KR20130137156A - 짧은 간섭 핵산 （ｓｉＮＡ）을 사용한 Ｂ형 간염 바이러스 （ＨＢＶ） 유전자 발현의 ＲＮＡ 간섭 매개 억제 - Google Patents

짧은 간섭 핵산 （ｓｉＮＡ）을 사용한 Ｂ형 간염 바이러스 （ＨＢＶ） 유전자 발현의 ＲＮＡ 간섭 매개 억제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 HBV 유전자 발현 및/또는 활성 조절에 대해 반응하고/하거나, HBV 유전자 발현 경로를 조절하는 특질, 질환 및 병태에 관한 연구, 진단, 및 치료를 위한 화합물, 조성물, 및 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 HBV 유전자 발현에 대한 RNA 간섭 (RNAi)을 매개할 수 있거나 매개하는, 소형 핵산 분자, 예컨대, 짧은 간섭 핵산 (siNA), 짧은 간섭 RNA (siRNA), 이중 가닥 RNA (dsRNA), 마이크로-RNA (miRNA), 및 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 분자를 비롯한, 이중 가닥 핵산 분자에 관한 것이다.

Description

짧은 간섭 핵산 （ｓｉＮＡ）을 사용한 Ｂ형 간염 바이러스 （ＨＢＶ） 유전자 발현의 ＲＮＡ 간섭 매개 억제{RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF HEPATITIS B VIRUS (HBV) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)}
서열 목록
37 CFR §1.52(e)(5)에 따라 EFS를 통해 제출된 서열 목록은 본원에 참고로 포함된다. EFS를 통해 제출된 서열 목록 텍스트 파일은 2010년 8월 17일에 작성된 455,495 바이트 크기의 파일 "SequenceListing_IFD1USPSP"를 포함한다.
B형 간염은 B형 간염 바이러스 (HBV)에 의해 유발되는 간의 감염성 질환이다. 상기 질병은 간 염증, 구토, 황달을 유발하는 급성 질병일 수 있고, 중증의 전격성 질환인 일부 드문 경우에 있어서는 사망에 이르게 할 수 있다. 감염의 대부분은 무증상이거나, 또는 만성 간 염증을 일으켜 간의 간경변을 유도하고, 간세포 암종 (HCC)이 발병될 발병률을 증가시킬 수 있는 만성 질병을 유발한다.
전세계에서 대략 3억 5천만명을 초과하는 사람들이 만성적으로 감염된 상태이고, 매년 HBV 관련 간 질환 또는 HCC로 인해 600,000명의 사람들이 사망하게 되는 바, HBV 감염은 전세계의 문제이다. 상기 질환은 아시아와 아프리카에서는 전염병을 유발한 바 있고, 이는 중국의 풍토병이다. HBV 전파는 감염성 혈액 또는 체액을 통해 이루어진다. 현재 HBV 감염 예방용 백신이 존재하다. 그러나, 상기 백신은 예방용이며, 이미 감염된 환자를 치료하는 데에는 사용되지 못한다.
HBV 폴리머라제의 작용을 차단함으로써 HBV 복제를 방해하는 만성 B형 간염용으로 승인받은 화학요법 치료가 수개 존재한다 (라미부딘, 아데포비어, 엔타카비어 및 텔비부딘). 상기 치료 중 어느 것도 바이러스를 완전하게 제거하지 못하며, 상기 치료는 장기간 치료 후 발생되는 약물 내성 HBV 변이체를 초래한다. B형 간염은 또한 페길화된 인터페론-알파2a로 치료될 수도 있지만, 이러한 치료는 심각한 부작용과 관련이 있으며, 모든 환자에서 효과가 있는 것은 아니다.
HBV는 헤파드나 과의 구성원이며, 이는 항원 에피토프에 기초하여 4가지 주요 혈청형 (adr , adw , ayr , ayw)으로 나뉜다. 바이러스는 또한 게놈 서열에 기초하여, A-H인 8개의 유전자형으로 분류된다. 유전자형 A는 아메리카, 아프리카, 인도 및 서유럽에서 일반적이다. 유전자형 B 및 C는 아시아 및 미국에서 발견된다. 유전자형 D는 남부 유럽 및 인도에서 가장 일반적인 것이다. 유전자형 E는 서남부 아프리카에서 발견된다. 유전자형 F 및 H는 일반적으로 중앙 아메리카 및 남아메리카에서 일반적으로 발견된다. 유전자형 G는 유럽 및 미국에서 일반적으로 발견된다.
HBV 게놈은 부분적으로 이중 가닥인 환형의 DNA 가닥으로 구성되어 있다. 게놈의 길이는 ~3.3 Kb이다. 이는 4개의 공지된 유전자 (C, X, P 및 S)를 코딩한다. HBV는 복제 과정에서 역전사효소를 사용하는, 몇 안되는 DNA 바이러스 중 하나이다. HBV 복제는 유입, 외피 제거, 및 바이러스 게놈의 핵으로의 수송을 포함하는 다단계를 포함한다. 먼저, HBV 게놈 복제는 RNA 중간체의 생성, 이어서, 이를 역전사시켜 DNA 바이러스 게놈을 생산하는 것을 포함한다.
현 요법은 그의 무력함, 심각한 부작용으로 인해, 또는 약물 내성 변이체의 생성으로 인해 한계가 있기 때문에, HBV 감염을 치료할 수 있는 새로운 요법 개발이 임상적으로 요구되고 있다.
RNA 간섭 (이하, "RNAi")을 통해 이루어지는 바이러스 유전자 발현, 구체적으로, HBV 유전자 발현의 변경이 상기와 같은 요구를 충족시켜 줄 수 있는 한 접근법이 된다. RNAi는 짧은 단일 가닥 RNA ("ssRNA") 또는 이중 가닥 RNA ("dsRNA") 분자에 의해 유도된다. "짧은 간섭 핵산 ("siNA")" 또는 "짧은 간섭 RNA" 또는 "siRNA" 또는 "RNAi 억제제"로도 명명되는 짧은 dsRNA 분자는 siNA와 서열 상동성을 공유하는 메신저 RNA ("mRNA")의 발현을 침묵화시킨다. 이는 보편적으로는 RNA 유도성 침묵화 복합체 (RISC)로 지칭되는, siNA를 함유하는 엔도뉴클레아제 복합체에 의해 매개되는 mRNA의 절단을 통해 발생할 수 있다. 표적 RNA의 절단의 siNA 이중체의 가이드 서열에 상보적인 영역 중앙에서 발생한다 (문헌 [Elbashir et al., 2001, Genes Dev ., 15: 188]). 추가로, RNA 간섭은 또한 가정컨대, 번역을 억제시키거나, 또는 염색질 구조를 조절하여 표적 유전자 서열의 전사를 방해하는 세포 기전을 통해 소형 RNA (예컨대, 마이크로-RNA 또는 miRNA) 매개 유전자 침묵화를 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Allshire, 2002, Science, 297: 1818-1819]; [Volpe et al., 2002, Science , 297: 1833-1837]; [Jenuwein, 2002, Science, 297:2215-2218]; 및 [Hall et al., 2002, Science, 297:2232-2237] 참조).
HBV 치료를 위해 RNAi를 사용하고자 한 여러 연구가 시도되었고, 이러한 접근법은 문헌 [RNAI for treating Hepatitis B Viral Infection, Chen, Y. et al., Pharmaceutical Research , 2008 Vol. 25, No.1, pgs 72-86]에서 광범위하게 리뷰되었다. 그러나, 상기 언급에서 지적한 바와 같이, 단일 siRNA의 형질감염은 대개는 적절한 유전자 침묵화를 제공하지 못한다 (상기 동일 문헌). 따라서, RNAi 분야에 있어서 상당한 진보가 이루어졌음에도 불구하고, HBV 유전자 발현를 효과적으로 억제시킬 수 있고, HBV 발현과 관련된 질환, 예컨대, 간 질환 및 암을 치료할 수 있는 제제에 대해서는 여전히 요구되고 있다.
발명의 개요
본 발명은 신규한 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자를 사용하여 HBV 발현을 조절함으로써, HBV 유전자 발현 조절에 대해 반응하는 질환을 치료하는 것에 관한 문제의 해결안을 제공한다.
본 발명은 소형 핵산 분자를 사용하는 RNA 간섭 (RNAi)에 의해 HBV 유전자의 발현을 조절하는 데, 및 B형 간염 및 B형 간염 감염으로부터 유발되는 그러한 병태를 치료하는 데 유용한 화합물, 조성물, 및 방법을 제공한다.
특히, 본 발명은 짧은 간섭 RNA (siRNA), 이중 가닥 RNA (dsRNA), 마이크로-RNA (miRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 및 환형 RNA 분자를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 소형 핵산 분자, 즉, 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자, 및 HBV 유전자 및/또는 HBV 유전자 발현 및/또는 활성 경로에 관여하는 다른 유전자의 발현을 조절하는 데 사용되는 방법을 특징으로 한다. 본 발명자들은 모든 공지된 전장의 HBV 게놈 중 보존되는 영역으로부터 표적 부위를 선택함으로써 효력 및 효능이 높은 서열을 생성할 수 있다는 것을 발견하게 되었다.
한 측면에서, 본 발명은 이중 가닥 siNA가 센스 및 안티센스 가닥을 포함하는 것인, 세포 또는 포유동물에서 HBV 유전자의 발현을 억제시키는 이중 가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자를 제공한다. 안티센스 가닥은 HBV 유전자의 발현과 관련된 RNA의 적어도 일부에 상보적인 서열을 포함한다. 센스 가닥은 안티센스 가닥에 상보적인 서열을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 1 이상의 가닥은 서열 1-502로 이루어진 서열 군으로부터 선택되는 15개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥은 표 1a에 제시된 표적 서열에 대해 서열 상보성을 가진 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 실시양태 및/또는 같은 실시양태에서, 안티센스 가닥은 표 1b에 제시된 안티센스 서열 중 하나의 15개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥 은 표 1b에 제시된 센스 가닥 서열의 15개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 상기 측면의 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥이 본 발명의 표적 서열에 대해 서열 상보성을 가진, 표 1c에 제시된 변형된 서열을 포함하는 것인, 이중 가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자를 제공한다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥 또한 표 1c에 제시된 변형된 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 siNA가 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고; 각 가닥의 길이는 독립적으로 15 내지 30개의 뉴클레오티드 길이이고; 안티센스 가닥이
Figure pct00001
중 임의의 것에 상보적인 서열을 가진 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 것인, HBV의 발현을 조절하는 이중 가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자를 제공한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, siNA 분자의 안티센스 가닥은
Figure pct00002
의 15개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자의 센스 가닥은
Figure pct00003
의 15개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는
Figure pct00004
중 임의의 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 이중체 R-008380648-000E, R-008380783-000R, R-008380665-000N, R-008380645-000D, R-008380408-000R, R-008380633-000U, R-008380767-000R, R-008380730-000C, R-008380777-000H, R-008380740-000V, R-008380558-000M, R-008380406-000Y, R-008380764-000P, R-008380772-000P, R-008380389-000D, R-008380362-000H, R-008380363-000S, R-008380340-000F, R-008380689-000H, R-008380756-000P, R-008380736-000E, R-008380757-000Y, R-008380753-000N, R-008380737-000N, R-008380734-000M, 또는 R-008380791-000R 중 임의의 것을 포함하는 이중 가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자를 특징으로 한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은
(a) 본 발명의 이중 가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA);
(b) 화합물 번호 1-46 중 임의의 것 또는 그의 임의의 조합을 가진 양이온성 지질 화합물;
(c) 콜레스테롤;
(d) DSPC; 및
(e) PEG-DMG
를 포함하는 조성물을 특징으로 한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 화합물 번호 1-46 중 임의의 것을 하기 몰비로 가지는 임의의 양이온성 지질을 포함한다:
양이온성 지질/콜레스테롤/PEG-DMG 56.6/38/5.4;
양이온성 지질/콜레스테롤/PEG-DMG 60/38/2;
양이온성 지질/ 콜레스테롤/PEG-DMG 67.3/29/3.7;
양이온성 지질/콜레스테롤/PEG-DMG 49.3/47/3.7;
양이온성 지질/콜레스테롤/PEG-DMG 50.3/44.3/5.4;
양이온성 지질/콜레스테롤/PEG-C-DMA/DSPC 40/48/2/10;
양이온성 지질/콜레스테롤/PEG-DMG/DSPC 40/48/2/10; 및
양이온성 지질/콜레스테롤/PEG-DMG/DSPC 58/30/2/10.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 각각의 몰비가 약 50:30:10:2인 (13Z,16Z)-N,N-디메틸-3-노닐도코사-13,16-디엔-1-아민, 콜레스테롤, DSPC, 및 PEG-DMG를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 동결보호제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 동결보호제는 수크로스, 트레할로스, 라피노스, 스타키오스, 베르바스코스, 만니톨, 글루코스, 락토스, 말토스, 말토트리오스-헵토스, 덱스트란, 히드록시에틸 전분, 인슐린, 소르비톨, 글리세롤, 아르기닌, 히스티딘, 리신, 프롤린, 디메틸술폭시드 또는 그의 임의의 조합이다. 일부 실시양태에서, 동결보호제는 수크로스이다. 일부 실시양태에서, 동결보호제는 트레할로스이다. 일부 실시양태에서, 동결보호제는 수크로스와 트레할로스의 조합물이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 본 발명의 siNA의 뉴클레오티드 모두 변형되지 않은 것이다. 다른 실시양태에서, siNA 분자의 한 가닥 또는 양 가닥 모두에서 독립적으로 뉴클레오티드 위치 중 하나 이상 (예컨대, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 또는 30개)이 변형된다. 변형은 핵산 당 변형, 염기 변형, 백본 (뉴클레오티드간 연결부) 변형, 비-뉴클레오티드 변형, 및/또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 특정 경우에서, 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오티드는 차별적으로 변형된다. 예를 들어, 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오티드는 2'-당 위치에서 차별적으로 변형될 수 있다 (즉, 1 이상의 퓨린은 2'-당 위치에서 동일하거나 상이한 가닥 중의 1 이상의 피리미딘과 상이한 변형을 가진다). 특정 경우에서, 퓨린은 한 가닥 또는 양 가닥 모두에서 변형되지 않는 반면, 피리미딘은 한 가닥 또는 양 가닥 모두에서 변형된다. 특정의 다른 경우에서, 피리미딘은 한 가닥 또는 양 가닥 모두에서 변형되지 않는 반면, 퓨린은 한 가닥 또는 양 가닥 모두에서 변형된다. 일부 경우에, 1 이상의 변형된 뉴클레오티드는 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드, 또는 2'-O-알킬 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 한 가닥 또는 양 가닥 모두에서 피리미딘 뉴클레오티드 중 적어도 5개 이상이 모두 2'-데옥시-2'-플루오로이거나, 또는 모두 2'-O-메틸 피리미딘 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 한 가닥 또는 양 가닥 모두에서 퓨린 뉴클레오티드 중 적어도 5개 이상이 모두 2'-데옥시-2'-플루오로이거나, 또는 모두 2'-O-메틸 퓨린 뉴클레오티드이다. 특정 경우에서, siNA 분자가 본원에 기술된 하나 이상의 변형을 포함할 경우, 가이드 (안티센스) 가닥의 5' 말단의 1, 2, 및 3번 위치에 있는 뉴클레오티드는 변형되지 않는다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 가닥 중 하나에 또는 양 가닥 모두에 1개, 2개, 3개 또는 4개의 뉴클레오티드(들)로 이루어진 3' 오버행을 가진다. 다른 실시양태에서, siNA 분자에는 오버행이 없다 (즉, 평활 말단을 가진다). 바람직하게, siNA 분자는 센스 및 안티센스 가닥, 양 가닥 모두에 2개의 뉴클레오티드로 이루어진 3' 오버행을 가진다. 오버행은 변형되거나, 변형되지 않을 수 있다. 오버행 중의 변형된 뉴클레오티드의 예로는 2'-O-알킬 뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드, 잠금 핵산 (LNA) 뉴클레오티드, 또는 2'-데옥시 뉴클레오티드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 안티센스 가닥 중의 오버행 뉴클레오티드는 HBV 표적 서열 중의 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 유사하게, 센스 가닥 중의 오버행은 HBV 표적 서열 중에 포함된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 특정 경우에서, 본 발명의 siNA 분자는 안티센스 가닥에 2'-O-알킬 (예컨대, 2'-O-메틸) 뉴클레오티드인 2개의 3' 오버행 뉴클레오티드, 및 센스 가닥에 2'-데옥시 뉴클레오티드인 2개의 3' 오버행 뉴클레오티드를 가진다. 다른 경우에서, 본 발명의 siNA 분자는 안티센스 가닥 및 센스 가닥, 양 가닥 모두에 2'-O-알킬 (예컨대, 2'-O-메틸) 뉴클레오티드인 2개의 3' 오버행 뉴클레오티드를 가진다. 특정 실시양태에서, 2'-O-알킬 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 우리딘 뉴클레오티드이다. 특정 경우에서, 오버행은 또한 오버행의 뉴클레오티드 사이에 하나 이상의 포스포로티오에이트 연결부를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 캡 (이는 또한 본원에서 "말단 캡"으로도 지칭된다)을 가진다. 캡은 5' 말단 (5'-캡)에 또는 3'-말단 (3'-캡)에 존재할 수 있거나, 또는 양 말단 모두에, 예컨대, siNA의 센스 가닥의 5' 및 3' 말단에 존재할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 안티센스 가닥의 5' 말단에서 인산화된다. 포스페이트 기는 포스페이트, 디포스페이트 또는 트리포스페이트일 수 있다.
본 발명의 siNA 분자는 이중 가닥일 경우, 이는 대칭이거나, 비대칭일 수 있다. 이들 이중 가닥 siNA의 각 가닥의 길이 범위는 독립적으로 3 내지 30개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 siNA 분자의 각 가닥의 길이는 약 15개 내지 30개의 (즉, 약 19개, 20개, 21개, 22개, 23개 또는 24개의) 뉴클레오티드 길이이다.
본 발명의 siNA 분자는 그가 이중 가닥이거나, 또는 이중체 구조를 가지는 경우, 독립적으로 약 3개 내지 약 30개의 (예컨대, 약 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 또는 30개의) 염기쌍을 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 siNA 분자의 이중체 구조의 길이는 15개 내지 30개 사이, 더욱 일반적으로, 18개 내지 25개 사이, 추가로 더욱 일반적으로, 19개 내지 24개 사이, 및 가장 일반적으로, 19개 내지 21개 사이의 염기쌍 길이이다.
특정 실시양태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 가지며, 하기 식 (A)를 포함하는 이중 가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자를 제공한다:
Figure pct00005
상기 식에서, 상부 가닥은 이중 가닥 핵산 분자의 센스 가닥이고, 하부 가닥은 이중 가닥 핵산 분자의 안티센스 가닥이며; 여기서, 상기 안티센스 가닥은 서열 452, 서열 453, 서열 454, 또는 서열 455의 15개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 센스 가닥은 안티센스 가닥에 상보적인 서열을 포함하고;
각각의 N은 독립적으로 변형되지 않았거나, 또는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드, 또는 비-뉴클레오티드이고;
각각의 B는 존재하거나 존재하지 않는 말단 캡이고;
(N)은 오버행잉형 뉴클레오티드를 나타내고, 이들 각각은 독립적으로 변형되지 않은 것이거나, 또는 화학적으로 변형된 것이고;
[N]은 리보뉴클레오티드인 뉴클레오티드를 나타내고;
X1 및 X2는 독립적으로 정수 0 내지 4이고;
X3은 정수 15 내지 30이고;
X4는 정수 9 내지 30이고;
X5는 정수 0 내지 6이되, 단, X4와 X5의 합은 15-30이다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) NX4 위치의 하나 이상의 피리미딘 뉴클레오티드가 독립적으로 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 또는 그의 임의의 조합이고;
(b) NX4 위치의 하나 이상의 퓨린 뉴클레오티드가 독립적으로 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 또는 그의 임의의 조합이고;
(c) NX3 위치의 하나 이상의 피리미딘 뉴클레오티드가 독립적으로 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 또는 그의 임의의 조합이고;
(d) NX3 위치의 하나 이상의 퓨린 뉴클레오티드가 독립적으로 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드인 것인, 식 (A)의 이중 가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA)을 특징으로 한다.
본 발명은 추가로 본원에 기술된 이중 가닥 핵산 분자를 임의로 제약상 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 포함하는 조성물을 제공한다.
조성물의 투여는 공지된 방법에 의해 수행될 수 있으며, 여기서, 핵산은 시험관내 또는 생체내에서 원하는 표적 세포 내로 도입된다.
세포, 조직 및 유기체로 본 발명의 핵산 분자를 도입시키기 위한 것으로서, 일반적으로 사용되는 기법은 각종 담체 시스템, 시약 및 벡터를 사용하는 것을 포함한다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 상기 담체 시스템의 비제한적 예로는 컨쥬게이트, 핵산-지질 입자, 지질 나노입자 (LNP), 리포솜, 리포플렉스, 미셀, 비로솜, 바이러스 유사 입자 (VLP), 핵산 복합체, 및 그의 혼합물을 포함한다.
본 발명의 조성물은 에어로졸, 분산액, 용액 (예컨대, 주사가능 용액), 크림, 연고, 정제, 분말, 현탁액 등의 형태일 수 있다. 이러한 조성물은 임의의 적합한 방식으로, 예컨대, 경구적으로, 설하로, 협측으로, 비경구적으로, 비강으로, 또는 국부적으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 에어로졸화되어 흡입에 의해 전달된다.
본 발명의 분자 및 조성물은 광범위한 범위에 걸친 치료학적 적용에 있어서 유용성을 가진다. 따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 대상체를 치료하는 데 있어서 본 발명의 화합물 및 조성물의 용도에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 HBV의 작용에 의해 매개된 병태를 앓는 대상체에게 유효량의 본 발명의 이중 가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자를 투여하는 것을 포함하는, HBV의 작용에 의해 매개된 병태를 앓는 대상체, 예컨대, 인간을 치료하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명의 siNA 분자는 B형 간염 감염 및/또는 그로부터 유발되는 병태를 치료한다. 일부 실시양태에서, 병태는 간 질환이다. 다른 실시양태에서, 병태는 암이다.
본 발명의 상기 측면 및 다른 측면은 하기의 상세한 설명과 첨부된 도면을 참고함으로써 자명해질 것이다. 추가로, 본원에 기술된 임의의 방법 또는 조성물은 본원에 기술된 임의의 다른 방법 또는 조성물과 관련하여 실행될 수 있고, 다른 실시양태가 조합될 수 있다는 것이 고려된다.
추가로, 본 발명의 다양한 측면을 기술하고, 더욱 구체적으로는 설명하기 위해 명세서 전역에 걸쳐 특허, 특허 출원, 및 다른 문헌들을 인용한다. 본원에서 인용된 상기 참고 문헌들은 각각 그 도면을 비롯한 그의 전문이 본원에서 참고로 포함된다.
도 1은 RNAi에 관여하는 표적 RNA 분해의 비제한적인 제안된 기계론적인 표현을 나타낸다. 외래 단일 가닥 RNA, 예를 들어, 바이러스, 트랜스포존 또는 다른 외인성 RNA로부터 RNA-의존성 RNA 폴리머라제 (RdRP)에 의해 생성되는 이중 가닥 RNA (dsRNA)가 다이서(DICER) 효소를 활성화시키고, 이는 이어서 siNA 이중체를 생성한다. 별법으로, 합성 또는 발현된 siNA를 적절한 수단에 의해 세포 내로 직접 도입시킬 수 있다. 표적 RNA를 인식하는 활성 siNA 복합체가 형성되어, RISC 엔도뉴클레아제 복합체에 의해 표적 RNA가 분해되거나, 또는 RNA-의존성 RNA 폴리머라제 (RdRP)에 의해 추가적인 RNA가 합성되고, 이는 다이서를 활성화시켜 추가적인 siNA 분자를 생성함으로써 RNAi 반응을 증폭시킬 수 있다.
도 2는 대표적인 siNA 이중체의 일반 구조를 사용하여 본 발명의 화학적으로 변형된 siNA 구축물의 비제한적인 일례를 나타낸 것이다. 본 도면에 제시되어 있는 구체적인 변형은 단독으로, 또는 본 발명의 임의의 siNA 분자와 관련하여 본원에 기술된 다른 변형 및 특징에 더하여, 본 도면의 다른 변형과 함께 조합하여 사용될 수 있다. 본 도면에서, N은 본원에 기술되어 있는 바와 같은 임의의 뉴클레오티드 또는 임의로 비-뉴클레오티드를 나타낸다. B-NX3-(N)X2-B-3'을 가지는 상부 가닥은 siNA의 센스 (또는 패신저) 가닥인 반면, B(N)X1-NX4-[N]X5-5'를 가지는 하부 가닥은 siNA의 안티센스 (또는 가이드) 가닥이다. 센스 가닥의 내부 부분의 뉴클레오티드 (또는 임의적 비-뉴클레오티드)는 NX3으로 표시되고, 안티센스 가닥의 내부 부분의 뉴클레오티드 (또는 임의적 비-뉴클레오티드)는 NX4로 표시된다. 내부 부분의 뉴클레오티드 (또는 임의적 비-뉴클레오티드)는 일반적으로 두 가닥 사이에 염기쌍을 형성하고 있지만, 일부 실시양태에서 이는 임의로는 염기쌍 형성을 결여할 수 있다 (예컨대, 미스매치 또는 갭). 오버행 영역의 뉴클레오티드 (또는 임의적 비-뉴클레오티드)는 (N)과 같이 괄호로 표시된다. 안티센스 가닥의 5' 말단부의 뉴클레오티드는 [N]으로 표시된다. 말단 캡은 임의로 센스 가닥의 5' 및/또는 3' 말단에 존재하고, 추가로 임의로는 안티센스 가닥의 3' 말단에 존재한다. 일반적으로, 각 가닥의 길이 범위는 독립적으로 약 15개 내지 약 30개의 뉴클레오티드 길이일 수 있지만, 이는 임의의 오버행 뉴클레오티드의 존재에 따라 달라질 수 있다. 특정 실시양태에서, X1 및 X2는 독립적으로 정수 0 내지 4이고; X3은 정수 15 내지 30이고; X4는 정수 9 내지 30이고; X5는 정수 0 내지 6이되, 단, X4와 X5의 합은 15-30이다. siNA 구축물의 센스 및 안티센스 가닥의 뉴클레오티드에 대한 다양한 변형이 제시되어 있다. (N) 오버행 뉴클레오티드 위치는 본원에 기술되어 있는 바와 같이 화학적으로 변형될 수 있고 (예컨대, 2'-O-메틸, 2'-데옥시-2'-플루오로, 2'-데옥시, LNA, 유니버설 염기 등), 상응하는 표적 핵산 서열로부터 유도될 수 있거나, 그렇지 않을 수 있다. 본 도면에 제시된 구축물은 또한 본원에 기술되어 있는 포스포로티오에이트 연결부를 포함할 수 있다. 예를 들어, 포스포로티오에이트 연결부는 임의의 N, (N), 및/또는 [N] 위치 사이에 존재할 수 있다. 그러한 포스포로티오에이트 도입은 퓨린 "R" 및 피리미딘 "Y" 위치 사이에서 사용될 수 있거나, 또는 일반적으로는 피리미딘 결합의 안정화를 위해 사용될 수 있다. 추가로, 비록 본 도면에는 도시되지 않았지만, 본 도면에 제시된 구축물은 임의로 센스 가닥의 5' 말단으로부터 9번째 위치에, 또는 가이드 가닥의 5' 말단으로부터 11개의 뉴클레오티드 위치의 수를 계수하여 가이드 가닥의 5' 말단에 기초하여 11번째 위치에 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 유사하게, 안티센스 가닥은 5' 말단으로부터 14번째 위치에 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있거나, 또는 별법으로, 2'-O-알킬 뉴클레오티드 (예컨대, 2'-O-메틸 퓨린)이 상기 위치에 존재하지 않도록 선택되거나 디자인될 수 있다. 추가로, 비록 본 도면에는 도시되지 않았지만, 안티센스 가닥의 5' 말단 위치는 본원에 기술된 말단 포스페이트 기를 포함할 수 있다. 안티센스 가닥은 일반적으로 본 발명의 임의의 표적 핵산 서열에 상보적인 서열, 예컨대, 본원 표 1a에 제시되어 있는 것을 포함한다.
도 3은 도 2에 제시된 대표적인 siNA 이중체에 적용되는 변형의 특정 조합에 관한 비제한적인 일례를 나타낸 것이다. 대표 구조 아래에 제시되어 있는 표는 (N)X1, (N)X2, NX3, NX4, 및/또는 [N]X5 뉴클레오티드 (및 임의적 비-뉴클레오티드) 위치의 구체적인 조합을 제공한다. 예를 들어, 5개 이상의 (예컨대, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개 또는 그 초과의) NX3 및 5개 이상의 (예컨대, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개 또는 그 초과의) NX4 피리미딘 "Y" 및 퓨린 "R" 뉴클레오티드의 조합이 명시되어 있으며, 이들 각각은 독립적으로 임의적 포스포로티오에이트 치환 이외에도, 본 도면에 제시된 바와 같이 구체적인 (N)X1, 및/또는 (N)X2 치환을 가질 수 있다. 5' 말단 안티센스 가닥 [N] 뉴클레오티드는 일반적으로는 리보뉴클레오티드이지만, 이는 또한 상기 뉴클레오티드가 퓨린 "R"인지 또는 피리미딘 "Y" 뉴클레오티드인지에 따라 변형되거나, 또는 변형되지 않을 수 있다.
도 4a-c는 본 발명의 상이한 siNA 구축물의 비제한적인 일례를 나타내는 것이다. 도 2 및 3에 제시되어 있는 대표적인 구조의 기준이 도 4a-c에 제시된 구조 중 임의의 것에 적용될 수 있다.
도 4a에 제시된 예 (구축물 1, 2, 및 3)는 19개의 대표적인 염기쌍을 가지지만; 본 발명의 상이한 실시양태는 본원에 기술된 임의 개수의 염기쌍을 포함한다. 괄호로 표시된 영역은 예를 들어, 길이가 약 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 뉴클레오티드 길이, 바람직하게, 약 2개의 뉴클레오티드 길이인 것을 포함하는 뉴클레오티드 오버행을 나타낸다. 구축물 1 및 2는 독립적으로 RNAi 활성을 위해 사용될 수 있다. 구축물 2는 폴리뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 링커를 포함할 수 있고, 이는 임의로 생분해성 링커로서 디자인될 수 있다. 한 실시양태에서, 구축물 2에 제시된 루프 구조는 생분해성 링커를 포함할 수 있으며, 이를 통해 생체내 및/또는 시험관내에서 구축물 1이 형성된다. 또 다른 일례로, 구축물 3은 링커를 사용하여 생체내 및/또는 시험관내에서 활성 siNA 구축물 2를 생성시키는 동일한 원리하에서 구축물 2를 생성하는데 사용될 수 있고, 이는 임의로 또 다른 생분해성 링커를 사용하여 생체내 및/또는 시험관내에서 활성 siNA 구축물 1을 생성시킬 수 있다. 이와 같이, siNA 구축물의 안정성 및/또는 활성은 생체내 또는 시험관내 및/또는 시험관내에서 사용하기 위한 siNA 구축물의 디자인에 기초하여 조절될 수 있다.
도 4b에 제시된 예는 부분적인 상보성으로부터 생성되는 오버행, 벌지, 루프, 및 스템-루프를 포함할 수 있는, 본 발명의 이중 가닥 핵산 분자, 예컨대, 마이크로RNA의 다양한 변형을 나타낸다. 벌지, 루프, 및 스템-루프를 포함하는 상기 모티프는 일반적으로 miRNA의 특징이다. 벌지, 루프, 및 스템-루프는 본 발명의 이중 가닥 핵산 분자의 한 가닥 또는 양 가닥 모두에서 약 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 초과의 뉴클레오티드의 미스매치 또는 벌지와 같은, 임의 정도의 부분적인 상보성으로부터 생성될 수 있다.
도 4c에 제시된 예는 디뉴클레오티드 3'-오버행을 가진 두 21개의 뉴클레오티드 서열의 19개의 염기쌍 이중체를 포함하는 본 발명의 모델 이중 가닥 핵산 분자를 나타낸다. 상부 가닥 (1)은 센스 가닥 (패신저 가닥)을 나타내고, 중간 가닥 (2)은 안티센스 가닥 (가이드 가닥)을 나타내고, 하부 가닥 (3)은 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 디뉴클레오티드 오버행 (NN)은 표적 폴리뉴클레오티드로부터 유래된 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 가이드 가닥 중의 3'-(NN) 서열은 표적 폴리뉴클레오티드의 5'-[NN] 서열에 상보적일 수 있다. 추가로, 패신저 가닥의 5'-(NN) 서열은 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 5'-[NN] 서열과 동일한 서열을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 오버행 (NN)은 표적 폴리뉴클레오티드 서열로부터 유래하지 않으며, 예를 들어, 가이드 가닥 중의 3'-(NN) 서열이 표적 폴리뉴클레오티드의 5'-[NN] 서열에 상보적이지 않고, 패신저 가닥의 5'-(NN) 서열이 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 5'-[NN] 서열과 상이한 서열을 포함할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 임의의 (NN) 뉴클레오티드는, 예컨대, 2'-O-메틸, 2'-데옥시-2'-플루오로 및/또는 본원의 다른 변형과 같이 화학적으로 변형된다. 추가로, 패신저 가닥은 패신저 가닥의 리보뉴클레오티드 위치 N 을 포함할 수 있다. 제시된 대표적인 19개의 염기쌍 21량체 이중체의 경우, 위치 N 은 패신저 가닥의 3' 말단으로부터 9개 뉴클레오티드일 수 있다. 그러나, 상이한 길이의 이중체에서, 위치 N 은 가이드 가닥의 5' 말단으로부터 11개의 뉴클레오티드 위치의 수를 계수하여 패신저 가닥 중의 상응하는 염기쌍이 형성된 뉴클레오티드를 선택함으로써 가이드 가닥의 5' 말단을 기준으로 결정된다. Ago2에 의한 절단은 화살표로 표시된, 10번 위치와 11번 위치 사이에서 일어난다. 추가의 실시양태에서, 2개의 리보뉴클레오티드 NN은, 가이드 가닥의 5' 말단으로부터 10 및 11개의 뉴클레오티드 위치의 수를 계수하여 패신저 가닥 중의 상응하는 염기쌍이 형성된 뉴클레오티드를 선택함으로써 가이드 가닥의 5' 말단을 기준으로 10번 위치와 11번 위치에 존재한다.
도 5는 예를 들어, 본 발명의 siNA 서열의 5' 및/또는 3' 말단을 안정화시키는데 사용할 수 있는, 상이한 안정화 화학물질의 비제한적인 예 (1 내지 10)를 나타내는 것으로서, (1) [3-3']-역전된 데옥시리보스; (2) 데옥시리보뉴클레오티드; (3) [5'-3']-3'-데옥시리보뉴클레오티드; (4) [5'-3']-리보뉴클레오티드; (5) [5'-3']-3'-O-메틸 리보뉴클레오티드; (6) 3'-글리세릴; (7) [3'-5']-3'-데옥시리보뉴클레오티드; (8) [3'-3']-데옥시리보뉴클레오티드; (9) [5'-2']-데옥시리보뉴클레오티드; 및 (10) [5-3']-디데옥시리보뉴클레오티드 (X = O일 때)를 포함한다. 도면에 제시된 변형된 및 변형되지 않은 백본 화학물질 이외에도, 이들 화학물질은 본원에 기술된 상이한 당 및 염기 뉴클레오티드 변형과 함께 조합될 수 있다.
도 6은 RNAi 활성을 매개하는 능력을 보존하면서, 뉴클레아제 내성인 본 발명의 화학적으로 변형된 siNA 구축물을 확인하는 데 사용되는 전략법의 비제한적인 예를 나타내는 것이다. 화학적 변형을 학습된 디자인 파라미터에 따라 siNA 구축물 내로 도입시킨다 (예를 들어, 2'-변형, 염기 변형, 골격 변형, 말단 캡 변형 등을 도입시킴). 변형된 구축물을 적절한 시스템에서 (예를 들어, 뉴클레아제 내성의 경우, 제시된 인간 혈청에서, 또는 PK/전달 파라미터의 경우 동물 모델에서) 시험한다. 동시에, siNA 구축물을 예를 들어, 세포 배양 시스템, 예컨대, 루시퍼라제 리포터 검정에서 RNAi 활성에 대해, 또는 내인성 mRNA에 대하여 시험한다. 이어서, RNAi 활성을 유지하면서 특정한 특징을 소유하는 선두 siNA 구축물을 확인하고, 추가로 변형시켜 다시 한번 검정할 수 있다. 상기 동일한 접근법을 이용하여 약동학적 프로파일, 전달 및 RNAi 활성이 개선된 siNA 컨쥬게이트 분자를 확인할 수 있다.
도 7은 선형 및 이중체 구축물 및 그의 비대칭 유도체를 비롯한, 본 발명의 인산화된 siNA 분자의 비제한적인 예를 보여준다.
도 8은 본 발명의 화학적으로 변형된 말단 포스페이트 기의 비제한적인 예를 보여준다.
도 9는 본 발명의 콜레스테롤 컨쥬게이트된 siNA 분자를 합성하는 데 사용될 수 있는 콜레스테롤 연결된 포스포라미다이트의 비제한적인 예를 보여준다. 콜레스테롤 모이어티가 siNA 분자의 센스 가닥의 5' 말단에 연결되어 있는 것인 일례를 보여준다.
도 10은 핵산 가닥에 연결된 5' 및 3' 역전된 무염기성 캡의 실시양태를 도시한다.
발명의 상세한 설명
A. 용어 및 정의
하기 용어 및 정의가 본 출원에 사용되는 바와 같이 적용된다.
본원에서 사용되는 바, "무염기성"이라는 용어는 당업계에서 일반적으로 허용되는 것과 같은 그의 의미를 나타낸다. 상기 용어는 일반적으로 핵염기가 없거나, 또는 당 모이어티의 1' 위치에 있는 핵염기 대신에 수소 원자 (H) 또는 다른 비-핵염기 화학기를 가진 당 모이어티를 지칭하며, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,998,203 (Adamic et al.)를 참조한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 무염기성 모이어티는 리보스, 데옥시리보스, 또는 디데옥시리보스 당이다.
본원에서 사용되는 바, "비-시클릭 뉴클레오티드"라는 용어는 당업계에서 일반적으로 허용되는 것과 같은 그의 의미를 나타낸다. 상기 용어는 일반적으로 비-시클릭 리보스 당을 가지는 임의의 뉴클레오티드, 예를 들어, 리보스 탄소/탄소 또는 탄소/산소 결합 중 임의의 것이 독립적으로 또는 조합하여 뉴클레오티드로부터 존재하지 않는 것인 임의의 뉴클레오티드를 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "알킬"라는 용어는 당업계에서 일반적으로 허용되는 것과 같은 그의 의미를 나타낸다. 상기 용어는 일반적으로 직쇄, 분지쇄, 알케닐, 알키닐 기 및 시클릭 기를 비롯한, 포화 또는 불포화 탄화수소를 지칭하지만, 방향족 기는 제외한다. 상기와 같음에도 불구하고, 알킬은 또한 비-방향족 헤테로사이클릭 기를 지칭한다. 바람직하게, 알킬 기는 1 내지 12개의 탄소를 가진다. 더욱 바람직하게, 이는 1 내지 7개의 탄소, 더욱 바람직하게는 1 내지 4개의 탄소로 이루어진 저급 알킬이다. 알킬 기는 치환되거나, 또는 비치환될 수 있다. 치환되는 경우, 치환기(들)는 바람직하게 바람직하게, 히드록실, 할로겐, 시아노, C1-C4 알콕시, =O, =S, NO2, SH, NH2, 또는 NR1R2 (여기서, R1 및 R2는 독립적으로 H 또는 C1-C4 알킬이다)이다.
"세포 주기 체크포인트를 방해하는 작용제"라는 어구는 세포 주기 체크포인트 신호를 전달하는 단백질 키나제를 억제함으로써 암 세포를 DNA 손상제로 감작화시키는 화합물을 의미한다.
"수용체 티로신 키나제 (RTK)를 방해하는 작용제"라는 어구는 RTK를 억제함으로써 종양 형성 및 종양 진행에 관여하는 기전을 억제하는 화합물을 의미한다.
"안드로겐 수용체 조절제"라는 어구는 기전에 상관없이, 안드로겐이 수용체에 결합하는 것을 방해하거나 억제하는 화합물을 의미한다.
"혈관신생 억제제"라는 어구는 기전에 상관없이, 새로운 혈관 형성을 억제하는 화합물을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "아릴"이라는 용어는 당업계에서 일반적으로 허용되는 것과 같은 그의 의미를 나타낸다. 상기 용어는 일반적으로 공액형 파이 전자계를 가진 1 이상의 고리를 가지며, 카르보시클릭 아릴, 헤테로사이클릭 아릴 및 비아릴 기 (이들은 모두 임의로 치환될 수 있다)를 포함하는 방향족 기를 의미한다. 아릴 기의 바람직한 치환기(들)는 할로겐, 트리할로메틸, 히드록실, SH, OH, 시아노, C1-C4 알콕시, C1-C4 알킬, C2-C4 알케닐, C2-C4 알키닐, NH2, 및 NR1R2 기 (여기서, R1 및 R2는 독립적으로 H 또는 C1-C4 알킬이다)이다.
본원에서 사용되는 바, "알킬아릴"이라는 용어는 당업계에서 일반적으로 허용되는 것과 같은 그의 의미를 나타낸다. 상기 용어는 일반적으로 (상기 기술된 바와 같은) 아릴 기에 공유 결합된 (상기 기술된 바와 같은) 알킬 기를 의미한다. 카르보시클릭 아릴 기는 방향족 고리 상의 고리 원자가 모두 탄소 원자인 것인 기이다. 탄소 원자는 임의로 치환된다. 헤테로사이클릭 아릴 기는 방향족 고리 내에 고리 원자로서 1 내지 3개의 헤테로원자를 가지며, 고리 원자 중 나머지는 탄소 원자인 기이다. 적합한 헤테로원자로는 산소, 황 및 질소를 포함하며, 이러한 헤테로원자를 가진 헤테로사이클릭 아릴 기의 예로는 푸라닐, 티에닐, 피리딜, 피롤릴, N-저급 알킬 피롤로, 피리미딜, 피라지닐, 이미다졸릴 등 (이들은 모두 임의로 치환된다)을 포함한다. 바람직하게, 알킬 기는 C1-C4 알킬 기이다.
본원에서 사용되는 바, "아미드"라는 용어는 당업계에서 일반적으로 허용되는 것과 같은 그의 의미를 나타낸다. 상기 용어는 일반적으로 -C(O)-NH-R (여기서, R은 알킬, 아릴, 알킬아릴 또는 수소이다)을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "안티센스 영역"이라는 어구는 당업계에서 일반적으로 허용되는 것과 같은 그의 의미를 나타낸다. 본 발명의 예시적인 핵산 분자와 관련하여, 상기 용어는 표적 핵산 서열에 대해 상보성을 가진 siNA 분자의 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 추가로, siNA 분자의 안티센스 영역은 임의로 siNA 분자의 센스 영역에 대해 상보성을 가진 핵산 서열을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, siNA 분자의 안티센스 영역은 안티센스 가닥 또는 가이드 가닥으로 지칭된다.
