MX2014005653A

MX2014005653A - Composiciones y metodos para el tratamiento de citomegalovirus.

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Publication number: MX2014005653A
Application number: MX2014005653A
Authority: MX
Inventors: David E Anderson; Anne-Catherine Fluckiger
Original assignee: Variation Biotechnologies Inc
Priority date: 2011-11-11
Filing date: 2012-11-09
Publication date: 2014-09-04
Also published as: JP2015505299A; US20140308308A1; EP2776567A4; RU2737530C1; US12421283B2; EP3854416A1; WO2013068847A3; AU2012335277B2; CN111995664A; CN111995664B; KR20140095556A; AU2020264275A1; MX387666B; CN107875382B; US20230272013A1; BR122019027913B1; CA2889659A1; US20170349634A1; ES2874233T3; AU2012335277A1

Abstract

La presente descripción proporciona composiciones y métodos útiles para tratar la infección por HCMV. Como se describen en la presente las composiciones y métodos se basan en el desarrollo de composiciones inmunogénicas que incluyen partículas tipo virus (VLPs) que comprenden una o más proteínas núcleo del virus de leucemia murina Moloney (MMLV) e incluyen uno o más epítopes de HCMV, tales como, por ejemplo, de las glicoproteínas gB y/o gH de envoltura de HCMV y/o la proteína pp65 de tegumento. Entre otras cosas, la presente invención abarca el reconocimiento de que la combinación de antígenos (e.g., glicoproteínas de envoltura y proteínas estructurales) puede conducir a respuestas inmunes benéficas, por ejemplo, que incluyen tanto una respuesta humoral (e.g., la producción de anticuerpos neutralizantes) como una respuesta celular (e.g., la activación de la célula T).

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA EL TRATAMIENTO DE CITOMEGALOVIRUS Referencia Cruzada a Solicitudes Relacionadas Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de E.U. No. 61/558,800, presentada el 11 de noviembre de 2011 y de la Solicitud Provisional de E.U. No. 61/654,157, presentada el 1 de junio de 2012, cuyos contenidos se incorporan en la presente mediante la referencia en la presente en su totalidad.

ANTECEDENTES El citomegalovirus humano (HCMV) , un ß-herpesvirus , es un patógeno que se presenta ubicuamente. En una persona inmunocompetente, normalmente no se percibe la infección por HCMV, teniendo a lo más síntomas moderados y no específicos. En contraste, ciertos grupos de riesgo, por ejemplo, en pacientes inmunosuprimidos tales como los paciente de SIDA o receptores de trasplante, y después de infección prenatal, la infección por HCMV tiene serias manifestaciones (Staras SA et al., 2006 Clin Infect Dis 43 (9) : 1143-51; Hebart H et al., 2004 Hum Immunol 65 (5) :432-6; Rowshani AT et al., 2005 Transplantation 79 (4) :381-6) . Las terapias existentes incluyen el uso de inmunoglobulinas y agentes antivirales tales como ganciclovir y sus derivados, que son más efectivos cuando se utilizan profilácticamente o muy prematuramente durante la infección en poblaciones en riesgo. Sin embargo, las terapias existentes se caracterizan por su significativa toxicidad y limitada eficacia, especialmente para la enfermedad de inicio tardío (Boeckh M. , 2004 Pediatr Transplant 8(Supl. 5): 19-27; Limaye AP. , 2004 Transplantation 78(9): 1390-6), y no han tenido un impacto en la enfermedad congénita por HCMV. El desarrollo de una vacuna efectiva para proteger contra la enfermedad por HCMV se reconoce como una importante prioridad de salud pública (Arvin AM et al., 2004 Clin Infect Dis 39(2): 233-9).

SUMARIO Entre otras cosas, la presente invención proporciona métodos y composiciones útiles para la profilaxis, el tratamiento y/o estudio de la infección por citomegalovirus humano (HCMV) . En algunas modalidades, la presente invención proporciona partículas tipo virus (VLPs) que comprenden una o más proteínas núcleo del virus de leucemia murina Moloney (MMLV) e incluyen uno o más epítopes de HCMV, tales como, por ejemplo, de las glicoproteínas gB y/o gH de envoltura de HCMV y/o la proteína pp65 de tegumento . Entre otras cosas , la presente invención abarca el reconocimiento de que la combinación de antígenos (e.g., glicoproteínas de envoltura y proteínas estructurales) puede conducir a una inducción mejorada de las respuestas inmunes benéficas, por ejemplo, que incluyen tanto una respuesta humoral (e.g., la producción de anticuerpos neutralizantes) como una respuesta celular (e.g., la activación de la célula T) . Las VLPs proporcionadas pueden caracterizarse en que no contienen ADN viral y no son infecciosas .

En algunas modalidades, las VLPs proporcionadas se encuentran rodeadas por una membrana de lípidos que contiene opcionalmente uno o más epítopes provenientes de glicoproteinas de envoltura virales (e.g., gB y/o gH) que son antígenos que juegan un papel en la inducción de anticuerpos neutralizantes del virus .

En algunas modalidades, las VLPs proporcionadas contienen uno o más epítopes provenientes de proteínas estructurales virales (e.g., pp65) que son antígenos que juegan un papel en la inducción de las respuestas inmunes celulares (e.g., la respuesta de la célula T) . En algunas modalidades, las proteínas estructurales virales utilizadas (e.g., pp65) estimulan ambas la formación de células T auxiliares y también inducen linfocitos T citotóxicos (CTL) contra HC V.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona variantes de glicoproteinas de envoltura virales (e.g., gB y/o gH) . En algunas modalidades, una glicoproteína variante de envoltura viral es o comprende una proteína de fusión. En algunas modalidades, una variante de una glicoproteína viral comprende un dominio de proteína heterólogo (e.g., un dominio de transmembrana y/o citoplásmico de una proteína diferente) . En algunas modalidades, una variante de una proteína estructural viral comprende un antígeno o epítope heterólogo. En algunas modalidades, la presente invención proporciona VLPs que comprenden variantes de proteínas estructurales virales . En algunas modalidades, una variante de una proteína estructural viral es o comprende una proteína de fusión.

Como se utiliza en esta solicitud, los términos "cerca de" y "aproximadamente" se utilizan como equivalentes. Cualquier número utilizado en esta solicitud con o sin cerca de/aproximadamente pretenden cubrir cualquier fluctuación normal apreciada por el experto en la técnica relevante.

Otras características, objetivos y ventajas de la presente invención son aparentes en la siguiente descripción detallada. Sin embargo, debe entenderse que la descripción detallada, aunque indica modalidades de la presente invención, se proporciona solamente a modo de ilustración, no como limitación. Varios cambios y modificaciones dentro del alcance de la invención se harán aparentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción detallada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Los dibujos son solamente para propósitos de ilustración, no como limitación.

La Figura 1A muestra el mapa del plásmido de expresión de ADN y la Figura IB muestra la construcción de los plásmidos de expresión recombinantes ejemplares.

La Figura 2A muestra el análisis FACS de antígenos de superficie heterólogos ejemplares en células de encapsidación HEK 293 y la Figura 2B muestra el inmunoanálisis western de la expresión del antígeno heterólogo en composiciones de VLP ejemplares.

La Figura 3A y 3B muestran la determinación del tamaño de partícula y el índice de poli-dispersión para dos composiciones de VLP ejemplares.

La Figura 4 muestra las valoraciones ELISA en ratones tratados con composiciones de VLP de gB/pp65 (A) , gH-G/pp65 (B) o gB/gH-G/pp65 (C) ejemplares.

La Figura 5 muestra la actividad del anticuerpo neutralizante en ratones tratados con composiciones de VLP ejemplares (analizadas en células humanas de fibroblasto) .

La Figura 6 muestra la actividad del anticuerpo neutralizante en ratones tratados con composiciones de VLP ejemplares (analizadas en células humanas epiteliales) .

La Figura 7 muestra la actividad del anticuerpo neutralizante en ratones tratados con composiciones de VLP ejemplares contra la proteína de gB recombinante (analizadas en células humanas de fibroblasto) .

La Figura 8A-B muestra las respuestas de CTL específicas al antígeno en ratones tratados con composiciones de VLP ejemplares expresadas en células HEK 294, representadas como la frecuencia CTL en base a la declinación de CFSE, la selección de células T CD3+ CD8+ (8A) o la frecuencia de CTLs específicas de pp65 (8B) proliferativas .

La Figura 9 muestra valoraciones del anticuerpo anti-gB y neutralizante en conejos tratados con composiciones de VLP ejemplares expresadas en células HEK 293 (analizadas en células humanas de fibroblasto) .

La Figura 10 muestra las valoraciones del anticuerpo neutralizante en conejos tratados con composiciones de VLP ejemplares expresadas en células HEK 293 (analizadas en células humanas epiteliales) .

La Figura 11A-B muestra imágenes de microscopía de electrón de manchado negativo (EM) de composiciones de VLP ejemplares expresadas en células CHO purificadas mediante (11A) filtración de flujo tangencial (TFF) o (11B) cromatografía de intercambio aniónico (AEX) .

La Figura 12 muestra las valoraciones del anticuerpo neutralizante en conejos tratados con composiciones de VLP ejemplares expresadas en células CHO y purificadas mediante filtración de flujo tangencial (TFF) y cromatografía de intercambio aniónico (AEX) (analizadas en células humanas de fibroblasto) .

La Figura 13 muestra las valoraciones del anticuerpo neutralizante en conejos tratados con composiciones de VLP ejemplares expresadas en células CHO purificadas mediante filtración de flujo tangencial (TFF) y cromatografía de intercambio aniónico (AEX) (analizadas en células humanas epiteliales) .

La Figura 14 muestra el índice de avidez de anticuerpos producidos en conejos tratados con composiciones de VLP ejemplares expresadas en células CHO y purificadas mediante filtración de flujo tangencial (TFF) y cromatografía de intercambio aniónico (AEX) .

DEFINICIONES A fin de entender más fácilmente la presente invención, primeramente se definen a continuación ciertos términos. Definiciones adicionales para los siguientes términos y otros términos se exponen a través de toda la especificación.

Aminoácido: Como se utiliza en la presente, el término "aminoácido" en su más amplio sentido, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que puede incorporarse en una cadena de polipéptidos . En algunas modalidades, un aminoácido tiene la estructura general H2N-C (H) ®-COOH. En algunas modalidades, un aminoácido es un aminoácido de origen natural. En algunas modalidades, el aminoácido es un aminoácido sintético; en algunas modalidades, el aminoácido es un aminoácido-d; en algunas modalidades, el aminoácido es un aminoácido-1. "Aminoácido estándar" se refiere a cualquiera de los veinte aminoácidos- 1 estándar comúnmente encontrados en péptidos de origen natural . "Aminoácido no estándar" se refiere a cualquier aminoácido, diferente a los aminoácidos estándar, sin importar si se prepara sintéticamente o se obtiene de una fuente natural. Como se utiliza en la presente, "aminoácido sintético" abarca aminoácidos químicamente modificados incluyen, pero no se limitan a, sales, derivados de aminoácido (tales como amidas) y/o sustituciones. Los aminoácidos, incluyendo aminoácidos de terminal carboxi y/o amino en péptidos, pueden modificarse mediante metilación, amidación, acetilación, grupos de protección, y/o sustitución con otros grupos químicos que pueden cambiar la vida media en circulación del péptido sin afectar adversamente su actividad. Los aminoácidos pueden participar en un enlace bisulfuro. Los aminoácidos pueden comprender una o más modificaciones post-translacionales , tales como la asociación con una o más entidades químicas (e.g., grupos metilo, grupos acetato, grupos acetilo, grupos fosfato, residuos de formilo, grupos isoprenoides, grupos sulfato, residuos de polietilenglicol, residuos de lípidos, residuos de carbohidratos, residuos de biotina, etc.) . El término "aminoácido" se utiliza de manera intercambiable con "residuo de aminoácido" y puede referirse a un aminoácido libre y/o a un residuo de aminoácido de un péptido. Será aparente a partir del contexto en el cual se utiliza el término si se refiere a un aminoácido libre o a un residuo de un péptido.

Antígeno: Como se utiliza en la presente, el término "antígeno" se refiere a una sustancia que contiene uno o más epítopes (ya sea lineales, conformacionales o ambos) que se reconocen por los anticuerpos. En ciertas modalidades, un antígeno es o comprende un virus o un polipéptido viral. En algunas modalidades, el término "antígeno" se refiere a un antígeno de subunidad (i.e., un antígeno que se encuentra separado de y no contiguo a un virus completo con el cual se asocia el antígeno en la naturaleza; e.g., un antígeno asociado con una partícula tipo virus) . Alternativa o adicionalmente , en algunas modalidades, el término "antígeno" se refiere a virus destruidos, atenuados o inactivados . En ciertas modalidades, un antígeno es un "inmunógeno" .

Aproximadamente o alrededor de: Como se utiliza en la presente, el término "aproximadamente" o "alrededor de" como se aplica a uno o más valores de interés, se refiere a un valor similar al valor de referencia declarado. En ciertas modalidades, el término "aproximadamente" o "alrededor de" se refiere a un rango de valores que cae dentro del 25%, 20%, 19%, 18%, 18%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o menos en cualquier dirección (más de o menos de) del valor de referencia declarado a menos que se defina de otra manera o sea de otra manera evidente a partir del contexto (excepto cuando tal número exceda el 100% de un valor posible) .

Mejoramiento: Como se utiliza en la presente, el término "mejoramiento" significa la prevención, reducción, paliación del estado, o la mejoría del estado de un sujeto. Mejoramiento incluye, pero no requiere, la completa recuperación o la completa prevención de una enfermedad, trastorno o condición (e.g., infección por HCMV) . El término "prevención" se refiere a un retraso en el inicio de una enfermedad, trastorno o condición. La prevención puede considerarse completa cuando el inicio de la enfermedad, trastorno o condición se ha retrasado durante un período de tiempo predefinido.

Porción característica: Como se utiliza en la presente, el término una "porción característica" de una sustancia, en el más amplio sentido, es una que comparte el grado de identidad estructural deseado con una sustancia intacta. En ciertas modalidades, una porción característica comparte al menos una característica funcional con la sustancia intacta. Por ejemplo, una "porción característica" de una proteína o polipéptido es una que contiene un tramo continuo de aminoácidos, o una recolección de tramos continuos de aminoácidos que juntos son característicos de una proteína o polipéptido. En algunas modalidades, cada uno de tales tramos continuos contiene generalmente al menos 2, 5, 10, 15, 20, 50 o más aminoácidos. En general, la porción característica de una sustancia (e.g., de una proteina, anticuerpo, etc.) es una que, además de la identidad de secuencia y/o estructural anteriormente especificadas, comparte al menos una característica funcional con la sustancia intacta relevante. En algunas modalidades, una porción característica puede ser biológicamente activa.

Secuencia característica: Una "secuencia característica" es una secuencia que se encuentra en todos los miembros de una familia de polipéptidos o ácidos nucleicos, y por consiguiente puede utilizarse por las personas de experiencia ordinaria en la técnica para definir miembros de la familia.

Dominio citoplásmico : Como se conoce en la técnica, los polipéptidos tienen algunas veces dominios transmembrana, citoplásmicos y/o extracelulares . En general, un "dominio citoplásmico", como se utiliza en la presente, se refiere a un dominio que tiene el atributo de estar presente en el citoplasma. Como se apreciará, no se requiere que cada aminoácido en el dominio citoplásmico se encuentre presente en el citoplasma. Por ejemplo, en algunas modalidades, el dominio citoplásmico se caracteriza en que un tramo o porción designada de una proteína se encuentra ubicada sustancialmente en el citoplasma. Como se conoce bien el la técnica, las secuencias de aminoácido o de ácido nucleico pueden analizarse utilizando una variedad de algoritmos para predecir la localización sub-celular de la proteína (e.g., localización citoplásmica) . Tales programas ejemplares incluyen psort (PSORT.org), Prosite (prosite.expasy.org), entre otros .

Forma de dosis: Como se utilizan en la presente, los términos "forma de dosis" y "forma de dosis unitaria" se refieren a una unidad físicamente separada de un agente terapéutico para el paciente que va tratarse. Cada unidad contiene una cantidad predeterminada del material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado. Sin embargo, se entenderá que la dosis total de la composición se decidirá por el médico a cargo dentro del alcance del juicio médico sensato.

Régimen de dosificación: Un "régimen de dosificación" (o "régimen terapéutico"), como se utiliza el término en la presente, es un conjunto de dosis unitarias (típicamente más de una) que se administran individualmente a un sujeto, típicamente separadas por períodos de tiempo. En algunas modalidades, un agente terapéutico dado tiene un régimen de dosificación recomendado que puede implicar una o más dosis. En algunas modalidades, el régimen de dosificación comprende una pluralidad de dosis separadas cada una de la otra por un período de tiempo de la misma longitud; en algunas modalidades, el régimen de dosificación comprende una pluralidad de dosis y al menos dos períodos de tiempo diferentes que separan las dosis individuales.

Expresión: Como se utiliza en la presente, la "expresión" de una secuencia de ácido nucleico se refiere a uno o más de los siguientes eventos: (1) la producción de una plantilla de ADN a partir de una secuencia de ADN (e.g., mediante transcripción) ,- (2) el procesamiento de una transcripción de ARN (e.g., dividir, editar la formación de la tapa 5' y/o la formación del extremo 3'); (3) la translación de un ARN en un polipéptido o proteína; y/o (4) la modificación post-translacional de un polipéptido o proteína.

Dominio extracelular : Como se conoce en la técnica, los polipéptidos tienen algunas veces dominios transmembrana, citoplásmicos, y/o extracelulares . En general, extracelular", como se utiliza en la presente, se refiere a un dominio que tiene el atributo de estar presente fuera de una célula. Como se apreciará, no se requiere que cada aminoácido en el dominio extracelular se encuentre presente fuera de la célula. Por ejemplo, en algunas modalidades, el dominio extracelular se caracteriza en que el tramo o porción designada de una proteína se ubica sustancialmente fuera de la célula. Como es bien sabido en la técnica, las secuencias de aminoácidos o ácido nucleico pueden analizarse utilizando una variedad de algoritmos para predecir la localización sub-celular de la proteína (e.g., la localización extracelular) . Tales programas ejemplares incluyen psort (PSORT.org) , Prosite (prosite.expasy.org), entre otros.

Protelna de fusión: Como se utiliza en la presente, el término "proteína de fusión" se refiere en general a un polipéptido que incluye al menos dos segmentos, de los cuales cada uno muestra un alto grado de identidad de aminoácido con el residuo de péptido que (1) se presenta en la naturaleza, y/o (2) representa un dominio funcional de un polipéptido. Típicamente, un polipéptido que contiene al menos dos de tales segmentos se considera como una proteína de fusión si los dos segmentos son residuos que (1) no se encuentran incluidos en la naturaleza en el mismo péptido, y/o (2) no se han enlazado previamente uno al otro en un solo polipéptido, y/o (3) se han enlazado entre sí a través de la acción de la mano del hombre.

Gen: Como se utiliza en la presente, el término 2gen" tiene su significado entendido en la técnica. Se apreciará por las personas de experiencia ordinaria en la técnica que el término wgen" puede incluir secuencias reguladoras del gen (e.g., promotores, mejoradores, etc.) y/o secuencias de intrón. Se apreciará además que las definiciones de gen incluyen referencias a ácidos nucleicos que no codifican para proteínas sino más bien codifican para moléculas de ARN funcionales tales como ARNts, agentes inductores de ARNi, etc. Para propósitos de claridad se anota que, como se utiliza en la presente solicitud, el término "gen" se refiere en general a una porción de un ácido nucleico que codifica para una proteína; el término puede abarcar opcionalmente secuencias regulatorias , como será claro a partir del contexto para las personas de experiencia ordinaria en la técnica. Esta definición no pretende excluir la aplicación del término "gen" a unidades de expresión que no codifican para proteínas sino más bien aclara que, en la mayoría de los casos, el término como se utiliza en este documento se refiere a un ácido nucleico que codifica para proteínas .

Producto del gen o producto de expresión: Como se utiliza en la presente, el término "producto del gen" o "producto de expresión" se refiere en general a un ARN transcrito a partir del gen (pre- y/o post-procesamiento) o un polipéptido (pre- y post-modificación) codificado por un ARN transcrito a partir del gen.

Heterólogo: Como se utiliza en la presente, el término "heterólogo" con respecto a una proteína o a un polipéptido se refiere a una proteína o polipéptido que es no de origen natural en un organismo particular, tal como un retrovirus o una VLP. En algunas modalidades, una proteína o polipéptido heterólogo es no de origen natural en un virión de retrovirus particular. Como se utiliza en la presente, el término "heterólogo" con respecto a un dominio de proteína se refiere generalmente a un dominio de proteína que es no de origen natural en una proteína particular.

Inmunogénico : Como se utiliza en la presente, el término "inmunogénico" significa que tiene la capacidad de producir una respuesta inmune en un animal huésped contra una entidad no huésped (e.g., un antígeno de HCMV) . En ciertas modalidades, esta respuesta inmune forma la base de la inmunidad protectora obtenida por una vacuna contra un organismo infeccioso específico (e.g., un HCMV) .

Respuesta inmune: Como se utiliza en la presente, el término "respuesta inmune" se refiere a una respuesta obtenida en un animal . Una respuesta inmune puede referirse a la inmunidad celular, a la inmunidad humoral o puede implicar ambas. La respuesta inmune también puede limitarse a una parte del sistema inmune. Por ejemplo, en ciertas modalidades, una composición inmunogénica puede inducir una respuesta a IFNy incrementada. En ciertas modalidades, una composición inmunogénica puede inducir una respuesta a IgA en mucosa (e.g., medida en lavados nasales y/o rectales) . En ciertas modalidades, una composición inmunogénica puede inducir una respuesta sistémica a IgG (e.g., medida en suero) . En ciertas modalidades, una composición inmunogénica puede inducir una respuesta a anticuerpos neutralizantes de virus o a un anticuerpo neutralizante.

Mejorar, incrementar o reducir: Como se utilizan en la presente, los términos "mejorar", "incrementar" o "reducir" o sus equivalentes gramáticos, indican valores relativos a una medición de línea base, tal como la medición en el mismo individuo antes de iniciar el tratamiento descrito en la presente, o la medición en un individuo de control (o en múltiples individuos de control) en ausencia del tratamiento descrito en la presente.

Individuo, sujeto, paciente: Como se utilizan en la presente, los términos "sujeto", "individuo" o "paciente" se refieren a un sujeto mamífero humano o no humano. En algunas modalidades, el individuo (también referido como "paciente" o "sujeto") que se trata es un individuo (feto, infante, niño, adolescente o adulto) que sufre de una enfermedad, por ejemplo, infección por HCMV. En algunas modalidades, el sujeto se encuentra en riesgo de infección por HCMV. En algunas modalidades, el sujeto es un sujeto inmunosuprimido . Por ejemplo, en algunas modalidades, el sujeto inmunosuprimido se selecciona del grupo que consiste de un sujeto infectado por VIH, un paciente de SIDA, un receptor de trasplante, un sujeto pediátrico, y un sujeto preñado. En algunas modalidades, el sujeto se ha expuesto a infección por HCMV. En algunas modalidades, el sujeto es un humano.

Aislado: Como se utiliza en la presente, el término "aislado" se refiere a una sustancia y/o entidad que (1) se ha separado de al menos algunos de los componentes con los cuales se encontraba asociada cuando se produjo inicialmente (ya sea en la naturaleza y/o en una instalación experimental) y/o (2) se ha producido, preparado y/o fabricado por la mano del hombre. Las sustancias y/o entidades aisladas pueden estar separadas aproximadamente 10%, aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% o más de aproximadamente 99% de los otros componentes con los cuales se encontraban asociadas inicialmente. En algunas modalidades, los agentes aislado son aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% o más de aproximadamente 99% puros. Como se utiliza en la presente, una sustancia el "pura" si se encuentra sustancialmente libre de otros componentes. Como se utiliza en la presente, el cálculo de la pureza porcentual de las sustancias y/o entidades aisladas no debe incluir los excipientes (e.g., amortiguador, solvente, agua, etc.).

Enlazador: Como se utiliza en la presente, el término "enlazador" se refiere, e.g., en una proteína de fusión, a una secuencia de aminoácidos de una longitud apropiada diferente a la que aparece en una posición particular en la proteína natural y generalmente se diseña para ser flexible y/o para interponerse a una estructura, tal como una hélice OÍ, entre dos residuos de proteína. En general, un enlazador permite que dos o más dominios de una proteína de fusión retengan el 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más de la actividad biológica de cada uno de los dominios . El enlazador también puede referirse como separador. Ácido nucleico: Como se utiliza en la presente, el término "ácido nucleico", en su más amplio sentido, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que esté o pueda ser incorporada en una cadena de oligonucleótidos . En algunas modalidades, un ácido nucleico es un compuesto y/o sustancia que está o puede estar incorporada en una cadena de oligonucleótidos a través de un enlace fosfodiéster . En algunas modalidades, "ácido nucleico" se refiere a residuos de ácido nucleico individuales (e.g., nucleótidos y/o nucleósidos) . En algunas modalidades, "ácido nucleico" se refiere a una cadena de oligonucleótidos que comprende residuos de ácido nucleico individuales. Como se utilizan en la presente, los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido" pueden utilizarse de manera intercambiable. En algunas modalidades, "ácido nucleico" abarca el ARN así como ADN de cadena única y/o doble y/o ADNc . Además, los términos "ácidos nucleico", "ADN", "ARN" y/o términos similares incluyen análogos de ácido nucleico, i.e., análogos que tienen una estructura diferente a fosfodiéster . Por ejemplo, los llamados "ácidos péptido nucleicos" que se conocen en la técnica y tienen enlaces de péptido en lugar de enlaces de fosfodiéster en la estructura, se consideran dentro del alcance de la presente invención. El término "secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos" incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones degeneradas una de la otra y/o que codifican para la misma secuencia de aminoácidos. Las secuencias de nucleótidos que codifican para proteínas y/o ARN pueden incluir intrones . Los ácidos nucleicos pueden purificarse a partir de fuentes naturales, producirse utilizando sistemas de expresión recombinante y opcionalmente purificarse, sintetizarse químicamente, etc. Cuando es apropiado, e.g., en el caso de moléculas químicamente sintetizadas, los ácidos nucleicos pueden comprender análogos de nucleósido tales como los análogos que tienen bases o azúcares químicamente modificados, modificaciones de estructura, etc. La secuencia de ácido nucleico se presenta en la dirección 5' o 3' a menos que se indique de otra manera. El término "segmento de ácido nucleico" se utiliza en la presente para referirse a una secuencia de ácido nucleico que es una porción de una secuencia de ácido nucleico más larga. En muchas modalidades, un segmento de ácido nucleico comprende al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más residuos. En algunas modalidades, un ácido nucleico es o comprende de nucleósidos naturales (e.g., adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina y desoxicitidina) ; análogos de nucleósido (e.g., 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3-metil adenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinil-citidina, C-5 propinil-uridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodouridina, C5-propinil-uridina, C5-propinil-citidina, C5-metilcitid9na, 2-aminoadenosina, 7-deaza adenosina, 7-deazaguanosina, 8 -oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O (6) -metilguanina y 2-tiocitidina) ; bases químicamente modificadas; bases biológicamente modificadas (e.g., bases metiladas) ; bases intercaladas; azúcares modificados (e.g., 2 ' -fluororribosa, ribosa, 2'-desoxirribosa, arabinosa y hexosa) ; y/o grupos fosfato modificados (e.g., enlaces de fosforotioatos y 5'-N-fosforamidita) . En algunas modalidades, la presente invención se dirige eepecíficamente a "ácidos nucleicos no modificados", lo cual significa ácidos nucleicos (e.g., polinucleótidos y residuos, incluyendo nucleótidos y/o nucleósidos) que se han modificado químicamente a fin de facilitar o lograr su suministro.

Farmacéuticamente aceptable: El término "farmacéuticamente aceptable" como se utiliza en la presente, se refiere a sustancias que, dentro del alcance del juicio médico sensato, son adecuadas para uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica, u otros problemas o complicaciones, proporcionales a una relación razonable de riesgo/beneficio .

Polipéptido: Como se utiliza en la presente, un "polipéptido", generalmente hablando, es una cadena de al menos dos aminoácidos unidos entre sí mediante un enlace péptido. En algunas modalidades, un polipéptido puede incluir al menos de 3 a 5 aminoácidos, de los cuales cada uno se encuentra unido a los otros por medio de al menos un enlace péptido. Las personas de experiencia ordinaria en la técnica apreciarán que los polipéptidos incluyen algunas veces aminoácidos "no naturales" u otras entidades que sin embargo tienen la capacidad de integrarse en una cadena de polipéptidos, opcionalmente.

Poliproteína: Como se utiliza en la presente, el término "poliproteína" se refiere en general a una proteína que, después de la síntesis, puede dividirse para producir varios polipéptidos funcionalmente distintos. Una poliproteína se codifica típicamente por una secuencia de aminoácidos única. En algunas modalidades, una poliproteína no dividida retiene la actividad biológica de sus partes componentes. Algunos virus producen poliproteínas tales, e.g., una poliproteína Gag, que pueden retenerse como una poliproteína funcional o que pueden procesarse en varios polipéptidos funcionalmente distintos. Funcionalmente, la poliproteína Gag se divide en tres dominios: el domino de enlace de membrana, que dirige la poliproteína Gag hacia la membrana celular; el dominio de interacción que promueve la polimerización de Gag; y el dominio último que facilita la liberación de viriones nacientes desde la célula huésped. En general, la forma de la proteína Gag que media el ensamble de la partícula viral es la poliproteína.

Porción de auto-ensamble : En general, una "porción de auto-ensamble", como se utiliza en la presente, se refiere a un tramo relevante de una entidad que adopta una disposición definida sin guía o manejo desde una fuente externa. En algunas modalidades, la entidad es una proteína. En algunas modalidades, la entidad es una poliproteína. En algunas de tales modalidades, el tramo relevante es de al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 475, 500 o más residuos. El auto-ensamble puede exhibirse, por ejemplo, dentro del contexto de una célula (e.g., in vivo). Alternativa o adicionalmente, el auto-ensamble puede exhibirse fuera del contexto de una célula (e.g., in vitro) . El auto-ensamble puede ser intramolecular (e.g., plegado) y/o intermolecular. En algunas modalidades, el auto-ensamble puede ser macromolecular mediante el cual las entidades se auto-ensamblan en un complejo y/o estructura macromolecular extendida. Las entidades auto-ensambladas pueden exhibir un amplio rango de motivos estructurales incluyen, pero no se limitan a, partículas, fibras, láminas y cintas. En algunas modalidades, el auto-ensamble de una entidad es importante para una función biológica de la entidad. Por ejemplo, en algunas modalidades, el auto-ensamble de un lípido conduce a la formación de una estructura de membrana celular. En algunas modalidades, el auto-ensamble de una proteína (e.g., una proteína estructural viral) en un contexto celular conduce a la formación de una estructura de partícula (e.g., una estructura de partícula viral) . Por ejemplo, una poliproteína estructural viral puede contener una secuencia de dirección que tiene la capacidad de dirigir su localización a una membrana celular de su célula huésped (e.g., membrana de plasma, endosoma, etc.) desde la cual la poliproteína puede germinar para formar una VLP que contiene material membranoso celular huésped que rodea la poliproteína estructural viral .

Homología sustancial : La frase "homología sustancial" se utiliza en la presente para referirse a una comparación entre secuencias de aminoácido o de ácido nucleico. Como se apreciará por las personas de experiencia ordinaria en la técnica, dos secuencias se consideran generalmente "sustancialmente homologas" si contienen residuos homólogos en las posiciones correspondientes. Los residuos homólogos pueden ser residuos idénticos. Alternativamente, los residuos homólogos pueden ser residuos no idénticos con características estructurales y/o funcionales apropiadamente similares. Por ejemplo, como es muy conocido por las personas de experiencia ordinaria en la técnica, ciertos aminoácidos se clasifican típicamente como aminoácidos "hidrófobos" o "hidrófilos" y/o teniendo cadenas laterales "polares" o "no polares" . La sustitución de un aminoácido por otro del mismo tipo puede considerarse frecuentemente como una sustitución "homologa" .

Como se conoce bien en la técnica, las secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos pueden compararse utilizando cualquiera de una variedad de algoritmos incluyendo aquellos disponibles en programas computarizados comerciales tales como BLASTN para secuencias de nucleótidos y BLASTP, BLAST ranurado, y PSI-BLAST para secuencias de aminoácidos. Tales programas ejemplares se describen en Altschul et al., Basic Local Alignment search tool (Herramienta básica de búsqueda de alineamiento local) J. Mol. Biol. 215(3): 403-410, 1990; Altschul et al., Methods in Enzymology (Métodos en enzimologia) 266: 460-480 (1996); Altschul et al., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein datábase search programs" (BLAST ranurado y PSI-BLAST: una nueva generación de programas de búsqueda de bases de datos de proteínas), Nucleic Acid Res. 25: 3389-3402, 1997; Baxevanis et al., Bioinformatics : A Practical guide to the Analysis of Genes and Proteins, (Bioinformática : una guía práctica para el análisis de genes y proteínas), Wiley, 1998; y Misener et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Bioinformática, métodos y protocolos) (Methods in Molecular Biology (Métodos en biología molecular) Vol. 132), Humana Press, 1999. Además de identificar secuencias homologas, los programas antes mencionados proporcionan típicamente una indicación del grado de homología. En algunas modalidades, dos secuencias se consideran sustancialmente homologas si al menos el 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de sus residuos correspondientes son homólogos sobre un tramo de residuos relevante. En algunas modalidades, el tramo relevante es una secuencia completa. En algunas modalidades, el tramo relevante es de al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 O más residuos.

