KR20220038608A - 다형성 교모세포종의 치료를 위한 면역치료 조성물 - Google Patents

다형성 교모세포종의 치료를 위한 면역치료 조성물 Download PDF

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KR20220038608A
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gbm
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데이비드 이벤더 앤더슨
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배리에이션 바이오테크놀로지스 아이엔씨.
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Abstract

본 발명은 다형성 교모세포종(GBM)을 치료하는 데 유용한 조성물 및 방법을 제공하며, 예를 들어, 그 조성물은 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MMLV) 코어 단백질 및 인간 거대세포바이러스 에피토프, gB 및 pp65를 포함하여 구성되는 바이러스-유사 입자(VLP)를 포함하여 구성되고, GM-CSF으로 제형화되며, 그 방법은 적어도 10㎍ gB/pp65 Gag의 투여로서 GBM 환자의 항-HCMV 면역 조절 장애를 반전시킨다.

Description

다형성 교모세포종의 치료를 위한 면역치료 조성물
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 5월 31일에 출원된되고, 그 전체 내용이 본 명세서에 참고 문헌으로 통합되는, 미국 가특허 출원 62/855,120호의 이익을 주장한다.
본 발명은 면역 종양학, 특히 다형성 교모세포종(Glioblastoma Multiforme, GBM)의 치료에 사용하기 위한 바이러스 유사 입자 백신 분야에 관한 것이다.
다형성 교모세포종(GBM)은 치료하지 않으면 평균 생존 시간이 3개월에 불과한 가장 흔하고 공격적인 1차 형태(primary form)의 뇌종양이다. GBM은 미국과 유럽에서 매년 100,000명당 2~3명의 성인에게 발생한다(affect). 미국에서만 매년 GBM이 20,000명 이상의 사람들에게서 진단되고 약 15,000명이 사망한다.
본 발명은 GBM의 치료에 유용한 조성물 및 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 HCMV로부터 항원을 발현하는 바이러스 유사 입자(VLP)를 포함하여 구성되는 조성물 및 그의 사용 방법을 제공한다. 본 발명의 조성물은 HCMV 항원 gB 및 pp65를 발현하는 VLP를 포함하여 구성된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은, 애주번트(adjuvant)로서, 과립구 대식세포 집락 자극 인자(granulocyte macrophage colony stimulating factor, "GM-CSF")로 제형화된 pp65-gB VLP를 포함하여 구성된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은, 애주번트로서, 적어도 약 0.4 ㎍ pp65 및 약 200 ㎍ GM-CSF의 투여량(dose)에서 GM-CSF로 제형화된 pp65-gB VLP를 포함하여 구성된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은, 애주번트로서, 적어도 약 10 ㎍ pp65 및 약 200 ㎍ GM-CSF의 투여량에서 GM-CSF로 제형화된 pp65-gB VLP를 포함하여 구성된다.
본 발명은 또한 피내 주사에 의한 본 발명의 조성물의 투여를 포함하여 구성되는, GBM을 앓고 있는 환자의 치료 방법을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 주사는 별개 부위에 2회의 절반 투여량 주사로 제공된다. 특히 바람직한 구현예에서, 주사는, 월 단위로, 별개 부위에 2회의 절반 투여량 주사로 제공된다. 추가적인 구현예에서, 본 발명은 GBM을 앓고 있는 환자의 치료 방법을 제공하며, 이 경우 환자는 HCMV에 대한 면역 조절 장애(dysregulation)를 나타내며, 이 방법은 본 발명의 조성물을 적어도 약 10 ㎍ pp65 및 200 ㎍ GM-CSF의 양으로 투여하는 것을 포함하여 구성된다.
본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 다음의 상세한 설명에서 명백히 드러난다. 그러나, 상세한 설명은 본 발명의 구현예를 나타내는 것이기는 하지만, 제한이 아니라 단지 예시로서 제공된다는 것을 이해해야 한다. 본 발명의 범위 내의 다양한 변경 및 수정은 상세한 설명으로부터 이 분야의 통상의 기술자에게 명백히 드러날 것이다.
서열 목록
다음은 본 명세서에 언급되는 서열의 목록이다:
서열번호 1은 MMLV-Gag 아미노산 서열이다.
MGQTVTTPLSLTLGHWKDVERIAHNQSVDVKKRRWVTFCSAEWPTFNVGWPRDGTFNRDLITQVKIKVFSPGPHGHPDQVPYIVTWEALAFDPPPWVKPFVHPKPPPPLPPSAPSLPLEPPRSTPPRSSLYPALTPSLGAKPKPQVLSDSGGPLIDLLTEDPPPYRDPRPPPSDRDGNGGEATPAGEAPDPSPMASRLRGRREPPVADSTTSQAFPLRAGGNGQLQYWPFSSSDLYNWKNNNPSFSEDPGKLTALIESVLITHQPTWDDCQQLLGTLLTGEEKQRVLLEARKAVRGDDGRPTQLPNEVDAAFPLERPDWDYTTQAGRNHLVHYRQLLLAGLQNAGRSPTNLAKVKGITQGPNESPSAFLERLKEAYRRYTPYDPEDPGQETNVSMSFIWQSAPDIGRKLERLEDLKNKTLGDLVREAEKIFNKRETPEEREERIRRETEEKEERRRTEDEQKEKERDRRRHREMSKLLATVVSGQKQDRQGGERRRSQLDRDQCAYCKEKGHWAKDCPKKPRGPRGPRPQTSLLTLDD
서열번호 2는 MMLV-Gag 뉴클레오티드 서열이다.
ATGGGCCAGACTGTTACCACTCCCTTAAGTTTGACCTTAGGTCACTGGAAAGATGTCGAGCGGATCGCTCACAACCAGTCGGTAGATGTCAAGAAGAGACGTTGGGTTACCTTCTGCTCTGCAGAATGGCCAACCTTTAACGTCGGATGGCCGCGAGACGGCACCTTTAACCGAGACCTCATCACCCAGGTTAAGATCAAGGTCTTTTCACCTGGCCCGCATGGACACCCAGACCAGGTCCCCTACATCGTGACCTGGGAAGCCTTGGCTTTTGACCCCCCTCCCTGGGTCAAGCCCTTTGTACACCCTAAGCCTCCGCCTCCTCTTCCTCCATCCGCCCCGTCTCTCCCCCTTGAACCTCCTCGTTCGACCCCGCCTCGATCCTCCCTTTATCCAGCCCTCACTCCTTCTCTAGGCGCCAAACCTAAACCTCAAGTTCTTTCTGACAGTGGGGGGCCGCTCATCGACCTACTTACAGAAGACCCCCCGCCTTATAGGGACCCAAGACCACCCCCTTCCGACAGGGACGGAAATGGTGGAGAAGCGACCCCTGCGGGAGAGGCACCGGACCCCTCCCCAATGGCATCTCGCCTACGTGGGAGACGGGAGCCCCCTGTGGCCGACTCCACTACCTCGCAGGCATTCCCCCTCCGCGCAGGAGGAAACGGACAGCTTCAATACTGGCCGTTCTCCTCTTCTGACCTTTACAACTGGAAAAATAATAACCCTTCTTTTTCTGAAGATCCAGGTAAACTGACAGCTCTGATCGAGTCTGTTCTCATCACCCATCAGCCCACCTGGGACGACTGTCAGCAGCTGTTGGGGACTCTGCTGACCGGAGAAGAAAAACAACGGGTGCTCTTAGAGGCTAGAAAGGCGGTGCGGGGCGATGATGGGCGCCCCACTCAACTGCCCAATGAAGTCGATGCCGCTTTTCCCCTCGAGCGCCCAGACTGGGATTACACCACCCAGGCAGGTAGGAACCACCTAGTCCACTATCGCCAGTTGCTCCTAGCGGGTCTCCAAAACGCGGGCAGAAGCCCCACCAATTTGGCCAAGGTAAAAGGAATAACACAAGGGCCCAATGAGTCTCCCTCGGCCTTCCTAGAGAGACTTAAGGAAGCCTATCGCAGGTACACTCCTTATGACCCTGAGGACCCAGGGCAAGAAACTAATGTGTCTATGTCTTTCATTTGGCAGTCTGCCCCAGACATTGGGAGAAAGTTAGAGAGGTTAGAAGATTTAAAAAACAAGACGCTTGGAGATTTGGTTAGAGAGGCAGAAAAGATCTTTAATAAACGAGAAACCCCGGAAGAAAGAGAGGAACGTATCAGGAGAGAAACAGAGGAAAAAGAAGAACGCCGTAGGACAGAGGATGAGCAGAAAGAGAAAGAAAGAGATCGTAGGAGACATAGAGAGATGAGCAAGCTATTGGCCACTGTCGTTAGTGGACAGAAACAGGATAGACAGGGAGGAGAACGAAGGAGGTCCCAACTCGATCGCGACCAGTGTGCCTACTGCAAAGAAAAGGGGCACTGGGCTAAAGATTGTCCCAAGAAACCACGAGGACCTCGGGGACCAAGACCCCAGACCTCCCTCCTGACCCTAGATGAC
서열번호 3은 코돈 최적화된 MMLV-Gag 뉴클레오티드 서열이다.
ATGGGACAGACCGTCACAACACCCCTGAGCCTGACCCTGGGACATTGGAAAGACGTGGAGAGGATCGCACATAACCAGAGCGTGGACGTGAAGAAACGGAGATGGGTCACATTCTGCAGTGCTGAGTGGCCAACTTTTAATGTGGGATGGCCCCGAGACGGCACTTTCAACAGGGATCTGATCACCCAGGTGAAGATCAAGGTCTTTAGCCCAGGACCTCACGGACATCCAGACCAGGTGCCTTATATCGTCACCTGGGAGGCACTGGCCTTCGATCCCCCTCCATGGGTGAAGCCATTTGTCCACCCAAAACCACCTCCACCACTGCCTCCAAGTGCCCCTTCACTGCCACTGGAACCACCCCGGAGCACACCACCCCGCAGCTCCCTGTATCCTGCTCTGACTCCATCTCTGGGCGCAAAGCCAAAACCACAGGTGCTGAGCGACTCCGGAGGACCACTGATTGACCTGCTGACAGAGGACCCCCCACCATACCGAGATCCTCGGCCTCCACCAAGCGACCGCGATGGAAATGGAGGAGAGGCTACTCCTGCCGGCGAAGCCCCTGACCCATCTCCAATGGCTAGTAGGCTGCGCGGCAGGCGCGAGCCTCCAGTGGCAGATAGCACCACATCCCAGGCCTTCCCTCTGAGGGCTGGGGGAAATGGGCAGCTCCAGTATTGGCCATTTTCTAGTTCAGACCTGTACAACTGGAAGAACAATAACCCCTCTTTCAGTGAGGACCCCGGCAAACTGACCGCCCTGATCGAATCCGTGCTGATTACCCATCAGCCCACATGGGACGATTGTCAGCAGCTCCTGGGCACCCTGCTGACCGGAGAGGAAAAGCAGCGCGTGCTGCTGGAGGCTCGCAAAGCAGTCCGAGGGGACGATGGACGGCCCACACAGCTCCCTAATGAGGTGGACGCCGCTTTTCCACTGGAAAGACCCGACTGGGATTATACTACCCAGGCAGGGAGAAACCACCTGGTCCATTACAGGCAGCTCCTGCTGGCAGGCCTGCAGAATGCCGGGAGATCCCCCACCAACCTGGCCAAGGTGAAAGGCATCACACAGGGGCCTAATGAGTCACCAAGCGCCTTTCTGGAGAGGCTGAAGGAAGCTTACCGACGGTATACCCCATACGACCCTGAGGACCCCGGACAGGAAACAAACGTCTCCATGTCTTTCATCTGGCAGTCTGCCCCAGACATTGGGCGGAAGCTGGAGAGACTGGAAGACCTGAAGAACAAGACCCTGGGCGACCTGGTGCGGGAGGCTGAAAAGATCTTCAACAAACGGGAGACCCCCGAGGAAAGAGAGGAAAGGATTAGAAGGGAAACTGAGGAAAAGGAGGAACGCCGACGGACCGAGGACGAACAGAAGGAGAAAGAACGAGATCGGCGGCGGCACCGGGAGATGTCAAAGCTGCTGGCCACCGTGGTCAGCGGACAGAAACAGGACAGACAGGGAGGAGAGCGACGGAGAAGCCAGCTCGACAGGGATCAGTGCGCATACTGTAAGGAAAAAGGCCATTGGGCCAAGGATTGCCCCAAAAAGCCAAGAGGACCAAGAGGACCAAGACCACAGACATCACTGCTGACCCTGGACGAC (SEQ ID NO: 4) GGMSWFSQILIGTLLMWLGLNAKNGSISLMCLALGGVLIFLSTAVSA
서열번호 4는 MMLV Gag - CMV pp65 아미노산 서열이다.
MGQTVTTPLSLTLGHWKDVERIAHNQSVDVKKRRWVTFCSAEWPTFNVGWPRDGTFNRDLITQVKIKVFSPGPHGHPDQVPYIVTWEALAFDPPPWVKPFVHPKPPPPLPPSAPSLPLEPPRSTPPRSSLYPALTPSLGAKPKPQVLSDSGGPLIDLLTEDPPPYRDPRPPPSDRDGNGGEATPAGEAPDPSPMASRLRGRREPPVADSTTSQAFPLRAGGNGQLQYWPFSSSDLYNWKNNNPSFSEDPGKLTALIESVLITHQPTWDDCQQLLGTLLTGEEKQRVLLEARKAVRGDDGRPTQLPNEVDAAFPLERPDWDYTTQAGRNHLVHYRQLLLAGLQNAGRSPTNLAKVKGITQGPNESPSAFLERLKEAYRRYTPYDPEDPGQETNVSMSFIWQSAPDIGRKLERLEDLKNKTLGDLVREAEKIFNKRETPEEREERIRRETEEKEERRRTEDEQKEKERDRRRHREMSKLLATVVSGQKQDRQGGERRRSQLDRDQCAYCKEKGHWAKDCPKKPRGPRGPRPQTSLLTLDDCESRGRRCPEMISVLGPISGHVLKAVFSRGDTPVLPHETRLLQTGIHVRVSQPSLILVSQYTPDSTPCHRGDNQLQVQHTYFTGSEVENVSVNVHNPTGRSICPSQEPMSIYVYALPLKMLNIPSINVHHYPSAAERKHRHLPVADAVIHASGKQMWQARLTVSGLAWTRQQNQWKEPDVYYTSAFVFPTKDVALRHVVCAHELVCSMENTRATKMQVIGDQYVKVYLESFCEDVPSGKLFMHVTLGSDVEEDLTMTRNPQPFMRPHERNGFTVLCPKNMIIKPGKISHIMLDVAFTSHEHFGLLCPKSIPGLSISGNLLMNGQQIFLEVQAIRETVELRQYDPVAALFFFDIDLLLQRGPQYSEHPTFTSQYRIQGKLEYRHTWDRHDEGAAQGDDDVWTSGSDSDEELVTTERKTPRVTGGGAMAGASTSAGRKRKSASSATACTAGVMTRGRLKAESTVAPEEDTDEDSDNEIHNPAVFTWPPWQAGILARNLVPMVATVQGQNLKYQEFFWDANDIYRIFAELEGVWQPAAQPKRRRHRQDALPGPCIASTPKKHRG* (SEQ ID NO:4) (MMLV Gag 아미노산 서열은 굵은 글시체임)
서열번호 5는 MMLV Gag - CMV pp65 뉴클레오티드 서열이다.