"비대칭 헤어핀"이라는 어구는 안티센스 영역, 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드를 포함할 수 있는 루프 부분, 및 센스 영역이 안티센스 영역과 염기쌍을 형성하고, 루프와 이중체를 형성하기에 충분한 상보적 뉴클레오티드를 가질 수 있을 정도로 안티센스 영역보다 더 적은 수의 뉴클레오티드를 포함하는 센스 영역을 포함하는 선형 siNA 분자를 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 비대칭 헤어핀 siNA 분자는 세포 또는 시험관내 시스템에서 RNAi를 매개하는 데 충분한 길이 (예컨대, 약 15개 내지 약 30개, 또는 약 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 또는 30개의 뉴클레오티드)를 가진 안티센스 영역, 및 약 4개 내지 약 12개 (예컨대, 약 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 또는 12개) 뉴클레오티드를 포함하는 루프 영역, 및 안티센스 영역에 상보적이고 약 3개 내지 약 25개 (예컨대, 약 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 또는 25개)의 뉴클레오티드를 가진 센스 영역을 포함할 수 있다. 비대칭 헤어핀 siNA 분자는 또한 화학적으로 변형될 수 있는 5' 말단 포스페이트 기를 포함할 수 있다. 비대칭 헤어핀 siNA 분자의 루프 부분은 본원에 기술된 바와 같은 뉴클레오티드, 비-뉴클레오티드, 링커 분자 또는 컨쥬게이트 분자를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "생분해성"이라는 용어는 당업계에서 일반적으로 허용되는 것과 같은 그의 의미를 나타낸다. 상기 용어는 일반적으로 생물계에서의 분해, 예를 들어, 효소적 분해 또는 화학적 분해를 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "생분해성 링커"라는 용어는 당업계에서 일반적으로 허용되는 것과 같은 그의 의미를 나타낸다. 본 발명의 예시적인 핵산 분자와 관련하여, 상기 용어는 한 분자를 또 다른 분자에 연결시키도록 디자인된 것으로서, 생물계에서 쉽게 분해되는 링커 분자를 의미한다. 링커는 핵산 또는 비핵산 기반 링커일 수 있다. 예를 들어, 생분해성 링커는 리간드 또는 생물학적으로 활성인 분자를 본 발명의 siNA 분자에 부착시키는 데 사용될 수 있다. 별법으로, 생분해성 링커는 본 발명의 siNA 분자의 센스 및 안티센스 가닥을 연결시키는 데 사용될 수 있다. 생분해성 링커는 그의 안정성이 특정 목적, 예컨대, 특정 조직 또는 세포 유형으로의 전달을 위하여 조절될 수 있도록 디자인된다. 핵산 기반 생분해성 링커 분자의 안정성은 다양한 화학물질, 예를 들어, 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 및 화학적으로 변형된 뉴클레오티드, 예컨대, 2'-O-메틸, 2'-플루오로, 2'-아미노, 2'-O-아미노, 2'-C-알릴, 2'-O-알릴, 및 다른 2'-변형된 또는 염기 변형된 뉴클레오티드의 조합을 사용함으로써 조절될 수 있다. 생분해성 핵산 링커 분자는 이량체, 삼량체, 사량체 또는 보다 장쇄의 핵산 분자, 예를 들어, 길이가 약 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 또는 20개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드일 수 있거나, 또는 인계 연결부, 예를 들어, 포스포르아미데이트 또는 포스포디에스테르 연결부를 가진 단일 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 생분해성 핵산 링커 분자는 또한 핵산 백본, 핵산 당, 또는 핵산 염기 변형을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "생물학적으로 활성인 분자"라는 어구는 당업계에서 일반적으로 허용되는 것과 같은 그의 의미를 나타낸다. 본 발명의 예시적인 핵산 분자와 관련하여, 상기 용어는 시스템 내에서 생물학적 반응을 유도하거나 변형시킬 수 있고/거나, 다른 생물학적으로 활성인 분자의 약동학적 성질 및/또는 약역학적 성질을 조절할 수 있는 화합물 또는 분자를 의미한다. 생물학적으로 활성인 분자의 예로는 단독으로, 또는 치료학적으로 활성인 분자, 예컨대, 항체, 콜레스테롤, 호르몬, 항바이러스제, 펩티드, 단백질, 화학요법제, 소분자, 비타민, 보조인자, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 효소 핵산, 안티센스 핵산, 삼중체 형성 올리고뉴클레오티드, 폴리아민, 폴리아미드, 폴리에틸렌 글리콜, 다른 폴리에테르, 2-5A 키메라, siNA, dsRNA, 알로자임, 압타머, 디코이(decoy) 및 그의 유사체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 다른 분자와 함께 조합된 siNA 분자를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "생물계"라는 어구는 당업계에서 일반적으로 허용되는 것과 같은 그의 의미를 나타낸다. 상기 용어는 일반적으로 인간 또는 동물을 포함하나, 이에 한정되지 않는 생물학적 공급원으로부터의 정제된 또는 비정제된 형태의 물질을 의미하고, 여기서, 상기 생물계는 RNAi 활성에 필요한 성분을 포함한다. 따라서, 상기 어구는 예를 들어, 세포, 조직, 대상체 또는 유기체, 또는 그의 추출물을 포함한다. 상기 용어는 또한 생물학적 공급원으로부터 재구성된 물질을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "평활 말단"이라는 어구는 당업계에서 일반적으로 허용되는 것과 같은 그의 의미를 나타낸다. 본 발명의 예시적인 핵산 분자와 관련하여, 상기 용어는 오버행잉형 뉴클레오티드를 가지지 않는 이중 가닥 siNA 분자의 말단을 의미한다. 예를 들어, 평활 말단을 가지는 이중 가닥 siNA 분자의 두 가닥은 말단에 오버행잉형 뉴클레오티드 없이 매치되는 염기쌍을 가지고 서로 정렬된다. 본 발명의 siNA 이중체 분자는 이중체의 한쪽 말단 또는 양 말단 모두에, 예컨대, 안티센스 가닥의 5' 말단에, 센스 가닥의 5' 말단에, 또는 이중체의 양 말단 모두에 위치하는 말단에 평활 말단을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 본원에서 "말단 캡"으로도 지칭되는 "캡"이라는 용어는 당업계에서 일반적으로 허용되는 것과 같은 그의 의미를 나타낸다. 본 발명의 예시적인 핵산 분자와 관련하여, 상기 용어는 본 발명의 하나 이상의 핵산 분자의 하나 이상의 말단에 도입될 수 있는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드일 수 있는 모이어티를 의미한다. 이러한 말단 변형은 핵산 분자를 엑소뉴클레아제 분해로부터 보호하고, 세포 내에서의 전달 및/또는 국소화에 도움이 될 수 있다. 캡은 본 발명의 임의의 핵산 분자의 5' 말단 (5'-캡)에 또는 3' 말단 (3'-캡)에 존재할 수 있거나, 또는 양 말단 모두에 존재할 수 있다. 캡은 본 발명의 핵산 분자의 센스 가닥의 5' 말단, 3' 말단 및/또는 5' 및 3' 말단에 존재할 수 있다. 추가로, 캡은 임의로 본 발명의 핵산 분자의 안티센스 가닥의 3' 말단에 존재할 수 있다. 비제한적인 일례로, 5'-캡으로는 LNA; 글리세릴; 역전된 데옥시 무염기성 잔기 (모이어티); 4',5'-메틸렌 뉴클레오티드; 1-(베타-D-에리트로푸라노실) 뉴클레오티드, 4'-티오 뉴클레오티드; 카르보시클릭 뉴클레오티드; 1,5-안히드로헥시톨 뉴클레오티드; L-뉴클레오티드; 알파-뉴클레오티드; 변형된 염기 뉴클레오티드; 포스포로디티오에이트 연결부; 트레오-펜토푸라노실 뉴클레오티드; 비-시클릭 3',4'-세코 뉴클레오티드; 비-시클릭 3,4-디히드록시부틸 뉴클레오티드; 비-시클릭 3,5-디히드록시펜틸 뉴클레오티드; 3'-3'-역전된 뉴클레오티드 모이어티; 3'-3'-역전된 무염기성 모이어티; 3'-2'-역전된 뉴클레오티드 모이어티; 3'-2'-역전된 무염기성 모이어티; 1,4-부탄디올 포스페이트; 3'-포스포르아미데이트; 헥실포스페이트; 아미노헥실 포스페이트; 3'-포스페이트; 3'-포스포로티오에이트; 포스포로디티오에이트; 또는 가교 또는 비-가교 메틸포스포네이트 모이어티를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 3'-캡의 비제한적인 일례로는 LNA; 글리세릴; 역전된 데옥시 무염기성 잔기 (모이어티); 4',5'-메틸렌 뉴클레오티드; 1-(베타-D-에리트로푸라노실) 뉴클레오티드; 4'-티오 뉴클레오티드; 카르보시클릭 뉴클레오티드; 5'-아미노-알킬 포스페이트; 1,3-디아미노-2-프로필 포스페이트; 3-아미노프로필 포스페이트; 6-아미노헥실 포스페이트; 1,2-아미노도데실 포스페이트; 히드록시프로필 포스페이트; 1,5-안히드로헥시톨 뉴클레오티드; L-뉴클레오티드; 알파-뉴클레오티드; 변형된 염기 뉴클레오티드; 포스포로디티오에이트; 트레오-펜토푸라노실 뉴클레오티드; 비-시클릭 3',4'-세코 뉴클레오티드; 3,4-디히드록시부틸 뉴클레오티드; 3,5-디히드록시펜틸 뉴클레오티드, 5'-5'-역전된 뉴클레오티드 모이어티; 5'-5'-역전된 무염기성 모이어티; 5'-포스포르아미데이트; 5'-포스포로티오에이트; 1,4-부탄디올 포스페이트; 5'-아미노; 가교 및/또는 비-가교 5'-포스포르아미데이트; 포스포로티오에이트 및/또는 포스포로디티오에이트; 가교 또는 비-가교 메틸포스포네이트; 및 5'-메르캅토 모이어티를 포함하나, 이에 한정되지 않는다 (보다 상세한 설명을 위해, 문헌 [Beaucage and Iyer, 1993, Tetrahedron 49, 1925] (이는 본원에서 참고로 포함된다)을 참조). 도 5는 다양한 캡의 몇몇 비제한적 예를 보여준다.
본원에서 사용되는 바, "세포"라는 용어는 당업계에서 일반적으로 허용되는 것과 같은 그의 의미를 나타낸다. 본 발명의 예시적인 핵산 분자와 관련하여, 상기 용어는 그의 통상적인 생물학적 의미로 사용되고, 전체 다세포 유기체를 의미하는 것은 아니며, 예컨대, 구체적으로 인간을 의미하는 것은 아니다. 세포는 유기체, 예컨대, 조류, 식물 및 포유동물, 예컨대, 인간, 소, 양, 유인원, 원숭이, 돼지, 개 및 고양이에 존재할 수 있다. 세포는 원핵성 (예컨대, 박테리아 세포) 또는 진핵성 (예컨대, 포유동물 또는 식물 세포)일 수 있다. 세포는 체세포 또는 배선 기원, 전능 또는 만능, 분열 또는 비-분열 세포일 수 있다. 세포는 또한 생식세포 또는 배아, 줄기 세포 또는 완전히 분화된 세포로부터 유래되거나 이들을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "화학적 변형"이라는 어구는 당업계에서 일반적으로 허용되는 것과 같은 그의 의미를 나타낸다. 본 발명의 예시적인 핵산 분자와 관련하여, 상기 용어는 일반적으로 천연 siRNA 또는 RNA의 뉴클레오티드와 상이한 뉴클레오티드의 화학 구조의 임의의 변형을 의미한다. "화학적 변형"이라는 용어는 본원에 기술된 바와 같이, 또는 다르게는 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 당, 염기 또는 뉴클레오티드간 연결부에서의 천연 siRNA 또는 RNA의 부가, 치환 또는 변형을 포함한다. 특정 실시양태에서, "화학적 변형"이라는 용어는 특정 생물계에서 천연적으로 발현된 특정 형태의 RNA, 예를 들어, 2'-O-메틸 변형 또는 이노신 변형을 의미할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "상보성" 또는 "상보적"이라는 용어는 당업계에서 일반적으로 허용되는 것과 같은 그의 의미를 나타낸다. 본 발명의 예시적인 핵산 분자와 관련하여, 상기 용어는 일반적으로 통상적인 왓슨-크릭(Watson-Crick) 또는 본원에 기술된 다른 비-통상적인 유형의 결합에 의한, 한 핵산 서열과 또 다른 핵산 서열 사이의 수소 결합(들)의 형성 또는 존재를 의미한다. 본 발명의 핵산 분자와 관련하여, 핵산 분자와 그의 상보적 서열에 대한 결합 자유 에너지는 관련된 핵산의 기능 (예컨대, RNAi 활성)이 진행되게 하는 데 충분하다. 핵산 분자의 결합 자유 에너지의 측정은 당업계에 주지되어 있다 (예컨대, [Turner et al., 1987, CSH Symp . Quant . Biol . LII pp.123-133]; [Frier et al., 1986, Proc . Nat . Acad . Sci. USA 83:9373-9377]; [Turner et al., 1987, J Am . Chem . Soc . 109:3783-3785] 참조). 완벽하게 상보적이라는 것은 핵산 서열의 모든 연속 잔기가 제2 핵산 서열 중의 동일한 개수의 연속 잔기와 수소 결합할 것이라는 것을 의미한다. 부분적 상보성은 핵산 분자의 센스 가닥 또는 센스 영역과 안티센스 가닥 또는 안티센스 영역 사이에, 또는 핵산 분자의 안티센스 가닥 또는 안티센스 영역과 상응하는 표적 핵산 분자 사이에 생성되는 벌지, 루프 또는 오버행을 형성할 수 있는, 핵산 분자 내의 다양한 미스매치 또는 염기쌍을 형성하지 않는 뉴클레오티드 (예컨대, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 초과의 미스매치, 비-뉴클레오티드 링커 또는 염기쌍을 형성하지 않는 뉴클레오티드)를 포함할 수 있다. 상기와 같은 부분적 상보성은 포함된 뉴클레오티드의 총 개수에 따라, 염기쌍을 형성하지 않는 뉴클레오티드의 개수에 의해 측정된 상보성(%), 즉, 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 등으로 표현될 수 있다. 상기와 같은 부분적 상보성은 핵산 분자 (예컨대, siNA)가 그의 기능, 예를 들어, 서열 특이 RNAi를 매개할 수 있는 능력을 유지할 수 있을 정도로까지 허용된다.
본원에서 사용되는 바, "조성물" 또는 "제제"라는 용어는 당업계에서 일반적으로 허용되는 것과 같은 그의 의미를 나타낸다. 상기 용어는 일반적으로 세포, 또는 예를 들어, 인간을 비롯한 대상체로의 투여, 예컨대, 전신 또는 국소 투여에 적합한 형태의, 예컨대, 제약상 허용되는 담체 또는 희석제 중의 조성물 또는 제제를 의미한다. 적합한 형태는 부분적으로, 용도, 또는 예를 들어, 경구, 경피, 흡입, 또는 주사에 의한 것인 유입 경로에 따라 달라진다. 상기 형태는 조성물 또는 제제가 표적 세포 (즉, 그로의 전달을 위해서는 음으로 하전된 핵산이 바람직한 것인 세포)로 도달하는 것을 방해해서는 안된다. 예를 들어, 혈류 내로 주사되는 조성물은 가용성이어야 한다. 다른 인자들이 당업계에 공지되어 있고, 예컨대, 조성물 또는 제제가 그의 효과를 발휘하지 못하도록 방해하는 독성 및 형태와 같은 고려 사항을 포함한다. 본원에서 사용되는 바, 제약 제제는 인간용 및 수의학용 제제를 포함한다. 본 발명의 핵산 분자와 함께 제제화시키는 데 적합한 제제에 관한 비제한적인 예로는 지질 나노입자 (예를 들어, 문헌 [Semple et al., 2010, Nat Biotechnol, Feb;28(2): 172-6] 참조); P-당단백질 억제제 (예컨대, 플루로닉(Pluronic) P85); 지속 방출 전달을 위한 생분해성 중합체, 예컨대, 폴리(DL-락티드-코글리콜리드) 미소구 (문헌 [Emerich, DF et al., 1999, Cell Transplant, 8, 47-58]); 및 예컨대, 폴리부틸시아노아크릴레이트로 제조된 것과 같은 로딩된 나노입자를 포함한다. 본 발명의 핵산 분자에 대한 전달 전략의 다른 비제한적인 예로는 문헌 [Boado et al., 1998, J Pharm . Sci ., 87, 1308-1315]; [Tyler et al., 1999, FEBS Lett., 421, 280-284]; [Pardridge et al., 1995, PNAS USA ., 92, 5592-5596]; [Boado, 1995, Adv . Drug Delivery Rev ., 15, 73-107]; [Aldrian-Herrada et al., 1998, Nucleic Acids Res ., 26, 4910-4916]; 및 [Tyler et al., 1999, PNAS USA ., 96, 7053-7058]에 기술되어 있는 물질을 포함한다. "제약상 허용되는 조성물" 또는 "제약상 허용되는 제제"는 원하는 활성에 가장 적합한 물리적 위치로 본 발명의 핵산 분자가 효과적으로 분포될 수 있게 하는 조성물 또는 제제를 의미한다.
"세포독성제/세포증식억제제"라는 어구는 주로 세포의 기능을 직접적으로 방해하여 세포 사멸을 일으키거나 세포 증식을 억제하거나, 또는 세포 유사분열을 억제하거나 방해하는 화합물을 의미하며, 이는, 알킬화제, 종양 괴사 인자, 삽입제(intercalator), 저산소증 활성화가능 화합물, 미세소관 억제제/미세소관 안정화제, 유사분열 키네신의 억제제, 히스톤 데아세틸라제 억제제, 유사분열 진행에 관련된 키나제의 억제제, 성장 인자 및 시토카인 신호 전달 경로에 관여하는 키나제의 억제제, 항증식제; 생물학적 반응 개질제; 호르몬/항호르몬 치료제, 조혈 성장 인자, 모노클로날 항체 표적 치료제, 토포이소머라제 억제제, 프로테오솜 억제제, 및 유비퀴틴 리가제 억제제를 포함한다.
"에스트로겐 수용체 조절제"라는 어구는 기전에 상관없이, 에스트로겐이 수용체에 결합하는 것을 방해하거나 억제하는 화합물을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "유전자" 또는 "표적 유전자"라는 용어는 당업계에서 일반적으로 허용되는 것과 같은 그의 의미를 나타낸다. 상기 용어는 일반적으로 폴리펩티드 생산에 필요한 부분 길이의 또는 전장의 코딩 서열을 포함하는 핵산 (예를 들어, DNA 또는 RNA) 서열을 의미한다. 표적 유전자는 또한 핵산 서열의 UTR 또는 비-코딩 영역을 포함할 수 있다. 유전자 또는 표적 유전자는 또한 기능적 RNA (fRNA) 또는 비-코딩 RNA (ncRNA), 예컨대, 소형 임시 RNA (stRNA), 마이크로 RNA (miRNA), 소형 핵 RNA (snRNA), 짧은 간섭 RNA (siRNA), 소형 핵인 RNA (snRNA), 리보솜 RNA (rRNA), 전달 RNA (tRNA) 및 그의 전구체 RNA를 코딩할 수 있다. 이러한 비-코딩 RNA는 기능적 또는 조절 세포 과정에 관여하는 fRNA 또는 ncRNA의 활성을 조절하는 데 있어서 siNA 매개 RNA 간섭을 위한 표적 핵산 분자로서 역할을 할 수 있다. 따라서, 질환을 유발하는 비정상적인 fRNA 또는 ncRNA 활성은 본 발명의 siNA 분자에 의해 조절될 수 있다. 또한, fRNA 및 ncRNA를 표적화하는 siNA 분자를 사용하여 예컨대, 유전자 각인, 전사, 번역 또는 핵산 프로세싱 (예를 들어, 아미노전이반응, 메틸화 등)과 같은 세포 과정에 개입함으로써, 대상체, 유기체 또는 세포의 유전자형 또는 표현형을 조작하거나, 또는 변경시킬 수 있다. 표적 유전자는 세포로부터 유래된 유전자, 내인성 유전자, 트랜스진, 또는 외인성 유전자, 예컨대, 병원체, 예를 들어, 바이러스의 유전자, 예를 들어, 그의 감염 후 세포에 존재하는 것일 수 있다. 표적 유전자를 함유하는 세포는 임의의 유기체, 예를 들어, 식물, 동물, 원생동물, 바이러스, 박테리아 또는 진균으로부터 유래되거나, 또는 이들 내에 함유될 수 있다. 식물의 비제한적 예로는 외떡잎 식물, 쌍떡잎 식물 또는 겉씨식물을 포함한다. 동물의 비제한적 예로는 척추동물 또는 무척추동물을 포함한다. 진균의 비제한적 예로는 곰팡이 또는 효모를 포함한다. 리뷰를 위해, 예를 들어, 문헌 [Snyder and Gerstein, 2003, Science, 300, 258-260]을 참조할 수 있다.
"HMG-CoA 리덕타제 억제제"라는 어구는 3-히드록시-3-메틸글루타릴-CoA 리덕타제의 억제제를 의미한다. 본원에서 사용되는 바, HMG-CoA 리덕타제 억제제라는 용어는 모든 제약상 허용되는 락톤 및 개환 산 형태 (즉, 락톤 고리가 개환되어 유리산을 형성한 경우) 뿐만 아니라, HMG-CoA 리덕타제 억제 활성을 가진 화합물의 염 및 에스테르 형태를 포함하고, 따라서, 이러한 염, 에스테르, 개환 산 및 락톤 형태의 용도가 본 발명의 범위 내에 포함된다.
"HBV"라는 용어는 B형 간염 바이러스를 지칭하는 것으로서, 이는 HBV 단백질, HBV 펩티드, HBV 폴리펩티드, HBV 조절 폴리뉴클레오티드 (예컨대, HBV miRNA 및 siNA), 돌연변이체 HBV 유전자, 및 HBV 유전자의 스플라이스 변이체를 코딩하는 유전자 뿐만 아니라, HBV의 유전자 발현 및/또는 활성 경로에 관여하는 다른 유전자이다. 따라서, "HBV"라는 용어와 관련하여 본원에 기술된 각각의 실시양태는 상기 용어가 본원에서 정의되어 있는 바와 같이, "HBV"라는 용어에 포함되는 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 및/또는 폴리뉴클레오티드 분자 모두에 적용될 수 있다. 총괄적으로, 본원에서 상기 유전자 표적이라는 것은 또한 일반적으로는 (표 1a에 열거된 표적 서열을 비롯한) "표적" 서열로서 지칭된다.
"고도로 보존된 서열 영역"이라는 어구는 세대간에 또는 생물계간에 유의적인 차이를 보이지 않는 표적 유전자 중 하나 이상의 영역의 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "상동성 서열"이라는 어구는 당업계에서 일반적으로 허용되는 것과 같은 그의 의미를 나타낸다. 상기 용어는 일반적으로 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열, 예컨대, 유전자, 유전자 전사체 및/또는 비-코딩 폴리뉴클레오티드에 의해 공유되는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 예를 들어, 상동성 서열은 예컨대, 유전자 패밀리의 다른 구성원, 다른 단백질 에피토프, 다른 단백질 이소형 또는 완전하게 분기성인 유전자와 같은, 관련되어 있지만 상이한 단백질을 코딩하는 2개 이상의 유전자에 의해 공유되는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 상동성 서열은 예컨대, 비코딩 DNA 또는 RNA, 조절 서열, 인트론, 및 전사 제어 또는 조절 부위와 같은 2개 이상의 비-코딩 폴리뉴클레오티드에 의해 공유되는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 상동성 서열은 또한 1개 초과의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 공유되는 서열 영역을 포함할 수 있다. (예컨대, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80% 이상 등의) 부분적으로 상동성인 서열도 또한 본 발명에서 고려되고, 본 발명의 범주내 포함되는 바, 상동성은 완벽하게 동일성 (예컨대, 100%)일 필요는 없다. 상동성 백분율은 두 서열 간에 매칭되는 뉴클레오티드의 수를 비교되는 총 길이로 나누고 100을 곱한 것이다.
"RNAi 활성 개선"이라는 어구는, RNAi를 매개할 수 있는 본 발명의 siNA의 능력 및 본 발명의 siNA의 안정성, 둘 모두를 반영하는 것인 RNAi 활성이 시험관내 및/또는 생체내에서 측정되었을 때, 증가한 것을 의미한다. 본 발명에서, 이러한 활성의 생성물은 시험관내 및/또는 생체내에서 모든 RNA siNA, 또는 복수개의 리보뉴클레오티드를 함유하는 siNA와 비교하였을 때 증가될 수 있다. 일부 경우에서, siNA 분자의 활성 또는 안정성은 감소할 수는 있지만 (즉, 10배 미만으로), siNA 분자의 전반적인 활성은 시험관내 및/또는 생체내에서 증진된다.
본원에서 사용되는 바, "억제하다," "하향조절하다," 또는 "감소시키다"라는 용어는 당업계에서 일반적으로 허용되는 것과 같은 그의 의미를 나타낸다. 본 발명의 예시적인 핵산 분자와 관련하여, 상기 용어는 일반적으로 하나 이상의 단백질 또는 단백질 서브유닛을 코딩하는 유전자의 발현 또는 RNA 분자 또는 등가의 RNA 분자의 수준, 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 서브유닛의 활성이, 본 발명의 핵산 분자 (예컨대, siNA)의 부재하에서 관찰된 것 미만으로 감소된 것을 의미한다. 하향조절은 또한 전사후 침묵화, 예컨대, RNAi 매개 절단과 관련이 있을 수 있거나, DNA 메틸화 패턴 또는 DNA 염색질 구조에서의 변경과 관련될 수 있다. siNA 분자를 사용한 억제, 하향조절 또는 감소는 불활성 분자, 감쇠된 분자, 스크램블 서열을 가진 siNA 분자 또는 미스매치를 가진 siNA 분자와 관련될 수 있거나, 또는 별법으로, 이는 핵산 부재의 시스템과 관련될 수 있다.
"세포 증식 및 생존 신호전달 경로의 억제제"라는 어구는 세포 표면 수용체, 및 상기 표면 수용체의 하류에 존재하는 신호 전달 캐스캐이드를 억제하는 제약 작용제를 의미한다.
"인테그린 차단제"라는 용어는 생리학적 리간드의 αωβ3 인테그린에의 결합을 선택적으로 길항시키거나, 억제시키거나, 또는 중화시키는 화합물, 생리학적 리간드의 αωβ5 인테그린에의 결합을 선택적으로 길항시키거나, 억제시키거나, 또는 중화시키는 화합물, 생리학적 리간드의 αωβ3 인테그린 및 αωβ5 인테그린, 둘 모두에의 결합을 길항시키거나, 억제시키거나, 또는 중화시키는 화합물, 및 모세혈관 내피 세포 상에서 발현되는 특정 인테그린(들)의 활성을 길항시키거나, 억제시키거나, 또는 중화시키는 화합물을 의미한다. 상기 용어는 또한 αωβ6, αωβ8, α1β1, α2β1, α5β1, α6β1, 및 α6β4 인테그린의 길항제를 의미한다. 상기 용어는 또한 αωβ3, αωβ5, αωβ6, αωβ8, α1β1, α2β1, α5β1, α6β1, 및 α6β4 인테그린의 임의의 조합의 길항제를 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "간헐적" 또는 "간헐적으로"라는 용어는 당업계에서 일반적으로 허용되는 것과 같은 그의 의미를 나타낸다. 상기 용어는 일반적으로 규칙적, 또는 불규칙적인 간격을 두고 주기적으로 중단하고 개시하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "뉴클레오시드간 연결부" 또는 "뉴클레오시드간 링커" 또는 "뉴클레오티드간 연결부" 또는 "뉴클레오티드간 링커"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 이는 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 두 뉴클레오시드 단위 사이의 임의의 링커 또는 연결부를 의미하고, 그 예로 포스페이트, 포스페이트의 유사체, 포스포네이트, 구아니듐, 히드록실아민, 히드록실히드라지닐, 아미드, 카르바메이트, 알킬, 및 치환된 알킬 연결부를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 뉴클레오시드간 연결부는 핵산 분자의 백본을 구성한다.
본원에서 사용되는 "포유동물의" 또는 "포유동물"이라는 용어는 당업계에서 일반적으로 허용되는 것과 같은 그의 의미를 나타낸다. 상기 용어는 일반적으로 임의의 온혈 척추동물 종, 예컨대, 인간, 마우스, 래트, 개, 고양이, 햄스터, 기니 피그, 토끼, 가축 등을 지칭한다.
"계량된 용량 흡입기" 또는 MDI라는 용어는 캔, 캔을 덮는 안전 캡 및 캡에 위치하는 제제 계량 밸브를 포함하는 유닛을 의미한다. MDI 시스템은 적합한 채널링 장치를 포함한다. 적합한 채널링 장치로는 예를 들어, 의약이 충전된 캐니스터로부터 계량 밸브를 통해 환자의 코 또는 입으로 전달될 수 있는 밸브 작동기 및 원통형 또는 원뿔 유사 통로, 예컨대, 마우스피스 작동기를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "마이크로RNA" 또는 "miRNA"라는 용어는 당업계에서 일반적으로 허용되는 것과 같은 그의 의미를 나타낸다. 상기 용어는 일반적으로 mRNA 절단, 번역 저해/억제 또는 이염색질 침묵화에 의해 표적 메신저 RNA의 발현을 조절하는 소형 이중 가닥 RNA를 의미한다 (예를 들어, 문헌 [Ambros, 2004, Nature, 431, 350-355]; [Bartel, 2004, Cell , 116, 281-297]; [Cullen, 2004, Virus Research ., 102, 3-9]; [He et al., 2004, Nat . Rev . Genet ., 5, 522-531]; [Ying et al., 2004, Gene, 342, 25-28]; 및 [Sethupathy et al., 2006, RNA, 12: 192-197] 참조).
본원에서 사용되는 바, "조절하다"라는 용어는 당업계에서 일반적으로 허용되는 것과 같은 그의 의미를 나타낸다. 본 발명의 예시적인 핵산 분자와 관련하여, 상기 용어는 유전자의 발현, 또는 하나 이상의 RNA 분자 (코딩 또는 비-코딩)의 수준, 또는 하나 이상의 RNA 분자 또는 단백질 또는 단백질 서브유닛의 활성이 상향조절되거나 하향조절되어 이러한 발현, 수준 또는 활성이 조절 작용을 하는 분자의 부재하에서 관찰되는 것보다 더 높거나 더 낮아지도록 하는 것을 의미한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, "조절하다"라는 용어는 예컨대, 유전자 발현의 억제라는 것을 의미할 수 있고, 다른 실시양태에서는 예컨대, 유전자 발현의 강화 또는 상향조절을 의미할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "변형된 뉴클레오티드"라는 어구는 당업계에서 일반적으로 허용되는 것과 같은 그의 의미를 나타낸다. 상기 용어는 일반적으로 당업계에 일반적으로 공지되어 있는 바와 같이, 변형되지 않은 (또는 천연) 뉴클레오티드의 염기, 당 및/또는 포스페이트의 화학 구조에 변형을 함유하는 것인 뉴클레오티드를 의미한다. 변형된 뉴클레오티드의 비제한적인 예는 본원 및 미국 출원 번호 12/064,014에 기술되어 있다.
본원의 목적을 위한, "선택적 COX-2 억제제인 NSAID"라는 어구는 세포 또는 마이크로솜 검정에 의해 평가된 COX-1의 IC50에 대한 COX-2의 IC50의 비로 측정된 바, COX-1에 비한 COX-2 억제 특이성이 100배 이상인 NSAID로 정의된다.
"염기쌍을 형성하지 않는"이라는 어구는 이중 가닥 siNA 분자의 센스 가닥 또는 센스 영역과 안티센스 가닥 또는 안티센스 영역 사이에 염기쌍이 형성되지 않은 뉴클레오티드를 의미하고, 예를 들어, 제한하는 것은 아니지만, 미스매치, 오버행, 단일 가닥 루프 등을 포함할 수 있다.
"비-뉴클레오티드"라는 용어는 하나 이상의 뉴클레오티드 단위 대신에 핵산 쇄 내로 도입될 수 있는 임의의 기 또는 화합물, 예를 들어, 제한하는 것은 아니지만 무염기성 모이어티 또는 알킬쇄를 의미한다. 상기 기 또는 화합물은 통상 알려져 있는 뉴클레오티드 염기, 예컨대, 아데노신, 구아닌, 시토신, 우라실 또는 티민을 함유하지 않고, 그에 따라 1' 위치에 핵염기가 없다는 점에서 "무염기성"이다.
"뉴클레오티드"라는 용어는 당업계에 일반적으로 인지되어 있는 바와 같이 사용된다. 뉴클레오티드는 일반적으로 핵염기, 당 및 뉴클레오시드간 연결부, 예컨대, 포스페이트를 포함한다. 염기는 당업계에 주지되어 있는 천연 염기 (표준), 변형된 염기, 또는 염기 유사체일 수 있다. 이러한 염기는 일반적으로 뉴클레오티드 당 모이어티의 1' 위치에 위치한다. 추가로, 뉴클레오티드는 변형되지 않거나, 또는 당, 뉴클레오시드간 연결부, 및/또는 염기 모이어티에서 변형될 수 있으며 (이는 또한 상호교환적으로, 뉴클레오티드 유사체, 변형된 뉴클레오티드, 비-천연 뉴클레오티드, 비-표준 뉴클레오티드 등으로도 지칭된다); 예를 들어, 미국 출원 번호 12/064,014를 참조할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "오버행"이라는 용어는 당업계에서 일반적으로 허용되는 것과 같은 그의 의미를 나타낸다. 예시적인 이중 가닥 핵산 분자와 관련하여, 상기 용어는 일반적으로 이중 가닥 핵산 분자의 두 가닥 사이에 염기쌍이 형성되지 않은 뉴클레오티드 서열의 말단부를 지칭한다 (예를 들어, 도 4 참조). 존재할 경우, 오버행은 전형적으로는 siNA 이중체의 한 가닥 또는 양 가닥 모두의 3' 말단에 존재한다.
본원에서 사용되는 바, "비경구적"이라는 용어는 당업계에서 일반적으로 허용되는 것과 같은 그의 의미를 나타낸다. 상기 용어는 일반적으로 소화관을 통하지 않는 방식으로 분자, 약물, 작용제 또는 화합물을 투여하는 방법 또는 기법을 의미하며, 이는 피부, 피하, 혈관내 (예컨대, 정맥내), 근육내 또는 경막내 주사 또는 주입 기법 등을 포함한다.
"경로 표적"이라는 어구는 유전자 발현 또는 활성의 경로에 관여하는 임의의 표적을 의미한다. 예를 들어, 임의의 주어진 표적은 생물학적 경로에서 상류, 하류 또는 조절 유전자를 포함할 수 있는 관련 경로 표적을 가질 수 있다. 이들 경로 표적 유전자는 본원의 질환, 병태 및 특질의 치료에서 상가적 또는 상승작용적 효과를 제공할 수 있다.
"포스포로티오에이트"라는 용어는 산소 원자 대신에 하나 이상의 황 원자를 포함하는 뉴클레오티드간 포스페이트 연결부를 지칭한다. 따라서, 포스포로티오에이트라는 용어는 포스포로티오에이트 및 포스포로디티오에이트 뉴클레오티드간 연결부를 둘 모두를 지칭한다.
"프레닐-단백질 트랜스퍼라제 억제제"는 파르네실-단백질 트랜스퍼라제 (FPTase), 게라닐게라닐-단백질 트랜스퍼라제 I형 (GGPTase-I) 및 게라닐게라닐-단백질 트랜스퍼라제 II형 (GGPTase-II, 또한 Rab GGPTase로도 명명된다)를 비롯한, 프레닐-단백질 트랜스퍼라제 효소의 임의의 하나 또는 임의의 조합을 억제하는 화합물을 의미한다.
"레티노이드 수용체 조절제"라는 어구는 기전에 상관없이, 레티노이드가 수용체에 결합하는 것을 방해하거나 억제하는 화합물을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "리보뉴클레오티드"라는 용어는 당업계에서 일반적으로 허용되는 것과 같은 그의 의미를 나타낸다. 상기 용어는 일반적으로 β-D-리보푸라노스 모이어티의 2' 위치에 히드록실 기를 가지는 뉴클레오티드를 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "RNA"라는 용어는 당업계에서 일반적으로 허용되는 것과 같은 그의 의미를 나타낸다. 일반적으로, 상기 용어 RNA는 1 이상의 리보푸라노시드 모이어티를 포함하는 분자를 의미한다. 상기 용어에는 이중 가닥 RNA, 단일 가닥 RNA, 단리된 RNA, 예컨대, 부분적으로 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합적으로 생산된 RNA, 뿐만 아니라, 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 천연 발생 RNA와 상이한 변경된 RNA를 포함한다. 이러한 변경으로는 예컨대, siNA의 말단(들)에 또는 내부에, 예를 들어, RNA의 하나 이상의 뉴클레오티드에 비-뉴클레오티드 물질을 부가하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 RNA 분자 내의 뉴클레오티드로는 또한 비-표준 뉴클레오티드, 예컨대, 비-천연 발생 뉴클레오티드 또는 화학적으로 합성된 뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이들 변경된 RNA는 유사체 또는 천연 발생 RNA의 유사체로 지칭될 수 있다.
"RNA 간섭"이라는 어구 또는 "RNAi"라는 용어는 당업계에 일반적으로 공지되어 있는 바와 같이, 짧은 간섭 핵산 분자에 의해 매개되는, 세포내 유전자 발현을 억제하거나 하향조절하는 생물학적 과정을 지칭하며, 예를 들어, 문헌 [Zamore and Haley, 2005, Science, 309, 1519-1524]; [Vaughn and Martienssen, 2005, Science, 309, 1525-1526]; [Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33]; [Bass, 2001, Nature , 411, 428-429]; [Elbashir et al., 2001, Nature, 411, 494-498]; 및 PCT 국제 공개 번호 WO 00/44895 (Kreutzer et al.); PCT 국제 공개 번호 WO 01/36646 (Zernicka-Goetz et al.); PCT 국제 공개 번호 WO 99/32619 (Fire); PCT 국제 공개 번호 WO 00/01846 (Plaetinck et al.); PCT 국제 공개 번호 WO 01/29058 (Mello and Fire); PCT 국제 공개 번호 WO 99/07409 (Deschamps-Depaillette); 및 PCT 국제 공개 번호 WO 00/44914 (Li et al.); [Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819]; [Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837]; [Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218]; 및 [Hall et al., 2002, Science , 297, 2232-2237]; [Hutvagner and Zamore, 2002, Science, 297, 2056-60]; [McManus et al., 2002, RNA, 8, 842-850]; [Reinhart et al., 2002, Gene & Dev ., 16, 1616-1626]; 및 [Reinhart & Bartel, 2002, Science , 297, 1831]을 참조할 수 있다. 추가로, RNAi라는 용어는 서열 특이 RNA 간섭, 예컨대, 전사후 유전자 침묵화, 번역 억제, 전사 억제, 또는 후성유전학적 성질을 기술하는 데 사용되는 다른 용어와 등가인 것으로 의도된다. 예를 들어, 본 발명의 siNA 분자는 전사후 수준 또는 전사전 수준에서 유전자를 후성유전학적으로 침묵화시키는 데 사용될 수 있다. 비제한적인 일례로, 본 발명의 siNA 분자에 의한 유전자 발현의 후성유전학적 조절은 유전자 발현을 변경시키기 위한 염색질 구조 또는 메틸화 패턴의 siNA 매개 변형으로 인한 것일 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Verdel et al., 2004, Science , 303, 672-676]; [Pal-Bhadra et al., 2004, Science, 303, 669-672]; [Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819]; [Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837]; [Jenuwein, 2002, Science , 297, 2215-2218]; 및 [Hall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237] 참조). 또 다른 비제한적 예에서, 본 발명의 siNA 분자에 의한 유전자 발현의 조절은 당업계에 공지된 바와 같이 RISC를 통해 또는 번역 억제를 통해 RNA (코딩 또는 비-코딩 RNA)의 siNA 매개 절단으로부터 야기될 수 있거나, 또는 조절은 전사 억제로부터 야기될 수 있다 (예를 들어, [Janowski et al., 2005, Nature Chemical Biology, 1, 216-222] 참조).
"RNAi 억제제"라는 어구는 세포 또는 유기체에서 RNA 간섭 기능 또는 활성을 하향조절, 감소 또는 억제시킬 수 있는 임의의 분자를 의미한다. RNAi 억제제는 RNAi 경로의 임의의 성분, 예를 들어, 단백질 성분, 예컨대, RISC, 또는 핵산 성분, 예컨대, miRNA 또는 siRNA와 상호작용하거나 그의 기능을 방해하여 RNAi를 하향조절, 감소 또는 억제시킬 수 있다 (예를 들어, 표적 폴리뉴클레오티드의 RNAi 매개 절단, 번역 억제 또는 전사 침묵화). RNAi 억제제는 siNA 분자, 안티센스 분자, 압타머, 또는 세포 또는 유기체에서 RISC, miRNA 또는 siRNA, 또는 RNAi 경로 내의 임의의 다른 성분과 상호작용하거나 이를 방해하는 소분자일 수 있다. RNAi를 억제함으로써 (예컨대, 표적 폴리뉴클레오티드의 RNAi 매개 절단, 번역 억제 또는 전사 침묵화), 본 발명의 RNAi 억제제는 표적 유전자의 발현을 조절 (예를 들어, 상향조절 또는 하향조절)하는 데 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "센스 영역"이라는 어구는 당업계에서 일반적으로 허용되는 것과 같은 그의 의미를 나타낸다. 본 발명의 예시적인 핵산 분자와 관련하여, 상기 용어는 siNA 분자의 안티센스 영역에 대해 상보성을 가진 siNA 분자의 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 추가로, siNA 분자의 센스 영역은 표적 핵산 서열과 상동성 또는 서열 동일성을 가진 핵산 서열을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, siNA 분자의 센스 영역은 또한 센스 가닥 또는 패신저 가닥으로도 지칭된다.
"짧은 간섭 핵산," "siNA," "짧은 간섭 RNA," "siRNA," "짧은 간섭 핵산 분자," "짧은 간섭 올리고뉴클레오티드 분자," 또는 "화학적으로 변형된 짧은 간섭 핵산 분자"라는 어구는 RNA 간섭 ("RNAi") 또는 유전자 침묵화를 서열 특이 방식으로 매개함으로써 유전자 발현 또는 바이러스 복제를 억제하거나 하향조절할 수 있는 임의의 핵산 분자를 의미한다. 이들 용어는 개별 핵산 분자, 복수개의 상기 핵산 분자, 또는 상기 핵산 분자의 풀 모두를 지칭할 수 있다. siNA 는 자기-상보적인 센스 및 안티센스 가닥을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자일 수 있는데, 여기서, 안티센스 가닥은 표적 핵산 분자 또는 그의 일부의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 센스 가닥은 표적 핵산 서열 또는 그의 일부에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. siNA 는 자기-상보적인 센스 및 안티센스 영역을 가진 이중체, 비대칭 이중체, 헤어핀 또는 비대칭 헤어핀 2차 구조의 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 여기서, 안티센스 영역은 별개의 표적 핵산 분자 또는 그의 일부의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 센스 영역은 표적 핵산 서열 또는 그의 일부에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. siNA는 자기-상보적인 센스 및 안티센스 영역을 포함하는 2개 이상의 루프 구조 및 스템을 가진 환형 단일 가닥 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 여기서, 안티센스 영역은 표적 핵산 분자 또는 그의 일부의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 센스 영역은 표적 핵산 서열 또는 그의 일부에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서, 환형 폴리뉴클레오티드는 생체내 또는 시험관내에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성 siNA 분자를 생성할 수 있다. siNA는 또한 표적 핵산 분자 또는 그의 일부의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가진 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있고 (예를 들어, 이러한 siNA 분자가 siNA 분자내에 표적 핵산 서열 또는 그의 일부에 상응하는 뉴클레오티드 서열의 존재를 필요로 하지 않는 경우), 여기서, 단일 가닥 폴리뉴클레오티드는 말단 포스페이트 기, 예컨대, 5'-포스페이트 (예를 들어, 문헌 [Martinez et al., 2002, Cell., 110, 563-574] 및 [Schwarz et al., 2002, Molecular Cell , 10, 537-568] 참조 ) 또는 5',3'-디포스페이트를 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "대상체"라는 용어는 당업계에서 일반적으로 허용되는 것과 같은 그의 의미를 나타낸다. 상기 용어는 일반적으로 본 발명의 핵산 분자를 투여할 수 있는 유기체를 의미한다. 대상체는 인간 또는 인간 세포를 비롯한, 포유동물 또는 포유동물의 세포일 수 있다. 상기 용어는 또한 체외이식된 세포의 공여자 또는 수용자인 유기체, 또는 세포 그 자체를 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "전신 투여"라는 어구는 당업계에서 일반적으로 허용되는 것과 같은 그의 의미를 나타낸다. 상기 용어는 일반적으로 약물이 혈류 중 생체내 전신 흡수되거나 축적된 후, 전신으로 분포되는 것을 의미한다.
HBV를 의미하는 것과 같이, "표적"이라는 용어는 예컨대, 표 7에 제시되어 있는 진뱅크(Genbank) 등록 번호에 의해 코딩되는 것과 같은, 임의의 HBV 표적 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드를 의미한다. 상기 용어는 또한 예컨대, 표 7에 제시되어 있는 진뱅크 등록 번호를 가지는 서열에 의해 코딩되는 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드와 같은, 임의의 표적 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 또는 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 관심의 대상이 되는 표적으로는 표적 폴리뉴클레오티드 서열, 예컨대, 표적 DNA 또는 표적 RNA를 포함할 수 있다. "표적"이라는 용어는 또한 상이한 이소형, 돌연변이체 표적 유전자, 표적 폴리뉴클레오티드의 스플라이스 변이체, 표적 다형태, 및 비-코딩 (예컨대, ncRNA, miRNA, stRNA, sRNA) 또는 본원에 기술된 다른 조절 폴리뉴클레오티드 서열과 같은 다른 서열도 포함하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 바, "표적 부위"라는 어구는 당업계에서 일반적으로 허용되는 것과 같은 그의 의미를 나타낸다. 상기 용어는 일반적으로 안티센스 영역 내에 표적 서열에 상보적인 서열을 함유하는 siNA 구축물에 의해 매개되는 절단에 대해 "표적화된", 표적 핵산 분자 (예컨대, RNA) 내의 서열을 지칭한다 .
본원에서 사용되는 바, "치료 유효량"이라는 어구는 당업계에서 일반적으로 허용되는 것과 같은 그의 의미를 나타낸다. 상기 용어는 일반적으로 연구원, 수의사, 의사 또는 다른 임상의에 의해 결정되는, 세포, 조직, 시스템, 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 유도해 내는 화합물 또는 제약 조성물의 양을 의미한다. 예를 들어, 질환 또는 장애와 관련된 측정가능한 파라미터가 25% 이상 감소되었을 때, 주어진 임상 치료는 효과가 있는 것으로 간주될 경우, 질환 또는 장애의 치료를 위한 약물의 치료 유효량은 상기 파라미터를 25% 이상 감소시키는 데 필요한 양이다.
본원에서 사용되는 바, "유니버설 염기"라는 어구는 당업계에서 일반적으로 허용되는 것과 같은 그의 의미를 나타낸다. 상기 유니버설 염기는 일반적으로 차이가 거의 없거나 전혀없이, 각각의 천연 DNA/RNA 염기와 염기쌍을 형성하는 뉴클레오티드 염기 유사체를 의미한다. 유니버설 염기의 비제한적인 예로는 당업계에 공지된 바와 같은 C-페닐, C-나프틸 및 다른 방향족 유도체, 이노신, 아졸 카르복스아미드 및 니트로아졸 유도체, 예컨대 3-니트로피롤, 4-니트로인돌, 5-니트로 인돌 및 6-니트로인돌을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Loakes, 2001, Nucleic Acids Research, 29, 2437-2447] 참조).