Identidad sustancial: La frase "identidad sustancial" se utiliza en la presente para referirse a una comparación entre las secuencias de aminoácidos o de ácido nucleico. Como se apreciará por las personas de experiencia ordinaria en la técnica, dos secuencias se consideran generalmente "sustancialmente idénticas" si contienen residuos idénticos en las posiciones correspondientes. Como es muy conocido en esta técnica, las secuencias de aminoácidos o de pacido nucleico pueden compararse utilizando cualquiera de una variedad de algoritmos, incluyendo aquellos disponibles en programas computarizados comerciales tales como BLASTN para secuencias de nucleótidos y BLASTP, BLAST ranurado, y PSI-BLAST para secuencias de aminoácidos. Tales programas ejemplares se describen en Altschul et al., Basic Local Alignment search tool (Herramienta básica de búsqueda de alineamiento local) J. Mol. Biol . 215(3): 403-410, 1990; Altschul et al., Methods in Enzymology (Métodos en enzimología) 266: 460-480 (1996); Altschul et al., Nucleic Acid Res. 25: 3389-3402, 1997; Baxevanis et al., Bioinformatics : A Practical guide to the Analysis of Genes and Proteins, (Bioinformática : una guía práctica para el análisis de genes y proteínas), Wiley, 1998; y Misener et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Bioinformática, métodos y protocolos) (Methods in Molecular Biology (Métodos en biología molecular) Vol. 132), Humana Press, 1999. Además de identificar secuencias idénticas, los programas antes mencionados proporcionan típicamente una indicación del grado de identidad. En algunas modalidades, dos secuencias se consideran sustancialmente homologas si al menos el 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de sus residuos correspondientes son idénticos sobre un tramo de residuos relevante. En algunas modalidades, el tramo relevante es una secuencia completa. En algunas modalidades, el tramo relevante es de al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 o más residuos .

Que sufre de: Un individuo que "sufre de" una enfermedad, trastorno o condición (e.g., infección por HCMV) se ha diagnosticado con y/o exhibe uno o más síntomas de la enfermedad, trastorno o condición.

Susceptible a: Un individuo que es "susceptible a" una enfermedad, trastorno o condición (e.g., infección por HCMV) se encuentra en riesgo de desarrollar la enfermedad, trastorno o condición. En algunas modalidades, un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno o condición no despliega ningún síntoma de la enfermedad, trastorno o condición. En algunas modalidades, un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno o condición no se ha diagnosticado con la enfermedad, trastorno o condición. En algunas modalidades, un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno o condición es un individuo que se ha expuesto a condiciones asociadas con el desarrollo de la enfermedad, trastorno o condición (e.g., el individuo se ha expuesto a HCMV) .

Los síntomas se reducen: De acuerdo con la presente invención, los "síntomas se reducen" cuando uno o más de los síntomas de una enfermedad, trastorno o condición particular se reducen en magnitud (e.g., intensidad, severidad, etc.) o frecuencia. Para propósitos de claridad, un retraso en el inicio de un síntoma particular se considera una forma de reducción de la frecuencia de ese síntoma. No se pretende que la presente invención se limite solamente a los casos en donde los síntomas se eliminan. La presente invención contempla específicamente el tratamiento de tal manera de uno o más de los síntomas se reduzcan (y por tanto la condición del sujeto "mejore"), aunque no se eliminen completamente.

Cantidad terapéuticamente efectiva: Como se utiliza en la presente, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad suficiente para conferir un efecto terapéutico en el sujeto tratado, a una relación razonable de riesgo/beneficio aplicable a cualquier tratamiento médico. El efecto terapéutico puede ser objetivo (i.e., medible por medio de alguna prueba o marcador) o subjetivo (i.e., el sujeto proporciona una indicación de o siente un efecto) . En particular, la "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de una proteína o composición terapéutica efectiva para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o condición deseada, o para exhibir un efecto terapéutico o preventivo deseable, tal como aminorando los síntomas asociados con la enfermedad, previniendo o retrasando el inicio de la enfermedad y/o también disminuyendo la severidad o la frecuencia de los síntomas de la enfermedad. Una cantidad terapéuticamente efectiva se administra comúnmente en un régimen de dosificación que puede comprender múltiples dosis unitarias. Para cualquier composición inmunogénica particular, una cantidad terapéuticamente efectiva (y/o una dosis unitaria apropiada dentro de un régimen de dosificación efectivo) puede variar, por ejemplo, dependiendo de la vía de administración, en combinación con otros agentes farmacéuticos. También, la cantidad terapéuticamente efectiva específica (y/o dosis unitaria) para cualquier paciente particular puede depender de una variedad de factores incluyendo el trastorno que se trata y la severidad del trastorno; la actividad del agente farmacéutico específico empleado; la composición específica empleada; la edad, el peso corporal, la salud general, el género y la dieta del paciente; el tiempo de administración, la vía de administración y/o la tasa de excreción o el metabolismo de la composición inmunogénica específica empleada; la duración del tratamiento; y factores similares como es muy conocido en las técnicas médicas .

Dominio de transmembrana: Como se conoce en la técnica, los polipéptidos tienen algunas veces dominios transmembrana, citoplásmicos y/o extracelulares. En general, transmembrana" como se utiliza en la presente, se refiere a un dominio que tiene el atributo de estar presente en la membrana (e.g., que se extiende en una porción o toda la membrana celular) . Como se apreciará, no se requiere que cada aminoácido en el dominio de transmembrana se encuentre presente en la membrana. Por ejemplo, en algunas modalidades, el dominio de transmembrana se caracteriza en que un tramo o porción designada de una proteína se encuentra ubicada sustancialmente en la membrana. Como se conoce bien el la técnica, las secuencias de aminoácido o de ácido nucleico pueden analizarse utilizando una variedad de algoritmos para predecir la localización sub- celular de la proteína (e.g., localización transmembrana) . Tales programas ejemplares incluyen psort (PSORT.org), Prosite (prosite.expasy.org), entre otros.

Tratamiento: Como se utiliza en la presente, el término "tratamiento" (también "tratar" o "tratando") se refiere a cualquier administración de una composición inmunogénica que parcial o completamente alivia, mejora, mitiga, inhibe, retrasa el inicio de, reduce la severidad de y/o reduce la incidencia de uno o más síntomas o características de una enfermedad, trastorno y/o condición particular (e.g., infección por HCMV) o la predisposición hacia la enfermedad. Tal tratamiento puede ser de un sujeto que no exhibe signos de la enfermedad, trastorno y/o condición relevante. Alternativa o adicionalmente, tal tratamiento puede ser de un sujeto que exhibe uno o más signos establecidos de la enfermedad, trastorno y/o condición relevante. En ciertas modalidades, el término "tratando" se refiere a la vacunación de un paciente.

Vacunación: Como se utiliza en la presente, el término "vacunación" se refiere a la administración de una composición destinada a generar una respuesta inmune, por ejemplo, a un agente que ocasiona la enfermedad (e.g., HCMV) . Para los propósitos de la presente invención, la vacunación puede administrarse antes, durante y/o después de la exposición al agente que ocasiona la enfermedad y, en ciertas modalidades, antes durante y/o poco después de la exposición al agente. En algunas modalidades, la vacunación incluye múltiples administraciones, apropiadamente separadas en tiempo, de una composición de vacunación.

Vector: Como se utiliza en la presente "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico con la capacidad de transportar otro ácido nucleico al cual se asocia. En algunas modalidades, los vectores tienen la capacidad de replicación extra-cromosómica y/o de expresión de los ácidos nucleicos a los cuales se encuentran enlazados en una célula huésped tal como una célula eucariótica y/o procariótica . Los vectores capaces de dirigir la expresión de genes operativamente enlazados se refieren en la presente como "vectores de expresión" .

Descripción Detallada de Ciertas Modalidades Entre otras cosas, la presente invención proporciona métodos y composiciones útiles para la profilaxis, tratamiento y/o estudio de la infección por citomegalovirus humano (HCMV) . En algunas modalidades, la presente invención proporciona partículas tipo virus (VLPs) que comprenden una o más proteínas núcleo del virus de leucemia murina Moloney ( MLV) e incluyen uno o más epítopes de HCMV, tales como, por ejemplo, de las glicoproteínas gB y/o gH de envoltura de HCMV y/o la proteína pp65 de tegumento. Entre otras cosas, la presente invención abarca el reconocimiento de que la combinación de antígenos (e.g., glicoproteínas de envoltura y proteínas estructurales) puede conducir a una mejor inducción de las respuestas inmunes benéficas, por ejemplo, que incluyen tanto una respuesta humoral (e.g., la producción de anticuerpos neutralizantes) como una respuesta celular (e.g., la activación de la célula T) . Las VLPs proporcionadas pueden caracterizarse en que no contienen ARN o ADN viral y no son infecciosas. En algunas modalidades, las VLPs proporcionadas contienen ARN o ADN viral y son infecciosas. En algunas de tales modalidades, las VLPs proporcionadas son útiles como una vacuna de ADN.

En algunas modalidades, la respuesta humoral inmune en un sujeto se sostiene durante al menos aproximadamente 1 mes, al menos aproximadamente 2 meses, al menos aproximadamente 3 meses, al menos aproximadamente 4 meses, al menos aproximadamente 5 meses, al menos aproximadamente 6 meses, al menos aproximadamente 7 meses, al menos aproximadamente 8 meses, al menos aproximadamente 9 meses, al menos aproximadamente 10 meses, al menos aproximadamente 11 meses, al menos aproximadamente 12 meses, al menos aproximadamente 13 meses, al menos aproximadamente 14 meses, al menos aproximadamente 15 meses, al menos aproximadamente 16 meses, al menos aproximadamente 17 meses, al menos aproximadamente 18 meses, al menos aproximadamente 19 meses, al menos aproximadamente 20 meses, al menos aproximadamente 21 meses, al menos aproximadamente 22 meses, al menos aproximadamente 23 meses, al menos aproximadamente 24 meses, al menos aproximadamente 28 meses, al menos aproximadamente 32 meses, al menos aproximadamente 36 meses, al menos aproximadamente 40 meses, al menos aproximadamente 44 meses, al menos aproximadamente 48 meses, o más. En algunas modalidades, la respuesta celular inmune en un sujeto se sostiene durante al menos aproximadamente 1 mes, al menos aproximadamente 2 meses, al menos aproximadamente 3 meses, al menos aproximadamente 4 meses, al menos aproximadamente 5 meses, al menos aproximadamente 6 meses, al menos aproximadamente 7 meses, al menos aproximadamente 8 meses, al menos aproximadamente 9 meses, al menos aproximadamente 10 meses, al menos aproximadamente 11 meses, o al menos 12 meses .

En algunas modalidades, las VLPs proporcionadas se encuentran rodeadas por una membrana de lípidos que contiene opcionalmente uno o más epítopes provenientes de glicoproteínas de envoltura virales (e.g., gB y/o gH) que son antígenos que juegan un papel en la inducción de anticuerpos neutralizantes del virus.

En algunas modalidades, las VLPs proporcionadas contienen uno o más epítopes provenientes de proteínas estructurales virales (e.g., pp65) que son antígenos que juegan un papel en la inducción de las respuestas inmunes celulares (e.g., la respuesta de la célula T) . En algunas modalidades, las proteínas estructurales virales utilizadas (e.g., pp65) estimulan ambas la formación de células T auxiliares (TH) y también inducen linfocitos T citotóxicos (CTL) contra HCMV.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona variantes de glicoproteinas de envoltura virales (e.g., gB y/o gH) . En algunas modalidades, una glicoproteína variante de envoltura viral es o comprende una proteina de fusión. En algunas modalidades, una variante de una glicoproteína viral comprende un dominio de proteína he erólogo (e.g., un dominio de transmembrana y/o citoplásmico de una proteína diferente) . En algunas modalidades, una variante de una proteína estructural viral comprende un antígeno o epítope heterólogo. En algunas modalidades, la presente invención proporciona VLPs que comprenden variantes de proteínas estructurales virales. En algunas modalidades, una variante de una proteína estructural viral es o comprende una proteína de fusión.

I. Partículas tipo virus (VLPs) Los retrovirus son virus de ARN envueltos que pertenecen a la familia Retroviridae . Después de la infección de una célula huésped por un retrovirus, el ARN se transcribe en el ADN a través de la enzima transcriptasa inversa. Después el ADN se incorpora en el genoma de la célula huésped por medio de una enzima integrasa y después se replica como parte del ADN de la célula huésped. La familia Retroviridae incluye los siguientes géneros Alpharetrovirus, Betaretrovirus, Gammaretrovirus , Deltaretrovirus , Epsilonretrovirus , Lentivirus y Spumavirus . Los huéspedes para esta familia de retrovirus son generalmente vertebrados. Los retrovirus producen un virión infeccioso que contiene una nucleocápside esférica (el genoma viral en complejo con proteínas estructurales virales) rodeada por una bicapa de lípidos derivada de la membrana de la célula huésped.

Los vectores retrovirales pueden utilizarse para generar viriones envueltos que son infecciosos y ya sea competentes en replicación o deficientes en replicación. Los vectores retrovirales infecciosos competentes en replicación contienen todos los genes necesarios para la síntesis de virión y continúan propagándose por sí mismos una vez que se presenta la infección de la célula huésped. Los vectores retrovirales infecciosos deficientes en replicación no se difunden después de la infección inicial. Esto se lleva a cabo mediante el remplazo de la mayor parte de las regiones de codificación del retrovirus con los genes o las secuencias de nucleótidos que van a transferirse; de manera que el vector no tiene la capacidad de producir las proteínas requeridas para las rondas de replicación adicionales.

Alternativa o adicionalmente, pueden utilizarse vectores retrovirales para generar partículas tipo virus (VLPs) que carecen de un genoma derivado del retrovirus y son tanto no infecciosas como no replicantes. Debido a las ventajosas propiedades de las VLPs, las VLPs pueden utilizarse como un sistema de suministro de antígeno. Además, debido a que las VLPs no son infecciosas, pueden administrarse con seguridad como una composición inmunogénica (e.g., una vacuna). Las VLPs son en general estructuralmente similares a los viriones envueltos descritos anteriormente, pero carecen de un genoma derivado del retrovirus, haciendo improbable que se presente la replicación viral. La expresión de las proteínas de cápside (e.g., Gag) de algunos virus (e.g., virus de leucemia murina, tales como el virus de leucemia murina Moloney (MMLV) ) conducen al auto-ensamble en partículas similares al virus nativo correspondiente, cuyas partículas se encuentran libres de material genético viral.

Se ha preparado una amplia variedad de VLPs. Por ejemplo, se han preparado VLPs que incluyen proteínas de cápside únicas o múltiples ya sea con o sin proteínas de envoltura y/o glicoproteínas de superficie. En algunos casos, las VLPs no son envueltas y se ensamblan mediante la expresión de solo una proteína de cápside mayor, como se muestra para las VLPs preparadas a partir de hepadnavirus (e.g., Engerix™, GSK y Recombivax HB™, Merck), virus del papiloma (e.g., Cervarix™, GSK y Gardasil™, Merck), parovirus, o poliomavirus . En algunas modalidades, las VLPs están envueltas y pueden comprender múltiples proteínas antigénicas encontradas en el virus nativo correspondiente.

Las VLPs se asemejan típicamente a sus virus nativos correspondientes y pueden ser estructuras particuladas multivalentes . En algunas modalidades, las proteínas antigénicas pueden presentarse internamente dentro de la VLP, como un componente de la estructura de VLP y/o en la superficie de la VLP. La presente invención abarca el reconocimiento de que la presentación de un antígeno en el contexto de una VLP es ventajosa para la inducción de anticuerpos neutralizantes contra el antígeno en comparación con otras formas de presentación de antígeno, e.g., antígenos solubles no asociados con una VLP. Los anticuerpos neutralizantes reconocen más frecuentemente las estructuras terciarias o cuaternarias; esto frecuentemente requiere la presentación de proteínas antigénicas, como las glicoproteínas de envoltura, en su conformación viral nativa. Alternativa o adicionalmente, las VLPs pueden ser útiles para presentar antígenos en un contexto que induce la inmunidad celular (e.g., la respuesta de la célula T) . La presente invención abarca además la visión de que el uso de combinaciones de antígeno en sistemas de VLP puede generar una respuesta inmune mejorada.

A. Proteínas Estructurales En algunas modalidades, la presente invención utiliza VLPs comprendidas de una o más proteínas estructurales retrovirales (e.g., Gag) . En algunas modalidades, una proteina estructural para uso de acuerdo con la presente invención es la proteína estructural Alpharetrovirus (e.g., virus de leucosis aviar), Betaretrovirus (virus de tumor mamario de ratón) , Gammaretrovirus (virus de leucemia murina) , Deltaretrovirus (virus de leucemia bovina) , Epsilonretrovirus (virus de sarcoma dérmico de Walley) , Lentivirus (virus 1 de inmunodeficiencia humana) o Spumavirus (virus espumoso de chimpancé) . En ciertas modalidades, una poliproteína estructural es una proteína estructural del virus de leucemia murina ( LV) . Los genomas de estos retrovirus se encuentran fácilmente disponibles en bases de datos. Los genes Gag de todos estos retrovirus tienen una similitud estructural general y dentro de cada grupo de retrovirus están conservados en el nivel de aminoácidos . Las proteínas Gag retrovirales funcionan principalmente en el ensamble viral. El gen Gag en forma de una poliproteína da lugar a las proteínas estructurales núcleo de la VLP. El gen Gag de MLV codifica para un precursor de poliproteína de 65 kDa que se desdobla proteolíticamente en 4 proteínas estructurales (Matrix (MA) pl2; Cápside (CA) ; y Nucleocápside (NC) ) , mediante la proteasa MLV, en el virión maduro. Los retrovirus ensamblan la cápside inmadura compuesta de la poliproteína Gag formada a partir del polipéptido Gag pero desprovista de otros elementos virales como la proteasa viral, siendo Gag la proteína estructural de la partícula del virus inmaduro. Funcionalmente , la poliproteína Gag se divide en tres dominios: el dominio de enlace de membrana, que dirige la poliproteína Gag a la membrana celular; el dominio de interacción que promueve la polimerización de Gag; y el dominio último que facilita la liberación de los viriones nacientes de la célula huésped. La forma de la proteína Gag que media el ensamble viral de la partícula viral es la poliproteína.

En algunas modalidades, una proteína estructural retroviral para uso de acuerdo con la presente invención es un polipéptido Gag. Como se utiliza en la presente, el término "polipéptido Gag" es el polipéptido estructural derivado de retrovirus responsable de la formación de las VLPs descritas en la presente y se refiere a una secuencia de polipéptidos cuya secuencia de aminoácidos incluye al menos una secuencia característica de Gag. Una amplia variedad de secuencias Gag provenientes de varios retrovirus se conocen en la técnica y las personas de experiencia ordinaria en la técnica, refiriéndose a tales secuencias, pueden identificar fácilmente secuencias que son características de las proteínas Gag en general y/o de polipéptidos Gag en particular.

Un polipéptido Gag ejemplar para uso de acuerdo con la presente invención se muestra como la SEQ ID NO: 1 más adelante. En algunas modalidades un polipéptido Gag adecuado es sustancialmente homólogo a un polipéptido Gag retroviral conocido. Por ejemplo, un polipéptido Gag puede ser un polipéptido Gag retroviral modificado que contiene una o más sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos en comparación con un polipéptido Gag de tipo silvestre o de origen natural (e.g., SEQ ID NO: 1), mientras retiene una actividad sustancial de auto-ensamble . Por tanto, en algunas modalidades, un polipéptido Gag adecuado para la presente invención es sustancialmente homólogo a un polipéptido Gag de MMLV (SEQ ID NO: 1) . En algunas modalidades, un polipéptido Gag adecuado para la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más, homologa a la SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, un polipéptido Gag adecuado para la presente invención es sustancialmente idéntico a un polipéptido Gag de MMLV (SEQ ID NO: 1) . En algunas modalidades, un polipéptido Gag adecuado para la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la SEQ ID NO: 1.

Secuencia de Aminoácidos Gag de MMLV (SEQ ID NO: 1) MGQTVTTPLSLTLGHWKDVERIAHNQSVDVKKRRWVTFCSAEWPTFNVGWPRDGTFNRDLI TQVKIKVFSPGPHGHPDQVPYIVTWEALAFDPPPWVKPFVHPKPPPPLPPSAPSLPLEPPR STPPRSSLYPALTPSLGAKPKPQVLSDSGGPLIDLLTEDPPPYRDPRPPPSDRDGNGG EATPAGEAPDPSPMASRLRGRREPPVADSTTSQAFPLRAGGNGQLQYWPFSSSDLYNW K N PSFSEDPGKLTALIESVLITHQPTWDDCQQLLGTLLTGEEKQRVLLEARKAVRGD DGRPTQLPNEVDAAFPLERPDWDYTTQAGR HLVHYRQLLLAGLQNAGRSPTNLAKV KGITQGPNESPSAFLERLKEAYRRYTPYDPEDPGQET VSMSFIWQSAPDIGRKLERLED LK KTLGDLWEAEKIFNKRETPEEREERIRRETEEKEERRRTEDEQKEKERDRRRHREM SKLLATWSGQKQDRQGGERRRSQLDRDQCAYCKEKGHWAKDCPKKPRGPRGPRPQT SLLTLDD (SEQ ID NO:l) Secuencia de Nucleótidos Gag de MLV (SEQ ID NO: 2) ATGGGCCAGACTGTTACCACTCCCTTAAGTTTGACCTTAGGTCACTGGAAAGATGTC GAGCGGATCGCTCACAACCAGTCGGTAGATGTCAAGAAGAGACGTTGGGTTACCTT CTGCTCTGCAGAATGGCCAACCTTTAACGTCGGATGGCCGCGAGACGGCACCTTTAA CCGAGACCTCATCACCCAGGTTAAGATCAAGGTCTTTTCACCTGGCCCGCATGGACA CCCAGACCAGGTCCCCTACATCGTGACCTGGGAAGCCTTGGCTTTTGACCCCCCTCC CTGGGTCAAGCCCTTTGTACACCCTAAGCCTCCGCCTCCTCTTCCTCCATCCGCCCCG TCTCTCCCCCTTGAACCTCCTCGTTCGACCCCGCCTCGATCCTCCCTTTATCCAGCCC TCACTCCTTCTCTAGGCGCCAAACCTAAACCTCAAGTTCTTTCTGACAGTGGGGGGC CGCTCATCGACCTACTTACAGAAGACCCCCCGCCTTATAGGGACCCAAGACCACCCC CTTCCGACAGGGACGGAAATGGTGGAGAAGCGACCCCTGCGGGAGAGGCACCGGA CCCCTCCCCAATGGCATCTCGCCTACGTGGGAGACGGGAGCCCCCTGTGGCCGACTC CACTACCTCGCAGGCATTCCCCCTCCGCGCAGGAGGAAACGGACAGCTTCAATACT GGCCGTTCTCCTCTTCTGACCTTTACAACTGGAAAAATAATAACCCTTCTTTTTCTGA AGATCCAGGTAAACTGACAGCTCTGATCGAGTCTGTTCTCATCACCCATCAGCCCAC CTGGGACGACTGTCAGCAGCTGTTGGGGACTCTGCTGACCGGAGAAGAAAAACAAC GGGTGCTCTTAGAGGCTAGAAAGGCGGTGCGGGGCGATGATGGGCGCCCCACTCAA CTGCCCAATGAAGTCGATGCCGCTTTTCCCCTCGAGCGCCCAGACTGGGATTACACC ACCCAGGCAGGTAGGAACCACCTAGTCCACTATCGCCAGTTGCTCCTAGCGGGTCTC CAAAACGCGGGCAGAAGCCCCACCAATTTGGCCAAGGTAAAAGGAATAACACAAG GGCCCAATGAGTCTCCCTCGGCCTTCCTAGAGAGACTTAAGGAAGCCTATCGCAGGT ACACTCCTTATGACCCTGAGGACCCAGGGCAAGAAACTAATGTGTCTATGTCTTTCA TTTGGCAGTCTGCCCCAGACATTGGGAGAAAGTTAGAGAGGTTAGAAGATTTAAAA AACAAGACGCTTGGAGATTTGGTTAGAGAGGCAGAAAAGATCTTTAATAAACGAGA AACCCCGGAAGAAAGAGAGGAACGTATCAGGAGAGAAACAGAGGAAAAAGAAGA ACGCCGTAGGACAGAGGATGAGCAGAAAGAGAAAGAAAGAGATCGTAGGAGACAT AGAGAGATGAGCAAGCTATTGGCCACTGTCGTTAGTGGACAGAAACAGGATAGACA GGGAGGAGAACGAAGGAGGTCCCAACTCGATCGCGACCAGTGTGCCTACTGCAAAG AAAAGGGGCACTGGGCTAAAGATTGTCCCAAGAAACCACGAGGACCTCGGGGACC AAGACCCCAGACCTCCCTCCTGACCCTAGATGAC (SEQ ID N0:2) Secuencia de Nucleótidos Gag de MMLV Optimizada por Codón (SEQ ID NO: 3) ATGGGACAGACAGTCACTACACCCCTGAGCCTGACACTGGGACATTGGAAAGACGT GGAGAGGATTGCACATAACCAGAGCGTGGACGTGAAGAAACGGAGATGGGTCACCT TTTGCTCCGCCGAGTGGCCAACATTCAATGTGGGATGGCCCCGAGATGGCACCTTCA ACCGGGACCTGATCACTCAGGTGAAGATCAAGGTCTTCTCTCCAGGACCCCACGGCC ATCCAGATCAGGTGCCCTACATCGTCACCTGGGAGGCTCTGGCATTTGACCCCCCTC CATGGGTGAAGCCTTTCGTCCACCCAAAACCACCTCCACCACTGCCTCCATCTGCCC CTAGTCTGCCACTGGAACCCCCTCGGTCAACCCCACCCAGAAGCTCCCTGTATCCCG CACTGACACCTAGCCTGGGGGCCAAGCCTAAACCACAGGTGCTGTCTGATAGTGGC GGGCCTCTGATCGATCTGCTGACCGAGGACCCTCCACCATACCGCGACCCACGACCT CCACCAAGCGACCGGGACGGAAACGGAGGAGAGGCTACACCCGCAGGCGAAGCCC CCGATCCTAGTCCAATGGCATCAAGGCTGCGCGGGAGGCGCGAACCTCCAGTGGCC GACTCAACCACAAGCCAGGCATTTCCACTGAGGGCCGGGGGAAATGGACAGCTCCA GTATTGGCCCTTCTCTAGTTCAGATCTGTACAACTGGAAGAACAATAACCCTAGCTT CAGCGAGGACCCAGGCAAACTGACCGCCCTGATCGAATCCGTGCTGATTACCCACC AGCCCACATGGGACGATTGTCAGCAGCTCCTGGGCACCCTGCTGACCGGAGAGGAA AAGCAGAGAGTGCTGCTGGAGGCTAGGAAAGCAGTCCGCGGGGACGATGGAAGGC CAACACAGCTCCCCAATGAGGTGGATGCCGCTTTCCCTCTGGAACGGCCAGATTGGG ACTATACTACCCAGGCTGGACGCAACCACCTGGTGCATTACCGGCAGCTCCTGCTGG CTGGACTGCAGAATGCAGGGCGCAGCCCCACTAACCTGGCCAAGGTGAAAGGAATC ACCCAGGGCCCCAATGAGTCCCCTTCTGCATTCCTGGAGCGGCTGAAGGAAGCCTAC CGACGGTATACTCCCTACGATCCTGAGGACCCAGGCCAGGAAACCAACGTGAGTAT GAGCTTCATCTGGCAGTCCGCTCCTGACATTGGCCGAAAACTGGAGCGGCTGGAAG ATCTGAAGAACAAGACCCTGGGCGACCTGGTGCGGGAGGCAGAAAAGATCTTCAAC AAAAGGGAGACTCCAGAGGAACGGGAGGAAAGAATTAGAAGGGAAACAGAGGAA AAGGAGGAACGCCGACGGACTGAGGATGAACAGAAGGAGAAAGAAAGAGACCGGC GGCGGCACCGGGAGATGTCTAAGCTGCTGGCCACCGTGGTCAGTGGCCAGAAACAG GATCGACAGGGAGGAGAGCGACGGAGAAGCCAGCTCGATCGGGACCAGTGCGCCT ATTGTAAGGAAAAAGGGCATTGGGCTAAGGACTGCCCCAAGAAACCCAGAGGCCCA CGCGGGCCCCGACCTCAGACTTCCCTGCTGACCCTGGACGAT (SEQ ID NO:3) Secuencia de Nucleótidos Gag de MMLV Optimizada por Codón (SEQ ID NO: 21) ATGGGACAGACCGTCACAACACCCCTGAGCCTGACCCTGGGACATTGGAAAGACGT GGAGAGGATCGCACATAACCAGAGCGTGGACGTGAAGAAACGGAGATGGGTCACA TTCTGCAGTGCTGAGTGGCCAACTTTTAATGTGGGATGGCCCCGAGACGGCACTTTC AACAGGGATCTGATCACCCAGGTGAAGATCAAGGTCTTTAGCCCAGGACCTCACGG ACATCCAGACCAGGTGCCTTATATCGTCACCTGGGAGGCACTGGCCTTCGATCCCCC TCC1ATGGGTGAAGCCATTTGTCCACCCAAAACCACCTCCACCACTGCCTCCAAGTGC CCCTTCACTGCCACTGGAACCACCCCGGAGCACACCACCCCGCAGCTCCCTGTATCC TGCTCTGACTCCATCTCTGGGCGCAAAGCCAAAACCACAGGTGCTGAGCGACTCCG GAGGACCACTGATTGACCTGCTGACAGAGGACCCCCCACCATACCGAGATCCTCGG CCTCCACCAAGCGACCGCGATGGAAATGGAGGAGAGGCTACTCCTGCCGGCGAAGC CCCTGACCCATCTCCAATGGCTAGTAGGCTGCGCGGCAGGCGCGAGCCTCCAGTGG CAGATAGCACCACATCCCAGGCCTTCCCTCTGAGGGCTGGGGGAAATGGGCAGCTC CAGTATTGGCCATTTTCTAGTTCAGACCTGTACAACTGGAAGAACAATAACCCCTCT TTCAGTGAGGACCCCGGCAAACTGACCGCCCTGATCGAATCCGTGCTGATTACCCAT CAGCCCACATGGGACGATTGTCAGCAGCTCCTGGGCACCCTGCTGACCGGAGAGGA AAAGCAGCGCGTGCTGCTGGAGGCTCGCAAAGCAGTCCGAGGGGACGATGGACGG CCCACACAGCTCCCTAATGAGGTGGACGCCGCTTTTCCACTGGAAAGACCCGACTGG GATTATACTACCCAGGCAGGGAGAAACCACCTGGTCCATTACAGGCAGCTCCTGCT GGCAGGCCTGCAGAATGCCGGGAGATCCCCCACCAACCTGGCCAAGGTGAAAGGCA TCACACAGGGGCCTAATGAGTCACCAAGCGCCTTTCTGGAGAGGCTGAAGGAAGCT TACCGACGGTATACCCCATACGACCCTGAGGACCCCGGACAGGAAACAAACGTCTC CATGTCTTTCATCTGGCAGTCTGCCCCAGACATTGGGCGGAAGCTGGAGAGACTGGA AGACCTGAAGAACAAGACCCTGGGCGACCTGGTGCGGGAGGCTGAAAAGATCTTCA ACAAACGGGAGACCCCCGAGGAAAGAGAGGAAAGGATTAGAAGGGAAACTGAGGA AAAGGAGGAACGCCGACGGACCGAGGACGAACAGAAGGAGAAAGAACGAGATCG GCGGCGGCACCGGGAGATGTCAAAGCTGCTGGCCACCGTGGTCAGCGGACAGAAAC AGGACAGACAGGGAGGAGAGCGACGGAGAAGCCAGCTCGACAGGGATCAGTGCGC ATACTGTAAGGAAAAAGGCCATTGGGCCAAGGATTGCCCCAAAAAGCCAAGAGGAC CAAGAGGACCAAGACCACAGACATCACTGCTGACCCTGGACGAC (SEQ ID NO:21) Típicamente en la naturaleza, una proteína Gag incluye una gran extensión de terminal C que puede contener actividad enzimática de proteasa retroviral, transcriptasa inversa e integrasa. Sin embargo, el ensamble de las VLPs, generalmente no requiere la presencia de tales componentes . En algunos casos, una proteína Gag retroviral sola (e.g., carente de una extensión de terminal C, carente de uno o más de ARN genómico, transcriptasa inversa, proteasa viral o proteína de envoltura) puede auto-ensamblarse para formar VLPs tanto in vitro como in vivo (Sharma S. et al., 1997 Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 94: 10803-8). La poliproteína Gag retroviral sola puede oligomerizarse y ensamblarse en VLPs.

En algunas modalidades, un polipéptido Gag para uso de acuerdo con la presente invención carece de la extensión de terminal C y/o contiene una extensión de terminal C modificada. Un polipéptido Gag puede incluir opcionalmente uno o más polipéptidos adicionales (e.g., un antígeno heterologo) . En algunas modalidades, el polipéptido Gag se co-expresa con un antígeno heterologo (e.g., bajo promotores separados y/o como proteínas separadas) . En algunas modalidades, un polipéptido Gag se expresa como una proteína de fusión con un antígeno heterologo. El polipéptido Gag puede estar enlazado a un antígeno heterologo para crear una proteína de fusión sin alterar la función de Gag. Por ejemplo, una secuencia de codificación para un antígeno heterólogo puede empalmarse en la secuencia de codificación del polipéptido Gag, e.g., en el extremo 3' de la secuencia de codificación del polipéptido Gag. En algunas modalidades, una secuencia de codificación para un antígeno heterólogo puede empalmarse en el marco en la secuencia de codificación del polipéptido Gag. En algunas modalidades, la secuencia de codificación del polipéptido Gag y el antígeno heterólogo pueden expresarse por medio de un solo promotor. En algunas modalidades, un antígeno heterólogo se inserta en (e.g., se fusiona a) la terminal C de un polipéptido Gag. Sin el deseo de vincularse a alguna teoría, se considera que la fusión de un polipéptido Gag de auto-ensamble a un antígeno heterólogo crea una proteína de fusión que actúa como un Gag no modificado y como resultado permitirá la incorporación del antígeno en los componentes estructurales de la VLP resultante. En algunas modalidades, los componentes estructurales de la VLP sirven como inmunógenos efectivos (e.g., para la inducción de la respuesta celular inmune). Por ejemplo, las VLPs proporcionadas pueden comprender un polipéptido Gag retroviral (e.g., Gag de MMLV) y un componente estructural del HCMV (e.g., pp65) . En algunas modalidades, el pp65 se incorpora en la VLP y sirve como un antígeno para producir una respuesta inmune contra HCMV.

