CN103930398A - 具有改进的细胞内动力学的阳离子脂质 - Google Patents

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Abstract

本发明提供当用作核酸递送载体时能够实现高细胞内表达效率的阳离子脂质。式(1)代表的化合物其中Xa和Xb各自独立地是X1或X2；s是1或2，R4是具有1-6个碳原子的烷基，na和nb各自独立地是0或1，R1a和R1b各自独立地是具有1-6个碳原子的亚烷基，R2a和R2b各自独立地是具有1-6个碳原子的亚烷基，Ya和Yb各自独立地是酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键或脲键，且R3a和R3b各自独立地是甾醇残基、脂溶性维生素残基或具有12-22个碳原子的脂肪族烃基。

Description

具有改进的细胞内动力学的阳离子脂质
技术领域
本发明涉及具有改进的细胞内动力学的阳离子脂质，含有所述阳离子脂质的脂质膜结构，及其用途。
背景技术
对于核酸治疗的实施，要求有效且安全的核酸递送载体。尽管病毒载体是具有良好表达效率的核酸递送载体，但从安全性的方面来看它们具有实际问题。因此，可以更安全地使用的非病毒核酸递送载体的开发正在进行中。其中，使用阳离子脂质的载体是目前最通常使用的非病毒核酸递送载体。
阳离子脂质主要由胺部分和脂质部分构成，其中显示阳离子性的胺部分和聚阴离子核酸静电相互作用以形成带正电的脂质体或脂质膜结构，其促进摄取到细胞内，并将核酸递送到细胞内。
作为通常并广泛使用的已知阳离子脂质，可以提及DOTAP和DODAP。这些已知的阳离子脂质当与磷脂组合时形成带正电的脂质体或脂质膜结构，其与核酸静电相互作用，以便能够将核酸递送至靶细胞(非专利文件1)。
专利文件1描述了含有大量氨基以便增加摄取到细胞内的量的阳离子脂质。该文件争辩认为，该阳离子脂质显示高细胞摄取效力并作用于具有不同细胞膜组成的各种细胞。
在另一方面，对于使用阳离子脂质以展示体内实际效果的核酸递送载体，良好的体内动力学，特别是血液中的高稳定性，在靶诸如肿瘤中高度聚集的特性等需要得到满足。鉴于该问题，Wheeler等人显示，含有pKa调节至约中性的阳离子脂质的脂质膜结构在静脉内注射后在血液中显示长寿命，在肿瘤部位中聚集，并且可以介导核酸在肿瘤部位中的表达(非专利文件2)。
尽管如上所示已经开发了具有改进的体内动力学的阳离子脂质，但是鉴于核酸递送载体通常将外源物质引入细胞内的特性，期望从小摄取量获得大效果输出。也就是说，当脂质膜结构被用作表达载体到细胞内的递送载体时，期望增加每个单位引入细胞内的脂质膜结构的表达水平，并提高细胞内表达效率。为了提高细胞内表达效率，除了体内动力学，有必要也改进细胞内动力学，诸如摄取过程，从内体逃逸等，核膜渗透性等。此外，已知核酸从载体的解离和转录因子的结合能力的增强对于促进细胞内转录是必要的(非专利文件3)。
促进核酸从脂质膜结构的细胞内解离的实例包括其中一个胺部分和两个脂质部分经由二硫键键合的化合物(专利文件2)和其中一个胺部分和两个脂质部分各自经由二硫键键合的化合物(专利文件3)。描述了这些化合物具有通过利用二硫键的细胞内裂解从脂质膜结构解离与胺部分相互作用的核酸的效果。
然而，尽管该领域有进展，但通过使用常规阳离子脂质的核酸递送载体实现的细胞内表达效率并不完全令人满意。
[文件列表]
[专利文件]
专利文件1： JP-A-2011-121966
专利文件2： WO 99/58152
专利文件3： WO 2010/154405
[非专利文件]
非专利文件1： Biomaterials 29(24-25):3477-96, 2008
非专利文件2： Gene Therapy 6:271-281, 1999
非专利文件3： Molecular Therapy 13(4):786-794, 2006。
发明概述
本发明待解决的问题