본원에서 사용되는 바, "상향조절하다"라는 어구는 당업계에서 일반적으로 허용되는 것과 같은 그의 의미를 나타낸다. 본 발명의 예시적인 핵산 분자와 관련하여, 상기 용어는 유전자의 발현, 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 서브유닛을 코딩하는 RNA 분자 또는 등가의 RNA 분자의 수준, 또는 하나 이상의 RNA, 단백질 또는 단백질 서브유닛의 활성이 본 발명의 핵산 분자 (예를 들어, siNA)의 부재하에 관찰된 것 초과로 증가한 것을 의미한다. 특정 경우에서, siNA 분자를 사용한 유전자 발현의 상향조절 또는 촉진은 불활성 또는 감쇠된 분자의 존재하에 관찰된 수준 초과이다. 다른 경우에서, siNA 분자를 사용한 유전자 발현의 상향조절 또는 촉진은, 예를 들어 스크램블 서열 또는 미스매치를 가진 siNA 분자의 존재하에 관찰된 수준보다 크다. 또 다른 경우에서, 본 발명의 핵산 분자를 사용한 유전자 발현의 상향조절 또는 촉진은 상기 핵산 분자의 부재하에서 보다 핵산 분자의 존재하에 더 크다. 일부 경우에, 유전자 발현의 상향조절 또는 촉진은, RNA 매개 유전자 침묵화의 억제, 예컨대, 상향 조절되는 관심의 대상이 되는 유전자의 발현을 하향조절, 억제 또는 침묵화시키는 코딩 또는 비-코딩 RNA 표적의 RNAi 매개 절단 또는 침묵화의 억제와 관련된다. 유전자 발현의 하향조절은, 예를 들어, 코딩 RNA 또는 그의 코딩된 단백질에 의해, 예컨대, 음성 피드백 또는 길항 효과를 통해 유도될 수 있다. 유전자 발현의 하향 조절은, 예를 들어 관심의 대상이 되는 유전자에 대한 조절 제어를 가진 비-코딩 RNA에 의해, 예를 들어, 번역 억제, 염색질 구조, 메틸화, RISC 매개 RNA 절단 또는 번역 억제를 통해 유전자의 발현을 침묵화시킴으로써 유도될 수 있다. 이와 같이, 관심의 대상이 되는 유전자를 하향조절하거나, 저해하거나, 침묵화시키는 표적의 억제 또는 하향조절을 이용하여, 치료 용도를 위하여 관심의 대상이 되는 유전자의 발현을 상향조절시킬 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "벡터"라는 용어는 당업계에서 일반적으로 허용되는 것과 같은 그의 의미를 나타낸다. 벡터라는 용어는 일반적으로 하나 이상의 핵산 분자를 전달하는 데 사용되는 임의의 핵산- 및/또는 바이러스-기반의 발현 시스템 또는 기법을 의미한다.
B. 본 발명의 siNA 분자
본 발명은 질환, 예컨대, 간 질환 또는 HBV 발현과 관련이 있는 악성 종양 및/또는 암, 또는 B형 간염 감염으로부터 유발되는 다른 병태를 치료하는 데 사용될 수 있는, HBV에 표적화되는 siNA를 포함하는 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 특정 측면 및 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 표 1a 및 표 1b에 제시된 서열의 15개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. siNA는 수개의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, siNA는 하나 이상의 siNA 화합물로서 단리될 수 있거나, 또는 DNA 플라스미드 중 전사 카세트 형태로 존재할 수 있다. siNA는 또한 화학적으로 합성될 수 있고, 이는 예를 들어, 제한하는 것은 아니지만, 표 1c 및 표 8에 제시된 바와 같은 변형을 포함할 수 있다. 따라서, 다양한 실시양태에서, 본 발명의 핵산의 1 이상의 가닥 또는 영역은 서열 1-502로 이루어진 서열 군으로부터 선택되는 15개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. siNA는 단독으로 투여될 수 있거나, 또는 다른 siNA 분자와 함께 또는 HBV 관련 질환 또는 병태를 치료하는 통상의 작용제와 함께 공동으로 투여될 수 있다.
본 발명의 siNA 분자를 사용하여 RNA 전사체와의 상호작용을 통해, 또는 별법으로, 특정 유전자 서열과의 상호작용에 의해 유전자 침묵화, 구체적으로 HBV 유전자 침묵화를 매개할 수 있는데, 여기서, 상기 상호작용을 통해 전사 수준 또는 전사 후 수준으로, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, RNAi로, 또는 염색질 구조 또는 표적의 메틸화 패턴을 조절하고, 표적 유전자의 전사를 방해하는 세포 과정을 통해 유전자 침묵화는 조절되고, 이로써, 표적의 뉴클레오티드 서열은 침묵화를 매개하게 된다. 더욱 구체적으로, 표적은 HBV RNA, DNA, 또는 mRNA 중 임의의 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 세포 또는 포유동물에서 HBV 유전자의 발현을 억제시키기 위한 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자를 제공한다. siNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 이중 가닥일 경우, siNA는 센스 및 안티센스 가닥을 포함한다. 안티센스 가닥은 HBV 유전자의 발현시 형성된 mRNA의 적어도 일부에 상보적이다. 센스 가닥은 안티센스 가닥에 상보적인 영역을 포함한다. 구체적 실시양태에서, 안티센스 가닥은 표 1b에 열거되어 있는 안티센스 서열의 15개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일반적으로, 이중 가닥 siNA는 표 1b 중의 센스 가닥의 15개 이상의 뉴클레오티드 서열 및 표 1b 중의 안티센스 가닥의 15개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명의 siNA의 하나 이상의 뉴클레오티드는 임의로 변형된다. 변형된 추가의 실시양태에서, 본 발명의 일부 siNA는 표 1c에서 제공하는 서열 군으로부터 선택되는 1 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, siNA는 표 1c에서 제공하는 서열 군으로부터 선택되는 2 이상의 서열을 포함하는데, 여기서, 2 이상의 서열 중 하나는 2 이상의 서열 중 또 다른 것에 상보적이고, 2 이상의 서열 중 하나는 HBV 유전자의 발현시에 생성된 mRNA의 서열에 상보적이다. 본 발명의 특정의 변형된 siNA의 예는 표 1c에 있다.
본 발명의 이중 가닥 RNA 분자는 대칭 또는 비대칭일 수 있고, 상보적인 것인 2개의 상이한 별개의 가닥, 즉, 단일 가닥 RNA 분자를 포함할 수 있거나, 또는 2개의 상보적인 부분, 예컨대, 센스 영역 및 안티센스 영역이 염기쌍을 형성하고, 하나 이상의 단일 가닥 "헤어핀" 부위 (즉, 루프)에 의해 공유적으로 결합함으로써 예를 들어, 단일 가닥 짧은 헤어핀 폴리뉴클레오티드 또는 환형 단일 가닥 폴리뉴클레오티드가 생성되는 것인 하나의 단일 가닥 분자를 포함할 수 있다.
링커는 폴리뉴클레오티드 링커 또는 비-뉴클레오티드 링커일 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 비-뉴클레오티드 링커이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 헤어핀 또는 환형 siNA 분자는 하나 이상의 루프 모티프를 함유하는데, 여기서, siNA 분자의 루프 부분 중 1 이상이 생분해성인 것이다. 예를 들어, 본 발명의 단일 가닥 헤어핀 siNA 분자는 siNA 분자의 루프 부분의 생체내에서의 분해를 통해 3' 말단 오버행, 예컨대, 1, 2, 3 또는 4개의 뉴클레오티드를 포함하는 3' 말단 뉴클레오티드 오버행을 가진 이중 가닥 siNA 분자가 생성될 수 있도록 디자인된다. 또한 별법으로, 본 발명의 환형 siNA 분자는 siNA 분자의 루프 부분의 생체내에서의 분해를 통해 3' 말단 오버행, 예컨대, 약 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 3' 말단 뉴클레오티드 오버행을 가진 이중 가닥 siNA 분자가 생성될 수 있도록 디자인된다.
본 발명의 대칭 siNA 분자에서, 각 가닥인, 센스 (패신저) 가닥 및 안티센스 (가이드) 가닥의 길이는 독립적으로 약 15개 내지 약 30개 (예컨대, 약 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 또는 30개)의 뉴클레오티드 길이이다. 일반적으로, 본 발명의 대칭 siNA 분자의 각 가닥의 길이는 약 19-24개 (예컨대, 약 19개, 20개, 21개, 22개, 23개 또는 24개)의 뉴클레오티드 길이이다.
비대칭 siNA 분자에서, 상기 분자의 안티센스 영역 또는 가닥의 길이는 약 15개 내지 약 30개 (예컨대, 약 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 또는 30개)의 뉴클레오티드 길이이며, 여기서, 센스 영역의 길이는 약 3개 내지 약 25개 (예컨대, 약 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 또는 25개)의 뉴클레오티드 길이이다. 일반적으로, 본 발명의 비대칭 siNA 분자의 각 가닥의 길이는 약 19-24개 (예컨대, 약 19개, 20개, 21개, 22개, 23개 또는 24개)의 뉴클레오티드 길이이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 단일 가닥 헤어핀 siNA 분자를 포함하며, 여기서, siNA 분자의 길이는 약 25개 내지 약 70개 (예컨대, 약 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 또는 70개)의 뉴클레오티드 길이이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 단일 가닥 환형 siNA 분자를 포함하며, 여기서, siNA 분자의 길이는 약 38개 내지 약 70개 (예컨대, 약 38개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 또는 70개)의 뉴클레오티드 길이이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 단일 가닥 비-환형 siNA 분자를 포함하며, 여기서, siNA 분자의 길이는 독립적으로 약 15개 내지 약 30개 (예컨대, 약 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21 개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 또는 30개)의 뉴클레오티드 길이이다.
다양한 대칭 실시양태에서, 본 발명의 siNA 이중체는 독립적으로 약 15개 내지 약 30개 (예컨대, 약 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21 개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 또는 30개)의 염기쌍을 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 siNA의 이중체 구조의 길이는 15개 내지 30개 사이, 더욱 일반적으로 18개 내지 25개 사이, 추가로 더욱 일반적으로 19개 내지 24개 사이, 및 가장 일반적으로 19개 내지 21개 사이의 염기쌍 길이이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 이중체 siNA 분자가 비대칭일 경우, siNA 분자는 약 3개 내지 25개 (예컨대, 약 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21 개, 22개, 23개, 24개, 또는 25개)의 염기쌍을 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 siNA의 이중체 구조의 길이는 15개 내지 25개 사이, 더욱 일반적으로 18개 내지 25, 추가로 더욱 일반적으로 19개 내지 24개 사이, 및 가장 일반적으로 19개 내지 21개 사이의 염기쌍 길이이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자가 헤어핀 또는 환형 구조일 경우, siNA 분자는 약 15개 내지 약 30개 (예컨대, 약 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 또는 30개)의 염기쌍을 포함한다.
본 발명의 siNA 분자의 센스 가닥과 안티센스 가닥, 또는 센스 영역과 안티센스 영역은 상보적일 수 있다. 또한, 안티센스 가닥 또는 안티센스 영역은 HBV 표적 RNA의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 일부에 상보적일 수 있다. siNA의 센스 가닥 또는 센스 영역은 HBV 유전자의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 일부를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자의 센스 영역 또는 센스 가닥은 예를 들어, 제한하는 것은 아니지만, 표 7에 제시된 진뱅크 등록 번호로 나타낸 서열과 같은 HBV 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 상보적인 siNA 분자의 안티센스 영역 또는 안티센스 가닥의 일부에 상보적이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 siNA 분자의 센스 가닥 또는 센스 영역과 안티센스 가닥 또는 안티센스 영역 사이에 완전한 상보성을 가진다. 다른 또는 동일한 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자의 안티센스 가닥은 상응하는 표적 핵산 분자에 완벽하게 상보적이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 siNA 분자의 센스 가닥 또는 센스 영역과 안티센스 가닥 또는 안티센스 영역 사이에, 또는 siNA 분자의 안티센스 가닥 또는 안티센스 영역과 상응하는 표적 핵산 분자 사이에 부분적인 상보성 (즉, 100% 미만의 상보성)을 가진다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중 가닥 핵산 분자는 나머지 다른 한 가닥의 뉴클레오티드에 상보적인, 약 15개 내지 약 30개 사이 (예컨대, 약 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 또는 30개)의 뉴클레오티드로 된 한 가닥을 가진다. 다른 실시양태에서, 분자는 이중 가닥 핵산 분자의 안티센스 영역의 뉴클레오티드에 상보적인, 약 15개 내지 약 30개 사이 (예컨대, 약 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 또는 30개)의 뉴클레오티드로 된 센스 영역을 가진다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 이중 가닥 핵산 분자는 안티센스 가닥의 상응하는 표적 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 약 15개 내지 약 30개 사이 (예컨대, 약 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 또는 30개)의 뉴클레오티드로 된 안티센스 가닥을 가진다.
다른 실시양태에서, siNA 분자는 하나 이상의 뉴클레오티드 결실, 치환, 미스매치 및/또는 부가를 포함할 수 있지만; 단, 상기 siNA 분자는 그의 활성, 예를 들어, RNAi를 매개하는 활성을 유지한다. 비제한적인 일례로, 결실, 치환, 미스매치 및/또는 부가를 통해 루프 또는 벌지, 또는 별법으로, 워블 또는 다른 대체 (비-왓슨-크릭) 염기쌍이 형성될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 예를 들어, 본 발명의 이중 가닥 핵산 분자는 나머지 다른 한 가닥 또는 영역과는 미스매치되거나, 또는 염기쌍을 형성하지 못하는, 1개 이상 (예컨대, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개)의 뉴클레오티드로 된 한 가닥 또는 영역을 가진다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 이중 가닥 핵산 분자는 다른 한 가닥 또는 영역과는 미스매치되거나, 또는 염기쌍을 형성하지 못하는, 1개 이상 (예컨대, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개)의 뉴클레오티드로 된 가닥 또는 영역을 가진다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 siNA는 3개 이하의 미스매치를 함유한다. siNA의 안티센스 가닥이 표적 서열에 대하여 미스매치를 함유할 경우, 미스매치 부위는 상보성 영역 중앙부에 위치하지 않는 것이 바람직할 수 있다.
다른 실시양태에서, siNA 분자는 표 1b의 서열에 대하여 하나 이상의 뉴클레오티드 결실, 치환, 미스매치 및/또는 부가를 포함할 수 있지만, 단, 상기 siNA 분자는 그의 활성, 예를 들어, RNAi를 매개하는 활성을 유지한다. 비제한적인 일례로, 결실, 치환, 미스매치 및/또는 부가를 통해 루프 또는 벌지, 또는 별법으로, 워블 또는 다른 대체 (비-왓슨-크릭) 염기쌍이 형성될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 기술된 것과는 다른, 제1 가닥 및 제2 가닥이 서로 상보적이고, 여기서, 1 이상의 가닥은 고도의 엄격한 조건하에서 표 1b의 서열의 폴리뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있고, 여기서, 뉴클레오티드 중 임의의 것은 변형되지 않은 것이거나, 또는 화학적으로 변형된 것인, 이중 가닥 핵산 (siNA) 분자를 포함한다.
혼성화 기법은 당업자에게 주지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)] 참조). 바람직한 엄격한 혼성화 조건은 50% 포름아미드, 5xSSC (150 mM NaCl, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5x 덴하르트(Denhardt's) 용액, 10% 덱스트란 술페이트, 및 20 ㎍/ml 전단된 변성 연어 정자 DNA를 포함하는 용액 중 42℃에서 밤새도록 인큐베이션한 후; 약 65℃에서 0.1 x SSC 중에서 필터를 세척하는 것을 포함한다.
한 구체적 실시양태에서, 제1 가닥은 다른 나머지 한 가닥의 뉴클레오티드에 상보적인 약 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 21개의 뉴클레오티드를 가지고, 1 이상의 가닥은 표 1b의 폴리뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 제1 가닥은 다른 나머지 한 가닥의 뉴클레오티드에 상보적인 약 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 21개의 뉴클레오티드를 가지고, 1 이상의 가닥은 고도의 엄격한 조건하에 서열 1, 서열 1210, 서열 2, 서열 1211, 서열 3, 서열 1212, 서열 4, 또는 서열 1213에 혼성화할 수 있으며, 여기서, 뉴클레오티드 중 임의의 것은 변형되지 않은 것이거나, 또는 화학적으로 변형된 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 약 1개 내지 약 4개 (예컨대, 약 1개, 2개, 3개 또는 4개)의 뉴클레오티드로 이루어진 오버행을 포함한다. 오버행 중의 뉴클레오티드는 동일하거나 상이한 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 오버행은 이중 가닥 핵산 분자의 한 가닥 또는 양 가닥 모두의 3' 말단에 존재한다. 예를 들어, 본 발명의 이중-가닥 핵산 분자는 안티센스 가닥/영역의 3' 말단에, 센스 가닥/영역의 3' 말단에, 또는 이중 가닥 핵산 분자의 안티센스 가닥/영역 및 센스 가닥/영역, 둘 모두의 3' 말단에 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 오버행을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자의 오버행 부분을 포함하는 뉴클레오티드는, 본 발명의 siNA 분자의 안티센스 가닥/영역의 오버행 부분을 포함하는 뉴클레오티드가 HBV 표적 폴리뉴클레오티드 서열 중의 뉴클레오티드에 상보적일 수 있고/거나, 본 발명의 siNA 분자의 센스 가닥/영역의 오버행 부분을 포함하는 뉴클레오티드가 HBV 표적 폴리뉴클레오티드 서열 중의 뉴클레오티드에 상보적일 수 있는 것인, HBV 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 기초한 서열을 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 오버행은 HBV 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 일부에 상보적인 2개의 뉴클레오티드 오버행을 포함한다. 다른 실시양태에서, 그러나, 오버행은 HBV 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 일부에 상보적이지 않은 2개의 뉴클레오티드 오버행을 포함한다. 특정 실시양태에서, 오버행은 HBV 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 일부에 상보적이지 않은 3'-UU 오버행을 포함한다. 다른 실시양태에서, 오버행은 안티센스 가닥의 3' 말단에 UU 오버행을, 및 센스 가닥의 3' 말단에 TT 오버행을 포함한다. 다른 실시양태에서, 오버행은 본원의 실시예, 표, 및 도면에 기술된 뉴클레오티드를 포함한다.
3' 말단 뉴클레오티드 오버행을 가지는, 본원에 기술된 siNA 분자에 관한 실시양태 중 임의의 것에서, 오버행은 임의로 하나 이상의 핵산 당, 염기, 또는 백본 위치에서 화학적으로 변형된다. 본 발명의 이중 가닥 핵산 (siNA) 분자의 오버행 부분 중의 변형된 뉴클레오티드에 관한, 대표적이지만, 비제한적인 예로는 2'-O-알킬 (예컨대, 2'-O-메틸), 2'-데옥시, 2'-데옥시-2'-플루오로, 2'-데옥시-2'-플루오로아라비노 (FANA), 4'-티오, 2'-O-트리플루오로 메틸, 2'-O-에틸-트리플루오로메톡시, 2'-O-디플루오로메톡시-에톡시, 유니버설 염기, 비-시클릭, 또는 5-C-메틸 뉴클레오티드를 포함한다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 오버행 뉴클레오티드는 각각 독립적으로, 2'-O-알킬 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 뉴클레오티드, 2'-데옥시-2-플루오로 뉴클레오티드, 또는 2'-데옥시 리보뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 오버행 뉴클레오티드는 하나 이상의 포스포로티오에이트 연결부에 의해 연결된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 평활 말단을 가진 (즉, 뉴클레오티드 오버행이 없는) 이중체 핵산 분자를 포함하는데, 여기서, 양 말단 모두 평활 말단이거나, 또는 별법으로, 말단 중 하나가 평활 말단이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 한 평활 말단을 포함하는데, 예를 들어, 여기서, 안티센스 가닥의 5' 말단, 및 센스 가닥의 3' 말단은 어떤 오버행잉형 뉴클레오티드도 가지지 않는다. 또 다른 일례로, siNA 분자는 한 평활 말단을 포함하는데, 예를 들어, 여기서, 안티센스 가닥의 3' 말단, 및 센스 가닥의 5' 말단은 어떤 오버행잉형 뉴클레오티드도 가지지 않는다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 2개의 평활 말단을 포함하는데, 예를 들어, 여기서, 안티센스 가닥의 3' 말단, 및 센스 가닥의 5' 말단 뿐만 아니라, 안티센스 가닥의 5' 말단, 및 센스 가닥의 3' 말단은 어떤 오버행잉형 뉴클레오티드도 가지지 않는다.
본 발명의 siNA 분자의 실시양태 또는 측면 중 임의의 것에서, 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥은 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 3' 말단, 5' 말단, 또는 3' 및 5' 말단 둘 모두에 캡, 예컨대, 본원에 기술되어 있거나, 당업계에 공지되어 있는 것과 같은 캡을 추가로 가질 수 있다. 또는, 헤어핀 siNA 분자의 경우, 캡은 폴리뉴클레오티드의 말단 뉴클레오티드 한쪽에 또는 양쪽 모두에 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 캡은 이중 가닥 siNA 분자의 센스 가닥의 말단 한쪽에 또는 양쪽 모두에 존재한다. 다른 실시양태에서, 캡은 안티센스 (가이드) 가닥의 3' 말단에 존재한다. 바람직한 실시양태에서, 캡은 센스 가닥의 3' 말단에, 및 센스 가닥의 5' 말단에 존재한다.
상기 말단 캡에 관한, 대표적이지만, 비제한적인 예로는 역전된 무염기성 뉴클레오티드, 역전된 데옥시 무염기성 뉴클레오티드, 역전된 뉴클레오티드 모이어티, 도 5에 제시되어 있는 기, 글리세릴 변형, 알킬 또는 시클로알킬 기, 헤테로사이클, 또는 당업계에 일반적으로 공지되어 있는 것과 같은 임의의 다른 캡을 포함한다.
본 발명의 siNA 분자의 실시양태 중 임의의 것은 5' 포스페이트 말단을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, siNA 분자에는 말단 포스페이트가 존재하지 않는다.
본 발명의 임의의 siNA 분자 또는 구축물은 하나 이상의 화학적 변형을 포함할 수 있다. 변형을 사용하여 시험관내 또는 생체내 특징들, 예컨대, 안정성, 활성, 독성, 면역 반응 (예컨대, 인터페론 반응, 염증성 또는 염증유발 시토카인 반응, 또는 톨(Toll) 유사 수용체 (TlF) 반응의 자극을 방지하는 것), 및/또는 생체이용률을 개선시킬 수 있다.
본 출원인들은 화학적으로 변형된 siNA 분자가 상응하는 변형되지 않은 siNA 분자에 비하여 개선된 RNAi 활성 및/또는 안정성을 가지고 있다고 본원에 기술하였다. 본원에 개시된 다양한 화학적으로 변형된 siNA 모티프는, 치료학적 적용에서 사용하는 데 적합한 뉴클레아제 내성 및 약동학적 특성을 제공함과 동시에, 변형되지 않았거나, 또는 최소로 변형된 활성 siRNA와 실질적으로 유사한 RNAi 활성을 유지할 수 있는 능력을 제공한다 (예를 들어, 문헌 [Elbashir et al., 2001, EMBO J., 20:6877-6888]).
다양한 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 센스 및/또는 안티센스 가닥 중에 존재하는 임의의 (예컨대, 하나 이상의 또는 모든) 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드인 (예컨대, 하나의 뉴클레오티드가 변형된 것인, 일부의 뉴클레오티드 (예컨대, 복수개의 또는 1 초과의 뉴클레오티드)가 변형된 것인, 또는 모든 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드인) 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 화학적 변형을 통해 부분적으로 변형된 것이다 (예컨대, 약 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 55개, 또는 59개의 뉴클레오티드가 변형된 것이다). 일부 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 변형된 뉴클레오티드인, 약 8개, 10개, 12개, 14개, 16개, 18개, 20개, 22개, 24개, 26개, 28개, 30개, 32개, 34개, 36개, 38개, 40개, 42개, 44개, 46개, 48개, 50개, 52개, 54개, 56개, 58개 또는 60개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 화학적 변형을 통해 완전하게 변형된 (예컨대, 예컨대, 100% 변형된) 것이며, 즉, siNA 분자는 임의의 리보뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자의 센스 가닥 중 하나 이상의 뉴클레오티드는 변형된 것이다. 같은 또는 다른 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자의 안티센스 가닥 중 하나 이상의 뉴클레오티드는 변형된 것이다.
단일 siNA 분자 내의 화학적 변형은 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1 이상의 가닥은 1 이상의 화학적 변형을 가진다. 다른 실시양태에서, 각 가닥은 동일하거나 상이할 수 있는, 1 이상의 화학적 변형, 예컨대, 당, 염기, 또는 백본 (즉, 뉴클레오티드간 연결부) 변형을 가진다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 적어도 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 상이한 화학적 변형을 포함한다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 화학적 변형의 비-제한적인 일례는 미국 특허 출원 번호 10/444,853; 10/981,966; 12/064,014 및 상기 문헌에서 인용된 참고 문헌에 개시되어 있고, 당, 염기, 및 포스페이트, 비-뉴클레오티드 변형 및/또는 그의 임의의 조합을 포함한다.
본 발명의 특정의 구체적 실시양태에서, 1 이상의 변형된 뉴클레오티드로는 일반적으로 당업계에 알려져 있는 것과 같이, 2'-데옥시-2-플루오로 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 (예컨대, 2'-O-메틸) 뉴클레오티드, 또는 잠금 핵산 (LNA) 뉴클레오티드가 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 1 이상의 뉴클레오티드는 리보 유사, 노던(Northern) 또는 헬릭스형 구조 (예컨대, 문헌 [Saenger, Principles of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag ed., 1984] 참조)를 가진다. 노던 구조를 가지는 뉴클레오티드에 관한 비-제한적인 예로는 잠금 핵산 (LNA) 뉴클레오티드 (예컨대, 2'-O, 4'-C-메틸렌-(D-리보푸라노실) 뉴클레오티드); 2'-메톡시에톡시 (MOE) 뉴클레오티드; 2'-메틸-티오-에틸 뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드; 2'-데옥시-2'-클로로 뉴클레오티드; 2'-아지도 뉴클레오티드; 2'-O-트리플루오로메틸 뉴클레오티드; 2'-O-에틸-트리플루오로메톡시 뉴클레오티드; 2'-O-디플루오로메톡시-에톡시 뉴클레오티드; 4'-티오 뉴클레오티드 및 2'-O-메틸 뉴클레오티드를 포함한다.
다양한 실시양태에서, 이중 가닥 siNA 분자에 존재하는 피리미딘 뉴클레오티드 대다수 (예컨대, 50% 초과)는 당 변형을 포함한다. 일부의 같은 및/또는 다른 실시양태에서, 이중 가닥 siNA 분자에 존재하는 퓨린 뉴클레오티드 대다수 (예컨대, 50% 초과)는 당 변형을 포함한다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥 중의 피리미딘 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 또는 2'-데옥시-2'-플루오로 피리미딘 뉴클레오티드이고, 안티센스 가닥 중에 존재하는 퓨린 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 뉴클레오티드 또는 2'-데옥시 뉴클레오티드이다. 다른 실시양태에서, 센스 가닥 중의 피리미딘 뉴클레오티드는 2'-데옥시-2'-플루오로 피리미딘 뉴클레오티드이고, 센스 가닥 중의 퓨린 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 또는 2'-데옥시 퓨린 뉴클레오티드이다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 센스 가닥 상의 상보적 영역 중에 있는 모든 피리미딘 뉴클레오티드는 2'-데옥시-2'-플루오로 피리미딘 뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥의 상보적 영역 중에 있는 피리미딘 뉴클레오티드 모두 2'-데옥시-2'-플루오로 피리미딘 뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥 상의 상보적 영역 중에 있는 모든 퓨린 뉴클레오티드는 2'-데옥시 퓨린 뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥 상의 상보적 영역 중에 있는 퓨린 모두 2'-O-메틸 퓨린 뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥 상의 상보적 영역 중에 있는 모든 피리미딘 뉴클레오티드는 2'-데옥시-2'-플루오로 피리미딘 뉴클레오티드이고; 안티센스 가닥 상의 상보적 영역 중에 있는 모든 피리미딘 뉴클레오티드는 2'-데옥시-2'-플루오로 피리미딘 뉴클레오티드이고; 센스 가닥 상의 상보적 영역 중에 있는 모든 퓨린 뉴클레오티드는 2'-데옥시 퓨린 뉴클레오티드이고, 안티센스 가닥 상의 상보적 영역 중에 있는 모든 퓨린은 2'-O-메틸 퓨린 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 한 가닥 또는 양 가닥 모두에서 피리미딘 뉴클레오티드 중 적어도 5개 이상이 2'-데옥시-2'-플루오로 피리미딘 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 한 가닥 또는 양 가닥 모두에서 피리미딘 뉴클레오티드 중 적어도 5개 이상이 2'-O-메틸 피리미딘 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 한 가닥 또는 양 가닥 모두에서 퓨린 뉴클레오티드 중 적어도 5개 이상이 2'-데옥시-2'-플루오로 퓨린 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 한 가닥 또는 양 가닥 모두에서 퓨린 뉴클레오티드 중 적어도 5개 이상이 2'-O-메틸 퓨린 뉴클레오티드이다.
특정 실시양태에서, 퓨린 및 피리미딘은 2'-당 위치에서 차별적으로 변형된다 (즉, 1 이상의 퓨린은 동일하거나 상이한 가닥의 2'-당 위치에서 1 이상의 피리미딘과 상이한 변형을 가지고 있다). 예를 들어, 일부 경우에, 한 가닥 또는 양 가닥 모두에서 피리미딘 뉴클레오티드 중 적어도 5개 이상이 2'-데옥시-2'-플루오로 피리미딘 뉴클레오티드이고, 한 가닥 또는 양 가닥 모두에서 퓨린 뉴클레오티드 중 적어도 5개 이상이 2'-O-메틸 퓨린 뉴클레오티드이다. 다른 경우에, 한 가닥 또는 양 가닥 모두에서 피리미딘 뉴클레오티드 중 적어도 5개 이상이 2'-O-메틸 피리미딘 뉴클레오티드이고, 한 가닥 또는 양 가닥 모두에서 퓨린 뉴클레오티드 중 적어도 5개 이상이 2'-데옥시-2'-플루오로 퓨린 뉴클레오티드이다.
다양한 변형 및 변형 패턴을 가지는 상기 siNA 분자의 센스 및 안티센스 가닥에 관한 추가의 비-제한적인 일례는 도 2 및 3에 제시되어 있다.
인용된 참고 문헌에서의 것을 비롯한, 상기 기술된 변형 중 임의의 것, 또는 그의 조합이 본 발명의 siNA 분자 중 임의의 것에 적용될 수 있다.
본 발명의 변형된 siNA 분자는 siNA 분자 내의 다양한 위치에 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중 가닥 siNA 분자는 siNA 이중체 내에 내부 염기쌍을 형성하는 위치에서 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 이중 가닥 siNA 분자는 siNA 분자의 비-염기쌍 형성 또는 오버행 영역에서 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 이중 가닥 siNA 분자는 siNA 분자의 말단 위치에 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 상기 말단 영역은 siNA 분자의 센스 및/또는 안티센스 가닥 또는 영역의 3'-위치 및/또는 5'-위치를 포함한다. 추가로, 본 발명의 변형된 siNA 분자 중 임의의 것은 siNA 이중체의 하나 또는 두 올리고뉴클레오티드 가닥 모두에, 예를 들어, 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 양 가닥 모두에 변형을 가질 수 있다. 또한, 본 발명의 siNA 분자의 화학적 변형과 관련하여, 본 발명의 이중 가닥 siNA 분자의 각 가닥은 하나 이상의 화학적 변형을 가질 수 있고, 이로써, 각 가닥은 상이한 패턴의 화학적 변형을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 이중 가닥 siNA 분자의 각 가닥은 상이한 패턴의 화학적 변형, 예컨대, 본원에 기술된 임의의 Stab 변형 화학 (표 8 참조) 또는 그의 임의의 조합, 즉, 정의된 안정화 화학 (Stab) 센스 및 안티센스 가닥의 상이한 조합을 포함한다. 추가로, 상이한 패턴의 변형을 일으킬 수 있는 변형 반응식에 관한 비-제한적인 일례는 표 8에 제시되어 있다. 표 8에서 Stab로 언급되는 안정화 화학은 센스/안티센스 화학의 임의 조합으로, 예컨대, Stab 7/8, Stab 7/11, Stab 8/8, Stab 18/8, Stab 18/11, Stab 12/13, Stab 7/13, Stab 18/13, Stab 7/19, Stab 8/19, Stab 18/19, Stab 7/20, Stab 8/20, Stab 18/20, Stab 7/32, Stab 8/32, 또는 Stab 18/32 또는 안정화 화학의 임의의 다른 조합으로 조합될 수 있다.
본 발명의 siNA 중 임의의 것에서, siNA 분자의 가이드 가닥 또는 가이드 영역 (이는 또한 안티센스 가닥 또는 안티센스 영역으로도 공지되어 있다)의 5' 말단에 있는 하나 이상의 (예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개의) 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 HBV의 발현을 조절하는 이중 가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자이며, 여기서, siNA가 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고; 각 가닥의 길이는 독립적으로 15개 내지 30개의 뉴클레오티드 길이이고; 안티센스 가닥은
Figure pct00006
중 임의의 것과 상보적인 서열을 가지는 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 것인, siNA 분자를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자의 안티센스 가닥은
Figure pct00007
의 15개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자의 센스 가닥은
Figure pct00008
의 15개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는
Figure pct00009
중 임의의 것을 포함한다.
인용된 참고 문헌에서의 것을 비롯한, 상기 기술된 변형 중 임의의 것, 또는 그의 조합이 상기 실시양태 중 임의의 것에 적용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 서열 1, 서열 452, 서열 2, 서열 453, 서열 3, 서열 454, 서열 4, 또는 서열 455의 15개 이상의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 뉴클레오티드는 연속 뉴클레오티드 스트레치를 형성한다.
일부 실시양태에서, siNA 분자는 서열 1, 서열 452, 서열 2, 서열 453, 서열 3, 서열 454, 서열 4, 또는 서열 455의 15개 이상의 뉴클레오티드 서열에 대하여 하나 이상의 뉴클레오티드 결실, 치환, 미스매치 및/또는 부가를 포함할 수 있지만, 단, 상기 siNA 분자는 그의 활성, 예를 들어, RNAi를 매개하는 활성을 유지한다. 비제한적인 일례로, 결실, 치환, 미스매치 및/또는 부가를 통해 루프 또는 벌지, 또는 별법으로, 워블 또는 다른 대체 (비-왓슨-크릭) 염기쌍이 형성될 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 가지며, 하기 식 (A)를 포함하는 이중 가닥 siNA 분자를 제공한다:
Figure pct00010
상기 식에서, 상부 가닥은 이중 가닥 핵산 분자의 센스 가닥이고, 하부 가닥은 이중 가닥 핵산 분자의 안티센스 가닥이며; 여기서, 상기 안티센스 가닥은 서열 452, 서열 453, 서열 454, 또는 서열 455의 15개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 센스 가닥은 안티센스 가닥에 상보적인 서열을 포함하고;
각각의 N은 독립적으로 변형되지 않았거나, 또는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드, 또는 비-뉴클레오티드이고;
각각의 B는 존재하거나 존재하지 않는 말단 캡이고;
(N)은 오버행잉형 뉴클레오티드를 나타내고, 이들 각각은 독립적으로 변형되지 않은 것이거나, 또는 화학적으로 변형된 것이고;
[N]은 리보뉴클레오티드인 뉴클레오티드를 나타내고;
X1 및 X2는 독립적으로 정수 0 내지 4이고;
X3은 정수 15 내지 30이고;
X4는 정수 9 내지 30이고;
X5는 정수 0 내지 6이되, 단, X4와 X5의 합은 15-30이다.
특정 실시양태에서, 서열 452, 서열 453, 서열 454, 또는 서열 455의 15개 이상의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 뉴클레오티드가 연속 뉴클레오티드 스트레치를 형성한다.
일부 실시양태에서, 식 (A)의 siNA 분자는 서열 452, 서열 453, 서열 454, 또는 서열 455의 15개 이상의 뉴클레오티드 서열에 대하여 하나 이상의 뉴클레오티드 결실, 치환, 미스매치 및/또는 부가를 포함할 수 있지만, 단, 상기 siNA 분자는 그의 활성, 예를 들어, RNAi를 매개하는 활성을 유지한다. 비제한적인 일례로, 결실, 치환, 미스매치 및/또는 부가를 통해 루프 또는 벌지, 또는 별법으로, 워블 또는 다른 대체 (비-왓슨-크릭) 염기쌍이 형성될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) NX4 위치의 하나 이상의 피리미딘 뉴클레오티드가 독립적으로 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 또는 그의 임의의 조합이고;
(b) NX4 위치의 하나 이상의 퓨린 뉴클레오티드가 독립적으로 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 또는 그의 임의의 조합이고;
(c) NX3 위치의 하나 이상의 피리미딘 뉴클레오티드가 독립적으로 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 또는 그의 임의의 조합이고;
(d) NX3 위치의 하나 이상의 퓨린 뉴클레오티드가 독립적으로 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 또는 그의 임의의 조합인 것인, 식 (A)의 이중 가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA)을 특징으로 한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은
(a) NX4 위치의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 피리미딘 뉴클레오티드가 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드이고;
(b) NX4 위치의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 퓨린 뉴클레오티드가 2'-O-알킬 뉴클레오티드이고;
(c) NX3 위치의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 피리미딘 뉴클레오티드가 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드이고;
(d) NX3 위치의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 퓨린 뉴클레오티드가 2'-데옥시 뉴클레오티드인 것인, 식 (A)의 이중 가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자를 특징으로 한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은
(a) NX4 위치의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 피리미딘 뉴클레오티드가 2'-O-알킬 뉴클레오티드이고;
(b) NX4 위치의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 퓨린 뉴클레오티드가 리보뉴클레오티드이고;
(c) NX3 위치의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 피리미딘 뉴클레오티드가 2'-O-알킬 뉴클레오티드이고;
(d) NX3 위치의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 퓨린 뉴클레오티드가 리보뉴클레오티드인 것인, 식 (A)의 이중 가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자를 특징으로 한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은
(a) NX4 위치의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 피리미딘 뉴클레오티드가 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드이고;
(b) NX4 위치의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 퓨린 뉴클레오티드가 2'-O-알킬 뉴클레오티드이고;
(c) NX3 위치의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 피리미딘 뉴클레오티드가 2'-O-알킬 뉴클레오티드이고;
(d) NX3 위치의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 퓨린 뉴클레오티드가 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드인 것인, 식 (A)의 이중 가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자를 특징으로 한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결부를 추가로 포함하는, 식 (A)의 이중 가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자를 특징으로 한다.
일부 실시양태에서, 식 (A)를 가지는 siNA 분자는 핵산 분자의 안티센스 가닥 또는 안티센스 영역의 5' 말단에 말단 포스페이트 기를 포함한다.
다양한 실시양태에서, 식 (A)를 가지는 siNA 분자는 X5 = 0, 1, 2, 또는 3; 각각의 X1 및 X2 = 1 또는 2; X3 = 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23, 및 X4 = 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23인 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 식 (A)를 가지는 siNA 분자는 X5 = 3인 것을 포함한다. 다른 실시양태에서 식 (A)를 가지는 siNA 분자는 X5 = 0인 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 식 (A)를 가지는 siNA 분자는 X1 = 2 및 X2 = 2인 것을 포함한다.
다양한 실시양태에서, 식 (A)를 가지는 siNA 분자는 X5 = 0, X1 = 2, 및 X2 = 2인 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 식 (A)를 가지는 siNA 분자는 X5 = 3, X1 = 2, 및 X2 = 2인 것을 포함한다.
한 구체적 실시양태에서, 식 (A)를 가지는 siNA 분자는 X5 = 3; 각각의 X1 및 X2 = 2; X3 = 19, 및 X4 = 16인 것을 포함한다.
다른 구체적인 실시양태에서, 식 (A)를 가지는 siNA 분자는 X5 = 0; 각각의 X1 및 X2 = 2; X3 = 19, 및 X4 = 19인 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 식 (A)를 가지는 siNA 분자는 센스 가닥 또는 센스 영역의 3' 및 5' 말단에 캡 (B)을 포함한다.
특정 실시양태에서, 식 (A)를 가지는 siNA 분자는 안티센스 가닥 또는 안티센스 영역의 3' 말단에 캡 (B)을 포함한다.
다양한 실시양태에서, 식 (A)를 가지는 siNA 분자는 센스 가닥 또는 센스 영역의 3' 및 5' 말단에 캡 (B)을 포함하고, 안티센스 가닥 또는 안티센스 영역의 3' 말단에 캡 (B)을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 식 (A)를 가지는 siNA 분자는 오직 이중 가닥 핵산 분자의 센스 (상부) 가닥의 5' 말단에만 캡 (B)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 식 (A)를 가지는 siNA 분자는 뉴클레오티드 사이에 하나 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결부를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 식 (A)를 가지는 siNA 분자는 제1 말단 (N)과, 핵산 분자의 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 센스 가닥 및 안티센스 가닥, 둘 모두의 3' 말단 상에 인접한 뉴클레오티드 사이에 하나 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결부를 포함한다. 예를 들어, 이중 가닥 핵산 분자는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 가지는 오버행잉형 뉴클레오티드 위치를 갖는 X1 및/또는 X2 = 2, 예컨대, (NsN) (여기서, "s"는 포스포로티오에이트를 나타낸다)을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 식 (A)를 가지는 siNA 분자의 하나 이상의 뉴클레오티드는 유니버설 염기를 가진다.
특정 실시양태에서, 식 (A)를 가지는 siNA 분자는 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 14번 위치의 뉴클레오티드가 퓨린일 때, 상기 14번 위치에 리보뉴클레오티드를 가진다. 다른 실시양태에서, 식 (A)를 가지는 siNA 분자는 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 14번 위치의 뉴클레오티드가 피리미딘 뉴클레오티드일 때, 상기 14번 위치에 리보뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드 또는 2'-O-메틸 뉴클레오티드를 가진다.
일부 실시양태에서, 식 (A)를 가지는 siNA 분자는 안티센스 가닥 (하부 가닥) 중, HBV 표적 폴리뉴클레오티드 서열 중의 뉴클레오티드에 상보적이며, 안티센스 (하부) 가닥의 N 및 [N] 뉴클레오티드에도 또한 상보적인 (N) 뉴클레오티드를 포함한다.
인용된 참고 문헌에서의 것을 비롯한, 본 발명의 siNA에 적용될 수 있는 것으로서 상기에서 논의된, 상기 기술된 변형 중 임의의 것, 또는 그의 조합이 식 (A)를 가지는 siNA 분자에 대한 실시양태 중 임의의 것에 적용될 수 있다.
C. siNA 분자의 생성/합성
본 발명의 siNA는 당업자에게 공지되는 다수의 기법을 사용함으로써 수득될 수 있다. 예를 들어, siNA는 화학적으로 합성될 수 있거나, 또는 (예컨대, 헤어핀 루프를 가진 이중체로 자동적으로 폴딩되는 서열로서 전사되는) 플라스미드에 의해 코딩될 수 있다. siNA는 또한 보다 장쇄인 dsRNA (예컨대, 길이가 약 25개 초과의 뉴클레오티드 길이인 dsRNA)의 이. 콜라이(E. coli) RNase II 또는 다이서(Dicer)에 의한 절단에 의해서도 생성될 수 있다. 상기 효소는 dsRNA를 생물학적으로 활성인 siNA로 프로세싱한다 (예컨대, 문헌 [Yang et al., PNAS USA 99:9942-9947 (2002)]; [Calegari et al. PNAS USA 99: 14236 (2002)]; [Byron et al. Ambion Tech Notes; 10 (1):4-6 (2009)]; [Kawaski et al., Nucleic Acids Res., 31 :981-987 (2003)], [Knight and Bass, Science, 293:2269-2271 (2001)] 및 [Roberston et al., J. Biol . Chem 243:82(1969)] 참조).
1. 화학적 합성
바람직하게, 본 발명의 siNA는 화학적으로 합성된 것이다. 올리고뉴클레오티드 (예컨대, 특정의 변형된 올리고뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드가 없는 올리고뉴클레오티드의 일부)는 당업계에 공지된 프로토콜, 예를 들어, 문헌 [Caruthers et al ., 1992, Methods in Enzymology 211, 3-19] PCT 국제 공보 번호 WO 99/54459 (Thompson et al .), [Wincott et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684], [Wincott et al., 1997, Methods Mol . Bio ., 74, 59], [Brennan et al., 1998, Biotechnol Bioeng ., 61, 33-45], 및 미국 특허 번호 6,001,311 (Brennan)에 기술되어 있는 것을 사용함으로써 합성된다. 올리고뉴클레오티드 합성은 일반 핵산 보호기 및 커플링기, 예컨대, 5' 말단의 디메톡시트리틸, 및 3' 말단의 포스포라미다이트를 이용한다.
변형되지 않은 siNA 분자는 문헌 [Usman et al., 1987, J Am . Chem . Soc , 109, 7845]; [Scaringe et al., 1990, Nucleic Acids Res., 18, 5433]에 기술되어 있는 것과 같은 방법을 사용하여 합성된다. 이러한 합성법은 일반 핵산 보호기 및 커플링기, 예컨대, 본 발명의 특정 siNA 분자를 위해 사용될 수 있는 5' 말단의 디메톡시트리틸, 및 3' 말단의 포스포라미다이트를 이용한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 미국 특허 번호 6,995,259, 6,686,463, 6,673,918, 6,649,751, 6,989,442, 및 미국 특허 출원 번호 10/190,359에 기술된 방법에 따라 합성, 탈보호화 및 분석된다.
비제한적인 합성 예에서, 394 어플라이드 바이오시스템즈, 인크.(394 Applied Biosystems, Inc.)의 합성기에서 0.2 μmol 규모의 프로토콜을 사용하여, 2'-O-메틸화된 뉴클레오티드의 경우에는 2.5 min의 커플링 단계로, 및 2'-데옥시 뉴클레오티드 및 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드의 경우에는 45초의 커플링 단계로 소규모 합성을 수행한다. 표 9에는 합성 사이클에서 사용되는 시약의 양과 접촉 시간이 개략적으로 제시되어 있다.
별법으로, 본 발명의 siNA 분자는 개별적으로 합성하고, 합성 후에, 예를 들어, 결찰에 의해 (문헌 [Moore et al., 1992, Science 256, 9923]; PCT 국제 공개 번호 WO 93/23569 (Draper et al.); [Shabarova et al., 1991, Nucleic Acids Research 19, 4247]; [Bellon et al., 1997', Nucleosides & Nucleotides, 16, 951]; [Bellon et al., 1997, Bioconjugate Chem . 8, 204]), 또는 합성 및/또는 탈보호화 후의 혼성화에 의해 함께 연결시킬 수 있다.
본 발명의 다양한 siNA 분자는 또한 미국 특허 번호 5,889,136; 6,008,400; 및 6,111,086 (Scaringe et al.)의 교시를 사용하여 합성될 수 있다.
2. 발현 벡터
별법으로, 표적 HBV 분자를 코딩하는 유전자와 상호작용하고, 이를 하향조절하는 본 발명의 siNA 분자는 DNA 또는 RNA 벡터 내로 삽입된 전사 단위로부터 발현되고 전달될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Couture et al., 1996, TIG., 12, 510] 참조). 재조합 벡터는 DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터일 수 있다. siNA 발현 바이러스 벡터는 제한하는 것은 아니지만, 아데노-관련 바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 알파바이러스에 기초하여 구성될 수 있다.