Un polipéptido de fusión Gag-pp65 ejemplar para uso de acuerdo con la presente invención se muestra como la siguiente SEQ ID NO: 4. En algunas modalidades, una proteína de fusión de polipéptido Gag adecuada incluye todo o una porción del polipéptido Gag que es sustancialmente homólogo a un polipéptido Gag retroviral conocido y todo o una porción de un polipéptido pp65 que es sustancialmente homólogo a un polipéptido pp65 conocido. Por ejemplo, la proteína de fusión de polipéptido Gag-pp65 puede contener una o más sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácido en comparación con un polipéptido Gag de tipo silvestre o de origen natural y/o un polipéptido pp65, mientras retiene su actividad sustancial de auto-ensamble . Por tanto, en algunas modalidades, una proteína de fusión de polipéptido Gag-pp65 adecuada para la presente invención es sustancialmente homologa a la SEQ ID NO: 4. En algunas modalidades, una proteína de fusión de polipéptido Gag-pp65 adecuada para la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más, homologa a la SEQ ID NO: 4. En algunas modalidades, una proteína de fusión de polipéptido Gag-pp65 adecuada para la presente invención es sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO: 4. En algunas modalidades, una proteína de fusión de polipéptido Gag-pp65 adecuada para la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la SEQ ID NO: 4.

Secuencia de Aminoácidos Gag-CMV pp65 de MMLV (SEQ ID NO: 4) MGQT TPLSLTLGHV^VERIAHNQSVDVKKl^WVTFCSAEWPTF VG PRDG TFNRDLITQVKIKVFSPGPHGHPDQVPYIVTWEAIJ^PPPWVKPFVHPKPPPPLPP SAPSLPLEPPRSTPPRSSLYPALTPSLGAKPKPQVLSDSGGPLIDLLTEDPPPYRDPRP PPSDRDGNGGEATPAGEAPDPSPMASRLRGRREPPVADSTTSQAFPLRAGGNGQLQ YWPFSSSDLYNW NNNPSFSEDPGKLTALIESVLITHQPTWDDCQQLLGTLLTGEE KQRVLLEARKAVRGDDGRPTQLPNEVDAAFPLERPDWDYTTQAGR HLVHYRQL LLAGLQNAGRSPTNLAKVKGITQGPNESPSAFLERLKEAYRRYTPYDPEDPGQETN VSMSFIWQSAPDIGRKLERLEDLKNKTLGDLVREAEKIFNKRETPEEREERIRRETE EKEERRRTEDEQKEKERDRRRHREMSKLLATVVSGQKQDRQGGERRRSQLDRDQ C1AYCKEKGHWAKDCPKKPRGPRGPRPQTSLLTLDDCESRGRRCPEMISVLGPISGHV LKAVFSRGDTPVLPHETRLLQTGIHVRVSQPSLILVSQYTPDSTPCHRGDNQLQVQHTYF TGSEVENVSVNVHNPTGRSICPSQEPMSIYVYALPLKMLNIPSINVHHYPSAAERKHRHL PVADAVIHASGKQMWQARLTVSGLAWTRQQNQWKEPDVYYTSAFVFPTKDVALRHV VCAHELVCSMENTRATKMQVIGDQYVKVYLESFCEDVPSGKLFMHVTLGSDVEEDLT MTRNPQPFMRPHERNGFTVLCPKNMIIKPGKISHIMLDVAFTSHEHFGLLCPKSIPGLSIS GNLLMNGQQIFLEVQAIRETVELRQYDPVAALFFFDIDLLLQRGPQYSEHPTFTSQYRIQ GKLEYRHTWDRHDEGAAQGDDDVWTSGSDSDEELVTTERKTPRVTGGGAMAGASTSA GRKRKSASSATACTAGVMTRGRLKAESTVAPEEDTDEDSDNEIHNPAVFTWPPWQAGI IiARNLVPMVATVQGQNLKYQEFFWDANDIYRIF AELEGVWQP AAQPKRRRHRQDALP GPCIASTPKKHRG* (SEQ ID NO:4) (MMLV secuencia de aminoácidos Gag en negrillas) Secuencia de Nucleótidos Gag-CMV pp65 de MMLV (SEQ ID NO: 5) ATGGGCCAGACTGTTACCACTCCCTTAA6TTTGACCTTAGGTCACTGGAAASAT GTCGAGCGGATCGCTCACAACCAGTCGGTAGATGTCAAGAAGAGACGTTGGGT TACCTTCTGCTCTGCAGAATGGCCAACCTTTAACGTCGGATGGCCGCGAGACG GCACCTTTAACCGAGACCTCATCACCCAGGTTAAGATCAAGGTCTTTTCACCTG GCCCGCATGGACACCCAGACCAGGTCCCCTACATCGTGACCTGGGAAGCCTTG GCTTTTGACCCCCCTCCCTGGGTCAAGCCCTTTGTACACCCTAAGCCTCCGCCT CCTCTTCCTCCATCCGCCCCGTCTCTCCCCCTTGAACCTCCTCGTTCGACCCCG CCTCGATCCTCCCTTTATCCAGCCCTCACTCCTTCTCTAGGCGCCAAACCTAAA CCTCAAGTTCTTTCTGACAGTGGGGGGCCGCTCATCGACCTACTTACAGAAGA CCCCCCGCCTTATAGGGACCCAAGACCACCCCCTTCCGACAGGGACGGAAATG GTGGAGAAGCGACCCCTGCGGGAGAGGCACCGGACCCCTCCCCAATGGCATCT CGCCTACGTGGGAGACGGGAGCCCCCTGTGGCCGACTCCACTACCTCGCAGGC ATTCCCCCTCCGCGCAGGAGGAAACGGACAGCTTCAATACTGGCCGTTCTCCT CTTCTGACCTTTACAACTGGAAAAATAATAACCCTTCTTTTTCTGAAGATCCAG GTAAACTGACAGCTCTGATCGAGTCTGTTCTCATCACCCATCAGCCCACCTGGG ACGACTGTCAGCAGCTGTTGGGGACTCTGCTGACCGGAGAAGAAAAACAACGG GTGCTCTTAGAGGCTAGAAAGGCGGTGCGGGGCGATGATGGGCGCCCCACTCA ACTGCCCAATGAAGTCGATGCCGCTTTTCCCCTCGAGCGCCCAGACTGGGATT ACACCACCCAGGCAGGTAGGAACCACCTAGTCCACTATCGCCAGTTGCTCCTA GCGGGTCTCCAAAACGCGGGCAGAAGCCCCACCAATTTGGCCAAGGTAAAAGG AATAACACAAGGGCCCAATGAGTCTCCCTCGGCCTTCCTAGAGAGACTTAAGG AAGCCTATCGCAGGTACACTCCTTATGACCCTGAGGACCCAGGGCAAGAAACT AATGTGTCTATGTCTTTCATTTGGCAGTCTGCCCCAGACATTGGGAGAAAGTTA GAGAGGTTAGAAGATTTAAAAAACAAGACGCTTGGAGATTTGGTTAGAGAGGC AGAAAAGATCTTTAA AAACGAGAAACCCCGGAAGAAAGAGAGGAACGTATCA GGAGAGAAACAGAGGAAAAAGAAGAACGCCG AGGACAGAGGATGAGCAGAA AGAGAAAGAAAGAGATCGTAGGAGACATAGAGAGA GAGCAAGCTATTGGCCA CTGTCGTTAGTGGACAGAAACAGGATAGACAGGGAGGAGAACGAAGGAGGTC CCAACTCGATCGCGACCAGTGTGCCTACTGCAAAGAAAAGGGGCACTGGGCTA AAGATTGTCCCAAGAAACCACGAGGACCTCGGGGACCAAGACCCCAGACCTCC CTCCTGACCCTAGATGACTGTGAGTCGCGCGGTCGCCGTTGTCCCGAAATGATATC CGTACTGGGTCCCATTTCGGGGCACGTGCTGAAAGCCGTGTTTAGTCGCGGCGACAC GCCGGTGCTGCCGCACGAGACGCGACTCCTGCAGACGGGTATCCACGTGCGCGTGA GCCAGCCCTCGCTGATCCTGGTGTCGCAGTACACGCCCGACTCGACGCCATGCCACC GCGGCGACAATCAGCTGCAGGTGCAGCACACGTACTTTACGGGCAGCGAGGTGGAG AACGTGTCGGTCAACGTGCACAACCCCACGGGCCGGAGCATCTGCCCCAGCCAAGA GCCCATGTCGATCTATGTGTACGCGCTGCCGCTCAAGATGCTGAACATCCCCAGCAT CAACGTGCACCACTACCCGTCGGCGGCCGAGCGCAAACACCGACACCTGCCCGTAG CTGACGCTGTGATTCACGCGTCGGGCAAGCAGATGTGGCAGGCGCGTCTCACGGTCT CGGGACTGGCCTGGACGCGTCAGCAGAACCAGTGGAAAGAGCCCGACGTCTACTAC ACGTCAGCGTTCGTGTTTCCCACCAAGGACGTGGCACTGCGGCACGTGGTGTGCGCG CACGAGCTGGTTTGCTCCATGGAGAACACGCGCGCAACCAAGATGCAGGTGATAGG TGACCAGTACGTCAAGGTGTACCTGGAGTCCTTCTGCGAGGACGTGCCCTCCGGCAA GCTCTTTATGCACGTCACGCTGGGCTCTGACGTGGAAGAGGACCTGACGATGACCCG CAACCCGCAACCCTTCATGCGCCCCCACGAGCGCAACGGCTTTACGGTGTTGTGTCC C1AAAAATATGATAATCAAACCGGGCAAGATCTCGCACATCATGCTGGATGTGGCTTT TACCTCACACGAGCATTTTGGGCTGCTGTGTCCCAAGAGCATCCCGGGCCTGAGCAT CTCAGGTAACCTATTGATGAACGGGCAGCAGATCTTCCTGGAGGTGCAAGCGATAC GCGAGACCGTGGAACTGCGTCAGTACGATCCCGTGGCTGCGCTCTTCTTTTTCGATA TCGACTTGCTGCTGCAGCGCGGGCCTCAGTACAGCGAACACCCCACCTTCACCAGCC AGTATCGCATCCAGGGCAAGCTTGAGTACCGACACACCTGGGACCGGCACGACGAG GGTGCCGCCCAGGGCGACGACGACGTCTGGACCAGCGGATCGGACTCCGACGAGGA ACTCGTAACCACCGAGCGCAAGACGCCCCGCGTTACCGGCGGCGGCGCCATGGCGG GCGCCTCCACTTCCGCGGGCCGCAAACGCAAATCAGCATCCTCGGCGACGGCGTGC ACGGCGGGCGTTATGACACGCGGCCGCCTTAAGGCCGAGTCCACCGTCGCGCCCGA AGAGGACACCGACGAGGATTCCGACAACGAAATCCACAATCCGGCCGTGTTCACCT GGCCGCCCTGGCAGGCCGGCATCCTGGCCCGCAACCTGGTGCCCATGGTGGCTACG GTTCAGGGTCAGAATCTGAAGTACCAGGAGTTCTTCTGGGACGCCAACGACATCTAC CGCATCTTCGCCGAATTGGAAGGCGTATGGCAGCCCGCTGCGCAACCCAAACGTCG CCGCCACCGGCAAGACGCCTTGCCCGGGCCATGCATCGCCTCGACGCCCAAAAAGC ACCGAGGTTAG (SEQ ID NO:5) (MMLV secuencia de nucleótidos Gag en negrillas) Secuencia de Nucleótidos Gag-CMV pp65 de MMLV Optimizada por Codón (SEQ ID NO: 6) ATGGGACAGACAGTCACTACACCCCTGAGCCTGACACTGGGACATTGGAAAGA CGTGGAGAGGATTGCACATAACCAGAGCGTGGACGTGAAGAAACGGAGATGG GTCACCTTTTGCTCCGCCGAGTGGCCAACATTCAATGTGGGATGGCCCCGAGA TGGCACCTTCAACCGGGACCTGATCACTCAGGTGAAGATCAAGGTCTTCTCTCC AGGACCCCACGGCCATCCAGATCAGGTGCCCTACATCGTCACCTGGGAGGCTC TGGCATTTGACCCCCCTCCATGGGTGAAGCCTTTCGTCCACCCAAAACCACCTC CACCACTGCCTCCATCTGCCCCTAGTCTGCCACTGGAACCCCCTCGGTCAACCC CACCCAGAAGCTCCCTGTATCCCGCACTGACACCTAGCCTGGGGGCCAAGCCT AAACCACAGGTGCTGTCTGATAGTGGCGGGCCTCTGATCGATCTGCTGACCGA GGACCCTCCACCATACCGCGACCCACGACCTCCACCAAGCGACCGGGACGGAA ACGGAGGAGAGGCTACACCCGCAGGCGAAGCCCCCGATCCTAGTCCAATGGCA TCAAGGCTGCGCGGGAGGCGCGAACCTCCAGTGGCCGACTCAACCACAAGCCA GGCATTTCCACTGAGGGCCGGGGGAAATGGACAGCTCCAGTATTGGCCCTTCT CTAGTTCAGATCTGTACAACTGGAAGAACAATAACCCTAGCTTCAGCGAGGAC CCAGGCAAACTGACCGCCCTGATCGAATCCGTGCTGATTACCCACCAGCCCAC ATGGGACGATTGTCAGCAGCTCCTGGGCACCCTGCTGACCGGAGAGGAAAAGC AGAGAGTGCTGCTGGAGGCTAGGAAAGCAGTCCGCGGGGACGATGGAAGGCC AACACAGCTCCCCAATGAGGTGGATGCCGCTTTCCCTCTGGAACGGCCAGATT GGGACTATACTACCCAGGCTGGACGCAACCACCTGGTGCATTACCGGCAGCTC CTGCTGGCTGGACTGCAGAATGCAGGGCGCAGCCCCACTAACCTGGCCAAGGT GAAAGGAATCACCCAGGGCCCCAATGAGTCCCCTTCTGCATTCCTGGAGCGGC TGAAGGAAGCCTACCGACGGTATACTCCCTACGATCCTGAGGACCCAGGCCAG GAAACCAACGTGAGTATGAGCTTCATCTGGCAGTCCGCTCCTGACATTGGCCG AAAACTGGAGCGGCTGGAAGATCTGAAGAACAAGACCCTGGGCGACCTGGTGC GGGAGGCAGAAAAGATCTTCAACAAAAGGGAGACTCCAGAGGAACGGGAGGA AAGAATTAGAAGGGAAACAGAGGAAAAGGAGGAACGCCGACGGACTGAGGAT GAACAGAAGGAGAAAGAAAGAGACCGGCGGCGGCACCGGGAGATGTCTAAGC TGCTGGCCACCGTGGTCAGTGGCCAGAAACAGGATCGACAGGGAGGAGAGCG ACGGAGAAGCCAGCTCGATCGGGACCAGTGCGCCTATTGTAAGGAAAAAGGGC ATTGGGCTAAGGACTGCCCCAAGAAACCCAGAGGCCCACGCGGGCCCCGACCT CAGACTTCCCTGCTGACCCTGGACGATTGCGAGAGCCGGGGCCGGCGGTGCCCA GAAATGATCTCTGTGCTGGGGCCCATTAGTGGACATGTGCTGAAGGCCGTCTTCTCC AGGGGAGACACCCCCGTGCTGCCTCACGAGACTCGACTGCTGCAGACCGGCATCCA TGTGCGGGTCTCCCAGCCCTCTCTGATTCTGGTGTCACAGTATACACCAGATAGCAC TCCCTGCCACAGAGGAGACAATCAGCTCCAGGTGCAGCATACCTACTTTACAGGCTC CGAGGTCGAAAACGTGTCTGTCAATGTGCACAACCCTACCGGCAGGAGCATCTGTC CTAGCCAGGAGCCAATGAGCATCTACGTGTACGCCCTGCCTCTGAAGATGCTGAATA TCCCATCAATTAACGTCCACCATTACCCTAGCGCAGCCGAACGGAAGCACAGACAT CTGCCAGTGGCCGACGCTGTCATCCATGCCAGCGGCAAACAGATGTGGCAGGCAAG ACTGACCGTGTCCGGGCTGGCCTGGACAAGGCAGCAGAATCAGTGGAAGGAGCCCG ACGTGTACTATACCAGCGCCTTCGTGTTCCCTACCAAAGACGTGGCCCTGAGACATG TGGTGTGCGCACATGAGCTGGTGTGCAGCATGGAAAACACTAGGGCCACCAAGATG CAGGTCATCGGCGATCAGTATGTCAAAGTGTACCTGGAGAGTTTTTGCGAAGACGTG CCATCAGGGAAGCTGTTCATGCATGTGACCCTGGGCAGCGATGTCGAGGAAGACCT GACCATGACAAGAAATCCACAGCCCTTTATGAGACCCCACGAGAGGAATGGGTTCA CTGTGCTGTGCCCCAAGAACATGATCATTAAGCCTGGAAAAATCAGTCATATTATGC TGGATGTGGCCTTTACATCACACGAGCATTTCGGACTGCTGTGCCCCAAATCCATCC CTGGACTGAGCATTTCCGGCAATCTGCTGATGAACGGCCAGCAGATCTTCCTGGAAG TGCAGGCCATCCGGGAGACCGTCGAACTGCGACAGTATGACCCAGTGGCTGCACTG TTCTTTTTCGACATCGACCTGCTGCTGCAGCGAGGACCACAGTACAGCGAGCACCCT ACTTTTACCTCCCAGTATCGGATTCAGGGGAAGCTGGAGTACAGGCACACCTGGGAT CGCCATGACGAAGGAGCCGCTCAGGGGGACGATGACGTGTGGACATCTGGCAGTGA TTCAGACGAGGAACTGGTGACAACTGAGCGAAAAACCCCCCGGGTGACAGGAGGA GGGGCAATGGCAGGGGCCAGCACCAGCGCAGGGCGGAAGCGAAAAAGCGCCAGCA GCGCCACAGCATGTACCGCCGGCGTGATGACTAGAGGAAGGCTGAAGGCCGAGTCT ACAGTCGCTCCCGAGGAAGATACTGACGAGGATAGTGACAATGAAATCCACAACCC CGCCGTGTTCACCTGGCCACCTTGGCAGGCAGGGATTCTGGCTCGCAACCTGGTCCC CATGGTGGCAACCGTCCAGGGACAGAATCTGAAGTATCAGGAGTTTTTCTGGGATGC TAACGACATCTACCGGATTTTTGCAGAGCTGGAAGGCGTGTGGCAGCCAGCAGCCC AGCCCAAACGACGGAGACATCGACAGGACGCTCTGCCAGGACCTTGTATCGCCAGC ACACCAAAGAAGCACAGGGGCTAA (SEQ ID NO: 6) (MMLV secuencia de nucleótidos Gag en negrillas) Secuencia de Nucleótidos Gag-CMV pp65 de MMLV Optimizada por Codón (SEQ ID NO: 22) ATGGGACAGACCGTGACAACACCCCTGAGCCTGACCCTGGGACATTGGAAAGA C GT GGAGAGGAT C GCAC A AAC CAGAGC GT GGAC GTGAAGAAACGGAGAT GG GTCACATTCTGCAGTGCTGAGTGGCCAACTTTTAATGTGGGATGGCCCCGAGA CGGCACTTTCAACAGGGATCTGATCACCCAGGTGAAGATCAAGGTCTTTAGCC CAGGAC CT CAC GGACAT C CAGAC CAGGTGC CT TATAT C GT CAC C T GGGAGGCA CTGGCCTTCGATCCCCCTCCATGGGTGAAGCCATTTGTCCACCCAAAACCACCT CCIACCACTGCCTCCAAGTGCCCCTTC^CTGCCACTGG^CCACCCCGGAGCAC ACCACCCCGCAGCTCCCTGTATCCTGCTCTGACTCCATCTCTGGGCGCAAAGCC AAAACCACAGGTGCTGAGCGACTCCGGAGGACCACTGATTGACCTGCTGACAG AGGACCCCCCACCATACCGAGATCCTCGGCCTCCACCAAGCGACCGCGATGGA AATGGAGGAGAGGCTACTCCTGCCGGCGAAGCCCCTGACCCATCTCCAATGGC TAGTAGGCTGCGCGGCAGGCGCGAGCCTCCAGTGGCAGATAGCACCACATCCC AGGCCTTCCCTCTGAGGGCTGGGGGAAATGGGCAGCTCCAGTATTGGCCATTT TCTAGTTCAGACCTGTACAACTGGAAGAACAATAACCCCTCTTTCAGTGAGGAC CCCGGCAAACTGACCGCCCTGATCGAATCCGTGCTGATTACCCATCAGCCCAC ATGGGACGATTGTCAGCAGCTCCTGGGCACCCTGCTGACCGGAGAGGAAAAGC AGCGCGTGCTGCTGGAGGCTCGCAAAGCAGTCCGAGGGGACGATGGACGGCC CACACAGCTCCCTAATGAGGTGGACGCCGCTTTTCCACTGGAAAGACCCGACT GGGATTATACTACCCAGGCAGGGAGAAACCACCTGGTCCATTACAGGCAGCTC CTGCTGGCAGGCCTGCAGAATGCCGGGAGATCCCCCACCAACCTGGCCAAGGT GAAAGGCATCACACAGGGGCCTAATGAGTCACCAAGCGCCTTTCTGGAGAGGC TGAAGGAAGCTTACCGACGGTATACCCCATACGACCCTGAGGACCCCGGACAG GAAACAAACGTCTCCATGTCTTTCATCTGGCAGTCTGCCCCAGACATTGGGCG GAAGCTGGAGAGACTGGAAGACCTGAAGAACAAGACCCTGGGCGACCTGGTG CGGGAGGCTGAAAAGATCTTCAACAAACGGGAGACCCCCGAGGAAAGAGAGG AAAGGATTAGAAGGGAAACTGAGGAAAAGGAGGAACGCCGACGGACCGAGGA CGAACAGAAGGAGAAAGAACGAGATCGGCGGCGGCACCGGGAGATGTCAAAG CTGCTGGCCACCGTGGTCAGCGGACAGAAACAGGACAGACAGGGAGGAGAGC GACGGAGAAGCCAGCTCGACAGGGATCAGTGCGCATACTGTAAGGAAAAAGGC CATTGGGCCAAGGATTGCCCCAAAAAGCCAAGAGGACCAAGAGGACCAAGACC ACAGACATCACTGCTGACCCTGGACGACTGCGAGAGCCGGGGCCGGCGGTGCCC AGAAATGATCTCTGTGCTGGGGCCCATTAGTGGACATGTGCTGAAGGCCGTCTTCTC CAGGGGAGACACCCCCGTGCTGCCTCACGAGACTCGACTGCTGCAGACCGGCATCC ATGTGCGGGTCTCCCAGCCCTCTCTGATTCTGGTGTCACAGTATACACCAGATAGCA CTCCCTGCCACAGAGGAGACAATCAGCTCCAGGTGCAGCATACCTACTTTACAGGCT CCGAGGTCGAAAACGTGTCTGTCAATGTGCACAACCCTACCGGCAGGAGCATCTGT CCTAGCCAGGAGCCAATGAGCATCTACGTGTACGCCCTGCCTCTGAAGATGCTGAAT ATCCCATCAATTAACGTCCACCATTACCCTAGCGCAGCCGAACGGAAGCACAGACA TCTGCCAGTGGCCGACGCTGTCATCCATGCCAGCGGCAAACAGATGTGGCAGGCAA GACTGACCGTGTCCGGGCTGGCCTGGACAAGGCAGCAGAATCAGTGGAAGGAGCCC GACGTGTACTATACCAGCGCCTTCGTGTTCCCTACCAAAGACGTGGCCCTGAGACAT GTGGTGTGCGCACATGAGCTGGTGTGCAGCATGGAAAACACTAGGGCCACCAAGAT GCAGGTCATCGGCGATCAGTATGTCAAAGTGTACCTGGAGAGTTTTTGCGAAGACGT GCCATCAGGGAAGCTGTTCATGCATGTGACCCTGGGCAGCGATGTCGAGGAAGACC TGACCATGACAAGAAATCCACAGCCCTTTATGAGACCCCACGAGAGGAATGGGTTC ACTGTGCTGTGCCCCAAGAACATGATCATTAAGCCTGGAAAAATCAGTCATATTATG CTGGATGTGGCCTTTACATCACACGAGCATTTCGGACTGCTGTGCCCCAAATCCATC CCTGGACTGAGCATTTCCGGCAATCTGCTGATGAACGGCCAGCAGATCTTCCTGGAA GTGCAGGCCATCCGGGAGACCGTCGAACTGCGACAGTATGACCCAGTGGCTGCACT GTTCTTTTTCGACATCGACCTGCTGCTGCAGCGAGGACCACAGTACAGCGAGCACCC TACTTTTACCTCCCAGTATCGGATTCAGGGGAAGCTGGAGTACAGGCACACCTGGGA TCGCCATGACGAAGGAGCCGCTCAGGGGGACGATGACGTGTGGACATCTGGCAGTG ATTCAGACGAGGAACTGGTGACAACTGAGCGAAAAACCCCCCGGGTGACAGGAGG AGGGGCAATGGCAGGGGCCAGC^CCAGCGCAGGGCGGAAGCGAAAAAGCGCCAGC AGCGCCACAGCATGTACCGCCGGCGTGATGACTAGAGGAAGGCTGAAGGCCGAGTC TACAGTCGCTCCCGAGGAAGATACTGACGAGGATAGTGACAATGAAATCCACAACC CCGCCGTGTTCACCTGGCCACCTTGGCAGGCAGGGATTCTGGCTCGCAACCTGGTCC CCATGGTGGCAACCGTCCAGGGACAGAATCTGAAGTATCAGGAGTTTTTCTGGGATG CTAACGACATCTACCGGATTTTTGCAGAGCTGGAAGGCGTGTGGCAGCCAGCAGCC CAGCCCAAACGACGGAGACATCGACAGGACGCTCTGCCAGGACCTTGTATCGCCAG CACACCAAAGAAGCACAGGGGCTAA (SEQ ID NO:22) (MMLV secuencia de nucleótidos Gag en negrillas) En algunas modalidades, la presente invención proporciona ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido Gag o una porción característica de un polipéptido Gag. En ciertas modalidades, los ácidos nucleicos pueden ser ADN o AR y pueden ser monocatenarios o de cadena doble. En algunas modalidades, los ácidos nucleicos de la invención pueden incluir uno o más nucleótidos no naturales; en otras modalidades, los ácidos nucleicos de la invención incluyen solamente nucleótidos naturales .

B. Proteínas de Envoltura En algunas modalidades, la presente invención utiliza VLPs comprendidas de uno o más polipéptidos de envoltura provenientes de HCMV (e.g., gB y/o gH) . Como se utiliza en la presente, el término "polipéptido de envoltura" se refiere a una secuencia de polipéptidos cuya secuencia de aminoácidos incluye al menos una secuencia característica de una glicoproteína de envoltura. Una amplia variedad de secuencias de glicoproteínas de envoltura provenientes de varios virus incluyen, pero no se limitan a, HCMV, se conocen en la técnica y las personas de experiencia ordinaria en la técnica refiriéndose a tales secuencias, pueden identificar fácilmente secuencias que son características de glicoproteínas de envoltura en general y/o de glicoproteínas de envoltura particulares. En algunas modalidades, un polipéptido de envoltura comprende una porción o dominio citoplásmico, transmembrana y/o extracelular .

En algunas modalidades, un polipéptido de envoltura proveniente de HCMV incluye un dominio de transmembrana y citoplásmico que no se encuentra en la naturaleza en la proteína de HCMV. Por ejemplo, en algunas modalidades, un polipéptido de envoltura proveniente de HCMV incluye un dominio de transmembrana y citoplásmico proveniente de otra proteína de HCMV (e.g., gB o gH) . En algunas modalidades, un polipéptido de envoltura proveniente de HCMV incluye un dominio de transmembrana y un dominio citoplásmico encontrados en la naturaleza en el virus de estomatitis vesicular (VSV) . Como se conoce en la técnica, los polipéptidos tienen algunas veces dominios transmembrana, citoplásmicos y/o extracelulares. En general, un "dominio de transmembrana", como se utiliza en la presente, se refiere a un dominio que tiene el atributo de estar presente en la membrana (e.g., que se extiende en una porción o en toda la membrana celular) . Como se apreciará, no se requiere que cada aminoácido en el dominio de transmembrana se encuentre presente en la membrana. Por ejemplo, en algunas modalidades, el dominio de transmembrana se caracteriza en que un tramo o porción designada de una proteína se encuentra ubicada sustancialmente en la membrana. Como se conoce bien el la técnica, las secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos pueden analizarse utilizando una variedad de algoritmos para predecir la localización sub-celular de la proteína (e.g., localización transmembrana). Tales programas ejemplares incluyen psort (PS0RT.org), Prosite (prosite.expasy.org), entre otros. En general, un "dominio citoplásmico", como se utiliza en la presente, se refiere a un dominio que tiene el atributo de estar presente en el citoplasma. Como se apreciará, no se requiere que cada aminoácido en el dominio citoplásmico se encuentre presente en el citoplasma. Por ejemplo, en algunas modalidades, el dominio citoplásmico se caracteriza en que un tramo o porción designada de una proteína se encuentra ubicada sustancialmente en el citoplasma. Como se conoce bien el la técnica, las secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos pueden analizarse utilizando una variedad de algoritmos para predecir la localización sub-celular de la proteína (e.g., localización citoplásmica) . Tales programas ejemplares incluyen psort (PSORT.org), Prosite (prosite.expasy.org), entre otros .

El dominio de transmembrana de VSV-G funciona para dirigir la glicoproteína viral hacia la membrana celular (Compton T et al., 1989 Proc . Nati. Acad. Sci. EUA 86: 4112-4116) . Se ha utilizado el intercambio de los dominios transmembrana y citoplásmicos de VSV-G por los dominios transmembrana y citoplásmicos de otra proteína para dirigir una proteína a la membrana celular cuando la proteína nativa no lo hace naturalmente o requiere proteínas accesorias coexpresadas para lograrlo (Garrone P et al., 2011 Sci Transí Med 94) .

Entre otras cosas, la presente invención abarca el reconocimiento de que las VLPs que contienen un componente estructural de un virus (e.g., MLV) y uno o más antígenos de superficie heterólogos (e.g., proteínas de envoltura) son especialmente efectivas para el suministro del antígeno y la inducción de la respuesta inmune contra el antígeno heterólogo .

C. Antígenos Heterólogos Las proteínas de envoltura de HCMV, tales como las glicoproteínas gB y gH, son importantes objetivos para la producción de anticuerpos neutralizantes contra HCMV, debido a que los anticuerpos neutralizantes generalmente tienen la capacidad de prevenir la infección. Se han desarrollado terapias para la infección por HCMV, tales como la vacuna de subunidad gB, y se han probado en estudios animales y clínicos experimentales. Sin embargo, los resultados de tales estudios han demostrado que en humanos, la respuesta al anticuerpo no tuvo una larga vida y no fue suficientemente efectiva para el tratamiento de HCMV en todos los casos. Las razones sugeridas para la limitada eficacia de las vacunas de subunidad en base exclusivamente a gB de HCMV a su vez son las variaciones específicas de la cepa en las respuestas inmunes, la inadecuada inducción de una respuesta inmune celular, y las restricciones estructurales en el antígeno utilizado, cuyos epítopes se consideran dependientes de la conformación. Los presentes inventores reconocieron que el desarrollo de una vacuna de HCMV que comprende uno o más antígenos de polipéptido de envoltura presentados en su conformación nativa en la superficie de una VLP conduce a la inducción de anticuerpos neutralizantes (e.g., a través de una respuesta humoral inmune) y una vacuna de HCMV que comprende uno o más antígenos de proteína estructural (e.g., proteína pp65 de tegumento) conduce a la inducción de células T auxiliares (linfocitos TH) y células T citotóxicas (e.g., a través de una respuesta inmune mediada por la célula) . Los anticuerpos neutralizantes se forman generalmente contra proteínas virales de envoltura y específicamente contra glicoproteínas gB y gH de HCMV. Las células TH se estimulan por medio de las proteínas estructurales de tegumento de un virus, tal como, por ejemplo, pp65 de HCMV (ppUL83) . Adicionalmente, la pp65 juega un importante papel en la inducción de la respuesta de CTL contra HCMV.

Se apreciará que las VLPs proporcionadas pueden comprender cualquier antígeno heterólogo, incluyendo los antígenos heterólogos provenientes de HCMV. Por ejemplo, en algunas modalidades, una VLP de acuerdo con la presente invención comprende uno o más polipéptidos de envoltura de HCMV. En algunas modalidades, una VLP de acuerdo con la presente invención comprende uno o más polipéptidos estructurales de HCMV. En algunas modalidades, una VLP de acuerdo con la presente invención comprende uno o más polipéptidos de envoltura de HCMV y uno o más polipéptidos estructurales de HCMV. Se proporciona más adelante una lista de antígenos de HCMV ejemplar, pero no limitante.

Complejo de gB-Glicoproteína (gC) I El complejo de glicoproteína más completamente caracterizado de HCMV es el complejo gB (gB; UL55) . Se ha demostrado que el suero de individuos seropositivos a CMV contiene anticuerpos para gB y hasta el 70% de la respuesta al anticuerpo neutralizante en el suero convaleciente es específico para gB ( arshall GS et al., 1994 J Med Virol 43: 77-83) .