ATGGGCCAGACTGTTACCACTCCCTTAAGTTTGACCTTAGGTCACTGGAAAGATGTCGAGCGGATCGCTCACAACCAGTCGGTAGATGTCAAGAAGAGACGTTGGGTTACCTTCTGCTCTGCAGAATGGCCAACCTTTAACGTCGGATGGCCGCGAGACGGCACCTTTAACCGAGACCTCATCACCCAGGTTAAGATCAAGGTCTTTTCACCTGGCCCGCATGGACACCCAGACCAGGTCCCCTACATCGTGACCTGGGAAGCCTTGGCTTTTGACCCCCCTCCCTGGGTCAAGCCCTTTGTACACCCTAAGCCTCCGCCTCCTCTTCCTCCATCCGCCCCGTCTCTCCCCCTTGAACCTCCTCGTTCGACCCCGCCTCGATCCTCCCTTTATCCAGCCCTCACTCCTTCTCTAGGCGCCAAACCTAAACCTCAAGTTCTTTCTGACAGTGGGGGGCCGCTCATCGACCTACTTACAGAAGACCCCCCGCCTTATAGGGACCCAAGACCACCCCCTTCCGACAGGGACGGAAATGGTGGAGAAGCGACCCCTGCGGGAGAGGCACCGGACCCCTCCCCAATGGCATCTCGCCTACGTGGGAGACGGGAGCCCCCTGTGGCCGACTCCACTACCTCGCAGGCATTCCCCCTCCGCGCAGGAGGAAACGGACAGCTTCAATACTGGCCGTTCTCCTCTTCTGACCTTTACAACTGGAAAAATAATAACCCTTCTTTTTCTGAAGATCCAGGTAAACTGACAGCTCTGATCGAGTCTGTTCTCATCACCCATCAGCCCACCTGGGACGACTGTCAGCAGCTGTTGGGGACTCTGCTGACCGGAGAAGAAAAACAACGGGTGCTCTTAGAGGCTAGAAAGGCGGTGCGGGGCGATGATGGGCGCCCCACTCAACTGCCCAATGAAGTCGATGCCGCTTTTCCCCTCGAGCGCCCAGACTGGGATTACACCACCCAGGCAGGTAGGAACCACCTAGTCCACTATCGCCAGTTGCTCCTAGCGGGTCTCCAAAACGCGGGCAGAAGCCCCACCAATTTGGCCAAGGTAAAAGGAATAACACAAGGGCCCAATGAGTCTCCCTCGGCCTTCCTAGAGAGACTTAAGGAAGCCTATCGCAGGTACACTCCTTATGACCCTGAGGACCCAGGGCAAGAAACTAATGTGTCTATGTCTTTCATTTGGCAGTCTGCCCCAGACATTGGGAGAAAGTTAGAGAGGTTAGAAGATTTAAAAAACAAGACGCTTGGAGATTTGGTTAGAGAGGCAGAAAAGATCTTTAATAAACGAGAAACCCCGGAAGAAAGAGAGGAACGTATCAGGAGAGAAACAGAGGAAAAAGAAGAACGCCGTAGGACAGAGGATGAGCAGAAAGAGAAAGAAAGAGATCGTAGGAGACATAGAGAGATGAGCAAGCTATTGGCCACTGTCGTTAGTGGACAGAAACAGGATAGACAGGGAGGAGAACGAAGGAGGTCCCAACTCGATCGCGACCAGTGTGCCTACTGCAAAGAAAAGGGGCACTGGGCTAAAGATTGTCCCAAGAAACCACGAGGACCTCGGGGACCAAGACCCCAGACCTCCCTCCTGACCCTAGATGACTGTGAGTCGCGCGGTCGCCGTTGTCCCGAAATGATATCCGTACTGGGTCCCATTTCGGGGCACGTGCTGAAAGCCGTGTTTAGTCGCGGCGACACGCCGGTGCTGCCGCACGAGACGCGACTCCTGCAGACGGGTATCCACGTGCGCGTGAGCCAGCCCTCGCTGATCCTGGTGTCGCAGTACACGCCCGACTCGACGCCATGCCACCGCGGCGACAATCAGCTGCAGGTGCAGCACACGTACTTTACGGGCAGCGAGGTGGAGAACGTGTCGGTCAACGTGCACAACCCCACGGGCCGGAGCATCTGCCCCAGCCAAGAGCCCATGTCGATCTATGTGTACGCGCTGCCGCTCAAGATGCTGAACATCCCCAGCATCAACGTGCACCACTACCCGTCGGCGGCCGAGCGCAAACACCGACACCTGCCCGTAGCTGACGCTGTGATTCACGCGTCGGGCAAGCAGATGTGGCAGGCGCGTCTCACGGTCTCGGGACTGGCCTGGACGCGTCAGCAGAACCAGTGGAAAGAGCCCGACGTCTACTACACGTCAGCGTTCGTGTTTCCCACCAAGGACGTGGCACTGCGGCACGTGGTGTGCGCGCACGAGCTGGTTTGCTCCATGGAGAACACGCGCGCAACCAAGATGCAGGTGATAGGTGACCAGTACGTCAAGGTGTACCTGGAGTCCTTCTGCGAGGACGTGCCCTCCGGCAAGCTCTTTATGCACGTCACGCTGGGCTCTGACGTGGAAGAGGACCTGACGATGACCCGCAACCCGCAACCCTTCATGCGCCCCCACGAGCGCAACGGCTTTACGGTGTTGTGTCCCAAAAATATGATAATCAAACCGGGCAAGATCTCGCACATCATGCTGGATGTGGCTTTTACCTCACACGAGCATTTTGGGCTGCTGTGTCCCAAGAGCATCCCGGGCCTGAGCATCTCAGGTAACCTATTGATGAACGGGCAGCAGATCTTCCTGGAGGTGCAAGCGATACGCGAGACCGTGGAACTGCGTCAGTACGATCCCGTGGCTGCGCTCTTCTTTTTCGATATCGACTTGCTGCTGCAGCGCGGGCCTCAGTACAGCGAACACCCCACCTTCACCAGCCAGTATCGCATCCAGGGCAAGCTTGAGTACCGACACACCTGGGACCGGCACGACGAGGGTGCCGCCCAGGGCGACGACGACGTCTGGACCAGCGGATCGGACTCCGACGAGGAACTCGTAACCACCGAGCGCAAGACGCCCCGCGTTACCGGCGGCGGCGCCATGGCGGGCGCCTCCACTTCCGCGGGCCGCAAACGCAAATCAGCATCCTCGGCGACGGCGTGCACGGCGGGCGTTATGACACGCGGCCGCCTTAAGGCCGAGTCCACCGTCGCGCCCGAAGAGGACACCGACGAGGATTCCGACAACGAAATCCACAATCCGGCCGTGTTCACCTGGCCGCCCTGGCAGGCCGGCATCCTGGCCCGCAACCTGGTGCCCATGGTGGCTACGGTTCAGGGTCAGAATCTGAAGTACCAGGAGTTCTTCTGGGACGCCAACGACATCTACCGCATCTTCGCCGAATTGGAAGGCGTATGGCAGCCCGCTGCGCAACCCAAACGTCGCCGCCACCGGCAAGACGCCTTGCCCGGGCCATGCATCGCCTCGACGCCCAAAAAGCACCGAGGTTAG (SEQ ID NO:5) (MMLV Gag 뉴클레오티드 서열은 굵은 글씨체임)
서열 번호 6은 코돈 최적화된 MMLV Gag - CMV pp65 뉴클레오티드 서열이다.
ATGGGACAGACAGTCACTACACCCCTGAGCCTGACACTGGGACATTGGAAAGACGTGGAGAGGATTGCACATAACCAGAGCGTGGACGTGAAGAAACGGAGATGGGTCACCTTTTGCTCCGCCGAGTGGCCAACATTCAATGTGGGATGGCCCCGAGATGGCACCTTCAACCGGGACCTGATCACTCAGGTGAAGATCAAGGTCTTCTCTCCAGGACCCCACGGCCATCCAGATCAGGTGCCCTACATCGTCACCTGGGAGGCTCTGGCATTTGACCCCCCTCCATGGGTGAAGCCTTTCGTCCACCCAAAACCACCTCCACCACTGCCTCCATCTGCCCCTAGTCTGCCACTGGAACCCCCTCGGTCAACCCCACCCAGAAGCTCCCTGTATCCCGCACTGACACCTAGCCTGGGGGCCAAGCCTAAACCACAGGTGCTGTCTGATAGTGGCGGGCCTCTATCGATCTGCTGACCGAGGACCCTCCACCATACCGCGACCCACGACCTCCACCAAGCGACCGGGACGGAAACGGAGGAGAGGCTACACCCGCAGGCGAAGCCCCCGATCCTAGTCCAATGGCATCAAGGCTGCGCGGGAGGCGCGAACCTCCAGTGGCCGACTCAACCACAAGCCAGGCATTTCCACTGAGGGCCGGGGGAAATGGACAGCTCCAGTATTGGCCCTTCTCTAGTTCAGATCTGTACAACTGGAAGAACAATAACCCTAGCTTCAGCGAGGACCCAGGCAAACTGACCGCCCTGATCGAATCCGTGCTGATTACCCACCAGCCCACATGGGACGATTGTCAGCAGCTCCTGGGCACCCTGCTGACCGGAGAGGAAAAGCAGAGAGTGCTGCTGGAGGCTAGGAAAGCAGTCCGCGGGGACGATGGAAGGCCAACACAGCTCCCCAATGAGGTGGATGCCGCTTTCCCTCTGGAACGGCCAGATTGGGACTATACTACCCAGGCTGGACGCAACCACCTGGTGCATTACCGGCAGCTCCTGCTGGCTGGACTGCAGAATGCAGGGCGCAGCCCCACTAACCTGGCCAAGGTGAAAGGAATCACCCAGGGCCCCAATGAGTCCCCTTCTGCATTCCTGGAGCGGCTGAAGGAAGCCTACCGACGGTATACTCCCTACGATCCTGAGGACCCAGGCCAGGAAACCAACGTGAGTATGAGCTTCATCTGGCAGTCCGCTCCTGACATTGGCCGAAAACTGGAGCGGCTGGAAGATCTGAAGAACAAGACCCTGGGCGACCTGGTGCGGGAGGCAGAAAAGATCTTCAACAAAAGGGAGACTCCAGAGGAACGGGAGGAAAGAATTAGAAGGGAAACAGAGGAAAAGGAGGAACGCCGACGGACTGAGGATGAACAGAAGGAGAAAGAAAGAGACCGGCGGCGGCACCGGGAGATGTCTAAGCTGCTGGCCACCGTGGTCAGTGGCCAGAAACAGGATCGACAGGGAGGAGAGCGACGGAGAAGCCAGCTCGATCGGGACCAGTGCGCCTATTGTAAGGAAAAAGGGCATTGGGCTAAGGACTGCCCCAAGAAACCCAGAGGCCCACGCGGGCCCCGACCTCAGACTTCCCTGCTGACCCTGGACGATTGCGAGAGCCGGGGCCGGCGGTGCCCAGAAATGATCTCTGTGCTGGGGCCCATTAGTGGACATGTGCTGAAGGCCGTCTTCTCCAGGGGAGACACCCCCGTGCTGCCTCACGAGACTCGACTGCTGCAGACCGGCATCCATGTGCGGGTCTCCCAGCCCTCTCTGATTCTGGTGTCACAGTATACACCAGATAGCACTCCCTGCCACAGAGGAGACAATCAGCTCCAGGTGCAGCATACCTACTTTACAGGCTCCGAGGTCGAAAACGTGTCTGTCAATGTGCACAACCCTACCGGCAGGAGCATCTGTCCTAGCCAGGAGCCAATGAGCATCTACGTGTACGCCCTGCCTCTGAAGATGCTGAATATCCCATCAATTAACGTCCACCATTACCCTAGCGCAGCCGAACGGAAGCACAGACATCTGCCAGTGGCCGACGCTGTCATCCATGCCAGCGGCAAACAGATGTGGCAGGCAAGACTGACCGTGTCCGGGCTGGCCTGGACAAGGCAGCAGAATCAGTGGAAGGAGCCCGACGTGTACTATACCAGCGCCTTCGTGTTCCCTACCAAAGACGTGGCCCTGAGACATGTGGTGTGCGCACATGAGCTGGTGTGCAGCATGGAAAACACTAGGGCCACCAAGATGCAGGTCATCGGCGATCAGTATGTCAAAGTGTACCTGGAGAGTTTTTGCGAAGACGTGCCATCAGGGAAGCTGTTCATGCATGTGACCCTGGGCAGCGATGTCGAGGAAGACCTGACCATGACAAGAAATCCACAGCCCTTTATGAGACCCCACGAGAGGAATGGGTTCACTGTGCTGTGCCCCAAGAACATGATCATTAAGCCTGGAAAAATCAGTCATATTATGCTGGATGTGGCCTTTACATCACACGAGCATTTCGGACTGCTGTGCCCCAAATCCATCCCTGGACTGAGCATTTCCGGCAATCTGCTGATGAACGGCCAGCAGATCTTCCTGGAAGTGCAGGCCATCCGGGAGACCGTCGAACTGCGACAGTATGACCCAGTGGCTGCACTGTTCTTTTTCGACATCGACCTGCTGCTGCAGCGAGGACCACAGTACAGCGAGCACCCTACTTTTACCTCCCAGTATCGGATTCAGGGGAAGCTGGAGTACAGGCACACCTGGGATCGCCATGACGAAGGAGCCGCTCAGGGGGACGATGACGTGTGGACATCTGGCAGTGATTCAGACGAGGAACTGGTGACAACTGAGCGAAAAACCCCCCGGGTGACAGGAGGAGGGGCAATGGCAGGGGCCAGCACCAGCGCAGGGCGGAAGCGAAAAAGCGCCAGCAGCGCCACAGCATGTACCGCCGGCGTGATGACTAGAGGAAGGCTGAAGGCCGAGTCTACAGTCGCTCCCGAGGAAGATACTGACGAGGATAGTGACAATGAAATCCACAACCCCGCCGTGTTCACCTGGCCACCTTGGCAGGCAGGGATTCTGGCTCGCAACCTGGTCCCCATGGTGGCAACCGTCCAGGGACAGAATCTGAAGTATCAGGAGTTTTTCTGGGATGCTAACGACATCTACCGGATTTTTGCAGAGCTGGAAGGCGTGTGGCAGCCAGCAGCCCAGCCCAAACGACGGAGACATCGACAGGACGCTCTGCCAGGACCTTGTATCGCCAGCACACCAAAGAAGCACAGGGGCTAA (SEQ ID NO:6) (MMLV Gag 뉴클레오티드 서열은 굵은 글씨체임))
서열 7은 코돈 최적화된 MMLV Gag - CMV pp65 뉴클레오티드 서열이다.
