ＳＰら、１９９５年 Ｊ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ １７１巻：２６〜３２頁）。これらの研究の解釈は、Ｔｏｗｎｅワクチンは、過剰に弱毒化されたというものであった。この可能性を調査するために、ＣＭＶの弱毒化されていない「Ｔｏｌｅｄｏ」株の領域が、Ｔｏｗｎｅゲノムの対応する領域と置換された一連の遺伝子組換え体は、Ｔｏｗｎｅワクチン弱毒化に関与する突然変異の、すべてではないが一部を含有するＴｏｗｎｅ／Ｔｏｌｅｄｏ「キメラ」の構築をもたらした（Ｈｅｉｎｅｍａｎ ＴＣら２００６年 Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓｅａｓｅ１９３巻：１３５０〜１３６０頁）。４種のＴｏｗｎｅ／Ｔｏｌｅｄｏ「キメラ」の安全性及び認容性が、第Ｉ相試験において試験されている。不顕性ＨＣＭＶ感染を確立する潜在的リスクへの長期安全性の懸念が、生存する弱毒化ワクチンのさらなる開発を妨げてきた。

[0118]先頭に立つサブユニットＣＭＶワクチン候補は、自然感染の際に高力価ウイルス中和抗体反応を誘発するこのタンパク質の能力のために、エンベロープ糖タンパク質、ｇＢ（精製組換えｇＢワクチンは、Ｓａｎｏｆｉ−Ｐａｓｔｅｕｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓによって製造されている）に基づいている。組換えｇＢワクチンは、中和抗体反応を誘発し、優れた安全性プロフィールを有するが、中和抗体反応のその他の糖タンパク質標的を排除し、より重要なことにＴリンパ球標的を排除する。ワクチンは、免疫原性を最適化するためにＭＦ５９アジュバントを必要とする。最近の試験では、このワクチンは、若い女性における第２相臨床試験においてＣＭＶ感染の予防について全体で５０％の有効性を提供した（Ｐａｓｓ ＲＦら、２００９年 Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６０巻：１１９１〜１１９９頁）。サブユニットワクチン候補として評価されているその他のウイルスタンパク質として、ｐｐ６５及びＩＥ１が挙げられ、その両方ともＴ細胞応答を誘発する。

[0119]ＤＮＡワクチンは、動物において頑強な細胞性及び体液性免疫応答を誘発し、ワクチン設計における特異性及び精密度に適している。ＣＭＶに対するＤＮＡワクチンが開発され、候補標的免疫原としてｇＢ、ＩＥ１及びｐｐ６５タンパク質に焦点があてられた。ｐｐ６５及びｇＢをコードするプラスミドＤＮＡを使用する二価のＣＭＶ ＤＮＡワクチン候補（Ｗｌｏｃｈ ＭＫ ２００８年 Ｊ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２９７巻：１６３４〜１６４２頁）及びＩＥ１遺伝子産物をコードする第３のプラスミドも含む三価のワクチン候補（Ｊａｃｏｂｓｏｎ ＭＡ ２００９年 Ｖａｃｃｉｎｅ ２７巻：１５４０〜１５４８頁）が、Ｖｉｃａｌ Ｖａｃｃｉｎｅｓによって開発された（米国特許第７，４１０，７９５号）。三価ＤＮＡワクチンは、単独で、投与経路に関わりなく最小の免疫原性を有していた。しかし、ＣＭＶ ＤＮＡワクチンは、生存する弱毒化ＣＭＶ（Ｔｏｗｎｅ）の投与後に観察されたＣＭＶ抗原に対する記憶応答を安全に抗原刺激すると思われた。

[0120]ベクターワクチンアプローチでは、対象とする遺伝子産物は、非複製（普通、ウイルス）担体との関連で発現される。この一例として、Ｖｉｒｏｇｅｎｅｔｉｃｓ及びＳａｎｏｆｉ−Ｐａｓｔｅｕｒ Ｖａｃｃｉｎｅによって開発されたＡＬＶＡＣと呼ばれるカナリアポックスベクターがあり、これは、哺乳類細胞において不稔に複製する弱毒化ポックスウイルスである。ＣＭＶ ｇＢを発現するＡＬＶＡＣ及びｐｐ６５を発現するＡＬＶＡＣ（ＵＳ６，２６７，９６５）は、臨床試験において試験されている。ＡＬＶＡＣ−ＣＭＶ（ｇＢ）は、中和抗体を誘導しなかったが、ｇＢサブユニット／ＭＦ５９ワクチンを用いるその後の免疫処置後に中和抗体力価をブーストしないと思われたものの（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ＤＩら ２００２年 Ｊ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ １８５巻：６８６〜６９０頁）、Ｔｏｗｎｅ株ＣＭＶでのその後の感染後のより高い中和抗体力価に対して抗原刺激した（Ａｄｌｅｒ ＳＰら １９９９年 Ｊ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ １８０巻：８４３〜８４６頁）。ｐｐ６５、ＡＬＶＡＣ−ＣＭＶ（ｐｐ６４）を発現するカナリアポックスベクターは、元々血清陰性のボランティアすべてにおいて、天然に血清陽性の個体に匹敵する頻度で長く持続するＣＴＬ反応を誘導した（Ｂｅｒｅｎｃｓｉ Ｋら ２００１年 Ｊ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ １８３巻：１１７１〜１１７９頁）。ｇＢをベクターワクチンとして発現させるために使用される別のアプローチとして、ＡｌｐｈａＶａｘ Ｉｎｃ製のアルファウイルスレプリコン系の使用がある（ＵＳ７，４１９，６７４）。このアプローチは、ｐｐ６５、ＩＥ１又はｇＢタンパク質を発現するウイルス様レプリコン粒子（ＶＲＰ）を製造するためにアルファウイルス、ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルスの弱毒化株に由来する増殖に欠陥のある単一サイクルＲＮＡレプリコンベクター系を含む（Ｂｅｒｓｔｅｉｎら、２０１０年 Ｖａｃｃｉｎｅ ２８巻：４８４〜４９３頁）。２成分アルファウイルスレプリコンワクチンを使用して、３種のＣＭＶタンパク質を、ＣＭＶ ｇＢ（Ｔｏｗｎｅ株）の可溶性形態として発現させ、ｐｐ６５／ＩＥ１融合タンパク質（Ｒｅａｐ ＥＡら ２００７年 Ｖａｃｃｉｎｅ ２５巻：７４４１〜７４４９頁）は安全であるとわかり、高レベルの中和抗体及び多機能性ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導した。高用量群の幾何平均力価（Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ Ｍｅａｎ Ｔｉｔｒｅ）（ＧＭＴ）は、アッセイにおいて試験された１２人の自然感染したＣＭＶ血清陽性個体におけるＧＭＴの約半分であった。