Una secuencia de aminoácidos y una de ácido nucleico de polipéptido gB de HCMV ejemplar se muestra más adelante como la SEQ ID NO: 7 y la SEQ ID NO: 8, respectivamente. En algunas modalidades un polipéptido gB adecuado es sustancialmente homólogo a un polipéptido gB de HCMV conocido. Por ejemplo, un polipéptido gB puede ser un polipéptido gB de HCMV modificado que contiene una o más sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos en comparación con un polipéptido gB de tipo silvestre o de origen natural (e.g., SEQ ID NO: 7). Por tanto, en algunas modalidades, un polipéptido gB adecuado para la presente invención es sustancialmente homólogo a un polipéptido gB de HCMV (SEQ ID NO: 7) . En algunas modalidades, un polipéptido de HCMV adecuado para la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más, homologa a la SEQ ID NO: 7. En algunas modalidades, un polipéptido gB adecuado para la presente invención es sustancialmente idéntico a un polipéptido gB de HCMV (SEQ ID NO: 7) . En algunas modalidades, un polipéptido gB adecuado para la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la SEQ ID NO: 7.

Secuencia de Aminoácidos de gB de HCMV (SEQ ID NO: 7) ESRI CLWCVNLCIVCLGAAVSSSSTRGTSATHSHHSSHTTSAAHSRSGSVSQRVTSS QTVSHGVNETIYNTTLKYGDWGVNTTKYPYRVCSMAQGTDLIRFERNIVCTSMKPINE DLDEGIMVWKRNIVAHTFKWVYQKVLTFRRSYAYIHTTYLLGSNTEYVAPPM EIH HINSHSQCYSSYSRVIAGTVFVAYHRDSYENKTMQLMPDDYSNTHSTRYVTVKDQWHS RGSTWL YRETCNLNCMVTITTARSKYPYHFFATSTGDWDISPFYNGTNRNASYFGENA DKFFIFPNYTIVSDFGRPNSALETHRLVAFLERADSVISWDIQDEKNVTCQLTFWEASERT IRSEAEDSYHFSSA MTATFLSKKQEVNMSDSALDCVRDEAINKLQQIFNTSYNQTYEK YGNVSVFETTGGLWFWQGIKQKSLVELERLANRSSLNLTHNRTKRSTDGNNATHLSN MESVHNLVYAQLQFTYDTLRGYINRALAQIAEAWCVDQRRTLEVFKELSKINPSAILSAI YNKPIAARFMGDVLGLASCVTINQTSVKVLRDMNVKESPGRCYSRPWIFNFANSSYVQ YGQLGEDNEILLGNHRTEECQLPSLKIFIAGNSAYEYVDYLFKRMIDLSSISTVDSMIALD IDPLENTDFRVLELYSQKELRSINVFDLEEIMREFNSYKQRVKYVED WDPLPPYLKGL DDLMSGLGAAGKAVGVAIGAVGGAVASWEGVATFLKNPFGAFTIILVAIAWIIIYLIY TRQRRLCMQPLQNLFPYLVSADGTTVTSGNTKDTSLQAPPSYEESVYNSGRKGPGPPSS DASTAAPPYTNEQAYQMLLALVRLDAEQRAQQNGTDSLDGQTGTQDKGQKPNLLDRL RHRKNGYRHLKDSDEEENV* (SEQ ID NO: 7) (TM y CD subrayados) Secuencia de Nucleótidos de gB de HCMV (SEQ 8 ) ATGGAATCCAGGATCTGGTGCCTGGTAGTCTGCGTTAACTTGTGTATCGTCTGTCTG GGTGCTGCGGTTTCCTCATCTTCTACTCGTGGAACTTCTGCTACTCACAGTCACCATT CCTCTCATACGACGTCTGCTGCTCATTCTCGATCCGGTTCAGTCTCTCAACGCGTAAC TTCTTCCCAAACGGTCAGCCATGGTGTTAACGAGACCATCTACAACACTACCCTCAA GTACGGAGATGTGGTGGGGGTCAACACCACCAAGTACCCCTATCGCGTGTGTTCTAT GGCACAGGGTACGGATCTTATTCGCTTTGAACGTAATATCGTCTGCACCTCGATGAA GCCCATCAATGAAGACCTGGACGAGGGCATCATGGTGGTCTACAAACGCAACATCG TCGCGCACACCTTTAAGGTACGAGTCTACCAGAAGGTTTTGACGTTTCGTCGTAGCT ACGCTTACATCCACACCACTTATCTGCTGGGCAGCAACACGGAATACGTGGCGCCTC CTATGTGGGAGATTCATCATATCAACAGTCACAGTCAGTGCTACAGTTCCTACAGCC GCGTTATAGCAGGCACGGTTTTCGTGGCTTATCATAGGGACAGCTATGAAAACAAA ACCATGCAATTAATGCCCGACGATTATTCCAACACCCACAGTACCCGTTACGTGACG GTCAAGGATCAATGGCACAGCCGCGGCAGCACCTGGCTCTATCGTGAGACCTGTAA TCTGAATTGTATGGTGACCATCACTACTGCGCGCTCCAAGTATCCCTATCATTTTTTC GCAACTTCCACGGGTGATGTGGTTGACATTTCTCCTTTCTACAACGGAACTAATCGC AATGCCAGCTATTTTGGAGAAAACGCCGACAAGTTTTTCATTTTTCCGAACTACACT ATCGTCTCCGACTTTGGAAGACCGAATTCTGCGTTAGAGACCCACAGGTTGGTGGCT TTTCTTGAACGTGCGGACTCAGTGATCTCCTGGGATATACAGGACGAGAAGAATGTT ACTTGTCAACTCACTTTCTGGGAAGCCTCGGAACGCACCATTCGTTCCGAAGCCGAG GACTCGTATCACTTTTCTTCTGCCAAAATGACCGCCACTTTCTTATCTAAGAAGCAAG AGGTGAACATGTCCGACTCTGCGCTGGACTGTGTACGTGATGAGGCCATAAATAAGT TACLAGC-AGATTTTCAATACTTCATAC^ATCAAACATATGAAAAATATGGAAACGTGT CCGTCTTTGAAACCACTGGTGGTTTGGTGGTGTTCTGGCAAGGTATCAAGCAAAAAT CTCTGGTGGAACTCGAACGTTTGGCCAACCGCTCCAGTCTGAATCTTACTCATAATA GAACCAAAAGAAGTACAGATGGCAACAATGCAACTCATTTATCCAACATGGAGTCG GTGCACAATCTGGTCTACGCCCAGCTGCAGTTCACCTATGACACGTTGCGCGGTTAC ATCAACCGGGCGCTGGCGCAAATCGCAGAAGCCTGGTGTGTGGATCAACGGCGCAC CCTAGAGGTCTTCAAGGAACTTAGCAAGATCAACCCGTCAGCTATTCTCTCGGCCAT CTACAACAAACCGATTGCCGCGCGTTTCATGGGTGATGTCCTGGGTCTGGCCAGCTG CGTGACCATTAACCAAACCAGCGTCAAGGTGCTGCGTGATATGAATGTGAAGGAAT CGCCAGGACGCTGCTACTCACGACCAGTGGTCATCTTTAATTTCGCCAACAGCTCGT ACGTGCAGTACGGTCAACTGGGCGAGGATAACGAAATCCTGTTGGGCAACCACCGC ACTGAGGAATGTCAGCTTCCCAGCCTCAAGATCTTCATCGCCGGCAACTCGGCCTAC GAGTACGTGGACTACCTCTTCAAACGCATGATTGACCTCAGCAGCATCTCCACCGTC GACAGCATGATCGCCCTAGACATCGACCCGCTGGAAAACACCGACTTCAGGGTACT GGAACTTTACTCGCAGAAAGAATTGCGTTCCATCAACGTTTTTGATCTCGAGGAGAT CATGCGCGAGTTCAATTCGTATAAGCAGCGGGTAAAGTACGTGGAGGACAAGGTAG TCGACCCGCTGCCGCCCTACCTCAAGGGTCTGGACGACCTCATGAGCGGCCTGGGCG CCGCGGGAAAGGCCGTTGGCGTAGCCATTGGGGCCGTGGGTGGCGCGGTGGCCTCC GTGGTCGAAGGCGTTGCCACCTTCCTCAAAAACCCCTTCGGAGCCTTCACCATCATC CTCGTGGCCATAGCCGTCGTCATTATCATTTATTTGATCTATACTCGACAGCGGCGTC TCTGCATGCAGCCGCTGCAGAACCTCTTTCCCTATCTGGTGTCCGCCGACGGGACCA CCGTGACGTCGGGCAACACCAAAGACACGTCGTTACAGGCTCCGCCTTCCTACGAG GAAAGTGTTTATAATTCTGGTCGCAAAGGACCGGGACCACCGTCGTCTGATGCATCC ACGGCGGCTCCGCCTTACACCAACGAGCAGGCTTACCAGATGCTTCTGGCCCTGGTC CGTCTGGACGCAGAGCAGCGAGCGCAGCAGAACGGTACAGATTCTTTGGACGGACA GACTGGCACGCAGGACAAGGGACAGAAGCCCAACCTGCTAGACCGACTGCGACACC GCAAAAACGGCTACCGACACTTGAAAGACTCCGACGAAGAAGAGAACGTCTGA (SEQ ID N0:8) (TM y CD subrayados) Secuencia de Nucleótidos de gB de HCMV Optimizada por Codón (SEQ ID NO: 9) ATGGAGTCAAGGATTTGGTGCCTGGTCGTGTGCGTCAATCTGTGCATCGTCTGTCTG GGGGCTGCCGTGTCATC^GTTCTACT^GAGGC^CCAGCGCCACCCACTCACACCA TAGCTCCCATACCACATCCGCCGCTCACTCCCGGTCTGGCAGCGTGAGCCAGAGAGT CACATCTAGTCAGACCGTGAGCCACGGGGTCAACGAGACCATCTACAATACTACCC TGAAGTATGGCGACGTGGTCGGGGTGAACACAACTAAATACCCATATAGGGTCTGC AGTATGGCCCAGGGCACTGATCTGATTAGATTCGAAAGGAACATCGTGTGCACCAG CATGAAGCCCATTAATGAGGACCTGGATGAAGGGATCATGGTGGTCTACAAACGCA ATATTGTGGCCCATACCTTCAAGGTGCGAGTCTATCAGAAAGTGCTGACATTTCGGA GATCTTACGCATATATCCACACCACATACCTGCTGGGGAGTAACACCGAGTATGTGG CTCCCCCTATGTGGGAAATTCACCATATCAATAGCCATTCCCAGTGCTACTCAAGCT ACAGCAGAGTGATCGCTGGAACAGTGTTCGTCGCATACCACAGAGACTCTTATGAG AACAAGACTATGCAGCTCATGCCCGACGATTACAGCAATACACATTCCACTAGATAT GTGACAGTCAAAGATCAGTGGCACTCAAGGGGCAGCACCTGGCTGTACCGCGAGAC ATGCAACCTGAATTGTATGGTGACTATCACTACCGCTAGATCCAAGTACCCCTATCA CTTCTTTGCAACTTCCACCGGGGACGTGGTCGATATTTCTCCTTTCTACAACGGCACA AACCGGAATGCATCTTATTTTGGGGAGAACGCCGACAAGTTCTTTATTTTCCCAAAT TACACCATCGTGTCTGATTTTGGCAGACCCAACAGTGCCCTGGAGACACATCGACTG GTGGCATTCCTGGAACGGGCCGACTCCGTCATTTCTTGGGACATCCAGGATGAGAAG AATGTGACCTGCCAGCTCACCTTCTGGGAGGCCAGCGAACGCACCATCCGATCCGA GGCTGAAGATTCTTACCACTTCTCCTCTGCCAAAATGACAGCTACTTTTCTGAGCAA GAAACAGGAGGTGAACATGTCTGACAGTGCTCTGGATTGCGTGCGGGACGAAGCAA TTAATAAGCTGCAGCAGATCTTCAACACATCATACAACCAGACTTACGAGAAGTAC GGAAACGTGAGCGTCTTCGAAACAACTGGCGGGCTGGTGGTCTTTTGGCAGGGCAT CAAGCAGAAATCCCTGGTGGAGCTGGAAAGGCTGGCCAATCGCAGTTCACTGAACC TGACTCATAATCGGACCAAGAGATCTACAGACGGAAACAATGCCACACATCTGTCT AACATGGAGAGTGTGCACAATCTGGTCTACGCTCAGCTCCAGTTTACCTACGACACA CTGAGAGGCTATATTAACAGGGCACTGGCCCAGATCGCTGAAGCATGGTGCGTGGA TCAGAGGCGCACCCTGGAGGTCTTGAAGGAACTGTCCAAAATCAACCCTTCAGCAA TTCTGAGCGCCATCTACAATAAGCCAATTGCAGCCAGGTTTATGGGAGACGTGCTGG GCCTGGCCAGTTGCGTCACTATCAACCAGACCTCAGTGAAGGTCCTGCGCGATATGA ATGTGAAAGAGAGTCCCGGCAGATGCTATTCACGGCCTGTGGTCATCTTCAACTTTG CTAATAGCTCCTACGTGCAGTATGGACAGCTCGGCGAGGACAACGAAATTCTGCTG GGGAATCACAGGACCGAGGAATGTCAGCTCCCTAGCCTGAAGATTTTCATCGCTGG AAACTCCGCATACGAGTATGTGGATTACCTGTTCAAGCGGATGATTGACCTGTCTAG TATCTCCACTGTGGATTCTATGATTGCCCTGGACATCGATCCACTGGAAAATACCGA CTTCAGGGTGCTGGAGCTGTATAGCCAGAAGGAACTGCGCTCCATCAACGTGTTCGA TCTGGAGGAAATTATGAGAGAGTTTAATAGCTACAAGCAGAGGGTGAAATATGTCG AAGATAAGGTGGTCGACCCCCTGCCACCCTACCTGAAAGGCCTGGACGATCTGATG AGCGGGCTGGGAGCTGCAGGGAAGGCAGTGGGAGTCGCTATCGGCGCAGTGGGAG GAGCCGTGGCCAGCGTGGTCGAGGGAGTGGCAACATTCCTGAAAAACCCCTTCGGG GCCTTCACCATCATTCTGGTGGCAATCGCCGTGGTCATCATTATCTACCTGATCTACA CAAGGCAGCGGCGGCTGTGCATGCAGCCTCTGCAGAACCTGTTTCCATACCTGGTGA GCGCCGACGGGACCACAGTCACCTCAGGAAATACTAAGGATACCTCTCTGCAGGCC CCCCCAAGTTACGAGGAATCAGTGTATAACAGCGGCAGAAAAGGACCAGGACCACC TTCAAGCGACGCCAGCACTGCCGCTCCACCCTACACCAATGAGCAGGCCTATCAGAT GCTGCTGGCTCTGGTGCGCCTGGATGCCGAACAGCGAGCTCAGCAGAACGGGACCG ACTCCCTGGATGGACAGACCGGAACACAGGACAAGGGACAGAAACCTAATCTGCTG GATCGGCTGCGGCACAGAAAAAACGGGTATAGGCACCTGAAGGACTCCGACGAAG AAGAAAATGTCTAA (SEQ ID NO:9) (TM y CD subrayados) En algunas modalidades, un polipéptido gB para uso de acuerdo con la presente invención carece de un dominio de transmembrana y/o dominio citoplásmico y/o contiene un dominio de transmembrana y/o dominio citoplásmico modificado. Un polipéptido gB puede incluir opcionalmente uno o más polipéptidos adicionales (e.g., un polipéptido de dominio de transmembrana y/o dominio citoplásmico heterólogo) . En algunas modalidades, el polipéptido gB se expresa como una proteína de fusión con un polipéptido heterólogo. El polipéptido gB puede enlazarse a un polipéptido heterólogo para crear una proteína de fusión sin alterar la función y/o la antigenicidad de gB. Por ejemplo, la secuencia de codificación para un polipéptido heterólogo puede empalmarse en la secuencia de codificación del polipéptido gB, e.g., en el extremo 3' de la secuencia de codificación del polipéptido gB. En algunas modalidades, la secuencia de codificación para un polipéptido heterólogo puede empalmarse en marco en la secuencia de codificación del polipéptido gB. En algunas modalidades, la secuencia de codificación del polipéptido gB y el polipéptido heterólogo pueden expresarse por medio de un solo promotor. En algunas modalidades, el polipéptido heterólogo se inserta en (e.g., se fusiona a) la terminal C de un polipéptido gB.

En algunas modalidades, un polipéptido heterólogo - li ¬ es o comprende un dominio de transmembrana y/o un dominio citoplásmico encontrados en el virus de estomatitis vesicular (VSV) . En algunas modalidades, un gB que carece de un dominio de transmembrana y/o un dominio citoplásmico se fusiona a un dominio de transmembrana y/o a un dominio citoplásmico proveniente de VSV. Un polipéptido de fusión de gB-VSV para uso de acuerdo con la invención se muestra más adelante como la SEQ ID NO: 10. En algunas modalidades, una proteína de fusión de polipéptido gB-VSV adecuada incluye todo o una porción del polipéptido gB que es sustancialmente homólogo a un polipéptido gB conocido y todo o una porción del polipéptido de VSV que es sustancialmente homólogo a un polipéptido VSV conocido. Por ejemplo, la proteína de fusión de polipéptido gB-VSV puede contener una o más sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácido en comparación con un polipéptido gB y/o un polipéptido de VSV tipo silvestre o de origen natural. Por tanto, en algunas modalidades, una proteína de fusión de polipéptido gB-VSV adecuada para la presente invención es sustancialmente homologa a la SEQ ID NO: 10. En algunas modalidades, una proteína de fusión de polipéptido gB-VSV adecuada para la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más, homologa a la SEQ ID NO: 10. En algunas modalidades, una proteína de fusión de polipéptido gB-VSV adecuada para la presente invención es sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO: 10. En algunas modalidades, una proteína de fusión de polipéptido gB-VSV adecuada para la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la SEQ ID NO: 10. Como se utiliza en la presente, gB-G" se refiere a una proteína de fusión de gB de HCMV-TM/CTD de VSV.

Secuencia de aminoácidos gB-G de HCMV (SEQ ID NO: 10) .

MESRIWCLWCVNLCIVCLGAA VSSSSTRGTSATHSHHSSHTTSAAHSRSGSVSQRVTSS QTVSHGVNETIYNTTLKYGDWGVNTTKYPYRVCSMAQGTDLIRFERNIVCTSMKPINE DLDEGIMVVYKRNIVAHTFKVRVYQ VLTFRRSYAYIHTTYLLGSNTEYVAPPMWEIH HINSHSQCYSSYSRVIAGTVFVAYHRDSYENKTMQLMPDDYSNTHSTRYVTVKDQWHS RGSTWLYRETCNLNCMVTITTARSKYPYHFFATSTGDWDISPFYNGTNRNASYFGENA DKFFIFPNYTIVSDFGRPNSALETHRLVAFLERADSVISWDIQDEKNVTCQLTFWEASERT IRSEAEDSYHFSSAKMTATFLSKKQEVTSMSDSALDCVRDEAINKLQQIFNTSYNQTYEK YGNVSVFETTGGLWFWQGIKQKSLVELERLANRSSLNLTHNRTKRSTDGNNATHLSN MESVHNLVYAQLQFTYDTLRGYINRALAQIAEAWCVDQRRTLEVFKELSKINPSAILSAI YNKPIAARFMGDVTJGLASCVTINQTSVKVLRDMNVKESPGRCYSRPVVIFNFANSSYVQ YGQLGEDNEILLGNHRTEECQLPSLKIFIAGNSAYEYVDYLFKRMIDLSSISTVDSMIALD IDPLENTDFRVLELYSQKELRSINVFDLEEIMREFNSYKQRVKYVEDK DPLPPYLKGL DDLMSGLGAAGKAVGVAIGAVGGAVASWEGVATFLKNPFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHL CIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK* (SEQ ID NO: 10) (TM y CTD subrayados) Secuencia de Nucleótidos gB-G de HCMV (SEQ ID NO: 11) ATGGAATCCAGGATCTGGTGCCTGGTAGTCTGCGTTAACTTGTGTATCGTCTGTCTG GGTGCTGCGGTTTCCTCATCTTCTACTCGTGGAACTTCTGCTACTCACAGTCACCATT CCTCTCATACGACGTCTGCTGCTCATTCTCGATCCGGTTCAGTCTCTCAACGCGTAAC TTCTTCCCAAACGGTCAGCCATGGTGTTAACGAGACCATCTACAACACTACCCTCAA GTACGGAGATGTGGTGGGGGTCAACACCACCAAGTACCCCTATCGCGTGTGTTCTAT GGCACAGGGTACGGATCTTATTCGCTTTGAACGTAATATCGTCTGCACCTCGATGAA GCCCATCAATGAAGACCTGGACGAGGGCATCATGGTGGTCTACAAACGCAACATCG TCGCGCACACCTTTAAGGTACGAGTCTACCAGAAGGTTTTGACGTTTCGTCGTAGCT ACGCTTACATCCACACCACTTATCTGCTGGGCAGCAACACGGAATACGTGGCGCCTC CTATGTGGGAGATTCATCATATC-ACAGTC^CAGTCIAGTGCTACAGTTCCTACAGCC GCGTTATAGCAGGCACGGTTTTCGTGGCTTATCATAGGGACAGCTATGAAAACAAA ACCATGCAATTAATGCCCGACGATTATTCCAACACCCACAGTACCCGTTACGTGACG GTCAAGGATCAATGGCACAGCCGCGGCAGCACCTGGCTCTATCGTGAGACCTGTAA TCTGAATTGTATGGTGACCATCACTACTGCGCGCTCCAAGTATCCCTATCATTTTTTC GCAACTTCCACGGGTGATGTGGTTGACATTTCTCCTTTCTACAACGGAACTAATCGC AATGCCAGCTATTTTGGAGAAAACGCCGACAAGTTTTTCATTTTTCCGAACTACACT ATCGTCTCCGACTTTGGAAGACCGAATTCTGCGTTAGAGACCCACAGGTTGGTGGCT TTTCTTGAACGTGCGGACTCAGTGATCTCCTGGGATATACAGGACGAGAAGAATGTT ACTTGTCAACTCACTTTCTGGGAAGCCTCGGAACGCACCATTCGTTCCGAAGCCGAG GACTCGTATCACTTTTCTTCTGCCAAAATGACCGCCACTTTCTTATCTAAGAAGCAAG AGGTGAACATGTCCGACTCTGCGCTGGACTGTGTACGTGATGAGGCCATAAATAAGT TACAGCAGATTTTCAATACTTCATACAATCAAACATATGAAAAATATGGAAACGTGT CCGTCTTTGAAACCACTGGTGGTTTGGTGGTGTTCTGGCAAGGTATCAAGCAAAAAT CTCTGGTGGAACTCGAACGTTTGGCCAACCGCTCCAGTCTGAATCTTACTCATAATA GAACCAAAAGAAGTACAGATGGCAACAATGCAACTCATTTATCCAACATGGAGTCG GTGCACAATCTGGTCTACGCCCAGCTGCAGTTCACCTATGACACGTTGCGCGGTTAC ATCAACCGGGCGCTGGCGCAAATCGCAGAAGCCTGGTGTGTGGATCAACGGCGCAC CCTAGAGGTCTTCAAGGAACTTAGCAAGATCAACCCGTCAGCTATTCTCTCGGCCAT CTACAACAAACCGATTGCCGCGCGTTTCATGGGTGATGTCCTGGGTCTGGCCAGCTG CGTGACCATTAACCAAACCAGCGTCAAGGTGCTGCGTGATATGAATGTGAAGGAAT CGCCAGGACGCTGCTACTCACGACCAGTGGTCATCTTTAATTTCGCCAACAGCTCGT ACGTGCAGTACGGTCAACTGGGCGAGGATAACGAAATCCTGTTGGGCAACCACCGC ACTGAGGAATGTCAGCTTCCCAGCCTCAAGATCTTCATCGCCGGCAACTCGGCCTAC GAGTACGTGGACTACCTCTTCAAACGCATGATTGACCTCAGCAGCATCTCCACCGTC GACAGCATGATCGCCCTAGACATCGACCCGCTGGAAAACACCGACTTCAGGGTACT GGAACTTTACTCGCAGAAAGAATTGCGTTCCATCAACGTTTTTGATCTCGAGGAGAT CATGCGCGAGTTCAATTCGTATAAGCAGCGGGTAAAGTACGTGGAGGACAAGGTAG TCGACCCGCTGCCGCCCTACCTCAAGGGTCTGGACGACCTCATGAGCGGCCTGGGCG CCGCGGGAAAGGCCGTTGGCGTAGCCATTGGGGCCGTGGGTGGCGCGGTGGCCTCC GTGGTCGAAGGCGTTGCCACCTTCCTCAAAAACCCCTTTTTCTTTATCATAGGGTTAA TCATTGGACTATTCTTGGTTCTCCGAGTTGGTATCCATCTTTGCATTAAATTAAAGCA CACCAAGAAAAGACAGATTTATACAGACATAGAGATGAACCGACTTGGAAAGTAA (SEQ ID N0:11) TM y CTD subrayados) Secuencia de nucleótidos gB-G de HCMV Optimizada por Codón (SEQ ID NO: 12) ATGGAGTCAAGGATTTGGTGTCTGGTCGTCTGCGTCAACCTGTGCATTGTCTGCCTG GGAGCCGCCGTCTCATCATCATCTACCCGAGGCACATCCGCCACTCACTCTCACCAT AGCTCCCATACCACATCCGCCGCTCACTCAAGAAGCGGGTCCGTGTCTCAGAGGGTC ACATCTAGTCAGACCGTGAGCCATGGAGTCAACGAGACAATCTACAATACTACCCT GAAGTATGGAGACGTGGTCGGCGTGAACACAACTAAATACCCCTATAGGGTCTGCT CTATGGCCCAGGGGACAGATCTGATCCGATTTGAACGGAACATCGTGTGCACTAGC ATGAAGCCTATCAATGAGGACCTGGATGAAGGAATTATGGTGGTCTACAAACGAAA TATCGTGGCCCATACTTTTAAGGTGAGAGTCTATCAGAAAGTGCTGACCTTCCGGAG AAGCTACGCTTATATTCACACCACATACCTGCTGGGGTCCAACACCGAGTATGTGGC ACCCCCTATGTGGGAAATCCACCATATTAATAGTCATTCACAGTGCTACTCAAGCTA CAGCAGAGTGATCGCTGGAACCGTGTTCGTCGCATACCACAGAGACAGTTATGAGA ACAAGACAATGCAGCTCATGCCCGACGATTACAGTAATACCCATTCAACAAGATAT GTGACCGTCAAAGATCAGTGGCACTCTCGCGGCAGTACCTGGCTGTACCGAGAGAC ATGCAACCTGAATTGTATGGTGACAATTACTACCGCCAGAAGCAAGTACCCTTATCA CTTCTTTGCTACCTCAACAGGGGACGTGGTCGACATCAGCCCCTTCTACAACGGAAC AAACCGGAATGCCTCCTATTTCGGCGAGAACGCTGACAAATTCTTTATCTTCCCCAA CTACACTATCGTGAGCGATTTCGGCAGACCTAACAGTGCCCTGGAGACCCATCGGCT GGTGGCATTTCTGGAAAGAGCCGACAGCGTGATCTCCTGGGACATTCAGGATGAGA AGAATGTGACCTGCCAGCTCACCTTCTGGGAGGCCAGCGAAAGAACCATCAGGTCC GAGGCAGAAGATTCTTACCACTTTTCCTCTGCAAAAATGACTGCCACCTTCCTGTCC AAGAAACAGGAGGTGAACATGAGCGACTCCGCACTGGATTGCGTGCGGGACGAAGC CATCAATAAGCTGCAGCAGATCTTCAACACATCTTACAACCAGACTTACGAGAAGTA CGGCAACGTGAGTGTCTTTGAAACAACTGGCGGGCTGGTGGTCTTCTGGCAGGGGAT CAAGCAGAAATCTCTGGTGGAGCTGGAACGGCTGGCCAATAGAAGTTCACTGAACC TGACTCATAATCGCACCAAGCGATCCACAGACGGAAACAATGCAACTCATCTGAGC AACATGGAGTCCGTGCACAATCTGGTCTACGCCCAGCTCCAGTTCACTTACGACACC CTGCGAGGCTATATCAACCGGGCCCTGGCTCAGATTGCAGAAGCCTGGTGCGTGGAT CAGAGGCGCACCCTGGAGGTCTTTAAGGAACTGAGCAAAATTAACCCATCTGCTATC CTGAGTGCAATCTACAATAAGCCCATCGCAGCCAGGTTCATGGGGGACGTGCTGGG ACTGGCCTCCTGCGTCACTATCAACCAGACCTCTGTGAAGGTCCTGCGCGATATGAA TGTGAAAGAGAGTCCTGGCAGGTGTTATTCACGCCCAGTGGTCATCTTCAACTTCGC TAATAGCTCCTACGTGCAGTATGGCCAGCTCGGGGAGGACAACGAAATCCTGCTGG GAAATCACAGGACCGAGGAATGTCAGCTCCCAAGTCTGAAGATCTTTATTGCCGGC AACTCAGCTTACGAGTATGTGGATTACCTGTTCAAACGCATGATCGACCTGTCTAGT ATTTCAACAGTGGATAGCATGATCGCCCTGGACATTGATCCCCTGGAAAATACTGAC TTCAGGGTGCTGGAGCTGTATAGCCAGAAGGAACTGCGCTCCATTAACGTGTTTGAT CTGGAGGAAATCATGAGGGAGTTCAATTCCTACAAGCAGCGCGTGAAATATGTCGA AGATAAGGTGGTCGACCCTCTGCCACCCTACCTGAAAGGCCTGGACGATCTGATGA GCGGGCTGGGAGCTGCAGGCAAGGCAGTGGGAGTCGCCATCGGAGCTGTGGGAGGC GCTGTCGCATCCGTGGTCGAGGGAGTGGCTACCTTTCTGAAGAACCCATTCTTTTTC ATCATCGGCCTGATCATTGGGCTGTTCCTGGTGCTGAGAGTCGGCATCCACCTGTGC ATTAAGCTGAAGCACACCAAGAAGAGGCAGATCTACACCGATATTGAAATGAACAG ACTGGGCAAGTGA (SEQ ID NO: 12) (TM y CTD subrayados) Complejo de gH-Glicoproteína (gC) III El complejo ge III contiene glicoproteínas gH (UL75) , gL (UL115) y gO (UL74) (Urban M et al., 1996 J Gen Virol 77:1537 - 47) . Como gB, gH es conservado entre herpesvirus patógenos humanos y juega un importante papel en numerosas etapas durante la replicación del HCMV. El HCMV codifica para dos complejos: gH/gL: gH/gL/gO y un complejo gH/gL/UL128/UL130/UL131 (Wang D y Shenk T 2005 Proc Natl Acad EUA 102: 18153-8) . El complejo que contiene g-0 es generalmente suficiente para la infección del fibroblasto con HCMV, mientras el complejo que contiene UL128/UL130/UL131 es necesario a fin de que el HCMV infecte las células endoteliales y epiteliales (Wang D y Shenk T 2005 J Virol 79 10330-8) . La infección natural con HCMV obtiene típicamente anticuerpos neutralizantes de alta titulación específicos para la entrada a la célula epitelial y se ha demostrado que los anticuerpos contra epítopes gH/gL/UL128/UL130/UL131 pueden comprender un componente significativo de esta actividad (Macagno A et al., 2010 J Virol 84: 1005-13). Estudios inmunológicos en gH han demostrado que en células de mamífero la proteína requiere polipéptidos adicionales (como gL) para el correcto procesamiento y transporte a la membrana celular (Urban M et al., 1996 J Gen Virol 77: 1537-1547). Si se expresa solo, el gH se encuentra exclusivamente en el citoplasma y/o en la membrana nuclear (Cranage MP et al., 1988 J Virol 62: 1416-1422).

Una secuencia de aminoácidos y una de ácido nucleico de polipéptido gH de HCMV ejemplar se muestra más adelante como la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 14, respectivamente. En algunas modalidades un polipéptido gH adecuado es sustancialmente homólogo a un polipéptido gH de HCMV conocido. Por ejemplo, un polipéptido gH puede ser un polipéptido gH de HCMV modificado que contiene una o más sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos en comparación con un polipéptido gH de tipo silvestre o de origen natural (e.g., SEQ ID NO: 13). Por tanto, en algunas modalidades, un polipéptido gH adecuado para la presente invención es sustancialmente homólogo a un polipéptido gH de HCMV (SEQ ID NO: 13) . En algunas modalidades, un polipéptido gH de HCMV adecuado para la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más, homologa a la SEQ ID NO: 13. En algunas modalidades, un polipéptido gH adecuado para la presente invención es sustancialmente idéntico a un polipéptido gH de HCMV (SEQ ID NO: 13) . En algunas modalidades, un polipéptido gH adecuado para la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la SEQ ID NO: 13.