일부 실시양태에서, pol III 기반 구축물은 본 발명의 핵산 분자를 발현시키는데 사용된다. siNA 분자 서열의 전사는 진핵성 RNA 폴리머라제 I (pol I), RNA 폴리머라제 II (pol II), 또는 RNA 폴리머라제 III (pol III)에 대한 프로모터로부터 유도될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,902,880 및 6,146,886 (Thompson) 참조). (또한, 문헌 [Izant and Weintraub, 1985, Science , 229, 345]; [McGarry and Lindquist, 1986, Proc . Natl . Acad . Set , USA 83, 399]; [Scanlon et al., 1991, Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 88, 10591-5]; [Kashani-Sabet et al., 1992, Antisense Res . Dev ., 2, 3-15]; [Dropulic et al., 1992, J Virol , 66, 1432-41]; [Weerasinghe et al., 1991, J Virol , 65, 5531-4]; [Ojwang et al., 1992, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89, 10802-6]; [Chen et al., 1992, Nucleic Acids Res ., 20, 4581-9]; [Sarver et al., 1990 Science, 247, 1222-1225]; [Thompson et al., 1995, Nucleic Acids Res ., 23, 2259]; [Good et al., 1997, Gene Therapy , 4, 45]도 참조). pol II 또는 pol III 프로모터로부터의 전사체는 모든 세포에서 고수준으로 발현되고; 주어진 세포 유형에서 주어진 pol II 프로모터의 수준은 그 주변에 존재하는 유전자 조절 서열 (인핸서, 사일렌서 등)의 성질에 따라 달라진다. 원핵성 RNA 폴리머라제 효소가 적절한 세포에서 발현되다면, 원핵성 RNA 폴리머라제 프로모터 또한 사용된다 (문헌 [Elroy-Stein and Moss, 1990, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 87, 6743-7]; [Gao and Huang 1993, Nucleic Acids Res ., 21, 2867-72]; [Lieber et al., 1993, Methods Enzymol , 217, 47-66]; [Zhou et al., 1990, Mol . Cell . Biol , 10, 4529-37]). 상기 프로모터로부터 발현된 핵산 분자는 포유동물 세포에서 작용을 할 수 있다는 것이 여러 연구원들을 통해 입증되었다 (예컨대, 문헌 [Kashani-Sabet et al., 1992, Antisense Res. Dev., 2, 3-15]; [Ojwang et al., 1992, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89, 10802-6]; [Chen et al., 1992, Nucleic Acids Res ., 20, 4581-9]; [Yu et al., 1993, Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 90, 6340-4]; [L'Huillier et al., 1992, EMBO J., 11, 4411-8]; [Lisziewicz et al., 1993, Proc . Natl . Acad . Sci . U. S. A, 90, 8000-4]; [Thompson et al., 1995, Nucleic Acids Res ., 23, 2259]; [Sullenger & Cech, 1993, Science , 262, 1566]). 더욱 구체적으로, 전사 단위, 예컨대, U6 소형 핵 (snRNA), 전달 RNA (tRNA) 및 아데노바이러스 VA RNA를 코딩하는 유전자로부터 유래된 전사 단위는 세포에서 원하는 RNA 분자, 예컨대, siNA를 고농도로 생성시키는 데에 유용하다 (문헌 [Thompson et al., 상기 문헌 동일]; [Couture and Stinchcomb, 1996, 상기 문헌 동일]; [Noonberg et al., 1994, Nucleic Acid Res ., 22, 2830]; 미국 특허 번호 5,624,803 (Noonberg et al.); [Good et al., 1997, Gene Ther ., 4, 45]; PCT 국제 공개 번호 WO 96/18736 (Beigelman et al.)). 상기 siNA 전사 단위는 제한하는 것은 아니지만, 플라스미드 DNA 벡터, 바이러스 DNA 벡터 (예컨대, 아데노바이러스 또는 아데노-관련 바이러스 벡터), 또는 바이러스 RNA 벡터 (예컨대, 레트로바이러스 또는 알파바이러스 벡터)를 비롯한, 포유동물 세포 내로의 도입을 위한 다양한 벡터 내로 도입될 수 있다 (리뷰를 위해, 문헌 [Couture and Stinchcomb, 1996, 상기 문헌 동일] 참조).
본 발명의 siNA 분자를 발한하는 데 사용되는 벡터는 siNA 이중체 중 한 가닥 또는 양 가닥 모두, 또는 siNA 이중체로 자기 혼성화하는 단일 자기-상보적 가닥을 코딩할 수 있다. 본 발명의 siNA 분자를 코딩하는 핵산 서열은 siNA 분자가 발현될 수 있도록 하는 방식으로 작동가능하게 연결될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Paul et al., 2002, Nature Biotechnology , 19, 505]; [Miyagishi and Taira, 2002, Nature Biotechnology , 19, 497]; [Lee et al., 2002, Nature Biotechnology, 19, 500]; 및 [Novina et al., 2002, Nature Medicine, advance online publication doi: 10.1038/nm725] 참조).
D. 담체 /전달 시스템
본 발명의 siNA 분자는 직접 첨가되거나, 또는 양이온성 지질과 복합체를 형성하고, 리포솜 내로, 또는 siNA 분자를 발현하는 재조합 플라스미드 또는 바이러스 벡터로서 패킹되거나, 또는 다르게는 표적 세포 또는 조직으로 전달될 수 있다. 핵산 분자 전달 방법은 문헌 [Akhtar et al., 1992, Trends Cell Bio ., 2, 139; Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995], [Maurer et al., 1999, Mol . Membr . Biol , 16, 129-140]; [Hofiand and Huang, 1999, Handb . Exp . Pharmacol , 137, 165-192]; 및 [Lee et al., 2000, ACS Symp. Ser ., 752, 184-192]에 기술되어 있다. 미국 특허 번호 6,395,713 (Beigelman et al.) 및 PCT WO 94/02595 (Sullivan et al.)에는 일반적인 핵산 분자 전달 방법이 추가로 기술되어 있다. 이러한 프로토콜은 사실상 임의의 핵산 분자를 전달하는 데 사용될 수 있다. 제한하는 것은 아니지만, 리포솜 내의 캡슐화, 이온영동법에 의해, 또는 예컨대, 생분해성 중합체, 히드로겔, 시클로덱스트린 (예를 들어, 문헌 [Gonzalez et al., 1999, Bioconjugate Chem ., 10, 1068-1074]; PCT 국제 공개 번호 WO 03/47518 및 WO 03/46185 (Wang et al.) 참조), 폴리(락트-코-글리콜)산 (PLGA) 및 PLCA 미소구 (예를 들어, 미국 특허 6,447,796 및 미국 특허 출원 공개 번호 US 2002130430 참조), 생분해성 나노캡슐 및 생접착성 미소구와 같은 다른 비히클 속으로의 도입에 의해, 또는 단백질성 벡터 (PCT 국제 공개 번호 WO 00/53722 (O'Hare and Normand)))에 의한 것을 비롯한, 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 핵산 분자를 세포에 투여할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 siNA 분자를 함유하는 담체 시스템을 제공한다. 일부 실시양태에서, 담체 시스템은 지질 기반 담체 시스템, 양이온성 지질, 또는 리포솜 핵산 복합체, 리포솜, 미셀, 비로솜, 지질 나노입자 또는 그의 혼합물이다. 다른 실시양태에서, 담체 시스템은 중합체 기반 담체 시스템, 예컨대, 양이온성 중합체-핵산 복합체이다. 추가의 실시양태에서, 담체 시스템은 시클로덱스트린 기반 담체 시스템, 예컨대, 시클로덱스트린 중합체-핵산 복합체이다. 추가의 실시양태에서, 담체 시스템은 단백질 기반 담체 시스템, 예컨대, 양이온성 펩티드-핵산 복합체이다. 바람직하게, 담체 시스템은 지질 나노입자 ("LNP") 제제이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 예컨대, 미국 특허 출원 번호 11/353,630, 11/586,102, 61/189,295, 61/204,878, 61/235,476, 61/249,807, 61/298,022, 61/351373, 61/347640, 61/345754, 61/322054, 12/640342, 및 12/617079, 및 PCT 출원 번호 PCT/US10/020013 및 PCT/ US09/053336에 기술되어 있는 것과 같이, 지질 나노입자 조성물로 제제화된다. 특정 실시양태에서, siNA는 본원 실시예 6에 기술되어 있고, 예시되어 있는 성분 및 비로 제제화된다 (또한, 표 10 & 11 참조).
다양한 실시양태에서, 표 10에 기술된 지질 나노입자 제제는 본원의 임의의 siNA 분자, 또는 siNA 분자의 조합에 적용된다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 양이온성 지질 화합물 번호 1-46 중 임의의 것 또는 그의 조합을 포함하는 조성물로서 제제화된, 본 발명의 siNA 분자를 포함하는 조성물을 특징으로 한다.
특정의 다른 실시양태에서, 본 발명은 미국 특허 출원 번호 61/189,295, 61/204,878, 61/235,476, 61/249,807, 및 61/298,022에 기술된 양이온성 지질 제제 중 임의의 것으로 제제화된, 본 발명의 siNA 분자를 포함하는 조성물을 특징으로 한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 siNA 분자의 컨쥬게이트 및/또는 복합체를 특징으로 한다. 상기 컨쥬게이트 및/또는 복합체를 사용함으로써 siNA 분자의 생물계, 예컨대, 세포 내로의 전달을 촉진시킬 수 있다. 본 발명에 의해 제공되는 컨쥬게이트 및 복합체는 치료학적 화합물을 세포막을 통해 전달하고, 본 발명의 핵산 분자의 약동학적 성질을 변경시키고/거나 국소화를 조절하여 치료학적 활성을 부여할 수 있다. 상기와 같은 컨쥬게이트의 비제한적인 일례는 미국 공개 번호 US2008/0152661 A1 및 US 2004/0162260 A1 (예컨대, CDM-LBA, CDM-Pip-LBA, CDM-PEG, CDM-NAG 등) 및 미국 특허 출원 번호 10/427,160, 10/201,394, 61/322422, 및 61/315223; 및 미국 특허 번호 6,528,631; 6,335,434; 6,235,886; 6,153,737; 5,214,136; 및 5,138,045에 기술되어 있다.
다양한 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)은 본 발명의 siNA 화합물에 공유적으로 부착될 수 있다. 부착된 PEG는 임의의 분자량, 바람직하게는 약 100 내지 약 50,000 달톤 (Da)일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 예를 들어, PCT 국제 공개 번호 WO 96/10391; PCT 국제 공개 번호 WO 96/10390 (Ansell et al.); PCT 국제 공개 번호 WO 96/10392 (Holland et al.)에 개시되어 있는 것과 같은, 폴리(에틸렌 글리콜) 지질 (PEG-변형된, 또는 장기 순환 리포솜 또는 스텔스 리포솜) 및 본 발명의 핵산 분자를 함유하는 표면 변형된 리포솜을 포함하는 조성물 또는 제제를 특징으로 한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 또한 폴리에틸렌이민 및 그의 유도체, 예컨대, 폴리에틸렌이민-폴리에틸렌글리콜-N-아세틸갈락토스아민 (PEI-PEG-GAL) 또는 폴리에틸렌이민-폴리에틸렌글리콜-트리-N-아세틸갈락토스아민 (PEI-PEG-트리GAL) 유도체와 함께 제제화되거나 또는 복합체를 형성할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 미국 특허 출원 공개 번호 20030077829에 기술되어 있는 바와 같이 제제화된다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 예컨대, 미국 특허 출원 공개 번호 20010007666에 기술되어 있는 것과 같은 막 파괴제와 복합체를 형성한다. 또 다른 실시양태에서, 막 파괴제 또는 파괴제들 및 siNA 분자는 또한 양이온성 지질 또는 헬퍼 지질 분자, 예컨대, 미국 특허 번호 6,235,310에 기술되어 있는 것과 같은 지질과 복합체를 형성한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 미국 특허 출원 공개 번호 2003077829; 20050287551; 20050164220; 20050191627; 20050118594; 20050153919; 20050085486; 및 20030158133; 및 PCT 국제 공개 번호 WO 00/03683 및 WO 02/087541에 기술되어 있는 것과 같은 전달 시스템과 복합체를 형성한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 리포솜 제제는 미국 특허 번호 6,858,224; 6,534,484; 6,287,591; 6,835,395; 6,586,410; 6,858,225; 6,815,432; 6,586,001; 6,120,798; 6,977,223; 6,998,115; 5,981,501; 5,976,567; 5,705,385; 및 미국 특허 출원 공개 번호 2006/0019912; 2006/0019258; 2006/0008909; 2005/0255153; 2005/0079212; 2005/0008689; 2003/0077829; 2005/0064595; 2005/0175682; 2005/0118253; 2004/0071654; 2005/0244504; 2005/0265961 및 2003/0077829에 기술되어 있는 화합물 및 조성물과 함께 제제화되거나 복합체를 형성하는 본 발명의 siNA 분자(예컨대, siNA)를 포함한다.
별법으로, 상기에서 논의된 바와 같은, 본 발명의 siNA를 발현하는 재조합 플라스미드 및 바이러스 벡터를 사용하여 본 발명의 분자를 전달할 수 있다. siNA 분자를 발현하는 벡터의 전달은 전신으로, 예컨대, 정맥내 또는 근육내 투여에 의해, 대상체로부터 체외이식된 표적 세포에 투여한 후, 대상체 내로 재도입함으로써, 또는 원하는 표적 세포 내로의 도입을 허용하는 임의의 다른 수단에 의해 이루어질 수 있다 (검토를 위해, 문헌 [Couture et al., 1996, TIG., 12, 510] 참조). 상기 재조합 플라스미드는 또한 직접 투여될 수 있거나, 또는 예를 들어, 미러스 트랜짓(Mirus Transit) LT1 친유성 시약; 리포펙틴; 리포펙타민; 셀펙틴; 폴리양이온 (예컨대, 폴리리신) 또는 리포솜 지질 기반 담체 시스템, 양이온성 지질, 또는 리포솜 핵산 복합체, 미셀, 비로솜, 지질 나노입자을 비롯한, 적합한 전달 시약과 함께 투여될 수 있다.
E. 키트
본 발명은 또한 키트 형태로 핵산을 제공한다. 키트는 용기를 포함할 수 있다. 키트는 전형적으로 본 발명의 핵산과, 그의 투여를 위한 설명서를 함께 포함한다. 특정의 경우에, 본 핵산은 부착되는 표적 모이어티를 가질 수 있다. 표적 모이어티 (예컨대, 항체, 단백질)를 부착시키는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 특정의 경우에, 본 핵산은 화학적으로 변형된 것이다. 다른 실시양태에서, 키트는 본 발명의 siNA 분자를 1 초과로 포함한다. 키트는 제약상 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 본 발명의 siNA 분자를 포함할 수 있다. 키트는 추가로 부형제를 포함할 수 있다.
F. 치료 용도/제약 조성물
HBV 연구에서의 현 지식 체계는 HBV 활성을 검정하는 방법, 및 연구, 진단, 및 치료 용도를 위해 HBV 발현을 조절할 수 있는 화합물이 필요하다는 것을 시사한다. 하기에 기술되어 있는 바와 같이, 본 발명의 핵산 분자는 HBV 수준과 관련된 질환 상태를 진단하는 검정법에서 사용될 수 있다. 추가로, 핵산 분자 및 제약 조성물을 사용하여 HBV RNA 수준과 관련된 질환 상태를 치료할 수 있다.
1. HBV 와 관련된 질환 상태
HBV 발현 조절과 관련되어 있을 수 있는 특정 질환 상태로는 간 질환 및 암을 포함한다. 상기 질환의 비제한적인 일례로 간경변 및 간세포 암종을 포함한다.
본 발명의 siNA 분자가 표적 HBV mRNA를 분해할 수 있다는 것을 (따라서, 상기 질환 상태를 억제시킬 수 있다는 것을) 이해하여야 한다. 질환 억제는 대상체에서 질환의 진행 상태를 직접 측정함으로써 평가할 수 있다. 이는 또한 질환 관련된 증상의 변화 또는 역전에 관한 관찰을 통해 유추될 수 있다. 추가로, 본 발명의 siNA 분자는 예방용으로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 핵산 분자 및 제약 조성물의 용도를 사용하여 상기 질환 및 HBV 유전자 발현 조절관 관련된 다른 질환을 호전, 치료, 예방, 및/또는 치유할 수 있다.
2. 제약 조성물
본 발명의 siNA 분자는 다양한 치료학적, 예방학적, 화장학적, 수의학적, 진단학적, 표적 확인, 게놈 발견, 유전공학, 및 약물유전체적 적용을 위해 유용한 시약 및 방법을 제공한다.
a. 제제
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 또한 기술된 siNA 분자의 제약 조성물, 즉, 제약상 허용되는 담체 또는 희석제 중의 조성물을 제공한다. 이러한 제약 조성물은 상기 화합물의 염, 에스테르, 또는 상기 에스테르의 염, 예컨대, 산 부가 염, 예를 들어, 염산, 브로민화수소산, 아이오딘화수소산, 아세트산 및 벤젠 술폰산의 염을 포함한다. 다른 염으로는 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 망가니즈, 암모늄, 및 칼슘 염을 포함한다. 이러한 제제 또는 조성물은 당업계에 일반적으로 공지되어 있는 것과 같은 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 1의 15개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 siNA 분자를 포함하는 제약 조성물을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 452의 15개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 siNA 분자를 포함하는 제약 조성물을 특징으로 한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 2의 15개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 siNA 분자를 포함하는 제약 조성물을 특징으로 한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 453의 15개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 siNA 분자를 포함하는 제약 조성물을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 3의 15개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 siNA 분자를 포함하는 제약 조성물을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 454의 15개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 siNA 분자를 포함하는 제약 조성물을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 4의 15개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 siNA 분자를 포함하는 제약 조성물을 특징으로 한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 455의 15개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 siNA 분자를 포함하는 제약 조성물을 특징으로 한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 식 (A)를 포함하는 siNA 분자를 포함하는 제약 조성물을 특징으로 한다.
본 발명의 siNA 분자는 바람직하게 당업계에 공지된 기법에 따라, 대상체에게 투여되기 이전에 제약 조성물로서 제제화된다. 본 발명의 제약 조성물은 적어도 멸균성이고, 발열성 물질이 없는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 제약 조성물을 제조하는 방법은 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science , 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)]에 기술되어 있는 바와 같이, 당업계의 기술내에 포함되어 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 (예컨대, siNA 및/또는 그의 LNP 제제) 통상의 제약 부형제 및/또는 첨가제를 추가로 포함한다. 적합한 제약 부형제로는 보존제, 향미제, 안정화제, 항산화제, 삼투압 조절제, 완충제, 및 pH 조절제를 포함한다. 적합한 첨가제로는 생리학상 생체적합성 완충제 (예컨대, 트리메틸아민 히드로클로라이드), 킬란트 부가물 (예를 들어, DTPA 또는 DTPA-비스아미드) 또는 칼슘 킬레이트 복합체 부가물 (예를 들어, 칼슘 DTPA, CaNaDTPA-비스아미드), 또는 임의로 칼슘 또는 나트륨 염 (예를 들어, 염화칼슘, 아스코르브산칼슘, 글루콘산칼슘 또는 락트산칼슘) 부가물을 포함한다. 추가로, 항산화제 및 현탁화제가 사용될 수 있다.
국소 투여용으로서의 다양한 유형의 제제에 관한 비제한적인 예로는 연고, 로션, 크림, 겔, 발포체, 경피 패치에 의한 전달용 제제, 분말, 분무, 에어로졸, 흡입기 또는 취입기용 캡슐 또는 카트리지 또는 점적제 (예를 들어, 점안제 또는 점비제), 연무용 용액/현탁액, 좌제, 페서리, 정체 관장제 및 씹을 수 있거나 빨아먹을 수 있는 정제 또는 펠릿 (예를 들어, 아프타성 궤양 치료용) 또는 리포솜 또는 미세캡슐화 제제를 포함한다.
연고, 크림 및 겔은 예를 들어, 수성 또는 오일성 기제를 사용하고, 적합한 증점제 및/또는 겔화제 및/또는 용매를 첨가하여 제제화될 수 있다. 따라서, 이러한 기제의 비-제한적인 예로는 예를 들어, 물 및/또는 오일, 예컨대, 액상 파라핀 또는 식물성 오일, 예컨대, 아라키스 오일 또는 피마자 오일, 또는 용매, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜을 포함할 수 있다. 기제의 성질에 따라 다양한 증점제 및 겔화제가 사용될 수 있다. 이러한 제제의 비-제한적인 예로는 연질 파라핀, 스테아르산알루미늄, 세토스테아릴 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 라놀린, 밀랍, 카르복시폴리메틸렌 및 셀룰로스 유도체, 및/또는 글리세릴 모노스테아레이트 및/또는 비-이온성 유화제를 포함한다.
한 실시양태에서, 로션은 수성 또는 오일성 기제를 사용하여 제제화될 수 있고, 일반적으로는 또한 하나 이상의 유화제, 안정화제, 분산액, 현탁화제 또는 증점제를 함유할 것이다.
한 실시양태에서, 외용 분말은 임의의 적합한 분말 기제, 예를 들어, 활석, 락토스 또는 전분의 도움으로 형성될 수 있다. 점적제는 하나 이상의 분산액, 가용화제, 현탁화제 또는 보존제를 또한 포함하는 수성 또는 비수성 기제를 사용하여 제제화될 수 있다.
경구용 조성물은 제약 조성물의 제조에 대해 당업계에 공지된 임의의 방법에 따라 제조할 수 있고, 이러한 조성물은 하나 이상의 감미제, 향미제, 착색제 또는 보존제를 함유하여 제약상 우아하고 맛좋은 제제를 제공할 수 있다. 정제는 정제를 제조하는 데 적합한 비-독성의 제약상 허용되는 부형제와 혼합된 활성 성분을 함유한다. 이러한 부형제는, 예를 들어, 불활성 희석제, 예컨대, 탄산칼슘, 탄산나트륨, 락토스, 인산칼슘 또는 인산나트륨; 과립화제 및 붕해제, 예를 들어, 옥수수 전분 또는 알긴산; 결합제, 예를 들어, 전분, 젤라틴 또는 아카시아; 및 윤활제, 예를 들어, 스테아르산마그네슘, 스테아르산 또는 활석일 수 있다. 정제는 코팅되지 않거나, 또는 공지된 기술에 의해 코팅될 수 있다. 일부 경우에, 이러한 코팅은 공지된 기술에 의해 제조될 수 있고, 이는 위장관에서 붕해 및 흡수를 지연시켜 장기간에 걸친 지속적인 작용을 제공할 수 있다. 예를 들어, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 시간 지연 물질을 사용할 수 있다.
경구용 제제는 또한 활성 성분이 불활성 고체 희석제, 예를 들어, 탄산칼슘, 인산칼슘 또는 카올린과 혼합된 경질 젤라틴 캡슐로서, 또는 활성 성분이 물 또는 오일 매질, 예컨대, 땅콩 오일, 액상 파라핀 또는 올리브 오일과 혼합된 연질 젤라틴 캡슐로서 제공될 수 있다.
수성 현탁액은 수성 현탁액의 제조에 적합한 부형제와 혼합된 활성 물질을 함유한다. 이러한 부형제는 현탁화제, 예를 들어, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드로프로필-메틸셀룰로스, 알긴산나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸트 검 및 아라비아 검이고; 분산액 또는 습윤제는 천연 발생 포스파티드, 예를 들어, 레시틴, 또는 알킬렌 옥시드와 지방산과의 축합 생성물, 예컨대, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트; 또는 에틸렌 옥시드와 장쇄 지방족 알콜과의 축합 생성물, 예컨대, 헵타데카에틸렌옥시세탄올, 또는 에틸렌 옥시드와 지방산 및 헥시톨로부터 유도된 부분적인 에스테르와의 축합 생성물, 예컨대, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레에이트, 또는 에틸렌 옥시드와 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유도된 부분적인 에스테르와의 축합 생성물, 예를 들어, 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레에이트일 수 있다. 수성 현탁액은 또한 하나 이상의 보존제, 예를 들어, 에틸 또는 n-프로필 p-히드록시벤조에이트, 하나 이상의 착색제, 하나 이상의 향미제 및 하나 이상의 감미제, 예컨대, 수크로스 또는 사카린을 함유할 수 있다.
오일성 현탁액은 활성 성분을 식물성 오일, 예를 들어, 아라키스 오일, 올리브 오일, 참깨 오일 또는 코코넛 오일 중에, 또는 미네랄 오일, 예컨대, 액상 파라핀 중에 현탁시킴으로써 제제화될 수 있다. 오일성 현탁액은 증점제, 예를 들어, 밀랍, 경질 파라핀 또는 세틸 알콜을 함유할 수 있다. 감미제 및 향미제를 첨가하여 맛좋은 경구용 제제를 제공할 수 있다. 이러한 조성물은 예컨대, 아스코르브산과 같은 항산화제의 첨가에 의해 보존될 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 또한 수중유 에멀젼의 형태일 수 있다. 오일상은 식물성 오일 또는 미네랄 오일 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 적합한 유화제는 천연 발생 검, 예를 들어, 아카시아 검 또는 트라가칸트 검, 천연 발생 포스파티드, 예를 들어, 대두, 레시틴, 및 지방산 및 헥시톨로부터 유도된 에스테르 또는 부분적인 에스테르, 무수물, 예를 들어, 소르비탄 모노올레에이트, 및 상기 부분적인 에스테르와 에틸렌 옥시드의 축합 생성물, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트일 수 있다. 에멀젼은 또한 감미제 및 향미제를 함유할 수 있다.
시럽 및 엘릭시르는 감미제, 예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 소르비톨, 글루코스 또는 수크로스와 함께 제제화될 수 있다. 이러한 제제는 또한 완화제, 보존제 및 향미제 및 착색제를 함유할 수 있다. 제약 조성물은 멸균 주사가능한 수성 또는 유성 현탁액의 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 상기 언급된 적합한 분산액 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 공지된 기술에 따라 제제화될 수 있다. 멸균 주사가능한 제제는 또한 비-독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사가능한 용액 또는 현탁액, 예를 들어, 1,3-부탄디올 중의 용액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용되는 비히클 및 용매 중에는 물, 링거액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 추가로, 멸균 고정 오일은 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 본 목적을 위해, 합성 모노 또는 디글리세리드를 비롯한, 임의의 무자극성 고정 오일을 사용할 수 있다. 추가로, 예컨대, 올레산과 같은 지방산은 주사가능한 제제에서 유용한 것으로 밝혀져 있다.
본 발명의 핵산 분자는 또한, 예컨대, 약물의 직장 투여용 좌제의 형태로 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 약물을, 상온에서는 고체이지만 직장 온도에서는 액체로 존재하여 직장 내에서 용융되어 약물을 방출하는 적합한 비-자극성 부형제와 혼합하여 제조될 수 있다. 이러한 물질로는 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
본 발명의 핵산 분자는 멸균 매질 중에서 비경구적으로 투여될 수 있다. 사용되는 비히클 및 농도에 따라 약물을 비히클에 현탁 또는 용해시킬 수 있다. 유리하게는, 아주반트, 예컨대, 국소 마취제, 보존제 및 완충제를 비히클에 용해시킬 수 있다.
다른 실시양태에서, 폐 전달에 사용하기 위한, 본원에서 제공하는 siNA 및 LNP 조성물 및 제제는 하나 이상의 계면활성제를 추가로 포함한다. 본 발명의 조성물의 흡수를 증진시키기에 적합한 계면활성제 또는 계면활성제 성분으로는 합성 및 천연 뿐만 아니라, 완전한 및 말단절단형 형태의 계면활성제 단백질 A, 계면활성제 단백질 B, 계면활성제 단백질 C, 계면활성제 단백질 D 및 계면활성제 단백질 E, 이포화된 포스파티딜콜린 (디팔미토일 제외), 디팔미토일포스파티딜콜린, 포스파티딜콜린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린 계면활성제; 포스파티드산, 유비퀴논, 리소포스파티딜에탄올아민, 리소포스파티딜콜린, 팔미토일-리소포스파티딜콜린, 데히드로에피안드로스테론, 돌리콜, 술파티드산, 글리세롤-3-포스페이트, 디히드록시아세톤 포스페이트, 글리세롤, 글리세로-3-포스포콜린, 디히드록시아세톤, 팔미테이트, 시티딘 디포스페이트 (CDP) 디아실글리세롤, CDP 콜린, 콜린, 콜린 포스페이트; 및 계면활성제, 오메가-3 지방산, 폴리엔산, 폴리에노산, 레시틴, 팔미틴산, 에틸렌 또는 프로필렌 옥시드의 비-이온성 블록 공중합체, 폴리옥시프로필렌, 단량체성 및 중합체성 폴리옥시에틸렌, 덱스트란 및/또는 알카노일 측쇄를 갖는 단량체성 및 중합체성 폴리(비닐 아민), Brij 35, 트리톤(Triton) X-100 및 합성 계면활성제 ALEC, 엑소술프 (Exosurf), 설반(Survan) 및 아토바쿠온(Atovaquone) 등의 성분을 위한 천연 담체 비히클인 천연 및 인공 박막층체 (lamellar body)가 포함된다. 이러한 계면활성제는 제제 중에 단독으로 또는 다중 성분 계면활성제의 일부로서, 또는 본원의 제약 조성물의 핵산 성분의 5' 및/또는 3' 말단에 공유결합된 부가물로서 사용될 수 있다.
b. 조합물
본 발명에 따른 siNA 및 제약 제제는 대상체에게 단독으로 투여될 수 있거나, 또는 하나 이상의 다른 치료제, 예를 들어, 항바이러스제 또는 항암제와 함께 조합되어 사용될 수 있거나, 이를 포함할 수 있다. 따라서, 다른 항바이러스제 또는 항암제 또는 화학요법제와 본 개시된 화합물과의 조합물이 본 발명의 범주내 포함된다.
항암제 또는 화학요법제의 예로는 문헌 [Cancer Principles and Practice of Oncology by V.T. Devita and S. Hellman (editors), 6th edition (February 15, 2001), Lippincott Williams & Wilkins Publishers]에서 살펴볼 수 있다. 당업자는 관련된 약물 및 암의 특정 성질에 따라 어떤 제제의 조합물이 유용할 것인지 분별할 수 있을 것이다. 이러한 항암제로는 하기: 에스트로겐 수용체 조절제, 안드로겐 수용체 조절제, 레티노이드 수용체 조절제, 세포독성제/세포증식억제제, 항증식제, 프레닐-단백질 트랜스퍼라제 억제제, HMG-CoA 리덕타제 억제제 및 다른 혈관신생 억제제, 세포 증식 및 생존 신호 전달 억제제, 아폽토시스 유도화제 및 세포 주기 체크포인트를 방해하는 작용제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 siNA는 또한 HCC 치료에 사용되는 임의의 치료제, 예를 들어, 제한하는 것은 아니지만, 소라페닙과 함께 조합되었을 때에 유용하다.
추가의 실시양태에서, 따라서, 본 발명은 하나 이상의 항바이러스제와 함께 본 발명의 siNA 분자, 예를 들어, 제한하는 것은 아니지만, 서열 1, 서열 1210, 서열 2, 서열 1211, 서열 3, 서열 1212, 서열 4, 또는 서열 1213의 15개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 siNA 분자; 또는 식 (A) 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 생리학상 기능적 유도체를 포함하는 조합물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 항바이러스제는 또 다른 HBV 억제제이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 하기: 라미부딘 (2',3'-디데옥시-3'-티아시티딘, 통상 3TC로 명명됨), Peg인터페론-알파2a, 테노포비어, 엔테카비어, 텔비부딘, 아데포비어를 비롯한, 공지된 HBV 항바이러스제와 함께 조합되었을 때에 유용하다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 항암제 또는 화학요법제와 함께 본 발명의 siNA 분자, 예를 들어, 제한하는 것은 아니지만, 서열 1, 서열 452, 서열 2, 서열 453, 서열 3, 서열 454, 서열 4, 또는 서열 455의 15개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 siNA 분자; 또는 식 (A) 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 생리학상 기능적 유도체를 포함하는 조합물을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 본 siNA 분자는 하기: 에스트로겐 수용체 조절제, 안드로겐 수용체 조절제, 레티노이드 수용체 조절제, 세포독성제, 항증식제, 프레닐-단백질 트랜스퍼라제 억제제, HMG-CoA 리덕타제 억제제, HIV 프로테아제 억제제, 역전사효소 억제제, 및 다른 혈관신생 억제제를 비롯한, 공지된 항암제와 함께 조합되었을 때에 유용하다.
본 발명의 화합물과 함께 조합하여 사용될 수 있는 에스트로겐 수용체 조절제의 예로는 타목시펜, 랄록시펜, 이독시펜, LY353381, LY117081, 토레미펜, 풀베스트란트, 4-[7-(2,2-디메틸-1-옥소프로폭시-4-메틸-2-[4-[2-(1-피페리디닐)에톡시]페닐]-2H-1-벤조피란-3-일]-페닐-2,2-디메틸프로파노에이트, 4,4'-디히드록시벤조페논-2,4-디니트로페닐-히드라존, 및 SH646을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 화합물과 함께 조합하여 사용될 수 있는 안드로겐 수용체 조절제의 예로는 피나스테리드 및 다른 5α-리덕타제 억제제, 닐루타미드, 플루타미드, 비칼루타미드, 리아로졸, 및 아비라테론 아세테이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 화합물과 함께 조합하여 사용될 수 있는 상기 레티노이드 수용체 조절제의 예로는 벡사로텐, 트레티노인, 13-시스-레티노산, 9-시스-레티노산, α-디플루오로메틸오르니틴, ILX23-7553, 트랜스-N-(4'-히드록시페닐)레틴아미드 및 N-4-카르복시페닐 레틴아미드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 화합물과 함께 조합하여 사용될 수 있는 세포독성제의 예로는 세르테네프, 카켁틴, 이포스파미드, 타소네르민, 로니다민, 카르보플라틴, 알트레타민, 프레드니무스틴, 디브로모둘시톨, 라니무스틴, 포테무스틴, 네다플라틴, 옥살리플라틴, 테모졸로미드, 헵타플라틴, 에스트라무스틴, 임프로술판 토실레이트, 트로포스파미드, 니무스틴, 디브로스피듐 클로라이드, 푸미테파, 로바플라틴, 사트라플라틴, 프로피로마이신, 시스플라틴, 이로풀벤, 덱시포스파미드, 시스-아민디클로로(2-메틸-피리딘)플래티넘, 벤질구아닌, 글루포스파미드, GPX100, (트랜스, 트랜스, 트랜스)-비스-뮤-(헥산-1,6-디아민)-뮤-[디아민-플래티넘(II)]비스[디아민(클로로)플래티넘(II)]테트라클로라이드, 디아리지디닐스페르민, 아르세닉 트리옥시드, 1-(11-도데실아미노-10-히드록시운데실)-3,7-디메틸크산틴, 조루비신, 이다루비신, 다우노루비신, 비스안트렌, 미토크산트론, 피라루비신, 피나피드, 발루비신, 암루비신, 안티네오플라스톤, 3'-데아미노-3'-모르폴리노-13-데옥소-10-히드록시카르미노마이신, 안나마이신, 갈라루비신, 엘리나피드, MEN10755, 및 4-데메톡시-3-데아미노-3-아지리디닐-4-메틸술포닐-다우노루비신(WO 00/50032 참조)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 화합물과 함께 조합하여 사용될 수 있는 저산소증 활성화가능 화합물의 예로는 티라파자민이 있다.
본 발명의 화합물과 함께 조합하여 사용될 수 있는 프로테오솜 억제제의 예로는 락타시스틴 및 보르테조밉을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 화합물과 함께 조합하여 사용될 수 있는 미세소관 억제제/미세소관 안정화제의 예로는 파클리탁셀, 빈데신 술페이트, 3',4'-디데히드로-4'-데옥시-8'-노르빈카류코블라스틴, 도세탁솔, 리족신, 돌라스타틴, 미보불린 이세티오네이트, 아우리스타틴, 세마도틴, RPR109881, BMS184476, 빈플루닌, 크립토피신, 2,3,4,5,6-펜타플루오로-N-(3-플루오로-4-메톡시페닐)벤젠 술폰아미드, 안히드로빈블라스틴, N,N-디메틸-L-발릴-L-발릴-N-메틸-L-발릴-L-프롤릴-L-프롤린-t-부틸아미드, TDX258, 에포틸론 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,284,781 및 6,288,237 참조) 및 BMS188797을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 화합물과 함께 조합하여 사용될 수 있는 토포이소머라제 억제제의 몇몇 예로는 토포테칸, 하이캅트아민, 이리노테칸, 루비테칸, 6-에톡시프로피오-3',4'-O-엑소-벤질리덴-카르트레우신, 9-메톡시-N,N-디메틸-5-니트로피라졸로[3,4,5-kl]아크리딘-2-(6H) 프로판아민, 1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2,3-디히드로-9-히드록시-4-메틸-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':b,7]-인돌리지노[1,2b]퀴놀린-10,13(9H,15H)디온, 루르토테칸, 7-[2-(N-이소프로필아미노)에틸]-(20S)캄프토테신, BNP1350, BNPI1100, BN80915, BN80942, 에토포시드 포스페이트, 테니포시드, 소부족산, 2'-디메틸아미노-2'-데옥시-에토포시드, GL331, N-[2-(디메틸아미노)에틸]-9-히드록시-5,6-디메틸-6H-피리도[4,3-b]카르바졸-1-카르복스아미드, 아술라크린, (5a,5aB,8aa,9b)-9-[2-[N-[2-(디메틸아미노)에틸]-N-메틸아미노]에틸]-5-[4-히드록시-3,5-디메톡시페닐]-5,5a,6,8,8a,9-헥소히드로푸로(3',4':6,7)나프토(2,3-d)-1,3-디옥솔-6-온, 2,3-(메틸렌디옥시)-5-메틸-7-히드록시-8-메톡시벤조[c]-페난트리디늄, 6,9-비스[(2-아미노에틸)아미노]벤조[g]이소구이놀린-5,10-디온, 5-(3-아미노프로필아미노)-7,10-디히드록시-2-(2-히드록시에틸아미노메틸)-6H-피라졸로 [4,5,1-de]아크리딘-6-온, N-[1-[2(디에틸아미노)에틸아미노]-7-메톡시-9-옥소-9H-티오크산텐-4-일메틸]포름아미드, N-(2-(디메틸아미노)에틸)아크리딘-4-카르복스아미드, 6-[[2-(디메틸아미노)에틸]아미노]-3-히드록시-7H-인데노[2,1-c]퀴놀린-7-온, 및 디메스나를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 화합물과 함께 조합하여 사용될 수 있는 유사분열 키네신, 및 특히 인간 유사분열 키네신 KSP의 억제제의 예로는 PCT 공보 WO 01/30768, WO 01/98278, WO 03/050,064, WO 03/050,122, WO 03/049,527, WO 03/049,679, WO 03/049,678, WO 04/039774, WO 03/079973, WO 03/099211, WO 03/105855, WO 03/106417, WO 04/037171, WO 04/058148, WO 04/058700, WO 04/126699, WO 05/018638, WO 05/019206, WO 05/019205, WO 05/018547, WO 05/017190, US2005/0176776에 기술된 억제제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 한 실시양태에서, 유사분열 키네신의 억제제로는 KSP의 억제제, MKLP1의 억제제, CENP-E의 억제제, MCAK의 억제제, Kif14의 억제제, M포스포1(Mphosph1)의 억제제 및 Rab6-KIFL의 억제제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 화합물과 함께 조합하여 사용될 수 있는 "히스톤 데아세틸라제 억제제"의 예로는 TSA, 옥삼플라틴, PXD101, MG98, 발프로산 및 스크립타이드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다른 히스톤 데아세틸라제 억제제에 대한 것은 문헌 [Miller, T.A. et al. J. Med. Chem. 46(24):5097-5116 (2003)]을 추가로 참조할 수 있다
본 발명의 화합물과 함께 조합하여 사용될 수 있는, 유사분열 진행에 관여하는 키나제의 억제제로는 오로라 키나제의 억제제, 폴로 유사 키나제 (PLK)의 억제제 (특히 PLK-1의 억제제), bub-1의 억제제 및 bub-R1의 억제제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 화합물과 함께 조합하여 사용될 수 있는 항증식제로는 안티센스 RNA 및 DNA 올리고뉴클레오티드, 예컨대, G3139, ODN698, RVASKRAS, GEM231, 및 INX3001, 및 항대사물, 예컨대, 에노시타빈, 카르모푸르, 테가푸르, 펜토스타틴, 독시플루리딘, 트리메트렉세이트, 플루다라빈, 카페시타빈, 갈록시타빈, 시타라빈 옥포스페이트, 포스테아빈 나트륨 수화물, 랄티트렉세드, 팔티트레시드, 에미테푸르, 티아조푸린, 데시타빈, 놀라트렉세드, 페메트렉세드, 넬자라빈, 2'-데옥시-2'-메틸리덴시티딘, 2'-플루오로메틸렌-2'-데옥시시티딘, N-[5-(2,3-디히드로-벤조푸릴)술포닐]-N'-(3,4-디클로로페닐)우레아, N6-[4-데옥시-4-[N2-[2(E),4(E)-테트라데카디엔오일]글리실아미노]-L-글리세로-B-L-만노-헵토피라노실]아데닌, 아플리딘, 엑테이나스시딘, 트록사시타빈, 4-[2-아미노-4-옥소-4,6,7,8-테트라히드로-3H-피리미디노[5,4-b][1,4]티아진-6-일-(S)-에틸]-2,5-티에노일-L-글루탐산, 아미노프테린, 5-플루로우라실, 알라노신, 11-아세틸-8-(카르바모일옥시메틸)-4-포르밀-6-메톡시-14-옥사-1,11-디아자테트라시클로(7.4.1.0.0)-테트라데카-2,4,6-트리엔-9-일 아세트산 에스테르, 스와인소닌, 로메트렉솔, 덱스라족산, 메티오니나제, 2'-시아노-2'-데옥시-N4-팔미토일-1-B-D-아라비노 푸라노실 시토신 및 3-아미노피리딘-2-카복스알데히드 티오세미카르바존을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 화합물과 함께 조합하여 사용될 수 있는 모노클로날 항체 표적 치료제의 예로는 암 세포 특이적 또는 표적 세포 특이적 모노클로날 항체에 부착된 방사성 동위원소 또는 세포독성제를 가진 치료제, 예컨대, 벡사(Bexxar)를 포함한다.
본 발명의 화합물과 함께 조합하여 사용될 수 있는 HMG-CoA 리덕타제 억제제의 예로는 로바스타틴 (메바코(MEVACOR)®; 미국 특허 번호 4,231,938, 4,294,926, 및 4,319,039 참조), 심바스타틴 (조코(ZOCOR)®; 미국 특허 번호 4,444,784, 4,820,850, 및 4,916,239 참조), 프라바스타틴 (프라바콜(PRAVACHOL)®; 미국 특허 번호 4,346,227, 4,537,859, 4,410,629, 5,030,447, 및 5,180,589 참조), 플루바스타틴 (레스콜(LESCOL)®; 미국 특허 번호 5,354,772, 4,911,165, 4,929,437, 5,189,164, 5,118,853, 5,290,946, 및 5,356,896 참조) 및 아토르바스타틴 (리피토(LIPITOR)®; 미국 특허 번호 5,273,995, 4,681,893, 5,489,691, 및 5,342,952 참조)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 방법에서 사용될 수 있는 이들 및 추가의 HMG-CoA 리덕타제 억제제의 구조식은 문헌 [M. Yalpani, "Cholesterol Lowering Drugs", Chemistry & Industry, pp. 85-89 (5 February 1996)]의 87면 및 미국 특허 번호 4,782,084 및 4,885,314에 기술되어 있다.
본 발명의 화합물과 함께 조합하여 사용될 수 있는 프레닐-단백질 트랜스퍼라제 억제제의 예로는 하기 공보 및 특허: WO 96/30343, WO 97/18813, WO 97/21701, WO 97/23478, WO 97/38665, WO 98/28980, WO 98/29119, WO 95/32987, 미국 특허 번호 5,420,245, 미국 특허 번호 5,523,430, 미국 특허 번호 5,532,359, 미국 특허 번호 5,510,510, 미국 특허 번호 5,589,485, 미국 특허 번호 5,602,098, 유럽 특허 공보 0 618 221, 유럽 특허 공보 0 675 112, 유럽 특허 공보 0 604 181, 유럽 특허 공보 0 696 593, WO 94/19357, WO 95/08542, WO 95/11917, WO 95/12612, WO 95/12572, WO 95/10514, 미국 특허 번호 5,661,152, WO 95/10515, WO 95/10516, WO 95/24612, WO 95/34535, WO 95/25086, WO 96/05529, WO 96/06138, WO 96/06193, WO 96/16443, WO 96/21701, WO 96/21456, WO 96/22278, WO 96/24611, WO 96/24612, WO 96/05168, WO 96/05169, WO 96/00736, 미국 특허 번호 5,571,792, WO 96/17861, WO 96/33159, WO 96/34850, WO 96/34851, WO 96/30017, WO 96/30018, WO 96/30362, WO 96/30363, WO 96/31111, WO 96/31477, WO 96/31478, WO 96/31501, WO 97/00252, WO 97/03047, WO 97/03050, WO 97/04785, WO 97/02920, WO 97/17070, WO 97/23478, WO 97/26246, WO 97/30053, WO 97/44350, WO 98/02436, 및 미국 특허 번호 5,532,359에서 살펴볼 수 있는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 혈관신생에 대한 프레닐-단백질 트랜스퍼라제 억제제의 역할의 예에 대해서는 문헌 [European J. of Cancer , Vol. 35, No. 9, pp.1394-1401 (1999)]를 참조할 수 있다.