鉴于使用阳离子脂质的核酸传递载体将外源物质引入细胞内的特性，要求它们从小摄取量表现出大效果，即增加每个单位引入细胞内的脂质膜结构的表达水平，并提高细胞内表达效率。本发明的一个目的是提供当用作核酸递送载体时能够实现高细胞内表达效率的阳离子脂质。
解决问题的方式
鉴于上述问题，本发明人已经进行了深入研究并发现，专利文件2的化合物甚至在二硫键裂解之后保持具有两个脂质部分的结构，并且作为结果，所述脂质膜结构在细胞内不会瓦解，并且封装化合物诸如核酸等没有被有效地释放到胞浆内。此外，当专利文件2的化合物用于核酸引入时，核酸被释放到细胞内，同时与胺部分相互作用，这可能阻止转录因子接近并结合至核酸。
而且，当使用专利文件2和3的化合物时，产生的残基在细胞内裂解二硫键之后被分为胺部分(这是极性基团)和脂质部分(这是非极性基团)，从而失去其表面活性。尽管这种表面活性的消失对于诱导细胞内脂质膜结构的瓦解是有利的，但是它不允许期望内体膜的去稳定化和与其相关的内体逃逸促进效果。
注意到此类新技术问题，已经进行了进一步研究。作为结果，已经发现，这些问题可以通过以耐受细胞内裂解的稳定结合方式结合胺部分和脂质部分并经由二硫键结合获得的表面活性剂的两个分子，而不是经由二硫键结合胺部分和脂质部分来解决，从而导致完成本发明。
因此，本发明涵盖以下内容。
[1] 式(1)代表的化合物
其中Xa和Xb各自独立地是X1或X2；
s是1或2，
R4是具有1 - 6个碳原子的烷基，
na和nb各自独立地是0或1，
R1a和R1b各自独立地是具有1 - 6个碳原子的亚烷基，
R2a和R2b各自独立地是具有1 - 6个碳原子的亚烷基，
Ya和Yb各自独立地是酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键或脲键，且
R3a和R3b各自独立地是甾醇残基、脂溶性维生素残基或具有12 - 22个碳原子的脂肪族烃基。
[2] [1]的化合物，其中Xa和Xb各自独立地是X1。
[3] [1]或[2]的化合物，其中R3a和R3b各自独立地是脂溶性维生素残基或具有12 - 22个碳原子的脂肪族烃基。
[4] [1]-[3]中任一项的化合物，其中R3a和R3各自独立地是脂溶性维生素残基。
[5] [1]-[3]中任一项的化合物，其中R3a和R3b各自独立地是具有12 - 22个碳原子的脂肪族烃基。
[6] 包含[1]-[5]中任一项的化合物作为膜构成脂质的脂质膜结构。
[7] 用于引入核酸的试剂，其包含[1]-[5]中任一项的化合物或[6]的脂质膜结构。
[8] 将核酸引入细胞内的方法，其包括使封装所述核酸的[6]的脂质膜结构与细胞接触。
[9] 将核酸引入细胞内的方法，其包括将封装所述核酸的[6]的脂质膜结构给药于活生物体，从而使得其被递送至靶细胞。
发明效果
本发明涉及具有两个叔氨基团和两个脂质部分以及一个作为可生物降解的基团的二硫键的化合物，和含有该化合物的脂质膜结构。本发明的化合物可以形成稳定的脂质膜结构诸如脂质体等，并且可以将脂质膜结构的pKa调节至接近中性。而且，当使用本发明的阳离子脂质进行转基因时，本发明的阳离子脂质中含有的二硫键在细胞内还原性环境中被裂解，并且由于脂质膜结构的去稳定促进了封装物质(核酸)的释放。因此，不仅可以提高递送基因的细胞内表达效率，即每个单位引入细胞内的脂质膜结构的细胞内表达效率，而且可以实现经由递送核酸的有效基因敲低。
当使用本发明的化合物或含有该化合物的脂质膜结构进行转基因时，血清组分对核酸的降解得到抑制，这对于血清存在下的转基因或体内转基因是有利的。
附图简述
图1显示在还原剂存在的情况下各种脂质膜的去稳定特性。
图2显示由B-2、B-2-1、DODAP或DOTAP制备的各种MEND的细胞内摄取的相对值。
图3显示由B-2、B-2-1、DODAP或DOTAP制备的各种MEND的基因转移活性。
图4显示由B-2、B-2-1、DODAP或DOTAP制备的各种MEND的基因表达活性(图3)用细胞内摄取量标准化的值(图4)。
图5显示B-2及其衍生物(B-2-2、B-2-3)的基因转移活性。
图6显示通过由B-2、B-2-1、DODAP或DOTAP制备的各种MEND引入的基因从内体的逃逸的评估。