Secuencia de Aminoácidos de gH de HCMV (SEQ ID NO: 13) MRPGLPSYLIVLAVCLLSHLLSSRYGAEAISEPLDKAFHLLLNTYGRPIRFLRENTTQCT YNSSLRNSTVVRENAISFNFFQSYNQYYVFHMPRCLFAGPLAEQFLNQVDLTETLERYQ QRLNTYALVSKDLASYRSFSQQLKAQDSLGEQPTTVPPPIDLSIPHVWMPPQTTPHGWTES HTTSGLHRPHFNQTCILFDGHDLLFSTVTPCLHQGFYLIDELRYVKITLTEDFFWTVSI DDDTPMLLIFGHLPRVLFKAPYQRDNFILRQTEKHELLVLVKKDQLNRHSYLKDPDFLD AALDFNYIL-DLSALLRNSFHRYAVDVLKSGRCQMLDRRTVEMAFAYALALFAAARQEE AGAQVSVPRALDRQAALLQIQEFMITCLSQTPPRTTLLLYPTAVDLAKRAL TPNQITDI TSLVRLVYILSKQNQQHLIPQ ALRQIADFALKLHKTHLASFLSAFARQELYLMGSLVH SMLVHTTERREIFIVETGLCSLAELSHFTQLLAHPHHEYLSDLYTPCSSSGRRDHSLERLT RLFPDATVPTTVPAALSILSTMQPSTLETFPDLFCLPLGESFSALTVSEHVSYWTNQYLI GISYPVSTTWGQSLIITQTDSQTKCELTR MHTTHSITAALNISLENCAFCQSALLEYD DTQGVINI YMHDSDDVLFALDPYNEVWSSPRTHYL LLKNGTVLEVTDVVVDATDS RLLMMSVYALSAIIGIYLLYRMLKTC* (SEQ ID NO: 13) (TM y CTD subrayados) Secuencia de Nucleótidos de gH de HCMV (SEQ ID NO: 14) ATGCGGCCAGGCCTCCCCTCCTACCTCATCGTCCTCGCCGTCTGTCTCCTCAGCCACC TACTTTCGTCACGATATGGCGCAGAAGCCATATCCGAACCGCTGGACAAAGCGTTTC ACCTACTGCTCAACACCTACGGGAGACCCATCCGCTTCCTGCGTGAAAACACCACCC AGTGTACCTACAATAGCAGCCTCCGTAACAGCACGGTCGTCAGGGAAAACGCCATC AGTTTCAACTTTTTCCAAAGCTATAATCAATACTATGTATTCCATATGCCTCGATGTC TTTTTGCGGGTCCTCTGGCGGAGCAGTTTCTGAACCAGGTAGATCTGACCGAAACCC TGGAAAGATACCAACAGAGACTTAACACTTACGCGCTGGTATCCAAAGACCTGGCC AGCTACCGATCTTTTTCGCAGCAGCTAAAGGCACAGGACAGCCTAGGTGAACAGCC CACCACTGTGCCACCACCCATTGACCTGTCAATACCTCACGTTTGGATGCCACCGCA AACCACTCCACACGGCTGGACAGAATCACATACCACCTCAGGACTACACCGACCAC ACTTTAACCAGACCTGTATCCTCTTTGATGGACACGATCTACTATTCAGCACCGTCAC ACCTTGTTTGCACCAAGGCTTTTACCTCATCGACGAACTACGTTACGTTAAAATAAC ACTGACCGAGGACTTCTTCGTAGTTACGGTGTCCATAGACGACGACACACCCATGCT GCTTATCTTCGGCCATCTTCCACGCGTACTCTTTAAAGCGCCCTATCAACGCGACAA CTTTATACTACGACAAACTGAAAAACACGAGCTCCTGGTGCTAGTTAAGAAAGATC AACTGAACCGTCACTCTTATCTCAAAGACCCGGACTTTCTTGACGCCGCACTTGACT TCAACTACCTGGACCTCAGCGCACTACTACGTAACAGCTTTCACCGTTACGCCGTGG ATGTACTCAAAAGCGGTCGATGTCAGATGCTGGACCGCCGCACGGTAGAAATGGCC TTCGCCTACGCATTAGCACTGTTCGCAGCAGCCCGACAAGAAGAGGCCGGCGCCCA AGTCTCCGTCCCACGGGCCCTAGACCGCCAGGCCGCACTCTTACAAATACAAGAATT TATGATCACCTGCCTCTCACAAACACCACCACGCACCACGTTGCTGCTGTATCCCAC GGCCGTGGACCTGGCCAAACGAGCCCTTTGGACACCGAATCAGATCACCGACATCA CCAGCCTCGTACGCCTGGTCTACATACTCTCTAAACAGAATCAGCAACATCTCATCC CCC^GTGGGCACTACGACAGATCGCCGACTTTGCCCTAAAACTACACAAAACGCAC CTGGCCTCTTTTCTTTCAGCCTTCGCGCGTCAAGAACTCTACCTCATGGGCAGCCTCG TCCACTCCATGCTAGTACATACGACGGAGAGACGCGAAATCTTCATCGTAGAAACG GGCCTCTGTTCATTAGCCGAGCTATCACACTTTACGCAGTTGCTAGCTCATCCGCAC CACGAATACCTCAGCGACCTGTACACACCCTGTTCCAGTAGCGGGCGACGCGATCA CTCGCTCGAACGCCTCACACGTCTCTTCCCCGATGCCACCGTCCCCACTACCGTTCCC GCCGCCCTCTCCATCCTATCTACCATGCAACCAAGCACGCTAGAAACCTTCCCCGAC CTGTTTTGTCTGCCGCTCGGCGAATCCTTCTCCGCGCTGACCGTCTCCGAACACGTCA GTTATGTCGTAACAAACCAGTACCTGATCAAAGGTATCTCCTACCCTGTCTCCACCA CCGTCGTAGGCCAGAGCCTCATCATCACCCAGACGGACAGTCAAACTAAATGCGAA CTGACGCGCAACATGCATACCACACACAGCATCACAGCGGCGCTCAACATTTCCCTA GAAAACTGCGCCTTTTGCCAAAGCGCCCTACTAGAATACGACGACACGCAAGGCGT CATCAACATCATGTACATGCACGACTCGGACGACGTCCTTTTCGCCCTGGATCCCTA CAACGAAGTGGTGGTCTCATCTCCGCGAACTCACTACCTCATGCTTTTGAAAAACGG TACGGTCCTAGAAGTAACTGACGTCGTCGTGGACGCTACCGACAGTCGTCTCCTCAT GATGTCCGTCTACGCGCTATCGGCCATCATCGGCATCTATCTGCTCTACCGCATGCTC AAGACATGCTGA (SEQ ID N0:14) (TM y CTD subrayados) Secuencia de Nucleótidos de gH de HCMV Optimizada por Codón (SEQ ID NO: 15) ATGAGACCTGGACTGCCTTCTTATCTGATTGTGCTGGCCGTCTGCCTGCTGTCACATC TGCTGAGTTCACGCTATGGGGCTGAGGCTATCTCCGAGCCACTGGACAAGGCTTTTC ACCTGCTGCTGAACACCTACGGGAGACCCATTAGGTTCCTGCGCGAGAATACCACA CAGTGCACATATAACAGCTCCCTGCGGAACAGCACTGTGGTCCGCGAAAACGCCAT CTCTTTTAATTTCTTTCAGAGTTACAACCAGTACTACGTGTTCCATATGCCACGCTGT CTGTTTGCAGGACCCCTGGCCGAGCAGTTCCTGAACCAGGTGGACCTGACCGAGAC ACTGGAAAGATACCAGCAGAGGCTGAATACCTATGCCCTGGTGAGTAAGGATCTGG CTTCATATCGGTCTTTCAGTCAGCAGCTCAAGGCCCAGGACTCACTGGGCGAGCAGC CTACTACCGTGCCCCCTCCAATCGATCTGAGCATTCCACACGTCTGGATGCCCCCTC AGACAACTCCCCACGGCTGGACCGAAAGCCATACCACATCCGGGCTGCACAGACCC CATTTCAACCAGACATGCATCCTGTTTGATGGGCACGACCTGCTGTTCAGCACTGTG ACCCCTTGTCTGCATCAGGGATTCTACCTGATCGATGAGCTGAGATATGTGAAAATT ACACTGACTGAAGACTTCTTTGTGGTCACCGTGAGCATCGACGATGACACACCAATG CTGCTGATTTTTGGACACCTGCCCCGGGTGCTGTTCAAGGCCCCCTACCAGCGAGAC AACTTTATTCTGCGGCAGACCGAGAAACACGAACTGCTGGTGCTGGTCAAGAAAGA TCAGCTCAACAGGCATAGCTATCTGAAGGACCCCGACTTTCTGGATGCCGCTCTGGA CTTCAACTACCTGGACCTGTCAGCACTGCTGCGGAATAGCTTCCACAGATATGCCGT GGATGTCCTGAAATCCGGAAGATGCCAGATGCTGGACCGGAGAACCGTGGAGATG GCATTTGCCTACGCTCTGGCACTGTTCGCAGCCGCTAGGCAGGAGGAAGCAGGCGC TCAGGTGTCCGTCCCTCGCGCACTGGATCGACAGGCAGCCCTGCTGCAGATCCAGGA GTTCATGATTACCTGTCTGTCTCAGACACCACCCAGAACTACCCTGCTGCTGTACCC CACTGCCGTGGACCTGGCTAAGAGGGCACTGTGGACCCCTAACCAGATCACTGATA TTACCTCTCTGGTGCGCCTGGTCTATATCCTGAGTAAACAGAATCAGCAGCACCTGA TCCCACAGTGGGCCCTGCGACAGATTGCCGACTTCGCTCTGAAGCTGCACAAAACCC ATCTGGCTTCCTTCCTGTCTGCATTTGCCCGCCAGGAGCTGTACCTGATGGGCTCTCT GGTGCACAGTATGCTGGTCCATACAACTGAGAGGCGCGAAATCTTTATTGTGGAGAC AGGGCTGTGCAGCCTGGCTGAACTGTCCCACTTCACTCAGCTCCTGGCCCATCCTCA CCATGAGTACCTGTCCGATCTGTATACCCCATGTTCTAGTTCAGGCCGACGGGACCA CTCTCTGGAACGACTGACTCGGCTGTTTCCTGATGCAACCGTGCCTACCACCGTGCC CGCCGCCCTGAGTATCCTGTC^CAATGCAGCCAAGCACACTGGAGACTTTCCCCGA CCTGTTTTGCCTGCCTCTGGGGGAGTCATTCAGCGCCCTGACCGTGTCAGAACATGT CAGCTACGTGGTCACAAACCAGTATCTGATCAAGGGAATTTCCTACCCCGTGTCTAC TACCGTGGTCGGCCAGAGTCTGATCATTACCCAGACAGATTCACAGACTAAATGTGA GCTGACCCGGAATATGCACACAACTCATAGCATCACCGCCGCTCTGAACATTTCCCT GGAGAATTGCGCTTTTTGTCAGAGTGCACTGCTGGAATACGATGACACACAGGGCGT GATCAACATTATGTATATGCACGATAGCGATGACGTGCTGTTCGCTCTGGACCCCTA CAACGAGGTGGTCGTGAGCTCCCCTCGCACTCATTATCTGATGCTGCTGAAGAATGG AACAGTGCTGGAAGTCACTGATGTCGTGGTCGATGCCACAGACTCCCGGCTGCTGAT GATGTCTGTGTACGCACTGTCCGCCATCATCGGCATCTATCTGCTGTATCGAATGCTG AAAACCTGTTGA (SEQ ID N0:15) (TM y CTD subrayado) En algunas modalidades, un polipéptido gH para uso de acuerdo con la presente invención carece de un dominio de transmembrana y/o dominio citoplásmico y/o contiene un dominio de transmembrana y/o dominio citoplásmico modificado. Un polipéptido gH puede incluir opcionalmente uno o más polipéptidos adicionales (e.g., un polipéptido de dominio de transmembrana y/o dominio citoplásmico heterólogo) . En algunas modalidades, el polipéptido gH se expresa como una proteína de fusión con un polipéptido heterólogo. El polipéptido gH puede enlazarse a un polipéptido heterólogo para crear una proteína de fusión sin alterar la función y/o la antigenicidad de gH. Por ejemplo, la secuencia de codificación para un polipéptido heterólogo puede empalmarse en la secuencia de codificación del polipéptido gH, e.g., en el extremo 3' de la secuencia de codificación del polipéptido gH. En algunas modalidades, la secuencia de codificación para un polipéptido heterólogo puede empalmarse en marco en la secuencia de codificación del polipéptido gH. En algunas modalidades, la secuencia de codificación del polipéptido gH y el polipéptido heterólogo pueden expresarse por medio de un solo promotor. En algunas modalidades, el polipéptido heterólogo se inserta en (e.g., se fusiona a) la terminal C de un polipéptido gH.

En algunas modalidades, un polipéptido heterólogo es o comprende un dominio de transmembrana y/o un dominio citoplásmico encontrados en el virus de estomatitis vesicular (VSV) . En algunas modalidades, un gH que carece de un dominio de transmembrana y/o un dominio citoplásmico se fusiona a un dominio de transmembrana y/o a un dominio citoplásmico proveniente de VSV. Un polipéptido de fusión de gH-VSV ejemplar para uso de acuerdo con la presente invención se muestra más adelante como la SEQ ID NO: 16. En algunas modalidades, una proteína de fusión de polipéptido gH-VSV adecuada incluye todo o una porción del polipéptido gH que es sustancialmente homólogo a un polipéptido gH de HCMV conocido y todo o una porción del polipéptido de VSV que es sustancialmente homólogo a un polipéptido VSV conocido. Por ejemplo, la protelna de fusión de polipéptido gH-VSV puede contener una o más sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácido en comparación con un polipéptido gH y/o un polipéptido de VSV tipo silvestre o de origen natural . Por tanto, en algunas modalidades, una protelna de fusión de polipéptido gH-VSV adecuada para la presente invención es sustancialmente homologa a la SEQ ID NO: 16. En algunas modalidades, una proteína de fusión de polipéptido gH-VSV adecuada para la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más, homologa a la SEQ ID NO: 16. En algunas modalidades, una proteína de fusión de polipéptido gH-VSV adecuada para la presente invención es sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO: 16. En algunas modalidades, una proteína de fusión de polipéptido gH-VSV adecuada para la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la SEQ ID NO: 16. Como se utiliza en la presente, "gH-G" se refiere a una proteína de fusión de gH de HCMV-TM/CTD de VSV.

Secuencia de aminoácidos gH-G de HCMV (SEQ ID NO: 16) .

MRPGLPSYLIVLA VCLLSHLLSSRYGAEAISEPLDKAFHLLLNTYGRPIRFLRENTTQCT YNSSLRNSTWRENAISFNFFQSYNQYYVFHMPRCLFAGPLAEQFLNQVDLTETLERYQQR LNTYALVSKDLASYRSFSQQLKAQDSLGEQPTTVPPPIDLSIPHVWMPPQTTPHGWTESHT TSGLHRPHF QTCILFDGHDLLFSTVTPCLHQGFYLIDELRYVKITLTEDFFWTVSI DDDTPMLLIFGHLPRVLFKAPYQRDNFILRQTEKHELLVLVKKDQLNRHSYLKDPDFLD AALDFNYLDL5ALLR SFHRYAVDVLKSGRCQMLDRRTVEMAFAYALALFAAARQEE AGAQVSVPRALDRQAALLQIQEFMITCLSQTPPRTTLLLYPTAVDLAKRAL WTPNQITDI TSLVRLVYILSKQNQQHLIPQWALRQIADFALKLHKTHLASFLSAFARQELYLMGSLVH SMLVHTTERREIFIVETGLCSLAELSHFTQLLAHPHHEYLSDLYTPCSSSGRRDHSLERLT RLFPDATVPTIVPAALSILSTMQPSTLETFPDLFCLPLGESFSALTVSEHVSYVVTNQYLI KGISYPVSTTWGQSLIITQTDSQTKCELTR MHTTHSITAALNISLENCAFCQSALLEYD DTQGVINIMYMHDSDDVLFALDPY EVWSSPRTHYLMLLKNGTVLEVTDWVDATDS RFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEM RLGK* (SEQ ID NO:16) (TM y CTD subrayados) Secuencia de Nucleótidos gH-G de HCMV (SEQ ID NO: 17) ATGCGGCCAGGCCTCCCCTCCTACCTCATCGTCCTCGCCGTCTGTCTCCTCAGCCACC TACTTTCGTCACGATATGGCGCAGAAGCCATATCCGAACCGCTGGACAAAGCGTTTC ACCTACTGCTCAACACCTACGGGAGACCCATCCGCTTCCTGCGTGAAAACACCACCC AGTGTACCTACAATAGCAGCCTCCGTAACAGCACGGTCGTCAGGGAAAACGCCATC AGTTTC!AACTTTTTCCAAAGCTATAATCAATACTATGTATTCCATATGCCTCGATGTC TTTTTGCGGGTCCTCTGGCGGAGCAGTTTCTGAACCAGGTAGATCTGACCGAAACCC TGGAAAGATACCAACAGAGACTTAACACTTACGCGCTGGTATCCAAAGACCTGGCC AGCTACCGATCTTTTTCGCAGCAGCTAAAGGCACAGGACAGCCTAGGTGAACAGCC (^CC^CTGTGCCACC^CCCATTGACCTGTC^TACCT^CGTTTGGATGCCACCGCA AACCACTCC1ACACGGCTGGACAGAATCACATACCACCTCAGGACTACACCGACCAC ACTTTAACCAGACCTGTATCCTCTTTGATGGACACGATCTACTATTCAGCACCGTCAC ACCTTGTTTGCACCAAGGCTTTTACCTCATCGACGAACTACGTTACGTTAAAATAAC ACTGACCGAGGACTTCTTCGTAGTTACGGTGTCCATAGACGACGACACACCCATGCT GCTTATCTTCGGCCATCTTCCACGCGTACTCTTTAAAGCGCCCTATCAACGCGACAA CTTTATACTACGACAAACTGAAAAACACGAGCTCCTGGTGCTAGTTAAGAAAGATC AACTGAACCGTCACTCTTATCTCAAAGACCCGGACTTTCTTGACGCCGCACTTGACT TCAACTACCTGGACCTCAGCGCACTACTACGTAACAGCTTTCACCGTTACGCCGTGG ATGTACTCAAAAGCGGTCGATGTCAGATGCTGGACCGCCGCACGGTAGAAATGGCC TTCGCCTACGCATTAGCACTGTTCGCAGCAGCCCGACAAGAAGAGGCCGGCGCCCA AGTCTCCGTCCCACGGGCCCTAGACCGCCAGGCCGCACTCTTACAAATACAAGAATT TATGATCACCTGCCTCTCACAAACACCACCACGCACCACGTTGCTGCTGTATCCCAC GGCCGTGGACCTGGCCAAACGAGCCCTTTGGACACCGAATCAGATCACCGACATCA CCAGCCTCGTACGCCTGGTCTACATACTCTCTAAACAGAATCAGCAACATCTCATCC CCCAGTGGGCACTACGACAGATCGCCGACTTTGCCCTAAAACTACACAAAACGCAC CTGGCCTCTTTTCTTTCAGCCTTCGCGCGTCAAGAACTCTACCTCATGGGCAGCCTCG TCCACTCCATGCTAGTACATACGACGGAGAGACGCGAAATCTTCATCGTAGAAACG GGCCTCTGTTCATTAGCCGAGCTATCACACTTTACGCAGTTGCTAGCTCATCCGCAC CACGAATACCTCAGCGACCTGTACACACCCTGTTCCAGTAGCGGGCGACGCGATCA CTCGCTCGAACGCCTCACACGTCTCTTCCCCGATGCCACCGTCCCCACTACCGTTCCC GCCGCCCTCTCCATCCTATCTACCATGCAACCAAGCACGCTAGAAACCTTCCCCGAC CTGTTTTGTCTGCCGCTCGGCGAATCCTTCTCCGCGCTGACCGTCTCCGAACACGTCA GTTATGTCGTAACAAACCAGTACCTGATCAAAGGTATCTCCTACCCTGTCTCCACCA CCGTCGTAGGCCAGAGCCTCATCATCACCCAGACGGACAGTCAAACTAAATGCGAA CTGACGCGCAACATGCATACC!ACACACAGCATGACAGCGGCGCTCAACATTTCCCTA GAAAACTGCGCCTTTTGCCAAAGCGCCCTACTAGAATACGACGACACGCAAGGCGT CATCAACATCATGTACATGCACGACTCGGACGACGTCCTTTTCGCCCTGGATCCCTA CAACGAAGTGGTGGTCTCATCTCCGCGAACTCACTACCTCATGCTTTTGAAAAACGG TACGGTCCTAGAAGTAACTGACGTCGTCGTGGACGCTACCGACAGTCGTTTTTTCTTT ATCATAGGGTTAATCATTGGACTATTCTTGGTTCTCCGAGTTGGTATCCATCTTTGCA TTAAATTAAAGCACACCAAGAAAAGACAGATTTATACAGACATAGAGATGAACCGA CTTGGAAAGTAA (SEQ ID N0:17) (TM y CTD subrayados) Secuencia de nucleótidos gH-G de HCMV Optimizada por Codón (SEQ ID NO: 18) ATGCGACCCGGACTGCCAAGCTACCTGATTGTCCTGGCTGTCTGTCTGCTGTCACAC CTGCTGAGTTCAAGATATGGGGCCGAAGCCATCAGCGAGCCACTGGACAAGGCTTT CCACCTGCTGCTGAACACCTACGGCAGACCCATTAGGTTTCTGCGCGAGAATACCAC ACAGTGCACATATAACAGCTCCCTGAGGAATAGCACTGTGGTCCGCGAAAACGCCA TCTCTTTCAATTTCTTTCAGAGTTACAACCAGTACTACGTGTTCCATATGCCACGCTG TCTGTTCGCAGGACCCCTGGCCGAGCAGTTTCTGAACCAGGTGGACCTGACCGAGAC ACTGGAAAGATACCAGCAGAGGCTGAATACCTATGCCCTGGTGAGTAAGGATCTGG CTTCATATCGGTCTTTCAGTCAGCAGCTCAAGGCCCAGGACTCTCTGGGAGAGCAGC CTACTACCGTGCCCCCTCCAATCGATCTGAGTATTCCACACGTCTGGATGCCCCCTC AGACAACTCCCCACGGATGGACCGAAAGCCATACCACATCCGGCCTGCACAGACCC CACTTCAACCAGACATGCATCCTGTTCGATGGCCACGACCTGCTGTTTTCCACTGTG ACCCCTTGTCTGCATCAGGGGTTCTACCTGATCGATGAGCTGAGATATGTGAAGATT ACACTGACTGAAGACTTCTTTGTGGTCACCGTGTCTATCGACGATGACACACCAATG CTGCTGATTTTCGGACACCTGCCCCGGGTGCTGTTCAAGGCCCCCTACCAGCGAGAC AACTTCATCCTGCGGCAGACCGAGAAACACGAACTGCTGGTGCTGGTCAAGAAAGA TCAGCTCAACCGGCATTCCTATCTGAAGGACCCCGACTTCCTGGATGCCGCTCTGGA CTTTAACTACCTGGACCTGTCAGCACTGCTGCGGAATAGCTTTCACAGATATGCCGT GGATGTCCTGAAATCTGGGCGCTGCCAGATGCTGGACCGGAGAACCGTGGAGATGG CATTCGCCTACGCTCTGGCACTGTTTGCAGCCGCTCGGCAGGAGGAAGCAGGAGCTC AGGTGAGTGTCCCTCGCGCACTGGATCGACAGGCAGCCCTGCTGCAGATCCAGGAG TTCATGATTACCTGTCTGAGCCAGACACCACCCAGAACTACCCTGCTGCTGTACCCC ACTGCCGTGGACCTGGCTAAGAGGGCACTGTGGACCCCTAACCAGATCACTGATATT ACCAGCCTGGTGAGACTGGTCTATATCCTGTCCAAACAGAATCAGCAGCACCTGATC CCACAGTGGGCCCTGAGGCAGATTGCCGACTTTGCTCTGAAGCTGCACAAAACCCAT CTGGCTTCCTTTCTGTCTGCATTCGCCAGACAGGAGCTGTACCTGATGGGATCTCTGG TGCACAGTATGCTGGTCCATACAACTGAGAGGCGCGAAATCTTCATTGTGGAGACA GGCCTGTGCAGCCTGGCTGAACTGTCCCACTTTACTCAGCTCCTGGCCCATCCTCAC CATGAGTACCTGTCAGATCTGTATACCCCATGTTCTAGTTCAGGACGACGGGACCAC AGCCTGGAACGACTGACTCGGCTGTTCCCTGATGCAACCGTGCCTACCACCGTGCCC GCCGCCCTGAGTATCCTGTCAACAATGCAGCCAAGCACACTGGAGACTTTTCCCGAC CTGTTCTGCCTGCCTCTGGGCGAGAGCTTCAGCGCCCTGACCGTGAGCGAACATGTC AGCTACGTGGTCACAAACCAGTATCTGATCAAGGGGATTTCCTACCCCGTGTCTACT ACCGTGGTCGGACAGTCCCTGATCATTACCCAGACAGATTCTCAGACTAAATGTGAG CTGACCAGAAATATGCACACAACTCATAGTATCACCGCCGCTCTGAACATTTCACTG GAGAATTGCGCTTTCTGTCAGTCCGCACTGCTGGAATACGATGACACACAGGGCGTG ATCAACATTATGTATATGCACGATTCTGATGACGTGCTGTTTGCTCTGGACCCCTACA ACGAGGTGGTCGTGAGCTCCCCCAGAACTCATTATCTGATGCTGCTGAAGAATGGCA CAGTGCTGGAAGTCACTGATGTCGTGGTCGATGCCACAGACTCCCGCTTCTTTTTCAT CATTGGCCTGATCATTGGGCTGTTCCTGGTGCTGCGAGTCGGCATCCACCTGTGCAT CAAGCTGAAGCATACAAAGAAGAGACAGATCTACACCGATATTGAAATGAACAGGC TGGGCAAATGA (SEQ ID NO.-18) (TM y CTD subrayados) En algunas modalidades, un polipéptido gH incluye un dominio de transmembrana y/o un dominio citoplásmico encontrados en gB. Un nucleótido ejemplar que codifica para un polipéptido de fusión de gH de HCMV-gB de HCMV de TM/CTD para uso de acuerdo con la presente invención se muestra más adelante como la SEQ ID NO: 20. En algunas modalidades, un polipéptido de gH de HCMV-gB de HCMV de TM/CTD adecuado para la presente invención es sustancialmente homólogo a un polipéptido codificado por la SEQ ID NO: 20. En algunas modalidades el polipéptido de gH de HCMV-gB de HCMV de TM/CTD adecuado para la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% O más, homologa al polipéptido codificado por la SEQ ID NO: 20. En algunas modalidades, el polipéptido de gH de HCMV-gB de HCMV de TM/CTD adecuado para la presente invención es sustancialmente idéntico al polipéptido codificado por la SEQ ID NO: 20. En algunas modalidades el polipéptido de gH de HCMV-gB de HCMV de TM/CTD adecuado para la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica al polipéptido codificado por la SEQ ID NO: 20.

Secuencia de Nucleótidos de gH de HCMV-gB de HCMV de TM/CTD (SEQ ID NO: 20) ATGCGGCCAGGCCTCCCCTCCTACCTCATCGTCCTCGCCGTCTGTCTCCTCAGCCACC TACTTTCGTCACGATATGGCGCAGAAGCCATATCCGAACCGCTGGACAAAGCGTTTC ACCTACTGCTCAACACCTACGGGAGACCCATCCGCTTCCTGCGTGAAAACACCACCC AGTGTACCTACAATAGCAGCCTCCGTAACAGCACGGTCGTCAGGGAAAACGCCATC AGTTTCAACTTTTTCCAAAGCTATAATCAATACTATGTATTCCATATGCCTCGATGTC TTTTTGCGGGTCCTCTGGCGGAGCAGTTTCTGAACCAGGTAGATCTGACCGAAACCC TGGAAAGATACCAACAGAGACTTAACACTTACGCGCTGGTATCCAAAGACCTGGCC AGCTACCGATCTTTTTCGCAGCAGCTAAAGGCACAGGACAGCCTAGGTGAACAGCC GACGACTGTGCC^C^CCC^TTGACCTGTCAATACCTC^CGTTTGGATGCCACCGC^ AACCACTCCACACGGCTGGACAGAATCACATACCACCTCAGGACTACACCGACCAC ACTTTAACCAGACCTGTATCCTCTTTGATGGACACGATCTACTATTCAGCACCGTCAC ACCTTGTTTGCACCAAGGCTTTTACCTCATCGACGAACTACGTTACGTTAAAATAAC ACTGACCGAGGACTTCTTCGTAGTTACGGTGTCCATAGACGACGACACACCCATGCT GCTTATCTTCGGCCATCTTCCACGCGTACTCTTTAAAGCGCCCTATCAACGCGACAA CTTTATACTACGACAAACTGAAAAACACGAGCTCCTGGTGCTAGTTAAGAAAGATC AACTGAACCGTCACTCTTATCTCAAAGACCCGGACTTTCTTGACGCCGCACTTGACT TCAACTACCTGGACCTCAGCGCACTACTACGTAACAGCTTTCACCGTTACGCCGTGG ATGTACTCAAAAGCGGTCGATGTCAGATGCTGGACCGCCGCACGGTAGAAATGGCC TTCGCCTACGCATTAGCACTGTTCGCAGCAGCCCGACAAGAAGAGGCCGGCGCCCA AGTCTCCGTCCCACGGGCCCTAGACCGCCAGGCCGCACTCTTACAAATACAAGAATT TATGATCACCTGCCTCTCACAAACACCACCACGCACCACGTTGCTGCTGTATCCCAC GGCCGTGGACCTGGCCAAACGAGCCCTTTGGACACCGAATCAGATCACCGACATCA CCAGCCTCGTACGCCTGGTCTACATACTCTCTAAACAGAATCAGCAACATCTCATCC CCCAGTGGGCACTACGACAGATCGCCGACTTTGCCCTAAAACTACACAAAACGCAC CTGGCCTCTTTTCTTTCAGCCTTCGCGCGTCAAGAACTCTACCTCATGGGCAGCCTCG TCCACTCCATGCTAGTACATACGACGGAGAGACGCGAAATCTTCATCGTAGAAACG GGCCTCTGTTCATTAGCCGAGCTATCACACTTTACGCAGTTGCTAGCTCATCCGCAC CACGAATACCTCAGCGACCTGTACACACCCTGTTCCAGTAGCGGGCGACGCGATCA CTCGCTCGAACGCCTCACACGTCTCTTCCCCGATGCCACCGTCCCCACTACCGTTCCC GCCGCCCTCTCCATCCTATCTACCATGCAACCAAGCACGCTAGAAACCTTCCCCGAC CTGTTTTGTCTGCCGCTCGGCGAATCCTTCTCCGCGCTGACCGTCTCCGAACACGTCA GTTATGTCGTAACAAACCAGTACCTGATCAAAGGTATCTCCTACCCTGTCTCCACCA CCGTCGTAGGCCAGAGCCTCATCATCACCCAGACGGACAGTCAAACTAAATGCGAA CTGACGCGCAAC^TGCATACCACAC^C^GCATC^CAGCGGCGCTC^CATTTCCCTA GAAAACTGCGCCTTTTGCCAAAGCGCCCTACTAGAATACGACGACACGCAAGGCGT CATCAACATCATGTACATGCACGACTCGGACGACGTCCTTTTCGCCCTGGATCCCTA CAACGAAGTGGTGGTCTCATCTCCGCGAACTCACTACCTCATGCTTTTGAAAAACGG TACGGTCCTAGAAGTAACTGACGTCGTCGTGGACGCTACCGACAGTCGTTTCGGAG CCTTCACCATCATCCTCGTGGCCATAGCCGTCGTCATTATCATTTATTTGATCT ATACTCGACAGCGGCGTCTCTGCATGCAGCCGCTGCAGAACCTCTTTCCCTATC TGGTGTCCGCCGACGGGACCACCGTGACGTCGGGCAACACCAAAGACACGTCG TTACAGGCTCCGCCTTCCTACGAGGAAAGTGTTTATAATTCTGGTCGCAAAGGA CCGGGACCACCGTCGTCTGATGCATCCACGGCGGCTCCGCCTTACACCAACGA GCAGGCTTACCAGATGCTTCTGGCCCTGGTCCGTCTGGACGCAGAGCAGCGAG CGCAGCAGAACGGTACAGATTCTTTGGACGGACAGACTGGCACGCAGGACAAG GGACAGAAGCCCAACCTGCTAGACCGACTGCGACACCGCAAAAACGGCTACCG ACACTTGAAAGACTCCGACGAAGAAGAGAACGTCTGA (SEQ ID NO:20) (señal del péptido gH subrayado; TM-CTD gB negrillas) Otros (incluyendo complejo de gN y gM -Glicoproteína (gC) II) Además de gB y gH, pueden ser útiles otras glicoproteínas de envoltura en el desarrollo de vacunas. Por ejemplo, el complejo gvll, que contiene gN (UL73) y gM (UL100) es de particular interés. Análisis proteómicos de viriones de HCMV han demostrado que el gcll es la glicoproteína más abundantemente expresada en partículas del virus, enfatizando su potencial importancia en la inmunidad protectora (Varnum SM et al., 2005 Human Gene Ther 16:1143-50) . La infección por HCMV obtiene una respuesta al anticuerpo especifica de gcll en la mayoría de los individuos seropositivos (Shimamura M et al., 2006 J Virol 80: 4591-600) y las vacunas de ADN que contienen los antígenos gcll gM y gN han demostrado obtener respuestas al anticuerpo neutralizante en conejos y ratones (Shen et al., 2007 Vaccine 25: 3319-27). pp65 La respuesta celular inmune a HCMV incluye respuestas del linfocito T CD8+ citotóxico CD4+ restringidas a MHC clase II y restringidas a MHC clase I a un número de antígenos virales, muchos de los cuales se encuentran en el tegumento viral, la región de la partícula viral que car entre la envoltura y la nucleocápside . Por ejemplo, la proteína pp65 de HCMV (UL83) ha demostrado obtener una respuesta significativa del linfocito T CD8+ después de la infección por HCMV (McLaughlin-Taylor E 1994 J Med Virol 43:103-10) . Esta proteína viral de 65 kDa es una de las proteínas estructurales más abundantemente expresadas de HCMV. Las secuencias de pp65 ejemplares se describen en la presente .

Otros (incluyendo IEl.ppl50) Otras proteínas que obtienen respuestas del linfocito T incluyen la proteína inmediata anterior 1 (IE1) (UL123) y ppl50 (UL32) (Gibson L et al., 2004 J Immunol 172: 2256-64; La Rosa C et al., 2005 Human Immunol 66:116-26).