ATGGGACAGACCGTCACAACACCCCTGAGCCTGACCCTGGGACATTGGAAAGACGTGGAGAGGATCGCACATAACCAGAGCGTGGACGTGAAGAAACGGAGATGGGTCACATTCTGCAGTGCTGAGTGGCCAACTTTTAATGTGGGATGGCCCCGAGACGGCACTTTCAACAGGGATCTGATCACCCAGGTGAAGATCAAGGTCTTTAGCCCAGGACCTCACGGACATCCAGACCAGGTGCCTTATATCGTCACCTGGGAGGCACTGGCCTTCGATCCCCCTCCATGGGTGAAGCCATTTGTCCACCCAAAACCACCTCCACCACTGCCTCCAAGTGCCCCTTCACTGCCACTGGAACCACCCCGGAGCACACCACCCCGCAGCTCCCTGTATCCTGCTCTGACTCCATCTCTGGGCGCAAAGCCAAAACCACAGGTGCTGAGCGACTCCGGAGGACCACTGATTGACCTGCTGACAGAGGACCCCCCACCATACCGAGATCCTCGGCCTCCACCAAGCGACCGCGATGGAAATGGAGGAGAGGCTACTCCTGCCGGCGAAGCCCCTGACCCATCTCCAATGGCTAGTAGGCTGCGCGGCAGGCGCGAGCCTCCAGTGGCAGATAGCACCACATCCCAGGCCTTCCCTCTGAGGGCTGGGGGAAATGGGCAGCTCCAGTATTGGCCATTTTCTAGTTCAGACCTGTACAACTGGAAGAACAATAACCCCTCTTTCAGTGAGGACCCCGGCAAACTGACCGCCCTGATCGAATCCGTGCTGATTACCCATCAGCCCACATGGGACGATTGTCAGCAGCTCCTGGGCACCCTGCTGACCGGAGAGGAAAAGCAGCGCGTGCTGCTGGAGGCTCGCAAAGCAGTCCGAGGGGACGATGGACGGCCCACACAGCTCCCTAATGAGGTGGACGCCGCTTTTCCACTGGAAAGACCCGACTGGGATTATACTACCCAGGCAGGGAGAAACCACCTGGTCCATTACAGGCAGCTCCTGCTGGCAGGCCTGCAGAATGCCGGGAGATCCCCCACCAACCTGGCCAAGGTGAAAGGCATCACACAGGGGCCTAATGAGTCACCAAGCGCCTTTCTGGAGAGGCTGAAGGAAGCTTACCGACGGTATACCCCATACGACCCTGAGGACCCCGGACAGGAAACAAACGTCTCCATGTCTTTCATCTGGCAGTCTGCCCCAGACATTGGGCGGAAGCTGGAGAGACTGGAAGACCTGAAGAACAAGACCCTGGGCGACCTGGTGCGGGAGGCTGAAAAGATCTTCAACAAACGGGAGACCCCCGAGGAAAGAGAGGAAAGGATTAGAAGGGAAACTGAGGAAAAGGAGGAACGCCGACGGACCGAGGACGAACAGAAGGAGAAAGAACGAGATCGGCGGCGGCACCGGGAGATGTCAAAGCTGCTGGCCACCGTGGTCAGCGGACAGAAACAGGACAGACAGGGAGGAGAGCGACGGAGAAGCCAGCTCGACAGGGATCAGTGCGCATACTGTAAGGAAAAAGGCCATTGGGCCAAGGATTGCCCCAAAAAGCCAAGAGGACCAAGAGGACCAAGACCACAGACATCACTGCTGACCCTGGACGACTGCGAGAGCCGGGGCCGGCGGTGCCCAGAAATGATCTCTGTGCTGGGGCCCATTAGTGGACATGTGCTGAAGGCCGTCTTCTCCAGGGGAGACACCCCCGTGCTGCCTCACGAGACTCGACTGCTGCAGACCGGCATCCATGTGCGGGTCTCCCAGCCCTCTCTGATTCTGGTGTCACAGTATACACCAGATAGCACTCCCTGCCACAGAGGAGACAATCAGCTCCAGGTGCAGCATACCTACTTTACAGGCTCCGAGGTCGAAAACGTGTCTGTCAATGTGCACAACCCTACCGGCAGGAGCATCTGTCCTAGCCAGGAGCCAATGAGCATCTACGTGTACGCCCTGCCTCTGAAGATGCTGAATATCCCATCAATTAACGTCCACCATTACCCTAGCGCAGCCGAACGGAAGCACAGACATCTGCCAGTGGCCGACGCTGTCATCCATGCCAGCGGCAAACAGATGTGGCAGGCAAGACTGACCGTGTCCGGGCTGGCCTGGACAAGGCAGCAGAATCAGTGGAAGGAGCCCGACGTGTACTATACCAGCGCCTTCGTGTTCCCTACCAAAGACGTGGCCCTGAGACATGTGGTGTGCGCACATGAGCTGGTGTGCAGCATGGAAAACACTAGGGCCACCAAGATGCAGGTCATCGGCGATCAGTATGTCAAAGTGTACCTGGAGAGTTTTTGCGAAGACGTGCCATCAGGGAAGCTGTTCATGCATGTGACCCTGGGCAGCGATGTCGAGGAAGACCTGACCATGACAAGAAATCCACAGCCCTTTATGAGACCCCACGAGAGGAATGGGTTCACTGTGCTGTGCCCCAAGAACATGATCATTAAGCCTGGAAAAATCAGTCATATTATGCTGGATGTGGCCTTTACATCACACGAGCATTTCGGACTGCTGTGCCCCAAATCCATCCCTGGACTGAGCATTTCCGGCAATCTGCTGATGAACGGCCAGCAGATCTTCCTGGAAGTGCAGGCCATCCGGGAGACCGTCGAACTGCGACAGTATGACCCAGTGGCTGCACTGTTCTTTTTCGACATCGACCTGCTGCTGCAGCGAGGACCACAGTACAGCGAGCACCCTACTTTTACCTCCCAGTATCGGATTCAGGGGAAGCTGGAGTACAGGCACACCTGGGATCGCCATGACGAAGGAGCCGCTCAGGGGGACGATGACGTGTGGACATCTGGCAGTGATTCAGACGAGGAACTGGTGACAACTGAGCGAAAAACCCCCCGGGTGACAGGAGGAGGGGCAATGGCAGGGGCCAGCACCAGCGCAGGGCGGAAGCGAAAAAGCGCCAGCAGCGCCACAGCATGTACCGCCGGCGTGATGACTAGAGGAAGGCTGAAGGCCGAGTCTACAGTCGCTCCCGAGGAAGATACTGACGAGGATAGTGACAATGAAATCCACAACCCCGCCGTGTTCACCTGGCCACCTTGGCAGGCAGGGATTCTGGCTCGCAACCTGGTCCCCATGGTGGCAACCGTCCAGGGACAGAATCTGAAGTATCAGGAGTTTTTCTGGGATGCTAACGACATCTACCGGATTTTTGCAGAGCTGGAAGGCGTGTGGCAGCCAGCAGCCCAGCCCAAACGACGGAGACATCGACAGGACGCTCTGCCAGGACCTTGTATCGCCAGCACACCAAAGAAGCACAGGGGCTAA (SEQ ID NO:7) (MMLV Gag 뉴클레오티드 서열은 굵은 글씨체임)
서열번호 8은 HCMV gB 아미노산 서열이다.
MESRIWCLVVCVNLCIVCLGAAVSSSSTRGTSATHSHHSSHTTSAAHSRSGSVSQRVTSSQTVSHGVNETIYNTTLKYGDVVGVNTTKYPYRVCSMAQGTDLIRFERNIVCTSMKPINEDLDEGIMVVYKRNIVAHTFKVRVYQKVLTFRRSYAYIHTTYLLGSNTEYVAPPMWEIHHINSHSQCYSSYSRVIAGTVFVAYHRDSYENKTMQLMPDDYSNTHSTRYVTVKDQWHSRGSTWLYRETCNLNCMVTITTARSKYPYHFFATSTGDVVDISPFYNGTNRNASYFGENADKFFIFPNYTIVSDFGRPNSALETHRLVAFLERADSVISWDIQDEKNVTCQLTFWEASERTIRSEAEDSYHFSSAKMTATFLSKKQEVNMSDSALDCVRDEAINKLQQIFNTSYNQTYEKYGNVSVFETTGGLVVFWQGIKQKSLVELERLANRSSLNLTHNRTKRSTDGNNATHLSNMESVHNLVYAQLQFTYDTLRGYINRALAQIAEAWCVDQRRTLEVFKELSKINPSAILSAIYNKPIAARFMGDVLGLASCVTINQTSVKVLRDMNVKESPGRCYSRPVVIFNFANSSYVQYGQLGEDNEILLGNHRTEECQLPSLKIFIAGNSAYEYVDYLFKRMIDLSSISTVDSMIALDIDPLENTDFRVLELYSQKELRSINVFDLEEIMREFNSYKQRVKYVEDKVVDPLPPYLKGLDDLMSGLGAAGKAVGVAIGAVGGAVASVVEGVATFLKNPFGAFTIILVAIAVVIIIYLIYTRQRRLCMQPLQNLFPYLVSADGTTVTSGNTKDTSLQAPPSYEESVYNSGRKGPGPPSSDASTAAPPYTNEQAYQMLLALVRLDAEQRAQQNGTDSLDGQTGTQDKGQKPNLLDRLRHRKNGYRHLKDSDEEENV* (SEQ ID NO:8) (TM 및 CD는 밑줄 침)
서열 번호: 9는 HCMV gB 뉴클레오티드 서열이다
ATGGAGTCAAGGATTTGGTGCCTGGTCGTGTGCGTCAATCTGTGCATCGTCTGTCTGGGGGCTGCCGTGTCATCAAGTTCTACAAGAGGCACCAGCGCCACCCACTCACACCATAGCTCCCATACCACATCCGCCGCTCACTCCCGGTCTGGCAGCGTGAGCCAGAGAGTCACATCTAGTCAGACCGTGAGCCACGGGGTCAACGAGACCATCTACAATACTACCCTGAAGTATGGCGACGTGGTCGGGGTGAACACAACTAAATACCCATATAGGGTCTGCAGTATGGCCCAGGGCACTGATCTGATTAGATTCGAAAGGAACATCGTGTGCACCAGCATGAAGCCCATTAATGAGGACCTGGATGAAGGGATCATGGTGGTCTACAAACGCAATATTGTGGCCCATACCTTCAAGGTGCGAGTCTATCAGAAAGTGCTGACATTTCGGAGATCTTACGCATATATCCACACCACATACCTGCTGGGGAGTAACACCGAGTATGTGGCTCCCCCTATGTGGGAAATTCACCATATCAATAGCCATTCCCAGTGCTACTCAAGCTACAGCAGAGTGATCGCTGGAACAGTGTTCGTCGCATACCACAGAGACTCTTATGAGAACAAGACTATGCAGCTCATGCCCGACGATTACAGCAATACACATTCCACTAGATATGTGACAGTCAAAGATCAGTGGCACTCAAGGGGCAGCACCTGGCTGTACCGCGAGACATGCAACCTGAATTGTATGGTGACTATCACTACCGCTAGATCCAAGTACCCCTATCACTTCTTTGCAACTTCCACCGGGGACGTGGTCGATATTTCTCCTTTCTACAACGGCACAAACCGGAATGCATCTTATTTTGGGGAGAACGCCGACAAGTTCTTTATTTTCCCAAATTACACCATCGTGTCTGATTTTGGCAGACCCAACAGTGCCCTGGAGACACATCGACTGGTGGCATTCCTGGAACGGGCCGACTCCGTCATTTCTTGGGACATCCAGGATGAGAAGAATGTGACCTGCCAGCTCACCTTCTGGGAGGCCAGCGAACGCACCATCCGATCCGAGGCTGAAGATTCTTACCACTTCTCCTCTGCCAAAATGACAGCTACTTTTCTGAGCAAGAAACAGGAGGTGAACATGTCTGACAGTGCTCTGGATTGCGTGCGGGACGAAGCAATTAATAAGCTGCAGCAGATCTTCAACACATCATACAACCAGACTTACGAGAAGTACGGAAACGTGAGCGTCTTCGAAACAACTGGCGGGCTGGTGGTCTTTTGGCAGGGCATCAAGCAGAAATCCCTGGTGGAGCTGGAAAGGCTGGCCAATCGCAGTTCACTGAACCTGACTCATAATCGGACCAAGAGATCTACAGACGGAAACAATGCCACACATCTGTCTAACATGGAGAGTGTGCACAATCTGGTCTACGCTCAGCTCCAGTTTACCTACGACACACTGAGAGGCTATATTAACAGGGCACTGGCCCAGATCGCTGAAGCATGGTGCGTGGATCAGAGGCGCACCCTGGAGGTCTTCAAGGAACTGTCCAAAATCAACCCTTCAGCAATTCTGAGCGCCATCTACAATAAGCCAATTGCAGCCAGGTTTATGGGAGACGTGCTGGGCCTGGCCAGTTGCGTCACTATCAACCAGACCTCAGTGAAGGTCCTGCGCGATATGAATGTGAAAGAGAGTCCCGGCAGATGCTATTCACGGCCTGTGGTCATCTTCAACTTTGCTAATAGCTCCTACGTGCAGTATGGACAGCTCGGCGAGGACAACGAAATTCTGCTGGGGAATCACAGGACCGAGGAATGTCAGCTCCCTAGCCTGAAGATTTTCATCGCTGGAAACTCCGCATACGAGTATGTGGATTACCTGTTCAAGCGGATGATTGACCTGTCTAGTATCTCCACTGTGGATTCTATGATTGCCCTGGACATCGATCCACTGGAAAATACCGACTTCAGGGTGCTGGAGCTGTATAGCCAGAAGGAACTGCGCTCCATCAACGTGTTCGATCTGGAGGAAATTATGAGAGAGTTTAATAGCTACAAGCAGAGGGTGAAATATGTCGAAGATAAGGTGGTCGACCCCCTGCCACCCTACCTGAAAGGCCTGGACGATCTGATGAGCGGGCTGGGAGCTGCAGGGAAGGCAGTGGGAGTCGCTATCGGCGCAGTGGGAGGAGCCGTGGCCAGCGTGGTCGAGGGAGTGGCAACATTCCTGAAAAACCCCTTCGGGGCCTTCACCATCATTCTGGTGGCAATCGCCGTGGTCATCATTATCTACCTGATCTACACAAGGCAGCGGCGGCTGTGCATGCAGCCTCTGCAGAACCTGTTTCCATACCTGGTGAGCGCCGACGGGACCACAGTCACCTCAGGAAATACTAAGGATACCTCTCTGCAGGCCCCCCCAAGTTACGAGGAATCAGTGTATAACAGCGGCAGAAAAGGACCAGGACCACCTTCAAGCGACGCCAGCACTGCCGCTCCACCCTACACCAATGAGCAGGCCTATCAGATGCTGCTGGCTCTGGTGCGCCTGGATGCCGAACAGCGAGCTCAGCAGAACGGGACCGACTCCCTGGATGGACAGACCGGAACACAGGACAAGGGACAGAAACCTAATCTGCTGGATCGGCTGCGGCACAGAAAAAACGGGTATAGGCACCTGAAGGACTCCGACGAAGAAGAAAATGTCTAA (SEQ ID NO:9) (TM 및 CD는 밑줄 침)
서열번호: 10은 코돈 최적화된 HCMV gB 뉴클레오티드 서열이다.