본 발명의 화합물과 함께 조합하여 사용될 수 있는 혈관신생 억제제의 예로는 티로신 키나제 억제제, 예컨대, 예를 들면, 티로신 키나제 수용체 Flt-1 (VEGFR1) 및 Flk-1/KDR (VEGFR2)의 억제제, 표피-유래, 섬유모세포-유래 또는 혈소판-유래 성장 인자의 억제제, MMP (매트릭스 메탈로프로테아제) 억제제, 인테그린 차단제, 인터페론-α, 인터류킨-12, 펜토산 폴리술페이트, 시클로옥시게나제 억제제, 예를 들면, 비스테로이드성 항염증제 (NSAID), 예로서, 아스피린 및 이부프로펜 뿐만 아니라, 선택적 시클로옥시게나제-2 억제제, 예로서, 셀레콕시브 및 로페콕시브 (문헌 [PNAS, Vol. 89, p. 7384 (1992)]; [JNCI, Vol. 69, p. 475 (1982)]; [Arch. Opthalmol, Vol. 108, p.573 (1990)]; [Anat . Rec , Vol. 238, p. 68 (1994)]; [FEBS Letters, Vol. 372, p. 83 (1995)]; [Clin , Orthop. Vol. 313, p. 76 (1995)]; [J Mol . Endocrinol , Vol. 16, p.107 (1996)]; [Jpn . J. Pharmacol, Vol. 75, p. 105 (1997)]; [Cancer Res ., Vol. 57, p. 1625 (1997)]; [Cell , Vol. 93, p. 705 (1998]; [Intl . J. Mol . Med ., Vol. 2, p. 715 (1998)]; [J Biol . Chem., Vol. 274, p. 9116 (1999)]), 스테로이드성 항염증제 (예컨대, 코르티코스테로이드, 미네랄로코르티코이드, 덱사메타손, 프레드니손, 프레드니솔론, 메틸프레드, 베타메타손), 카르복시아미도트리아졸, 콤브레타스타틴 A-4, 세쿠알라민, 6-O-클로로아세틸-카르보닐)-푸마길롤, 탈리도미드, 안지오스타틴, 트로포닌-1, 안지오텐신 II 길항제 (문헌 [Fernandez et al., J Lab . Clin . Med . 105:141-145 (1985)] 참조), 및 VEGF에 대한 항체 (문헌 [Nature Biotechnology, Vol. 17, pp.963-968 (October 1999)]; [Kim et al., Nature, 362, 841-844 (1993)]; WO 00/44777; 및 WO 00/61186 참조)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
또한 본 발명의 화합물과 함께 조합하여 사용될 수 있는, 혈관신생을 조절하거나 억제하는 다른 치료제로는 응고 및 섬유소용해 시스템을 조절 또는 억제하는 제제를 포함한다 (문헌 [Clin . Chem . La . Med. 38:679-692 (2000)]에서의 리뷰 참조). 본 발명의 화합물과 함께 조합하여 사용될 수 있는, 응고 및 섬유소용해 경로를 조절 또는 억제하는 작용제의 예로는 헤파린 (문헌 [Thromb . Haemost. 80: 10-23 (1998)] 참조), 저분자량 헤파린 및 카르복시펩티다제 U 억제제 (이는 또한 활성 트롬빈 활성화 가능한 섬유소용해 억제제 [TAFIa]의 억제제로서도 공지되어 있다) (문헌 [Thrombosis Res. 101 :329-354 (2001)] 참조)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. TAFIa 억제제는 PCT 공보 WO 03/013,526 및 미국 일련 번호 60/349,925 (2002년 1월 18일 출원)에 기술되어 있다.
본 발명의 화합물과 함께 조합하여 사용될 수 있는, 세포 주기 체크포인트를 방해하는 작용제로는 ATR, ATM, Chk1 및 Chk2 키나제의 억제제, 및 cdk 및 cdc 키나제 억제제를 포함하나, 이에 한정되지 않고, 구체적으로는 7-히드록시스타우로스포린, 플라보피리돌, CYC202 (시클라셀) 및 BMS-387032로 예시된다.
본 발명의 화합물과 함께 조합하여 사용될 수 있는, 수용체 티로신 키나제 (RTK)를 방해하는 제제로는 c-Kit, Eph, PDGF, Flt3 및 HBV 억제제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 추가의 작용제로는 문헌 [Bume-Jensen and Hunter, Nature , 411 :355-365, 2001]에 기술된 RTK의 억제제를 포함한다.
본 발명의 화합물과 함께 조합하여 사용될 수 있는, 세포 증식 및 생존 신호전달 경로의 억제제로는 EGFR의 억제제 (예를 들어, 게피티닙 및 엘로티닙), ERB-2의 억제제 (예를 들어, 트라스투주맙), IGFR의 억제제, 시토카인 수용체의 억제제, HBV의 억제제, PI3K의 억제제 (예를 들어, LY294002), 세린/트레오닌 키나제 (Akt의 억제제, 예컨대, WO 02/083064, WO 02/083139, WO 02/083140, US 2004-01 16432, WO 02/083138, US 2004-0102360, WO 03/086404, WO 03/086279, WO 03/086394, WO 03/084473, WO 03/086403, WO 2004/041 162, WO 2004/096131, WO 2004/096129, WO 2004/096135, WO 2004/096130, WO 2005/100356, WO 2005/100344에 기술되어 있는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다), Raf 키나제의 억제제 (예를 들어, BAY-43-9006), MEK의 억제제 (예를 들어, CI-1040 및 PD-098059) 및 mTOR의 억제제 (예를 들어, 와이어스(Wyeth) CCI-779)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 작용제로는 소분자 억제제 화합물 및 항체 길항제가 포함된다.
본 발명의 화합물과 함께 조합하여 사용될 수 있는 아폽토시스 유도제로는 TNF 수용체 패밀리 구성원 (TRAIL 수용체 포함)의 활성화제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 화합물과 함께 조합하여 사용될 수 있는 선택적 COX-2 억제제인 NSAID로는 미국 특허 5,474,995, 미국 특허 5,861,419, 미국 특허 6,001,843, 미국 특허 6,020,343, 미국 특허 5,409,944, 미국 특허 5,436,265, 미국 특허 5,536,752, 미국 특허 5,550,142, 미국 특허 5,604,260, 미국 특허 5,698,584, 미국 특허 5,710,140, WO 94/15932, 미국 특허 5,344,991, 미국 특허 5,134,142, 미국 특허 5,380,738, 미국 특허 5,393,790, 미국 특허 5,466,823, 미국 특허 5,633,272, 및 미국 특허 5,932,598 (이들 모두 본원에 참고로 포함된다)에 개시되어 있는 NSAID를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 화합물과 조합되는 데 특히 유용한 COX-2의 억제제로는 3-페닐-4-(4-(메틸술포닐)페닐)-2-(5H)-푸라논; 및 5-클로로-3-(4-메틸술포닐)-페닐-2-(2-메틸-5-피리디닐)피리딘; 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함한다.
구체적인 COX-2 억제제로서 기술되어 있고, 따라서, 본 발명에서 유용한 화합물로는 파레콕시브, 셀레브렉스(CELEBREX)® 및 벡스트라(BEXTRA)® 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 화합물과 함께 조합하여 사용될 수 있는 혈관신생 억제제로는 엔도스타틴, 우크라인, 란피르나제, IM862, 5-메톡시-4-[2-메틸-3-(3-메틸-2-부테닐)옥시라닐]-1-옥사스피로[2,5]옥트-6-일(클로로아세틸)카르바메이트, 아세틸디나날린, 5-아미노-1-[[3,5-디클로로-4-(4-클로로벤조일)페닐]메틸]-1H-1,2,3-트리아졸-4-카복스아미드, CM101, 스쿠알라민, 콤브레타스타틴, RPI4610, NX31838, 황산화된 만노펜타오스 포스페이트, 7,7-(카르보닐-비스[이미노-N-메틸-4,2-피롤로카르보닐이미노[N-메틸-4,2-피롤]-카르보닐이미노]-비스-(1,3-나프탈렌 디술포네이트) 및 3-[(2,4-디메틸피롤-5-일)메틸렌]-2-인돌리논 (SU5416)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 화합물과 함께 조합하여 사용될 수 있는 티로신 키나제 억제제로는 N-(트리플루오로메틸페닐)-5-메틸이속사졸-4-카르복스아미드, 3-[(2,4-디메틸피롤-5-일)메틸리데닐)인돌린-2-온, 17-(알릴아미노)-17-데메톡시겔다나마이신, 4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-메톡시-6-[3-(4-모르폴리닐)프로폭실]퀴나졸린, N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)-4-퀴나졸린아민, BIBX1382, 2,3,9,10,11,12-헥사히드로-10-(히드록시메틸)-10-히드록시-9-메틸-9,12-에폭시-1H-디인돌로[1,2,3-fg:3',2',1'-kl]피롤로[3,4-i][1,6]벤조디아조신-1-온, SH268, 게니스테인, 이마티닙 (STI571), CEP2563, 4-(3-클로로페닐아미노)-5,6-디메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘메탄 술포네이트, 4-(3-브로모-4-히드록시페닐)아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린, 4-(4'-히드록시페닐)아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린, SU6668, STI571A, N-4-클로로페닐-4-(4-피리딜메틸)-1-프탈라진아민, 및 EMD121974를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
항암 화합물 이외의 화합물과의 조합물 또한 본 조성물 및 방법에 포함된다. 예를 들어, 청구된 본 화합물과 PPAR-γ (즉, PPAR-감마) 효능제 및 PPAR-δ (즉, PPAR-델타) 효능제와의 조합물이 특정 악성 종양 치료에 유용하다. PPAR-γ 및 PPAR-δ는 핵 퍼옥시솜 증식제 활성화된 수용체 γ 및 δ이다. 내피 세포 상에서의 PPAR-γ의 발현 및 그의 혈관신생에의 연루는 문헌에 보고되어 있다 (문헌 [J. Cardiovasc. Pharmacol. 31 :909-913 (1998)]; [J. Biol . Chem. 274:9116-9121 (1999)]; [Invest . Ophthalmol Vis . Sci . 41 :2309-2317 (2000)] 참조). 더욱 최근에, PPAR-γ 효능제는 시험관내에서 VEGF에 대한 혈관신생 반응을 억제하는 것으로 밝혀졌다; 트로글리타존 및 로시글리타존 말레에이트, 둘 모두 마우스의 망막 혈관신생 발생을 억제한다 (문헌 [Arch . Ophthamol. 119:709-717 (2001)]). 본 발명의 화합물과 함께 조합하여 사용될 수 있는 PPAR-γ 효능제 및 PPAR-γ/α 효능제의 예로는 티아졸리딘디온 (예컨대, DRF2725, CS-011, 트로글리타존, 로시글리타존, 및 피오글리타존), 페노피브레이트, 겜피브로질, 클로피브레이트, GW2570, SB219994, AR-H039242, JTT-501, MCC-555, GW2331, GW409544, NN2344, KRP297, NP0110, DRF4158, NN622, GI262570, PNU182716, DRF552926, 2-[(5,7-디프로필-3-트리플루오로메틸-1,2-벤즈이속사졸-6-일)옥시]-2-메틸 프로피온산 (USSN 09/782,856에 개시) 및 2(R)-7-(3-(2-클로로-4-(4-플루오로페녹시)페녹시)프로폭시)-2-에틸크로만-2-카르복실산 (USSN 60/235,708 및 60/244,697에 개시)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 암 치료를 위한 유전자 요법과 병용되는 개시된 본 화합물의 용도이다. 암 치료를 위한 유전적 전략법에 관한 개관을 위해, 문헌 [Hall et al. (Am J Hum Genet 61:785-789 (1997))] 및 [Kufe et al. (Cancer Medicine, 5th Ed, pp 876-889, BC Decker, Hamilton, 2000)]을 참조한다. 유전자 요법은 임의의 종양 억제 유전자를 전달하는 사용될 수 있다. 이러한 유전자의 예로는 재조합 바이러스-매개 유전자 전달을 통해 전달될 수 있는 것인 p53 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,069,134 참조), uPA/uPAR 길항제 (문헌 ["Adenovirus-Mediated Delivery of a uPA/uPAR Antagonist Suppresses Angiogenesis-Dependent Tumor Growth and Dissemination in Mices," Gene Therapy , August 5(8): 1105-13 (1998)]), 및 인터페론 감마 (문헌 [J. Immunol. 164:217-222 (2000)])를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 화합물은 또한 내재된 다중약물 내성 (MDR), 특히, 수송체 단백질의 고수준의 발현과 관련된 MDR의 억제제와 함께 조합되어 투여될 수 있다. 이러한 MDR 억제제로는 p-당단백질 (P-gp)의 억제제, 예컨대, LY335979, XR9576, OC144-093, R101922, VX853 및 PSC833 (발스포다르)을 포함한다.
본 발명의 화합물은 본 발명의 화합물을 단독으로 사용하거나 방사성 요법과 함께 사용하는 경우 유발될 수 있는 오심 또는 구토, 예를 들면, 급성, 지연, 말기 및 예기 구토를 치료하기 위한 항구토제와 함께 사용될 수 있다. 구토의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 화합물은 다른 항구토제, 특히, 뉴로키닌-1 수용체 길항제, 5HT3 수용체 길항제, 예컨대, 온단세트론, 그라니세트론, 트로피세트론 및 자티세트론, GABAB 수용체 효능제, 예컨대, 바클로펜, 코르티코스테로이드, 예컨대, 데카드론 (덱사메타손), 케날로그, 아리스토코르트, 나살리드, 프레페리드, 베네코르텐 등, 예컨대, 미국 특허 번호 2,789,118, 2,990,401, 3,048,581, 3,126,375, 3,929,768, 3,996,359, 3,928,326, 및 3,749,712에 개시되어 있는 것, 항도파민제, 예컨대, 페노티아진 (예를 들어, 프로클로르페라진, 플루페나진, 티오리다진 및 메조리다진), 메토클로프라미드 또는 드로나비놀과 함께 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 뉴로키닌-1 수용체 길항제, 5HT3 수용체 길항제 및 코르티코스테로이드로부터 선택되는 항구토제는 본 화합물의 투여시 유발될 수 있는 구토의 치료 또는 예방을 위한 아주반트로서 투여된다.
본 발명의 화합물과 함께 사용되는 뉴로키닌-1 수용체 길항제는 예를 들어, 미국 특허 번호 5,162,339, 5,232,929, 5,242,930, 5,373,003, 5,387,595, 5,459,270, 5,494,926, 5,496,833, 5,637,699, 5,719,147; 유럽 특허 공보 번호 EP 0 360 390, 0 394 989, 0 428 434, 0 429 366, 0 430 771, 0 436 334, 0 443 132, 0 482 539, 0 498 069, 0 499 313, 0 512 901, 0 512 902, 0 514 273, 0 514 274, 0 514 275, 0 514 276, 0 515 681, 0 517 589, 0 520 555, 0 522 808, 0 528 495, 0 532 456, 0 533 280, 0 536 817, 0 545 478, 0 558 156, 0 577 394, 0 585 913,0 590 152, 0 599 538, 0 610 793, 0 634 402, 0 686 629, 0 693 489, 0 694 535, 0 699 655, 0 699 674, 0 707 006, 0 708 101, 0 709 375, 0 709 376, 0 714 891, 0 723 959, 0 733 632 및 0 776 893; PCT 국제 특허 공개 번호 WO 90/05525, 90/05729, 91/09844, 91/18899, 92/01688, 92/06079, 92/12151, 92/15585, 92/17449, 92/20661, 92/20676, 92/21677, 92/22569, 93/00330, 93/00331, 93/01159, 93/01165, 93/01169, 93/01170, 93/06099, 93/09116, 93/10073, 93/14084, 93/14113, 93/18023, 93/19064, 93/21155, 93/21181, 93/23380, 93/24465, 94/00440, 94/01402, 94/02461, 94/02595, 94/03429, 94/03445, 94/04494, 94/04496, 94/05625, 94/07843, 94/08997, 94/10165, 94/10167, 94/10168, 94/10170, 94/11368, 94/13639, 94/13663, 94/14767, 94/15903, 94/19320, 94/19323, 94/20500, 94/26735, 94/26740, 94/29309, 95/02595, 95/04040, 95/04042, 95/06645, 95/07886, 95/07908, 95/08549, 95/11880, 95/14017, 95/15311, 95/16679, 95/17382, 95/18124, 95/18129, 95/19344, 95/20575, 95/21819, 95/22525, 95/23798, 95/26338, 95/28418, 95/30674, 95/30687, 95/33744, 96/05181, 96/05193, 96/05203, 96/06094, 96/07649, 96/10562, 96/16939, 96/18643, 96/20197, 96/21661, 96/29304, 96/29317, 96/29326, 96/29328, 96/31214, 96/32385, 96/37489, 97/01553, 97/01554, 97/03066, 97/08144, 97/14671, 97/17362, 97/18206, 97/19084, 97/19942 및 97/21702; 및 영국 특허 공개 번호 2 266 529, 2 268 931, 2 269 170, 2 269 590, 2 271 774, 2 292 144, 2 293 168, 2 293 169, 및 2 302 689에 충분히 기술되어 있다. 상기 화합물의 제조법은 상기 언급된 특허 및 공보에 충분히 기술되어 있고, 이들 특허 및 공보는 본원에서 참고로 포함된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 화합물과 함께 사용되는 뉴로키닌-1 수용체 길항제는 2-(R)-(1-(R)-(3,5-비스(트리플루오로메틸)-페닐)에톡시)-3-(S)-(4-플루오로페닐)-4-(3-(5-옥소-1H,4H-1,2,4-트리아졸로)메틸)모르폴린, 또는 그의 제약상 허용되는 염 (미국 특허 번호 5,719,147에 기술)으로부터 선택된다.
본 발명의 화합물은 또한 빈혈의 치료에 유용한 작용제와 함께 투여될 수 있다. 이러한 빈혈 치료제로는 예를 들어, 연속 적혈구생성 수용체 활성화제 (예컨대, 에포에틴 알파)가 있다.
본 발명의 화합물은 또한 호중구감소증의 치료에 유용한 작용제와 함께 투여될 수 있다. 이러한 호중구감소증 치료제로는 예를 들어, 호중구의 생성 및 기능을 조절하는 조혈 성장 인자, 예컨대, 인간 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF)가 있다. G-CSF의 예로는 필그라스팀 및 PEG-필그라스팀이 포함된다.
본 발명의 화합물은 또한 면역 증진 약물, 예컨대, 레바미졸, 이소프리노신 및 자닥신과 함께 투여될 수 있다.
다른 siNA 치료제와 함께 조합된 본 발명의 화합물은 또한 간 질환 또는 암을 치료 또는 예방하는 데 유용할 수 있다.
본 발명의 화합물은 또한 γ-세크레타제 억제제 및/또는 NOTCH 신호전달의 억제제와 함께 조합되어 투여될 수 있다. 상기 억제제로는 WO 01/90084, WO 02/30912, WO 01/70677, WO 03/013506, WO 02/36555, WO 03/093252, WO 03/093264, WO 03/093251, WO 03/093253, WO 2004/039800, WO 2004/039370, WO 2005/030731, WO 2005/014553, USSN 10/957,251, WO 2004/089911, WO 02/081435, WO 02/081433, WO 03/018543, WO 2004/031137, WO 2004/031139, WO 2004/031138, WO 2004/101538, WO 2004/101539 및 WO 02/47671 (LY-450139 포함)에 기술된 화합물이 포함된다.
본 발명의 화합물은 또한 PARP 억제제와 함께 조합되어 암을 치료 또는 예방하는 데 유용할 수 있다.
하기: 아바렐릭스 (플레낙시스(Plenaxis) 데포®); 알데스류킨 (프로킨(Prokine)®); 알데스류킨 (프로류킨(Proleukin)®); 알렘투주맙 (캠파스(Campath)®); 알리트레티오인 (판레틴(Panretin)®); 알로푸리놀 (질로프림(Zyloprim)®); 알트레타민민 (헥살렌(Hexalen)®); 아미포스틴 (에티올(Ethyol)®); 아나스트로졸 (아리미덱스(Arimidex)®); 삼산화비소 (트리세녹스(Trisenox)®); 아스파라기나제 (엘스파(Elspar)®); 아자시티딘 (비다자(Vidaza)®); 벤다무스틴 히드로클로라이드 (트린다(Treanda)®); 베바쿠지맙 (아바스틴(Avastin)®); 벡사로텐 캡슐 (타그레틴(Targretin)®); 벡사로텐 겔 (타그레틴®); 블레오마이신 (블레녹산(Blenoxane)®); 보르테조밉 (벨케이드(Velcade)®); 브레펠딘 A; 정맥용 부술판 (부술펙스(Busulfex)®); 경구용 부술판 (미레란(Myleran)®); 칼루스테론 (메토사르브(Methosarb)®); 카페시타빈 (젤로다(Xeloda)®); 카르보플라틴 (파라플라틴(Paraplatin)®); 카르무스틴 (BCNU®, BiCNU®); 카르무스틴 (글리아델(Gliadel)®); 폴리페프로산(Polifeprosan) 20을 포함하는 카르무스틴 인플란트 (글리아델 와퍼(Gliadel Wafer)®); 셀레콕시브 (셀레브렉스(Celebrex)®); 세툭시맙 (얼비툭스(Erbitux)®); 클로람부실 (류케란(Leukeran)®); 시스플라틴 (플라티놀(Platinol)®); 클라드리빈 (류스타틴(Leustatin)®, 2-CdA®); 클로파라빈 (클로라(Clolar)®); 시클로포스파미드 (시톡산(Cytoxan)®, 네오사르(Neosar)®); 시클로포스파미드 (시톡산 주사제(Cytoxan Injection)®); 시클로포스파미드 (시톡산 정제(Cytoxan Tablet)®); 시타라빈 (시토사-U(Cytosar-U)®); 시타라빈 리포솜 (데포Cyt(DepoCyt)®); 다카르바진 (DTIC-돔(Dome)®); 닥티노마이신, 악티노마이신 D (코스메겐(Cosmegen)®); 달테파린 나트륨 주사제 (프라그민(Fragmin)®); 다르베포에틴 알파 (아라네스프(Aranesp)®); 다사티닙 (스프라이셀(Sprycel)®); 다우노루비신 리포솜 (다누오좀(DanuoXome)®); 다우노루비신, 다우노마이신 (다우노루비신(Daunorubicin)®); 다우노루비신, 다우노마이신 (세루비딘(Cerubidine)®); 데가레릭스 (피르마곤(Firmagon)®); 데닐류킨 디프티톡스 (온탁(Ontak)®); 덱스라족산 (진카드(Zinecard)®); 덱스라족산 히드로클로라이드 (토텍(Totect)®); 디뎀닌 B; 17-DMAG; 도세탁셀 (탁소테레(Taxotere)®); 독소루비신 (아드리아마이신 PFS(Adriamycin PFS)®); 독소루비신 (아드리아마이신®, 루벡스(Rubex)®); 독소루비신 (아드리아마이신 PFS 주사제®); 독소루비신 리포솜 (독실(Doxil)®); 드로모스타놀론 프로피오네이트 (드로모스타놀론(Dromostanolone)®); 드로모스타놀론 프로피오네이트 (마스테론 주사제(Masterone Injection)®); 에쿨리주맙 주사제 (솔리리스(Soliris)®); 엘리엇(Elliott's) B 용액 (엘리엇 B 용액®); 엘트롬보팩 (프로막타(Promacta)®); 에피루비신 (엘렌스(Ellence)®); 에포에틴 알파 (에포겐(epogen)®); 엘로티닙 (타세바(Tarceva)®); 에스트라무스틴 (엠시트(Emcyt)®); 에티닐 에스트라디올; 에토포시드 포스페이트 (에토포포스(Etopophos)®); 에토포시드, VP-16 베페시드(Vepesid)®); 에베로리무스 정제 (아피니토르(Afinitor)®); 엑스메스탄 (아로마신(Aromasin)®); 페루모시톨 (페라헴 주사제(Feraheme Injection)®); 필그라스팀 (뉴포겐(Neupogen)®); 플록수리딘 (동맥내) (FUDR®); 플루다라빈 (플루다라빈(Fludara)®); 플루오로우라실, 5-FU (아드루실(Adrucil)®); 풀베스트란트 (파슬로덱스(Faslodex)®); 게피티닙 (이레사(Iressa)®); 겔다나마이신; 젬시타빈 (젬자(Gemzar)®); 겜투주맙 오조가미신 (마일로타그(Mylotarg)®); 고세렐린 아세테이트 (졸라덱스 임플란트(Zoladex Implant)®); 고세렐린 아세테이트 (졸라덱스®); 히스트렐린 아세테이트 (히스트렐린 임플란트(Histrelin implant)®); 히드록시우레아 (히드리아(Hydrea)®); 이브리투모맙 티욱세탄 (제발린(Zevalin)®); 이다루비신 (이다마이신(Idamycin)®); 이포스파미드 (IFEX®); 이마티닙 메실레이트 (글리벡(Gleevec)®); 인터페론 알파 2a (로페론 A(Roferon A)®); 인터페론 알파-2b (인트론 A(Intron A)®); 이오벤구안 I 123 주사제 (아드레뷰(AdreView)®); 이리노테칸 (캄토사(Camptosar)®); 익사베필론 (익셈프라(Ixempra)®); 라파티닙 정제 (타이커브(Tykerb)®); 레날리도미드 (레브리미드(Revlimid)®); 레트로졸 (페마라(Femara)®); 류코보린 (웰코보린(Wellcovorin)®, 류코보린(Leucovorin)®); 류프롤리드 아세테이트 (엘리가드(Eligard)®); 레바미솔 (에르가솔(Ergamisol)®); 로무스틴, CCNU (CeeBU®); 메클로레타민, 질소 머스타드 (무스타젠(Mustargen)®); 메게스트롤 아세테이트 (메게이스(Megace)®); 멜파란, L-PAM (Alkeran®); 메르캅토퓨린, 6-MP (퓨리네톨(Purinethol)®); 메스나 (메스넥스(Mesnex)®); 메스나 (메스넥스 정제®); 메토트렉세이트 (메토트렉세이트(Methotrexate)®); 메톡스살렌 (우바덱스(Uvadex)®); 8-메톡시소랄렌; 미토마이신 C (무타마이신(Mutamycin)®); 미토탄 (리소드렌(Lysodren)®); 미톡산트론 (노반트론(Novantrone)®); 미트라마이신; 난드롤론 펜프로피오네이트 (듀라보린-50(Durabolin-50)®); 넬라라빈 (아레논(Arranon)®); 닐로티닙 (타시그나(Tasigna)®); 노페투모맘 (벨루마(Verluma)®); 오파투무맙 (아제라(Arzerra)®); 오프렐베킨 (뉴메가(Neumega)®); 옥살리플라틴 (엘록사틴(Eloxatin)®); 파클리탁셀(팍센(Paxene)®); 파클리탁셀 (탁솔(Taxol)®); 파클리탁셀 단백질 결합 입자 (아브락산(Abraxane)®); 팔리퍼민 (케피반스(Kepivance)®); 파미드로네이트 (아레디아(Aredia)®); 파니투무맙 (벡티빅스(Vectibix)®); 파조파닙 정제 (보트리엔틈(Votrienttm)®); 페가데마제 (아다겐(Adagen) (페가데마제 보빈(Pegademase Bovine))®); 페가스파르가제 (온카스파르(Oncaspar)®); 페그필그라스팀 (뉴라스타(Neulasta)®); 페메트렉세드 이나트륨 (알림타(Alimta)®); 펜토스타틴 (니펜트(Nipent)®); 피포브로만 (베르사이트(Vercyte)®); 플레릭사포르 (모조빌(Mozobil)®); 플리카마이신, 미트마이신 (미트라신(Mithracin)®); 포르피머 나트륨 (포토프린(Photofrin)®); 프랄라트렉세이트 주사제 (폴로틴(Folotyn)®); 프로카르바진 (마툴란(Matulane)®); 퀴나크린 (아타브린(Atabrine)®); 라파마이신; 라스부리카제 (엘리테크(Elitek)®); 랄록시펜 히드로클로라이드 (에비스타(Evista)®); 리툭시맙 (리툭산(Rituxan)®); 로미뎁신 (이스토닥스(Istodax)®); 로미프롤스팀 (엔플레이트(Nplate)®); 사르그라모스팀 (류킨(Leukine)®); 사르그라모스팀 (프로킨(Prokine)®); 소라페닙 (넥사바(Nexavar)®); 스트렙토조신 (자노사(Zanosar)®); 수니티닙 말레에이트 (수텐트(Sutent)®); 활석 (스클레로졸(Sclerosol)®); 타목시펜 (놀바덱스(Nolvadex)®); 테모졸로미드 (테모다르(Temodar)®); 템시로리무스 (토리셀(Torisel)®); 테니포시드, VM-26 (부몬(Vumon)®); 테스토락톤 (테스락(Teslac)®); 티오구아닌, 6-TG (티오구아닌(Thioguanine)®); 티오퓨린; 티오테파 (티오플렉스(Thioplex)®); 토포테칸 (히캄틴(Hycamtin)®); 토레미펜 (파레스톤(Fareston)®); 토시투모맙 (벡사®); 토시투모맙/I-131 토시투모맙 (벡사®); 트랜스-레티노산; 트라스투주맙 (허셉틴(Herceptin)®); 트레티노인, ATRA (베사노이드(Vesanoid)®); 트리에틸렌멜라민; 우라실 머스타드 (우라실 머스타드 캡슐스(Uracil Mustard Capsules)®); 발루비신 (발스타(Valstar)®); 빈블라스틴 (벨반(Velban)®); 빈크리스틴 (온코빈(Oncovin)®); 비노렐빈 (나벨빈(Navelbine)®); 보리노스타트 (졸린자(Zolinza)®); 보르트만닌; 및 졸레드로네이트 (조메타(Zometa)®)와 함께 조합된 본 발명의 화합물은 또한 암을 치료하는 데 유용할 수 있다.
상기 언급된 조합물은 제약 제제의 형태로 사용되도록 편리하게 제공될 수 있고, 따라서, 제약상 허용되는 희석제 또는 담체와 함께 상기 정의된 바와 같은 조합물을 포함하는 제약 조성물은 본 발명의 추가의 측면을 나타낸다.
이러한 조합물의 개개의 화합물들은 별개의 또는 조합된 제약 제제로 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 개개의 화합물들은 조합된 제약 제제 중에서 동시에 투여될 것이다.
따라서, 기술된 분자는 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 대상체 또는 유기체에서 본원에 기술된 질환, 장애, 병태, 및 특질을 예방 또는 치료하기 위한 하나 이상의 공지된 화합물, 치료법, 또는 방법과 함께, 예컨대, 다른 HBV 억제제와 함께 병용하여 사용될 수 있다.
3. 치료학적 적용
HBV 연구에서의 현 지식 체계는 치료 용도를 위해 HBV 발현을 조절할 수 있는 방법이 필요하다는 것을 시사한다.
따라서, 본 발명의 한 측면은 HBV 유전자 발현의 작용에 의해 매개된 HBV 감염 또는 병태를 앓는 대상체에게 유효량의 본 발명의 이중 가닥 siNA 분자를 투여하는 것을 포함하는, HBV 유전자 발현의 작용에 의해 매개된 HBV 감염 또는 병태를 앓는 인간을 포함하나, 이에 한정되지 않는 대상체를 치료하는 방법을 포함한다. 본 측면의 한 실시양태에서, siNA 분자는 서열 1, 서열 452, 서열 2, 서열 453, 서열 3, 서열 454, 서열 4, 또는 서열 455의 15개 이상의 뉴클레오티드 서열; 또는 식 (A)를 포함한다.
본 측면의 일부 실시양태에서, 병태는 암이다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명의 분자 및 조성물은 암을 치료하는 방법에서, 및 특히, 간세포 암종 (HCC)을 치료하는 방법에서 유용하다.
일부 실시양태에서, 병태는 간 질환이다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명의 분자 및 조성물은 간 질환을 치료하는 방법에서, 및 특히, 간의 간경변을 치료하는 방법에서 유용하다.
특정 실시양태에서, siNA 분자의 투여는 국소 투여 또는 전신 투여를 통해 이루어진다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 관련 조직 또는 세포로의, 예컨대, 폐 세포 및 조직으로의 국소 투여를 통해, 예컨대, 폐 전달을 통해 대상체 또는 유기체를 본 발명의 siNA 분자와 접촉시키는 것을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 대상체 또는 유기체에서 관련 조직 또는 세포로의, 예컨대, 간 또는 암성 조직 또는 세포로의 전신 투여를 통해 (예컨대, siNA의 정맥내 또는 피하 투여를 통해) 대상체 또는 유기체를 본 발명의 siNA 분자와 접촉시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 siNA 분자는 또한 생체외 적용에서 시약으로서 사용된다. 예를 들어, siNA 시약은 치료 효과를 위해서 대상체에게 이식되는 조직 또는 세포로 도입된다. 상기 세포 및/또는 조직은 추후에 해당 체외 이식편을 수용받을 유기체 또는 대상체로부터 유래된 것일 수 있거나, 이식 전에 또 다른 유기체 또는 대상체로부터 유래된 것일 수 있다. siNA 분자는 세포 또는 조직이 원하는 표현형을 획득하거나, 생체내 이식되는 경우에 기능을 수행할 수 있도록 세포 또는 조직내 하나 이상의 유전자의 발현을 조절하는 데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 환자로부터의 특정 HBV 표적 세포를 추출한다. 이러한 추출된 세포를 세포 내에서 이들 세포에 의한 siNA의 흡수에 적합한 조건하에 특이 뉴클레오티드 서열을 표적으로 하는 HBV siNA와 (예컨대, 전달 시약, 예컨대, 양이온성 지질, 리포솜 등을 사용하거나, 예컨대, 전기천공과 같이 siNA를 세포로 전달하는 것을 촉진시키는 기법을 이용하여) 접촉시킨다. 이어서, 상기 세포를 동일 환자 또는 다른 환자에게 다시 재도입한다.
치료학적 적용을 위해, 제약상 유효 용량의 본 발명의 siNA 분자 또는 제약 조성물을 대상체에게 투여한다. 제약상 유효 용량은 질환 상태를 예방, 그의 발병을 억제, 또는 그를 치료하는 데 (증상을 어느 정도, 바람직하게는 모든 증상을 완화시키는 데) 필요한 용량이다. 당업자는 예컨대, 대상체의 크기 및 체중, 질환의 진행 또는 침투 정도, 대상체의 연령, 건강 상태, 및 성별, 투여 경로, 및 투여가 국부 투여인지 또는 전신 투여인지 여부과 같은 인자를 고려함으로써 주어진 대상체에게 투여되는 본 발명의 siNA의 치료 유효 용량을 쉽게 결정할 수 있다. 일반적으로, 음으로 하전된 중합체의 효력에 의존하여, 활성 성분은 0.1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg (체중)/일의 양으로 투여된다. 최적의 투여 스케줄은 환자 체내에서의 약물 축적량의 측정으로부터 계산될 수 있다. 본 발명의 siNA 분자는 단일 용량 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다.
본 발명의 siNA 분자는 월 1회, 주 1회, 1일 1회 (QD)로 투여되거나, 예를 들어, 제한하는 것은 아니지만, 월당, 주당, 또는 일당 다중 용량으로, 예컨대, 1일 2회 (BID), 1일 3회 (TID), 매 2주마다 1회인 것과 같이 분할 투여될 수 있다. 당업자는 체액 또는 조직 중 약물의 체류 시간 및 농도에 관한 측정치에 기초하여 반복 투여 속도를 쉽게 추정할 수 있다.
추가로, 투여는 연속, 즉, 매일, 또는 간헐적으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화합물의 간헐적 투여는 주당 1 내지 6일 수행될 수 있거나, 또는 이는 주기적으로 투여하는 것 (예컨대, 연속하여 2 내지 8주간 매일 투여한 후, 최대 1주 동안 투여하지 않는 휴지기를 가지는 것)을 의미할 수 있거나, 또는 격일로 투여하는 것을 의미할 수 있다.
G. 투여
조성물 또는 제제는 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 본 발명의 투여 방법에 관한 비제한적인 예로는 경구, 협측, 설하, 비경구 (즉, 동맥내로, 정맥내로, 복강내로, 피하로, 또는 근육내로), 국소 직장 투여 또는 다른 국소 투여를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 취입 및 흡입에 의해 투여될 수 있다. 투여는 단일 용량 또는 분할된 용량으로 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 볼루스 주사에 의해 정맥내로 또는 복강내로 투여된다 (예컨대, 미국 특허 번호 5,286,634 참조)). 지질 핵산 입자는 환부에의 직접 주사에 의해, 또는 환부로부터 떨어져 있는 부위에의 주사에 의해 투여될 수 있다 (예컨대, 문헌 [Culver, HUMAN GENE THERAPY, MaryAnn Liebert, Inc., Publishers, New York. pp. 70-71(1994)] 참조). 한 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자 및 그의 제제 또는 조성물은 본원에 기술되어 있고, 일반적으로는 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 세포, 대상체, 또는 유기체에게 투여된다.
1. 생체내 투여
본 발명의 임의의 치료 방법에 있어서, siNA는 단독으로 단일요법으로서 또는 본원에 기술되어 있거나 당업계에 공지되어 있는 바와 같은 추가의 요법과 함께 병용하여, 본원에 기술된 바와 같거나 또는 다르게는 당업계에 공지되어 있는 바와 같이 대상체에게 전신 투여될 수 있다. 전신 투여는 당업계에 공지되어 있는 바와 같은, 예를 들어, 폐 (흡입, 연무 등), 정맥내, 피하, 근육내, 카테터삽입, 비인두, 경피 또는 경구/위장관 투여를 포함할 수 있다.
본 발명의 임의의 치료 또는 예방 방법에 있어서, siNA는 단독으로 단일요법으로서 또는 당업계에 공지되어 있는 바와 같은 추가의 요법과 함께 병용하여, 본원에 기술된 바와 같거나 또는 다르게는 당업계에 공지되어 있는 바와 같이 대상체에게 국소적으로 또는 국소 조직에 투여될 수 있다. 국소 투여는 일반적으로 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 예를 들어, 흡입, 연무, 카테터삽입, 이식, 직접 주사, 진피/경피 적용, 패취, 스텐트 설치, 점이제/점안제, 또는 관련 조직으로의 문맥 투여, 또는 임의의 다른 국소 투여 기법, 방법 또는 절차를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자 및 그의 제제 또는 조성물은 일반적으로 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 간으로 투여된다 (예를 들어, 문헌 [Wen et al., 2004, World J Gastroenterol ., 10, 244-9]; [Murao et al., 2002, Pharm Res., 19, 1808-14]; [Liu et al., 2003, gene Ther ., 10, 180-7]; [Hong et al., 2003, J Pharm Pharmacol , 54, 51-8]; [Herrmann et al., 2004, Arch Virol , 149, 1611-7]; 및 [Matsuno et al., 2003, gene Ther ., 10, 1559-66] 참조).
한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 siNA 분자를 단핵구 및 림프구를 비롯한, 조혈 세포로 전달하는 방법의 용도를 특징으로 한다. 이러한 방법은 문헌 [Hartmann et al., 1998, J Phamacol . Exp . Ther ., 285(2), 920-928]; [Kronenwett et al., 1998, Blood, 91(3), 852-862]; [Filion and Phillips, 1997, Biochim . Biophys. Acta ., 1329(2), 345-356]; [Ma and Wei, 1996, Leuk . Res ., 20(11/12), 925-930]; 및 [Bongartz et al., 1994, Nucleic Acids Research , 22(22), 4681-8]에 상세하게 기술되어 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자 및 그의 제제 또는 조성물은 일반적으로 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 진피로 또는 여포로 직접 또는 국부적으로 (예컨대, 국소적으로) 투여된다 (예를 들어, 문헌 [Brand, 2001, Curr . Opin . Mol. Ther ., 3, 244-8]; [Regnier et al., 1998, J Drug 표적, 5, 275-89]; [Kanikkannan, 2002, BioDrugs , 16, 339-47]; [Wraight et al., 2001, Pharmacol . Ther., 90, 89-104]; 및 [Preat and Dujardin, 2001, STP PharmaSciences , 11, 57-68] 참조). 한 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자 및 그의 제제 또는 조성물은 알콜 (예컨대, 에탄올 또는 이소프로판올), 물을 포함하고, 임의로는 추가의 작용제, 예로서, 이소프로필 미리스테이트 및 카르보머 980을 포함하는 수성알콜성 겔 제제를 사용하여 직접 또는 국부적으로 투여된다. 다른 실시양태에서, siNA는 비강으로 국부적으로 투여될 수 있도록 제제화된다. 국부용 제제는 환부에 1일당 1회 이상으로 적용시킴으로써 투여될 수 있고; 피부 부위에 밀봉 드레싱을 사용하는 것이 유리할 수 있다. 연속 또는 장기간 전달은 점착성 저장 시스템에 의해 달성될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 예를 들어, 특정 기관 또는 구획 (예컨대, 눈, 눈 뒷부분, 심장, 간, 신장, 방광, 전립선, 종양, CNS 등)에 이온영동적으로 투여된다. 이온영동 전달에 관한 비제한적인 예는 예를 들어, WO 03/043689 및 WO 03/030989 (상기 문헌의 전문이 본원에 참고로 포함된다)에 기술되어 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자 및 그의 제제 또는 조성물은 본원에 기술된 바와 같이, 및 일반적으로 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 폐로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자 및 그의 제제 또는 조성물은 미국 특허 공개 번호 2006/0062758; 2006/0014289; 및 2004/0077540에 기술되어 있는 바와 같이, 폐 조직 및 세포로 투여된다.
2. 에어로졸 및 전달 장치
a. 에어로졸 제제
본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 다른 적합합 성분과 함께 조합하여 흡입에 의해 (예컨대, 비내로 또는 기관내로) 투여되는 에어로졸 제제로 제조될 수 있다 (즉, 이는 "연무화될 수 있다") (문헌 [Brigham et al., Am . J. Sci ., 298:278 (1989)] 참조). 에어로졸 제제는 허용되는 가압형 추진제, 예컨대, 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등에 배치될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자 및 그의 제제는 예컨대, 흡입 장치 또는 연무기에 의해 투여되는 에어로졸 또는 분무 건조된 제제의 흡입과 같은 폐 전달을 통해 투여되어, 관련 폐 조직으로 핵산 분자가 신속하게 국소적으로 흡수될 수 있다. 미분화된 핵산 조성물의 호흡가능한 건조 입자를 함유하는 고체 미립자 조성물은, 건조되거나 동결건조된 핵산 조성물을 분쇄한 후, 미분화된 조성물을 예를 들어, 400 메쉬 스크린을 통해 통과시켜 큰 응집물을 분해하거나 분리시킴으로써 제조될 수 있다. 본 발명의 siNA 조성물을 포함하는 고체 미립자 조성물은 에어로졸 뿐만 아니라, 다른 치료 화합물의 형성을 촉진시키는 역할을 하는 분산액을 임의로 함유할 수 있다. 적합한 분산액은 락토스이고, 이는 1 대 1의 중량비와 같은 임의의 적합한 비율로 핵산 화합물과 블렌딩될 수 있다.
본 발명의 siNA 분자 또는 조성물을 포함하는 분무 조성물은 예를 들어, 적합한 액화 추진제를 사용하여 가압형 팩, 예컨대, 계량된 용량 흡입기로부터 전달되는 수용액 또는 현탁액 또는 에어로졸로서 제제화될 수 있다. 한 실시양태에서, 흡입에 적합한 본 발명의 에어로졸 조성물은 현탁액 또는 용액일 수 있고, 일반적으로 서열 1, 서열 452, 서열 2, 서열 453, 서열 3, 서열 454, 서열 4, 또는 서열 455의 15개 이상의 뉴클레오티드 서열; 또는 식 (A)를 포함하는 siNA 분자 및 적합한 추진제, 예컨대, 플루오로카본 또는 수소 함유 클로로플루오로카본 또는 그의 혼합물, 특히, 히드로플루오로알칸, 특히, 1,1,1,2-테트라플루오로에탄, 1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로-n-프로판 또는 그의 혼합물을 함유한다. 에어로졸 조성물은 당업계에 주지된 추가의 제제화 부형제, 예컨대, 계면활성제를 임의로 함유할 수 있다. 비제한적인 예로 올레산, 레시틴 또는 올리고락트산 또는 유도체, 예컨대, WO 94/21229 및 WO 98/34596에 기술된 것 및 공용매, 예를 들어, 에탄올을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 제약 에어로졸 제제는 본 발명의 화합물 및 추진제로서의 플루오로카본 또는 수소 함유 클로로플루오로카본 또는 그의 혼합물을 임의로는 계면활성제 및/또는 공용매와 함께 조합하여 포함한다.
본 발명의 에어로졸 제제는 적합한 완충제의 첨가에 의해 완충될 수 있다.
에어로졸 제제는, 제제가 멸균 제조되지 않은 경우, 보존제를 비롯한 임의적 첨가제를 포함할 수 있다. 비제한적인 예로는 메틸 히드록시벤조에이트, 항산화제, 향미제, 휘발성 오일, 완충제 및 유화제, 및 다른 제제 계면활성제를 포함한다. 한 실시양태에서, 플루오로카본 또는 퍼플루오로카본 담체는 분해를 감소시키는데 사용되며, 보다 안전한 본 발명의 생체적합성 비-액체 미립자 현탁액 조성물 (예를 들어, siNA 및/또는 그의 LNP 제제)을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 연무기를 포함하는 장치는 정균성인 플루오로화학물질을 포함하는 본 발명의 조성물 (예를 들어, siNA 및/또는 그의 LNP 제제)을 전달하며, 이로써 상용성 장치에서의 미생물 성장의 잠재성을 감소시킨다.
흡입기 또는 취입기에서 사용하기 위한, 본 발명의 조성물을 포함하는 캡슐 및 카트리지, 예를 들어, 젤라틴으로 된 것은 본 발명의 화합물 및 적합한 분말 기제, 예컨대, 락토스 또는 전분의 흡입을 위한 분말 믹스를 함유하도록 제제화될 수 있다. 한 실시양태에서, 각각의 캡슐 또는 카트리지는 서열 1, 서열 452, 서열 2, 서열 453, 서열 3, 서열 454, 서열 4, 또는 서열 455의 15개 이상의 뉴클레오티드 서열; 또는 식 (A)를 포함하는 siNA 분자, 및 하나 이상의 부형제를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 부형제, 예컨대, 락토스없이 제공될 수 있다.