Como se describió anteriormente, el polipéptido Gag puede incluir opcionalmente uno o más polipéptidos adicionales (e.g., un antígeno heterólogo). En algunas modalidades, el polipéptido Gag se co-expresa con un antígeno heterólogo (e.g., bajo promotores separados y/o como proteínas separadas) . El polipéptido Gag puede co-expresarse con un antígeno heterólogo sin alterar la función de Gag. Sin el deseo de vincularse a una teoría, se considera que la co-expresión de un polipéptido Gag de auto-ensamble con un antígeno de envoltura heterólogo permitirá incorporar el antígeno en la envoltura o bicapa de lípidos de una VLP resultante. En algunas modalidades, los componentes de la envoltura de VLP sirven como inmunógenos efectivos (e.g., para la inducción de una respuesta humoral inmune) . En algunas modalidades, el polipéptido Gag se expresa como una proteína de fusión con un antígeno heterólogo. Por ejemplo, una secuencia decodificación para un antígeno heterólogo puede empalmarse en la secuencia de codificación del polipéptido Gag, e.g., en el extremo 3' de la secuencia de codificación del polipéptido Gag. En algunas modalidades, una secuencia de codificación para un antígeno heterólogo puede empalmarse en el marco en la secuencia de codificación del polipéptido Gag. En algunas modalidades, la secuencia de codificación del polipéptido Gag y el antígeno heterólogo pueden expresarse por medio de un solo promotor. En algunas modalidades, un antígeno heterólogo se inserta en (e.g., se fusiona a) la terminal C de un polipéptido Gag. Sin el deseo de vincularse a alguna teoría, se considera que la fusión de un polipéptido Gag de auto-ensamble a un antígeno heterólogo permitirá la incorporación del antígeno en los componentes estructurales de la VLP resultante. En algunas modalidades, los componentes estructurales de la VLP sirven como inmunógenos efectivos (e.g., para la inducción de la respuesta celular inmune) . Por ejemplo, las VLPs proporcionadas pueden comprender un polipéptido Gag retroviral (e.g., Gag de MLV) y un componente estructural del HCMV (e.g., pp65) . En algunas modalidades, el pp65 se incorpora en la VLP y sirve como un antígeno para producir una respuesta inmune contra HCMV.

Las VLPs proporcionadas pueden contener una proteína retroviral estructural (e.g., polipéptido Gag) dispuesta y construida de tal manera que se auto-ensambla para formar la VLP y se coloca en el interior de la VLP. En algunas modalidades, las VLPs proporcionadas contienen una proteína de envoltura (e.g., gB y/o gH) dispuesta y construida de tal manera que uno o más epitopes de la proteína de envoltura (e.g., gB y/o gH) se colocan en la superficie de la VLP. En algunas modalidades, las VLPs proporcionadas contienen una proteína estructural de fusión (e.g., Gag/pp65) dispuesta y construida de tal manera que uno o más epitopes de la proteína estructural (e.g., pp65) se coloca en el interior de la VLP.

II. Producción de VLPs Se apreciará que la composición que comprende VLPs incluirá típicamente una mezcla de VLPs con un rango de tamaños . Debe entenderse que los valores de diámetro listados a continuación corresponden al diámetro más frecuente dentro de la mezcla. En algunas modalidades > 90% de las vesículas en una composición tendrán un diámetro que cae dentro del 50% del valor más frecuente (e.g., 1000 ± 500 nm) . En algunas modalidades la distribución puede ser más estrecha, e.g., > 90% de las vesículas en una composición pueden tener un diámetro que cae dentro del 40, 30, 20, 10 o 5% del valor más frecuente. En algunas modalidades, puede utilizarse sonicación o ultra-sonicación para facilitar la formación de VLP y/o para alterar el tamaño de la VLP. En algunas modalidades, puede utilizarse filtración, diálisis y/o centrifugación para ajustar la distribución de tamaño de la VLP.

En general, las VLPs producidas de acuerdo con los métodos de la presente descripción pueden ser de cualquier tamaño. En ciertas modalidades, la composición puede incluir VLPs con diámetros en un rango de aproximadamente 20 nm a aproximadamente 300 nm. En algunas modalidades, una VLP se caracteriza en que tiene un diámetro dentro de un rango limitado por un límite inferior de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 nm y limitado por un límite superior de 300, 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180 o 170 nm. En algunas modalidades, las VLPs dentro de una población muestran un diámetro promedio dentro de un rango limitado por un límite inferior de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 nm y limitado por un límite superior de 300, 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180 o 170 nm. En algunas modalidades, las VLPs en una población tienen un índice de poli-dispersión que es menor a 0.5 (e.g., que es menor a 0.45, que es menor a 0.4 o que es menor a 0.3). En algunas modalidades, el diámetro de la VLP se determina mediante nano-dimensionado. En algunas modalidades, el diámetro de la VLP se determina mediante microscopía de electrón.

A. Producción de VLP in vitro/Ex vivo Las VLPs proporcionadas de acuerdo con la presente invención pueden prepararse de acuerdo con las metodologías generales conocidas por la persona experta. Por ejemplo, varias moléculas de ácido nucleico, genomas o vectores reconstituidos o plásmidos pueden prepararse utilizando secuencias de virus conocidos. Tales secuencias se encuentran disponibles de bancos, y el material puede obtenerse de diversas colecciones, plásmidos publicados, etc. Estos elementos pueden aislarse y manipularse utilizando técnicas muy conocidas por el técnico experto, o aislarse a partir de plásmidos disponibles en la técnica. También pueden producirse varias secuencias sintéticas o artificiales a partir de análisis computarizados o a través de la exploración (de alto rendimiento) de bibliotecas. La expresión recombinante de los polipéptidos para VLPs requiere la construcción de un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica para uno o más polipéptidos. Una vez obtenido un polinucleótido que codifica para uno o más polipéptidos, el vector para la producción del polipéptido puede producirse mediante tecnología de ADN recombinante utilizando técnicas conocidas en la técnica. Los vectores de expresión que pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, vectores de expresión de mamífero, vectores de expresión de baculovirus, vectores de expresión vegetales (e.g., virus mosaico de coliflor (Ca V) , virus mosaico de tabaco (T V) ) , vectores de expresión de plásmido (e.g., plásmido Ti), entre otros.

Un plásmido de expresión de VLP ejemplar que puede utilizarse de acuerdo con la presente invención se muestra a continuación como la SEQ ID NO: 19: Plásmido de Expresión Propol II (SEQ ID NO: 19) CTAGAGAGCTTGGCCCATTGCATACGTTGTATCCATATCATAATATGTACATTTATAT TGGCTCATGTCCAACATTACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAG TAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAA CTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCA ATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGG GTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCA AGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAG TACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTA TTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACT CACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACC AAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATG GGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCG TCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGA CCGATCCAGCCTCCGGTCGACCGATCCTGAGAACTTCAGGGTGAGTTTGGGGACCCT TGATTGTTCTTTCTTTTTCGCTATTGTAAAATTCATGTTATATGGAGGGGGCAAAGTT TTCAGGGTGTTGTTTAGAATGGGAAGATGTCCCTTGTATCACCATGGACCCTCATGA TAATTTTGTTTCTTTCACTTTCTACTCTGTTGACAACCATTGTCTCCTCTTATTTTCTTT TCATTTTCTTGTAACTTTTTCGTTAAACTTTAGCTTGCATTTGTAACGAATTTTTAAAT TCACTTTTGTTTATTTGTCAGATTGTAAGTACTTTCTCTAATCACTTTTTTTTCAAGGC AATCAGGGTATATTATATTGTACTTCAGCACAGTTTTAGAGAACAATTGTTATAATT AAATGATAAGGTAGAATATTTCTGCATATAAATTCTGGCTGGCGTGGAAATATTCTT ATTGGTAGAAACAACTACATCCTGGTCATCATCCTGCCTTTCTCTTTATGGTTACAAT GATATACACTGTTTGAGATGAGGATAAAATACTCTGAGTCCAAACCGGGCCCCTCTG CTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTAT TGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCCTCGAGCGTACGCCTAGGGGATCCAG CGCTATTTAAATGCTAGCATGCATGTTAACCCTGCAGGGGTACCGCGGCCGCAAGCT TAGATCCGTCGAGGAATTCACTCCTCAGGTGCAGGCTGCCTATCAGAAGGTGGTGGC TGGTGTGGCCAATGCCCTGGCTCACAAATACCACTGAGATCTTTTTCCCTCTGCCAA AAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAA ATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACA TATGGGAGGGCAAATCATTTAAAACATCAGAATGAGTATTTGGTTTAGAGTTTGGCA ACATATGCCCATATGCTGGCTGCCATGAACAAAGGTTGGCTATAAAGAGGTCATCA GTATATGAAACAGCCCCCTGCTGTCCATTCCTTATTCCATAGAAAAGCCTTGACTTG AGGTTAGATTTTTTTTATATTTTGTTTTGTGTTATTTTTTTCTTTAACATCCCTAAAAT TTTCCTTACATGTTTTACTAGCCAGATTTTTCCTCCTCTCCTGACTACTCCCAGTCATA GCTGTCCCTCTTCTCTTATGGAGATCCCTCGACGGATCGGCCGCAATTCGTAATCATG TCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGA GCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATT AATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCA TTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGC TTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGC TCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGA ACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCT GGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAG TCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAA GCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTT TCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCG GTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGAC CGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTA TCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGG TGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATT TGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTG ATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGAT TACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGA CGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAA GGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTA TATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCT CAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAAC TACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACC CACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAG CGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGG GAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCT ACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCC AACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGGTTAGCTC 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ACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTC CCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTC GCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAA CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAGCGCGCGTAA TACGACTCACTATAGGGCGAATTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCT (SEQ ID NO:19) Las VLPs proporcionadas pueden prepararse de acuerdo con técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, en algunas modalidades, las VLPs proporcionadas pueden producirse en cualquier sistema de expresión de proteínas disponible. Típicamente, el vector de expresión se transfiere a una célula huésped mediante técnicas convencionales y las células transfectadas se cultivan entonces mediante técnicas convencionales para producir las VLPs. En algunas modalidades, las VLPs se producen utilizando la transfección transitoria de las células. En algunas modalidades, las VLPs se producen utilizando células establemente transfectadas . Las lineas celulares típicas que pueden utilizarse para la producción de VLP incluyen, pero no se limitan a, líneas celulares de mamífero tales como células de riñon embrionario humano (HEK) 293, de ovario de hámster chino (CHO) , de riñon de mono (COS) , HT1080, CIO, HeLa, de riñón de cría de hámster (BHK) , 3T3, C127, CV-1, HaK, NS/O y L-929. Los ejemplos específicos no limitantes incluyen, pero no se limitan a, línea de mieloma de ratón BALB/c (NSO/l, ECACC No. 85110503); retinoblastos humanos (PER.C6 (CruCell, Leiden, Países Bajos) ) ; línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651) ; línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10) ; células de ovario de hámster chino +/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 77:4216 (1980)), células sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol . Reprod., 23: 243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70) ; células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1 587); células de carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL 2) : células caninas de riñón (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3a, ATCC CRL 1442) ; células de pulmón humano ( 138, ATCC CCL 75) ; células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL 51); células TR1 (Mather et al., Annals. N.Y., Acad Sci., 383: 44-68 (1982)); células MRC 5 ; células FS4 ; y una línea de hepatoma humano (Hep G2) . En algunas modalidades, las líneas celulares que pueden utilizarse para la producción de VLP incluyen células de insecto (e.g., Sf-9, Sf-21, Tn-368, Hi5) o vegetales (e.g., leguminosas, cereales o tabaco) . Se apreciará en algunas modalidades, particularmente cuando la glicosilación es importante para la función de las proteínas, que se prefieren las células de mamífero para la expresión de proteínas y/o la producción de VLP (ver, e.g., Roldao A et al., 2010 Ex t . Rev. Vaccines 9:1149-76).

Se apreciará que puede seleccionarse una cepa celular que module la expresión de las secuencias insertadas o que modifique y procese el producto del gen de una manera específica. Tales modificaciones (e.g., glicosilación) y procesamientos (e.g., división o transporte hacia la membrana) de los productos de proteína pueden ser importantes para la generación de una VLP o la función de un polipéptido de VLP o de un polipéptido adicional (e.g., un adyuvante o antígeno adicional) . Diferentes células tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento post-translacional y la modificación de proteínas y productos del gen. Pueden seleccionarse líneas celulares o sistemas huésped apropiados para asegurar la correcta modificación y procesamiento de la proteína externa expresada. Generalmente, pueden utilizarse células huésped eucarióticas (también referidas como células de encapsidación (e.g., células de riñon embrionario humano 293T) que poseen la maquinaria celular apropiada para el apropiado procesamiento de la transcripción, glicosilación y fosforilación primaria del producto del gen de acuerdo con la presente invención.

Las VLPs pueden purificarse de acuerdo con técnicas conocidas, tales como centrifugación, gradientes, ultra-centrifugación de gradiente de sacarosa, filtración y cromatografía de flujo tangencial (e.g., cromatografía columna de intercambio de ion (anión y catión) , de afinidad y de tamaño), o solubilidad diferencial, entre otras. Alternativa o adicionalmente , pueden utilizarse directamente los sobrenadantes celulares, sin etapa de purificación. Pueden agregarse entidades adicionales, tales como antígenos o adyuvantes adicionales a las VLPs purificadas.

En algunas modalidades, las secuencias de polinucleótido proporcionadas se optimizan mediante codón. La optimización por codón es muy conocida en la técnica e implica la modificación del uso del codón de manera que se produzcan altos niveles de proteína.

B. Producción de VLP in vivo Las VLPs proporcionadas de acuerdo con la presente invención pueden prepararse como vacunas de ADN de acuerdo con métodos muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, en algunas modalidades, uno o más vectores o plásmidos, e.g., tales como los descritos anteriormente, se administran a un sujeto de tal manera que las células receptoras expresan los polipéptidos codificados por el vector o plásmido. En algunas modalidades, las células receptoras que expresan tales polipéptidos producen VLPs que comprenden los polipéptidos .

C. VLPs mono-, di- o trivalentes De acuerdo con la presente invención, las células pueden transíectarse con un solo vector de expresión como se describe en la presente. En algunas modalidades, un solo vector de expresión codifica para más de un elemento de una VLP (e.g., más de una poliproteína estructural, polipéptido de tegumento CMV, glicoproteína CMV, etc.) . Por ejemplo, en algunas modalidades, un solo vector de expresión codifica para dos o más elementos de una VLP. En algunas modalidades, un solo vector de expresión codifica para tres o más elementos de una VLP.

En algunas modalidades, las células se transfectan con dos o más vectores de expresión. Por ejemplo, en algunas modalidades, las células se transfectan con un primer vector que codifica para un polipéptido Gag y un segundo vector que codifica para una glicoproteína de envoltura de HCMV (e.g., gB o gB-G o gH-G) . En algunas de tales modalidades, se producen VLPs "monovalentes" que comprenden una glicoproteína de envoltura de HCMV (e.g., gB o gB-G o gH-G) . En algunas modalidades, las células se transfieren con un primer vector que codifica para un polipéptido Gag, un segundo vector que codifica para una glicoproteína de envoltura de HCMV (e.g., gB o gB-G o gH-G) y un tercer vector que codifica para otra glicoproteína de envoltura de HCMV (e.g., gB o gB-G o gH-G) . En algunas de tales modalidades, se producen VLPs "bivalentes" que comprenden 2 glicoproteínas de envoltura de HCMV (e.g., gB o y gH-G o gB-G y gH-G). En algunas modalidades, las células se transfectan con un primer vector que codifica para un polipéptido de fusión Gag-pp65 y un segundo vector que codifica para una glicoproteína de envoltura de HCMV (e.g., gB o gB-G o gH-G) . En algunas de tales modalidades, se producen VLPs "bivalentes" que comprenden una proteína estructural de HCMV y una glicoproteína de envoltura de HCMV (e.g., gB o gB-G o gH-G) . En algunas modalidades, las células se transfectan con un primer vector que codifica para un polipéptido de fusión Gag-pp65, un segundo vector que codifica para una glicoproteína de envoltura de HCMV (e.g., gB o gB-G o gH-G) y un tercer vector que codifica para otra glicoproteína de envoltura de HCMV (e.g., gB o gB-G o gH-G). En algunas de tales modalidades, se producen VLPs "trivalentes" que comprenden una proteína estructural de HCMV y 2 glicoproteínas de envoltura de HCMV (e.g., gB u gH-G o gB-G o gH-G) .

En algunas modalidades, se mezclan VLPs monovalentes, bivalentes o trivalentes. Por ejemplo, en algunas modalidades, las VLPs monovalentes y bivalentes se mezclan para formar una mezcla de VLP trivalente. En algunas modalidades se mezclan dos VLPs bivalentes para formar una mezcla de VLP trivalente.

III . Infección por HCMV y Tratamiento El citomegalovirus humano (HCMV) , un ß-herpesvirus, es un patógeno que se presenta ubicuamente. En general, la entrada de herpesvirus a las células es un complejo proceso iniciado por la absorción y el enlace al receptor y seguido por una fusión de la envoltura del virus con una membrana celular. La fusión se presenta generalmente ya sea en la membrana de plasma o en una membrana endosomal . El HCMV infecta múltiples tipos de células in vivo, incluyendo células epiteliales, células endoteliales y fibroblastos (Plachter B et al., 1996 Adv Virus Res 46: 195-261). Éste se fusiona con las membranas de plasma de los fibroblastos (Compton T et al., 1992 Virology 191:387-395), pero entra a las células epiteliales pigmentadas y a las células endoteliales del cordón umbilical a través de endocitosis (Bodaghi B et al., 1999 J Immunol 162-957-964; Tyckman BJ et al., 2006 J Virol 80: 710-722). El mecanismo mediante el cual los herpesvirus seleccionan sus rutas de entrada sigue siendo poco claro. Generalmente se asume que las trayectorias de entrada se determinan principalmente por la célula huésped, pero no existe evidencia para los papeles trópicos de las glicoproteínas de virión (Wang X et al., 1998 J Viro9l 72:5552-5558). Como se mencionó previamente, el HCMV codifica para dos complejos de gH/gL: gH/gL/gO y gH/gL/UL128/UL130/UL131. El complejo que contiene gO es suficiente para la infección del fibroblasto, mientras el complejo que contiene pUL128/UL130/UL131 es importante para la infección por HCMV de células endoteliales y epiteliales.

El HCMV infecta al 50-85% de los adultos cerca de los 40 años de edad (Gershon AA et al., 1997 en Viral Infections of Humans (Infecciones virales de humanos) 4a edición, New York: Plenum Press 229-251) . La mayor parte de los adultos sanos que adquieren HCMV después del nacimiento desarrollan pocos, si es que algunos, síntomas. Sin embargo, la enfermedad por HCMV es la causa e significativa morbidez y mortalidad en individuos inmunocomprometidos, tales como los receptores de trasplantes de células hematopoyéticas (HCT) y trasplantes de órgano sólido (SOT) (Pass RF 2001 Cytomegalovirus . In Fields Virology, 4a edición, Philadelphia; Lippincott Williams & Wilkens 2675-2705) . En poblaciones de SOT o HCT, la enfermedad por HCMV puede presentarse ya sea a partir de una nueva infección transmitida del órgano donante o HCT, o puede recurrir como resultado de la reactivación de un virus latente en el receptor. En individuos infectados con VIH, la infección por HCMV acelera la progresión al SIDA y a la muerte, a pesar de la disponibilidad de una terapia anti-retroviral (Deayton JR et al., 2004 Lancet 363: 2116-2121). Adicionalmente en los EU, el HCMV es la infección intrauterina más común y ocasiona anormalidades congénitas que dan como resultado la muerte o severos defectos de nacimiento incluyendo sordera y retraso mental, en aproximadamente 8000 infantes cada año (Stagon S et al., 1986 JAMA 256:1904-1908).

Las respuestas inmunes que controlan el HCMV se han comprendido de manera incompleta. Por analogía a otros herpesvirus humanos, puede asumirse que las respuestas inmunes tanto celulares como humorales juegan un importante papel (Kohl S 1992 Curret topics in Microbiology and Immunology (Tópicos actuales en microbiología e inmunología) 179: 75-88) . Para el CMV murino se ha demostrado que es suficiente ya sea una respuesta a la célula T citotóxica o la transferencia pasiva de anticuerpos neutralizantes para proteger contra un desafío letal ( app M et al., 1993 Multidisciplinary Approach to Understanding Cytomegalovirus Disease (Procedimiento multidisciplinario para la comprensión de la enfermedad por citomegalovirus) 327-332; Reddehase MJ et al., 198 J Virology 61:3102-3108).

El control de persona inmunocoraprometidas se asocia principalmente con las respuestas inmunes celulares; los linfocitos T tanto CD8+ como CD4+ parecen ser importantes para la protección contra la enfermedad por CMV (Gamadia LE et al., 2003 Blood 101:2686-2692; Cobbold M et al., 2005 J Exp Med 202: 379-386) . La respuesta inmune celular a CMV incluye las respuestas del linfocito T auxiliar CD4+ y el linfocito T citotóxico CD8+ a numerosos antígenos, encontrados en el tegumento viral. La región de la partícula viral entre la envoltura y la cápside. Un estudio reciente de células T CD4+ y CD8+ específicas para CMV de donantes sanos utilizó péptidos traslapados provenientes de una serie de marcos de lectura abiertos del CMV para identificar antígenos reconocidos después de la infección por CMV (Sylwester AW et al., 2005 J Exp Med 202: 673-685). La fosfoproteína 65 de tegumento de CMV (pp65) y la glicoproteína de superficie gB fueron los antígenos más frecuentemente reconocidos por las células T CD8+.

En contraste con el escenario del trasplante, la respuesta inmune humoral materna contra el virus parece ser importante para prevenir la enfermedad por HCMV en el neonato. Los anticuerpos para glicoproteínas de superficie, especialmente gB, parecen ser críticos para la protección contra la transferencia materno-fetal del CMV (Fowler KB et al., 2003 JAMA 289:1008-1011). Además, en un estudio anterior de vacunación se demostró que la protección contra la re-infección se correlaciona con los anticuerpos neutralizantes (Adler SP et al., 1995 J Infectious Diseases 171: 26-32). La respuesta inmune humoral al CMV se encuentra dominada por las respuestas a glicoproteínas de envoltura viral presentes en la envoltura exterior de la partícula de virus (e.g., gB y gH) .

En el caso del HCMV, se dificulta la evaluación directa de las funciones efectoras inmunológicas debido a que el virus es estrictamente específico de la especie y no se encuentra disponible ningún sistema de modelo animal. Sin embargo, se ha utilizado el CMV murino y el CMV de conejillo de indias para evaluar las estrategias de vacunación en estas especies huésped.

Una vacuna para CMV que induce las respuestas protectoras tanto de la célula T como del anticuerpo neutralizante tiene el potencial para prevenir la infección o aminorar la enfermedad por CMV debida a infección congénita o trasplante .

El primer candidato de vacuna para HCMV vivo, atenuado probado en humanos se basó en la cepa AD169 adaptada para laboratorio. Subsecuentes pruebas con otro aislado clínico adaptado para laboratorio, la cepa Towne, confirmaron que las vacunas vivas atenuadas podrían obtener respuestas de anticuerpos neutralizantes, así como de linfocitos T CD4+ y CD8+. La eficacia de la vacuna Towne se evaluó en una serie de estudios en receptores de trasplante renal . Aunque la vacuna Towne proporcionó un impacto protector en la enfermedad por HCMV falló en prevenir la infección por HCMV después de trasplante (Plotkin SA et al., 1984 Lancet 1:528-530) . La vacuna Towne también se evaluó en un estudio controlado por placebo de madres seronegativo que tuvieron niños que asistían a un grupo de cuidados diurnos en donde ésta falló en la prevención de que estas mujeres adquirieran la infección de sus niños infectados por HCMV (Adler SP et al., 1995 J Infectious Diseases 171: 26-32). Una interpretación de estos estudios fue que la vacuna Towne estaba sobre-atenuada. Para explorar esta posibilidad una serie de recombinantes genéticos en los cuales se sustituyeron las regiones de la cepa "Toledo" no atenuada de CMV por las regiones correspondientes del genoma Towne, dio como resultado la construcción de "quimeras" Towne/Toledo que contenían algunas, pero no todas, las mutaciones que contribuyen a la atenuación de la vacuna Towne (Heineman TC et al., 2006 J Infect Disease 193: 1350-1360). Se probó la seguridad y la tolerabilidad de cuatro "quimeras" Towne/Toledo en una prueba en Fase I . Los problemas de seguridad a largo plazo acerca del riesgo potencial de establecer una infección por HCMV latente han obstaculizado el desarrollo posterior de vacunas vivas, atenuadas.

El candidato de vacuna contra CMV de subunidad guía se basa en la glicoproteína de envoltura, gB, (la vacuna gB recombinante purificada se fabrica por Sanofi-Pasteur Vaccines) debido a la capacidad de esta proteína para obtener respuestas al anticuerpo neutralizante del virus de alta titulación durante la infección natural. La vacuna de gB recombinante obtiene respuestas al anticuerpo neutralizante y tiene un excelente perfil de seguridad, sin embargo, ésta excluye a otros objetivos de glicoproteína de la respuesta al anticuerpo neutralizante y más importantemente a objetivos del linfocito T. La vacuna requiere el adyuvante MF59 para optimizar la inmunogenicidad . En la prueba más reciente, esta vacuna proporcionó una eficacia general del 50% para la prevención de la infección por CMV en una prueba clínica en Fase 2 en mujeres jóvenes (Pass RF et al., 2009 N Engl J Med 360: 1191-1199). Otras proteínas virales evaluadas como candidatos de vacuna de subunidad incluyen pp65 e IE1, de las cuales ambas obtienen respuestas a la célula T.

Las vacunas de ADN obtienen robustas respuestas inmunes celulares y humorales en animales y son muy adecuadas para la especificidad y precisión en el diseño de vacunas. Se han desarrollado vacunas de ADN para CMV y se han enfocado en proteínas gB, IE1 y pp65 como inmunógenos objetivo candidato. Se ha desarrollado un candidato de vacuna bivalente de ADN para CMV (Wloch MK 2008 J Infectious Diseases 297: 1634-1642), que utiliza ADN de plásmido que codifica para pp65 y gB y un candidato de vacuna trivalente (Jacobson MA 2009 Vaccine 27: 1540-1548) que también incluye un tercer plásmido que codifica para el producto de gen IE1, por Vical Vaccines (Patente de E.U. 7,410,795). La vacuna de ADN trivalente sola tu8vo mínima inmunogenicidad independientemente de la vía de administración. Sin embargo, la vacuna de ADN para CMV pareció preparar de manera segura para una respuesta de memoria a los antígenos de CMV observados después de la administración de la CMV viva, atenuada (Towne) .

En un procedimiento de vacuna vectorizado, el producto del gen de interés se expresa en el contexto de un vehículo no replicante (comúnmente viral) . Un ejemplo de esto es un vector de viruela llamado ALVAC desarrollado por Virogenetics y Sanofi-Pasteur Vaccines, que es un virus de viruela atenuado que se replica de manera abortiva en células de mamífero. En pruebas clínicas se han probado la gB de CMV que expresa ALVAC y pp65 que expresa ALVAC (EU 6,267,965). ALVAC-CMV (gB) no indujo anticuerpos neutralizantes pero preparó para valoraciones neutralizantes más altas después de la subsecuente infección con la cepa Towne CMV (Adler SP et al., 1999 J Infectious Diseases 180:843-846), aunque no pareció reforzar las valoraciones del anticuerpo neutralizante después de la inmunización subsecuente con la vacuna de subunidad gB/MF59 (Bernstein SI et al., 2002 J Infectious Diseases 185: 686-690=. Un vector de viruela que expresa pp65, ALVAC-CMV (pp64) , indujo respuestas CTL de larga duración en todos los voluntarios originalmente seronegativos a frecuencias comparables con individuos naturalmente seropositivos (Berencsi K et al., 2001 J Infectious Diseases 183: 1171-1179). Otro procedimiento utilizado para expresar gB como una vacuna vectorizada es el uso de un sistema de replicón alfavirus por AlphaVax Inc (EU 7,419,674). Este procedimiento implica un sistema de vector de replicón de ARN de ciclo único defectivo en propagación derivado de una cepa atenuada de un alfavirus, virus de encefalitis equina venezolano (VEE) , para producir partículas de replicón tipo virus (VRPs) que expresan la proteína pp65, IE1 o gB (Berstein et al., 2010 Vaccine 28:484-493). Se utilizó una vacuna del replicón alfavirus de dos componentes para expresar las tres proteínas de CMV como una forma soluble de gB de CMV (cepa To ne) y se descubrió que la proteína de fusión de pp65/IEl (Reap EA et al., 2007 Vaccine 25:7441-7449) fue segura e indujo altos niveles de anticuerpo neutralizante y respuestas polifuncionales de la célula T específica al antígeno de CD4+ y CD8+. La titulación geométrica promedio (GMT) para el grupo de dosis alta fue de aproximadamente la mitad de la GMT en 12 individuos seropositivo a CMV infectados de manera natural probados en el análisis.

Un nuevo candidato para la vacunación contra HCMV actualmente en desarrollo preclínico es una vacuna de "cuerpo denso". Los cuerpos densos (DBs) son partículas envueltas, defectivas en replicación formas durante la replicación de los CMVs en cultivo celular. Contienen tanto glicoproteínas de envoltura como grandes cantidades de proteína pp65. Los DBs son no infecciosos e inmunogénicos pero sin la capacidad de establecer una infección latente por HCMV en el receptor de la vacuna. Los DBs han demostrado tener la capacidad de inducir respuestas a anticuerpos neutralizantes de virus y células T en ratones en ausencia de la expresión del gen viral (Pepperl S et al., 2000 J Virol 74: 6132-6146 WO 00/52729 y EU 6,713,070).

IV. Composiciones Farmacéuticas La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden las VLPs proporcionadas y/o las variantes de glicoproteína proporcionadas . En algunas modalidades, la presente invención proporciona una VLP y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones farmacéuticas pueden comprender opcionalmente y/o administrarse en combinación con una o más sustancias terapéuticamente activas. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas proporcionadas son útiles en medicina. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas proporcionadas son útiles como agentes profilácticos (i.e., vacunas) en el tratamiento o prevención del HCMV o de las ramificaciones negativas asociadas o correlacionadas con la infección por HCMV. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas proporcionadas son útiles en aplicaciones terapéuticas, por ejemplo, en individuos que sufren de o son susceptibles a la infección por HCMV. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas se formulan para su administración a humanos .

Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente pueden proporcionarse en una forma inyectable estéril (e.g., una forma adecuada para inyección subcutánea o infusión intravenosa) . Por ejemplo, en algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas se proporcionan en una forma de dosis líquida adecuada para inyección. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas se proporcionan como polvos (e.g., liofilizados y/o esterilizados) , opcionalmente bajo vacío, que se reconstituyen con un diluyente acuoso (e.g., agua, amortiguador, solución salina, etc.) antes de la inyección. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas se diluyen y/o se reconstituyen en agua, solución de cloruro de sodio, solución de acetato de sodio, solución de alcohol bencílico, salina amortiguada con fosfato, etc. En algunas modalidades, el polvo puede mezclarse suavemente con el diluyente acuoso (e.g., sin agitación).

En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas proporcionadas comprenden uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables (e.g., conservadores, diluyentes inertes, agentes de dispersión, agentes activos de superficie, y/o emulsionantes, agentes amortiguadores, etc.). Los excipientes adecuados incluyen, por ejemplo, agua, salina, dextrosa, sacarosa, trehalosa, glicerol, etanol, o similares, y sus combinaciones. Adicionalmente, si se desea, la vacuna puede contener sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes amortiguadores de pH, o adyuvant5es que aumentan la efectividad de las vacunas. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas comprenden uno o más conservadores. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas no comprenden ningún conservador.

En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas se proporcionan en una forma que puede refrigerarse y/o congelarse. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas se proporcionan en una forma que no puede ref igerarse y/o congelarse . En algunas modalidades, las soluciones reconstituidas y/o formas de dosis líquida pueden almacenarse durante cierto período de tiempo después de su reconstitución (e.g., 2 horas, 12 horas, 24 horas, 2 días, 5 días, 7 días, 10 días, 2 semanas, un mes, dos meses o más) . En algunas modalidades, el almacenamiento de formulaciones de VLP durante más del tiempo especificado da como resultado la degradación de la VLP.

Las formas de dosis líquidas y/o soluciones reconstituidas pueden comprender material en partículas y/o de decoloración antes de su administración. En algunas modalidades, la solución no debe utilizarse si se decolora o se enturbia y/o si el material en partículas permanece después de la filtración.

Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente pueden prepararse mediante cualquier método conocido o desarrollado posteriormente en la técnica de la farmacología. En algunas modalidades, tales métodos de preparación incluyen la etapa de poner al ingrediente activo en asociación con uno o más excipientes y/o uno o más ingredientes accesorios diferentes, y después, si es necesario y/o deseable, conformar y/o empaquetar el producto en la unidad de dosis única o múltiple deseada.

Una composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede prepararse, empaquetarse y/o comercializarse en volumen, como una dosis unitaria y/o como una pluralidad de dosis unitarias. Como se utiliza en la presente, una "dosis unitaria" es la cantidad deparada de la composición farmacéutica que comprende una cantidad predeterminada del ingrediente activo. La cantidad del ingrediente activo es generalmente igual a una dosis que se administraría a un sujeto y/o a una fracción conveniente de tal dosis tal como, por ejemplo, la mitad o un tercio de tal dosis.