图7是显示通过由B-2、B-2-1、DODAP或DOTAP制备的各种MEND引入的基因从内体的逃逸效率的图。
图8显示通过由B-2、B-2-1和DOTAP制备的各种MEND引入的基因的去封装效率的评估。
图9显示在静脉内给药由B-2或阳离子脂质制备的MEND之后肝脏内的基因表达活性。
图10显示通过由B-2或阳离子脂质制备的MEND的基因表达的器官特异性。
图11是显示内体、溶酶体酸化抑制对由B-2、B-2-1、DODAP或DOTAP制备的各种MEND的基因表达活性的影响的图。
图12是显示由B-2或DOTAP制备的各种MEND对体外翻译反应的影响的图。
图13显示由B-2制备的MEND针对血清对核酸的降解的耐受性效果。
图14显示通过静脉内给药由B-2制备的MEND、由R8/GALA制备的MEND或体内JetPEI-Gal引入肝脏的表达载体(CpG(+)或CpG(-))的基因表达活性的时程变化。
图15给出显示由B-2制备的MEND和由R8/GALA制备的MEND在肝脏中的行为的图。
图16给出显示在给药含有表达载体(CpG(+)或CpG(-))的由B-2制备的MEND或由R8/GALA制备的MEND之后血液中的细胞因子的浓度曲线的图。
图17显示由B-2或B-2-4制备的各种MEND的电子显微图。
图18是显示通过由B-2、B-2-4或B-2-5制备的各种MEND引入的基因的表达活性的图。
图19是显示由B-2、B-2-4或DOTAP制备的各种MEND的细胞内摄取的时程变化的图，其中空心圆显示B-2，实心圆显示B-2-4，且空心正方形显示DOTAP。
图20是显示由B-2、B-2-4或DOTAP制备的各种MEND的基因转移活性的图。
图21给出显示包括罗丹明标记的pDNA的由B-2制备的MEND和由B-2-4制备的MEND的细胞内动力学的图。
图22是显示通过由B-2或B-2-4制备的各种MEND引入的基因的内体逃逸效率的图。
图23给出显示用由B-2或B-2-4制备的各种MEND处理的细胞的内体量的评估的图。
图24是显示用由B-2或B-2-4制备的各种MEND处理的细胞的相对内体量的图。
图25给出显示通过由B-2或B-2-4制备的各种MEND引入的基因的去封装效率的评估的图。
图26是显示通过由B-2或B-2-4制备的各种MEND引入的基因的去封装效率的图。
图27是显示蔗糖、阿米洛利和菲律宾菌素对由B-2或B-2-4制备的各种MEND的细胞内摄取的影响的图。
图28是显示蔗糖、阿米洛利和菲律宾菌素对由B-2或B-2-4制备的各种MEND的基因表达活性的影响的图。
图29是显示内体酸化抑制对由B-2或B-2-4制备的各种MEND的基因表达活性的影响的图。
图30给出显示视黄酸对由B-2或B-2-4制备的各种MEND的基因表达活性的影响的图。
图31给出显示包括罗丹明标记的pDNA的由B-2制备的MEND和由B-2-4制备的MEND的细胞内动力学的图。
图32是显示GA对由B-2或B-2-4制备的各种MEND的基因表达活性的影响的图。
图33是显示通过由B-2、B-2-4或B-2-5制备的各种MEND引入针对FVII的siRNA的效果的图。
图34是评估通过由B-2-5制备的各种MEND引入的针对FVII的siRNA的基因敲低效果的持续性的图。
实施方案的描述
尽管以下解释了本发明的实施方案，但本发明不限于此。
本发明提供式(1)代表的化合物。
在式(1)中，Xa和Xb各自独立地是以下显示的X1或X2，优选X1。
X1中的R4是具有1-6个碳原子的烷基，其可以是直链、支链或环状的。该烷基优选具有1 – 3的碳原子数。具有1 - 6个碳原子的烷基的具体实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、1,2-二甲基丙基、2-甲基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、环己基等。R4优选是甲基、乙基、丙基或异丙基，最优选甲基。
X2中的s是1或2。当s是1时，X2优选为吡咯烷鎓基团，并且当s为2时，X2优选为哌啶鎓基团。