[0121]現在、前臨床開発中であるＨＣＭＶに対するワクチン接種の新規候補として、「デンスボディ（ｄｅｎｓｅ ｂｏｄｙ）」ワクチンがある。デンスボディ（ＤＢ）は、細胞培養においてＣＭＶの複製の際に形成される、エンベロープを持つ複製に欠陥のある粒子である。それらは、エンベロープ糖タンパク質及び多量のｐｐ６５タンパク質の両方を含有する。ＤＢは、非感染性であり、免疫原性であるが、ワクチンレシピエントにおいて不顕性のＨＣＭＶ感染を確立できない。ＤＢは、ウイルスの遺伝子発現の非存在下でマウスにおいてウイルス中和抗体及びＴ細胞応答を誘導できるとわかっている（Ｐｅｐｐｅｒｌ Ｓら、２０００年 Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７４巻：６１３２〜６１４６頁−ＷＯ００／５３７２９及びＵＳ６，７１３，０７０）。

ＩＶ．医薬組成物
[0122]本発明は、提供されるＶＬＰ及び／又は提供される糖タンパク質変異体を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＶＬＰ及び少なくとも１種の医薬上許容される賦形剤を提供する。このような医薬組成物は、１種又は複数のさらなる治療上活性な物質を所望により含むこと及び／又は１種又は複数のさらなる治療上活性な物質と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、提供される医薬組成物は、医薬において有用である。いくつかの実施形態では、提供される医薬組成物は、ＨＣＭＶの、又はＨＣＭＶ感染と関連若しくは相関する負の派生効果の治療又は予防において予防薬（すなわち、ワクチン）として有用である。いくつかの実施形態では、提供される医薬組成物は、例えば、ＨＣＭＶ感染を患っているか、又はそれに対して感受性である個体における治療的適用において有用である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ヒトへの投与のために製剤される。

[0123]例えば、本明細書において提供される医薬組成物は、滅菌注射用形態（例えば、皮下注射又は静脈内注入に適している形態）で提供され得る。例えば、いくつかの実施形態では、医薬組成物は、注射に適した液体剤形で提供される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、注射に先立って水性希釈液（例えば、水、バッファー、塩溶液など）を用いて再構成される、所望により、真空下で、散剤（例えば、凍結乾燥され、及び／又は滅菌された）として提供される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、水、塩化ナトリウム溶液、酢酸ナトリウム溶液、ベンジルアルコール溶液、リン酸緩衝生理食塩水などで希釈及び／又は再構成される。いくつかの実施形態では、散剤は、水性希釈液と穏やかに混合されなければならない（例えば、振盪されるのではなく）。

[0124]いくつかの実施形態では、提供される医薬組成物は、１種又は複数の医薬上許容される賦形剤（例えば、保存料、不活性希釈液、分散剤、界面活性剤及び／又は乳化剤、緩衝剤など）を含む。適した賦形剤として、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、スクロース、トレハロース、グリセロール、エタノール又は同様のもの及びそれらの組み合わせが挙げられる。さらに、必要に応じて、ワクチンは、ワクチンの有効性を増強する、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤又はアジュバントなどの補助物質を含有し得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１種又は複数の保存料を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、保存料を含まない。

[0125]いくつかの実施形態では、医薬組成物は、冷蔵及び／又は凍結され得る形態で提供される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、冷蔵及び／又は凍結され得ない形態で提供される。いくつかの実施形態では、再構成された溶液及び／又は液体剤形は、再構成後、特定の期間（例えば、２時間、１２時間、２４時間、２日、５日、７日、１０日、２週間、１カ月、２カ月又はそれより長く）保存され得る。いくつかの実施形態では、指定の時間より長いＶＬＰ製剤の保存は、ＶＬＰ分解をもたらす。

[0126]液体剤形及び／又は再構成された溶液は、投与に先立って粒状物質及び／又は変色を含み得る。いくつかの実施形態では、溶液は、変色した、又は濁った場合、及び／又は粒状物質が残存する場合には、濾過後に使用されなければならない。

[0127]本明細書に記載された医薬組成物の製剤は、薬理学の技術分野で公知の、又は今後開発される任意の方法によって調製され得る。いくつかの実施形態では、このような調製方法は、有効成分を、１種又は複数の賦形剤及び／又は１種又は複数のその他の副成分と関連させる工程、次いで、必要に応じて、及び／又は望ましい場合には、生成物を所望の単回又は複数回用量単位に、成形及び／又はパッケージングする工程を含む。

[0128]本発明に従う医薬組成物は、単回単位用量として、及び／又は複数の単回単位用量として、調製、パッケージングされ得る、及び／又はバルクで販売され得る。本明細書において使用されるように、「単位用量」とは、所定量の有効成分を含む、別個の量の医薬組成物である。有効成分の量は、一般に、対象に投与される用量及び／又は例えば、このような用量の１／２又は１／３などのこのような用量の好都合な画分に匹敵する。

[0129]本発明に従う医薬組成物中の有効成分、医薬上許容される賦形剤及び／又は任意のさらなる成分の相対量は、同一性、大きさ及び／又は治療される対象の状態に応じて、及び／又は組成物が投与される経路に応じて変わり得る。例として、組成物は、０．１％から１００％（ｗ／ｗ）の間の有効成分を含み得る。

[0130]本発明の医薬組成物は、本明細書において使用されるように、所望の特定の剤形に適しているような、溶媒、分散媒、希釈剤又はその他の液体媒体、分散又は懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘又は乳化剤、保存料、固体結合剤、滑沢剤などであり得るか、又はそれを含み得る、医薬上許容される賦形剤をさらに含み得る。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ、（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ、２００６年）には、医薬組成物の製剤において使用される種々の賦形剤及び医薬組成物を調製するための公知の技術が開示されている。任意の従来の賦形剤媒体が、任意の望ましくない生物学的効果を生じること、そうでなければ、有害な方法で医薬組成物の任意のその他の成分（複数可）と相互作用することなどによって、物質又はその誘導体と適合しない場合を除いて、その使用は、本発明の範囲内にあると考慮される。

[0131]いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ワクチンとして十分に免疫原性である（例えば、アジュバントの非存在下で）。いくつかの実施形態では、医薬組成物の免疫原性は、アジュバントを含むことによって増強される。本発明に従って、任意のアジュバントが使用され得る。多数のアジュバントが公知であり；多数のこのような化合物の有用な一覧が、米国国立保健研究所によって準備されており、見ることができる（ｗｗｗ．ｎｉａｉｄ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄａｉｄｓ／ｖａｃｃｉｎｅ／ｐｄｆ／ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ．ｐｄｆ）。また、Ａｌｌｉｓｏｎ（参照により本明細書に組み込まれる、１９９８年、Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． Ｓｔａｎｄ．、９２巻：３〜１１頁）、Ｕｎｋｅｌｅｓｓら（参照により本明細書に組み込まれる、１９９８年、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６巻：２５１〜２８１頁）及びＰｈｉｌｌｉｐｓら（参照により本明細書に組み込まれる、１９９２年、Ｖａｃｃｉｎｅ、１０巻：１５１〜１５８頁）も参照のこと。何百種もの種々のアジュバントが当技術分野で公知であり、本発明の実施において使用され得る。本発明に従って利用され得る例示的アジュバントとして、それだけには限らないが、サイトカイン、ゲル型アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウムなど）；微生物アジュバント（例えば、ＣｐＧモチーフを含む免疫調節性ＤＮＡ配列；モノホスホリル脂質Ａなどのエンドトキシン；コレラ毒素、大腸菌熱不安定性毒素及び百日咳毒素などのエキソトキシン；ムラミルジペプチドなど）；オイルエマルジョン及び乳化剤ベースのアジュバント（例えば、フロイントのアジュバント、ＭＦ５９［Ｎｏｖａｒｔｉｓ］、ＳＡＦなど）；粒子状アジュバント（例えば、リポソーム、生分解性ミクロスフェア、サポニンなど）；合成アジュバント（例えば、非イオン性ブロックコポリマー、ムラミルペプチド類似体、ポリホスファゼン、合成ポリヌクレオチドなど）；及び／又はそれらの組み合わせが挙げられる。その他の例示的アジュバントとして、いくつかのポリマー（例えば、ポリホスファゼン；参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５００，１６１号に記載される）、Ｑ５７、ＱＳ２１、スクアレン、テトラクロロデカオキシドなどが挙げられる。医薬上許容される賦形剤は、「医薬組成物」と題された上記の節にさらに詳細にこれまでに記載されている。