ATGGAATCCAGGATCTGGTGCCTGGTAGTCTGCGTTAACTTGTGTATCGTCTGTCTGGGTGCTGCGGTTTCCTCATCTTCTACTCGTGGAACTTCTGCTACTCACAGTCACCATTCCTCTCATACGACGTCTGCTGCTCATTCTCGATCCGGTTCAGTCTCTCAACGCGTAACTTCTTCCCAAACGGTCAGCCATGGTGTTAACGAGACCATCTACAACACTACCCTCAAGTACGGAGATGTGGTGGGGGTCAACACCACCAAGTACCCCTATCGCGTGTGTTCTATGGCACAGGGTACGGATCTTATTCGCTTTGAACGTAATATCGTCTGCACCTCGATGAAGCCCATCAATGAAGACCTGGACGAGGGCATCATGGTGGTCTACAAACGCAACATCGTCGCGCACACCTTTAAGGTACGAGTCTACCAGAAGGTTTTGACGTTTCGTCGTAGCTACGCTTACATCCACACCACTTATCTGCTGGGCAGCAACACGGAATACGTGGCGCCTCCTATGTGGGAGATTCATCATATCAACAGTCACAGTCAGTGCTACAGTTCCTACAGCCGCGTTATAGCAGGCACGGTTTTCGTGGCTTATCATAGGGACAGCTATGAAAACAAAACCATGCAATTAATGCCCGACGATTATTCCAACACCCACAGTACCCGTTACGTGACGGTCAAGGATCAATGGCACAGCCGCGGCAGCACCTGGCTCTATCGTGAGACCTGTAATCTGAATTGTATGGTGACCATCACTACTGCGCGCTCCAAGTATCCCTATCATTTTTTCGCAACTTCCACGGGTGATGTGGTTGACATTTCTCCTTTCTACAACGGAACTAATCGCAATGCCAGCTATTTTGGAGAAAACGCCGACAAGTTTTTCATTTTTCCGAACTACACTATCGTCTCCGACTTTGGAAGACCGAATTCTGCGTTAGAGACCCACAGGTTGGTGGCTTTTCTTGAACGTGCGGACTCAGTGATCTCCTGGGATATACAGGACGAGAAGAATGTTACTTGTCAACTCACTTTCTGGGAAGCCTCGGAACGCACCATTCGTTCCGAAGCCGAGGACTCGTATCACTTTTCTTCTGCCAAAATGACCGCCACTTTCTTATCTAAGAAGCAAGAGGTGAACATGTCCGACTCTGCGCTGGACTGTGTACGTGATGAGGCCATAAATAAGTTACAGCAGATTTTCAATACTTCATACAATCAAACATATGAAAAATATGGAAACGTGTCCGTCTTTGAAACCACTGGTGGTTTGGTGGTGTTCTGGCAAGGTATCAAGCAAAAATCTCTGGTGGAACTCGAACGTTTGGCCAACCGCTCCAGTCTGAATCTTACTCATAATAGAACCAAAAGAAGTACAGATGGCAACAATGCAACTCATTTATCCAACATGGAGTCGGTGCACAATCTGGTCTACGCCCAGCTGCAGTTCACCTATGACACGTTGCGCGGTTACATCAACCGGGCGCTGGCGCAAATCGCAGAAGCCTGGTGTGTGGATCAACGGCGCACCCTAGAGGTCTTCAAGGAACTTAGCAAGATCAACCCGTCAGCTATTCTCTCGGCCATCTACAACAAACCGATTGCCGCGCGTTTCATGGGTGATGTCCTGGGTCTGGCCAGCTGCGTGACCATTAACCAAACCAGCGTCAAGGTGCTGCGTGATATGAATGTGAAGGAATCGCCAGGACGCTGCTACTCACGACCAGTGGTCATCTTTAATTTCGCCAACAGCTCGTACGTGCAGTACGGTCAACTGGGCGAGGATAACGAAATCCTGTTGGGCAACCACCGCACTGAGGAATGTCAGCTTCCCAGCCTCAAGATCTTCATCGCCGGCAACTCGGCCTACGAGTACGTGGACTACCTCTTCAAACGCATGATTGACCTCAGCAGCATCTCCACCGTCGACAGCATGATCGCCCTAGACATCGACCCGCTGGAAAACACCGACTTCAGGGTACTGGAACTTTACTCGCAGAAAGAATTGCGTTCCATCAACGTTTTTGATCTCGAGGAGATCATGCGCGAGTTCAATTCGTATAAGCAGCGGGTAAAGTACGTGGAGGACAAGGTAGTCGACCCGCTGCCGCCCTACCTCAAGGGTCTGGACGACCTCATGAGCGGCCTGGGCGCCGCGGGAAAGGCCGTTGGCGTAGCCATTGGGGCCGTGGGTGGCGCGGTGGCCTCCGTGGTCGAAGGCGTTGCCACCTTCCTCAAAAACCCCTTCGGAGCCTTCACCATCATCCTCGTGGCCATAGCCGTCGTCATTATCATTTATTTGATCTATACTCGACAGCGGCGTCTCTGCATGCAGCCGCTGCAGAACCTCTTTCCCTATCTGGTGTCCGCCGACGGGACCACCGTGACGTCGGGCAACACCAAAGACACGTCGTTACAGGCTCCGCCTTCCTACGAGGAAAGTGTTTATAATTCTGGTCGCAAAGGACCGGGACCACCGTCGTCTGATGCATCCACGGCGGCTCCGCCTTACACCAACGAGCAGGCTTACCAGATGCTTCTGGCCCTGGTCCGTCTGGACGCAGAGCAGCGAGCGCAGCAGAACGGTACAGATTCTTTGGACGGACAGACTGGCACGCAGGACAAGGGACAGAAGCCCAACCTGCTAGACCGACTGCGACACCGCAAAAACGGCTACCGACACTTGAAAGACTCCGACGAAGAAGAGAACGTCTGA (SEQ ID NO:10) (TM 및 CD는 밑줄 침)
GBM은, 종양의 국재성(局在性), localization), 화학요법에 대한 세포의 고유한 내성, 및 뇌 세포의 열악한 자가 치유(self-repair) 능력을 비롯한 여러 요인으로 인해 치료에 잘 반응하지 않는다. 일반적으로 GBM 종양은 가능한 범위까지 외과적으로 제거되지만, GBM 세포가 주변 조직으로 빠르게 침투하기 때문에 완전한 제거는 일반적으로 불가능하다. 종종 질병의 진행을 지연시키기 위해 외과적 치료 후에 방사선 및 화학 요법이 사용된다. 그러나, GBM 종양은, 재발하는 것이 일반적이며, 치료받은 환자의 평균 생존 기간은 12개월에서 15개월 사이이다.
최근에, T 세포가 종양 세포를 죽이고 뇌 종양에 침투하는 것으로 밝혀졌다는 지식에 기초하여 GBM에 대한 치료로서 면역요법이 제안되었다. 그러나, GBM을 치료하기 위한 면역치료제의 개발은, 종양 세포의 다양성 그리고 면역 표적으로 작용할 수 있는 일반적인 종양 거부 항원(tumour rejection antigen)의 결핍(lack)으로 인해 어려운 것으로 입증되었다. 또한, 많은 GBM 환자는, 무감각, 내성 및 T-세포 고갈을 포함하는 다양한 T-세포 기능장애를 나타낸다(Woroniecka et al, Clin Cancer Res. (2018) 24 4175-4186). 그들은 또한 약화된 항체 반응을 보일 수 있다.
면역 체크포인트, 특히 면역 세포의 활성을 시뮬레이션하거나 억제하는 분자를 조절하는 것과 관련된 여러 항암 면역 요법이 개발되었다. 예를 들어, PD-1 및 PD-L1과 같은 조절자는 T 세포의 활성을 억제하는 것으로 알려져 있으므로, 면역 치료제의 매력적인 표적이 되었고, 다양한 형태의 암을 치료하는 데 성공적으로 사용되었다. 항-PD1 억제제로 치료한 GBM 환자에 대한 소규모 연구에서 일부 생존 이점이 관찰되었지만(Cloughesy et al., Nature Medicine, (2019) 25: 477-486), 더 큰 규모의 3상 연구는 방사선과 함께 항PD1 억제제를 병용한 화학요법과 비교해 환자의 수명을 연장하지 못함으로써 실패했다(BMS - Optivo CheckMate 498 Clinical Trial - 2019년 5월 9일).
다른 연구에서는, 자가면역의 위험을 낮추는 합성 펩티드로 백신 접종을 시도했다(Schuster Neuro Oncol 2015, 17:854-861). EGFRvIII은, GBM의 약 30%에서 발견되지만 정상 세포에서는 발견되지 않는 표피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor,"EGFR")의 절단된 변이체(truncated variant)이다. EGFRvIII의 13-mer 펩티드에 대한 백신 접종을 사용한 초기 I 상 및 II 상 임상 시험은, 재발성(recurrent) GBM을 가진 면역된 환자에서 전체 생존 기간이 26개월로 유의하게 증가함을 보여줌으로써, GBM에 대한 치료적 백신 접종에 대한 고무적인 뒷받침을 제공했다. 그러나, 새로 진단된 GBM 환자를 대상으로 한 대규모 III상 연구는, 약물이 생존 혜택을 나타내지 않음으로써 중단되었다(ABBVIE 보도 자료, 2019년 5월 17일). 실망스러운 III상 결과에 더해, EGFRvIII 백신 접종은, 종양이 EGFRvIII를 발현하는 GBM 환자의 부분 집합(subset)으로 제한되며, 백신 접종 후 EGFRvIII 항원이 없는 종양 세포의 면역 회피(immune escape)가 이미 명백하여 이 접근법의 장기적 효능을 제한한다(Swampson, JH J of Clinical Oncol. 2010; 28:4722-4729).
GBM을 치료하기 위한 다른 면역치료적 접근법이, 정상 뇌 조직에서 더 낮은 발현을 나타내는 GBM 종양 세포에서 바이러스 항원을 발견한 것을 기반으로 제안되었다. 이미 2002년에 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)가 GBM 세포에 존재한다는 것이 발견되었다(Cobbs et al, Can. Res (2002) 62:3347). β-헤르페스바이러스인 HCMV는, 광범위하게 발생하는 병원체이다. 면역이 있는 사람에서 HCMV 감염은 일반적으로 눈에 띄지 않으며 기껏해야 경미하고 비특이적인 증상을 보이다. HCMV DNA 및 단백질은 GBM 세포의 90% 이상에서 발현되지만 주변의 정상 뇌 조직에서는 발현되지 않는다(Dziurzynski et al, Neuro-Onc. (2012) 14:246). GBM에서 HCMV의 역할은 잘 알려져 있지 않지만, HCMV 당단백질 B(gB)는 수용체 티로신 키나제 PDGFR-알파(PDGFRα)에 결합하여, 신경교종 세포 진입을 조정(mediate)함으로써, 종양 세포 성장 및 침습성을 모두 향상시키는, PI3 키나제/Akt 신호 전달 경로의 활성화를 초래하는 것으로 나타났다(Cobbs, C., Oncotarget 2014; 5:1091-1100). 낮은 수준의 HCMV 발현은 GBM 환자에서 개선된 전체 생존과 상관관계가 있었다(Rahbar, A. Herpesviridae 2012; 3:3).
GBM 세포에서 HCMV의 편재적 존재(ubiquitous presence)는, HCMV 항원이 면역치료적 치료를 위한 치료 표적이 될 수 있다는 시사(suggestions)를 이끌어 냈다. HCMV 항원을 표적으로 사용하는 데 있어 특히 잠재적인 이점은, 그들이 면역학적으로 "외래적(foreign)"으로 인식되고, T 세포는 자가 항원보다 외래 항원에 대해 훨씬 더 높은 친화도를 갖는다는 것이다.
일부 연구는 GBM의 치료에서 HCMV 항원에 대한 면역요법에 대해 조사했다. 한 연구에서, HCMV 특이적 T 세포(CD4+ 및 CD8+ 다관능성 T 세포)가, 자가 GBM 종양 세포를 인지하고 죽이는 것으로 나타났으며, 이는 HCMV 항원이 면역학적으로 관련 레벨(relevant levels)에서 종양 세포에 의해 주어진다(presented)는 증거를 제공한다(Nair, SK., Clin Cancer Res 2014; 20: 2684-2694). 이러한 관찰을 병원(clinic)으로 확장하면, 자가 HCMV 특이적 T 세포를 사용한 입양 T 세포 요법이, 환자 10명 중 4명은 연구 기간 동안 질병이 없었던, 고무적인 초기 임상 결과를 보여주었다(Schuessler, A. Cancer Res. 2014; 74: 3466 -3476).
이들 예비 연구는 HCMV-표적화된 면역요법에 대한 가능성을 보여주었지만, 다른 연구는 GBM 환자가 건강한 사람과 비교하여 HCMV에 대해 상당히 더 낮은 면역 반응을 나타낸다는 것을 보여주었다(Liu et al, J. Trans Med., 2018 16: 182). 특히, GBM 환자는 HCMV 양성인 건강한 피험자(subject)에 비해 유의하게 더 낮은 항-HCMV 항체(IgG)를 생성하는 것으로 나타났다(Liu, 2018). 한 연구에서 HCMV가 있는 GBM 종양 환자의 31%는 항-CMV 항체가 완전히 결여되어 있었다(Rahbar, 2015). 따라서, 많은 GBM 환자는 HCMV에 대한 면역의 심각한 조절장애를 갖고 있으며, 이는 HCMV 항원에 기초한 면역치료 치료법을 개발하는 데 어려움을 야기한다.
HCMV에 대한 면역 약화를 극복하기 위해, 연구자들은 HCMV 항원에 대한 RNA로 펄스된(pulsed with RNA) GBM 환자의 수지상 세포(dendritic cells)를 사용하는 치료법을 개발했다. 소규모의 통제된 I상 시험이, HCMV 비구조(non-structural) 단백질(pp65)에 대해 RNA로 펄스된 자가 수지상 세포로 백신 접종하기 2일 전에 주사 부위에서의 수지상 세포 사전 조절(preconditioning )이 원발성(primary) GBM 환자의 전체 생존을 유의하게 향상시키는 것으로 나타났다(Mitchell, DA 네이처 2015, 519: 366-369). 환자에게서 관찰된 전체 생존의 실질적인 증가는, 수지상 세포 동원(cell mobilization)과 관련된 케모카인인, CCL3의 높은 혈청 수준과 상관관계가 있었으며, 이 바이오마커(biomarker)는 마우스 모델에서 확인되었다. 보다 최근에는, 동일한 HCMV pp65 수지상 세포 백신과 테모졸로마이드(temozolomide) 화학요법의 조합이 GBM 환자의 생존 시간을 향상시켰다(Batich et al, (2017) Clin Cancer Res 23 1898-1909). 이 연구에서, HCMV pp65 항원에 대한 IFN-γ-분비 CD8+ T 세포는 임상적 이점과 상관관계가 있었다. 이러한 연구는 HCMV pp65 단백질이 면역요법의 잠재적 표적이 될 수 있음을 보여주지만, 이 방법은 각 환자에 대해 고유한 펄스화 수지상 세포가 생성되어야 하며, 이는 비용이 많이 들고 대부분의 인구에서 사용할 수 없는 수준의 맞춤 치료를 수반한다.
GBM 종양 세포를 효과적으로 표적화하지만 광범위한 환자 집단에서 사용하기 위해 제형화될 수 있는 GBM에 대한 접근가능한 면역치료에 대한 필요성이 존재한다.
본 발명은 GBM의 치료를 위한 면역치료 조성물 및 그의 사용 방법을 제공한다. 본 발명의 면역원성 조성물은 HCMV-발현 GBM 종양에 대한 항-HCMV T 세포 면역을 자극한다. 또한, 본 발명의 조성물은 GBM 환자에서 종양 반응 및 개선된 생존 시간의 관점에서 임상 효능을 입증하였다. 특히, 본 발명의 면역원성 조성물에 반응한 임상 피험자는 치료에 반응하지 않은 피험자와 비교하여 전체 생존 시간 중앙값에서 6.25개월 개선을 보여주었다. 예기치 않게, 적어도 10 ㎍ pp65 및 200 ㎍ GM-CSF의 투여량에서, 본 발명의 조성물은, HCMV gB 항원에 대한 항체 반응 결핍에 의해 나타난 바와 같이, HCMV에 대해 상당한 면역 조절 장애를 나타낸 GBM 환자에서 반응을 유도할 수 있었다.