본 발명의 에어로졸 조성물은 호흡가능한 크기의 입자, 예컨대, 흡입시 코, 입, 및 후두를 통과하고, 기관지 및 폐의 폐포를 통과할 수 있을 정도로 충분히 작은 크기의 입자를 비롯한 제제로서 호흡계 내로 투여될 수 있다. 일반적으로, 호흡가능한 입자의 크기는 약 0.5 내지 10 ㎛ 범위이다. 한 실시양태에서, 미립자는 1 내지 5 ㎛ 범위일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 미립자는 2 내지 3 ㎛ 범위일 수 있다. 에어로졸 중에 포함되는 비-호흡가능한 크기의 입자는 목에 침착되기 쉽고, 이를 삼켜야 하는 성질을 가지고 있는 바, 따라서, 에어로졸 중의 비-호흡가능한 입자의 양은 최소화된다. 비내 투여를 위해서는 비강내에 확실히 잔류할 수 있도록 10-500 um 범위의 입자 크기인 것이 바람직하다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 siNA 조성물은 예를 들어, 비염 치료를 위해서 코에 국부적으로, 가압 펌프에 의해 코에 투여되는 가압 에어로졸 제제를 통해 또는 연무에 의해 투여된다. 적합한 제제는 본 목적을 위해 희석제 또는 담체로서 물을 함유한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물을 폐 또는 코에 투여하기 위한 수성 제제는 통상의 부형제, 예컨대, 완충제, 등장성 개질제 등과 함께 제공될 수 있다.
b. 장치
본 발명의 siNA 분자는 상기 논의된 바와 같은 입자 및/또는 에어로졸로서 제제화되고 전달될 수 있고, 당업자가 알고 있는 각종의 에어로졸화 장치로부터 분산될 수 있다.
본 발명의 siNA 분자 또는 제제를 포함하는 액체 또는 비-액체 입자로 된 에어로졸은 임의의 적합한 수단에 의해, 예컨대, 연무기를 포함하는 장치 (예를 들어, 미국 특허 4,501,729 참조), 예컨대, 초음파 또는 공기 분사 연무기로 제조될 수 있다.
본 발명의 siNA 분자 또는 제제 및 계면활성제를 포함하는 고체 입자 에어로졸은 임의의 고체 미립자 에어로졸 발생기로 제조될 수 있다. 본 발명의 siNA 분자와 함께 사용되는 고체 입자 에어로졸 발생기의 한 유형으로는 취입기가 있다. 예시적인 에어로졸 발생기의 2번째 유형으로는 계량된 용량 흡입기 ("MDI")를 포함한다. 본원에 교시된 siNA 분자 또는 제제를 함유하는 MDI는 당업계의 방법에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Byron, 상기 문헌 동일] 및 WO 96/32099 참조).
siNA 분자는 예컨대, WO 05/044354에 기술되어 예시되어 있는 것과 같은, 유체 분배기로부터의 전달을 위한 유체 제제로서 제제화될 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 연무기 장치는 모든 연령대의 의식이 있는 자발적으로 호흡하는 대상체 및 환기가 제어되는 대상체에 대한 적용에 이용된다. 연무기 장치는 폐로의 표적화된 국부 약물 전달 및 전신 약물 전달에 이용될 수 있다. 한 실시양태에서, 연무기를 포함하는 장치는 본 발명의 siNA 분자 또는 제제를 폐 또는 폐 조직으로 국소 전달하는데 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 연무기를 포함하는 장치는 본 발명의 siNA 분자 또는 제제를 전신 전달하는데 사용된다.
H. 본 발명의 siNA 분자의 다른 적용/용도
본 발명의 siNA 분자는 또한 진단학적 적용, 연구 적용, 및/또는 의약 제조를 위해서도 사용될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 대상체에서 질환, 특징, 또는 병태를 진단하는 데 적합한 조건하에서 대상체에게 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 질환, 특징, 또는 병태를 진단하는 방법을 특징으로 한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 대상체 또는 유기체에서 특질, 질환 또는 병태와 관련되는 반수체형 다형태로부터 유발되는 HBV 단백질의 발현을 하향조절하거나 억제시키는 데 사용된다. HBV 유전자, 또는 HBV 단백질 또는 RNA 수준 분석을 사용하여 상기 다형태를 가진 대상체, 또는 본원에 기술된 특질, 병태, 또는 질환이 발병될 위험이 있는 상기와 같은 대상체를 확인할 수 있다. 이러한 대상체는 치료법, 예를 들어, 본 발명의 siNA 분자 및 표적 유전자 발현과 관련된 질환을 치료하는 데 유용한 임의의 다른 조성물을 사용한 치료법을 잘 받아들인다. 따라서, HBV 단백질 또는 RNA 수준 분석을 사용함으로써 대상체를 치료하는 데 있어서 치료법의 유형 및 요법 과정을 결정할 수 있다. HBV 단백질 (예컨대, B형 간염 코어 항원, 또는 HbcAg), HBV 표면 항원 (예컨대, HBsAg) 또는 RNA 수준을 모니터링하는 것을 사용함으로써 치료 결과를 예측할 수 있고, 특질, 장애, 병태, 또는 질환과 관련된 특정의 HBV 단백질의 수준 및/또는 활성을 조절하는 화합물 및 조성물의 효능을 측정할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 의약 제조에서 사용하기 위한, 본 발명에 따른 이중 가닥 핵산의 용도를 포함한다. 한 실시양태에서, 의약은 HBV의 작용에 의해 매개되는 HBV 감염 또는 병태를 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 한 실시양태에서, 의약은 HBV 감염을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 의약은 암을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 간세포 암종을 치료하는 데 유용하다. 한 실시양태에서, 의약은 간 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 간의 간경변을 치료하는 데 유용하다.
특정 실시양태에서, 1 이상의 가닥이 서열 1, 서열 452, 서열 2, 서열 453, 서열 3, 서열 454, 서열 4, 또는 서열 455의 15개 이상의 뉴클레오티드 서열; 또는 식 (A)를 포함하는 것인 siNA는 HBV 감염을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 것이다.
특정 실시양태에서, 1 이상의 가닥이 서열 1, 서열 452, 서열 2, 서열 453, 서열 3, 서열 454, 서열 4, 또는 서열 455의 15개 이상의 뉴클레오티드 서열; 또는 식 (A)를 포함하는 것인 siNA는 암을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 것이다.
특정 실시양태에서, 1 이상의 가닥이 서열 1, 서열 452, 서열 2, 서열 453, 서열 3, 서열 454, 서열 4, 또는 서열 455의 15개 이상의 뉴클레오티드 서열; 또는 식 (A)를 포함하는 것인 siNA는 간 질환을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 것이다.
I. 실시예
이제 본 발명은 하기의 비제한적인 실시예를 통해 설명될 것이다. 중요하지 않은 다양한 파라미터를 변형 또는 수정함으로써 본질적으로는 같은 결과를 얻을 수 있다는 것을 당업자는 쉽게 이해할 것이다.
실시예 1: HBV에 대해 활성을 띠는 siNA의 디자인, 합성, 및 확인
HBV siNA 합성
일련의 siNA 분자를 디자인하고, 합성하고, HBV 유전자 발현에 대한 효능에 대해 평가하였다. HBV 서열을 디자인하고, HBV 게놈 혈청형 adw2 (등록 번호 X02763)로부터 19개의 가능한 모든 뉴클레오티드 서열을 선택한 후, 이들 서열을 표 7에 제시되어 있는 22개의 다른 HBV 서브타입의 게놈 서열과 비교함으로써 선별하였다. 22개의 게놈 모두와 완벽하게 매치되거나, 22개의 게놈 중 21개와 완벽하게 매치되고 나머지 게놈에 대해서는 1 또는 2개의 미스매치를 이루는 19개의 뉴클레오티드 서열을 보유하였다. 이들 서열을 표준 필터 (예컨대, 인간 게놈에 대해 표적에서 벗어남, 같은 염기의 진행, 인간 miRNA 시드 서열에의 매치)에 가하였다 (또한, 디자인 방법 및 표준 필터에 관해 미국 출원 번호 60/182,605 참조). 나머지 후보 물질은 독점 침묵화 예측 점수에 의해 분류하고, 특정 서열을 선택하였다.
인간 siNA에 대한 HBV 서열을 디자인하기 위한 1차 기준은 (i) 다중 HBV 유전자형 및 혈청형 사이의 상동성 및 (ii) 독점 알고리즘에 의해 측정된 바, 높은 효능 점수였다. 선택된 siNA의 표적 서열은 표 1a (표적 서열)에 기재되어 있다. 표 1a의 표적 서열에 상응하는 siNA 서열의 센스 및 안티센스 가닥은 표 1b에 기재되어 있다. 합성된 다양한 화학적으로 변형된 siNA는 표 1c에 기재되어 있다.
<표 1a>
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
<표 1b>
Figure pct00014
Figure pct00015
표적 서열의 각각의 올리고뉴클레오티드를 위해, siNA의 2개의 개개의 상보적 가닥을 고체상 합성을 이용하여 개별적으로 합성한 후, 역상 고체상 추출 (SPE)에 의해 개별적으로 정제하였다. 상보적 가닥을 어닐링하여 이중 가닥 (이중체)을 형성하고, 원하는 농도로 선택된 완충제 중에서 전달하였다.
간략하면, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 당업계에 공지된 바와 같이 자동화된 고체상 합성기에서 포스포라미다이트 화학을 이용하여 합성하였다 (예를 들어, 미국 출원 번호 12/064,014 참조). 합성 칼럼을 (천연 또는 화학적으로 변형된) 제1 뉴클레오시드 잔기로 유도체화된 고체 지지체로 팩킹하였다. 산 불안정성 5'-O-디메톡시트리틸 기의 탈트리틸화에 의해 합성을 개시하여, 5'-히드록실을 유리시켰다. 적합하게 보호된 포스포라미다이트 및 아세토니트릴 중 적합한 활성화제를 합성 칼럼에 동시에 전달하여, 아미다이트를 5'-히드록실에 커플링시켰다. 이어서, 칼럼을 용매, 예컨대, 아세토니트릴로 세척하였다. 산화 용액, 예컨대, 아이오딘 용액을 칼럼을 통해 펌핑하여 포스파이트 트리에스테르 연결기 P(III)를 그의 포스포트리에스테르 P(V) 유사체로 산화시켰다. 미반응 5'-히드록실 기를 2,6-루티딘 및 N-메틸이미다졸의 존재하에 시약, 예컨대, 아세트산 무수물을 이용하여 캡핑하였다. 신장 주기는 다음 포스포라미다이트 도입을 위한 탈트리틸화 단계로 재개되었다. 원하는 서열이 합성될 때까지 상기 공정을 반복하였다. 합성은 최종 5' 말단 보호기 (트리틸 또는 5'-O-디메톡시트리틸)에 의해 종료되었다.
합성 완료시, 고체-지지체 및 회합된 올리고뉴클레오티드를 아르곤 압력 또는 진공하에 건조시켰다. 수성 염기를 첨가하고, 혼합물을 가열하여, 숙시닐 연결기의 절단, 시아노에틸 포스페이트 보호기의 제거 및 엑소시클릭 아민 보호의 탈보호를 달성하였다.
하기 공정은 리보뉴클레오티드를 함유하지 않은 단일 가닥에서 수행되었다. 고체 지지체를 수성 염기로 처리한 후, 혼합물을 여과하여 탈보호된 조 합성 물질로부터 고체 지지체를 분리하였다. 이어서, 고체 지지체를 물로 세정하고, 이를 여과물과 합하였다. 생성된 염기성 용액이 5'-O-디메톡시트리틸 기를 보유하도록 하여 5' 말단 위치에 (트리틸-온) 잔류시켰다.
리보뉴클레오티드를 함유하는 단일 가닥을 위해, 하기 공정을 수행하였다. 고체 지지체를 수성 염기로 처리한 후, 혼합물을 여과하여 탈보호된 조 합성 물질로부터 고체 지지체를 분리하였다. 이어서, 고체 지지체를 디메틸술폭시드 (DMSO)로 세정하고, 이를 여과물과 합하였다. 플루오라이드 시약, 예컨대, 트리에틸아민 트리히드로플루오라이드를 혼합물에 첨가하고, 용액을 가열하였다. 적합한 완충제로 반응을 켄칭시켜 최종 5' 말단 위치 상에 5'-O-디메톡시트리틸 기를 가진 조 단일 가닥의 용액을 제공하였다.
각각의 조 단일 가닥의 트리틸-온 용액을 크로마토그래피 정제, 예컨대, SPE RPC 정제를 이용하여 정제하였다. 트리틸 기의 소수성 성질을 통해 비-트리틸화된 말단절단형의 불이행 서열에 비해 원하는 전장의 올리고물이 더 강하게 유지될 수 있다. 상기 불이행 서열을 적합한 용매, 예컨대, 저비율의 아세토니트릴을 이용하여 수지로부터 선택적으로 세척하였다. 이어서, 보유된 올리고뉴클레오티드를 트리플루오로아세트산에 의해 칼럼 상에서 탈트리틸화시켜 산 불안정성 트리틸 기를 제거하였다. 나머지 산을 칼럼으로부터 세척하고, 염 교환을 수행하고, 물질의 최종 탈염을 개시하였다. 전장의 올리고물은 수성 유기 용매를 사용하여 정제된 형태로 회수하였다. 이어서, 최종 생성물을 순도 (HPLC), 동일성 (말디(Maldi)-TOF MS) 및 수율 (UV A260)에 대해 분석하였다. 올리고물을 동결건조 또는 진공 축합을 통해 건조시켰다.
어닐링: 생성물의 분석을 기준으로, 건조된 올리고물을 적절한 완충제에 용해시킨 후, 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오티드 가닥을 (이론상의 흡광 계수를 이용하여 계산된) 등몰량으로 혼합하였다. 이어서, 상기 용액을 크로마토그래피 방법 및 원하는 최종 농도에 의해 이중체의 순도에 대해 분석하였다. 분석에 의해 어느 한 가닥이 과잉인 것으로 나타나는 경우, 추가의 비-과잉 가닥을 이중체 형성이 완료될 때까지 적정하였다. 분석에 의해 표적 생성물 순도가 달성된 것으로 나타났을 때, 물질을 전달하고, 즉시 사용하게 하였다.
하기는 상기 프로토콜을 사용하여 합성된, 또는 상기 프로토콜을 사용하거나 또는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 합성될 수 있는, 다양한 변형된 siNA를 보여주는 표이다.
<표 1c>
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
여기서,
A, C, G, 및 U = 리보스 A, C, G 또는 U
a, g, c 및 u = 2'-데옥시-2'-플루오로 A, G, C 또는 U
A, U, C 및 G = 2'-O-메틸 (2'-OMe) A, U, C, 또는 G
A, U, C, 및 G = 데옥시 A, U, C, 또는 G
B = 역전된 무염기성
T = 티미딘
s = 포스포로티오에이트 연결부.
상업적 제조를 위한 추가의 합성 단계
일단 분석을 통해 어닐링 단계 후에 표적 생성물 순도가 달성된 것으로 나타나면, 어닐링 단계 전에 수행하는 것과는 대조적으로, 물질을 농축 및 탈염을 위해 접선 흐름 여과 (TFF) 시스템으로 전달하였다.
한외여과: 어닐링된 생성물 용액을 적절한 분자량 컷-오프 막을 함유하는 TFF 시스템을 사용하여 농축시켰다. 농축 후, 여과물의 전도성이 물의 전도성이 될 때까지 밀리-Q(Milli-Q) 수를 사용하여 정용여과를 통해 생성물 용액을 탈염시켰다.
동결건조: 농축된 용액을, 급속 냉동되고 동결건조기에 부착된 병으로 전달하였다. 이어서, 생성물을 분말로 냉동 건조시켰다. 병을 동결건조기로부터 분리하고, 이제 사용 준비되었다.
초기 스크리닝 프로토콜 (96-웰 플레이트 형질감염)
세포 배양물 제조:
인간 간세포암 세포주인 HepG2, 또는 마우스 간세포암 세포주인 Hepa1-6을 변형된 이글 배지 중에서 성장시켰다. 배양 배지 모두 10% 소 태아 혈청, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신, 100 U/mL 페니실린, 및 1% 중탄산나트륨으로 보충하였다.
형질감염 및 스크리닝
부분 HBV 게놈이 pSiCheck2 플라스미드 (프로메가(Promega: 미국 위스콘신주 매디슨)) 내로 레닐라 루시퍼라제(Renilla Luciferase) 유전자 하류의 XhoI / NotI 부위에 삽입된 플라스미드 (pSiCheck-HepB-파셜(pSiCheck-HepB-Partial), 참조 번호 1104)를 생성하였다. 이어서, HBV 전사체 상류에서 레닐라 루시퍼라제 mRNA 전사체를 발현시키고, HBV 전사체를 녹다운시키는, HBV 게놈에 대해 표적화된 siNAS는 또한 레닐라 루시퍼라제 전사체 또한 녹다운시킬 것이다. 레닐라 루시퍼라제의 활성량을 직접 측정함으로써 레닐라 루시퍼라제 전사체의 수준을 측정할 수 있었다. 플라스미드는 또한 HBV siNA에 의해 영향을 받지 않는 반딧불이 루시퍼라제 유전자도 발현하였으며, 이는 세포내로 형질감염된 플라스미드의 양에 있어서의 임의의 변동을 고려하여 데이터를 정규화시키는 데 사용될 수 있었다.
부분 HBV 게놈은 adw2 유전자형 A HBV 바이러스의 2270 nts로 구성되었다 (nts 158-2427 (여기서, EcoRI 부위가 nt1이다)).
부분 HBV DNA 서열 (서열 503):
Figure pct00033
Figure pct00034
세포를 조직 배양물 처리된, 96-웰 플레이트의 모든 웰에 100 ㎕의 적절한 배양 배지 중 웰당 10,000개의 세포인 최종 계수로 플레이팅하였다. 플레이팅한 후, 세포를 5% CO2의 존재하에 37℃에서 밤새도록 배양하였다.
그 다음날, siNA, pSiCheck-HepB-파셜 플라스미드, 및 리포펙타민 (인비트로겐(Invitrogen))을 함유하는 복합체를 하기와 같이 생성하였다. 500 nM siNA 및 30 ng/ul 플라스미드를 함유하는 siNA 및 플라스미드의 용액을 생성하였다. 동시에, OPTI-MEM 중에 33배 희석된 리포펙타민 용액을 제조하였다. RNAiMax/OPTI-MEM 용액을 실온에서 5분 동안 인큐베이션한 후, 동일한 부피의 siNA 용액 및 RNAiMax 용액을 각각의 siNA에 대해 함께 첨가하였다.
혼합에 의해 siNA의 농도가 60 nM이고, 플라스미드 농도가 3.6 ng/㎕인 siNA/RNAiMax 용액을 생성하였다. 이 용액을 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 용액 20 ㎕를 각각의 관련된 웰에 첨가하였다. 각 웰에서 siNA의 최종 농도는 10 nM이고, 플라스미드의 최종 농도는 0.6 ng/㎕였다. 각 웰에서 리포펙타민의 최종 부피는 0.3 ul였다.
12점 용량 반응 곡선 연구를 위해, siNA 시리즈는 30 nM에서부터 출발한 6배 연속 희석액, 또는 40 nM에서 출발한 4배 연속 희석액이었다. 모든 형질감염은 다중의 생물학적 반복으로 설정하였다.
리포펙타민-siNA 복합체와의 인큐베이션의 시간은 48시간이었고, 형질감염 및 스크리닝 및 용량 반응 곡선 연구를 위한 수거 사이에 배지 변화는 없었다.
루시퍼라제 검정
50 ㎕의 듀얼-글로(Dual-Glo)TM 반딧불이 시약 (프로메가: 미국 위스콘신주 매디슨)을 96-웰의 각 웰에 첨가한 후, 플레이트를 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 루시퍼라제 프로토콜을 사용하여 왈락 인비젼(Wallac Envison) 플레이트 판독기 상에서 반딧불이 발광을 판독하였다. 스톱 & 글로(Stop & Glo) 기질 (프로메가, 미국 위스콘신주 매디슨)의 1:100 희석액 50 ㎕를 96-웰의 각 웰에 첨가한 후, 플레이트를 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 루시퍼라제 프로토콜을 사용하여 왈락 인비젼 플레이트 판독기 상에서 레닐라 발광을 판독하였다.
계산
관심의 대상이 되는 유전자의 발현 수준 및 유전자 발현 억제율(%) (%KD)을 비교 방법을 이용하여 계산하였다:
L_반딧불이 = 로그 2 (반딧불이 luc 광도)
L_레닐라 = 로그 2 (레닐라 luc 광도)
dL = L_반딧불이 - L_레닐라
ddL(로그2(변화 배수)) = dL_siRNA - dL_NTC
상대 발현 수준 = 2- ddL
% KD = 100 x (1 - 2- ddL)
달리 명시되지 않는 한, 비-표적화 대조군 siNA는 이것이 가장 관련성이 큰 대조군이기 때문에, 유전자 발현의 억제(녹다운)율(%)을 계산하기 위한 기준값으로서 선택되었다.
추가로, 세포의 일반적인 건강 상태, 및 플라스미드 및 siNA의 품질을 반영하는 것인, 정규화된 데이터만을 조사하였다. 처리된 세포에서 2개의 상이한 mRNA의 수준을 검토함으로써 상기 조사를 수행하였는데, 그 중 첫번째 것은 표적 mRNA이고, 두번째 것은 정규화기 mRNA였다. 전체 플레이트에 대하여 반딧불이 루시퍼라제 (정규화기)의 로그2 발광을 상대로 각 웰 중의 레닐라 루시퍼라제 (표적)의 로그2 발광을 비교함으로써 상기 조사를 수행하였다. 이를 통해 관심의 대상이 되는 유전자를 단지 녹다운시키기보다는 잠재적으로 세포에 대하여 독성을 띨 수 있는 것인 siNA를 제거할 수 있었다.
R.2.9.2 소프트웨어를 사용하여 모든 IC50 계산을 수행하였다. 단순 리간드 결합에 대한 S자형 용량 반응 (가변 기울기) 방정식을 사용하여 데이터를 분석하였다. 억제(녹다운)율(%)에 관한 모든 계산에서, 달리 명시되지 않는 한, 계산은 비-표적화 대조군 (Ctrl siNA)으로 처리된 샘플에서의 관심의 대상이 되는 유전자의 정규화된 발현 수준에 대한 상대적인 값으로 이루어졌다.
결과:
앞서 기술된 바와 같이 HBV siNA를 디자인하고, 합성하였다. pSiCheck-HepB-파셜 플라스미드로 형질감염된 HepG2 또는 Hepa1-6 세포에서 다양한 siNA에 관해 스크리닝하였다. 인간 세포에서 다양한 변형된 HBV siNA로 처리하였을 때의 HBV mRNA 발현 수준의 로그2(변화 배수)는 표 3a 및 b에 제시되어 있다. 루시퍼라제 검정 방법을 사용하여 48 hr째에 각 스크린을 수행하였다.
<표 3a>
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
<표 3b>
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
1차 스크린에서 큰 로그2(변화 배수) 값을 가지는, 표 3a 및 표 3b로부터의 siNA 하위세트를 3중으로 단일 96-웰 플레이트 상에 재래킹(re-racking)하고, pSiCheck_HepB-파셜로 형질감염된 인간 HepG2 세포에서 다시 스크리닝하여 녹다운을 확인하고, 상이한 플레이트 상에서 합성된 siNA를 직접 비교하였다. 표 4에는 데이터가 요약되어 있다. HBV mRNA 발현 수준의 로그2(변화 배수)에 기초하여 siNA를 순위 매김하였다.
<표 4>
Figure pct00041
Figure pct00042
pSiCheck-HepB-파셜 플라스미드로 형질감염된 HepG2 세포에서의 효능 및 효력에 관해 표 4로부터의 엄선된 상위 (로그2(변화 배수) 값이 보다 더 큰) siNA를 추가로 분석하였다. 1:6 연속 용량 적정된 siNA로 세포를 처리하여 값을 확립하였다. 효력50은 표적 mRNA를 50% 녹다운시키는, 계산된 siNA 형질감염 농도이다. 이러한 siNA에 대한 결과는 표 5에 제시되어 있다.
<표 5>
Figure pct00043
Figure pct00044
이어서, 표 5로부터의 상위인 것 (로그2(변화 배수) 값이 보다 더 크고, 낮은 효력50 값을 가지는 것)에 기초하여, 이전 스크린에서 확인된, 성능이 정상인 엄선된 서열을 패신저 및 가이드 가닥, 둘 모두에서 다양한 화학적 변형을 통해 합성하였다. 이어서, 상기 siNA를 pSiCheck-HepB-파셜 플라스미드로 형질감염된 Hepa1-6 세포에서의 효능 및 효력에 관해 분석하였다. 인간 세포에서 다양한 변형된 HBV siNA로 처리하였을 때의 HBV mRNA 발현 수준의 로그2(변화 배수)는 표 6A에 제시되어 있다. 루시퍼라제 검정 방법을 사용하여 48 hr째에 각 스크린을 수행하였다.
<표 6A>
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
1차 스크린에서 큰 로그2(변화 배수) 값을 가지는, 표 6a로부터의 siNA 하위세트를 3중으로 단일 96-웰 플레이트 상에 재래킹하고, pSiCheck_HepB-파셜로 형질감염된 뮤린 Heap1-6 세포에서 다시 스크리닝하여 녹다운을 확인하고, 상이한 플레이트 상에서 합성된 siNA를 직접 비교하였다. 표 6B에는 데이터가 요약되어 있다. HBV mRNA 발현 수준의 로그2(변화 배수)에 기초하여 siNA를 순위 매김하였다.
<표 6B>
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
pSiCheck-HepB-파셜 플라스미드로 형질감염된 Hepa1-6 세포에서의 효능 및 효력에 관해 표 6b로부터의 엄선된 상위 (로그2(변화 배수) 값이 보다 더 큰) siNA를 추가로 분석하였다. 1:6 연속 용량 적정된 siNA로 세포를 처리하여 값을 확립하였다. 효력50은 표적 mRNA를 50% 녹다운시키는, 계산된 siNA 형질감염 농도이다. 이러한 siNA에 대한 결과는 표 6c에 제시되어 있다.
<표 6c>
Figure pct00055
Figure pct00056
실시예 2: siNA의 시험관내에 혈청 안정성 측정
H2O를 사용하여 50 μM 내지 100 μM 스톡 용액으로서 siNA를 재구성하고, 37℃로 미리 가온된 인간 혈청에 첨가하여 최종 농도가 20 ㎍/mL가 되도록 만들었다. 이어서, 혼합물을 37℃에서 0, 1 및 2시간 동안 인큐베이션하였다. 각 시점 종결시, 동일한 부피의 페노메넥스(Phenomenex) 용해-로딩용 완충제와 혼합함으로써 반응을 종결시켰다. 페노메넥스 고체상 추출에 의해 96-웰 포맷으로 올리고뉴클레오티드를 정제하고, 건조될 때까지 랩콘코 트리아드 리오-00417(Labconco Triad Lyo-00417)을 사용하여 동결건조시켰다. 동결건조된 샘플을 RNase 무함유 H2O로 제조된 150 ㎕의 1 mM EDTA 중에서 재구성하였다. 이어서, 써모피셔 오르비트랩(ThermoFisher Orbitrap) 상에서의 액체 크로마토그래피/질량 분석법 (LC/MS) 분석을 위해 1 mM EDTA를 이용하여 샘플 용액을 5배 희석시켰다. 측정된 분자량에 기초하여 siNA의 혈청 대사산물을 측정하였다.
실시예 3: 시토카인 유도 시험
지질 나노입자 (예컨대, 40/48/2/10 비율의 DLinDMA/콜레스테롤/S-PEG-C-DMA/DSPC)에 로딩된 본 발명의 다양한 siNA의 면역자극성 효과를 평가하기 위해, 단일 3 mpk 용량의 LNP 제제화된 siNA를 꼬리 정맥 주사를 통해 C57B1/6 마우스에 투여하였다. 투여 후 3 및 24시간째에 혈청 또는 혈장 샘플을 수집하였다. 오손 바이오사이언시즈(Aushon Biosciences)로부터의 서치라이트 IR 시토카인 어레이(Searchlight IR Cytokine Array)를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 상기 샘플 중의 시토카인 및 케모카인의 수준을 측정하였다. 측정된 시토카인 및 케모카인은 IL-1α, IL-1β, IL-6, KC, IL-10, IFNγ, TNF, GMCSF, MIP-1β, MCP-1/JE, 및 RANTES였다.
실시예 4: 마우스에서의 효능 연구
인간화된 간을 가진 SCID 마우스에서 생체내 효능 연구를 수행하였는데, 이는 후속적으로 HBV를 주사받았다. 이환된 간을 가진 트랜스제닉 마우스에 인간 1차 간세포를 주사함으로써 최대 70%로 인간 간세포를 가진 마우스 간으로 재증식될 수 있도록 하였다. 이어서, 마우스에 인간 HBV 단리물을 접종하였다. 감염된 마우스에 단일 3 mpk 용량의 LNP 캡슐화된 siNA 또는 비히클 대조군을 꼬리 정맥 주사를 통해 IV 투여하였다. 투여 후 다양한 시점에 혈청 샘플을 채취한 후, qPCR에 의해 혈청 중 순환 HBV 게놈 수준을 측정함으로써 siNA가 바이러스 로드에 미치는 효과를 측정하였다.
실시예 5: 비인간 영장류에서의 약역학적 연구
HBV로 감염된 침팬지에 단일 2.5 mpk 용량의 siNA 로딩된 지질 나노입자를 정맥내 주입을 통해 투여하였다. HBV 바이러스 로드를 모니터링하기 위해, 투여 전 및 투여 후 다양한 시점에 혈청 샘플을 채취하고, qPCR을 통해 HBV 게놈 수준을 측정하였다. 모든 절차는 USDA 동물 복지법(USDA Animal Welfare Act) (9 CFR, 파트 1, 2 및 3)에 개요된 규정 및 문헌 [The Guide for Care and Use of Laboratory Animals (ILAR publication, 1996, National Academy Press)]에 명시된 조건을 준수하였다.
실시예 6: siNA LNP 제제
A. DLinDMA 제제를 위한 일반 LNP 공정 설명:
충돌 제트 공정에 의해 지질 나노입자를 제조하였다. 알콜 중에 용해되어 있는 지질을 시트레이트 완충제 중에 용해되어 있는 siNA와 혼합함으로써 입자를 형성하였다. 지질 대 siNA의 혼합 비율은 45-55% 지질 대 65-45% siNA로 표적화하였다. 지질 용액은 알콜 (예를 들어, 에탄올) 중 5-15 mg/mL의 농도로, 9-12 mg/mL를 표적으로 하여 양이온성 지질, 헬퍼 지질 (콜레스테롤), PEG (예컨대, PEG-C-DMA, PEG-DMG) 지질, 및 DSPC를 함유하였다. 지질의 비율은 양이온성 지질의 경우, 범위가 25-98 몰%이고, 35-65 몰%를 표적으로 하며, 헬퍼 지질의 경우, 범위가 0-75 몰%이고, 30-50 몰%를 표적으로 하며, PEG 지질의 경우, 범위가 1-15 몰%이고, 1-6 몰%를 표적으로 하며, DSPC의 경우, 범위가 0-15 몰%이고, 0-12 몰%를 표적으로 하였다. siNA 용액은 pH 범위가 3.5-5인 시트르산나트륨 완충된 염 용액 중 0.3 내지 1.0 mg/mL 범위의 농도로, 0.3-0.9 mg/mL를 표적으로 하여 하나 이상의 siNA 서열을 함유하였다. 두 액체를 15-40℃ 범위의, 30-40℃로 표적화된 온도로 가열한 후, 충돌 제트 혼합기에서 혼합하였을 때, 그 즉시 LNP가 형성되었다. teeID 범위는 0.25 내지 1.0 mm이고, 총 유량은 10-600 mL/분이었다. 유량과 배관 ID의 조합이 LNP의 입자 크기를 30 내지 200 nm으로 조절하는 효과를 가지고 있었다. 이어서, 혼합 비율을 1:1 내지 1:3 vol:vol 범위로, 1:2 vol:vol을 표적으로 하여 높은 pH의 완충된 용액과 함께 상기 용액을 혼합하였다. 상기 완충된 용액의 온도는 15-40℃ 범위의 온도였으며, 30-40℃를 표적으로 하였다. 음이온 교환 여과 단계를 수행하기 30분 내지 2 hr 전에 혼합된 LNP를 유지시켰다. 인큐베이션을 진행하는 동안의 온도는 15-40℃ 범위의 온도였으며, 30-40℃를 표적으로 하였다. 인큐베이션 후, 음이온 교환 분리 단계를 포함하여, 0.8 um 필터를 통해 용액을 여과시켰다. 상기 공정에서는 배관 ID 범위가 1 mm ID 내지 5 mm ID이고, 유량이 10 내지 2,000 mL/분인 것을 사용하였다. LNP를 농축시키고, 한외여과 공정을 통해 정용여과하여 알콜을 제거하고, 시트레이트 완충제를 최종 완충제 용액, 예컨대, 포스페이트 완충된 염수로 교환하였다. 한외여과 공정은 접선 흐름 여과 포맷 (TFF)을 사용하였다. 상기 공정은 막의 공칭 분자량 컷오프 범위가 30-500 KD인 것을 사용하였다. 막 포맷은 중공 섬유 또는 플랫 시트 카세트였다. 적절한 분자량 컷오프를 사용한 TFF 공정은 보유액 주에서는 LNP를 보유하였고, 여과물 또는 침투물은 알콜; 시트레이트 완충제; 최종 완충제 폐기물을 함유하였다. TFF 공정은 초기에 siNA 농도를 1-3 mg/mL로 농축시키는, 다단계 공정이었다. 농축 후, LNP 용액을 10-20 부피에 대해서 최종 완충제에 대해 정용여과하여 알콜을 제거하고, 완충제 교환을 수행하였다. 이어서, 물질을 추가로 1-3배 농축시켰다. LNP 공정의 최종 단계는 농축된 LNP 용액을 멸균 여과하고, 생성물을 바이알에 넣는 것이었다.
분석 절차
1) siNA 농도
2996 PDA 검출기가 장착된 워터스 2695 얼라이언스(Waters 2695 Alliance) 시스템 (워터스 코포레이션(Waters Corporation: 미국 매사추세츠주 밀퍼드))을 사용하여 강한 음이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피 (SAX-HPLC)에 의해 siNA 이중체 농도를 측정하였다. 다르게는 RNAi 전달 비히클 (RDV)로도 지칭되는 LNP를 0.5% 트리톤 X-100으로 처리하여 전체 siNA를 유리시키고, 254 nm에서 UV 검출하면서, 디오넥스 바이오LC(Dionex BioLC) DNAPac PA 200 (4 x 250 mm) 칼럼을 사용하여 SAX 분리에 의해 분석하였다. 이동상은 A: 25 mM NaClO4, 10 mM 트리스, 20% EtOH (pH 7.0) 및 B: 250 mM NaClO4, 10 mM 트리스, 20% EtOH (pH 7.0)로, 0-15 min의 선형 구배, 및 1 ml/분의 유량인 것으로 구성되었다. siNA 표준 곡선과의 비교에 의해 siNA 양을 측정하였다.
2) 캡슐화 속도
RNA를 정량화하여 RDV의 캡슐화 속도를 모니터링하기 위해 형광 시약 SYBR 골드(SYBR Gold)를 사용하였다. 트리톤 X-100과 함께, 또는 그를 사용하지 않고 RDV를 사용하여 유리 siNA 및 전체 siNA 양을 측정하였다. 몰레큘라 디바이스즈(Molecular Devices: 미국 캘리포니아주 서니베일)로부터 스펙트라맥스 M5e(SpectraMax M5e) 마이크로플레이트 분광광도계를 사용하여 검정을 수행하였다. 485 nm에서 샘플을 여기하고, 530 nm에서 형광 방출을 측정하였다. siNA 표준 곡선과의 비교를 통해 siNA 양을 측정하였다.
캡슐화 속도 = (1- 유리 siNA/전체 siNA) x 100%
3) 입자 크기 및 다분산성
1 ㎍ siNA를 함유하는 RDV를 1 x PBS를 이용하여 최종 부피 3 ml로 희석시켰다. 제타PALS(ZetaPALS) 기기 (브룩헤븐 인스트루먼츠 코포레이션(Brookhaven Instruments Corporation: 미국 뉴욕주 홀스빌))를 이용하여 동적 광 산란 방법에 의해 샘플의 입자 크기 및 다분산성을 측정하였다. 90°의 산란각을 이용하여 25℃에서 He-Ne 레이저를 이용함으로써 산란 강도를 측정하였다.
4) 제타 전위 분석
1 ㎍ siNA를 함유하는 RDV를 트리스 완충제 (pH 7.4)를 이용하여 최종 부피 2 ml로 희석시켰다. 전극 및 광원으로서 He-Ne 레이저와 함께 제타PALS 기기 (브룩헤븐 인스트루먼츠 코포레이션: 미국 뉴욕주 홀스빌)를 이용하여 샘플의 전기영동 이동성을 측정하였다. 제타 전위 계산에서 스몰루초스키(Smoluchowski) 한계가 추정되었다.
5) 지질 분석
코로나(Corona) 하전된 에어로졸 검출기 (CAD) (ESA 바이오사이언시즈, 인크.(ESA Biosciences, Inc.: 미국 매사추세츠주 첼름스퍼드))가 장착된 워터스 2695 얼라이언스 시스템 (워터스 코포레이션: 미국 매사추세츠주 밀퍼드))을 사용하여 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC)에 의해 개별 지질 농도를 측정하였다. 60℃에서 CAD와 함께 애질런트 조르박스 SB-C18(Agilent Zorbax SB-C18) (50 x 4.6 mm, 1.8 ㎛ 입자 크기) 칼럼을 사용하여 RDV 중의 개별 지질을 분석하였다. 이동상은 A: H2O 중 0.1% TFA 및 B: IPA 중 0.1% TFA로 구성되었다. 구배는 시점 0에서부터의 60% 이동상 A 및 40% 이동상 B로부터 1.00 min에 40% 이동상 A 및 60% 이동상 B로; 1.00에서 5.00 min에 40% 이동상 A 및 60% 이동상 B로; 5.00 min에서의 40% 이동상 A 및 60% 이동상 B에서 10.00 min에 25% 이동상 A 및 75% 이동상 B; 10.00 min에서의 25% 이동상 A 및 75% 이동상 B에서 15.00 min에 5% 이동상 A 및 95% 이동상 B로; 및 15.00에서의 5% 이동상 A 및 95% 이동상 B에서 20.00 min에 60% 이동상 A 및 40% 이동상 B로 변하고, 유량은 1 ml/분이었다. 개별 지질 농도는 이차 곡선 피트를 이용하여 표준 곡선과의 비교를 통해 RDV 중의 모든 지질 성분과 비교함으로써 측정하였다. 각 지질의 몰비율(%)은 그의 분자량에 기초하여 계산하였다.
B. 71.9:20.2:7.9 비율의 CLinDMA /콜레스테롤/ PEG - DMG 에 대한 일반 제제화 절차
siNA를 25 mM 시트레이트 완충제 (pH 4.0) 중에 0.8 mg/mL의 농도로 용해시켜 siNA 용액을 제조하였다. 71.9:20.2:7.9 비율의 2S-옥틸-ClinDMA, 콜레스테롤 및 PEG-DMG의 혼합물을 무수 에탄올 중에 약 10 mg/mL의 농도로 용해시켜 지질 용액을 제조하였다. 2개의 시린지 펌프를 이용하여 동일한 부피의 siNA 및 지질 용액을 같은 유량으로 혼합 T 연결 장치로 전달하였다. 생성된 유백색 혼합물을 멸균 병에 수집하였다. 이어서, 동일한 부피의 시트레이트 완충제를 이용하여 상기 혼합물을 천천히 희석시키고, 크기 배제 중공 섬유 카트리지를 통해 여과시켜 혼합물 중의 임의의 유리 siNA를 제거하였다. 시트레이트 완충제 (pH 4.0)에 대한 한외여과를 사용하여 에탄올을 제거하고 (ALCO 스크린으로부터 테스트 스틱), PBS (pH 7.4)에 대한 한외여과를 사용하여 완충제를 교환하였다. 원하는 부피까지 농축시켜 최종 LNP를 수득하고, 0.2 mm 필터를 통해 멸균 여과시켰다. 수득된 LNP를 입자 크기, 알콜 함량, 총 지질 함량, 핵산 캡슐화, 및 총 핵산 농도에 관하여 특징을 규명하였다.
C. 표 10 의 다양한 제제에 대한 일반 LNP 제조
siNA 및/또는 담체 분자를 20 mM 시트르산나트륨 완충제 (pH 5.0) 중에 약 0.40 mg/mL의 농도로 용해시켜 표 10의 siNA 나노입자 현탁액을 제조하였다. (표 10에 제시된 비율의) 양이온성 지질 (예컨대, (13Z,16Z)-N,N-디메틸-3-노닐도코사-13,16-디엔-1-아민, 표 11의 구조 참조), DSPC, 콜레스테롤, 및 PEG-DMG의 혼합물을 무수 에탄올 중에 약 8 mg/mL의 농도로 용해시켜 지질 용액을 제조하였다. 질소 대 포스페이트의 비는 대략 6:1이었다.
2개의 FPLC 펌프를 이용하여 거의 동일한 부피의 siNA/담체 및 지질 용액을 같은 유량으로 혼합 T 연결 장치로 전달하였다. 배압 밸브를 사용하여 원하는 입자 크기로 조정하였다. 생성된 유백색 혼합물을 멸균 유리병에 수집하였다. 이어서, 동일한 부피의 시트레이트 완충제, 이어서, 동일한 부피의 PBS (pH 7.4)를 이용하여 상기 혼합물을 희석시키고, 이온 교환 막을 통해 여과시켜 혼합물 중의 임의의 유리 siNA/담체를 제거하였다. PBS (7.4)에 대한 한외여과를 사용하여 에탄올을 제거하고, 완충제를 교환하였다. 원하는 부피까지 농축시켜 최종 LNP를 수득하고, 0.2 ㎛ 필터를 통해 멸균 여과시켰다. 수득된 LNP를 입자 크기, 제타 전위, 알콜 함량, 총 지질 함량, 핵산 캡슐화, 및 총 핵산 농도에 관하여 특징을 규명하였다.
LNP 제조 절차
비제한적인 일례로, LNP를 벌크로 하기와 같이 제조하였다. 본 공정은 (1) 지질 용액 제조; (2) siNA/담체 용액 제조; (3) 혼합/입자 형성; (4) 인큐베이션; (5) 희석; (6) 한외여과 및 농축으로 구성되었다.
1. 지질 용액 제조
2 L 유리 시약 병 및 측정용 실린더에서 발열성 물질을 제거하였다. 지질을 실온으로 가온시켰다. 피펫을 이용하여 유리 시약 병 안으로 8.0 g의 (13Z,16Z)-N,N-디메틸-3-노닐도코사-13,16-디엔-1-아민을 전달하고, 1.2 g의 DSPC, 3.5 g의 콜레스테롤, 0.9 g의 PEG-DMG를 첨가하였다. 상기 혼합물에 에탄올 1 L를 첨가하였다. 50℃를 초과하지 않는 온도에서 시약 병을 가열된 수조에 두었다. 지질 현탁액을 교반 막대를 이용하여 교반하였다. 밀봉 어댑터가 있는 둥근 바닥 플라스크의 한 목을 통해 열전대 프로브를 상기 현탁액 안에 넣었다. 현탁액이 투명해질 때까지, 30-40℃에서 가열하였다. 용액을 실온으로 냉각시켰다.
2. siNA/담체 용액의 제조
0.4 g X 물 보정 계수 (대략 1.2)의 siNA 분말을 칭량하여 멸균 용기 (코닝(Corning) 보관용 병)에 넣었다. 발열성 물질이 제거된 2 L 유리 시약 병에 siNA를 전달하였다. 칭량용 용기를 시트레이트 완충제 (20 mM (pH 5.0))로 3x 세정하고, 린스를 2 L 유리병에 넣고, 1 L가 될 때까지 충분량의 시트레이트 완충제를 넣었다. 하기 절차를 사용하여 UV 분광계로 siNA 용액의 농도를 측정하였다. 용액으로부터 20 ㎕를 제거하고, 1,000 ㎕까지 50배로 희석하고, 시트레이트 완충제로 블랭킹한 후, A260 nm에서의 UV 판독값을 기록하였다. 이를 반복하였다. 단, 두 샘플의 판독값이 일관될 경우, 평균값을 구하고, siNA의 흡광 계수에 기초하여 농도를 계산하였다는 것에 주목한다. 최종 농도가 0.40 ± 0.01 mg/mL 범위를 벗어난 경우에는, siNA/담체 분말을 더 첨가하거나, 또는 시트레이트 완충제를 더 첨가함으로써 농도를 조정할 수 있었다. 적용가능한 경우, 제2 siNA에 대해 상기 공정을 반복하였다.
siNA/담체 용액이 2개 이상의 siNA 이중체 및/또는 담체의 칵테일 대신 단일 siNA 이중체를 포함하였을 때에는, siNA/담체를 20 mM 시트레이트 완충제 (pH 5.0) 중에 용해시켜 최종 농도가 0.4 mg/mL가 되도록 만들었다.
이어서, 지질 및 에탄올 용액을 팔 아크로팩(Pall Acropak) 20 0.8/0.2 ㎛ 멸균 필터 PN 12203을 통해 멸균 여과시키고, 마스터 플렉스 연동 펌프 모델 7520-40(Master Flex Peristaltic Pump Model 7520-40)을 이용하여 발열성 물질이 제거된 유리 용기에 넣음으로써 캡슐화 공정을 위한 멸균 출발 물질을 수득하였다. 여과 공정은 80 mL 규모로 진행되었고, 막의 면적은 20 ㎠였다. 유량은 280 mL/분이었다. 배관 직경 및 여과 면적을 증가시킴으로써 상기 공정 규모를 확장시킬 수 있다.
3. 입자 형성 - 혼합 단계
2-배럴 시린지 구동 펌프 (하버드 33 트윈 시린지(Harvard 33 Twin Syringe))를 이용하여 멸균 지질/에탄올 용액 및 멸균 siNA/담체 또는 siNA/담체 칵테일/시트레이트 완충제 (20 mM 시트레이트 완충제 (pH 5.0)) 용액을 동일한, 또는 거의 동일한 유량으로 0.5 mm ID T-혼합기에서 혼합하였다 (혼합 단계 I). 생성된 아울렛 LNP 현탁액은 40-50 vol% 에탄올을 함유하였다. 45 vol% 에탄올 아울렛 현탁액을 수득하기 위해, 멸균 지질/에탄올 및 멸균 siNA/담체 또는 siNA/담체 칵테일/시트레이트 완충제 용액를 각각 54 mL/min 및 66 mL/min의 유량으로 혼합하여, 혼합 아울렛의 전체 유량이 120 mL/min가 되었다.