Ｖ．投与
[0132]本開示内容の提供される組成物及び方法は、ヒト成人及び小児を含めた対象におけるＨＣＭＶ感染の予防及び／又は治療にとって有用である。しかし、一般に、それらは任意の動物で使用され得る。特定の実施形態では、本明細書における方法は、獣医学的適用、例えば、イヌ及びネコへの適用に使用され得る。必要に応じて、本明細書における方法はまた、ヒツジ、鳥類、ウシ、ブタ及びウマの品種などの家畜で使用され得る。

[0133]本明細書において使用されるように、用語「対象」、「個体」又は「患者」とは、ヒト又は非ヒト哺乳類対象を指す。治療されている個体（「患者」又は「対象」とも呼ばれる）は、疾患、例えば、ＨＣＭＶ感染を患っている個体（胎児、乳児、小児、青年又は成体）である。いくつかの実施形態では、対象は、ＨＣＭＶ感染のリスクにある。いくつかの実施形態では、対象は、免疫抑制対象である。例えば、いくつかの実施形態では、免疫抑制対象は、ＨＩＶ感染した対象、ＡＩＤＳ患者、移植レシピエント、小児対象及び妊娠中の対象からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、対象は、ＨＣＭＶ感染に曝露されている。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。

[0134]本明細書に記載された組成物は、一般に、免疫応答を誘導するのに必要であるか、又は誘導するのに十分であるような量で、そのような期間投与される。投与計画は、単回用量又は一定期間にわたる複数回用量からなり得る。投与されるべき免疫原性組成物（例えば、ＶＬＰ）の正確な量は、対象毎に変わり得、いくつかの因子に応じて変わり得る。したがって、当然のことではあるが、一般に、使用される的確な用量は、処方医師によって決定され、対象の体重及び投与経路だけでなく、対象の年齢及び症状の重篤度及び／又は感染のリスクに応じても変わる。特定の実施形態では、ＶＬＰ組成物の特定の量が、単回用量として投与される。特定の実施形態では、ＶＬＰ組成物の特定の量が、２以上の用量（例えば、１〜１２カ月離れている１〜３回の用量）として投与される。特定の実施形態では、ＶＬＰ組成物の特定の量が、いくつかの単回用量として何回も投与される（例えば、１〜１２カ月離れている１〜３回の用量）。

[0135]いくつかの実施形態では、提供される組成物は、初回用量及び少なくとも１回の追加免疫用量で投与される。いくつかの実施形態では、提供される組成物は、初回用量及び２回の追加免疫用量で投与される。いくつかの実施形態では、提供される組成物は、初回用量及び３回の追加免疫用量で投与される。いくつかの実施形態では、提供される組成物は、初回用量及び４回の追加免疫用量で投与される。いくつかの実施形態では、提供される組成物は、初回用量及び初回用量後、約１カ月、約２カ月、約３カ月、約４カ月、約５カ月又は約６カ月の少なくとも１回の追加免疫で投与される。いくつかの実施形態では、提供される組成物は、初回用量後、約６カ月、約７カ月、約８カ月、約９カ月、約１０カ月、約１１カ月又は約１年の第２の追加免疫用量で投与される。いくつかの実施形態では、提供される組成物は、追加免疫用量で、１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年又は１０年毎に投与される。

[0136]特定の実施形態では、提供される組成物は、非経口的に、例えば、注射による送達のために製剤され得る。このような実施形態では、投与は、例えば、静脈内、筋肉内、皮内又は皮下であり得るか、又は注入又は無針注射技術によるものであり得る。特定の実施形態では、組成物は、経口（ｐｅｒｏｒａｌ）送達、経口（ｏｒａｌ）送達、鼻腔内送達、頬側送達、舌下送達、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）送達、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）送達、腹膜内送達、膣内送達、直腸送達又は頭蓋内送達のために製剤され得る。

[0137]以下の実施例は、本明細書に記載されている特定の組成物を作製及び実施するいくつかの例示的様式を記載する。これらの実施例は、単に例示目的のものであって、本明細書に記載された組成物及び方法の範囲を制限しようとするものではないということは理解されなければならない。

実施例１：ＤＮＡ発現プラスミドの構築
[0138]この実施例は、組換えＨＣＭＶ遺伝子配列（例えば、ｇＢ、ｇＢ−Ｇ、ｇＨ−Ｇ及びＧａｇ／ｐｐ６５融合遺伝子配列）の発現のための発現プラスミド及び構築物の開発を記載する。標準発現プラスミドは、一般に、哺乳類起源のプロモーター配列、イントロン配列、ポリアデニル化シグナル配列（ポリＡ）、ｐＵＣ複製起点配列（ｐＵＣ−ｐＢＲ３２２は、ｃｏｌＥｌ起源／複製開始部位であり、大腸菌（Ｅ Ｃｏｌｉ）（ＤＨ５α）などの細菌においてプラスミドを複製するために使用される）及びプラスミドプラーク選択のための選択マーカーとしての抗生物質耐性遺伝子からなる。イントロンの後のプラスミド内に、対象とする遺伝子又は部分遺伝子配列にスプライスされるよう使用され得る種々の制限酵素部位がある。

[0139]Ｐｒｏｐｏｌ ＩＩ発現プラスミドは、ｐＨＣＭＶ（ＨＣＭＶの初期プロモーター）、β−グロビンイントロン（ＢＧＬイントロン）、ウサギグロビンポリアデニル化シグナル配列（ポリＡ）、ｐＵＣ複製起点配列（ｐＵＣ−ｐＢＲ３２２は、ｃｏｌＥｌ起源／複製開始部位であり、大腸菌（ＤＨ５α）などの細菌においてプラスミドを複製するために使用される）及びアンピシリン耐性遺伝子β−ラクタマーゼ（Ａｍｐ Ｒ−プラスミドの選択マーカーは、アンピシリンに対する耐性を付与する）（１００μｇ／ｍｌ）（図１Ａ）を含有する。