본 발명의 면역치료 조성물은 바이러스-유사 입자("VLP")를 포함하여 구성된다. VLP는 일반적으로 하나 또는 그 이상의 바이러스 단백질로 구성된 다중 단백질 구조이다. VLP는 바이러스의 형태(conformation)를 모방하지만 유전 물질이 없기 때문에 감염되지 않는다. 그들은 적절한 상황에서 바이러스 구조 단백질의 발현에 따라 형성(또는 "자가 조립")할 수 있다. VLP는 약독화된 바이러스를 사용하여 제조된 백신의 일부 단점을 극복한다. 왜냐하면 생산 과정에서 살아있는 바이러스가 없어도 생산할 수 있기 때문이다. 다양한 VLP가 제조되어 왔다. 예를 들어, 외피 단백질 및/또는 표면 당단백질이 있거나 없는 단일 또는 다중 캡시드 단백질을 포함하는 VLP가 제조되어 왔다. 어떤 경우에는 VLP가 비-외피성(non-enveloped )이고 단 하나의 주요 캡시드 단백질의 발현에 의해 조립된다. 다른 경우에, VLP는 외피성이고 상응하는 천연 바이러스에서 발견되는 다중 항원성 단백질을 포함하여 구성될 수 있다. 외피성 VLP의 자가 조립은, 숙주 세포막과의 "걸합(fusion)"에 필요한 복잡한 반응(Garrone et al., 2011 Science Trans. Med. 3: 1-8) 및 완전히 외피성인(fully enve) 별개 입자를 형성하기 위한 VLP의 "출아(buddin" 때문에 비-외피성 VLP보다 더 복잡하다. 온전한(intact) VLP의 형성은 전자 현미경을 사용하여 입자를 이미징하여 확인할 수 있다.
VLP는 전형적으로 그들의 상응하는 천연 바이러스와 유사하고 다가 미립자 구조일 수 있다. VLP의 맥락에서, 표면 당단백질의 제공(presentation)은, 다른 형태의 항원, 예를 들어 VLP와 연관되지 않은 가용성 항원과 비교하여 폴리펩티드에 대한 중화 항체의 유도에 유리하다. 중화 항체는 대부분 3차 또는 4차 구조를 인지하며; 이것은 종종 외피 당단백질과 같은 항원 단백질을 본래의 바이러스 형태로 제공해야 한다.
VLP의 표면 상에 발현된 항원은 또한, 중화 항체 및 세포독성 T 림프구(CTL) 반응을 유도하고, 유지하는 것을 도울 수 있는 CD4-제한 T 헬퍼 세포 반응을 유도할 수 있다. 대조적으로, VLP의 내부 공간 내에서 발현된 항원은 교차 프라이밍 및 제공이라고 하는 과정에서 VLP의 수지상 세포 흡수를 통해 CD8-제한된 CTL 반응을 촉진할 수 있다.
본 발명의 VLP는 레트로바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 레트로바이러스는 레트로바이러스과 계통(family Retroviridae)에 속하는 외피성 RNA 바이러스이다. 레트로바이러스에 의한 숙주 세포의 감염 후, RNA는 효소 역전사 효소(enzyme reverse transcriptase)를 통해 DNA로 전사된다(enzyme reverse transcriptase). 그런 다음 DNA는 통합 효소에 의해 숙주 세포의 게놈에 통합되고 그 후 숙주 세포의 DNA의 일부로 복제된다. 레트로바이러스과 계통은 Alpharetrovirus, Betaretrovirus, Gammearetrovirus, Deltaretrovirus, Epsilonretrovirus, Lentivirus 및 Spumavirus 속(genus)을 포함한다. 이 레트로바이러스과 계열의 숙주는 일반적으로 척추동물이다. 레트로바이러스는 숙주 세포막에서 유래한 지질 이중층으로 둘러싸인 구형 뉴클레오캡시드(바이러스 구조 단백질과 복합된 바이러스 게놈)를 포함하는 감염성 비리온을 생성한다.
레트로바이러스 벡터는, 레트로바이러스 유래 게놈이 결여되어 복제되지 않는 VLP를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 이것은 대부분의 레트로바이러스 코딩 영역을 유전자 또는 뉴클레오티드 서열로 대체함으로써 달성되며; 그에 따라. 벡터가 추가 복제에 필요한 단백질을 만들 수 없게 된다. 입자 표면에 존재하는 당단백질의 특성에 따라, VLP는 숙주 세포에 결합하고 숙주 세포로 들어가는 능력이 제한되지만 증식할 수는 없다. 따라서 VLP는 면역원성 조성물로서 안전하게 투여될 수 있다.
본 발명은 레트로바이러스 구조 단백질, 쥐 백혈병 바이러스(MLV) 구조 단백질 및 특히, 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(MMLV)를 포함하여 구성되는 VLP를 이용한다. 이러한 레트로바이러스의 게놈은 데이터베이스에서 쉽게 구할 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 레트로바이러스 구조 단백질은 Gag 폴리펩티드이다. 레트로바이러스의 Gag 단백질은 전체적인 구조적 유사성을 가지며 레트로바이러스의 각 그룹 내에서 아미노산 수준으로 보존된다. 레트로바이러스 Gag 단백질은 주로 바이러스 어셈블리(viral assembly)에서 기능한다. 일부 숙주 세포에서, 일부 바이러스(예: MMLV와 같은 쥐 백혈병 바이러스)의 Gag 발현은 발현 생성물이 VLP로 자가 조립되는 결과를 초래할 수 있다. 폴리단백질 형태의 Gag 유전자 발현 산물은 VLP의 핵심 구조 단백질을 생성한다. 기능적으로, Gag 폴리단백질은, 세포막에 Gag 폴리단백질을 표적으로 하는 막 결합 도메인, Gag 중합을 촉진하는 상호작용 도메인 및 숙주 세포로부터 초기 비리온의 방출을 촉진하는 후기 도메인(late domain)의 세 가지 도메인으로 나뉜다. 일반적으로 바이러스 입자 여셈블리를 조정하는 Gag 단백질의 형태는 폴리단백질이다. 레트로바이러스는, Gag 폴리단백질로 구성되지만, 미성숙 바이러스 입자의 구조 단백질로서 Gag를 갖는 바이러스 프로테아제와 같은 다른 바이러스 요소가 없는, 미성숙 캡시드를 조립한다.
MMLV Gag 유전자는 성숙한 비리온에서 MLV 프로테아제에 의해 4개의 구조적 단백질(매트릭스(MA); p12; 캡시드(CA) 및 뉴클레오캡시드(NC))로 단백질분해적으로 절단되는 65 kDa 폴리단백질 전구체를 코딩한다(encode). MLV 프로테아제가 없는 경우, 폴리단백질은 절단되지 않은 상태로 남아 있고, 생성된 입자는 미성숙한 형태로 남아 있다. MMLV 핵산을 코딩하는 유전자는 본 명세서에서 서열번호 2로 제공된다. MMLV 핵산의 예시적인 코돈 최적화 서열은 서열번호 3으로 제공된다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 Gag 폴리펩티드는, 서열번호 1인 MMLV Gag 폴리펩티드와 실질적으로 상동성이다. 일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 Gag 폴리펩티드는 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 서열번호 1에 상동성인 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 Gag 폴리펩티드는 서열번호 1 또는 그의 코돈 축퇴 버전(codon degenerate version)과 실질적으로 동일하거나 동일하다. 서열번호 1과 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성을 공유하는 Gag 폴리펩티드 변이체가 당업계에 알려져 있다.
일부 구현예에서, 적합한 MMLV Gag 폴리펩티드는, 서열번호 2에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 일부 구현예에서, 적합한 MMLV Gag 폴리펩티드는 서열번호 2 또는 그의 코돈 축퇴 버전을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩된다.
이 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 바와 같이, 특정 아미노산(즉, 코돈)을 코딩하는 핵산을, 숙주 유기체에서 더 잘 발현되는 다른 코돈으로 대체함으로써 숙주 유기체에서 핵산 서열의 발현을 개선하는 것이 가능하다. 이 효과가 발생하는 하나의 이유는, 유기체마다 상이한 코돈에 대한 선호도를 나타내기 때문이다. 코돈 선호도에 따라 더 나은 발현을 달성하기 위해 핵산 서열을 변경하는 과정을 코돈 최적화라고 한다. 다양한 유기체에서 코돈 사용 편향(bias)을 분석하기 위한 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있고, 코돈 최적화된 유전자 서열의 설계에서 이러한 분석을 구현하기 위해 많은 컴퓨터 알고리즘이 개발되어 왔다. 따라서, 일부 구현예에서, 적합한 MMLV Gag 폴리펩티드는, MMLV Gag를 암로화하고, 서열번호 3에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% , 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성를 갖는, 핵산 서열의 코돈 최적화된 버전에 의해 코딩된다. 일부 구현예에서, 적합한 MMLV-Gag 폴리펩티드는 서열번호 3과 실질적으로 동일하거나 동일한 핵산 서열에 의해 코딩된다.
당업계에 잘 알려진 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열은, 뉴클레오티드 서열에 대한 BLASTN 및 아미노산 서열에 대한 BLASTP, 갭(gapped) BLAST 및 PSI-BLAST와 같은 상용 컴퓨터 프로그램에서 이용가능한 것을 포함하는 다양한 알고리즘 중 임의의 것을 사용하여 비교할 수 있다. 이러한 프로그램의 예는 Altschul, et al., 1990, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410; Altschul, et al., 1996, Methods in Enzymology 266:460-480; Altschul, et al., 1997 Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Baxevanis, et al., 1998, Bioinformatics: A Practical Guide to Analysis of Genes and Proteins, Wiley; 및 Misener, et al., (eds.), 1999, Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press 에 설명되어 있다. 상동성 서열을 확인하는 것 외에도 위에서 언급한 프로그램은 일반적으로 상동인 정도의 표시를 제공한다. 일부 구현예에서, 2개의 서열은, 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 상응하는 잔기는, 잔기의 관련 스트레치에 걸쳐(over a relevant stretch) 상동인 경우 실질적으로 상동인 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, 그 관련 스트레치는 완전한 서열이다. 일부 구현예에서, 그 관련 스트레치는, 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500개 이상의 잔기이다.
본 발명에 사용되는 Gag 폴리펩티드는, 실질적인 자가 조립 활성을 유지하면서 야생형 또는 자연 발생 Gag 폴리펩티드와 비교하여, 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환, 결실(deletions) 및/또는 삽입을 함유하는 변형된 레트로바이러스 Gag 폴리펩티드일 수 있다. 일반적으로, 본질적으로(in nature), Gag 단백질은 레트로바이러스 프로테아제, 역전사 효소(reverse transcriptase) 및 인테그라제 효소 활성을 포함할 수 있는 큰 C-말단 확장부(C-terminal extension)를 포함한다. 그러나, VLP 어셈블리는 일반적으로 이러한 구성 요소의 존재를 필요로 하지 않는다. 일부 경우에, 단독 레트로바이러스 Gag 단백질(예: C-말단 확장부가 없고; 게놈 RNA, 역전사 효소, 바이러스 프로테아제 또는 엔벨로프 단백질 중 하나 또는 그 이상이 없음)은 자가 조립되어, 시험관내 및 생체내 모두에서 VLP를 형성할 수 있다(Sharma S et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 10803-8).
본 발명에 따라 사용하기 위한 Gag 폴리펩티드는 C-말단 연장부가 없고 HCMV로부터의 pp65 항원과의 융합 단백질로서 발현된다. 자연적으로 발생하는 HCMV에서 pp65는 캡시드와 바이러스 외피 사이의 외피 내에 위치한다. 이것은 세포독성 T 세포 반응의 주요 표적이며 T 보조 세포의 형성을 자극하고 HCMV에 대한 세포독성 T 림프구(CTL)를 유도하는 것으로 알려져 있다. pp65 폴리펩티드는, 예를 들어, Gag 폴리펩티드 코딩 서열의 3' 말단에서, Gag 폴리펩티드 코딩 서열 내로 프레임이 ㅇ이어진다(spliced in frame). Gag 폴리펩티드 코딩 서열과 pp65 항원은 단일 프로모터에 의해 발현된다.
본 발명의 VLP는 또한, VLP의 표면에 HCMV gB 외피 당단백질을 발현한다. gB는, 강력한 체액성 면역 반응(potent humoral immune response)을 포함하는, 중화, 보호 면역 반응을 유도하는 HCMV의 주요 B 세포 항원 중 하나이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은, 그 서열이 서열번호 8 또는 서열번호 8의 코돈 축퇴 버전인, 야생형 외피 HCMV gB 폴리펩티드를 포함하여 구성되는 VLP를 포함하여 구성된다. 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 서열번호 9로 표시된다. 서열번호 9의 코돈 최적화된 버전은 서열번호 10으로 표시된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은, 서열번호 8에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상으로 상동인, 아미노산 서열을 갖는 gB 폴리펩티드를 포함하여 구성되는 VLP를 포함하여 구성된다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는,서열번호 9에 대해 핵산 서열에 의해 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상으로 상동인, 핵산 서열에 의해 코딩된다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는, 서열번호 10에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상으로 상동인, 서열번호 9의 핵산 서열의 코돈 최적화된 버전에 의해 코딩된다.
VLP를 포함하여 구성되는 조성물은 전형적으로 다양한 크기를 갖는 VLP의 혼합물을 포함할 것이라는 것이 이해될 것이다. 아래 나열된 직경 값은 혼합물 내에서 가장 빈번한 직경에 해당하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 구현예에서, 조성물 내 소포(포함하는 조성물)의 > 90%는 가장 빈번한 값(예를 들어, 1000 ± 500 nm)의 50% 내에 있는 직경을 가질 것이다. 일부 구현예에서 분포는 더 좁을 수 있고, 예를 들어 조성물 내 소포의 > 90%는 가장 빈번한 값의 40, 30, 20, 10 또는 5% 내에 있는 직경을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 초음파 처리를 사용하여 VLP 형성을 촉진하고 그리고/또는 VLP 크기를 변경할 수 있다. 일부 구현예에서, 여과, 투석(dialysis) 및/또는 원심분리를 사용하여 VLP 크기 분포를 조정할 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 VLP는 임의의 크기일 수 있다. 특정 구현예에서, 조성물은 약 20 nm 내지 약 300 nm 범위의 직경을 갖는 VLP를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, VLP는 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 nm의 하한으로 경계가 정해지고 300, 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 또는 170 nm의 상한으로 경계가 정해지는 범위 내의 직경을 갖는 것을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 집단(population) 내의 VLP는 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 nm의 하한으로 경계를 이루고, 300, 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 또는 170 nm의 상한으로 경계를 이루는 범위 내에서 평균 직경을 나타낸다. 일부 구현예에서, 집단 내의 VLP는 0.5 미만(예를 들어, 0.45 미만, 0.4 미만, 또는 0.3 미만)인 다분산 지수를 갖는다. 일부 구현예에서, VLP 직경은 나노사이징에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, VLP 직경은 전자 현미경에 의해 측정된다.