4. 희석
혼합 단계 I의 아울렛 스트림을 4 mm ID T-혼합기에 바로 공급하고 (혼합 단계 II), 여기서, 더 높은 pH의 완충된 용액 (20 mM 시트르산나트륨, 300 mM 염화나트륨 (pH 6.0))을 이용하여 1:1 vol:vol% 비로 희석하였다. 상기 완충된 용액을 30-40℃ 범위의 온도에 놓고, 이를 연동 펌프 (콜 파머 마스터플렉스(Cole Parmer MasterFlex) L/S 600 RPM)를 통해 120 mL/min의 유량으로 4 mm T-혼합기로 전달하였다.
혼합 단계 II의 아울렛 스트림을 6 mm ID T-혼합기에 바로 공급하고 (혼합 단계 III), 여기서, 더 높은 pH의 완충된 용액 (PBS, pH 7.4)을 이용하여 1:1 vol:vol% 비로 희석하였다. 상기 완충된 용액을 15-25℃ 범위의 온도에 놓고, 이를 연동 펌프 (콜 파머 마스터플렉스 L/S 600 RPM)를 통해 240 mL/min의 유량으로 6 mm T-혼합기로 전달하였다.
5. 인큐베이션 및 유리 siNA 제거
혼합 후 혼합 단계 III의 아울렛 스트림을 그대로 유지시켜 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션은 35-40℃의 온도에서 수행하고, 제조 중인 현탁액을 광으로부터 보호하였다. 인큐베이션 후, 무스탕(Mustang) Q 크로마토그래피 필터 (캡슐)를 이용하여 음이온 교환을 통해 유리 (캡슐화되지 않은) siNA를 제거하였다. 사용 전, 크로마토그래피 필터를 순차적으로 1 N NaOH, 1 M NaCl, 및 PBS 중의 12.5 vol% 에탄올 최종 용액의 플러쉬로 전처리하였다. 최종 플러쉬의 pH가 확실하게 pH < 8이 되도록 체크하였다. 이어서, 인큐베이션된 LNP 스트림을 연동 펌프 (콜 파머 마스터플렉스 L/S 600 RPM)를 통해 대략 100 mL/min의 유량으로 무스탕 Q 필터를 통해 여과시켰다. 여과된 스트림을 멸균 유리 용기에 넣고, 하기와 같이 한외여과 및 농축시켰다.
6. 한외여과, 농축 및 멸균 여과
한외여과 공정은 시한 공정이며, 유량은 주의깊에 모니터링되어야 한다. 이는 2단계 공정으로서; 제1 단계는 희석된 물질을 취하고, 이를 대략 8배로, 농도가 대략 0.3-0.6 mg/mL siNA가 될 때까지 농축시키는 농축 단계이다.
제1 단계에서, 한외여과 막 100 kDa PES (스펙트럼 랩스(Spectrum Labs))가 설치된 링-스탠드를 연동 펌프 (스펙트럼 크로스플로II 시스템(Spectrum KrosFloII System))에 부착시켰다. 9.2 L의 멸균 증류수를 저장소에 첨가하고; 3 L를 폐기물로 배수하고, 나머지는 투과물에 통과시켜 폐기물로 배수하였다. 5.3 L의 0.25 N 수산화나트륨을 저장소에 첨가하고, 1.5 L를 폐기물로 배수하고, 3.1 L는 투과물에 통과시켜 폐기물로 배수하였다. 남은 수산화나트륨은 (10분 이상의) 소독을 위해 시스템에 그대로 유지시킨 후, 펌프를 배수시켰다. 9.2 L의 70 (v/v)% 이소프로필 알콜을 저장소에 첨가하고, 1.5 L를 폐기물로 배수하고, 나머지는 투과물에 통과시켜 폐기물로 배수하였다. 6 L의 조건화 완충제 (포스페이트 완충된 염수 중 12.5% 에탄올)를 첨가하고, 1.5 L를 폐기물로 배수하고, 나머지는 폐기물의 pH가 중성 pH (7-8)가 될 때까지 투과물에 통과시켜 폐기물로 배수하였다. 막 유동 값을 기록한 후, 펌프를 배수시켰다.
희석된 LNP 용액을 저장소에 1.1 L 마크가 있는 곳까지 넣었다. 펌프를 2.3 L/min으로 작동시켰다. 5분간의 재순환 후, 투과물 펌프를 62.5 mL/min로 작동시켰으며, 액체 수준은 저장소에서 대략 950 mL로 일정하게 유지되었다. 희석된 LNP 용액을 140분에 걸쳐 9.8 L에서 1.1 L로 농축시키고, 희석된 LNP 용액 모두가 저장소로 전달되었을 때, 펌프를 정지시켰다.
제2 단계는 에탄올/수성 완충제를 포스페이트 완충된 염수로 교환하는 정용여과 단계였다. 상기 단계 동안 대략 10-20 정용여과 부피의 포스페이트 완충된 염수를 사용하였다. 정용여과 후, LNP 현탁액을 3배로 대략 1-1.5 mg/mL siRNA로 농축시키는 2차 농축에 착수하였다. 농축된 현탁액을 멸균 플라스틱 PETG 병 안에 수집하였다. 이어서, 바이알 충전 전에 최종적으로 멸균화시키기 위해서 최종 현탁액을 순차적으로 팔(Pall) 0.45 um PES 및 팔 0.2 um PES 필터를 통해 여과시켰다.
수득된 LNP를 입자 크기, 제타 전위, 알콜 함량, 총 지질 함량, 핵산 캡슐화, 및 총 핵산 농도에 관하여 특징을 규명하였다.
D. 신규한 양이온성 지질의 합성
신규한 양이온성 지질의 합성은 지질산 (i)으로부터 출발하는 선형 과정이다. N,O-디메틸 히드록실아민에의 커플링을 통해 와인랩(Weinreb) 아미드 (ii)를 수득한다. 그리냐르(Grignard) 첨가를 통해 케톤 (iii)을 생성한다. 티타늄 매개 환원성 아미노화를 통해 (iv)형의 최종 생성물을 수득한다.
일반 반응식 1
Figure pct00057
단일 탄소의 동족체화된 양이온성 지질 (v)의 합성은 지질 케톤 (iii)으로부터 출발하는 선형 과정이다. 케톤의 니트릴 (iv)로의 전환은 TOSMIC 및 칼륨 tert-부톡시드 처리를 통해 달성된다. 니트릴의 1급 아민으로의 환원에 이어, 환원성 아미노화를 통해 최종 양이온성 지질 (v)이 제조된다.
일반 반응식 2
Figure pct00058
탄소 2개의 동족체화된 양이온성 지질 (viii)의 합성은 지질 케톤 (iii)으로부터 출발하는 선형 과정이다. 케톤의 α,β-불포화된 아미드 (vi)로의 전환은 피터슨(Peterson) 조건하에서 달성된다. LS-셀렉트라이드를 사용하여 수행되는 α,β-불포화의 컨쥬게이트 환원을 통해 아미드 (vii)가 제조된다. 수소화 알루미늄 리튬으로 아미드를 환원시킴으로써 최종 양이온성 지질 (viii)이 제조된다.
일반 반응식 3
Figure pct00059
시클로프로필 함유 지질은 일반 반응식 4에 따라 제조한다. 불포화된 와인랩 아미드 (ii)를 시몬스-스미스(Simmons-Smith) 시클로프로판화 조건에 가함으로써 시클로프로필 함유 와인랩 아미드 (ix)를 수득한다. 이를 일반 반응식 1-3에 개략적으로 설명되어 있는 바와 같이 최종 생성물에 이르도록 계속 수행한다.
일반 반응식 4
Figure pct00060
알릴 아민 양이온성 지질 (xv)의 합성은 알데히드 (x)로부터 출발하는 선형 과정이다. t-부틸 아세테이트의 첨가를 통해 β-히드록시 에스테르 (xi)가 생성된다. 히드록실 관능기의 플루오로 기로의 전환에 이어, 산 처리를 통해 β-플루오로 산 (xii)이 생성된다. 산의 와인랩 아미드로의 전환에 이어, 그리냐르 첨가에 의해 β-플루오로 케톤 (xiv)이 생성된다. 환원성 아미노화를 통한 동시 제거에 의해 원하는 아릴 아민 (xv)가 생성된다.
일반 반응식 5
Figure pct00061
20,23- 노나코사디엔 -10-아민, N,N-디메틸-, (20Z,23Z) (화합물 1)
Figure pct00062
11,14-에이코사디에노산, (11Z,14Z)- (50 g, 162 mmol), N,O-디메틸히드록실아민 히드로클로라이드 (31.6 g, 324 mmol), HOAt (44.1 g, 324 mmol), Et3N (45.2 mL, 324 mmol), 및 EDC (62.1 g, 324 mmol)를 DCM (810 mL) 중에서 혼합하고, 주변 온도에서 밤새도록 교반하였다. 이어서, 반응물을 5 x 700 mL 물로 세척한 후, 1 x 600 mL 1 M NaOH로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 셀라이트를 통해 여과시키고, 증발시켜 투명한 금색 오일로서 53.06 g (93%)의 11,14-에이코사디엔아미드, N-메톡시-N-메틸-, (11Z,14Z)을 수득하였다.
Figure pct00063
Figure pct00064
11,14-에이코사디엔아미드, N-메톡시-N-메틸-, (11Z,14Z)-1 (4 g, 11.38 mmol)을 250 mL 플라스크 중에서 건조 THF (50.0 ml)에 용해시킨 후, 질소하에 주변 온도에서 1 M 노닐마그네슘 브로마이드 (22.76 ml, 22.76 mmol)를 첨가하였다. 10 min 후, 과량의 포화 수성 NH4Cl로 반응물을 천천히 켄칭시켰다. 헥산 및 물로 반응물을 세척하여 분리 깔때기 내로 넣고, 진탕시키고, 하부의 수성 층은 버리고, 상부층은 황산나트륨으로 건조시키고, 여과시키고, 증발시켜 금색 오일로서 조 케톤을 수득하였다. 상기 조 케톤에 디메틸아민 (THF 중 2 M) (14.22 ml, 28.4 mmol)을 첨가한 후, Ti(O-i-Pr)4 (6.67 ml, 22.76 mmol)를 첨가하고, 밤새도록 교반하였다. 그 다음날, EtOH (50 ml) 첨가 후, NaBH4 (0.646 g, 17.07 mmol)를 첨가하였다. 5 min 동안 교반한 후, 330 g 실리카 칼럼과 연결되어 있는 40 g 실리카 칼럼 상에 전체 반응물을 직접 주입하였다. 10 min 동안 100% DCM, 이어서, 30 min 동안 0-15% MeOH/DCM에서 용리시키고, 옅은 금색 오일로서 20,23-노나코사디엔-10-아민, N,N-디메틸-, (20Z,23Z) (1) (2.45 g, 5.47 mmol, 수율 48.1%)을 수집하였다.
Figure pct00065
화합물 2-30은 신규한 양이온성 지질이며, 이는 상기 일반 반응식 1에 따라 제조하였다.
Figure pct00066
Figure pct00067
Figure pct00068
Figure pct00069
(12Z,15Z)- N,N -디메틸-2- 노닐헤니코사 -12,15- 디엔 -1-아민 (화합물 31)
Figure pct00070
디메톡시에탄 (45 mL) 중 케톤 (iii) (4.0 g, 9.55 mmol), TOSMIC (2.4 g, 12.4 mmol)의 용액을 0℃로 냉각시키고, 칼륨 tert-부톡시드 (19.1 mmol, tBuOH 중의 1 M의 용액 19.1 mL)로 처리하였다. 90분 후, 반응물을 헥산과 물 사이에 분배하였다. 유기물을 물로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과시키고, 진공에서 증발시켰다. 상기 물질을 플래쉬 크로마토그래피 (0-5% EtOAc/헥산)에 의해 정제하여 원하는 생성물 (~20%의 s.m. 함유)을 수득하였다. 상기 혼합물을 그대로 다음 단계로 이월시켰다. LC/MS (M+H) = 430.6.
Figure pct00071
주변 온도에서 수소화 알루미늄 리튬 (23.9 mmol, THF 중 1 M의 용액 23.9 mL)을 니트릴 (iv) (3.42 g, 8 mmol)에 직접 첨가하고, 반응물을 20분 동안 교반하였다. 반응물을 100 mL THF로 희석시키고, 0℃로 냉각시키고, 황산나트륨 10수화물 용액으로 주의하여 켄칭시켰다. 고체를 여과시키고, THF로 세척하였다. 여과물을 진공에서 증발시키고, 조 상태 그대로 다음 반응에 직접 이월시켰다. LC/MS (M+H) = 434.6.
Figure pct00072
디클로로에탄 (100 mL) 중 1급 아민 (3.45 g, 6.2 mmol)의 용액을 포름알데히드 (1.6 mL, 21.7 mmol)로 처리한 후, 나트륨 트리아세톡시보로히드라이드 (6.6 g, 31 mmol)로 처리하였다. 5분 후, 반응물을 디클로로메탄과 1 N NaOH 사이에 분배하였다. 유기물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과시키고, 진공에서 증발시켰다. 조 혼합물을 역상 정제용 크로마토그래피 (C8 칼럼)에 의해 정제하여 (12Z,15Z)-N,N-디메틸-2-노닐헤니코사-12,15-디엔-1-아민을 수득하였다.
Figure pct00073
(13Z,16Z)- N,N -디메틸-3- 노닐도코사 -13,16- 디엔 -1-아민 (화합물 32)
Figure pct00074
실릴 아미드 피터슨 시약 (3.1 g, 16.7 mmol)을 THF (35 mL) 중에 용해시키고, -63℃로 냉각시켰다. 상기 용액에 nBuLi (16.7 mmol, 2.5 M 용액 6.7 mL)을 첨가하였다. 반응물을 30분 동안 주변 온도로 가온시켰다. 케톤 (5.0 g, 11.9 mmol)을 제2 플라스크 중에서 THF (25 mL)에 용해시켰다. -60℃에서 피터슨 시약을 케톤 용액으로 옮겨 놓았다. 반응물을 1시간 동안 -40℃로 가온시킨 후, 30분 동안 0℃로 가온시켰다. 중탄산나트륨으로 반응물을 켄칭시키고, 추가의 물로 희석시키고, 물/헥산 사이에 분배하였다. 유기물을 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과시키고, 진공에서 증발시켰다. 플래쉬 크로마토그래피 (0-40% MTBE/헥산)에 의해 정제하여 α,β-불포화된 아미드 (vi)를 수득하였다.
Figure pct00075
Figure pct00076
밀봉된 튜브 중에서 α,β-불포화된 아미드 (vi) (1 g, 2.1 mmol) 및 LS-셀렉트라이드 (4.1 mmol, 1 M 용액 4.1 mL)를 조합하고, 24시간 동안 60℃로 가열하였다. 반응물을 주변 온도로 냉각시키고, 염화암모늄 용액과 헵탄 사이에 분배하였다. 유기물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과시키고, 진공에서 증발시켜 아미드 (vii)를 수득하였다. 상기 중간체를 조 상태 그대로 다음 반응에 직접 이월시켰다.
Figure pct00077
아미드 (vii) 용액 (2.85 g, 5.8 mmol)에 수소화 알루미늄 리튬 (8.7 mmol, 1 M 용액 8.7 mL)을 첨가하였다. 반응물을 주변 온도에서 10분 동안 교반한 후, 황산나트륨 10수화물 용액을 천천히 첨가하여 켄칭시켰다. 고체를 여과시키고, THF로 세척하고, 여과물을 진공에서 증발시켰다. 조 혼합물을 역상 정제용 크로마토그래피 (C8 칼럼)에 의해 정제하여 오일로서 (13Z,16Z)-N,N-디메틸-3-노닐도코사-13,16-디엔-1-아민 (화합물 32)을 수득하였다.
Figure pct00078
N,N -디메틸-1-(2- 옥틸시클로프로필 ) 헵타데칸 -8-아민 (화합물 33)
Figure pct00079
0℃로 냉각된 DCM (500 mL) 중의 올레산 (1 g, 3.5 mmol) 용액에 CDI (0.63 g, 3.9 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 30분 동안 주변 온도로 가온시킨 후, 0℃로 냉각시키고, 먼저 트리에틸아민 (0.39 g, 3.9 mmol)으로 처리한 후, 디메틸 히드록실아민 히드로클로라이드 (0.38 g, 3.9 mmol)로 처리하였다. 1시간 후, 반응물을 물과 헵탄 사이에 분배하였다. 유기물을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과시키고, 진공에서 증발시켜 조 와인랩 아미드 (ii)를 수득하고, 이를 바로 다음 반응으로 이월시켰다.
Figure pct00080
디클로로메탄 (130 mL) 중 디에틸아연 (70.3 mmol, 1 M 용액 70.3 mL)을 -1℃로 냉각시키고, TFA (8.0 g, 70.3 mmol)를 적가함으로써 처리하였다. 30분 후, 디아이오도메탄 (18.8 g, 70.3 mmol)을 첨가하고, 이를 얼음조 중에서 30분 동안 숙성시켰다. 상기 용액에 와인랩 아미드 (ii) (7.6 g, 23.4 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 주변 온도로 가온시키고, 1시간 동안 교반하였다. 염화암모늄 용액 (100 mL)으로 반응물을 켄칭시키고, 유기층을 분배하고, 10% 티오황산나트륨으로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과시키고, 진공에서 증발시켰다. 플래쉬 크로마토그래피 (0-30% MTBE/헵탄)에 의해 정제하여 원하는 생성물 (ix)을 수득하였다.
Figure pct00081
Figure pct00082
와인랩 아미드 (ix)의 화합물 33으로의 전환은 상기 화합물 1에 대하여 기술된 것과 유사한 방식으로 (노닐 그리냐르 첨가 후, 환원성 아미노화) 수행하였다.
Figure pct00083
화합물 34-43은 신규한 양이온성 지질이며, 이는 상기 일반 반응식 1-4에 따라 제조하였다.
Figure pct00084
Figure pct00085
(11E,20Z,23Z)- N,N - 디메틸노나코사 -11,20,23-트리엔-10-아민 (화합물 44)
Figure pct00086
-78℃로 냉각된 THF (127 mL) 중의 LDA 용액 (95 mmol, 2 M 용액 47.5 mL)에 t-부틸 아세테이트를 첨가하였다. 반응물을 15분 동안 교반한 후, 알데히드 (x)를 첨가하였다. 즉시 염화암모늄 용액으로 반응물을 켄칭시키고, 주변 온도로 가온시키고, 물/펜탄 사이에 분배하였다. 유기물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과시키고, 진공에서 증발시켰다. LC/MS (M+H-tBu) = 325.4.
Figure pct00087
히드록시 케톤 (xi) (7 g, 18.4 mmol)를 디클로로메탄 (150 mL) 중에 용해시키고, 0℃로 냉각시키고, 데옥소플루오르 (7.3 g, 33.1 mmol)로 처리하였다. 16시간 동안 교반시키면서, 반응물을 주변 온도로 가온시킨 후, 중탄산나트륨 용액으로 켄칭시켰다. 반응물을 분배하고, 유기물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과시키고, 진공에서 증발시켰다. 플래쉬 칼럼 크로마토그래피 (0-5% 에틸 아세테이트/헥산)에 의해 플루오로 에스테르를 수득하였다.
디클로로메탄 중의 플루오로 에스테르 중간체 (6 g, 15.6 mmol)를 염화수소 (157 mmol, 디옥산 중 4 M 용액 39.2 mL)로 처리하고, 반응물을 주변 온도에서 16시간 동안 교반하였다. 반응물을 진공에서 증발시켜 원하는 β-플루오로산 (xii)을 수득하였다. LC/MS (M+H) = 327.3.
Figure pct00088
플루오로 카르복실산 (xii) (5.1 g, 15.7 mmol), EDC (6.0 g, 31.4 mmol), N,O-디메틸히드록실아민 히드로클로라이드 (3.1 g, 31.4 mmol), 트리메틸아민 (4.0 g, 39.2 mmol), 및 HOAt (4.3 g, 31.4 mmol)를 DCM (78 mL) 중에서 조합하고, 주변 온도에서 16시간 동안 교반하였다. 반응물을 물/DCM 사이에 분배하고, 유기물을 물 (3x) 및 NaOH 용액 (1x)으로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과시키고, 진공에서 증발시켰다. 조 물질을 역상 정제용 크로마토그래피에 의해 정제하여 원하는 와인랩 아미드 (xiii)를 수득하였다. LC/MS (M+H) = 370.4.
Figure pct00089
주변 온도에서 THF (50 mL) 중의 와인랩 아미드 (xiii) (4.3 g, 11.7 mmol)의 용액을 노닐마그네슘 브로마이드 (23.4 mmol, 1 M 용액 23.4 mL)로 처리하였다. 1시간 후, 반응물을 염화암모늄 용액으로 켄칭시키고, 물과 펜탄 사이에 분배하였다. 유기물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과시키고, 진공에서 증발시켰다. 상기 물질을 조 상태 그대로 다음 반응에 이월시켰다.
Figure pct00090
케톤 (xiv) (5.1 g, 11.7 mmol)을 디메틸아민 (29.3 mmol, THF 중의 2 M 용액 14.7 mL) 및 티타늄(IV) 이소프로폭시드 (6.7 g, 23.5 mmol)로 처리하고, 반응물을 주변 온도에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 에탄올 (50 mL)을 첨가한 후, 나트륨 보로히드라이드 (0.67 g, 17.6 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실리카 칼럼 상에 직접 로딩하고, 플래쉬 크로마토그래피 (0-15% MeOH/DCM)에 의해 정제하였다. 이 물질은 정제용 역상 크로마토그래피에 의한 2차 정제를 필요로 하였으며, 그에 의해 (11E,20Z,23Z)-N,N-디메틸노나코사-11,20,23-트리엔-10-아민을 수득하였다.
Figure pct00091
화합물 45는 문헌 [Nature Biotechnology, 2010, 28, 172-176], WO 2010/042877 A1, WO 2010/048536 A2, WO 2010/088537 A2, 및 WO 2009/127060 A1에 기술되어 있는 것과 같은 DLinKC2DMA이다.
Figure pct00092
화합물 46은 WO 2010/054401, 및 WO 2010/144740 A1에 기술되어 있는 것과 같은 MC3이다.
Figure pct00093
E. 지질 나노입자 조성물
본 발명의 하기 지질 나노입자 조성물 (LNP)은 올리고뉴클레오티드, 구체적으로, 본 발명의 siNA 분자를 전달하는 데 유용하다:
양이온성 지질/콜레스테롤/PEG-DMG 56.6/38/5.4;
양이온성 지질/콜레스테롤/PEG-DMG 60/38/2;
양이온성 지질/ 콜레스테롤/PEG-DMG 67.3/29/3.7;
양이온성 지질/콜레스테롤/PEG-DMG 49.3/47/3.7;
양이온성 지질/콜레스테롤/PEG-DMG 50.3/44.3/5.4;
양이온성 지질/콜레스테롤/PEG-C-DMA/DSPC 40/48/2/10;
양이온성 지질/콜레스테롤/PEG-DMG/DSPC 40/48/2/10; 및
양이온성 지질/콜레스테롤/PEG-DMG/DSPC 58/30/2/10.
본 발명은 목적을 달성하고, 언급된 목표 및 이점 뿐만 아니라, 그안에 내재되어 있는 것을 얻기 위해서 잘 적합화될 수 있다는 것을 당업자는 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 현 상태 그대로 바람직한 실시양태를 나타내는 바와 같이, 본원에 기술된 방법 및 조성물은 예시적인 것이며, 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것은 아니다. 그의 변경 및 다른 용도가 당업자에게 떠오를 것이며, 이는 특허청구범위의 범주에 의해 정의되는 본 발명의 정신에 포함된다.
<표 7>
Figure pct00094
Figure pct00095
<표 8>
Figure pct00096
Figure pct00097
Figure pct00098
<표 9>
Figure pct00099
Figure pct00100
<표 10>
Figure pct00101
Figure pct00102
Figure pct00103
<표 11>
Figure pct00104
SEQUENCE LISTING <110> Steve Bartz Duncan Brown Michael Robinson <120> RNA Interference Mediated Inhibition of Hepatitis B Virus (HBV) Gene Expression using Short Interfering Nucleic Acid (siNA) <130> SIR-IFD-00001 <160> 526 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 ucguggugga cuucucuca 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 gugguggacu ucucucaau 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 gccgauccau acugcggaa 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 ccgauccaua cugcggaac 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 cauccugcug cuaugccuc 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 6 ugcugcuaug ccucaucuu 19 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 7 gguggacuuc ucucaauuu 19 <210> 8 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 8 ugguggacuu cucucaauu 19 <210> 9 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 9 uagacucgug guggacuuc 19 <210> 10 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 10 uccucugccg auccauacu 19 <210> 11 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 11 ugccgaucca uacugcgga 19 <210> 12 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 12 uggauguguc ugcggcguu 19 <210> 13 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 13 cgauccauac ugcggaacu 19 <210> 14 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 14 cgcaccucuc uuuacgcgg 19 <210> 15 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 15 cugccgaucc auacugcgg 19 <210> 16 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 16 cgugguggac uucucucaa 19 <210> 17 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 17 cugcugcuau gccucaucu 19 <210> 18 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 18 ccugcugcua ugccucauc 19 <210> 19 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 19 cuagacucgu gguggacuu 19 <210> 20 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 20 uccugcugcu augccucau 19 <210> 21 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 21 gacucguggu ggacuucuc 19 <210> 22 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 22 auccauacug cggaacucc 19 <210> 23 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 23 cucugccgau ccauacugc 19 <210> 24 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 24 gauccauacu gcggaacuc 19 <210> 25 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 25 gaagaacucc cucgccucg 19 <210> 26 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 26 aagccuccaa gcugugccu 19 <210> 27 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 27 agaagaacuc ccucgccuc 19 <210> 28 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 28 ggagugugga uucgcacuc 19 <210> 29 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 29 ccucugccga uccauacug 19 <210> 30 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 30 caagccucca agcugugcc 19 <210> 31 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 31 uccauacugc ggaacuccu 19 <210> 32 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 32 cagagucuag acucguggu 19 <210> 33 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 33 aagaagaacu cccucgccu 19 <210> 34 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 34 gaguguggau ucgcacucc 19 <210> 35 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 35 ucuagacucg ugguggacu 19 <210> 36 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 36 gcugcuaugc cucaucuuc 19 <210> 37 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 37 agucuagacu cguggugga 19 <210> 38 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 38 cuccucugcc gauccauac 19 <210> 39 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 39 uggcucaguu uacuagugc 19 <210> 40 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 40 gucuagacuc gugguggac 19 <210> 41 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 41 uucaagccuc caagcugug 19 <210> 42 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 42 cuaugggagu gggccucag 19 <210> 43 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 43 cucguggugg acuucucuc 19 <210> 44 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 44 ccuaugggag ugggccuca 19 <210> 45 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 45 aagaacuccc ucgccucgc 19 <210> 46 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 46 ucugccgauc cauacugcg 19 <210> 47 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 47 agagucuaga cucguggug 19 <210> 48 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 48 gaagaagaac ucccucgcc 19 <210> 49 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 49 ucaagccucc aagcugugc 19 <210> 50 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 50 agccuccaag cugugccuu 19 <210> 51 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 51 agacucgugg uggacuucu 19 <210> 52 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> ribonucleotide unmodified or modified as described for this sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> inverted abasic cap <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> inverted abasic cap <400> 52 ucguggugga cuucucucat t 21 <210> 53 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-O-methyl <400> 53 ugagagaagu ccaccacgau u 21 <210> 54 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> ribonucleotide unmodified or modified as described for this sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> inverted abasic cap <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> 2'-deoxy <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (6)..(8) <223> 2'-deoxy <220> <221> misc_feature <222> (9)..(16) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> 2'-deoxy <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> inverted abasic cap <400> 54 gugguggacu ucucucaaut t 21 <210> 55 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (4)..(11) <223> 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (12)..(14) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-O-methyl <400> 55 auugagagaa guccaccacu u 21 <210> 56 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> ribonucleotide unmodified or modified as described for this sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> inverted abasic cap <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> inverted abasic cap <400> 56 gccgauccau acugcggaat t 21 <210> 57 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-O-methyl <400> 57 uuccgcagua uggaucggcu u 21 <210> 58 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> ribonucleotide unmodified or modified as described for this sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> inverted abasic cap <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> inverted abasic cap <400> 58 gugguggacu ucucucaaut t 21 <210> 59 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-O-methyl <400> 59 auugagagaa guccaccacu u 21 <210> 60 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> ribonucleotide unmodified or modified as described for this sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> inverted abasic cap <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> 2'-deoxy <220> <221> misc_feature <222> (5)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> 2'-deoxy <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> 2'-deoxy <220> <221> misc_feature <222> (11)..(12) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (15)..(18) <223> 2'-deoxy <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> inverted abasic cap <400> 60 ccgauccaua cugcggaact t 21 <210> 61 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (18)..(21) <223> 2'-O-methyl <400> 61 guuccgcagu auggaucggu u 21 <210> 62 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> ribonucleotide unmodified or modified as described for this sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> inverted abasic cap <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> inverted abasic cap <400> 62 cauccugcug cuaugccuct t 21 <210> 63 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-O-methyl <400> 63 gaggcauagc agcaggaugu u 21 <210> 64 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> ribonucleotide unmodified or modified as described for this sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> inverted abasic cap <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> inverted abasic cap <400> 64 ugcugcuaug ccucaucuut t 21 <210> 65 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-O-methyl <400> 65 aagaugaggc auagcagcau u 21 <210> 66 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> ribonucleotide unmodified or modified as described for this sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> inverted abasic cap <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 2'-deoxy <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (4)..(6) <223> 2'-deoxy <220> <221> misc_feature <222> (7)..(14) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> 2'-deoxy <220> <221> misc_feature <222> (17)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> inverted abasic cap <400> 66 gguggacuuc ucucaauuut t 21 <210> 67 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (6)..(13) <223> 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-O-methyl <400> 67 aaauugagag aaguccaccu u 21 <210> 68 <211> 21 <212> DNA <213> 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auccagcauc uagggaucuu guaguaaauu auguuaauac 360 uaacgugggu uuaaagauca ggcaacuauu gugguuucau auaucuugcc uuacuuuugg 420 aagagagacu guacuugaau auuuggucuc uuucggagug uggauucgca cuccuccagc 480 cuauagacca ccaaaugccc cuaucuuauc aacacuuccg gaaacuacug uuguuagacg 540 acgggaccga ggcagguccc cuagaagaag aacucccucg ccucgcagac gcagaucucc 600 aucgccgcgu cgcagaagau cucaaucucg ggaaucucaa uguuaguauu ccuuggacuc 660 auaagguggg aaacuuuacg gggcuuuauu ccucuacagu accuaucuuu aauccugaau 720 ggcaaacucc uuccuuuccu aagauucauu uacaagagga cauuauuaau aggugucaac 780 aauuuguggg cccucucacu guaaaugaaa agagaagauu gaaauuaauu augccugcua 840 gauucuaucc uacccacacu aaauauuugc ccuuagacaa aggaauuaaa ccuuauuauc 900 cagaucaggu aguuaaucau uacuuccaaa ccagacauua uuuacauacu cuuuggaagg 960 cugguauucu auauaagcgg gaaaccacac guagcgcauc auuuugcggg ucaccauauu 1020 cuugggaaca agagcuacag caugggaggu uggucaucaa aaccucgcaa aggcaugggg 1080 acgaaucuuu cuguucccaa uccucuggga uucuuucccg aucaucaguu ggacccugca 1140 uucggagcca acucaaacaa uccagauugg 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auucccaucc caucguccug ggcuuucgca 2040 aaauaccuau gggagugggc cucaguccgu uucucuuggc ucaguuuacu agugccauuu 2100 guucaguggu ucguagggcu uucccccacu guuuggcuuu cagcuauaug gaugaugugg 2160 uauugggggc caagucugua cagcaucgug agucccuuua uaccgcuguu accaauuuuc 2220 uuuugucucu ggguauacau uuaaacccua acaaaacaaa aagauggggu uauucccuaa 2280 acuucauggg cuacauaauu ggaaguuggg gaacuuugcc acaggaucau auuguacaaa 2340 agaucaaaca cuguuuuaga aaacuuccug uuaacaggcc uauugauugg aaaguauguc 2400 aaagaauugu gggucuuuug ggcuuugcug cuccauuuac acaaugugga uauccugccu 2460 uaaugccuuu guaugcaugu auacaagcua aacaggcuuu cacuuucucg ccaacuuaca 2520 aggccuuucu aaguaaacag uacaugaacc uuuaccccgu ugcucggcaa cggccugguc 2580 ugugccaagu guuugcugac gcaaccccca cuggcugggg cuuggccaua ggccaucagc 2640 gcaugcgugg aaccuuugug gcuccucugc cgauccauac ugcggaacuc cuagccgcuu 2700 guuuugcucg cagccggucu ggagcaaagc ucaucggaac ugacaauucu gucguccucu 2760 cgcggaaaua uacaucguuu ccauggcugc uaggcuguac ugccaacugg auccuucgcg 2820 ggacguccuu uguuuacguc ccgucggcgc ugaaucccgc ggacgacccc ucucggggcc 2880 gcuugggacu cucucguccc cuucuccguc ugccguucca gccgaccacg gggcgcaccu 2940 cucuuuacgc ggucuccccg ucugugccuu cucaucugcc gguccgugug cacuucgcuu 3000 caccucugca cguugcaugg agaccaccgu gaacgcccau cagauccugc ccaaggucuu 3060 acauaagagg acucuuggac ucccagcaau gucaacgacc gaccuugagg ccuacuucaa 3120 agacugugug uuuaaggacu gggaggagcu gggggaggag auuagguuaa aggucuuugu 3180 auuaggaggc uguaggcaca aauuggucug cgcaccagca c 3221 <210> 505 <211> 3215 <212> RNA <213> Hepatitis B virus <400> 505 cucaacccag uuccaccaag cucuguugga ucccagggua agggcucugu acuucccugc 60 ugguggcucc aguucaggga cacagaaccc ugcuccgacu auugccucuc ucacaucauc 120 aaucuucucg aagacugggg gcccugcuau gaacauggac aacauuacau caggacuccu 180 aggaccccug cucguguuac aggcggugug uuucuuguug acaaaaaucc ucacaauacc 240 acagagucua gacucguggu ggacuucucu caauuuucua gggggacuac ccgggugucc 300 uggccaaaau ucgcaguccc caaccuccaa ucacuuacca accuccuguc cuccaacuug 360 uccuggcuau cguuggaugu gucugcggcg uuuuaucauc uuccucuuca uccugcugcu 420 augccucauc uucuuguugg uucuucugga cuaucaaggu auguugcccg uuuguccucu 480 acuuccagga uccacgacca ccagcacggg acccugcaaa accugcacaa cucuugcaca 540 aggaaccucu auguuucccu ccuguugcug uuccaaaccc ucggacggaa acugcacuug 600 uauucccauc ccaucauccu gggcuuuagg aaaauaccua ugggaguggg ccucagcccg 660 uuucuccugg cucaguuuac uagugcaauu uguucagugg ugcgucgggc uuucccccac 720 uguuuggcuu uuaguuauau ggaugaucug guauuggggg ccaaaucugu gcagcaucuu 780 gagucccuuu auaccgcugu uaccaauuuu cuguuaucug uggguaucca uuuaaauacc 840 ucuaaaacaa aaagaugggg uuacucccua cauuuuaugg guuaugucau ugguaguugg 900 ggaucauuac cccaagauca cauuguacac aaaaucaagg aaugcuuucg aaaacugccu 960 guaaaucguc caauugauug gaaaguuugu caacgcauag ugggucuuuu gggcuuugcu 1020 gccccuuuca cccaaugcgg uuauccugcu cucaugccuc uguaugccug uauuacugcu 1080 aaacaggcuu uugucuucuc gccaaccuac aaggccuuuc uguguaaaca auacaugaac 1140 cuuuacccgg uugcucggca acggccaggc cugugccaag uguuugcuga cgcaaccccc 1200 acugguuggg gcuuggccau uggccaucag cgcaugcgug gaaccuuugu ggcuccucug 1260 ccgauccaua 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ugggugggca auaauuugga ggacccugca gcuagggauu uaguaguuaa 2160 cuauguuaac acuaacaugg gccuaaaaau uagacaacug uugugguuuc acauuuccug 2220 ccuuacuuuu ggaagagaaa caguucuaga guauuuggug uccuuuggag uguggauucg 2280 cacuccuccu gcuuacagac caccaaaugc cccuauccua uccacacuuc cggaaacuac 2340 uguuguuaga cgacgaggca gguccccuag aagaagaacu cccucgccuc gcagacgaag 2400 aucucaaucg ccgcgucgcc gcagaucuca aucuccagcu ucccaauguu aguauuccuu 2460 ggacucauaa ggugggaaac uuuacggggc uuuacucuuc uacugugccu gcuuuuaauc 2520 cuaacugguc cacuccuucu uuuccugaua uucauuugca ucaagaccug auuucuaaau 2580 gugaacaauu uguaggccca cuuacuaaaa augaauuacg aagauuaaaa uugguuaugc 2640 cagcuagauu uuauccuaag guuaccaaau auuuucccau ggauaaaggc aucaaacccu 2700 auuauccuga gcaugcaguu aaucauuacu uuaaaaccag acauuauuug cauacuuuau 2760 ggaaggcggg aauuuuauau aagagagaau ccacacguag cgccucauuu ugugggucac 2820 cauauuccug ggaacaagag cuacagcaug ggagcaccuc ucucaacgac acgaagaggc 2880 augggacaga aucucucugu gcccaauccu cugggauucu uuccagacca ucagcuggau 2940 ccgcuauuca gagcaaauuc cagcaguccc gacugggacu ucaacacaaa caaggacagu 3000 uggccaaugg caaacaaggu aggaguggga ggcuacgguc caggguucac acccccacac 3060 gguggccugc ugggguggag cccucaagca caaggugugu uaacaaccuu gccagcagau 3120 ccgccuccug cuuccaccaa ucggcggucc gggagaaagc caaccccagu cucuccaccu 3180 cuaagagaca cacauccaca ggcaaugcag uggaa 3215 <210> 506 <211> 3182 <212> RNA <213> Hepatitis B virus <400> 506 aacuccacaa ccuuccacca aacucugcaa gaucccagag ugagaggccu guauuucccu 60 gcugguggcu ccaguucagg aacaguaaac ccuguucuga cuacugccuc ucccuuaucg 120 ucaaucuccg cgaggacugg ggacccugca cugaacaugg agaacaucac aucaggauuc 180 cuaggacccc ugcucguguu acaggcgggg uuuuucuugu ugacaagaau ccucacaaua 240 ccgcagaguc uagacucgug guggacuucu cucaauuuuc uagggggaac uaccgugugu 300 cuuggccaaa auucgcaguc cccaaccucc aaucacucac caaccucuug uccuccaacu 360 uguccugguu aucgcuggau gugucugcgg cguuuuauca ucuuccucuu cauccugcug 420 cuaugccuca ucuucuuguu gguucuucug gacuaucaag guauguugcc cguuuguccu 480 cuaauuccag gaucuucaac aaccagcacg ggaccaugca gaaccugcac gacuccugcu 540 caaggaaccu cuauguaucc cuccuguugc uguaccaaac cuucggacgg aaauugcacc 600 uguauuccca ucccaucauc uugggcuuuc ggaaaauucc uaugggagug ggccucagcc 660 cguuucuccu ggcucaguuu acuagugcca uuuguucagu gguucguagg gcuuuccccc 720 acuguuuggc uuucaguuau auggaugaug ugguauuggg ggccaagucu guacagcauc 780 uugagucccu uuuuaccgcu guuaccaauu uucuuuuguc ucuggguaua cauuuaaacc 840 cuaacaaaac aaaaagaugg gguuauuccc uaaacuucau ggguuacaua auuggaaguu 900 ggggaacguu gccacaagau cauauuguac aaaagaucaa agaauguuuu agaaaacuuc 960 cuguuaacag gccuauugau uggaaaguau ggcaacgaau ugugggucuu uugggcuuug 1020 cugcuccauu uacacaaugu ggauauccug ccuuaaugcc uuuguaugcc uguauacaag 1080 cuaaacaggc uuucacuuuc ucgccaacuu acaaggccuu ucuaaguaaa caguacauga 1140 accuuuaccc cguugcucgg caacggccug gucugugcca aguguuugcu gacgcaaccc 1200 ccacuggcug gggcuuggca auaggcaauc agcgcaugcg uggaaccauu guggcuccuc 1260 ugccgaucca uacugcggaa cuccuagccg cuuguuuugc ucgcagccgg ucuggggcaa 1320 agcucaucgg aacugacaau ucuguugucc ucucgcggaa auauacaucg uuuccauggc 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ggggcgcacc ucucuuuacg cggucucccc gucugugccu 1560 ucucaucugc cggaccgugu gcacuucgcu ucaccucugc acguagcaug gagaccaccg 1620 ugaacgccca ccaggucuug cccaaggucu uacacaagag gacucuugga cucucagcaa 1680 ugucaacgac cgaccuugag gcauacuuca aagacuguuu guuuaaagac ugggaggagu 1740 ugggggagga gauuagguua aaggucuuug uacuaggagg cuguaggcau aaauuggucu 1800 guucaccagc accaugcaac uuuuuccccu cugccuaauc aucucauguu cauguccuac 1860 uguucaagcc uccaagcugu gccuugggug gcuuuggggc auggacauug acccguauaa 1920 agaauuugga gcuucugugg aguuacucuc uuuuuugccu ucugacuucu uuccuucuau 1980 ucgagaucuc cucgacaccg ccucugcucu guaucgggag gccuuagagu cuccggaaca 2040 uuguucaccu caccauacag cacucaggca agcuauucug uguuggggug aguugaugaa 2100 ucuggccacc ugggugggaa guaauuugga agacccagca uccagggaau uaguagucag 2160 cuaugucaau guuaauaugg gccuaaaaau uagacaacua uugugguuuc acauuuccug 2220 ccuuacuuuu ggaagagaaa cuguccuuga guauuuggug ucuuuuggag uguggauucg 2280 cacuccuccc gcuuacagac caccaaaugc cccuaucuua ucaacacuuc cggaaacuac 2340 uguuguuaga cgacgaggca 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1620 ugaacgccca ccggaaccug cccaaggucu ugcauaagag gacucuugga cuuucagcaa 1680 ugucaacgac cgaccuugag gcauacuuca aagacugugu guuuaaugag ugggaggagc 1740 ugggggagga gauuagguua aaggucuuug uacucggagg cuguaggcau aaauuggucu 1800 guucaccagc accaugcaac uuuuucaccu cugccuaguc aucucuuguu cauguccuac 1860 uguucaagcc uccaagcugu gccuugggug gcuuuggggc auggacauug accccuauaa 1920 agaauuugga gcuacugugg aguuacucuc uuuuuugccu ucugacuucu uuccgucggu 1980 gcgggaccuc cuagauaccg ucucugcucu guaucgggaa gccuuaaaau cuccugagca 2040 uugcucaccu caccacacag cacucaggca agcuauucug ugcugggggg aauuaaugac 2100 ucuagcuacc ugggugggua auaauuugga agauccagca ucccgggauc uaguagucaa 2160 uuauguuaac acuaacaugg gccuaaagau caggcaacua uggugguuuc acauuuccug 2220 ucuuacuuuu ggaagagaaa cuguucugga auauuuggua ucuuuuggag uguggauucg 2280 cacuccuccu gccuacagac caccaaaugc cccuaucuua ucaacacuuc cggaaacuac 2340 uguuguuaga cgacgaggca gguccccuag aagaagaacu cccucgccuc gcagacgaag 2400 gucucaauca ccgcgucgca gaagaucuca aucucgggaa ucccaauguu aguaucccuu 2460 ggacucauaa ggugggaaac uuuacggggc uuuauucuuc uacaguaccu gucuuuaauc 2520 cugaauggca aacuccuucu uuuccagaca uucauuuaca ggaggacauu guugauagau 2580 guaagcaauu ugugggaccc cuuacaguaa augaaaacag gagacuaaaa uuaauaaugc 2640 cugcuagauu uuaucccaau guuaccaaau auuugcccuu agauaaaggu aucaaaccuu 2700 auuauccaga gcauguaguu aaucauuacu uccagacuag acauuauuug cauacucuuu 2760 ggaaggcggg uaucuuauau aaaagagagu caacacauag cgccucauuu ugcgggucac 2820 cuuauucuug ggaacaagau cuacagcaug ggagguuggu cuuccaaacc ucgaaaaggc 2880 auggggacaa aucuuucugu ccccaauccc cugggauucu uccccgauca ucaguuggac 2940 ccugcauuca aagccaacuc agaaaaucca gauugggacc ucaacccaca caaggacaac 3000 uggccggacg cccacaaggu gggaguggga gcauucgggc caggauucac cccuccccau 3060 gggggacugu ugggguggag cccucaggcu cagggcauac ucacaucugu gccagcagcu 3120 ccuccuccug ccuccaccaa ucggcaguca ggacggcagc cuacuccccu aucuccaccu 3180 cuaagggaca cucauccuca ggccaugcag uggaa 3215 <210> 509 <211> 3182 <212> RNA <213> Hepatitis B virus <400> 509 aacuccacaa ccuuccacca aacucugcaa gaucccagag ugagaggccu guaucucccu 60 gcugguggcu ccaguucagg aacaguaaac ccuguuccga cuacugucuc ucccauaucg 120 ucaaucuucu cgaggauugg ggacccugcg cugaacaugg agaacaucac aucaggauuc 180 cuaggacccc ugcucguguu acaggcgggg uuuuucuugu ugacaaaaau ccucacaaua 240 ccgaagaguc uagacucgug guggacuucu cucaauuuuc uagggggaac caccgugugu 300 cuuggccaaa auucgcaguc cccaaccucc aaucacucac caaccuccug uccuccaacu 360 uguccugguu aucgcuggau gugucugcgg cguuuuauca ucuuccucuu cauccugcug 420 cuaugccuca