[0140]図１Ｂは、例示的組換え発現プラスミドを表す。例えば、ｐＨＣＭＶ−Ｇａｇ ＭＭＬＶ発現構築物（「ＭＬＶ−Ｇａｇ」）を開発するために、ＭＭＬＶのＧａｇポリタンパク質（Ｃ末端Ｐｏｌ配列を有さないＧａｇ）をコードする相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列を、Ｐｒｏｐｏｌ ＩＩ（ｐＨＣＭＶ）発現ベクターにクローニングした。ｇＢ発現構築物（「ｇＢ」）を開発するために、ｇＢの細胞外部分、膜貫通ドメイン（ＴＭ）及び細胞質部分（Ｃｙｔｏ）を含むｇＢの全長配列を、ヒト発現（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）のためにコドン最適化し、Ｐｒｏｐｏｌ ＩＩ発現ベクターにクローニングした。ｇＨ−Ｇ発現構築物（「ｇＨ−Ｇ」）を開発するために、細胞外部分のみをコードするｇＨの末端切断型配列を、ＶＳＶ−ＧのＴＭ及びＣｙｔｏ部分と一緒に融合し、ヒト発現（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）のためにコドン最適化し、Ｐｒｏｐｏｌ ＩＩ発現ベクターにクローニングした。同様に、ｇＢ−Ｇ発現構築物（「ｇＢ−Ｇ」）を開発するために、細胞外部分のみをコードするｇＢの末端切断型配列を、ＶＳＶ−ＧのＴＭ及びＣｙｔｏ部分と一緒に融合し、ヒト発現（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）のためにコドン最適化し、Ｐｒｏｐｏｌ ＩＩ発現ベクターにクローニングした。Ｇａｇ／ｐｐ６５発現構築物（「Ｇａｇ／ｐｐ６５」）を開発するために、ＭＭＬＶのＧａｇポリタンパク質（Ｃ末端Ｐｏｌ配列を有さないＧａｇ）をコードする配列を、ｐｐ６５の全長配列と融合し、ヒト発現（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）のためにコドン最適化し、Ｐｒｏｐｏｌ ＩＩ発現ベクターにクローニングした。

[0141]ＤＮＡプラスミドを、コンピテント大腸菌（ＤＨ５α）において増幅し、エンドトキシン不含調製キットを標準プロトコールに従って用いて精製した。

実施例２：ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の製造
[0142]この実施例は、実施例１に記載される種々の組換えＨＣＭＶ抗原を含有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）の製造のための方法を記載する。

[0143]ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１１２６８）を、ＭＭＬＶ−Ｇａｇ ＤＮＡ発現プラスミドを用いるリン酸カルシウム法を使用して一過性にトランスフェクトし、ｇＢ又はｇＢ−Ｇ（示されていないデータ）又はｇＨ−Ｇ ＤＮＡ発現プラスミドを用いて同時トランスフェクトした。或いは、細胞をＧａｇ／ｐｐ６５ ＤＮＡ発現プラスミドを用いてトランスフェクトし、ｇＢ又はｇＢ−Ｇ（示されていないデータ）又はｇＨ−Ｇ ＤＮＡ発現プラスミドのいずれかを用いて同時トランスフェクトした。当然のことではあるが、細胞を、ＭＭＬＶ−Ｇａｇ ＤＮＡ発現プラスミドを用いてトランスフェクトし、ｇＢ及びｇＨ−Ｇ又はｇＢ−Ｇ及びｇＨ−Ｇ ＤＮＡ発現プラスミドの両方を用いて同時トランスフェクトしてもよい。ＨＥＫ２９３細胞による種々のＨＣＭＶ抗原の発現は、フローサイトメトリーによって確認した（図２Ａ）。トランスフェクションの４８〜７２時間後、ＶＬＰを含有する上清を回収し、０．４５μｍの孔径の膜を通して濾過し、さらに濃縮し、ＳＷ３２ Ｂｅｃｋｍａｎローター（２５，０００ｒｐｍ、２時間、４℃）における２０％スクロースクッションを介した超遠心分離によって精製した。ペレットを、滅菌エンドトキシン不含ＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ）に再懸濁して、５００倍濃縮されたＶＬＰストックを得た。総タンパク質は、ブラッドフォードアッセイ定量キット（ＢｉｏＲａｄ）によってアリコートで決定した。精製ＶＬＰは、使用されるまで−８０℃で保存した。精製ＶＬＰの各ロットを、ＭＭＬＶ−Ｇａｇ、ｇＢ、ｇＨ−Ｇ及び／又はＭＭＬＶ−Ｇａｇ／ｐｐ６５融合タンパク質の発現について、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ並びにｇＢ（ｇＢに対するＣＨ２８マウスモノクローナル抗体；Ｖｉｒｕｓｙｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ； Ｐｅｒｅｉｒａ， Ｌら１９８４年 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １３９巻：７３〜８６頁）、ｇＨ−Ｇ（抗ＶＳＶ−Ｇタグ抗体Ｐ５Ｄ４に対するマウスモノクローナル抗体；Ａｂｃａｍ ｐｌｃ）及びｐｐ６５（ＵＬ８３／ｐｐ６５に対するＣＨ１２マウスモノクローナル抗体；Ｖｉｒｕｓｙｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ； Ｐｅｒｅｉｒａ， Ｌ．ら１９８２年 Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ３６巻：９２４〜９３２頁）に対する特異的抗体を用いるウエスタンブロット分析した（図２Ｂ）。抗体は、増強化学発光（ＥＣＬ）を使用して検出した。

実施例３：ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の物理化学的特性決定
[0144]ＶＬＰの物理化学的分析は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｚｅｔａ−Ｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏシリーズ（ＺＥＮ３６００）を使用する粒径決定及び多分散指数評価を含んでいた。ナノ化分析から得られた例示的結果が、図３Ａ及び３Ｂに示されている。例示的ＶＬＰ組成物（ｇＨ−Ｇ／ｐｐ６５二価ＶＬＰ組成物）は、同一組換え発現ベクターを使用して２つの異なる実験室で製造し、両ＶＬＰ調製によって直径１５０〜１８０ｎｍの平均粒径が得られた。これは、１５０〜２００ｎｍの大きさであると報告されているＣＭＶビリオンの大きさと一致する（１９９７年 Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １８２巻：２７３〜２８１頁）。０．２１４〜０．２４０の低い多分散指数（ＰｄＩ）は、生成物の均一性又は狭い大きさ分布を示す。

実施例４：マウスにおけるＶＬＰの免疫原性及び中和活性
[0145]実施例２に記載のとおり調製されたＶＬＰ組成物を、６〜８週齢の雌のＢＡＬＢ／Ｃマウスにおいて試験した（試験群あたり最小６匹の動物）。マウスを、２００μｌのＶＬＰ組成物を用いて、２回、０日目に１回（プライム）及び５６日目に１回（８週、ブースト）、腹膜内に免疫処置した。マウスを、１０μｇ、２５μｇ又は５０μｇ（総タンパク質）の二価ｇＢ／Ｇａｇ／ｐｐ６５、二価ｇＨ−Ｇ／Ｇａｇ／ｐｐ６５又は三価ｇＢ／ｇＨ−Ｇ／Ｇａｇ／ｐｐ６５ＶＬＰ組成物を用いて処置した。マウスにおいて体液性免疫応答を評価するために、免疫処置前、次いで、１回目及び２回目の免疫処置後０、２、３、４、６、８、９、１０、１２及び１４週間に研究群中のすべてのマウスから血液を採取した。研究デザインは、表１に要約されている。