Las cantidades relativas del ingrediente activo, excipiente farmacéuticamente aceptable, y/o cualquier ingrediente adicional en una composición farmacéutica de acuerdo con la invención pueden variar, dependiendo de la identidad, el tamaño y/o la condición del sujeto tratado y/o dependiendo de la vía por la cual va a administrarse la composición. A modo de ejemplo, la composición puede comprender entre 0.1% y 100% (peso/peso) del ingrediente activo.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden comprender adicionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable que, como se utiliza en la presente, puede ser o comprender solventes, medios de dispersión, diluyentes u otros vehículos líquidos, auxiliares de dispersión o suspensión. Agentes activos de superficie, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservadores, aglutinantes sólidos, lubricantes y lo similar, según sea adecuado para la forma de dosis particular deseada. Remington's The Science and Practice of Pharmacy (La ciencia y práctica farmacéutica de Remington) 21a edición, A.R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore MD, 2006) describe diversos excipientes utilizados para formular composiciones farmacéuticas y técnicas conocidas para su preparación. Excepto en lo que respecta a que cualquier medio de excipiente convencional sea incompatible con una sustancia o sus derivados, tal como produciendo algún efecto biológico indeseable que interactúe de manera nociva con cualquier otro(s) componente (s) de la composición farmacéutica, su uso se contempla dentro del alcance de esta invención.

En algunas modalidades, la composición farmacéutica es suficientemente inmunogénica como vacuna (e.g., en ausencia de un adyuvante) . En algunas modalidades, la inmunogenicidad de una composición farmacéutica aumenta incluyendo un adyuvante. El adyuvante puede utilizarse de acuerdo con la presente invención. Se conoce un gran número de adyuvantes; un compendio de muchos de tales compuestos se prepara por el National Institutes of Health y puede encontrarse (www.niaid.nih.gov/daids/vaccine/pdf/compendium.pdf) . Ver también Allison (1998, Dev. Biol . Stans. 92:3-11); incorporada en la presente mediante la referencia) . Unkeless et al., (1998, Annu. Rev. Immunol . , 6:251-281); incorporada en la presente mediante la referencia) y Phillips et al., (1992; Vaccine, 10: 151-158; incorporada en la presente mediante la referencia) . Se conocen cientos de adyuvantes diferentes en la técnica y pueden emplearse en la práctica de la presente invención. Los adyuvantes ejemplares que pueden utilizarse de acuerdo con la invención incluyen, pero no se limitan a, citosinas, adyuvantes tipo gel (e.g., hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, fosfato de calcio, etc.); adyuvantes microbianos (e.g., secuencias de ADN inmunomoduladoras que incluyen motivos CpG; endotoxinas tales como el lípido A monofosforilo; exotoxinas tales como la toxina del cólera, la toxina lábil al calor de E. coli, y la toxina de la tosferina; dipéptido de muramilo, etc.); adyuvantes de emulsión en aceite y a base de emulsionante (e.g., adyuvante de Freund, MF59 (Novartis) , SAF, etc.); adyuvantes en partículas (e.g., liposomas, microesferas biodegradables, saponinas, etc.); adyuvantes sintéticos (e.g., copolímeros de bloque no iónicos, análogos de péptido de muramilo, polifosfaceno, polinucleótidos sintéticos, etc.); y/o combinaciones de los mismos. Otros adyuvantes ejemplares incluyen algunos polímeros (e.g., polifosfacenos ; descritos en la Patente de E.U. 5,500,161, que se incorpora en la presente mediante la referencia), Q57, QS21, escualeno, tetraclorodecaóxido, etc. Los excipientes farmacéuticamente aceptables se han descrito previamente en mayor detalle en la sección anterior titulada "Composiciones Farmacéuticas" .

V. Administración Las composiciones y métodos de la presente invención proporcionados son útiles para profilaxis y/o tratamiento de la infección por HCMV en un sujeto, incluyendo humanos adultos y niños. Sin embargo, en general pueden utilizarse con cualquier animal. En ciertas modalidades, los métodos en la presente pueden utilizarse para aplicaciones veterinarias, e.g., aplicaciones en caninos y felinos. Si se desea, los métodos de la presente pueden utilizarse también con animales de granja, tales como crías de ovinos, aviares, bovinos, porciones y equinos.

Como se utilizan en la presente, los términos "sujeto", "individuo" o "paciente" se refieren a un sujeto mamífero humano o no humano. El individuo (también referido como "paciente" o "sujeto") que se trata es un individuo (feto, infante, niño, adolescente o adulto) que sufre de una enfermedad, por ejemplo, infección por HCMV. En algunas modalidades, el sujeto se encuentra en riesgo de infección por HCMV. En algunas modalidades, el sujeto es un sujeto inmunosuprimido . Por ejemplo, en algunas modalidades, el sujeto inmuosuprimido se selecciona del grupo que consiste de un sujeto infectado por VIH, un paciente de SIDA, un receptor de trasplante, un sujeto pediátrico y un sujeto preñado. En algunas modalidades, el sujeto se ha expuesto a infección por HCMV. En algunas modalidades, el sujeto es un humano.

Las composiciones descritas en la presente se administrarán generalmente en cantidades tales y por un tiempo tal que sean necesarios o suficientes para inducir una respuesta inmune. Los regímenes de dosificación pueden consistir de una sola dosis o de una pluralidad de dosis durante un período de tiempo. La cantidad exacta de una composición inmunogénica (e.g., VLP) que va a administrarse puede variar de un sujeto a otro y puede depender de diversos factores. Por tanto, se apreciará que, en general, la dosis precisa utilizada será como se determine por el médico que prescribe y dependerá no solamente del peso del sujeto y la vía de administración, sino también de la edad del sujeto y de la severidad de los síntomas y/o del riesgo de infección. En ciertas modalidades se administra una cantidad particular de una composición de VLP como una dosis única. En ciertas modalidades, se administra una cantidad particular de una composición de VLP como más de una dosis (e.g., de 1 a 3 dosis separadas por 1 a 12 meses) . En ciertas modalidades, la cantidad particular de la composición de VLP se administra como una dosis única en varias ocasiones (e.g., de 1 a 3 dosis separadas por 1 a 12 meses) .

En algunas modalidades, la composición proporcionada se administra en una dosis inicial y en al menos una dosis de refuerzo. En algunas modalidades, la composición proporcionada se administra en una dosis inicial y en dos dosis de refuerzo. En algunas modalidades, la composición proporcionada se administra en una dosis inicial y en tres dosis de refuerzo. En algunas modalidades, la composición proporcionada se administra en una dosis inicial y en cuatro dosis de refuerzo. En algunas modalidades, la composición proporcionada se administra en una dosis inicial y en al menos una dosis de refuerzo aproximadamente un mes, aproximadamente dos meses, aproximadamente tres meses, aproximadamente cuatro meses, aproximadamente cinco meses, o aproximadamente seis meses después de la dosis inicial. En algunas modalidades, la composición proporcionada se administra en una segunda dosis de refuerzo aproximadamente seis meses, aproximadamente siete meses, aproximadamente ocho meses, aproximadamente nueve meses, aproximadamente diez meses, aproximadamente once meses o aproximadamente un año después de la dosis inicial. En algunas modalidades, la composición proporcionada se administra en una dosis de refuerzo cada año, cada 2 años, 3 años, 4 años, 5 años, 6 años, 7 años, 8 años, 9 años o 10 años.

En ciertas modalidades, las composiciones proporcionadas pueden formularse para suministro de manera parenteral, e.g., por medio de inyección. En tales modalidades, la administración puede ser, por ejemplo, intravenosa, intramuscular, intradérmica, o subcutánea, o a través de técnicas de infusión o inyección son agujas. En ciertas modalidades, las composiciones pueden formularse para suministro peroral, suministro oral, suministra intranasal, suministro bucal, suministro sublingual, suministro transdérmico, suministro transcutáneo, suministro intraperitoneal , suministro intravaginal , suministro rectal o suministro intracraneal.

Ej emplos Los siguientes ejemplos describen algunos modos ejemplares para producir y llevar a la práctica ciertas composiciones que se describen en la presente. Debe entenderse que estos ejemplos son solamente para propósitos ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de las composiciones y métodos descritos en la presente.

Ejemplo 1: Construcción de Plásmidos de Expresión de ADN Este ejemplo describe el desarrollo de plásmidos de expresión y construcciones para la expresión de secuencias del gen de HCMV recombinante (e.g., secuencias del gen de fusión gB, gB-G, gH-G y Gag/pp65) . El plásmido de expresión estándar consiste generalmente de una secuencia promotora de origen mamífero, una secuencia de intrón, una secuencia de señal de poliadenilación (PolyA) , un origen pUC de la secuencia de replicación (pUC - pBR322 es un origen/sitio de inicio de la replicación colEl y se utiliza para replicar plásmidos en bacterias tales como E. coli (CH5a) ) , y un gen de resistencia al antibiótico como marcador seleccionable para la selección de placa de plásmido. Dentro del plásmido que sigue al intrón se encuentra una variedad de sitios de enzima de restricción que pueden utilizarse para empalmarse en un gen o secuencia de gen parcial de interés.

El plásmido de expresión Propol II contiene el pHCMV (promotor temprano para HCMV) , un intrón beta-globina (intrón BGL) , una secuencia de señal de poliadenilación de globina de conejo (PolyA) , un origen pUC de la secuencia de replicación (pUC - pBR322 es un origen/sitio de inicio de la replicación de colEl y se utiliza para replicar plásmidos en bacterias tales como E. coli (DH5o¡) ) ) , y un gen de resistencia a ampicilina ß-lactamasa (Amp R - el marcador seleccionable para plásmido confiere resistencia a la ampicilina) (100 g/ml) (Figura 1A) .

La Figura IB representa plásmidos de expresión recombinantes ejemplares. Por ejemplo, para desarrollar una construcción de expresión pHCMV-Gag MMLV ("MLV-Gag"), una secuencia de ADN complementario (ADNc) que codifica para una poliproteína Gag de MMLV (Gag sin su secuencia Pol de terminal C) se clonó en un vector de expresión Propol II (pHCMV) . Para desarrollar una construcción de expresión gB ("gB"), la secuencia de longitud total de gB se optimizó por codón para expresión humana (GenScript) y se clonó en un vector de expresión Propol II incluyendo la porción extracelular, el dominio de transmembrana (TM) y la porción citoplásmica (Cyto) de gB. Para desarrollar una construcción - - de expresión gH-G ("gH-G"), la secuencia truncada de gH que codifica solamente para la porción extracelular se fusionó junto con las porciones TM y Cyto de VDV-G y se optimizó por codón para expresión humana (GenScript) y se clonó en un vector de expresión Propol II. De manera similar, para desarrollar una construcción de expresión gB-G ("gB-G"), la secuencia truncada de gB que codifica solamente para la porción extracelular se fusionó junto con las porciones TM y Cyto de VSV-G y se optimizó por codón para expresión humana (GenScript) y se clonó en un vector de expresión Propol II. Para desarrollar una construcción de expresión Gag/pp65 ("Gag/pp65") una secuencia que codifica para la poliproteína Gag de MMLV (Gag sin su secuencia Pol de terminal C) se fusionó con la secuencia de longitud total de pp65 y se optimizó por codón para expresión humana (GenScript) y se clonó en un vector de expresión Propol II.

Los plásmidos de ADN se amplificaron en E. coli competente (DH5 ) y se purificaron con equipos de preparación sin endotoxina de acuerdo con los protocolos estándar.

Ejemplo 2: Producción de Partículas Tipo Virus (VLPs) Este Ejemplo describe métodos para la producción de partículas tipo virus (VLPs) que contienen diversos antígenos de HCMV recombinante descritos en el Ejemplo 1.

Se transíectaron transitoriamente células HEK 293T (ATCC, CRL-11268) utilizando métodos de fosfato de calcio con un plásmido de expresión de ADN MMLV-Gag y se co-transfectaron con un plásmido de expresión de ADN ya sea gB o gB-G (datos no mostrados) o gH-G. Alternativamente las células se transíectaron con un plásmido de expresión de ADN Gag/pp65 y se co-transfectaron con un plásmido de expresión de ADN ya sea gB o gB-G (datos no mostrados) o gH-G. Se apreciará que las células pueden transíectarse con un plásmido de expresión de ADN MMLV-Gag y co-transfectarse con un plásmido de expresión de ADN tanto gB como gH-G o tanto gB-G como gH-G. La expresión de varios antígenos de HCMV mediante las células HEK 293 se confirmó mediante citometría de flujo (Figura 2A) . Después de 48 a 72 horas de transíección, los sobrenadantes conteniendo las VLPs se cosecharon y se filtraron a través de membranas de tamaño d poro de 0.45 µp? y se concentraron y se purificaron adicionalmente mediante ultra-centrifugación a través de una almohadilla de sacarosa al 20% e un rotor Beckman SW32 (25,000 rpm, 2 horas, 4°C) . Los gránulos se re-suspendieron en PBS estéril sin endotoxina (GIBCO) para obtener reservas de VLP 500 veces concentradas. El total de proteínas se determinó en un alícuota mediante un equipo de cuantificación de análisis Bradford (BioRad) . Las VLPs purificadas se almacenaron a -80°C hasta su uso. Cada lote de VLPs purificadas se analizó por la expresión de la proteína de fusión MMLV-Gag, gB, gH-G y/o MMLV-Gag/pp65 mediante SDS-Page e inmunoanálisis Western con anticuerpos específicos para gB (anticuerpo monoclonal de ratón CH 28 para gB; Virusys Corporation; Pereira L et al., 1984 Virology 139:73-86), gH-G (anticuerpo monoclonal de ratón para en anticuerpo P5D4 de etiqueta anti-VSV-G; Abcam pie) y pp65 (anticuerpo monoclonal de ratón CH12 para UL83/pp65; Virusys Corporation; Pereira L et al., 1982 Infect Immun 36:924-932) (Figura 2B) . Los anticuerpos se detectaron utilizando quimioluminiscencia mejorada (ECL) .

Ejemplo 3: Caracterización Físico-química de Partículas Tipo Virus (VLPs) El análisis físico-químico de las VLPs incluyó la determinación de tamaño y la evaluación del índice de polidispersión utilizando un Malvern Instrument Zeta-Sizer serie (ZEN3600) . Los resultados ejemplares obtenidos del análisis de nano-dimensionado se muestran en las Figuras 3A y 3B. Una composición de VLP ejemplar (composición de VLP bivalente gH-G/pp65) se produjo en dos laboratorios diferentes utilizando los mismos vectores de expresión recombinante y ambas preparaciones de VLP proporcionaron un tamaño promedio de partícula de 150 a 180 nm de diámetro. Esto es consistente con el tamaño de un virión de C V que se reporta de 150 a 200 nm en dimensión (1997 J Pathol 182: 273-281). EL bajo índice de polidispersión (Pdl) de 0.214 a 0.240 indica la homogeneidad del producto o una estrecha distribución de tamaño.

Ejemplo 4: Inmunogenicidad y Actividad de Neutralización de VLPs en Ratones Las composiciones de VLP preparadas como se describió en el Ejemplo 2 se probaron en ratones hembra BALB/C de 6 a 8 semanas de edad (mínimo de 6 animales por grupo de prueba) . Se inmunizó a los ratones de manera intraperitoneal con 200 µ? de composiciones de VLP dos veces, una vez en el día 0 (preparación) y una vez en el día 56 (refuerzo de la semana 8) . Se trató a los ratones con 10 µg, 25 g o 50 g (total de proteína) de una composición de VLP bivalente gB-Gag/pp65, bivalente gH-G/Gag/pp65 o trivalente gB/gH-G/Gag/pp65. Para evaluar las respuestas inmunes humorales en los ratones, se recolectó sangre de todos los ratones en los grupos de estudio previo a la inmunización y después de la 1" y 2a inmunizaciones en las semanas 0, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 10, 12, y 14. El diseño del estudio se resume en la Tabla 1.

Tabla 1 Se llevó a cabo un análisis inmuno-absorbente enlazado a enzimas (ELISA) utilizando placas de ELISA comercialmente disponibles (IBL International) , recubiertas con Usados derivados de células MRC-5 infectadas con la cepa AD169 de HC V. El lisado de HCMV comercial crudo que contiene todos los antígenos relacionados con CMV y es útil para detectar las respuestas inmunes de IgG, se utilizó como un control positivo para determinar el contenido de IgG de HCMV en el suero de ratón mediante ELISA. Se incubaron diluciones seriales de suero de ratón (dilución en TBS-T/BSA/DMEM FCS al 10%) con las placas recubiertas durante 2 horas a temperatura ambiente . Después de lavar las placas , se agregó anticuerpo secundario conjugado de peroxidasa de rábano (HRP) anti-ratón a una dilución de 1/10,000 y se incubaron durante 1 hora seguido por la adición de solución de sustrato de tetrametilbencidina (TMB) . La reacción se detuvo mediante la adición de 1 N de HC1 y se leyó la absorbencia a 450 nm en un lector de placa de micro-pozos ELISA. La Figura 4 muestra evidencia de anticuerpos persistentes y fuerte reforzamiento de los ratones después de la 2a inmunización a 8 semanas para cada una de las composiciones de VLP bivalentes y trivalentes.

Las respuestas del anticuerpo neutralizante al HCMV se determinaron utilizando un análisis de micro-neutralización. Una cantidad estándar de la cepa VR1814 de HCMV (una cepa de CMV trópica a la célula endotelial -Revello MG et al., J Gen Virol 82:1429-1438) se diluyó con el medio de infección (DME conteniendo FBS inactivado con calor al 1%, mezcla de aminoácidos al 1%, penicilina-estreptomicina al 1% y PBS libre de Ca+2 y Mg+2) , y se agregó a un volumen igual de diluciones seriales del suero de prueba inactivado con calor y se incubó durante 1 hora a 37°C en un rotador. Las mezclas de suero/HCMV se agregaron a fibroblastos de prepucio humano (HFF) o células epiteliales retínales pigmentadas (células ARPE-19) cultivadas en portaobjetos en placas de cultivo de tejido de 24 pozos y se incubaron durante 2 horas a 37°C, C02 5%. Las placas se lavaron con PBS dos veces y después se cultivaron durante 48 horas a 37 °C, C02 5%. Las células se fijaron con paraformaldehído al 4%, se hicieron reaccionar con un anticuerpo monoclonal anti-IE1 (anticuerpo monoclonal de ratón CH160 para IEl/2 o anticuerpo monoclonal CG443 para IE1; Virusys Corporation) durante 1 hora a temperatura ambiente seguido por anticuerpo de cabra anti-ratón etiquetado con FITC durante 45 minutos a temperatura ambiente . El número de células que expresaron IE1 se determinó mediante microscopía fluorescente. El suero de ratón depositado (dilución de 1:6) se probó por su actividad de neutralización en cada punto de tiempo del sangrado (0, 3, 6, 8 y 9 semanas) por duplicado. La Figura 5 muestra la inducción de anticuerpos neutralizantes en ratones (analizada en células de fibroblasto) después de la 2a inmunización a las 8 semanas para cada una de las composiciones de VLP bivalentes y trivalentes. La Figura 6 muestra la inducción de anticuerpos neutralizantes en ratones (analizada en células epiteliales) después de la 2a inmunización a las 8 semanas para cada una de las composiciones de VLP bivalentes.

En otro estudio, las composiciones monovalentes de VLP de gB-G preparadas como se describió en el Ejemplo 2 se probaron en ratones hembra BALB-C de 6 a 8 semanas de edad (un mínimo de 8 animales por grupo de prueba) . Se inmunizó a los ratones de manera intraperitoneal con 200 µ? de composiciones de VLP dos veces, una vez en el día 0 (preparación) y una vez en el día 56 (refuerzo de la semana 8) . Se trató a los ratones con cantidades equivalentes de 20 pg, del contenido de gB (determinadas por ELISA) por inyección. Para evaluar las respuestas inmunes humorales en los ratones, se recolectó sangre de todos los ratones en los grupos de estudio previo a la Ia inmunización y después de la Ia inmunización a las 3 y 6 semanas y previo a la 2 a inmunización a las 8 semanas y después posterior a la 2 a inmunización a las 9 semanas desde el inicio del estudio. El diseño del estudio se resume en la Tabla 2.

Tabla 2 Las respuestas del anticuerpo neutralizante al HCMV se determinaron utilizando un análisis de micro- neutralización en células de fibroblasto en base a un virus de HCMV (TB40) que expresa una proteína verde fluorescente (GFP) y un análisis de citometría de flujo de células HFF infectadas (CFP+) . Para evaluar la presencia de los anticuerpos neutralizantes en muestras de suero, el suero de pre- incubó con HCMV que expresa GFP durante un período de tiempo suficiente para que los anticuerpos neutralizantes reduzcan la infectividad del HCMV. Diluciones seriales de la mezcla de suero pre- incubada y HCMV se utilizaron para hacer contacto con la célula huésped (fibroblasto o epitelial) susceptible a infección por HCMV. El número de células que expresan la construcción del gen informante (GFP) se determinó mediante citometría de flujo para calcular la titulación infecciosa de la preparación del virus. La Figura 7 representa las valoraciones del anticuerpo neutralizante para ratones inmunizados dos veces en la semana 0 y 8 con VLPs de gB-G contra gB recombinante . El suero recolectado pre y post inmunización como se describe se depositó y se probó en relación a una hiperglobulina CMV de control positivo, Cytogam TM, en presencia de un complemento de conejillo de indias al 10%. Como se muestra en la Figura 7, la composición de VLP de gB-G monovalente obtuvo una neutralización más rápida y potente de la infección de células de fibroblasto de la que se obtuvo por una proteína de gB recombinante .

Como puede observarse (o como se apreciará por los expertos en la técnica habiendo leído la presente especificación) , los datos demuestran, entre otras cosas, una actividad sorprendentemente buena de las VLPs, tal como de las VLPs que incluyen gB-G en comparación con el gB recombinante .

En otro estudio, las composiciones de VLP de gB/Gag/pp65 bivalente preparadas como se describe en el Ejemplo 2 se probaron en ratones BALB/C de 6 a 8 semanas de edad (un mínimo de 4 animales por grupo de prueba) . Se inmunizó a los ratones de manera intraperitoneal con 200 µ? de composiciones de VLP dos veces, una en el día 0 (preparación) y una en el día 56 (refuerzo en la semana 8) . Se trató a los ratones con VLPs de gB/Gag/pp65 bivalente y se recolectaron los esplenocitos 14 días después . Las células T CD8+ enriquecidas se estimularon (relación de 1:5) con los esplenocitos transíectados durante 24 horas con plásmidos que codifican para Gag/pp65 o Gag para determinar las frecuencias de CTLs dirigidas contra pp65 o Gag. Las frecuencias de CTL se determinaron en base a la declinación de CFSE, seleccionando células T CD3+ CD8+. (Figura 8A) El diagrama de dispersión muestra la frecuencia de proliferación de CTLs específicos para pp65 después de sustraer las respuestas dirigidas contra Gag (Figura 8B) . Como se representa en la Figura 8A-B, las VLPs de gB/Gag/pp65 bivalentes produjeron CTLs específicos para pp65 en ratones inmunizados.

Ejemplo 5: Inmunogenicidad y Actividad de Neutralización de VLPs en Conejos Las composiciones de VLP de gB/Gag/pp65 y gH- G/Gag/pp65 bivalentes preparadas como se describe en el Ejemplo 2 se probaron en conejos blancos de Nueva Zelanda de 6 a 8 semanas de edad (un mínimo de 6 animales por grupo de prueba) . Se inmunizó a los conejos de manera intramuscular con 0.5 mi de composiciones de VLP tres veces, una en el día 0 (preparación) y una en el día 56 (refuerzo a la semana 8) y una vez en el día 168 (refuerzo a la semana 24) . Se trató a los conejos con 25 pg o 50 o 100 g (total de proteína) de la composición ya sea gB/Gag/pp65 bivalente, gH-G/Gag/pp65 bivalente o gB/gH-G/Gag/pp65 trivalente (gB/Gag/pp65 y gH-G/Gag/pp65 bivalentes mezclados entre sí a una relación de 1:1). Para evaluar las respuestas inmunes humorales en los conejos, se recolectó sangre de todos los conejos en los grupos de estudio previo a la Ia inmunización y después de la Ia inmunización a las 2, 4, 6 y 8 semanas y posterior a la 2* inmunización a las 10, 13, 16, 20 y 24 semanas desde el inicio del estudio y después posterior a la 3a inmunización a las 26 y 28 semanas desde el inicio del estudio. El diseño del estudio se resume en la Tabla 3.

Tabla 3 El suero individual de conejo se probó por reactividad contra el antígeno de gB recombinante mediante ELISA (trazado en el eje izquierdo de la Figura 9) . La respuesta del anticuerpo neutralizante al HCMV se determinó utilizando un análisis de micro-neutralización en células de fibroblasto en base a un virus de CMV que expresa GFP (TB40) y un análisis de citometría de flujo de células HFF infectadas (GFP+) como se describe en el Ejemplo 4 (trazado en el eje derecho de la Figura 9) . El suero de conejo recolectado pre y post inmunización como se describe se depositó y se probó por su actividad de neutralización en presencia de complemento contra HCMV que expresa GFP en fibroblastos de HFF en relación con una hiperglobulina de CMV de control positivo, Cytogam TM. Las valoraciones del punto de extremo se trazaron y representan una reducción del 50% en células infectadas con CMV en relación con el suero igualado previo a la inmunización (trazado en el eje izquierdo en la Figura 9). 50,000 células se recolectaron durante el análisis de citometría de flujo de células infectadas (GFP+) (trazado en el eje derecho en la Figura 9) . Como se muestra en la Figura 9, la composición de VLP de Gb/Gag/pp65 bivalente obtuvo respuestas de alta titulación de enlace (A) y alta titulación de anticuerpo neutralizante (B) en conejos contra la infección de células de fibroblasto.

También se probó el suero de conejo depositado por las respuestas del anticuerpo neutralizante al HCMV utilizando un análisis de micro-neutralización en células epiteliales en base a un virus de HCMV que expresa GFP (Towne TS15-rR) y un análisis de citometría de flujo de células ARPE-19 infectadas (GFP+) . El suero de conejo recolectado pre y post-inmunización como se describe se depositó y se probó por su actividad de neutralización en presencia de complemento contra HCMV que expresa GFP en células epiteliales ARPE-19 en relación a una hiperglobulina de CMV de control positivo, Cytogam TM. Como se muestra en la Figura 10, sorprendentemente, la combinación de la composición de VLP de gB/Gag/pp65 bivalente y gH-G/Gag/pp65 bivalente obtuvo una respuesta del anticuerpo neutralizante sinérgica y más rápida en conejos contra la invención de la célula epitelial, en relación a gB/Gag/pp65 o gH/Gag/pp65.

Como puede observarse (o como se apreciará por los expertos en la técnica habiendo leído la presente especificación) , los datos demuestran, entre otras cosas, una actividad sorprendentemente buena de las VLPs, tal como mediante una combinación de VLPs que incluyen gB/Gag/pp65 y VLPs que incluyen gH-G/Gag/pp65 incluso en comparación con VLPs que incluyen gB/Gag/pp65 o VLPs que incluyen gH-G/Gag/pp65.

Ejemplo 6: Producción y Purificación en Escala Ascendente de Partículas Tipo Virus (VLPs) Las VLPs se produjeron y se purificaron como sigue. Se transfectaron células CHO a una densidad celular entre 1.5 E06 y 2.0 E06 células/ml con los plásmidos seleccionados (preparados como se describe en el Ejemplo 1) a concentraciones y proporciones predeterminadas. Se agregó el producto de ADN para producir una concentración total de ADN de hasta 1 g/ml de cultivo celular. Los plásmidos utilizados para la transfección se purificaron primeramente mediante equipos de purificación de plásmido MaxiPrep o GigaPrep (Qiagen) . El PEIMAX utilizado para la transfección para suministrar el ADN a las células se proporcionó a una proporción de 6:1 (PEI :ADN peso/peso). Las células se cultivaron durante 72 horas y después los cultivos se centrifugaron a 4000 rpm durante 20 minutos utilizando un rotor JS-4 2A por Beckman Coulter en botellas de 1 litro. El sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0.8/0.45 ym (AcroPak 500 Capsule, Pall) . El sobrenadante del filtro se concentró después mediante filtración de flujo tangencial (TFF) y se diafiltró contra un amortiguador conteniendo histidina. El material diafiltrado se cargó sobre una columna de cromatografía de intercambio aniónico (AEX) en donde se recolectó el flujo continuo. El flujo continuo se filtró entonces de manera estéril a través de 0.45 µp? para alicuotarse en diferentes volúmenes.

El procedimiento de TFF implicó el saneamiento durante la noche de las membranas de RFF (Pellicon 2 Mini corte de 500 kDa, área de superficie 0.1 m2) en 0.5 M de NaOH fijándolas en paralelo en un alojamiento de acero inoxidable. Después de hacer correr agua a un pH neutro en la fracción retenida así como en el lado permeado, el amortiguador de fosfato (PBS) se utilizó para equilibrar la membrana. El sobrenadante se cargó entonces en el circuito de recirculación de la fracción retenida de TFF. La presión de entrada inicial fue de 10.5 psi a una tasa de flujo de permeado de 400 ml/min que se redujo a aproximadamente 200 ml/min al final de la concentración. Después de la concentración a aproximadamente 10 a 20 veces, se realizó una diafiltración con 5 volúmenes de 20 mM de histidina + 150 mM de NaCl, pH 5.5. El material diafiltrado se recolectó y se enjuagó con un volumen igual de amortiguador de his después de recircularse durante otros 5 minutos con el flujo de permeado cerrado. La fracción retenida se recolectó y se depositó con la fracción retenida previamente recolectada. Para mantener la funcionalidad de las membranas, las membranas se enjuagaron con PBS durante 10 minutos; con 0.5 M de NaOH durante 40 minutos (después de hacer fluir 200 mi para desechar el permeado y la fracción retenida) ; y finalmente con agua a un pH neutro en la fracción retenida y el permeado. Las membranas se almacenaron entonces en 0.1 M de solución de NaOH en un refrigerador.

Se utilizó cromatografía de columna AEX para reducir el contenido de ADN utilizando una columna HP de sefarosa HiLoad 16/10 de 20 mi a una tasa de flujo de 1.6 ml/min para equilibrar con amortiguador de equilibrio (20 mM de histidina + 150 mM de NaCl, pH 5.5) y una tasa de flujo de 3.2 ml/min para las etapas de carga, lavado y retiro. Se llevaron a cabo procedimientos de limpieza a 0.8 ml/min. Se utilizó un registrador de gráfica para monitorear la absorbencia UV a 280 nm. Se utilizó un sistema de cromatografía Gradifrac (GE Healthcare) , que se saneó antes del uso. Primeramente, se retiró el etanol (20% v/v presente en la columna como amortiguador de almacenamiento) de la columna utilizando 5 volúmenes de columna de agua Super Q (baja en endotoxinas) . El amortiguador de equilibrio se pasó por 5 volúmenes de columna, seguido por 5 volúmenes de columna del amortiguador de retiro (20 mM de histidina + 1000 mM de NaCl, pH 5.5) para acondicionar la columna. E amortiguador de equilibrio se pasó por 5 volúmenes de columna de nuevo para preparar la columna para carga. La carga se llevó a cabo a 3.2 ml/min, después de lo cual la columna se lavó con 5 volúmenes de columna del amortiguador de equilibrio, o hasta observar la línea de base. El flujo continuo se recolectó desde el inicio del pico UV hasta la caída del pico UV a aproximadamente 10% de la altura del pico máximo de absorbencia UV durante la carga del material . Después la columna se limpió mediante 5 volúmenes de columna del amortiguador de retiro (20 mM de histidina + 1000 mM de NaCl, pH 5.5) y se recolectó el pico. A esto le siguieron 5 volúmenes de columna de otro amortiguador de retiro (20 mM de histidina + 2000 mM de NaCl, pH 5.5) para retirar cualquier proteína y ácido nucleico fuertemente enlazados y se recolectó el pico. Después se limpió la columna con 1 M de NaOH para retirar cualquier proteína precipitada a 0.8 ml/min para 4 volúmenes de columna. La columna se enjuagó después con agua a 0.8 ml/min hasta un pH neutro (normalmente de 4 a 5 volúmenes de columna) . La columna se pasó entonces por etanol al 20% (4 volúmenes de columna a 0.8 ml/min) para retirar cualquier lipoproteína o lípido (2 volúmenes de columna) . En esta etapa la columna se almacenó o se enjuagó con agua (4 volúmenes de columna) para reiniciar el ciclo para un segundo lote .

La Figura 11A-B representa imágenes de una VLP monovalente de gB-G purificada producida a partir de células CHO y después sometida a métodos de purificación de TFF (Figura 11A) y a AEX (Figura 11B) seguido por métodos analíticos de microscopía de electrón de manchado negativo. Como se muestra en la Figura 11A-B, se encuentran presentes VLPs monovalentes de gB-G intactas después de la purificación de TFF (Figura 11A) y AEX (Figura 11B) .

Ejemplo 7: Inmunogenicidad y Actividad de neutralización de las VLPs Purificadas en Conejos Las composiciones de VLP de gB monovalentes preparadas como se describe en el Ejemplo 6 se probaron en conejos blancos de Nueva Zelanda de 6 a 8 semanas de edad (un mínimo de 6 animales por grupo de prueba) . Se inmunizó a los conejos de manera intramuscular con 0.5 mi (contenido de gB 50 g) de composiciones de VLP tres veces, una en el día 0 (preparación) y una en el día 56 (refuerzo a la semana 8) y una vez en el día 168 (refuerzo a la semana 24) . Para evaluar las respuestas inmunes humorales en los conejos, se recolectó sangre de todos los conejos en los grupos de estudio previo a la Ia inmunización y después de la Ia inmunización a las 2, 4, 6 y 8 semanas y posterior a la 2" inmunización a las 10, 13, 16, 20 y 24 semanas desde el inicio del estudio. El diseño del estudio se resume en la Tabla 4.

Tabla 4 Figura 12 representa la potente neutralización de la infección de células de fibroblastos que se obtuvo mediante el suero proveniente de los conejos inmunizados con VLPS monovalentes de gB-G producidas por células CHO purificadas mediante TFF/AEX ("eVLPs de gB" en la Figura 12) . Esta neutralización fue superior a la lograda con hiperglobulina de CMV de control positivo, Cytogam TM. La Figura 12 también incluye los datos de la titulación de neutralización publicados para la vacuna Towne y la vacuna de subunidad de gB adyuvante (gB + MF59 TM) (Cui X et al., 2008 Vaccine 26:5760-5766).