본 발명에 따른 VLP는 이 분야의 통상의 기술자에게 공지된 일반적인 방법론에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자, 재구성된 벡터 또는 플라스미드는 이 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 기술을 사용하여 제조할 수 있다. VLP에 대한 폴리펩티드의 재조합 발현은 하나 이상의 폴리펩티드(들)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 발현 벡터의 구성을 필요로 한다. 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 수득되면, 폴리펩티드의 생산을 위한 벡터는 당업계에 공지된 기술을 사용하는 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다. 본 발명에 따라 이용될 수 있는 발현 벡터는, 특히 포유동물 및 조류 발현 벡터, 바큘로바이러스 발현 벡터, 식물 발현 벡터[예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV), 담배 모자이크 바이러스(TMV)), 플라스미드 발현 벡터(예: Ti 플라스미드)]를 포함하되, 그에 한정되지 않는다. .
본 발명의 VLP는 임의의 이용가능한 단백질 발현 시스템에서 생산될 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터는 통상적인 기술에 의해 숙주 세포로 전달되고, 이어서 형질 감염된 세포(transfected cells)는 VLP를 생성하기 위해 통상적인 기술에 의해 배양된다. 일부 구현예에서, VLP는 세포의 일시적 형질 감염(transient transfection)을 사용하여 생성된다. 일부 구현예에서, VLP는 안정적으로 형질감염된 세포를 사용하여 생산된다. VLP 생산에 사용될 수 있는 전형적인 셀 라인(cell lines )은 인간 배아 신장[(HEK) 293, WI 38], 차이니즈 햄스터 난소(CHO), 원숭이 신장[(COS), HT1080, C10, HeLa], 아기 햄스터 신장[(BHK), 3T3, C127, CV-1, HaK, NS/O] 및 L-929 세포와 같은 포유동물 셀 라인을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 구체적인 비제한적 예는, BALB/c 마우스 골수종 계통(line)(NSO/1, ECACC 번호: 85110503); 인간 망막 모세포[PER.C6(CruCell, Leiden, The Netherlands)]; SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계통(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 계통[현탁 배양에서 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); 아기 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포 +/-DHFR [CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)]; 쥐 세르톨리 세포(mouse sertoli cells)[TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251(1980)]; 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1 587); 인간 자궁경부암 세포(HeLa, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 쥐(rat) 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065); 쥐 유선 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간종 계통(Hep G2)를 포함하되, 그에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, VLP 생산을 위해 사용될 수 있는 셀 라인은, 곤충(예를 들어, Sf-9, Sf-21, Tn-368, Hi5) 또는 식물(예를 들어, 레구미노사, 곡물 또는 담배) 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 특히 글리코실화가 단백질 관능에 중요한 경우, 포유동물 세포가 단백질 발현 및/또는 VLP 생산에 바람직하다는 것이 이해될 것이다(예를 들어, Roldao A et al., 2010 Ext Rev Vaccines 9:1149-76 참조).
삽입된 서열의 발현을 조절하거나(modulate) 특정 방식으로 유전자 산물을 변형 및 처리하는 세포주(cell strain)가 선택될 수 있음이 이해될 것이다. 상이한 세포들은, 단백질 및 유전자 산물의 번역 후 처리 및 변형(post-translational processing and modification)을 위한 특징적이고 특정한 메커니즘을 가지고 있다. 발현된 외래 단백질(foreign protein)의 올바른 변형 및 처리를 보장하기 위해 적절한 셀 라인 또는 숙주 시스템을 선택할 수 있다. 일반적으로, 1차 전사체(primary transcript)의 적절한 처리, 유전자 산물의 글리코실화 및 인산화를 위한 적절한 세포 기구(cellular machinery)를 보유하는 진핵 숙주 세포(패키징 세포(예: 293T 인간 배아 신장 세포)라고도 함)가 본 발명에 따라 사용할 수 있다.
VLP는, 무엇보다도, 원심분리, 그래디엔트(gradients), 자당-구배 (sucrose -gradient) 초원심분리, 접선 흐름 여과(tangential flow filtration) 및 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환(음이온 및 양이온), 친화성 및 사이징 컬럼 크로마토그래피(affinity and sizing column chromatography)), 또는 차등 용해도(differential solubility)와 같은 공지된 기술에 따라 정제될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 세포 상등액(cell supernatant )을 정제 단계 없이 직접 사용할 수 있다. 추가 항원 또는 애주번트와 같은 추가 엔티티(Additional entities)가 정제된 VLP에 추가될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 VLP를 생성하기 위해, 세포는 2개의 발현 벡터, 즉 Gag-pp65 융합 폴리펩티드를 코딩하는 제1 벡터 및 gB 외피 당단백질을 코딩딩하는 제2 벡터로 공동-형질감염된다(co-transfected). 공동 형질감염된 HCMV gB 플라스미드는 세포 표면에서 발아하는(budding) 입자가 gB 단백질을 지질 이중층으로 통합할 수 있도록 한다. 그 결과, HCMV pp65 비구조 단백질 및 HCMV gB 외피 당단백질을 포함하여 구성되는 "2가" VLP가 생성된다. 전형적으로 이러한 VLP의 gB 함량(content)은 pp65 함량의 1/40~1/5이고, 일반적으로 pp65 함량의 1/10~1/20이다.
본 발명자들은, 이전에 중화 항체의 생산을 자극하는 천연 형태로(in its native conformation) 제공되는 gB 표면 항원, 및 헬퍼 T 세포(TH 림프구)와 세포독성 T 세포(CTL)를 유도하는 pp65 외피 단백질을 포함하는 HCMV VLP 백신의 개발을 보고한 바 있다(WO 2013/0688477). 건강한 피험자의 말초 혈액 단핵 세포를 사용한 연구에서, 이 VLP는 재조합 gB 및 pp65 항원 단독에 의해 생성된 반응보다 우수한 CD4+ 및 CD8+ T 세포 면역 반응을 자극하는 것으로 나타났다(실시예 3 참조).
본 발명의 조성물은 애주번트, 과립구-대식세포 집락-자극 인자 (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)를 추가로 포함하여 구성된다. GM-CSF는 사이토카인으로 기능하는 대식세포, T 세포, 비만 세포, 자연 살해 세포, 내피 세포 및 섬유아세포에서 분비되는 단량체성 당단백질이다. 연구에 따르면 GM-CSF를 생산하도록 유전적으로 변형된 방사선 조사된 종양 세포를 사용한 백신 접종이 강력한 항종양 면역을 촉진하는 것으로 나타났다(Dranoff, G. Proc.Natl. Acad. Sci. 1993; 90: 3539-3542). GM-CSF는 항원 제시 세포의 발달 및 성숙을 촉진하고 면역계를 Th1-유형 반응으로 편위시키는(skew) 것으로 나타났다(Arellano, M. & Lonial, S. Biologics. 2008; 2:13-27). 그 결과, GM-CSF는 GBM의 치료를 포함하는 암 면역요법(Clive, KS Expert Rev Vaccines 2010; 9:529-525)에서 애주번트로 제안되었다(Schijns, VE Vaccine 2015; 33: 2690-2696).
건강한 HCMV-양성 피험자로부터의 세포를 사용한 생체외 연구에서, 본 발명의 발명자들은 본 발명의 조성물에 GM-CSF을 포함시키는 것이, gB/pp65Gag VLP 자극에 의해 인터페론-γ(IFN-γ)의 T 세포 생성을 촉진한다는 것을 보여주었다. 위에서 논의된 바와 같이, IFN-γ는 항종양 효과 분자(anti-tumor effector molecule)로 확인되었으며, IFN-γ 또는 IFN-γ 신호전달(signaling)이 결핍된 마우스는 종양 형성에 더 민감하다. 따라서, 종양 반응성 T 세포에 의한 IFN-γ의 분비는 더 큰 효능과 연관될 수 있는 바람직한 바이오마커를 나타낸다. 실시예 4에 추가로 기술된 바와 같이, 건강한 피험자의 세포는 본 발명의 조성물의 존재하에 IFN-γ의 증가를 나타낸다. 이들은, 지속적인(sustained) IFN-γ생성으로 Th1 반응에 대한 T 세포 재활성화(reactivation)를 유도하기 위해 GM-CSF로 제형화된 gB/pp65Gag eVLP의 사용을 뒤받침한다.
본 발명의 예시적인 조성물의 면역학적 효과를 더 평가하기 위해, 항원에 노출된 적이 없고(naive) 건강한 마우스에서 시험하였다. 치료에 대한 T 세포 반응은 IFN-γ-분비 CD4+ T 세포의 변화를 측정하여 평가하였다. 처리된 마우스의 비장세포에서, 본 발명의 조성물은 재조합 pp65를 사용한 생체외 재활성화 후 IFN-γ-분비 CD4+ T 세포의 증가에 의해 나타난 바와 같이 HCMV-특이적 Th1 반응을 자극할 수 있었다. 이들 데이터는, 본 발명의 예시적인 조성물이 순수한 건강한 동물에서 새로운 HCMV-특이적 T 세포 반응을 유도할 수 있음을 입증하고, 이는 건강한 HCMV-양성 피험자로부터 수득된 세포를 사용하여 생체외 연구에서 수득된 결과를 확인시켜준다. 그러나, 설치류 연구로부터의 결과는 HCMV에 대한 면역성을 나타내는 인간 GBM 환자에서 T 세포 반응을 자극하는 본 발명의 조성물의 효과를 입증할 수 없다. 본 발명의 조성물이 GBM 피험자에서 면역 조절장애의 효과를 상쇄하는 데 효과적인지 여부를 평가하기 위해, 인간 GBM 환자에서 조성물을 시험할 필요가 있다.
본 발명의 조성물은 I-II상 투여량 증량 연구(dose escalation study)에서 인간 GBM 환자에게 시험되었다. 재발성(recurrent) GBM이 있는 총 18명의 피험자를 각각 6명의 피험자로 구성된 3개의 그룹으로 나누었다. 각 그룹에는 본 발명의 조성물의 다음 3가지 투여량 중 하나가 할당되었다:
저 투여량 - (0.4 ㎍ pp65 함량) 0.2 mL 부피 중에 GM-CSF(200 ㎍)로 제형화
중간 투여량 - (2㎍ pp65 함량) 0.2 mL 부피 중에 GM-CSF(200 ㎍)로 제형화
고 투여량 - (10 ㎍ pp65 함량) 0.2 mL 부피 중에 GM-CSF(200 ㎍)로 제형화
조성물은 질병 진행이 확립되었을(disease progression was established) 때까지, 4주마다, 별개의 부위에 2회의 동일한 피내 주사로 투여되었다.
환자는 첫 번째 주사 전에 HCMV gB 항원에 대한 항체에 대해 테스트되었다. 환자의 절반 이상이 gB에 대한 항체를 나타내지 않았으며, 이는 환자 집단에서 HCMV에 대한 큰 면역 조절 장애(dysregulation of immunity)를 나타낸다.
I-II상 임상 연구의 결과는, 시험된 조성물의 각 투여량이 일부 GBM 환자에서 면역 반응을 자극할 수 있음을 보여준다. 조성물에 대한 면역 반응을 보인 6명의 피험자 중 3명은 최고 투여량 그룹에, 2명은 최저 투여량 그룹에, 1명은 중간 투여량 그룹에 있었다. 따라서 각 투여량에서 일부 피험자는 면역 반응을 보였다. 그러나, 저투여량 및 중간 투여량의 조성물은, HCMV gB 단백질에 대한 검출가능한 항체의 결핍에 의해 입증된 바와 같이, 첫 번째 주사 전에 면역 조절장애를 보인 환자에서 T 세포 반응을 자극하지 않았다. 놀랍게도, 최고 투여량의 조성물은 HCMV에 대한 상당한 면역 조절 장애를 가진 환자 5명 중 3명에서 T 세포 반응을 자극할 수 있었다. 모든 투여량군에서 백신에 반응한 환자들 역시 질병 안정화의 형태로 생리학적 반응을 보였다. 특히, 백신 반응자는 12주 이상 동안 안정 병변(stable disease)을 나타내었고 비반응자에 비해 전체 생존 중앙값에서 6.25개월 개선을 보였다. 가장 놀랍게도, 최고 투여량 그룹의 2명의 환자는 원발성 종양의 크기가 60% 감소한 것을 경험했다.그 결과는 조성물의 각 투여량이 면역 반응을 유도할 가능성이 있음을 보여준다. 그러나, 최고 투여량의 조성물을 투여받은 환자는 저투여량 및 중간 투여량을 투여한 환자와 다르게 반응하였다. 특히, 최고 투여량은 GBM 환자에서 관찰된 면역 조절 장애를 극복할 수 있었다. HCMV에 대한 면역이 회복되면서 반응성 GBM 환자는 GBM 종양 세포의 증식을 방지하는 T 세포의 능력을 이용할(harness) 수 있었고 결과적으로 개선된 전체 생존 시간을 경험할 수 있었다. 따라서, 본 발명은 GBM의 면역학적 치료, 구체적으로 특정 GBM 환자에서 안정 병변 및 더 긴 생존 시간을 달성할 수 있을 뿐만 아니라, 10 ㎍ pp65 함량.투여량의 치료를 사용하여 HCMV 면역 조절장애를 반전시킬 수 있는 조성물의 상당한 발전을 기술한다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 애주번트로서 GM-CSF로 제형화된 pp65-gB VLP를 포함하여 구성되는 GBM의 치료용 조성물을 적어도 0.4 ㎍ pp65 및 200 ㎍ GM-CSF의 투여량으로 제공한다. 일부 구현예에서, 또한 본 발명은 애주번트로서 GM-CSF로 제형화된 pp65-gB VLP를 포함하여 구성되는 GBM의 치료용 조성물을 적어도 10 ㎍ pp65 및 200 ㎍ GM-CSF의 투여량으로 제공하며, 이 투여량은, HCMV에 대한 면역 조절 장애를 보이는 GBM 환자에서 T 세포 반응을 자극하는 데 효과적이다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기술된 VLP 그리고 GM-CSF를 포함하여 구성되는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 적어도 하나의 제약상 허용되는 부형제, 애주번트 및/또는 담체를 추가로 포함하여 구성된다. 이러한 약제학적 조성물은 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 추가 치료 활성 물질과 조합하여 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 제약 조성물은 멸균 주사가능한 형태(예를 들어, 피내 주사에 적합한 형태)로 제공될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 제약 조성물은 주사에 적합한 액체 투여 형태로 제공된다. 일부 구현예에서, 제약 조성물은, 임의선택적으로 진공 하에, 주사 전에 수성 희석제(예를 들어, 물, 완충액, 염 용액 등)로 재구성되는 분말(예를 들어, 동결건조 및/또는 멸균)로서 제공된다. 일부 구현예에서, 제약 조성물은 물, 염화나트륨 용액, 아세트산나트륨 용액, 벤질 알코올 용액, 인산염 완충 식염수 등에 희석 및/또는 재구성된다. 일부 구현예에서, 분말은 수성 희석제와 부드럽게 혼합되어야 한다(예를 들어, 흔들지 않음).
일부 구현예에서, 제공된 제약 조성물은 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용되는 부형제(예를 들어, 보존제, 불활성 희석제, 분산제, 표면 활성제 및/또는 유화제, 완충제 등)를 포함하여 구성된다. 적합한 부형제는 예를 들어 물, 식염수, 덱스트로스, 수크로스, 트레할로스, 글리세롤, 에탄올 또는 유사물, 및 이들의 조합을 포함한다. Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro, (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006)은 제약 조성물을 제형화하는데 사용되는 다양한 부형제 및 그의 제조를 위한 공지된 기술을 개시하고 있다. 임의의 통상적인 부형제 매체가 바람직하지 않은 생물학적 효과를 생성하거나 제약 조성물의 다른 성분(들)과 유해한 방식으로 상호작용하는 것과 같이 물질 또는 그의 유도체와 양립할 수 없는 경우를 제외하고, 부형제의 사용은 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, 제약 조성물은 하나 이상의 보존제를 포함하여 구성된다. 일부 구현예에서, 제약 조성물은 보존제를 포함하여 구성되지 않는다.