[0146]ＨＣＭＶ株ＡＤ１６９に感染したＭＲＣ−５細胞から得た溶解物でコーティングした市販のＥＬＩＳＡプレート（ＩＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を実施した。すべてのＣＭＶ関連抗原を含有し、ＩｇＧ免疫応答を検出するために有用である粗製の市販ＨＣＭＶ溶解物を陽性対照として使用し、ＥＬＩＳＡによってマウス血清ＨＣＭＶ ＩｇＧ含量を決定した。マウス血清の段階希釈物（ＴＢＳ−Ｔ／ＢＳＡ／ＤＭＥＭ １０％ ＦＣＳで希釈）を、コーティングされたプレートとともに室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、抗マウスセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）がコンジュゲートした二次抗体を１／１０，０００の希釈で添加し、１時間インキュベートし、続いて、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液を添加した。ＨＣＬ １Ｎの添加によって反応を停止し、ＥＬＩＳＡマイクロウェルプレートリーダーにおいて４５０ｎｍで吸光度を読み取った。図４は、二価及び三価ＶＬＰ組成物の各々の、マウスの持続性抗体及び８週における２回目の免疫処置の強力な追加免疫の証拠を示す。

[0147]マイクロ中和アッセイを使用して、ＨＣＭＶに対する中和抗体反応を決定した。ＨＣＭＶ株ＶＲ１８１４（内皮細胞向性ＣＭＶ株−Ｒｅｖｅｌｌｏ ＭＧらＪ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ８２巻：１４２９〜１４３８頁）の標準量を、感染培地（１％熱不活化ＦＢＳ、１％アミノ酸混合物、１％ペニシリン−ストレプトマイシン及びＣａ^＋２及びＭｇ^＋２不含ＰＢＳを含有するＤＭＥ）で希釈し、等容量の熱不活化試験血清の段階希釈物に添加し、回転板上で３７℃で１時間インキュベートした。２４ウェル組織培養プレート中のカバーリップ上で増殖させたヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）又は網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９細胞）に、血清／ＨＣＭＶ混合物を添加し、３７℃、５％ ＣＯ_２で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで２回洗浄し、次いで、３７℃、５％ ＣＯ_２で４８時間培養した。細胞を４％パラホルムアルデヒドを用いて固定し、抗ＩＥ１モノクローナル抗体（ＩＥ１／２に対するＣＨ１６０マウスモノクローナル抗体又はＩＥ１に対するＣＨ４４３モノクローナル抗体；Ｖｉｒｕｓｙｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と室温で１時間反応させ、続いて、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウス抗体と室温で４５分間反応させた。蛍光顕微鏡によってＩＥ１を発現する細胞数を決定した。各出血時点（０、３、６、８及び９週間）で、プールしたマウス血清（１：６希釈）を、中和活性について２連で試験した。図５は、二価及び三価ＶＬＰ組成物の各々の、８週における２回目の免疫処置後のマウスにおける中和抗体の誘導を示す（線維芽細胞においてアッセイされた）。図６は、二価ＶＬＰ組成物の各々の、８週における２回目の免疫処置後のマウスにおける中和抗体の誘導を示す（上皮細胞においてアッセイされた）。

[0148]別の研究では、雌のＢＡＬＢ／Ｃマウス６〜８週齢（試験群あたり最小８匹の動物）において、実施例２に記載されたように調製された一価ｇＢ−Ｇ ＶＬＰ組成物を試験した。マウスを、２００μｌのＶＬＰ組成物を用いて、２回、０日目に１回（プライム）及び５６日目に１回（８週、ブースト）、腹膜内に免疫処置した。マウスを、注射あたり２０μｇのｇＢ含量（ＥＬＩＳＡによって決定された）の等量を用いて処置した。マウスにおける体液性免疫応答を評価するために、研究開始から、１回目の免疫処置前、次いで、３週及び６週における１回目の免疫処置後及び８週における２回目の免疫処置前、次いで、９週における２回目の免疫処置後に研究群中のすべてのマウスから血液を採取した。研究デザインは、表２に要約されている。

[0149]緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現ＨＣＭＶウイルス（ＴＢ４０）及び感染（ＧＦＰ＋）ＨＦＦ細胞のフローサイトメトリーによる分析に基づいて、線維芽細胞におけるマイクロ中和アッセイを使用して、ＨＣＭＶに対する中和抗体反応を決定した。血清サンプル中の中和抗体の存在を評価するために、ＧＦＰ発現ＨＣＭＶとともに、中和抗体がＨＣＭＶの感染力を低減するのに十分な期間、血清をプレインキュベートした。血清及びＨＣＭＶのプレインキュベートした混合物の段階希釈物を使用して、ＨＣＭＶによる感染に対して感受性である宿主細胞（線維芽細胞又は上皮）と接触させた。リポーター遺伝子構築物（ＧＦＰ）を発現する細胞数をフローサイトメトリーによって決定して、ウイルス調製物の感染力価を算出した。図７は、一価ｇＢ−Ｇ ＶＬＰ対組換えｇＢを用いて、０及び８週で２回免疫処置したマウスの中和抗体力価を表す。記載したように免疫処置前及び免疫処置後に採取した血清をプールし、１０％モルモット相補体の存在下で陽性対照ＣＭＶハイパーグロブリン、サイトガム（Ｃｙｔｏｇａｍ）（商標）に対して試験した。図７に示されるように、一価ｇＢ−Ｇ ＶＬＰ組成物は、組換えｇＢタンパク質によって誘発されるものよりも、より迅速で強力な線維芽細胞感染の中和を誘発した。

[0150]わかるように（又は本明細書を読んだ当業者には理解されるであろうが）、データは、とりわけ、組換えｇＢと比較して、ｇＢ−Ｇを含むＶＬＰの驚くほど良好な活性を実証する。

[0151]別の研究では、雌のＢＡＬＢ／Ｃマウス６〜８週齢（試験群あたり最小４匹の動物）において、実施例２に記載のとおりに調製された二価ｇＢ／Ｇａｇ／ｐｐ６５ＶＬＰ組成物を試験した。マウスを、２００μｌのＶＬＰ組成物を用いて、２回、０日目に１回（プライム）及び５６日目に１回（８週、ブースト）、腹膜内に免疫処置した。マウスを、二価ｇＢ／Ｇａｇ／ｐｐ６５ＶＬＰを用いて処置し、１４日後に脾細胞を採取した。Ｇａｇ／ｐｐ６５又はＧａｇをコードするプラスミドで２４時間トランスフェクトされた脾細胞を用いて、濃縮されたＣＤ８^＋Ｔ細胞を刺激して（１：５比）、ｐｐ６５又はＧａｇに対して向けられたＣＴＬの頻度を決定した。ＣＴＬ頻度は、ＣＦＳＥ崩壊、ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞でのゲートの開閉に基づいて決定した（図８Ａ）。散布図は、Ｇａｇに対して向けられた反応を差し引いた後の、増殖するｐｐ６５特異的ＣＴＬの頻度を示す（図８Ｂ）。図８に表されるように、二価ｇＢ／Ｇａｇ／ｐｐ６５ ＶＬＰは、免疫処置されたマウスにおいてｐｐ６５特異的ＣＴＬを誘発した。