La Figura 13 ilustra la potente neutralización de la infección de células epiteliales que se obtuvo mediante el suero proveniente de los conejos inmunizados con VLPs monovalentes de gB-G producidas por células CHO purificadas mediante TFF/AEX ("eVLPs de gB" en la Figura 13) . Esta neutralización fue comparable a la lograda con hiperglobulina de CMV de control positivo, Cytogam TM. La Figura 13 también incluye los datos de la titulación de neutralización publicados para la vacuna Towne y la vacuna de subunidad de gB adyuvante (gB + MF59 TM) (Cui X et al., 2008 Vaccine 26:5760-5766).

La Figura 14 representa el índice de avidez de los anticuerpos obtenidos en conejos inmunizados con composiciones de VLP monovalente de gB-G producidas por células CHO purificadas mediante TFF/AEX. El suero de conejo depositado y una hiperglobulina de CMV de control positivo, Cytogam TM, se diluyeron a 1:600,000 y se probaron contra el antígeno gB recombinante de longitud total mediante ELISA en presencia o ausencia de 5 M de urea. La avidez del anticuerpo se determinó como se describió previamente (Marshall BC y Adler S 2003 Viral Immunol 16: 491-500). Como se muestra en la Figura 14 , se obtuvo una rápida inducción de los anticuerpos neutralizantes de alta avidez en conejos mediante inmunización con VLPs monovalentes de gB-G producidas por células CHO purificadas mediante TFF/AEX. Se logró la máxima avidez del anticuerpo después de dos inmunizaciones con la VLP de gB-G.

Otras Modalidades Otras modalidades de la descripción serán aparentes para los expertos en la técnica a partir de la consideración de la especificación o la práctica de la descripción descrita en la presente. Se pretende que la especificación y ejemplos se consideres solamente ejemplares, siendo indicado el alcance real de la descripción por las siguientes reivindicaciones. El contenido de cualquier referencia referida en la presente se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad.

Breve Descripción de la Lista de Secuencias La SEQ ID NO. 1 representa una secuencia de aminoácidos de Gag de MMLV.

La SEQ ID NO: 2 representa una secuencia de nucleótidos de Gag de MMLV.

La SEQ ID NO: 3 representa una secuencia de nucleótido de Gag de MMLV optimizada por codón.

La SEQ ID NO: 4 representa una secuencia de aminoácidos de Gag de MMLV- pp65 de CMV.

La SEQ ID NO: 5 representa una secuencia de nucleótidos de Gag de MMLV- pp65 de CMV.

La SEQ ID NO: 5 representa una secuencia de nucleótidos de Gag de MMLV- pp65 de CMV optimizada por codón.

La SEQ ID NO: 7 representa una secuencia de aminoácidos de gB de HCMV.

La SEQ ID NO: 8 representa una secuencia de nucleótidos de gB de HCMV.

La SEQ ID NO: 9 representa una secuencia de nucleótidos de gB de HCMV optimizada por codón.

La SEQ ID NO: 10 representa una secuencia de aminoácidos de gB-G de HCMV.

La SEQ ID NO: 11 representa una secuencia de nucleótidos de gB-G de HCMV.

La SEQ ID NO: 12 representa una secuencia de nucleótidos de gB-G de HCMV optimizada por codón.

La SEQ ID NO: 13 representa una secuencia de aminoácidos de gH de HCMV.

La SEQ ID NO: 14 representa una secuencia de nucleótidos de gH de HCMV.

La SEQ ID NO: 15 representa una secuencia de nucleótidos de gH de HCMV optimizada por codón.

La SEQ ID NO: 16 representa una secuencia de aminoácidos de gH-G de HCMV.

La SEQ ID NO: 17 representa una secuencia de nucleótidos de gH-G de HCMV.

La SEQ ID NO: 18 representa una secuencia de nucleótidos de gH-G de HCMV optimizada por codón.

La SEQ ID NO: 19 representa una secuencia de nucleótidos de plásmido de expresión Propol II.

La SEQ ID NO: 20 representa una secuencia de nucleótidos de gB TM/CTD de gH de HCMV-gB de HCMV.

La SEQ ID NO: 21 representa una secuencia de nucleótidos de Gag de MMLV optimizada por codón.

La SEQ ID NO: 22 representa una secuencia de nucleótidos de Gag de MMLV-pp65 de CMV optimizada por codón.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una partícula tipo virus (VLP) que comprende: un primer polipéptido que es un polipéptido gag del virus de leucemia murina (MLV) en el cual su secuencia de aminoácidos incluye una porción de al menos 100, 200, 300 o más aminoácidos de longitud que muestra al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad con una porción de auto-ensamble de una proteína Gag de MLV de referencia que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 1; y un segundo polipéptido cuya secuencia de aminoácidos incluye un epítope reconocido por uno o más anticuerpos que se enlazan a la proteína de citomegalovirus humano (HCMV) .

2. La VLP de la reivindicación 1, en donde el segundo polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que incluye un epítope reconocido por uno o más anticuerpos para una proteína de glicoproteína B (gB) de HCMV.

3. La VLP de la reivindicación 1, en donde el segundo polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que incluye un epítope reconocido por uno o más anticuerpos para una proteína de glicoproteína H (gH) de HCMV.

4. La VLP de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el segundo polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que comprende un dominio de transmembrana, uno citoplásmico, o ambos.

5. La VLP de la reivindicación 4 , en donde el dominio de transmembrana no se encuentra en la naturaleza en la proteína de HCMV.

6. La VLP de la reivindicación 4 , en donde el dominio de transmembrana se encuentra en la naturaleza en una proteína del virus de estomatitis vesicular (VSV) .

7. La VLP de la reivindicación 4 , en donde el dominio de transmembrana tiene una secuencia de aminoácidos diferente a la encontrada en la SEQ ID NO: 7 y la SEQ ID NO: 13.

8. La VLP de la reivindicación 4, en donde el dominio de transmembrana tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de, el dominio de transmembrana encontrado en la SEQ ID NO: 7, el dominio de transmembrana encontrado en la SEQ ID NO: 13, y el dominio de transmembrana encontrado en la SEQ ID NO: 16.

9. La VLP de la reivindicación 4 , en donde el dominio de transmembrana tiene una secuencia de aminoácidos de los residuos 752 a 795 de la SEQ ID NO: 10.

10. La VLP de la reivindicación 4, en donde el dominio de transmembrana tiene una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 2152-2622 de la SEQ ID NO: 20.

11. La VLP de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10, en donde el segundo polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que incluye 1) un epítope encontrado en la SEQ ID NO: 13; y 2) una secuencia de aminoácidos que comprende un dominio de transmembrana de los residuos 752 a 795 de la SEQ ID NO: 10.

12. La VLP de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10, en donde el segundo polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que incluye 1) un epítope encontrado en la SEQ ID NO: 13; y 2) una secuencia de aminoácidos que comprende un dominio de transmembrana de una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 2152 a 2622 de la SEQ ID NO: 20.

13. La VLP de las reivindicación 11 o la reivindicación 12, en donde el segundo polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que incluye una o más secuencias encontradas en la SEQ ID NO: 13 además del epítope, en donde las una o más secuencias no incluyen un dominio de transmembrana completo.

14. La VLP de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde el primer polipéptido es o comprende una proteína de fusión.

15. La VLP de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde el segundo polipéptido es o comprende una proteína de fusión.

16. Un polipéptido de transmembrana de gH modificado.

17. El polipéptido de la reivindicación 16, que comprende un dominio extracelular de terminal N de una proteína de gH encontrada en HCMV.

18. El polipéptido de la reivindicación 16 o la reivindicación 17, que comprende un dominio de transmembrana, uno citoplásmico, o ambos.

19. El polipéptido de la reivindicación 18, en donde el dominio de transmembrana, el dominio citoplásmico o ambos no se encuentran en la naturaleza en la proteína de gH.

20. El polipéptido de la reivindicación 18, en donde el dominio de transmembrana, el dominio citoplásmico o ambos se encuentran en la naturaleza en una proteína de VSV.

21. El polipéptido de la reivindicación 19, en donde el dominio de transmembrana, el dominio citoplásmico o ambos se encuentran en la naturaleza en una proteína de gB.

22. El polipéptido de la reivindicación 16, que comprende la SEQ ID NO: 16.

23. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22, en donde el polipéptido se encuentra presente en una VLP.

24. Un polinucleótido que codifica para el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22.

25. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 24.

26. Una partícula tipo virus (VLP) que comprende un polipéptido que comprende un epítope de una proteína de gB encontrada en HCMV.

27. La VLP de la reivindicación 26, en donde el polipéptido comprende un dominio extracelular de terminal N de una proteína de gB encontrada en HCMV.

28. La VLP de la reivindicación 26 o la reivindicación 27, en donde el polipéptido comprende un dominio de transmembrana, un dominio citoplásmico, o ambos.

29. La VLP de la reivindicación 28, en donde el dominio de transmembrana, el dominio citoplásmico o ambos no se encuentran en la naturaleza en la proteína de gB.

30. La VLP de la reivindicación 28, en donde el dominio de transmembrana, el dominio citoplásmico o ambos se encuentran en la naturaleza en una proteína de VSV.

31. La VLP de la reivindicación 26, en donde el polipéptido comprende la SEQ ID NO : 7.

32. La VLP de la reivindicación 30, en donde el polipéptido comprende la SEQ ID NO: 10.

33. Una proteína de fusión que comprende: a) un primer polipéptido que es un polipéptido gag de MLV en el cual su secuencia de aminoácidos incluye una porción de al menos 100, 200, 300 o más aminoácidos de longitud que muestra al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad con una porción de auto-ensamble de una proteína Gag de MLV de referencia que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 1; y b) un segundo polipéptido que es un polipéptido pp65 de HC V que comprende un epítope de pp65 en el cual su secuencia de aminoácidos incluye una porción de al menos 100, 200, 300 o más aminoácidos de longitud que muestra al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad con una proteína pp65 de referencia que tiene una secuencia de aminoácidos de los residuos 539 a 1099 de la SEQ ID NO. 4.

34. Una partícula tipo virus (VLP) que comprende una proteína de fusión que comprende: a) un primer polipéptido que es un polipéptido gag de MLV en el cual su secuencia de aminoácidos incluye una porción de al menos 100, 200, 300 o más aminoácidos de longitud que muestra al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad con una porción de auto-ensamble de una proteína Gag de MLV de referencia que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 1; y b) un segundo polipéptido que es un polipéptido pp65 de HCMV que comprende un epítope de pp65 en el cual su secuencia de aminoácidos incluye una porción de al menos 100, 200, 300 o más aminoácidos de longitud que muestra al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad con una proteína pp65 de referencia que tiene una secuencia de aminoácidos de los residuos 539 a 1099 de la SEQ ID NO. 4.

35. Una partícula tipo virus (VLP) que comprende: un primer polipéptido que comprende un epítope de una proteína de gB encontrada en HCMV; y un segundo polipéptido que comprende un polipéptido de transmembrana de gH modificado.

36. La VLP de la reivindicación 35, en donde el primer polipéptido comprende un dominio extracelular de terminal N de una proteína de gB encontrada en HCMV.

37. La VLP de la reivindicación 36, en donde el primer polipéptido comprende un dominio de transmembrana, un dominio citoplásmico, o ambos.

38. La VLP de la reivindicación 37, en donde el dominio de transmembrana, el dominio citoplásmico, o ambos no se encuentran en la naturaleza en la proteína de gB.

39. La VLP de la reivindicación 38, en donde el dominio de transmembrana, el dominio citoplásmico, o ambos se encuentran en la naturaleza en una proteína de VSV.

40. La VLP de la reivindicación 35, en donde el primer polipéptido comprende la SEQ ID NO: 7.

41. La VLP de la reivindicación 39, en donde el primer polipéptido comprende la SEQ ID NO: 10.

42. La VLP de la reivindicación 35, en donde el segundo polipéptido comprende un dominio extracelular de terminal N de una proteína de gH encontrada en HCMV.

43. La VLP de la reivindicación 35 o 42, en donde el segundo polipéptido comprende un dominio de transmembrana, un dominio citoplásmico, o ambos.

44. La VLP de la reivindicación 43, en donde el dominio de transmembrana, el dominio citoplásmico o ambos no se encuentran en la naturaleza en la proteína de gH.

45. La VLP de la reivindicación 43, en donde el dominio de transmembrana, el dominio citoplásmico o ambos se encuentran en la naturaleza en una proteína de VSV.

46. La VLP de la reivindicación 35, en donde el segundo polipéptido comprende la SEQ ID NO: 16.

47. Una partícula tipo virus (VLP) que comprende: una proteína de fusión que comprende: a) un primer polipéptido que es un polipéptido gag de MLV en el cual su secuencia de aminoácidos incluye una porción de al menos 100, 200, 300 o más aminoácidos de longitud que muestra al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad con una porción de auto-ensamble de una proteína Gag de MLV de referencia que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 1; y b) un segundo polipéptido que es un polipéptido pp65 de HCMV que comprende un epítope de pp65 en el cual su secuencia de aminoácidos incluye una porción de al menos 100, 200, 300 o más aminoácidos de longitud que muestra al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad con una proteína pp65 de referencia que tiene una secuencia de aminoácidos de los residuos 539 a 1099 de la SEQ ID NO. 4; un epítope de una segunda proteína encontrada en HCMV.

48. La VLP de la reivindicación 47, en donde la proteína de fusión se dispone y se construye de tal manera que se auto-ensambla para formar la VLP de modo que el epítope pp65 se coloca en el interior de la VLP.

49. La VLP de la reivindicación 47 o la reivindicación 48, que se dispone y construye de tal manera que el segundo epítope de la proteína de HCMV se coloca en la superficie de la VLP.

50. Una VLP que comprende: una proteína de fusión que comprende una porción de terminal N de una proteína Gag encontrada en MVL fusionada corriente arriba de un epítope de una proteína pp65 encontrada en HCMV; y un polipéptido que comprende un epítope de una proteína de gB encontrada en HCMV.

51. La VLP de la reivindicación 50, en donde la porción de terminal N de la proteína Gag no comprende una secuencia de polimerasa de terminal C encontrada en MLV.

52. La VLP de la reivindicación 50 o la reivindicación 51, en donde la porción de terminal N de la proteína Gag comprende los residuos 1 a 538 de la proteína de longitud total .

53. La VLP de cualquiera de las reivindicaciones 50 a 52, en donde el epítope de la proteína de gB se encuentra en la proteína de gB de longitud total .

54. La VLP de cualquiera de las reivindicaciones 50 a 52, en donde el epítope de la proteína de gB se reconoce por un anticuerpo que se enlaza a un epítope en la gB de longitud total .

55. La VLP de cualquiera de las reivindicaciones 50 a 52, en donde el epítope de la proteína de gB se reconoce por un anticuerpo que se enlaza a un epítope en la SEQ ID NO: 7.

56. La VLP de cualquiera de las reivindicaciones 50 a 52, en donde el polipéptido que comprende un epítope de gB tiene una secuencia de aminoácidos que incluye los residuos 1 a 751 de la proteína de gB de longitud total.

57. La VLP de cualquiera de las reivindicaciones 50 a 52, en donde el polipéptido que comprende un epítope de gB tiene una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 15 residuos consecutivos de la SEQ ID NO: 7.

58. La VLP de cualquiera de las reivindicaciones 50 a 52, en donde el polipéptido que comprende un epítope de gB tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 7.

59. La VLP de cualquiera de las reivindicaciones 50 a 52, en donde el polipéptido que comprende un epítope de gB comprende una proteína de fusión.

60. La VLP de la reivindicación 59, en donde la proteína de fusión comprende un primer polipéptido que comprende un dominio extracelular de terminal N proveniente de una proteína de gB encontrada en HCMV fusionada a un segundo polipéptido que comprende un dominio de transmembrana, citoplásmico, o ambos que no se encuentran en la naturaleza en la proteína de HCMV.

61. La VLP de la reivindicación 60, en donde el segundo polipéptido se encuentra en la naturaleza en el virus de estomatitis vesicular (VSV) .

62. La VLP de la reivindicación 60, en donde la proteína de fusión comprende la SEQ ID NO: 10.

63. Una VLP que comprende: una proteína de fusión que comprende una porción de terminal N de una proteína Gag encontrada en MLV fusionada a un epítope de una proteína pp65 encontrada en HCMV; y un polipéptido que comprende un epítope de una proteína de gH encontrada en HCMV.

64. La VLP de la reivindicación 63, en donde la porción de terminal N de la proteína Gag no comprende una secuencia de polimerasa de terminal C encontrada en MLV.

65. La VLP de la reivindicación 63 o la reivindicación 64, en donde la porción de terminal N de la proteína Gag comprende los residuos 1 a 538 de la proteína de longitud total .

66. La VLP de cualquiera de las reivindicaciones 63 a 65, en donde el epítope de la proteína de gH se encuentra en la proteína de gH de longitud total .

67. La VLP de cualquiera de las reivindicaciones 63 a 65, en donde el epítope de la proteína de gH se reconoce por un anticuerpo que se enlaza a un epítope en la gH de longitud total .

68. La VLP de cualquiera de las reivindicaciones 63 a 65, en donde el epítope de la proteína de gH se reconoce por un anticuerpo que se enlaza a un epítope en la SEQ ID NO: 13.

69. La VLP de cualquiera de las reivindicaciones 63 a 65, en donde el polipéptido que comprende un epítope de gH tiene una secuencia de aminoácidos que incluye los residuos 1 a 751 de la proteína de gH de longitud total.

70. La VLP de cualquiera de las reivindicaciones 63 a 65, en donde el polipéptido que comprende un epítope de gH tiene una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 15 residuos consecutivos de la SEQ ID NO: 13.

71. La VLP de cualquiera de las reivindicaciones 63 a 65, en donde el polipéptido que comprende un epítope de gH tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 13.

72. La VLP de cualquiera de las reivindicaciones 63 a 65, en donde el polipéptido que comprende un epítope de gH comprende una proteína de fusión.

73. La VLP de la reivindicación 72, en donde la proteína de fusión comprende un primer polipéptido que comprende un dominio extracelular de terminal N proveniente de una proteína de gH encontrada en HCMV fusionada a un segundo polipéptido que comprende un dominio de transmembrana, citoplásmico, o ambos que no se encuentran en la naturaleza en la proteína de HCMV.

74. La VLP de la reivindicación 73, en donde el segundo polipéptido es una proteína de gB .

75. La VLP de la reivindicación 73, en donde el segundo polipéptido se encuentra en la naturaleza en el virus de estomatitis vesicular (VSV) .

76. Una VLP que comprende: una proteína de fusión que comprende una porción de terminal N de una proteína Gag encontrada en el virus de leucemia murina (MVL) fusionada corriente arriba de un epítope de una proteína pp65 encontrada en el citomegalovirus humano (HCMV) ; un polipéptido que comprende un epítope de una proteína de glicoproteína B (gB) encontrada en HCMV; y un polipéptido que comprende un epítope de una proteína de glicoproteína H (gH) encontrada en HCMV.

77. La VLP de la reivindicación 76, en donde la porción de terminal N de la proteína Gag no comprende una secuencia de polimerasa de terminal C encontrada en el virus de leucemia murina ( LV) .

78. La VLP de la reivindicación 76 o la reivindicación 77, en donde la porción de terminal N de la proteína Gag comprende los residuos 1 a 538 de la proteína de longitud total.

79. La VLP de cualquiera de las reivindicaciones 76 a 78, en donde el epítope de la proteína de gB se encuentra en la proteína de gB de longitud total .

80. La VLP de cualquiera de las reivindicaciones 76 a 78, en donde el epítope de la proteína de gB se reconoce por un anticuerpo que se enlaza a un epítope en la gB de longitud total .

81. La VLP de cualquiera de las reivindicaciones 76 a 78, en donde el epítope de la proteína de gB se reconoce por un anticuerpo que se enlaza a un epítope en la SEQ ID NO: 7.

82. La VLP de cualquiera de las reivindicaciones 76 a 78, en donde el polipéptido que comprende un epítope de gB tiene una secuencia de aminoácidos que incluye los residuos 1 a 751 de la proteína de gB de longitud total.

83. La VLP de cualquiera de las reivindicaciones 76 a 78, en donde el polipéptido que comprende un epítope de gB tiene una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 15 residuos consecutivos de la SEQ ID NO: 7.

8 . La VLP de cualquiera de las reivindicaciones 76 a 78, en donde el polipéptido que comprende un epítope de gB tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 7.

85. La VLP de cualquiera de las reivindicaciones 76 a 78, en donde el polipéptido que comprende un epítope de gB comprende una proteína de fusión.

86. La VLP de la reivindicación 85, en donde la proteína de fusión comprende un primer polipéptido que comprende un dominio extracelular de terminal N proveniente de una proteína de gB encontrada en HCMV fusionada a un segundo polipéptido que comprende un dominio de transmembrana, citoplásmico, o ambos que no se encuentran en la naturaleza en la proteína de HCMV.

87. La VLP de la reivindicación 86, en donde el segundo polipéptido se encuentra en la naturaleza en el virus de estomatitis vesicular (VSV) .

88. La VLP de la reivindicación 86, en donde la proteína de fusión comprende la SEQ ID NO: 10.

89. La VLP de cualquiera de las reivindicaciones 76 a 88, en donde el epítope de la proteína de gH se encuentra en la proteína de gH de longitud total.

90. La VLP de cualquiera de las reivindicaciones 76 a 88, en donde el epítope de la proteína de gH se reconoce por un anticuerpo que se enlaza a un epítope en la gH de longitud total .

91. La VLP de cualquiera de las reivindicaciones 76 a 88, en donde el epítope de la proteína de gH se reconoce por un anticuerpo que se enlaza a un epítope en la SEQ ID NO: 13.

92. La VLP de cualquiera de las reivindicaciones 76 a 88, en donde el polipéptido que comprende un epítope de gH tiene una secuencia de aminoácidos que incluye los residuos 1 a 717 de la proteína de gH de longitud total.

93. La VLP de cualquiera de las reivindicaciones 76 a 88, en donde el polipéptido que comprende un epítope de gH tiene una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 15 residuos consecutivos de la SEQ ID NO: 13.

94. La VLP de cualquiera de las reivindicaciones 76 a 88, en donde el polipéptido que comprende un epítope de gH tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 13.

95. La VLP de cualquiera de las reivindicaciones 76 a 88, en donde el polipéptido que comprende un epítope de gH comprende una proteína de fusión.

96. La VLP de la reivindicación 95, en donde la proteína de fusión comprende un primer polipéptido que comprende un dominio extracelular de terminal N proveniente de una proteína de gH encontrada en HCMV fusionada a un segundo polipéptido que comprende un dominio de transmembrana, citoplásmico, o ambos que no se encuentran en la naturaleza en la proteína de HCMV.

97. La VLP de la reivindicación 96, en donde el segundo polipéptido es una proteína de gB.

98. La VLP de la reivindicación 96, en donde el segundo polipéptido se encuentra en la naturaleza en el virus de estomatitis vesicular (VSV) .

99. La VLP de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, 26 a 32 y 34 a 98, en donde la VLP se caracteriza en que tiene un diámetro dentro de un rango limitado por un límite inferior de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 nm y limitado por un límite superior de 300, 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180 o 170 nm.

100. Una población de VLPs de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, 26 a 32 y 34 a 98, en donde las VLPs dentro de la población muestran un diámetro promedio dentro de un rango limitado por un límite inferior de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 nm y limitado por un límite superior de 300, 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180 o 170 nm.

101. La población de VLPs de acuerdo con la reivindicación 100, en donde las VLPs en la población tienen un índice de poli-dispersión que es menor a 0.5.

102. La VLP de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, 26 a 32 y 34 a 98, en donde la VLP se caracteriza en que el epltope de la glicoproteína se expone sobre la superficie de la VLP y la proteína de fusión se localiza en el tegumento/lumen de la VLP.

103. Una composición inmunogénica que comprende la VLP de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, 26 a 32 y 34 a 98.

104. La composición inmunogénica de la reivindicación 103, en donde la composición se caracteriza en que induce las respuestas inmunes tanto humorales como celulares cuando se administran a un sujeto.

105. La composición inmunogénica de la reivindicación 104, en donde la respuesta inmune humoral en un sujeto se sostiene durante al menos aproximadamente 1 mes, al menos aproximadamente 2 meses, al menos aproximadamente 3 meses, al menos aproximadamente 4 meses, al menos aproximadamente 5 meses, al menos aproximadamente 6 meses, al menos aproximadamente 7 meses, al menos aproximadamente 8 meses, al menos aproximadamente 9 meses, al menos aproximadamente 10 meses, al menos aproximadamente 11 meses, o al menos 12 meses .

106. La composición inmunogénica de la reivindicación 104, en donde la respuesta inmune celular en un sujeto se sostiene durante al menos aproximadamente 1 mes, al menos aproximadamente 2 meses, al menos aproximadamente 3 meses, al menos aproximadamente 4 meses, al menos aproximadamente 5 meses, al menos aproximadamente 6 meses, al menos aproximadamente 7 meses, al menos aproximadamente 8 meses, al menos aproximadamente 9 meses, al menos aproximadamente 10 meses, al menos aproximadamente 11 meses, o al menos 12 meses .

107. Una composición inmunogénica que comprende una mezcla de la VLP de la reivindicación 50 y la VLP recom inante de la reivindicación 63.

108. Una composición inmunogénica que comprende una mezcla de la VLP de la reivindicación 50 y la VLP de la reivindicación 75.

109. Un vector que comprende: un polinucleótido que codifica para una proteína de fusión que comprende una porción de terminal N de una proteína Gag encontrada en el virus de leucemia murina (MLV) fusionada corriente arriba de un epítope de una proteína de pp65 encontrada en citomegalovirus humano (HCMV) ; en donde el polinucleótido que codifica para la proteína de fusión se encuentra bajo el control de un solo promotor,- y en donde el vector comprende una señal de poliadenilación corriente abajo del polinucleótido que codifica para el vector de la proteína de fusión.

110. El vector de la reivindicación 109, en donde la porción de terminal N de la proteína Gag no comprende la secuencia de polimerasa de terminal C encontrada en el virus de leucemia murina (MLV) .

111. El vector de la reivindicación 109 o la reivindicación 110, en donde la porción de terminal N de la proteína Gag comprende los residuos 1 a 538 de la proteína de longitud total .

112. El vector de cualquiera de las reivindicaciones 109 a 111, que comprende una secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 22.

113. El vector de cualquiera de las reivindicaciones 109 a 111, en donde el vector es como se representa en la Figura 1A-B.

114. Un vector que comprende: un polinucleótido que codifica para un polipéptido que comprende un epítope de una proteína de glicoproteína B (gB) encontrada en HCMV; en donde el polinucleótido se encuentra bajo el control de un solo promotor; y en donde el vector comprende una secuencia de señal corriente arriba del polinucleótido y una señal de poliadenilación corriente abajo del polinucleótido.

115. El vector de la reivindicación 11 , en donde el polipéptido que comprende un epítope de la proteína de gB comprende los residuos 1 a 751 de la proteína de gB de longitud total.

116. El vector de la reivindicación 114 o la reivindicación 115, que comprende una secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 8 o la SEQ ID NO: 9.

117. El vector de cualquiera de las reivindicaciones 114 a 116, en donde el vector es como se representa en la Figura 1A-B.

118. Un vector que comprende: un polinucleótido que codifica para un polipéptido que comprende un epítope de una proteína de glicoproteína H (gH) encontrada en HCMV; en donde el polinucleótido se encuentra bajo el control de un solo promotor; y en donde el vector comprende una secuencia de señal corriente arriba del polinucleótido y una señal de poliadenilación corriente abajo del polinucleótido.

119. El vector de la reivindicación 118, en donde el polipéptido que comprende un epítope de la proteína de gH no comprende un dominio de transmembrana o citoplásmico proveniente de una proteína de gH encontrada en HCMV.

120. El vector de la reivindicación 118 o la reivindicación 119, en donde el polipéptido que comprende un epítope de la proteína de gH comprende una proteína de fusión.

121. El vector de la reivindicación 120, en donde la proteína de fusión comprende un dominio extracelular de terminal N de una proteína de gH proveniente de HCMV fusionada corriente arriba a un segundo polipéptido que comprende un dominio de transmembrana, citoplásmico, o ambos que no se encuentran en la naturaleza en la proteína de HCMV.

122. El vector de la reivindicación 121, en donde el segundo polipéptido es una proteína de gB.

123. El vector de la reivindicación 121, en donde el segundo polipéptido se encuentra en la naturaleza en el virus de estomatitis vesicular (VSV) .

124. El vector de cualquiera de las reivindicaciones 118 a 123, en donde el polipéptido que comprende un epítope de gH comprende los residuos 1 a 717 de la proteína de gH de longitud total .

125. El vector de cualquiera de las reivindicaciones 118 a 124, que comprende una secuencia de polinucleótidos de los nucleótidos 1 a 2148 de la SEQ ID NO: 14 o los nucleótidos 1 a 2148 de la SEQ ID NO: 15.

126. El vector de cualquiera de las reivindicaciones 118 a 125, en donde el vector es como se representa en la Figura 1A-B.

127. Una célula que comprende uno o más vectores de cualquiera de las reivindicaciones 109 a 126.

128. La célula de la reivindicación 127, en donde la célula se transfecta transitoriamente con uno o más de los vectores .

129. La célula de la reivindicación 127, en donde la célula se transfecta de manera estable con uno o más de los vectores .

130. Un método para la producción de una VLP, comprendiendo el método: co-transfectar una célula huésped con el vector de cualquiera de las reivindicaciones 109 a 113 y el vector de cualquiera de las reivindicaciones 114 a 117; y cultivar la célula huésped en un medio adecuado bajo condiciones que permitan la expresión de las proteínas codificadas por los vectores.

131. Un método para la producción de una VLP, comprendiendo el método: co-transfectar una célula huésped con el vector de cualquiera de las reivindicaciones 109 a 113 y el vector de cualquiera de las reivindicaciones 118 a 126; y cultivar la célula huésped en un medio adecuado bajo condiciones que permitan la expresión de las proteínas codificadas por los vectores.

132. Un método para la producción de una VLP, comprendiendo el método: co-transfectar una célula huésped con el vector de cualquiera de las reivindicaciones 109 a 113, el vector de cualquiera de las reivindicaciones 114 a 117 y el vector de cualquiera de las reivindicaciones 118 a 126; y cultivar la célula huésped en un medio adecuado bajo condiciones que permitan la expresión de las proteínas codificadas por los vectores.

133. El método de cualquiera de las reivindicaciones 130 a 132, que comprende además la etapa de recuperar las VLPs del medio y/o las células huésped.

13 . Una composición farmacéutica que comprende la VLP de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, 26 a 32 y 34 a 98 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

135. La composición farmacéutica de la reivindicación 134, que comprende además un adyuvante.

136. La composición farmacéutica de la reivindicación 135, en donde el adyuvante se selecciona del grupo que consiste de citosinas, adyuvantes tipo gel; adyuvantes microbianos; adyuvantes de emulsión en aceite y a base de emulsionante; adyuvantes en partículas; adyuvantes sintéticos; adyuvantes poliméricos y/o combinaciones de los mismos .

137. Un método para reducir la frecuencia o la severidad o para retrasar el inicio de los síntomas de la infección por HCMV en un sujeto, comprendiendo el método administrar la composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 134 a 136.

138. El método de la reivindicación 137, en donde el sujeto se encuentra en riesgo de infección por HCMV.

139. El método de la reivindicación 138, en donde el sujeto es un sujeto inmunosuprimido .

140. El método de la reivindicación 139, en donde el sujeto inmunosuprimido se selecciona del grupo que consiste de un sujeto infectado con VIH, un paciente de SIDA, un receptor de trasplante, un sujeto pediátrico y un sujeto preñado .

141. El método de cualquiera de las reivindicaciones 137 a 140, en donde el sujeto se ha expuesto a infección por HCMV.

142. El método de cualquiera de las reivindicaciones 137 a 141, en donde el sujeto es un humano.

143. El método de la reivindicación 137, en donde la frecuencia, la severidad o el inicio de los síntomas de la infección por HCMV en un sujeto se reducen por aproximadamente el 50% o más en comparación con la frecuencia, severidad o inicio de los síntomas de la infección por HCMV en el sujeto antes de la administración de la composición farmacéutica.

144. El método de la reivindicación 143, en donde la frecuencia, la severidad o el inicio de los síntomas de la infección por HCMV en un sujeto se reducen por aproximadamente el 60% o más, aproximadamente el 70% o más, o aproximadamente el 75% o más, en comparación con la frecuencia, severidad o inicio de los síntomas de la infección por HCMV en el sujeto antes de la administración de la composición farmacéutica.

145. El método de cualquiera de las reivindicaciones 137 a 144, en donde la composición farmacéutica se administra en una dosis inicial y al menos en una dosis de refuerzo.

146. El método de la reivindicación 145, en donde la composición farmacéutica se administra en una dosis inicial y dos dosis de refuerzo.

147. El método de la reivindicación 145, en donde la composición farmacéutica se administra en una dosis inicial y tres dosis de refuerzo.

148. El método de la reivindicación 145, en donde la composición farmacéutica se administra en una dosis inicial y cuatro dosis de refuerzo.

149. El método de la reivindicación 145, en donde la composición farmacéutica se administra en una dosis inicial y al menos en una dosis de refuerzo aproximadamente un mes, aproximadamente dos meses, aproximadamente tres meses, aproximadamente cuatro meses, aproximadamente cinco meses o aproximadamente seis meses después de la dosis inicial .

150. El método de la reivindicación 149, en donde la composición farmacéutica se administra en una segunda dosis de refuerzo aproximadamente seis meses, aproximadamente siete meses, aproximadamente ocho meses, aproximadamente nueve meses, aproximadamente diez meses, aproximadamente once meses, o aproximadamente un año después de la dosis inicial.

151. El método de cualquiera de las reivindicaciones 137 a 150, en donde la composición farmacéutica se administra en una dosis de refuerzo cada año, cada 2 años, 3 años, 4 años, 5 años, 6 años, 7 años, 8 años, 9 años o 10 años.