Xa可以与Xb相同或不同，且Xa优选为与Xb相同的基团。
na和nb各自独立地是0或1，优选1。当na为1时，R3a经由Ya和R2a与Xa结合，且当na为0时，采用R3a-Xa-R1a-S-的结构。类似地，当nb为1时，R3b经由Yb和R2b与Xb结合，且当nb为0时，采用R3b-Xb-R1b-S-的结构。
na可以与nb相同或不同，且na优选与nb相同。
R1a和R1b各自独立地是具有1 - 6个碳原子的亚烷基，其可以是直链或支链的，优选直链的。具有1 - 6个碳原子的亚烷基的具体实例包括亚甲基、亚乙基、三亚甲基、亚异丙基、四亚甲基、亚异丁基、五亚甲基、亚新戊基等。R1a和R1b各自优选为亚甲基、亚乙基、三亚甲基、亚异丙基或四亚甲基，最优选亚乙基。
R1a可以与R1b相同或不同，且R1a优选为与R1b相同的基团。
R2a和R2b各自独立地是具有1 - 6个碳原子的亚烷基，其可以是直链或支链的，优选直链的。具有1 - 6个碳原子的亚烷基的实例包括针对R1a或R1b描述为具有1 - 6个碳原子的亚烷基的实例的那些。R2a和R2b各自优选为亚甲基、亚乙基、三亚甲基、亚异丙基或四亚甲基，最优选三亚甲基。
R2a可以与R2b相同或不同，且R2a优选为与R2b相同的基团。
Ya和Yb各自独立地是酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键或脲键，优选酯键、酰胺键或氨基甲酸酯键，最优选酯键。尽管Ya和Yb的结合方向没有限制，但是，当Ya为酯键时，R3a-CO-O-R2a-的结构是优选的，且当Yb为酯键时，R3b-CO-O-R2b-的结构是优选的。
Ya可以与Yb相同或不同，且Ya优选为与Yb相同的基团。
R3a和R3b各自独立地是甾醇残基、脂溶性维生素残基或具有12 - 22个碳原子的脂肪族烃基，优选脂溶性维生素残基或具有12 - 22个碳原子的脂肪族烃基，最优选脂溶性维生素残基。
甾醇残基的实例包括胆甾烯基(胆固醇残基)、胆甾烷基(胆甾烷醇残基)、豆甾烯基(stigmasteryl)(豆甾醇残基)、β-谷甾烯基(β-sitosteryl)(β-谷甾醇残基)、羊毛甾烯基(lanosteryl)(羊毛甾醇残基)和麦角甾烯基(ergosteryl)(麦角甾醇残基)等。甾醇残基优选为胆甾烯基或胆甾烷基。
作为脂溶性维生素残基，可以使用由脂溶性维生素衍生的残基，以及由通过将羟基、醛或羧酸(这是脂溶性维生素中的官能团)适当转化为其它反应官能团而获得的衍生物衍生的残基。至于具有羟基的脂溶性维生素，例如，可以通过与琥珀酸酐、戊二酸酐等反应而将羟基转化为羧酸。脂溶性维生素的实例包括视黄酸、视黄醇、视黄醛、麦角甾醇、7-脱氢胆固醇、钙化醇、胆钙化醇、二氢麦角钙化醇、二氢速甾醇、生育酚、生育三烯酚等。脂溶性维生素的优选实例包括视黄酸和生育酚。
具有12 - 22个碳原子的脂肪族烃基可以是直链或支链的，优选直链的。脂肪族烃基可以是饱和的或不饱和的。在不饱和脂肪族烃基的情况下，脂肪族烃基通常含有1 - 6个，优选1 - 3，更优选1 - 2个不饱和键。当不饱和键包括碳-碳双键和碳-碳三键时，优选碳-碳双键。脂肪族烃基具有优选12 – 18、最优选13 – 17的碳原子数。尽管脂肪族烃基包括烷基、烯基、炔基等，但其优选为烷基或烯基。具有12 - 22个碳原子的脂肪族烃基的具体实例包括十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基、十二碳烯基、十三碳烯基、十四碳烯基、十五碳烯基、十六碳烯基、十七碳烯基、十八碳烯基、十九碳烯基、二十碳烯基、二十一碳烯基、二十二碳烯基、十碳二烯基、十三碳二烯基、十四碳二烯基、十五碳二烯基、十六碳二烯基、十七碳二烯基、十八碳二烯基、十九碳二烯基、二十碳二烯基、二十一碳二烯基、二十二碳二烯基、十八碳三烯基、二十碳三烯基、二十碳四烯基、二十碳五烯基、二十二碳六烯基、异硬脂基等。具有12 - 22个碳原子的脂肪族烃基优选为十三烷基、十四烷基、十七烷基、十八烷基、十七碳二烯基或十八碳二烯基，特别优选十三烷基、十七烷基或十七碳二烯基。