実施例５：ウサギにおけるＶＬＰの免疫原性及び中和活性
[0152]ニュージーランドホワイトウサギ６〜８週齢（試験群あたり最小６匹の動物）において、実施例２に記載されたとおり調製された二価ｇＢ／Ｇａｇ／ｐｐ６５及びｇＨ−Ｇ／Ｇａｇ／ｐｐ６５ＶＬＰ組成物を試験した。ウサギを、０．５ｍｌのＶＬＰ組成物を用いて、３回、０日目に１回（プライム）及び５６日目に１回（８週、ブースト）及び１６８日目に１回（２４週、ブースト）、筋肉内に免疫処置した。ウサギを、２５μｇ又は５０μｇ又は１００μｇ（総タンパク質）の二価ｇＢ／Ｇａｇ／ｐｐ６５、二価ｇＨ−Ｇ／Ｇａｇ／ｐｐ６５又は三価ｇＢ／ｇＨ−Ｇ／Ｇａｇ／ｐｐ６５（１：１比で一緒に混合された、二価ｇＢ／Ｇａｇ／ｐｐ６５及びｇＨ−Ｇ／Ｇａｇ／ｐｐ６５）ＶＬＰ組成物のいずれかを用いて処置した。ウサギにおける体液性免疫応答を評価するために、１回目の免疫処置前、次いで、２、４、６及び８週における１回目の免疫処置後及び研究の開始から１０、１３、１６、２０及び２４週における２回目の免疫処置後、次いで、研究の開始から２６及び２８週における３回目の免疫処置後に、研究群中のすべてのウサギから血液を採取した。研究デザインは、表３に要約されている。

[0153]個々のウサギ血清を、ＥＬＩＳＡによって組換えｇＢ抗原に対する反応性について試験した（図９Ａ左軸にプロットされている）。実施例４に記載されるようなＧＦＰ発現ＣＭＶウイルス（ＴＢ４０）及び感染（ＧＦＰ＋）ＨＦＦ細胞のフローサイトメトリーによる分析に基づいて、線維芽細胞におけるマイクロ中和アッセイを使用して、ＨＣＭＶに対する中和抗体反応を決定した（図９Ｂ右軸にプロットされている）。記載されるように免疫処置前及び免疫処置後に採取したウサギ血清を、プールし、ＨＦＦ線維芽細胞において、陽性対照ＣＭＶハイパーグロブリン、サイトガム（商標）に対して、ＧＦＰを発現するＨＣＭＶに対する相補体の存在下で中和活性について試験した。エンドポイント力価がプロットされ、対応する免疫処置前血清に対して、ＣＭＶ感染細胞における５０％低減を表す（図９Ａ左軸にプロットされた）。感染（ＧＦＰ^＋）細胞のフローサイトメトリー分析の際に５０，０００個の細胞を採取した（図９Ｂ右軸にプロットされている）。図９に示されるように、二価ｇＢ／Ｇａｇ／ｐｐ６５ＶＬＰ組成物は、線維芽細胞感染に対して、ウサギにおいて高力価結合（Ａ）及び高力価中和抗体（Ｂ）反応を誘発した。

[0154]プールされたウサギ血清はまた、ＧＦＰ発現ＨＣＭＶウイルス（Ｔｏｗｎｅ ＴＳ１５−ｒＲ）及び感染（ＧＦＰ＋）ＡＲＰＥ−１９細胞のフローサイトメトリーによる分析に基づいて、上皮細胞におけるマイクロ中和アッセイを使用して、ＨＣＭＶに対する中和抗体反応について試験した。記載されるように免疫処置前及び免疫処置後に採取したウサギ血清をプールし、ＡＲＰＥ−１９上皮細胞において、陽性対照ＣＭＶハイパーグロブリン、サイトガム（商標）に対して、ＧＦＰを発現するＨＣＭＶに対する相補体の存在下で中和活性について試験した。図１０に示されるように、驚くべきことに、二価ｇＢ／Ｇａｇ／ｐｐ６５及び二価ｇＨ−Ｇ／Ｇａｇ／ｐｐ６５ＶＬＰ組成物の組合せは、ウサギにおいて、上皮細胞感染に対して、ｇＢ／Ｇａｇ／ｐｐ６５又はｇＨ／Ｇａｇ／ｐｐ６５に対して相乗的な、より迅速な中和抗体反応を誘発した。

[0155]わかるように（又は本明細書を読んだ当業者には理解されるように）、データは、とりわけ、ｇＢ／Ｇａｇ／ｐｐ６５を含むＶＬＰ又はｇＨ−Ｇ／Ｇａｇ／ｐｐ６５を含むＶＬＰと比較してでさえ、ｇＢ／Ｇａｇ／ｐｐ６５を含むＶＬＰ及びｇＨ−Ｇ／Ｇａｇ／ｐｐ６５を含むＶＬＰの組み合わせなどによるＶＬＰの驚くほど良好な活性を実証する。

実施例６：ウイルス様粒子（ＶＬＰ）のスケールアップ製造及び精製
[0156]ＶＬＰを、以下のとおりに製造し、精製した。ＣＨＯ細胞を、所定の濃度及び比で選択したプラスミドを用い、１．５Ｅ０６〜２．０Ｅ０６個細胞／ｍＬの間の細胞密度でトランスフェクトした（実施例１に記載されたとおりに調製された）。総ＤＮＡ濃度を最大１μｇ／細胞培養物１ｍＬとするようにスタッファーＤＮＡを加えた。トランスフェクションに使用したプラスミドは、ＭａｘｉＰｒｅｐ又はＧｉｇａＰｒｅｐプラスミド精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）によって、まず精製した。ＤＮＡを細胞に送達するためにトランスフェクションのために使用したＰＥＩＭＡＸは、６：１（ＰＥＬ：ＤＮＡ ｗｔ／ｗｔ）の比で提供された。細胞を７２時間培養し、次いで、培養物を、１Ｌボトル中でＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ製のローターＪＳ−４．２Ａを使用して４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を０．８／０．４５μｍフィルター（ＡｃｒｏＰａｋ ５００ Ｃａｐｓｕｌｅ、Ｐａｌｌ）を通して濾過した。次いで、濾過された上清を、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって濃縮し、ヒスチジン含有バッファーに対してダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションされた物質を、陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＡＥＸ）にロードし、フロースルーを回収した。次いで、フロースルーを０．４５μｍを通して滅菌濾過し、種々の容積に分注した。