ucuucuuguu gguucuucug gacuaucaag guauguugcc cguuuguccu 480 cugauuccag gaucuucaac caccagcacg ggaccaugca gaaccugcac gacuccugcu 540 caaggaaccu cuauguaucc cuccuguugc uguaccaaac cuucggacgg aaauugcacc 600 uguauuccca ucccaucauc cugggcuuuc ggaaaauucc uaugggagug ggccucagcc 660 cguuucuccu ggcucaguuu acuagugcca uuuguucagu gguucguagg gcuuuccccc 720 acuguuuggc uuuuaguuau auggaugaug ugguauuggg ggccaaaacu guucaccauc 780 uugagucccu uuuuaccgcu guuaccaauu uucuuuuguc uuuggguaua caucuaaacc 840 cuaacaaaac aaaaagaugg gguuacucuu uacauuuuau gggcuauguc auuggauguu 900 augggucuuu gccacaagau cacaucauac agaaaaucaa agaauguuuu agaaaacuuc 960 cuguuaacag gccuauugau uggaaagucu gucaacguau ugugggucuu uugggauuug 1020 cugcuccuuu uacacaaugu gguuauccug cuuuaaugcc cuuguaugca uguauucaau 1080 cuaagcaggc uuucacuuuc ucgccaacuu acaaggccuu ucuguguaaa caauaccuga 1140 accuuuaccc cguugcccgg caacgcccag gucugugcca aguguuugcu gacgcaaccc 1200 ccacuggcug gggcuugguc augggccauc agcgcaugcg uggaaccuuu caggcuccuc 1260 ugccgaucca uacugcggaa cuccuagccg cuuguuuugc ucgcagccgg ucuggagcaa 1320 acauucucgg gacggauaac ucuguuguuc ucucccgcaa auauacgucg uuuccauggc 1380 ugcuaggcug ugcugccaac uggauccugc gcgggacguc cuuuguuuac gucccgucgg 1440 cgcugaaucc cgcggacgac ccuucucggg gccgcuuggg acucucucgu ccccuucucc 1500 gucugccguu ucgaccgacc acggggcgca ccucucuuua cgcggacucc ccgucugugc 1560 cuucucaucu gccggaccgu gugcacuucg cuucaccucu gcacgucgca uggagaccac 1620 cgugaacgcc caccaauucu ugcccaaggu cuuacauaag aggacucuug gacucucugu 1680 aaugucaacg accgaccuug aggcauacuu caaagacugu uuguuuaagg acugggagga 1740 gucgggggag gagauuagau uaaugaucuu uguacuagga ggcuguaggc auaaauuggu 1800 cugcgcacca gcaccaugca acuuuuucac cucugccuaa ucaucucuug uucauguccu 1860 acuguucaag ccuccaagcu gugccuuggg uggcuuuagg acauggacau ugauccuuau 1920 aaagaauuug gagcuacugu ggaguuacuc ucguuucugc cuucugacuu cuuuccuuca 1980 guacgagauc uucuagauac cgccucagcu cuauaucggg aagccuuaga aucuccugag 2040 cauuguucac cucaccauac ugcacucagg caagcaauuc ucugcugggg ggaucuaaua 2100 acucuaucca ccuggguggg ugguaauuug gaagauccaa caucuaggga ccuaguaguc 2160 aguuauguua acacuaauau gggccuaaag uucaggcaac uauugugguu ucacauuucu 2220 ugucucacuu uuggaagaga aacggucaua gaguauuugg ugucuuuugg aguguggauu 2280 cgcacuccuc cagcuuauag accaccaaau gccccuaucu uaucaacacu uccggagacu 2340 acuguuguua gacgacgagg cagguccccu agaagaagaa cucccucgcc ucgcagacga 2400 aggucucaau cgccacgucg cagaagaacu caaucucggg aaucucaaug uuaguauucc 2460 cuggacucau aaggugggaa acuuuacggg gcuuuauucu ucuacuguuc cugucuuuaa 2520 cccucauugg aaaacacccu cuuuuccuaa uauacauuua caccaagaca 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ucugccgauc 1140 cauacugcgg aacuccuagc agcuuguuuu gcucgcgacc ggucuggagc aaaacuuauc 1200 gggacugaca acucgguugu ccucucucgg aaauacaccu ccuucccaug gcugcucggg 1260 ugugcugcca acuggauccu gcgcgggacg uccuuugucu acgucccguc ggcgcugaau 1320 cccgcggacg acccgucucg gggccguuug ggccucuacc gucccuugcu uucucugccg 1380 uuccagccga ccacggggcg caccucucuu uacgcggucu ccccgucugu gccuucucau 1440 cugccggacc gugugcacuu cgcuucaccu cugcacgucg cauggagacc accgugaacg 1500 gccaccaggu cuugcccaag cucuuacaua agaggacucu uggacucuca gcaaugucaa 1560 caaccgaccu ugaggcauac uucaaagacu guuuguuuaa agacugggag gaguuggggg 1620 aggagauuag guuaaagguc uuuguacuag gaggcuguag gcauaaauug gucuguucac 1680 cagcaccaug caacuuuuuc accucugccu aaucaucuca uguucauguc cuacuguuca 1740 agccuccaag cugugccuug gguggcuuug gggcauggac auugacccgu auaaagaauu 1800 uggagcuucu guggaguuac ucucuuuuuu gccuucugac uucuuuccuu cuauucgaga 1860 ucuccucgac accgccucug cucuguaucg ggaggccuua gagucuccgg aacauuguuc 1920 accucaccau acagcacuca ggcaagcuau ucuguguugg ggugaguuga ugaauuuggc 1980 caccugggug ggaaguaauu uggaagaccc agcauccagg gaauuaguag ucagcuaugu 2040 caauguuaau augggccuaa aaaucagaca acuauugugg uuucauauuu ccugucuuac 2100 uuuuggaaga gaaacuguuc uugaguauuu ggugucuuuu ggagugugga uucgcacucc 2160 ucccgcuuac agaccaccaa augccccuau cuuaucaaca cuuccggaaa cuacuguugu 2220 uagacgacga ggcagguccc cuagaagaag aacucccucg ccucgcagac gaaggucuca 2280 aucgccgcgu cgcagaagau cucaaucucg ggaaucucaa uguuaguauc ccuuggacuc 2340 auaagguggg aaacuuuacu gggcuuuauu cuucuacugu accuguccuu aauccugagu 2400 cccaaacucc cuccuuuccu aacauucauu uacaggagga cauuauuaau agaugucaac 2460 aauauguggg cccucuuaca guuaaugaaa aaaggagauu aaaauuaauu augccugcua 2520 gguucuaucc uaaccuuacc aaauauuugc ccuuggauaa aggcauuaaa ccuuauuauc 2580 cugaacaugc aguuaaucau uacuucaaaa cuaggcauua uuuacauacu cuguggaagg 2640 cuggcauucu auauaaaaga gaaacuacac gcagcgcuuc auuuuguggg ucaccauauu 2700 cuugggaaca agagcuacgg caugggaggu uggucuucca aaccucgaca aggcaugggg 2760 acgaaucuuu cuguucccaa uccucuggga uucuuucccg aucaccaguu ggacccugcg 2820 uucggagcca acucaaacaa uccagauugg gacuucaacc ccaacaagga ucacuggcca 2880 gaggcaauca agguaggagc gggagacuuc gggccagggu ucaccccacc acacggcggu 2940 cuuuuggggu ggagcccuca ggcucagggc auauugacaa cagugccagc agcgccuccu 3000 ccuguuucca ccaaucggca gucaggaaga cagccuacuc ccaucucucc accucuaaga 3060 gacagucauc cucaggccau gcaguggaac uccacaacau uccaccaagc ucugcuagau 3120 cccagaguga ggggccuaua uuuuccugcu gguggcucca guuccggaac aguaaacccu 3180 guuccgacua cugucucacc cauaucguca aucuu 3215 <210> 512 <211> 3182 <212> RNA <213> Hepatitis B virus <400> 512 aacuccacaa ccuuccaaca cacucugcaa gaucccagag ugaaaggccu guaucucccu 60 gcugguggcu ccaguucagg aacaguaaac ccuguuccga ccacugccuc ucccuuaucg 120 ucaaucuucu cgaggauugg ggacccugcg cugaacaugg agaacaucac aucaggauuc 180 cuaggacccc uucucguguu acaggcgggg uuuuucuugu ugacaagaau ccucacaaua 240 ccgcagaguc uagacucgug guggacuucu cucaauuuuc uagggggaac uaccgugugu 300 cuuggccaaa auucgcaguc cccaaccucc aaucacucac caaccuccug uccuccaacu 360 uguccugguu aucgcuggau 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agcgcaugcg uggaaccuuu cuggcuccuc 1260 ugccgaucca uacugcggaa cuccuagccg cuuguuuugc ucgcagcagg ucuggagcaa 1320 acauuaucgg gacugauaac ucuguugucc ucucccgcaa auauacaucg uuuccauggc 1380 ugcuaggcug ugcugccaac uggauccugc gcgggacguc cuuuguuuac gucccgucgg 1440 cgcugaaucc cgcggacgac cccucucggg gucgcuuggg acuuucucgu ccccuucucc 1500 gucugccguu ccgaccgacc acggggcgca ccucucuuua cgcggacucc ccgucugugc 1560 cuucucaucu gccggaccga gugcacuuag guucaccucu gcacgucgca uggagaccac 1620 cgugaacgcc caccaaaucu ugcccaaggu cuuacauaag aggacucuug gacuuucugc 1680 aaugucaacg accgaccuug aggcauacuu caaagacugu uuguuuaaag acugggagga 1740 guugggggag gagauuuggu uaaaggucuu uguacuagga ggcuguaggc auaaauuggu 1800 cugcgcacca gcaccaugcg acuuuuucac cucugccuaa ucaucucuug uucauguccu 1860 acuguucaag ccucuaagcu gugccuuagg uggcuuuagg gcauggacau ugacccuuau 1920 aaagaauuug gagcuucugu ggaguuacuc ucguuuuugc cuucugacuu cuuuccuuca 1980 guacgagauc uucuagauac cgccucagcu cuguaucggg aagccuuaga gucuccugag 2040 cacuguacac cucaccauac ugcacucagg caagcaauuc uuugcugggg ggaccuaaug 2100 acucuagcua ccuggguggg uguuaauuug gaagauccag caucuagaga ccuaguaguu 2160 aguuauguca acacuaauau gggccuaaag uucaggcaac uuuugugguu ucacguuucu 2220 ugucucacuu uuggaagaga aacaguugua gaguauuugg ugucuuucgg aguguggauu 2280 cgcacuccuc cagcuuauag accaccaaau gccccuaucc uaucaacacu uccggagacu 2340 acuguuguua gacgacgaug cagguccccu agaagaagaa cucccucgcc ucgcagacga 2400 aggucucaau cgccgcgucg cagaagaucu caaucucggg aaucucaaug uuaguauucc 2460 uuggacucau aaggugggga acuuuacugg gcuuuauucu ucuacuguac cugucuuuaa 2520 uccucauugg aaaacaccau cuuuuccuaa uauacauuua caccaagaca uuaucaaaaa 2580 augugaacag uuuguaggcc cacucacagu uaaugagaaa agaagauugc aauugauuau 2640 gccugcuagg uuuuauccaa auguuaccaa auauuuacca uuggauaagg guauuaaacc 2700 uuauuaucca gaacaucuag uuaaucauua cuuccaaacu agacacuauu uacacacucu 2760 auggaaggcg gguauauuau auaagagaga aacaacacau agcgccucau uuuguggguc 2820 accauauucu ugggaacaag aucuacagca uggggcagaa ucuuuccacc agcaauccuc 2880 ugggauucuu ucccgaccac caguuggauc cagccuucag agcaaacacc gcaaauccag 2940 auugggacuu caaucccaac aaggacaccu ggccagaugc caacaaggua ggagcuggag 3000 cauucgggcu ggguuucacc ccaccgcacg gaggccuuuu gggauggagc ccucaggcuc 3060 agggcauacu acuaacuuug ccagcaaauc cgccuccugc cuccaccaau cgccagucag 3120 gcaggcagcc uaccccgcug acuccaccuu ugagaaacac ucauccucag gccaugcagu 3180 gg 3182 <210> 513 <211> 3221 <212> RNA <213> Hepatitis B virus <400> 513 uuccacugcc uuccaccaag cucugcaaga ccccagaguc aggggucugu auuuuccugc 60 ugguggcucc aguucaggaa caguaaaccc ugcuccgaau auugccucuc acaucucguc 120 aaucuccgcg aggaccgggg acccugugac gaacauggag aacaucacau caggauuccu 180 aggaccccug cccguguuac aggcgggguu uuucuuguug acaagaaucc ucacaauacc 240 gcagagucua gacucguggu ggacuucucu caauuuucua gggggaucac ccgugugucu 300 uggccaaaau ucgcgauccc caaccuccaa ucacucacca accuccuguc cuccaauuug 360 uccugguuau cgcuggaugu gucugcggcg uuuuaucaua uuccucuuca uccugcugcu 420 augccucauc uucuuauugg uucuucugga uuaucaaggu auguugcccg uuuguccucu 480 aauucuagga ucaacaacaa ccaguacggg accaugcaaa 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auaucucuug 2220 ccuuacuuuu ggaagagaaa cuguacuuga auauuugguc ucuuucggag uguggauucg 2280 cacuccucca gccuauagac caccaaaugc cccuaucuua ucaacacuuc cggaaacuac 2340 uguuguuaga cgacgggacc gaggcagguc cccuagaaga agaacucccu cgccucgcag 2400 acgcagaucu caaucgccgc gucgcagaag aucucaaucu cgggaaucuc aauguuagua 2460 uuccuuggac ucauaaggug ggaaacuuca cugggcuuua uuccucuaca gcaccuaucu 2520 uuaauccuga auggcaaacu ccuuccuuuc cuaaaauuca uuuacaagag gacauuauua 2580 auagguguca acaauuugug ggcccucuca cuguaaauga aaagagaaga uugaaauuaa 2640 uuaugccugc uagauucuau ccuacccaca cuaaauauuu gcccuuagac aaaggaauua 2700 aaccuuauua uccagaucag guaguuaauc auuacuucca aaccagacau uauuuacaua 2760 cucuuuggaa ggcggguauu cuauauaaga gagaaaccac acguagcgca ucauuuugcg 2820 ggucaccaua uucuugggaa caagagcuac agcaugggag guuggucauc aaaaccucgc 2880 aaaggcaugg ggacgaaucu uucuguuccc aacccucugg gauucuuucc cgaucaucag 2940 uuggacccug uauucggagc caacucaaac aauccagauu gggacuucaa ccccaucaag 3000 gaccacuggc cagcagccaa ccagguagga gugggagcau ucgggccagg 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ggcucaguuu acuagugcca uuuguucagu gguucguagg gcuuuccccc 720 acugucuggc uuucaguuau auggaugaug ugguuuuggg ggccaagucu guacaacauc 780 uugagucccu uuaugccgcu guuaccaauu uucuuuuguc uuuggguaua cauuuaaacc 840 cucacaaaac aaaacgaugg ggauauuccc uuaacuucau gggauaugua auugggaguu 900 ggggcacauu gccacaggaa cauauuguac aaaaaaucaa acuguguuuu aggaaacuuc 960 cuguaaacag gccuauugau uggaaaguau gucaacgaau ugugggucua uugggguuug 1020 ccgccccuuu uacacaaugu ggauauccug cucuaaugcc uuuauaugca uguauacaag 1080 caaaacaggc uuuuacuuuc ucgccaacuu acaaggccuu ucuaaguaaa caguaucuga 1140 accuuuaccc cguugcucgg caacggccug gucugugcca aguguuugcu gacgcaaccc 1200 ccacugguug gggcuuggcg auaggccauc agcgcaugcg ugggaccuuu cugucuccuc 1260 ugccgaucca uacugcggaa cuccuagcag cuuguuuugc ucgcagcagg ucuggggcaa 1320 aacucaucgg gacugacaau ucugucguac ucucccgcaa guauacauca uuuccauggc 1380 ugcuaggcug ugcugccaac uggauccugc gcgggacguc cuuuguuuac gucccgucgg 1440 cgcugaaucc cgcggacgac cccucgcggg gccgcuuggg gcucuaccgc ccgcuucucc 1500 gccuguucua ccgaccgacc acggggcgca ccucucuuua cgcggacucc ccgucugugc 1560 cuucucaucu gccggaccgu gugcacuucg cuucaccucu gcacgucgca uggagaccac 1620 cgugaacgcc cacaggaacc ugcccaaggu cuugcauaag aggacucuug gacuuucagc 1680 aaugucaacg accgaccuug aggcauacuu caaagacugu guguuuaaug agugggagga 1740 guugggggag gagguuaggu uaaaggucuu uguacuagga ggcuguaggc auaaauuggu 1800 guguucacca gcaccaugca acuuuuucac cucugccuaa ucaucucaug uucauguccu 1860 acuguucaag ccuccaagcu gugccuuggg uggcuuuggg gcauggacau ugacccguau 1920 aaagaauuug gagcuucugu ggaguuacuc ucuuuuuugc cuucugacuu cuuuccuucu 1980 auucgagauc uccucgacac cgccucugcu cuguaucggg aggccuuaga gucuccggaa 2040 cauuguucac cucaccauac ggcacucagg caagcuauuc uguguugggg ugaguugaug 2100 aaucuagcca ccuggguggg aaguaauuug gaagauccau cauccaggga auuaguaguc 2160 agcuauguca acguuaauau gggcauaaaa aucagacaac uauugugguu ucacauuucc 2220 ugucucacuu uugggagaga aacuguucuu gaauauuugg ugucuuuugg aguguggauu 2280 cgcacuccuc cugcauauag accaccaaau gccccuaucu uaucaacacu uccggaaacu 2340 acuguuguua gacgaagagg 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uagucaauua uguuaauacu aacaugggcc uaaagaucag gcaauuauug ugguuucaua 840 uuucuugccu uacuuuugga agagaaacug uccuugagua uuuggucucu uucggagugu 900 ggauucgcac uccaccagcu uauagaccac caaaugcccc uaucuuauca acacuuccgg 960 aaacuacugu uguuagacga cgagaccgag gcaggucccc uagaagaaga acucccucgc 1020 cucgcagacg aagaucucaa ucgccgcguc gcagaagauc ucaaucucgg gaaucucaau 1080 guuaguauuc cuuggacuca uaagguggga aauuuuacug ggcuuuacuc uucuacuguc 1140 ccuaucuuua auccugaaug gcaaaccccu ucuuuuccua aaauucauuu acaugaagac 1200 auugcuaaua ggugucagca auuuguaggc ccucucacug uaaaugaaaa aagaagacug 1260 aaauuaauua ugccugcuag guuuuauccc aacagcacaa aauauuugcc uuuagacaaa 1320 gggauuaaac cuuauuaucc ugaucaugua guuaaucauu acuuucaaac ccgacauuau 1380 uuacauacuc uuuggaaggc ugggauucua uauaagaggg aaacuacacg uagcgccuca 1440 uuuugcgggu caccauauuc uugggaacaa gagcuacauc augggagguu ggucaucaaa 1500 accucgcaaa ggcaugggga cgaaccuuuc uguucccaac ccucugggau ucuuucccga 1560 ucaucaguug gacccugcau ucggagccaa uucaaacaau ccagauuggg acuucaaccc 1620 caucaaggac cacuggccac aagccaacca gguaggagug ggagcauucg ggccaggguu 1680 cacuccccca cacggaggug uuuuggggug gagcccucag gcucagggca uauuggccac 1740 agugccagca gugccuccuc cugccuccac caaucggcag ucaggaaggc agccuacucc 1800 caucucucca ccucuaagag acagucaucc ucaggccaug caguggaauu ccacagcuuu 1860 ccaccaagcu cugcaagauc ccagagucag gggccuguau uuuccugcug guggcuccag 1920 uucaggaaca cucaacccug uuccaacuau ugccucucac aucucgucaa ucuccucgag 1980 gauuggggac ccugugccga acauggagaa caucacauca ggauuccuag gaccccugcu 2040 cguguuacag gcgggguuuu ucuuguugac aagaauccuc acaauaccgc agagucuaga 2100 cucguggugg acuucucuca auuuucuagg gggaucaccc gugugucuug gccaaaauuc 2160 gcagucccca accuccaauc acucaccaac cuccuguccu ccaauuuguc cugguuaucg 2220 cuggaugugu cugcggcguu uuaucauauu ccucuucauc cugcugcuau gccucaucuu 2280 cuuauugguu cuucuggauu aucaagguau guugcccguu uguccucuaa uuccaggauc 2340 aacaacaacc agcacgggac ccugcaaaac cugcacgacu ccugcucaag gcaacucuau 2400 guuucccuca uguugcugua caaaaccuac ggauggaaau ugcaccugua uucccauccc 2460 aucaucuugg gcuuucgcaa aauaccuaug ggagugggcc ucaguccguu ucucuuggcu 2520 caguuuacua gugccauuug uucagugguu cguagggcuu ucccccacug uuuggcuuuc 2580 agcuauaugg augauguggu acugggggcc aagucuguac agcaucuuga gucccuuuau 2640 accgguguua ccaauuuucu uuugucuuug gguauacauu uaaacccuaa caaaacaaag 2700 agaugggguu auucacugaa uuucaugggu uauguaauug gaaguugggg uacauugcca 2760 caggaucaua uuguacaaaa aaucaaacac uguuuuagaa aacuuccugu caaucgaccu 2820 auugauugga aaguauguca aagaauugug ggucuuuugg gcuuugccgc uccauuuaca 2880 caaugugguu auccugcauu aaugccuuug uaugcaugua uacaagcaaa acaggcuuuu 2940 acuuucucgc caacuuacaa ggccuuucua aguaaacagu auaugaaccu uuaccccguu 3000 gcccggcaac ggccuggucu gugccaagug uuugcugacg caacccccac uggcuggggc 3060 uuggccaucg gccaucagcg caugcgcgga accuuugugg cuccucugcc gauccauacu 3120 gcggaacucc uggccgcuug uuuugcucgc agccggucug gagcaaaacu caucgggacu 3180 gauaauucug ucguccuuuc ucggaaauau acaucauuuc c 3221 <210> 517 <211> 3215 <212> RNA <213> Hepatitis B virus <400> 517 cuccaccacg uuccaccaaa cucuucaaga ucccagaguc agggcucugu acuuuccugc 60 ugguggcucc aguucaggaa caguaaaccc uguucagaac acugccucuu ccauaucguc 120 aaucuuaucg acgacugggg acccugugcc gaacauggag aacaucgcau caggacuccu 180 aggaccccug cucguguuac aggcgggguu uuucucguug acaaaaaucc ucacaauacc 240 acagagucua gacucguggu ggacuucucu caauuuucua gggggaacac ccgugugucu 300 uggccaaaau ucgcaguccc aaaucuccag ucacucacca acuuguuguc cuccgauuug 360 uccugguuau cgcuggaugu gucugcggcg uuuuaucauc uuccucugca uccugcugcu 420 augccucauc uucuuguugg uucuucugga cuaucaaggu auguugcccg uuuguccucu 480 aauuccagga ucaucaacca ccagcacagg accaugcaaa accugcacga cuccugcuca 540 aggaaccucu auguuucccu cauguugcug uauaaaaccu acggacggaa acugcaccug 600 uauucccauc ccaucaucuu gggcuuucgc aaaauaccua ugggaguggg ccucaguccg 660 uuucucuugg cucaguuuac uagugccauu uguucagugg uucguagggc uuucccccac 720 ugucuggcuu ucaguuauau ggaugaugug guuuuggggg ccaagucugu acaacaucuu 780 gagucccuuu augccgcugu uaccaauuuu cuuuugucuu ugggcauaca uuuaaacccu 840 cagaaaacaa aaagaugggg cuacucccuu aacuucaugg gguauguaau 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ugggaggagu 1740 ugggggagga gaucagguua aaggucuuug uacuaggagg cuguaggcau aaauuggucu 1800 guucaccagc accaugcaac uuuuucaccu cugccuaauc aucucauguu cauguccuac 1860 uguucaagcc uccaagcugu gccuugggug gcuuuggggc auggacauug acaccuauaa 1920 agaauuugga gcuucugugg aguuacucuc uuuuuugccu ucugacuucu uuccuucuau 1980 ucgagaucuu cucgacaccg ccucugcucu guaucgggag gccuuagagu cuccggaaca 2040 uuguucaccu caccauacgg cacucaggca agcuauugug uguuggggug aguugaugaa 2100 ucuagccacc ugggugggaa guaauuugga agacccagcc ucccgggaau uaguagucag 2160 uuaugucaau guuaauaugg gccuaaaaau cagacaacua uugugguuuc acauuuccug 2220 ucuuacuuuu ggaagagaaa cuguucuuga auauuuggug ucuuuuggag uguggauucg 2280 cacaccucca gcauauagac caccaaaugc cccuaucuua ucaacacuuc cggaaacuac 2340 uguuguuaga cgacgaggca gguccccuag aagaagaacu cccucgccuc gcagacgaag 2400 gucucaaucg ccgcgucgca gaagaucuca aucucgggaa ucuaaauguu aguauuccuu 2460 ggacucauaa ggugggaaac uuuacggggc uuuauucuuc uacgguaccu agcuuuaauc 2520 cucaauggca aacuccuuca uuuccugaca uucauuugca ggaggacauc 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acggccaggc cugugccaag uguuugcuga cgcaaccccc 1200 acugguuggg gcuuggccau uggccaucag cgcaugcgug gaaccuuugu ggcuccucug 1260 ccgauccaua cugcggaacu ccuugcagcc uguuucgcuc gcagccgguc uggagcgaac 1320 auuaucggua cagacaacuc uguuguccuc ucuaggaagu acaccuccuu uccauggcug 1380 cucgguugug cugccaacug gauccugcgc gggacguccu uuguuuacgu cccgucggcg 1440 cugaaucccg cggacgaccc cucccggggu cgcuuggggc uguaccgccc ccuucuucgu 1500 cugccguucc agccgaccac gggucgcacc ucucuuuacg cggacucccc gucuguuccu 1560 ucucaucugc cggaccgugu gcacuucgcu ucaccucugc acgucgcaug gagaccaccg 1620 ugaacgcccc cuggaaucug ccaacagucu uacauaagag gacucuugga cuuucaggac 1680 ggucaaugac cuggaucgaa gacuacauca aagacugugu auuuaaggac ugggaggagc 1740 ugggggagga gaucagguua aaggucuuug uacuaggagg cuguaggcau aaauuggucu 1800 guucaccagc accaugcaac uuuuucaccu cugccuaauc aucuuuuguu caugucccac 1860 uguucaagcc uccaagcugu gccuugggug gcuuuggggc auggacauug acccuuauaa 1920 agaauuugga gcuucugugg aauugcucuc uuuuuugccu ucugauuucu ucccgucugu 1980 ucgggaccua cucgacaccg 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cacuaacaac uuugccagca gauccgccuc cugccuccac caaucgucag 3180 ucagggaggc agccuacucc caucucucca ccacuaagag acagucaucc ucaggccaug 3240 caguggaa 3248 <210> 524 <211> 3215 <212> RNA <213> Hepatitis B virus <400> 524 gaacucaaca caguuccacc aagcacuguu ggauccgaga gucagggguc uguauuuucc 60 ugcugguggc uccaguucag aaacacagaa cccuguuccg acuauugccu cucucacauc 120 aucaaucuuc ucgaagacug gggacccugc uaugaacaug gagaacauca caucaggacu 180 ccuaggaccc cuucucgugu uacaggcggu guguuucuug uugacaaaaa uccucacaau 240 accacagagu cuagacucgu gguggacuuc ucucaauuuu cuagggguac cacccgggug 300 uccuggccaa aauucgcagu ccccaaucuc caaucacuua ccaaccuccu guccuccaac 360 uuguccuggc uaucguugga ugugucugcg gcguuuuauc aucuuccucu ucauccugcu 420 gcuaugccuc aucuucuugu ugguucuucu ggacuaucaa gguauguugc ccgugugucc 480 ucuacuucca ggaucuacaa ccaccagcac gggacccugc aaaaccugca ccacucuugc 540 ucaaggaacc ucuauguuuc ccuccugcug cuguaccaaa ccuucggacg gaaauugcac 600 cuguauuccc aucccaucau cuugggcuuu cggaaaauac cuaugggagu gggccucagc 660 ccguuucucu uggcucaguu uacuagugca auuuguucag uggugcguag ggcuuucccc 720 cacugucugg cuuuuaguua uauggaugau uugguauugg gggccaaauc ugugcagcau 780 cuugaguccc uuuauaccgc uguuaccaau uuuuuguuau cugugggcau ccauuuaaac 840 acagcuaaaa caaaauggug ggguuauucc uuacacuuua uggguuauau cauugggagu 900 ugggggacau ugccucagga acauauugug caaaaaauca aaaauugcuu ucgcaaacuu 960 cccguuaauc gacccauuga uuggaaaguc ugucaacgaa uugugggucu uuugggcuuu 1020 gcagccccuu uuacucaaug ugguuauccu gcucucaugc ccuuauaugc cuguauuacc 1080 gcuaaacagg cuuuuguuuu cucgccaacu uacaaggccu uucucuguaa acaauacaug 1140 aaccuuuacc ccguugcucg gcaacggcca ggccuuugcc aaguguuugc ugacgcaacc 1200 cccacuggcu ggggcuuggc gauuggccau cagcgcaugc gcggaaccuu uguggcuccu 1260 cugccgaucc auacugcgga acuccuagca gcuuguuucg cucgcagccg gucuggagcg 1320 gacauuaucg gcacugacaa cuccguuguc cugucucgga aguacaccuc cuucccaugg 1380 cugcuaggcu gugcugccaa cuggauccug cgcgggacgu ccuuuguuua cgucccgucg 1440 gcgcugaauc cugcggacga ccccucucgu ggucgccugg ggcucugccg cccccuucuc 1500 cgccuuccgu uccggccgac gacagggcgc accucucuuu acgcggacuc cccgccugug 1560 ccuuuucauc agccggcccg ugugcacuuc gguucaccuc ugcacgucgc auggagacca 1620 ccgugaacgc cccucaaagc uugccaacac ccuuacauaa aaggacucuu ggacuuucgc 1680 cccggucaac gaccuggauu gaggaauaca ucaaagacug uguguuuaag gacugggagg 1740 agucggggga ggaguugagg uuaaaggucu uuguauuagg aggcuguagg cauaaauugg 1800 ucuguucacc agcaccaugc aacuuuuuca ccucugccua aucaucuuuu guucaugucc 1860 cacuguucaa gccuccaagc ugugccuugg guggcuuugg ggcauggaca uugacccuua 1920 uaaagaauuu ggagcuucug uggaguuacu cucauuuuug ccuucugacu ucuucccguc 1980 uguccgggac cuacucgaca ccgcuucagc ccucuaccga gaugccuuag aaucacccga 2040 acauugcacc cccaaccaua cugcucucag gcaagcuauu cugugcuggg gugaguuaau 2100 gacuuuggcu uccugggugg gcaauaauuu agaggauccu gcggcuagag aucuaguagu 2160 uaauuauguc aacacuaaua ugggccuaaa aauuagacaa uuacuauggu uucauauuuc 2220 cugccuuaca uuuggaagag aaacuguucu ugaguauuug gugucuuuug gaguguggau 2280 ucgcacucca ccugcuuaua gaccaccaaa ugccccuauc cuaucaacac uuccggagac 2340 uacuguuguu agacaacgag gcagggcccc uagaagaaga acucccucgc cucgcagacg 2400 aagaucucaa ucaccgcguc gcagaagauc ucaaucucca gcuucccaau guuaguaucc 2460 cuuggacuca uaagguggga aacuuuaccg gucuuuacuc cucuacugua ccuguuuuca 2520 auccugauug guuaacuccu ucuuuuccug acauucaccu acaucaagau uugauacaaa 2580 aaugugagca auuugugcgc ccacucacua aaaaugaagu gagacgauug aaauuaauua 2640 ugccagcaag guuuuauccc aaagcuacua aauacuuccc uuuggauaaa gguauuaaac 2700 cauauuaucc agagaaugug guuaaucauu acuucaaaac uacacacuau uuacauacuu 2760 uguggaaggc aagaauucua uauaagagag aauccacaca uagcgccuca uuuugugggu 2820 caccauauuc cugggaacaa gaacuacagc augggagcac cucucucaac ggcgagaagg 2880 ggcaugggac agaaucucuc ugugcccaau ccucugggau ucuuuccaga ccaccaguug 2940 gauccacuau ucagagcaaa uuccagcagu cccgauuggg acuucaacac aaacaaggac 3000 aauuggccaa uggcaaacaa gguaggagug ggaggcuuug guccaggguu cacaccccca 3060 cacgguggcc uucuggggug gagcccucag gcacagggca uucugacaac cucgccacca 3120 gauccaccuc ccgcuuccac caaucggagg ucaggaagga aaccaacccc agucucucca 3180 ccucuaaggg acacacaucc acaggccaug cagug 3215 <210> 525 <211> 3215 <212> RNA <213> Hepatitis B virus <400> 525 gaacucaaca caguuccacc aagcacuguu ggauccgaga guaagggguc uguaucuucc 60 ugcugguggc uccaguucag aaacacagaa cccuguuccg acuauugccu cucucacauc 120 aucaaucuuc ucgaagacug gggacccugc uaugaacaug gagaacauca caucaggacu 180 ccuaggaccc cuucucgugu uacaggcggu guguuucuug uugacaaaaa uccucacaau 240 accacagagu cuagacucgu gguggacuuc ucucaauuuu cuagggguac cacccgggug 300 uccuggccaa aauucgcagu ccccaaucuc caaucacuua ccaaccuccu guccuccaac 360 uuguccuggc uaucguugga ugugucugcg gcguuuuauc aucuuccucu ucauccugcu 420 gcuaugccuc aucuucuugu ugguucuucu ggacuaucaa gguauguugc ccgugugucc 480 ucuacuucca ggaucuacaa ccaccagcac gggucccugc aaaaccugca ccacucuugc 540 ucaaggaacc ucuauguuuc ccuccugcug cuguaccaaa ccuucggacg gaaauugcac 600 cuguauuccc aucccaucau cuugggcuuu cggaaaauac cuaugggagu gggccucagc 660 ccguuucucu uggcucaguu uacuagugca auuuguucag uggugcguag ggcuuucccc 720 cacugucugg cuuuuaguua uauggaugau uugguauugg gggccaaauc ugugcagcau 780 cuugaguccc uuuauaccgc uguuaccaau uuuuuguuau cugugggcau ccauuuaaac 840 acagcuaaaa caaaauggug ggguuauucc uuacacuuua uggguuauau cauugggagu 900 ugggggacau ugccucagga acauauugug caaaaaauca aagauugcuu ucgcaaacuu 960 ccuguuaauc gacccauuga uuggaaaguc ugucaacgaa uugugggucu uuugggcuuu 1020 gcagccccuu uuacucaaug ugguuauccu gcucucaugc ccuuauaugc cuguauuacc 1080 gcuaaacagg cuuuuguuuu cucgccaacu uacaaggccu uucucuguaa acaauacaug 1140 aaccuuuacc ccguugcucg gcaacggcca ggccuuugcc aaguguuugc ugacgcaacc 1200 cccacuggcu ggggcuuggc gauuggccau cagcgcaugc gcggaaccuu uguggcuccu 1260 cugccgaucc auacugcgga acuccuagca gcuuguuucg cucgcagccg gucuggagcg 1320 gacauuaucg gcacugacaa cuccguuguc cugucucgga aguacaccuc cuucccaugg 1380 cugcuaggcu gugcugccaa cuggauccug cgcgggacgu ccuuuguuua cgucccgucg 1440 gcgcugaauc cugcggacga ccccucucgu ggucgccugg ggcucugccg cccccuucuc 1500 cgccuuccgu uccggccgac gacgggucgc accucucuuu acgcggacuc cccgccugug 1560 ccuucucauc ugccggcccg ugugcacuuc gcuucaccuc ugcacgucgc auggagacca 1620 ccgugaacgc cccucaaagc uugccaacaa ccuuacauaa gaggacucuu ggacuuucac 1680 cccggucaac gaccuggauu gaggaauaca ucaaagacug uguguuuaag gacugggagg 1740 agucggggga ggaguugagg uuaaaggucu uuguauuagg aggcuguagg cauaaauugg 1800 ucuguucacc agcaccaugc aacuuuuuca ccucugccua aucaucuuuu guucaugucc 1860 cacuguucaa gccuccaagc ugugccuugg guggcuuugg ggcauggaca uugacccuua 1920 uaaagaauuu ggagcuucug uggaguuacu cucauuuuug ccuucugacu ucuucccguc 1980 uguccgggac cuacucgaca ccgcuucagc ccucuaccga gaugccuuag aaucucccga 2040 acauugcacc cccaaccaua cugcucucag gcaagcuauu cugugcuggg gugaguuaau 2100 gacuuuggcu uccugggugg gcaauaauuu agaggauccu gcggcuagag aucuaguagu 2160 uaauuauguc aacacuaaua ugggccuaaa aauuagacaa uuacuauggu uucauauuuc 2220 cugccuuaca uuuggaagag auacuguucu ugaguauuug gugucuuuug gaguguggau 2280 ucgcacucca ccugcuuaua gaccaccaaa ugccccuauc cuaucaacac uuccggagac 2340 uacuguuguu agacaacgag gcagggcccc uagaagaaga acucccucgc cucgcagacg 2400 aagaucucaa ucaccgcguc gccgaagauc ucaaucucca gcuucccaau guuaguaucc 2460 cuuggacuca uaagguggga aacuuuaccg gucuuuacuc cucuacugua ccuguuuuca 2520 auccugauug guuaacuccu ucuuuuccug acauucaccu acaucaagau uugauacaaa 2580 aaugugaaca auuuguaggc ccacucacua aaaaugaagu gagacgauug aaauuaauua 2640 ugccagcaag auuuuauccc aaaguuacua aauacuuccc uuuggauaaa gguauuaaac 2700 cauauuaucc agagcaugug guuaaucauu acuucaaaac uagacacuau uuacauacuu 2760 uguggaaggc aggaauucua uauaagagag aauccacaca uagcgccuca uuuugugggu 2820 caccauauuc cugggaacaa gagcuacagc augggagcac cucucucaac ggcgagaagg 2880 ggcaugggac agaaucuuuc ugugcccaau ccucugggau ucuuuccaga ccaccaguug 2940 gauccacuau ucagagcaaa uuccagcagu cccgauuggg acuucaacac aaacaaggac 3000 aauuggccaa uggcaaacaa gguaggagug ggaggcuuug guccaggguu cacaccccca 3060 cacgguggcc uucuggggug gagcccucag gcacagggca uucugacaac cucgccaccc 3120 gauccaccuc ccgcuuccac caaucggagg ucaggaagga aaccaacccc agucucucca 3180 ccucuaaggg acacacaucc acaggccaug cagug 3215 <210> 526 <211> 3215 <212> RNA <213> Hepatitis B virus <400> 526 gaacucaaca caguuccacc aagcacuguu ggauccgaga guaagggguc uguauuuucc 60 ugcugguggc uccaguucag aaacacagaa cccugcuccg acuauugccu cucucacauc 120 aucaaucuuc ucgaagacug gggacccugc uaugaacaug gagaacauca caucaggacu 180 ccuaagaccc cuucucgugu uacaggcggu guguuucuug uugacaaaaa uccucacaau 240 accacagagu cuagacucgu gguggacuuc ucucaauuuu cuagggguac cacccgggug 300 uccuggccaa aauucgcagu ccccaaucuc caaucacuua ccaaccuccu guccuccaac 360 uuguccuggc uaucguugga ugugucugcg gcguuuuauc aucuuccucu ucauccugcu 420 gcuaugccuc aucuucuugu ugguucuucu ggacuaucaa gguauguugc ccgugugucc 480 ucuacuucca ggaucuacaa ccaccagcac gggacccugc aaaaccugca ccacucuugc 540 ucaaggaacc ucuauguuuc ccucuugcug cuguaccaaa ccuucggacg gaaauugcac 600 cuguauuccc aucccaucau cuugggcuuu cggaaaauac cuaugggagu gggccucagc 660 ccguuucucu uggcucaguu uacuagugca auuuguucag uggugcguag ggcuuucccc 720 cacugucugg cuuuuaguua uauggaugau uugguauugg gggccaaauc ugugcagcau 780 cuugaguccc uuuauaccgc uguuaccaau uuuuuguuau cugugggcau ccauuugaac 840 acagcuaaaa caaaauggug ggguuauucc uuacacuuua uggguuauau aauugggagu 900 ugggggaccu ugccucagga acauauugug cauaaaauca aagauugcuu ucgcaaacuu 960 cccgugaaua gacccauuga uuggaagguu ugucaacgca uugugggucu uuugggcuuu 1020 gcagccccuu uuacucaaug ugguuauccu gcucucaugc ccuuguaugc cuguauuacc 1080 gcuaagcagg cuuuuguuuu cucgccaacu uacaaggccu uucucuguaa acaauacaug 1140 aaccuuuacc ccguugcucg gcaacggcca ggccuuugcc aaguguuugc ugacgcaacc 1200 cccacuggcu ggggcuuggc gauuggccau cagcgcaugc gcggaaccuu uguggcuccu 1260 cugccgaucc auacugcgga acuccuagca gcuuguuucg cucgcagcag gucuggagcg 1320 gacauuaucg gcacugacaa cucuguuguc cuuucucgga aguacaccuc cuucccaugg 1380 cugcucggcu gugcugccaa cuggauccug cgcgggacgu ccuuugucua cgucccgucg 1440 gcgcugaauc cugcggacga ccccucucgu ggucgcuugg ggcucugccg cccucuucuc 1500 cgccugccgu uccggccgac gacgggucgc accucucuuu acgcggacuc cccgccugug 1560 ccuucucauc ugccggcccg ugugcacuuc gcuucaccuc ugcacgucgc auggagacca 1620 ccgugaacgc cccuuggaac uugccaacaa ccuugcauaa gaggacucuu ggucuuucgc 1680 cccggucaac gaccuggauu gaggaauaca ucaaagacug uguauuuaag gacugggagg 1740 agucggggga ggaguugagg uuaaaggucu uuguauuagg aggcuguagg cauaaauugg 1800 ucuguucacc agcaccaugc aacuuuuuca ccucugccua aucaucuuuu guucaugucc 1860 cacuguucaa gccuccaagc ugugccuugg guggcuuugg ggcauggaca uugacccuua 1920 uaaagaauuu ggagcuucug uggaguuacu cucauuuuug ccuucugacu ucuucccguc 1980 uguccgggac cugcucgaca ccgcuucagc ccucuaccga gaugccuuag aaucacccga 2040 acauugcacc cccaaccaca cugcucucag gcaagcuauu uugugcuggg gugaguugau 2100 gaccuuggcu uccugggugg gcaauaauuu agaggauccu gcagcaagag aucuaguagu 2160 uaauuauguc aauacuaaca ugggccuaaa aauuagacaa uuauuauggu uucacauuuc 2220 cugccuuaca uuuggaagag aaacugugcu ugaguauuug gugucuuuug gaguguggau 2280 ucgcacucca ccugcuuaua gaccaccaaa ugccccuauc cuaucaacac uuccggagac 2340 uacuguuguu agacaacgag gcagggcccc uagaagaaga acucccucgc cucgcagacg 2400 aagaucucaa ucaccgcguc gcagaagauc ucaaucucca gcuucccaau guuaguauuc 2460 cuuggacuca uaagguggga aacuuuaccg gucuuuacuc cucuacuaua ccuguuuuua 2520 auccugacug gcuaacuccc ucuuuuccug acauucacuu gcaucaagau cugauacaaa 2580 aaugugaaca auuuguaggc ccacucacua caaaugaaag gagacgauug aaacuaauua 2640 ugccagcuag guuuuauccc aaaguuacua aauacuuccc uuuggauaaa gguauuaagc 2700 cuuacuaucc agagaaugug guuaaucauu acuucaaaac uagacauuau uuacauacuu 2760 uguggaaggc aggaauucua uauaagagag aauccacaca uagcgccuca uuuugugggu 2820 caccauauuc cugggaacaa gagcuacagc augggagcac cucucucaac ggcgagaagg 2880 ggcaugggac agaaccuuuc ugugcccaau ccucugggau ucuuuccaga ccaccaguug 2940 gauccacuau ucagagcaaa uuccagcagu cccgauuggg acuucaacac aaacaaggac 3000 aauuggccaa uggcaaacaa gguaggagug ggaggcuucg guccaggguu cacaccccca 3060 cacgguggcc uucuggggug gagcccucag gcacagggca uucugacaac cucgccacca 3120 gauccaccuc cugcuuccac caaucggagg ucaggaagaa agccaacccc agucucucca 3180 ccucuaaggg acacacaucc acaggccaug cagug 3215

Claims (10)

  1. R-008380648-000E, R-008380783-000R, R-008380665-000N, R-008380645-000D, R-008380408-000R, R-008380633-000U, R-008380767-000R, R-008380730-000C, R-008380777-000H, R-008380740-000V, R-008380558-000M, R-008380406-000Y, R-008380764-000P, R-008380772-000P, R-008380389-000D, R-008380362-000H, R-008380363-000S, R-008380340-000F, R-008380689-000H, R-008380756-000P, R-008380736-000E, R-008380757-000Y, R-008380753-000N, R-008380737-000N, R-008380734-000M, 또는 R-008380791-000R 중 임의의 것을 포함하는 이중 가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자.
  2. 제1항에 따른 이중 가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 및 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물.
  3. (a) 제1항의 이중 가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA);
    (b) 양이온성 지질;
    (c) 콜레스테롤;
    (d) DSPC; 및
    (e) PEG-DMG
    를 포함하는 조성물.
  4. (a) 제1항의 이중 가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA);
    (b) (13Z,16Z)-N,N-디메틸-3-노닐도코사-13,16-디엔-1-아민;
    (c) 콜레스테롤;
    (d) DSPC; 및
    (e) PEG-DMG
    를 포함하는 조성물.
  5. 제4항에 있어서, (13Z,16Z)-N,N-디메틸-3-노닐도코사-13,16-디엔-1-아민, 콜레스테롤, DSPC, 및 PEG-DMG가 각각 50:30:10:2의 몰비를 갖는 것인 조성물.
  6. 제5항에 따른 조성물 및 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물.
  7. B형 간염 바이러스 (HBV)의 작용에 의해, 또는 작용 소실에 의해 매개되는 병태를 앓는 인간 대상체에게 유효량의 제1항의 이중 가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자를 투여하는 것을 포함하는, B형 간염 바이러스 (HBV)의 작용에 의해, 또는 작용 소실에 의해 매개되는 병태를 앓는 인간 대상체를 치료하는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 병태가 HBV 감염인 방법.
  9. 제6항에 있어서, 병태가 간세포 암종인 방법.
  10. 제1항에 따른 이중 가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA)을 포함하는 키트.
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