일부 구현예에서, 제약 조성물은 냉장 및/또는 냉동될 수 있는 형태로 제공된다. 일부 구현예에서, 재구성된 용액 및/또는 액체 투여 형태는 재구성 후 특정 기간(예를 들어, 2시간, 12시간, 24시간, 2일, 5일, 7일, 10일, 2주, 한 달, 두 달 또는 그 이상) 저장될 수 있다. 일부 구현예에서, 지정된 시간보다 더 긴 시간 동안 VLP 제제를 저장하면 VLP 분해(VLP degradation)가 발생한다.
본 명세서에 기술된 제약 조성물의 제제는 약리학 분야에서 공지되거나 이후 개발될 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 제조 방법은 활성 성분을 하나 이상의 부형제 및/또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 걸합(bringing into association with )시킨 다음, 필요하고 그리고/또는 바람직한 경우, 제품을 원하는 단일 또는 다중 투여량 단위로 포장하는 단게를 포함한다..
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 단일 단위 투여량 및/또는 복수의 단일 단위 투여량으로서 대량으로 제조, 포장 및/또는 판매될 수 있다. 본 명세서에 사용된 "단위 투여량"은 미리 결정된 양의 활성 성분을 포함하여 구성되는 약학 조성물의 별개의 분리된 양(discrete amount )이다. 활성 성분의 양은 일반적으로 피험자에게 투여되는 투여량 및/또는 이러한 투여량의 편리한 분획, 예를 들어 이러한 투여량의 1/2 또는 1/3과 동일하다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물의 투여량은 동시에 2개의 별도의 절반 투여량으로 전달된다.
활성 성분, 약학적으로 허용되는 부형제, 및/또는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 임의의 추가 성분의 상대적인 양은 피험자의 신원(identity), 크기 및/또는 상태에 따라 그리고/또는 조성물이 투여되는 경로에 따라 달라질 수 있다.
일부 구현예에서, 치료는 본 발명의 조성물의 적절한 시간 간격의 다중 투여를 포함한다. 본 명세서에 기술된 조성물은 일반적으로 면역 반응을 계속 유도하는 시간 동안, 또는 환자가 질병의 진행을 경험할 때까지 투여될 것이다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 4주마다 투여된다.
일부 구현예에서, 투여될 면역원성 조성물의 정확한 양은, 적어도 약 0.4 ㎍ pp65 및 약 200㎍ GM-CSF이고, HCMV에 대한 면역 조절 장애를 나타내는 피험자의 경우, 적어도 약 10㎍ pp65 및 약 200㎍ GM-CSF이다. 일부 구현예에서, 투여된 면역원성 조성물은 (i) 적어도 약 0.4 ㎍ pp65 (예를 들어, 약 0.4 ㎍, 약 0.5 ㎍, 약 0.6 ㎍, 약 0.7 ㎍, 약 0.8 ㎍, 약 0.9 ㎍, 약 1㎍, 약 2㎍ 이상의 pp65) 및 (ii) 적어도 약 200㎍ GM-CSF(예: 약 200㎍, 약 250㎍, 약 300㎍, 약 350㎍, 약 400㎍, 약 450㎍, 약 500㎍ 이상의 GM-CSF)을 포함하여 구성된다. 일부 구현예에서, HCMV에 대한 면역 조절 장애를 나타내는 피험자의 경우, 투여된 면역원성 조성물은 (i) 적어도 약 10 ㎍ pp65(예를 들어, 약 10 ㎍, 약 15 ㎍, 약 20 ㎍, 약 25 ㎍ , 약 30 ㎍, 약 35 ㎍, 약 40 ㎍, 약 50 ㎍ 이상의 pp65) 및 (ii) 약 200 ㎍ 이상의 GM-CSF(예: 약 200 ㎍, 약 250 ㎍, 약 300 ㎍, 약 350 ㎍, 약 400 ㎍, 약 450 ㎍, 약 500 ㎍ 이상의 GM-CSF)를 포함하여 구성된다. 바람직한 투여량은 피험자마다 다를 수 있으며, 여러 요인에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 일반적으로 사용되는 정확한 투여량은, 처방 의사에 의해 결정될 것이며, 피험자의 체중뿐만 아니라 피험자의 연령 그리고 가능하게는 질병의 진행 및 환자의 HCMV에 대한 면역 조절 장애의 정도에 따라 달라질 것이라는 점을 이해해야 한다.
특정 구현예에서, 제공된 조성물은 예를 들어 주사에 의한 비경구 전달을 위해 제제화될 수 있다. 이러한 구현예에서, 투여는 예를 들어 정맥내, 근육내, 피내, 또는 피하, 또는 인퓨젼(infusion) 또는 무바늘(needleless) 주사 기술을 통한 것일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 조성물은 피내 주사용으로 제제화된다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌은 그 전체가 본 명세서에 참고문헌으로 통합된다. 또한, 재료, 방법 및 예는 예시일 뿐이며 제한하려는 것으로 의도된 것이 아니다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 등가인 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 본 명세서에 기술되어 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다. 실시예는 설명 목적으로만 제공된다. 그것들은 어떤 식으로든 개시 내용의 범위 또는 내용을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
실시예 1: DNA 발현 플라스미드의 구축
이 실시예는 재조합 HCMV 유전자 서열(gB 및 Gag/pp65 융합 유전자 서열)의 발현을 위한 발현 플라스미드 및 구조체의 개발(development of expression plasmids and constructs)을 설명한다. 표준 발현 플라스미드는 일반적으로 포유류 기원의 프로모터 서열, 인트론(intron) 서열, 폴리아데닐화 신호 서열(PolyA), pUC 복제 기원 서열(pUC -pBR322는 colE1 기원/복제 개시 부위이며, E. Coli(DH5α)와 같은 박테리아에 플라스미드를 복제하는데 사용됨) 및 플라스미드 플라크 선택을 위한 선택 가능한 마커로서 항생제 내성 유전자(antibiotic resistance gene)로 구성된다. 인트론 다음의 플라스미드 내에는, 관심 있는 유전자 또는 부분 유전자 서열을 스플라이싱하는 데 사용할 수 있는 다양한 제한 효소 부위(restriction enzyme sites)가 있다.
Propol II 발현 플라스미드는, pHCMV(HCMV의 초기 프로모터), 베타-글로빈 인트론(BGL Intron), 토끼 글로빈 폴리아데닐화 신호 서열(PolyA), 복제 서열의 pUC 기원(pUC - pBR322가 colE1 기원/복제 개시 부위이며 대장균(E. coli)(DH5α)과 같은 박테리아에서 플라스미드를 복제하는 데 사용됨), 및 암피실린 내성 유전자 β-락타마제(플라스미드에 대한 Amp R-선택성 마커가 암피실린에 대한 내성을 부여함(100㎍/ml))을 함유한다.
Gag MMLV 발현 구조체("MLV-Gag")을 개발하기(develop) 위해, MMLV의 Gag 폴리단백질(C 말단 Pol 서열이 없는 Gag)을 코딩하는 상보적 DNA(cDNA) 서열(서열 번호: 3)을 Propol II 발현 벡터에서 클로닝하였다. gB 발현 구조체("gB")를 개발하기 위해 gB의 전체 길이 서열은 인간 발현(GenScript)에 대해 코돈 최적화되었고, gB의 세포외 부분, 트랜스멤브레인 도메인(TM) 및 세포질 부분(Cyto)을 포함하는 Propol II 발현 벡터에 클로닝되었다. Gag/pp65 발현 구조체("Gag/pp65")를 개발하기 위해 MMLV의 Gag 폴리단백질(C 말단 Pol 서열이 없는 Gag)을 코딩하는 서열을 인간 발현(GenScript)에 최적화된 pp65 코돈의 전체 길이 서열과 융합시켰고, Propol II 발현 벡터에 클로닝되었다.
DNA 플라스미드를 컴피턴트(competent) E. coli(DH5α)에서 증폭하고, 표준 프로토콜에 따라 내독소-없는 제조 키트로(with endotoxin-free preparation kits) 정제하였다.
실시예 2: 바이러스 유사 입자의 생산
이 실시예는 실시예 1에 기술된 다양한 재조합 HCMV 항원을 함유하는 바이러스-유사 입자의 생산 방법을 설명한다.
HEK 293 세포로부터 유래된 293SF-3F6 셀 라인을 무혈청 화학적으로 정의된 배지(CA 2,252,972 및 US 6,210,922)에서 성장된 독점적인 현탁 세포 배양물이다. 세포를 인산칼슘 방법을 사용하여 MMLV-Gag /pp65 DNA 발현 플라스미드로 일시적으로 형질감염시키고 gB DNA 발현 플라스미드로 공동 형질감염시켰다. HEK 293 세포에 의한 HCMV 항원의 발현을 유세포 분석(flow cytometry)에 의해 확인하였다. 48~72시간의 형질감염 후, VLP를 함유하는 상등액을 수확하고(harvest) 0.45μm 기공 크기 막을 통해 여과하고 SW32 Beckman 로터(25,000rpm, 2시간, 4℃)에서 20% 자당 쿠션을 통한 초원심분리로 추가 농축 및 정제했다. . 펠렛을 멸균 내독소가 없는 PBS(GIBCO)에 재현탁하여 500배 농축된 VLP 스톡을 얻었다. 총 단백질은 Bradford 분석 정량 키트(BioRad)에 의해 부분 표본으로(on an aliquot) 결정되었다. 정제된 VLP는 사용할 때까지 -80℃에서 보관되었다. 정제된 VLP의 각 로트를, SDS-Page and Western Blot에 의해, gB에 대한 특이적 항체(specific antibody to gB )(gB에 대한 CH 28 마우스 모노클로날 항체; Virusys Corporation; Pereira, L et al 1984 Virology 139:73-86), 및 pp65에 대한 특이적 항체(UL83/pp65에 대한 CH12 마우스 모노클로날 항체; Virusys Corporation; Pereira, L. et al. 1982 Infect Immun 36: 924-932)로 gB 및 MMLV-Gag/pp65 융합 단백질의 발현에 대하여 분석했다. ECL(Enhanced chemilluminescence)을 사용하여 항체를 검출했다.
실시예 3: gB/pp65 Gag VLP를 사용한 건강한 HCMV-양성 피험자의 PBMC에서 T 세포의 자극
이 연구의 목적은 실시예 2에 기술된 바와 같이 생산되고, 건강한 HCMV 양성 피험자로부터의 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells, " PBMCs')에 사전 존재하는 HCMV-특이성 CD4+ and CD8+ T 세포를 활성화하기 위해 자당 쿠션 초원심분리에 의해 정제된 gB/pp65 Gag VLP의 능력을 평가하기 위한 것이었다.
CMV+ 건강한 기증자로부터 인간 말초 혈액을 얻었다. Ficoll 구배 분리를 사용하여 전체 혈액에서 PBMC를 분리하고 일회용 부분 표본을 생성했다. PBMC는 분리 후 신선하게 또는 -170℃에서 보관 후 사용되었다. 간단히 말해서, PBMC를 4mL PP 배양 튜브에서 1 x 106세포/mL로 배양했다. gB/pp65 eVLP 및 대조군을 세포에 추가했다. 세포를, 모넨신을 첨가하기 전에, 자극제와 함께 3시간 동안 배양하고 추가로 10시간 동안 배양하였다.
IFN-γ-분비 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 빈도의 관점에서 생체외 PBMC 배양물에서 효능을 평가하였다. 세포를 수집하고 PerCP-접합된 항-CD3, PE-접합된 항-CD4 및 APC-접합된 항-CD8 단일클론 항체를 사용하여 표면 항원에 대해 염색했다. 그런 다음 세포를 투과처리하고(permeabilize), BV510-접합된 항-IFNγ으로 세포내 염색을 위해 고정시켰다. 염색된 웰을 FACS Accuri(Beckton-Dickinson)에서 유세포 분석으로 분석했다. FlowJo 소프트웨어(TreeStar)를 사용하여 CD3+ 세포에서 게이팅(gating)을 먼저 수행하여 CD3+CD4+ 또는 CD3+CD8+ 집단 중 IFN-γ 분비 세포의 비율을 평가했다.
데이터는 하기 표 1과 같다. 데이터는 빈(empty) VLP(gB/pp65 VLP를 포함하여 구성되는 조성물의 경우) 또는 자극되지 않은 세포(재조합 단백질의 경우)로 자극에 대한 배경 반응(background responses to stimulation)을 뺀 후 세포의 평균 백분율로 표시되어 있다.
조성물 CD4+ 집단내의
평균 % IFNγ+ T 세포 		CD8+ 집단내의
평균 % IFNγ+ T 세포
gB/pp65Gag VLP (2 ㎍/ml) 0.4811 0.8422
gB/pp65Gag VLP (1 mg/ml) 0.4511 1.537
재조합 gB (2 ㎍/ml) + pp65 0.0656 0.4789
재조합 gB (1 ㎍/ml) + pp65 0.0889 0.8433
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 2가 gB/pp65 Gag VLP는 CD4+ 및 CD8+ IFN-γ-분비 T 세포 반응 둘 모두를 생체외에서 자극한다. 재조합 gB 및 pp65 단백질의 조합은 건강한 피험자의 PBMC에서 CD8+ 및 특히 CD4+ T 세포 반응을 자극하는 데 2가 VLP보다 덜 효과적이었다.
실시예 4: GM-CSF와 함께 gB/pp65 Gag VLP를 사용한 건강한 피험자의 PBMC에서 T 세포의 자극
이 연구의 목적은 건강한 공여자로부터 HCMV-특이적 생체외 배양된 T 세포를 재활성화하기 위해 GM-CSF로 제형화된 gB/pp65 Gag VLP의 능력을 평가하는 것이었다. T 세포 재활성화는, IFN-γ-분비 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 빈도의 관점에서, 또는 1 군(panel)의 사이토카인과 케모카인의 분비에 기초하여 평가되었다.
실시예 3의 방법을 사용하여 4명의 건강한 공여자로부터 PBMC를 단리하고(isolate), 2회 투여량의 gB/pp65 Gag VLP 및 2회 투여량의 GM-CSF 및 자극 대조군(stimulation controls)과 함께 배양하였다. 배양 후, 실시예 3에 기술된 바와 같이 표면 및 세포내 염색을 위해 세포를 수집하거나, 제조사의 지침에 따라 시판되는 ELISA 키트를 사용하여 사이토카인 및 케모카인 분석을 위해 상등액을 수집하였다.
IFN-γ 분비 T 세포의 빈도로서 결과를 표 2에 나타내었다.
조성물(각각 10ng/ml GM-CSF 함유) CD4+ IFNγ CD8+ IFNγ
gB/pp65Gag VLP (0.25 ㎍/ml gB) 1.995 1.195
gB/pp65Gag VLP (1 ㎍/ml) 및 1.643 1.133
0.25 ㎍/ml gB와 동등한 빈 GAG 0.308 0.120
1 ㎍/ml gB와 동등한 빈 GAG 0.300 0.143
표 2에 나타낸 바와 같이, GM-CSF로 제형화된 gB/pp65 Gag VLP는 배양된 PBMC에서 IFNγ-생성 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 자극한다.
실시예 5: GM-CSF로 제형화된 gB/pp65Gag VLP를 사용한 마우스에서의 면역 반응의 특성화
이 연구의 목적은 GM-CSF로 제형화된 2가 gB/pp65 Gag VLP에 의해 마우스에서 생체내 유도된 면역 반응을 특징짓는 것이었다.