[0157]ＴＦＦ手順は、ステンレススチール筺体中に平行に固定することによる０．５ Ｍ ＮａＯＨ中での２枚のＴＦＦ膜（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ２ Ｍｉｎｉ ５００ ｋＤａカットオフ、０．１ｍ^２表面積）の一晩の衛生化を含んでいた。保持液並びに浸透側で中性ＰＨのランニング水後、リン酸バッファー（ＰＢＳ）を使用して、膜を平衡化した。次いで、濾過された上清を、ＴＦＦ保持液再循環ループ中にロードした。出発入口圧力は、４００ｍＬ／分の透過液流速で１０．５ｐｓｉとし、濃縮の最後に約２００ｍＬ／分に低減した。約１０〜２０倍に濃縮した後、５容積の２０ｍＭヒスチジン＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５を用いるダイアフィルトレーションを行った。ダイアフィルトレーションされた物質を回収し、等容量のｈｉｓ−バッファーですすぎ、さらに５分間再循環した後透過液流を閉じた。次いで、保持液を回収し、これまでに回収された保持液とともにプールした。膜の機能性を維持するために、ＰＢＳで１０分間、０．５Ｍ ＮａＯＨで４０分間（透過液及び保持液を通して廃棄するために２００ｍＬをフラッシングした後）、最後に水を用いて保持液及び透過液において中性ｐＨに膜をすすいだ。次いで、膜を冷蔵庫中、０．１Ｍ ＮａＯＨ溶液中で保存した。

[0158]平衡バッファー（２０ｍＭヒスチジン＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５）を用いる平衡化のために１．６ｍＬ／分の流速で、並びにローディング、洗浄及びストリッピング工程のために３．２ｍＬ／分の流速で２０ｍＬ ＨｉＬｏａｄ １６／１０ セファロースＨＰカラムを使用するＡＥＸカラムクロマトグラフィーを使用して、ＤＮＡ含量を低減した。清浄化手順は、０．８ｍＬ／分で実施した。チャート式記録計を使用して、２８０ｎｍのＵＶ吸光度をモニタリングした。使用前に衛生化した、Ｇｒａｄｉｆｒａｃクロマトグラフィーシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。５カラム容積のＳｕｐｅｒ Ｑ水（低エンドトキシン）を使用して、カラムから最初のエタノール（保存バッファーとしてカラム中に存在する２０％ ｖ／ｖ）を除去した。カラムを整えるために、５カラム容積の平衡バッファー、続いて、５カラム容積のストリッピングバッファー（２０ｍＭ ヒスチジン＋１０００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５）を通した。ローディングのためにカラムを準備するために、５カラム容積の平衡バッファーを再度通した。ローディングは、３．２ｍＬ／分で実施し、その後、５カラム容積の平衡バッファーを用いて、又はベースラインが観察されるまでカラムを洗浄した。物質のローディングの間、ＵＶピークの開始からＵＶピークがＵＶ吸光度の最大ピーク高の約１０％に低下するまでフロースルーを回収した。次いで、５カラム容積のストリッピングバッファー（２０ｍＭヒスチジン＋１０００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５）によってカラムをストリッピングし、ピークを回収した。これに５カラム容積の別のストリッピングバッファー（２０ｍＭヒスチジン＋２０００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５）を続けて、任意の強力に結合しているタンパク質及びヌクレオチドを除去し、ピークを回収した。次いで、４カラム容積の１Ｍ ＮａＯＨを０．８ｍＬ／分で用いてカラムを清浄化して、任意の沈殿したタンパク質を除去した。次いで、０．８ｍｌ／分の水で、中性ｐＨまでカラムをすすいだ（普通、４〜５カラム容積）。次いで、２０％エタノール（０．８ｍＬ／分で４カラム容積）をカラムに通して、任意のリポタンパク質又は脂質を除去した（２カラム容積）。この段階で、カラムを保存するか、水（４カラム容積）ですすいで、第２のバッチのサイクルを再開した。

[0159]図１１は、ＣＨＯ細胞から製造され、ＴＦＦ（図１１Ａ）及びＡＥＸ（図１１Ｂ）精製方法と、それに続く、ネガティブ染色電子顕微鏡分析法に付された精製ｇＢ−Ｇ一価ＶＬＰの画像を表す。図１１に示されるように、ＴＦＦ（図１１Ａ）及びＡＥＸ精製後に未変化のｇＢ−Ｇ一価ＶＬＰが存在する（図１１Ｂ）。

実施例７：ウサギにおける精製ＶＬＰの免疫原性及び中和活性
[0160]ニュージーランドホワイトウサギ６〜８週齢（試験群あたり最小６匹の動物）において、実施例６に記載されたように調製した一価ｇＢ−Ｇ ＶＬＰ組成物を試験した。ウサギを、０．５ｍｌ（５０μｇのｇＢ含量）のＶＬＰ組成物を用いて、３回、０日目に１回（プライム）及び５６日目に１回（８週、ブースト）及び１６８日目に１回（２４週、ブースト）、筋肉内に免疫処置した。ウサギにおける体液性免疫応答を評価するために、１回目の免疫処置前、次いで、２、４、６及び８週における１回目の免疫処置後及び研究の開始から１０、１３、１６、２０及び２４週間での２回目の免疫処置後、次いで、研究の開始から２６及び２８週における３回目の免疫処置後に、研究群中のすべてのウサギから血液を採取した。研究デザインは、表４に要約されている。

[0161]図１２は、ＴＦＦ／ＡＥＸ精製されたＣＨＯ細胞によって製造されたｇＢ−Ｇ一価ＶＬＰを用いて免疫処置されたウサギから得られた血清によって誘発された、線維芽細胞感染の強力な中和を表す（図１２中、「ｇＢ ｅＶＬＰｓ」）。この中和は、陽性対照ＣＭＶハイパーグロブリン、サイトガム（商標）を用いて達成されたものよりも優れていた。図１２はまた、Ｔｏｗｎｅワクチン及びアジュバント添加ｇＢサブユニットワクチン（ｇＢ＋ＭＦ５９（商標））の公開された中和力価データも含む（Ｃｕｉ Ｘら ２００８年 Ｖａｃｃｉｎｅ ２６巻：５７６０〜５７６６頁）。

[0162]図１３は、ＴＦＦ／ＡＥＸ精製されたＣＨＯ細胞によって製造されたｇＢ−Ｇ一価ＶＬＰを用いて免疫処置されたウサギから得られた血清によって誘発された、上皮細胞感染の強力な中和を例示する（図１３中、「ｇＢ ｅＶＬＰｓ」）。この中和は、陽性対照ＣＭＶハイパーグロブリン、サイトガム（商標）を用いて達成されたものに匹敵するものであった。図１３はまた、Ｔｏｗｎｅワクチン及びアジュバント添加ｇＢサブユニットワクチン（ｇＢ＋ＭＦ５９（商標））の公開された中和力価データも含む（Ｃｕｉ Ｘら ２００８年 Ｖａｃｃｉｎｅ ２６巻：５７６０〜５７６６頁）。

[0163]図１４は、ＴＦＦ／ＡＥＸ精製されたＣＨＯ細胞によって製造されたｇＢ−Ｇ一価ＶＬＰを用いて免疫処置されたウサギにおいて誘発された抗体の結合活性指数を表す。プールされたウサギ血清及び陽性対照ＣＭＶハイパーグロブリン、サイトガム（商標）を、１：６００，０００希釈し、５Ｍ尿素の存在下又は非存在下でＥＬＩＳＡによって全長組換えｇＢ抗原に対して試験した。抗体結合活性は、先に記載されたように決定した（Ｍａｒｓｈａｌｌ ＢＣ ａｎｄ Ａｄｌｅｒ Ｓ ２００３ Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６巻：４９１〜５００頁）。図１４に示されるように、ＴＦＦ／ＡＥＸ精製されたＣＨＯ細胞によって製造されたｇＢ−Ｇ一価ＶＬＰを用いて免疫処置されたウサギにおいて、高結合活性中和抗体の迅速な誘導が誘発された。最大抗体結合活性は、２回のｇＢ−Ｇ ＶＬＰ免疫処置後に達成された。

その他の実施形態
[0164]開示内容のその他の実施形態は、本明細書の検討及び本明細書に開示される開示内容の実施から当業者には明らかとなる。本明細書及び実施例は、単に例示的なものと考えられ、本開示内容の真の範囲は以下の特許請求の範囲によって示されるものとする。本明細書において参照される任意の参考文献の内容は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
配列表の短い説明
配列番号１は、ＭＭＬＶ Ｇａｇアミノ酸配列を表す。
配列番号２は、ＭＭＬＶ Ｇａｇヌクレオチド配列を表す。
配列番号３は、コドン最適化ＭＭＬＶ Ｇａｇヌクレオチド配列を表す。
配列番号４は、ＭＭＬＶ Ｇａｇ−ＣＭＶ ｐｐ６５アミノ酸配列を表す。
配列番号５は、ＭＭＬＶ Ｇａｇ−ＣＭＶ ｐｐ６５ヌクレオド配列を表す。
配列番号６は、コドン最適化ＭＭＬＶ Ｇａｇ−ＣＭＶ ｐｐ６５ヌクレオチド配列を表す。
配列番号７は、ＨＣＭＶ ｇＢアミノ酸配列を表す。
配列番号８は、ＨＣＭＶ ｇＢヌクレオチド配列を表す。
配列番号９は、コドン最適化ＨＣＭＶ ｇＢヌクレオチド配列を表す。
配列番号１０は、ＨＣＭＶ ｇＢ−Ｇアミノ酸配列を表す。
配列番号１１は、ＨＣＭＶ ｇＢ−Ｇヌクレオチド配列を表す。
配列番号１２は、コドン最適化ＨＣＭＶ ｇＢ−Ｇヌクレオチド配列を表す。
配列番号１３は、ＨＣＭＶ ｇＨアミノ酸配列を表す。
配列番号１４は、ＨＣＭＶ ｇＨヌクレオチド配列を表す。
配列番号１５は、コドン最適化 ＨＣＭＶ ｇＨヌクレオチド配列を表す。
配列番号１６は、ＨＣＭＶ ｇＨ−Ｇアミノ酸配列を表す。
配列番号１７は、ＨＣＭＶ ｇＨ−Ｇヌクレオチド配列を表す。
配列番号１８は、コドン最適化ＨＣＭＶ ｇＨ−Ｇヌクレオチド配列を表す。
配列番号１９は、Ｐｒｏｐｏｌ ＩＩ発現プラスミドヌクレオチド配列を表す。
配列番号２０は、ＨＣＭＶ ｇＨ−ＨＣＭＶ ｇＢ ＴＭ／ＣＴＤヌクレオチド配列を表す。
配列番号２１は、コドン最適化ＭＭＬＶ Ｇａｇヌクレオチド配列を表す。
配列番号２２は、コドン最適化ＭＭＬＶ Ｇａｇ−ＣＭＶ ｐｐ６５ヌクレオチド配列を表す。

関連出願の相互参照
[0001]本願は、２０１１年１１月１１日に出願された米国特許仮出願第６１／５５８，８００号及び２０１２年６月１日に出願された米国特許仮出願第６１／６５４，１５７号の利益を主張し、その両方の内容は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。

Claims (12)

1. アミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸配列を有する参照マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）ｇａｇタンパク質の自己組織化部分と、少なくとも９０％の同一を示す、少なくとも１００個のアミノ酸の長さの部分を含む、ＭＬＶ ｇａｇポリペプチドである第１のポリペプチドと、
   アミノ酸配列が、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）タンパク質に対する１種又は複数の抗体によって認識されるエピトープを含む第２のポリペプチドであって、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）タンパク質において見られる膜貫通ドメインを含むアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドと
   を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
2. 膜貫通ドメインが、配列番号１０の残基７５２〜７９５のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のＶＬＰ。
3. ＶＬＰを製造するための方法であって、
   宿主細胞を、
   （１）マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）ｇａｇポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターであって、
   ＭＬＶ ｇａｇポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸配列を有する参照ＭＬＶ ｇａｇタンパク質の自己組織化部分と、少なくとも９０％の同一を示す、少なくとも１００個のアミノ酸の長さの部分を含むベクター、及び
   （２）ＨＣＭＶにおいて見られる糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）タンパク質のエピトープを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターであって、
   ポリペプチドが、配列番号１０のアミノ酸配列を有し、
   ポリヌクレオチドが、単一プロモーターの制御下にあり、
   ポリヌクレオチドの上流にシグナル配列を含み、ポリヌクレオチドの下流にポリアデニル化シグナルを含むベクター
   で同時トランスフェクトするステップと、
   宿主細胞を、前記２つのベクターにコードされる２つのタンパク質の発現を可能にする条件下で適した培地中で培養するステップと
   を含む、方法。
4. 請求項１又は２に記載のＶＬＰと、医薬上許容される担体とを含む医薬組成物。
5. サイトカイン、ゲル型アジュバント、微生物アジュバント、オイルエマルジョン及び乳化剤ベースのアジュバント、粒子状アジュバント、合成アジュバント、ポリマーアジュバント及び／又はそれらの組み合わせからなる群から選択されるアジュバントをさらに含む、請求項４に記載の医薬組成物。
6. 対象においてＨＣＭＶ感染の症状の頻度若しくは重篤度を低減させる、又はその発症を遅延させるための、請求項４又は請求項５に記載の医薬組成物。
7. 対象が、免疫抑制対象である、請求項６に記載の医薬組成物。
8. 免疫抑制対象が、ＨＩＶ感染した対象、ＡＩＤＳ患者、移植レシピエント、小児対象及び妊娠中の対象からなる群から選択される、請求項７に記載の医薬組成物。
9. 対象が、ＨＣＭＶ感染に曝露されている、請求項６〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
10. 対象がヒトである、請求項６〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
11. 対象におけるＨＣＭＶ感染の症状の頻度、重篤度又は発症が、医薬組成物の投与の前の対象におけるＨＣＭＶ感染の症状の頻度、重篤度又は発症と比較して、５０％以上低減される、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
12. 初回用量及び少なくとも１回の追加免疫用量で投与されるための、請求項６〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。