6-8 주령의 암컷 Balb/C 마우스 24 마리를 Charles River Laboratories(St-Constant, Quebec, Canada)에서 구입했다. 동물이 적응하도록(acclimatize) 하였다. 도착 시 마우스의 체중은 18.1 ± 0.42g이었다. 도착 시, 마우스를 그룹당 4 마리의 동물을 포함하는 3개의 그룹으로 무작위로 나누었다. 모든 그룹의 VLP 투여량은 ELISA를 사용한 gB 함량에 기초한 0.5㎍ gB 및 2.5 ㎍/쥐 GM-CSF의 투여량(2.5 ㎍/dose of murine GM-CSF)이었다. 0일 및 28일에, 5 ㎍/ml GM-CSF로 제형화된 2가 gB/pp65 Gag VLP 또는 빈 VLP-GM-CSF 대조군으로 마우스를 면역화시켰다.
그룹당 4마리 동물로부터의 비장세포 및 혈액의 수집은 2차 면역화 후 10일째에 예정되었다. 새로 단리된 세포를 완전한 DMEM에서 배양하고, 유세포 분석에 앞서서, gB/pp65Gag VLP 또는 재조합 gB, 재조합 pp65 또는 빈 Gag VLP로 16시간 동안 자극했다. CD3+CD4+ T 세포에서 IFNγ의 발현 수준은 상업용 키트를 사용하여 평가하였다.
그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
조성물 CD4+ 집단 내의
평균 % IFNγ+ T 세포		 평균 항-HCMV gB 특이성
총IgG 항체가
gB/pp65Gag VLP (1 ㎍/ml)
+ 5 ㎍/ml GM-CSF		 1.4 3691
5 ㎍/ml GM-CSF 0.25 38.38
표 3에 나타낸 바와 같이, gB/pp65 Gag VLP는 재조합 pp65로 생체외 재활성화 후 IFN-γ-분비 CD4+ T 세포의 증가에 의해 지시된 바와 같이 CMV-특이적 Th1 반응을 유도할 수 있다. 이러한 데이터는 GM-CSF로 제형화된 gB/pp65 Gag eVLP는 항체에 접촉한 적이 없는 동물(naive animals)에서 새로운(de novo) CMV-특이적 T 세포 반응을 유도할 수 있으며, 이는 건강한 피험자와 GBM 환자로부터 얻은 PBMC의 생체 외 자극 연구에서 얻은 결과를 확인시켜준다.
실시예 6: 인간 GBM 환자에서 gB/pp65 Gag VLP의 임상 시험
애주번트로서 GM-CSF로 제형화된 gB/pp65 Gag VLP를 포함하여 구성되는 면역원성 조성물의 안전성, 내약성 및 최적 투여량 수준을 정하기 위해 gB/pp65Gag VLP를 투여량-증량 연구(dose-escalation study)에서 시험하였다.
테모졸로미드의 유무에 관계없이, 수술 및 방사선 요법을 포함하는 초기 치료 후 재발성 WHO 등급 IV GBM 및 종양 재발(임의의 수의 재발) 또는 진행의 명백한 증거가 있는 18명의 성인 피험자(18-70세)가 연구에 참가했다. 피험자들은 각각 6명의 참가자로 구성된 3개의 그룹으로 나뉘었다. 각 그룹은 임상 질병 진행이 확인될 때까지 4주마다 다음 3가지 투여량 중 하나를 투여받았다.
그룹 1: 0.2mL 부피에 GM-CSF(200㎍)로 제형화된 저투여량(0.4㎍ gB/pp65 Gag VLP) 백신.
그룹 2: 0.2mL 부피에 GM-CSF(200㎍)로 제형화된 중간 투여량(2㎍ gB/pp65 Gag VLP) 백신.
그룹 3: 0.2mL 부피에 GM-CSF(200㎍)로 제형화된 고투여량(10㎍ gB/pp65 Gag VLP) 백신.
연구용 약물은 별개의 주사 부위에 2회의 동일한 피내 주사로 투여되었다. 한 피험자가 임상 질환 진행에 대한 기준을 충족했을 때, 그 피험자는 연구 치료에서 제외되었고 더 이상 백신 반응에 대해 평가되지 않았다. MRI를 사용하여 종양 크기를 측정하여 임상 질환 진행을 모니터링했다. 피험자들은 문서화된 종양 진행을 보일 때까지 첫 번째 주사 날짜부터 모니터링되었다.
연구 약물에 대한 반응은 다음과 같이 밝혀졌다:
Figure pct00001
기준선 및 각 약물 투여 2주 후 ELISA 분석에 의한 HCMV gB 항원에 대한 항체가는, 기준선 및 주사 후 샘플에서 혈청 IgG 항gB 항체가의 결과를 제공했음.
Figure pct00002
IFN-γ 및 IL-5 ELISPOT을 사용하여 HCMV gB 및 pp65 항원에 대한 세포 면역성을 기준선에서 그리고 각 치료 후 2주에서 평가했음. 결과는 기준선에서 그리고 각 치료 후에, HCMV 자극 후 IFN-γ 및 IL-5 스폿/3x105 PBMC의 빈도로 제공되었음.
Figure pct00003
최초 투여일부터 진행일(또는 사망일)까지의 무진행 생존(PFS).
매우 빠른 질병 진행으로 인해 3명의 임상 시험 피험자로부터 샘플을 얻을 수 없었으므로 이들 피험자에 대한 데이터를 얻을 수 없었다. 그 나머지 15명의 피험자에 대한 데이터는 아래 표 4 및 5(저투여량), 표 6 및 7(중간 투여량), 및 표 8 및 9(고투여량)에 나타나 있다. 세포 면역(CMI) 데이터는 106 PBMC당 스폿 형성 세포(SFC)로 표현된다. 종양 반응은, 피험자가 테스트에서 월별로 SD(안정 변병), PD(진행된 질병) 또는 ?(테스트가 결정적이지 않음; test inconclusive) 상태로 남아 있는 것을 보여준다.
표 4 - 저투여량 백신 접종 피험자
피험자 기준선
gB 역가		 치료후
피크 항체가 		gB CMI
SFC/106
PBMCs		 치료후 IFN-γ 분비
gB 특이적 T 세포의
피크 #
01-003 EPT: 86,885 751,226 SFC: 0 456
01-005 EPT: 500 500 SFC: 0 0
01-004 EPT: 195412 207653 SFC: 6 39
01-006 EPT: 49,273 185,752 SFC: 166 38
01-007 EPT: 83,920 125,893 SFC: 1 380
01-009 EPT: 500 500 SFC: 4 0
표 5 - 저투여량 백신 접종 피험자
피험자 pp65 CMI
SFC/106 PBMCs		 치료후 IFN-γ 분비
pp65 특이적 T 세포의
피크 # 		백신 유도 반응 종양 반응 (월별 표시)
01-003 SFC: 0 2,500 예 SD→SD→SD→SD→SD
01-005 SFC: 0 0 아니오 ?→?→PD
01-004 SFC: 0 0 아니오 PD
01-006 SFC: 0 0 아니오 PD
01-007 SFC: 0 847 예 PD
01-009 SFC: 4 8 아니오 PD
표 6 - 중간 투여량 백신 접종 피험자

피험자		 기준선
gB 역가		 치료후 피크
항체가 		gB CMI
SFC/106 PBMCs		 치료후 IFN-γ 분비
gB 특이적 T 세포의 피크 #
01-012 EPT: 124,595 494,373 SFC: 1 55
01-013 EPT: 500 500 SFC: 0 5
01-016 EPT: 500 500 SFC: 8 0
03-001 EPT: 500 500 SFC: 5 21
표 7 - 중간 투여량 백신 접종 피험자

피험자		 pp65 CMI
SFC/106 PBMCs		 치료후 IFN-γ 분비
pp65 특이적 T 세포의 피크 #
백신 유도 반응		 종양 반응 (월별 표시)
01-012 SFC: 181 2756 예 SD→PD
01-013 SFC: 0 4 아니오 PD
01-016 SFC: 66 0 아니오 SD →PD
03-001 SFC: 1 55 아니오 SD →
첫 달 후 자진 탈퇴
표 8 - 고투여량 백신 접종 피험자

피험자		 기준선
gB 역가		 치료후
피크 항체가 		gB CMI
SFC/106 PBMCs		 치료후 IFN-γ 분비
gB 특이적 T세포의
피크 #
01-017 EPT: 500 500 SFC: 0 0
03-003 EPT: 500 10,977 SFC: 5 0
01-018 EPT: 500 500 SFC: 0 N/A
03-004 EPT: 500 4,349 SFC: 0 70
03-006 EPT: 500 500 SFC: 33 75
표 9 - 고투여량 백신 접종 피험자

피험자		 pp65 CMI
SFC/106 PBMCs		 치료후 IFN-γ 분비
pp65 특이적 T 세포의 피크 		백신 유도 반응 종양 반응 (월별 표시)
01-017 SFC: 0 0 아니오 PD
03-003 SFC: 24 159 예 SD→ ? → SD
01-018 SFC: 0 N/A 아니오 PD
03-004 SFC: 0 35 예 SD→SD
03-006 SFC: 0 0 아니오 SD→SD→SD→SD
표 4 내지 7에서 알 수 있는 바와 같이, 각각의 저투여량 및 중간 투여량 백신 접종자는, 첫 번째 주사 전에 gB 항원에 대한 항체가 있었던(즉, 기준선에 있었던) GBM 환자에서 T 세포 반응을 자극했다. 그러나 저투여량과 중간 투여량 백신 접종자 모두 첫 번째 주사 전에 gB에 대한 항체가 없었던 환자에서 T 세포 반응을 자극하지 못했으며, 이는 HCMV 면역 조절 장애의 증거이다.
그러나, 놀랍게도, 본 발명의 조성물의 고투여량 백신 접종자는 첫 번째 주사 전에 gB에 대한 항체가 없는 환자의 대다수(5명 중 3명)에서 면역 반응을 자극하였다(표 8 및 9 참조). 이 환자들은 치료 전에 HCMV 면역의 상당한 조절장애가 있었다. 그러나 고투여량 백신 접조으로 면역 조절 장애를 극복하였고, 환자는 HCMV 항원에 대한 T 세포 반응과 항체를 나타냈다. 더욱 의미심장하게도, 백신 접종 후 HCMV-특이적 면역 조절 장애를 극복한 환자는, 종양 성장 및 질병 진행의 안정화 측면에서도 긍정적인 임상 반응을 보였다.
안정화된 병변을 가진 환자의 종양을 MRI를 이용하여 측정하였다. 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다. 시간은 주 단위로 표시되고, 시간 0은 첫 번째 치료 날짜이다.
피험자 크기 (㎟)
시간 = 0		 크기 (㎟)
시간 = 5-7 		크기 (㎟)
시간 = 11-13		 크기 (㎟)
시간 = 19
03-003 955 998 1828 2000
03-004 237 235 151 142
(새 병소 - 385)
03-006 186 128 102
새 병소-120		 77
106
위의 표 10에서 볼 수 있는 바와 같이, 안정 병변을 가진 2명의 피험자는 원발성 종양의 크기가 감소한 것으로 나타났다.
임상 시험 대상을 사망까지의 생존 시간에 대한 연구 후에 추적하였다. 아래의 표 11은, 연구 백신에 대한 반응 여부와 함께, 연구에 참여한 각 피험자의 PFS 및 전체 생존 시간(주 단위)을 보여준다.
피험자 PFS
(주)		 전체 생존 시간
(주) 		백신 반응
(예 또는 아니오)
03-001 10 11.0 아니오
01-017 7 16 아니오
01-009 6 18 아니오
01-004 5 28 아니오
01-013 12 31 아니오
01-016 8 43 아니오
01-018 5 57 아니오
01-005 15 93 아니오
01-006 6 97 아니오
01-003 36 37 예
03-004 16 53 예
03-006 28 56 예
01-007 8 56 예
03-003 18 59 예
01-012 13 65 예
표 11에서 알 수 있는 바와 같이, 백신 반응자(vaccine responders)의 전체 생존율이, 무반응자의 비율을 크게 초과했으며, 백신 비반응자의 12개월 전체 생존율은 25%인 반면 백신 반응자의 12개월 전체 생존율은 83%이다. 백신 무반응자의 전체 생존 중앙값은 31주였으며 백신 반응자의 전체 생존 기간은 56주로, 6.25개월 개선을 나타냈다. 따라서, 백신에 대한 반응은 개선된 생존 시간과 높은 상관관계가 있었다.
등가물
본 발명이 본 발명의 상세한 설명과 함께 기술되었지만, 상기 설명은 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도된 것이 아니고 예시하기 위한 것임을 이해해야 한다. 다른 태양, 이점 및 수정은 아래의 청구 범위 내에 속하는 것이다.

Claims (11)

  1. (i) (a) HCMV에서 발견되는 pp65 단백질의 상류에서 융합된 뮤린 백혈병 바이러스(MLV)에서 발견되는 gag 단백질의 N-말단 부분을 포함하여 구성되는 융합 단백질; 및 (b) HCMV에서 발견되는 당단백질(gB) 단백질을 포함하여 구성되는 폴리펩티드; 를 포함하여 구성되는 바이러스 유사 입자(VLP): 및
    (ii) GM-CSF;를 포함하여 구성되고;
    여기서 상기 VLP가 투여량 당 적어도 4㎍ gB/pp65 Gag의 양으로 존재하는,
    인간 대상체에서 다형성 교모세포종(GBM)의 치료를 위한 면역치료 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질이 서열번호 4와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하여 구성되고, 상기 폴리펩티드가 서열번호 7과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하여 구성되는 것인, 면역치료 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질이 서번호열 4의 아미노산 서열을 포함하여 구성되고, 상기 폴리펩티드가 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하여 구성되는 것인, 면역치료 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 GM-CSF가 투여량 당 200 ㎍ 이상의 양으로 존재하는 것인 면역치료 조성물
  5. 제1항의 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하여 구성되는, GBM을 가진 대상체를 치료하는 방법.
  6. (i) (a) HCMV에서 발견되는 pp65 단백질의 상류에서 융합된 뮤린 백혈병 바이러스(MLV)에서 발견되는 gag 단백질의 N-말단 부분을 포함하여 구성되는 융합 단백질; 및 (b) HCMV에서 발견되는 당단백질(gB) 단백질을 포함하는 폴리펩타이드;를 포함하여 구성되는 바이러스 유사 입자(VLP): 및
    (ii) GM-CSF;를 포함하여 구성되고;
    여기서 상기 VLP가 투여량당 적어도 10 ㎍ gB/pp65 Gag의 양으로 존재하는,
    인간 대상체에서 다형성 교모세포종(GBM)의 치료를 위한 면역치료 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 융합 단백질이 서열번호 4와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하여 구성되고, 상기 폴리펩티드가 서열번호 7과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하여 구성되는 것인, 면역치료 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 융합 단백질이 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하여 구성되고, 상기 폴리펩티드가 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하여 구성되는 것인, 면역치료 조성물.
  9. 제6항에 있어서, 상기 GM-CSF가 투여량 당 200 ㎍ 이상의 양으로 존재하는 것인, 면역치료 조성물.
  10. 제6항의 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하여 구성되는, GBM을 갖는 대상체를 치료하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 대상체가 HCMV에 대한 면역 조절장애를 가지고 있고, 상기 조절장애가 HCMV gB 단백질에 대한 검출가능한 항체 반응의 결핍에 의해 측정되는 것인, 방법.
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