在一个实施方案中，使用具有12 - 22个碳原子的脂肪族烃基，其是由脂肪酸、脂肪醇或脂族胺衍生的。当R3a (或R3b)由脂肪酸衍生时，Ya (或Yb)为酯键或酰胺键，且脂肪酸衍生的羰基碳包括在Ya (或Yb)中。例如，当使用亚油酸时，R3a (或R3b)是十七碳二烯基。
R3a可以与R3b相同或不同，且R3a优选为与R3b相同的基团。
在一个实施方案中，Xa与Xb相同，na与nb相同，R1a与R1b相同，R2a与R2b相同，R3a与R3b相同，且Ya与Yb相同。
在一个实施方案中，
Xa和Xb各自独立地是X1，
R4是具有1 - 3个碳原子的烷基，na和nb各自是1，
R1a和R1b各自独立地是具有1 - 6个碳原子的亚烷基，
R2a和R2b各自独立地是具有1 - 6个碳原子的亚烷基，
Ya 和Yb各自是酯键，且
R3a和R3b各自独立地是具有12 - 22个碳原子的脂肪族烃基。
在一个实施方案中，
Xa和Xb各自是X1，
R4是具有1 - 3个碳原子的烷基，na和nb各自是1，
R1a和R1b各自是具有1 - 6个碳原子的亚烷基，
R2a和R2b各自是具有1 - 6个碳原子的亚烷基，
Ya 和Yb各自是酯键，
R3a和R3b各自是具有12 - 22个碳原子的脂肪族烃基，
Xa与Xb相同，
R1a与R1b相同，
R2a与R2b相同，且
R3a与R3b相同。
在一个实施方案中，
Xa和Xb各自是X1，
R4是甲基，na和nb各自是1，
R1a和R1b各自是亚乙基，
R2a和R2b各自是三亚甲基，
Ya 和Yb各自是-CO-O-，且
R3a和R3b各自独立地是具有13 - 17个碳原子的烷基或烯基。
在一个实施方案中，
Xa和Xb各自是X1，
R4是甲基，na和nb各自是1，
R1a和R1b各自是亚乙基，
R2a和R2b各自是三亚甲基，
Ya 和Yb各自是-CO-O-，
R3a和R3b各自是具有13 - 17个碳原子的烷基或烯基，且
R3a与R3b相同。
在一个实施方案中，
Xa和Xb各自独立地是X1，
R4是具有1 - 3个碳原子的烷基，na和nb各自是1，
R1a和R1b各自独立地是具有1 - 6个碳原子的亚烷基，
R2a和R2b各自独立地是具有1 - 6个碳原子的亚烷基，
Ya 和Yb各自是酯键，且
R3a和R3b各自独立地是脂溶性维生素残基（例如，视黄酸残基，生育酚残基）。
在一个实施方案中，
Xa和Xb各自是X1，
R4是具有1 - 3个碳原子的烷基，na和nb各自是1，
R1a和R1b各自是具有1 - 6个碳原子的亚烷基，
R2a和R2b各自是具有1 - 6个碳原子的亚烷基，
Ya 和Yb各自是酯键，
R3a和R3b各自是脂溶性维生素残基（例如，视黄酸残基，生育酚残基），
Xa与Xb相同，
R1a与R1b相同，
R2a与R2b相同，且
R3a与R3b相同。
在一个实施方案中，
Xa和Xb各自是X1，
R4是甲基，na和nb各自是1，
R1a和R1b各自是亚乙基，
R2a和R2b各自是三亚甲基，
Ya 和Yb各自是-CO-O-，且
R3a和R3b各自独立地是脂溶性维生素残基（例如，视黄酸残基，生育酚残基）。
在一个实施方案中，
Xa和Xb各自是X1，
R4是甲基，na和nb各自是1，
R1a和R1b各自是亚乙基，
R2a和R2b各自是三亚甲基，
Ya 和Yb各自是-CO-O-，
R3a和R3b各自是脂溶性维生素残基（例如，视黄酸残基，生育酚残基），且
R3a与R3b相同。
本发明的化合物的具体实例包括以下B-2、B-2-2、B-2-3、B-2-4和B-2-5的化合物。
现在解释本发明的化合物的制备方法。
本发明的化合物具有-S-S-(二硫)键。因此，所述制备方法包括，例如，包括制备
R3a-(Ya-R2a)n a-Xa-R1a-SH，和
R3b-(Yb-R2b)n b-Xb-R1b-SH，且
使它们经受氧化(偶联)以得到本发明的含有-S-S-的化合物的方法，包括依次将必需部分与含有-S-S-键的化合物键合以最终获得本发明的化合物的方法等。优选的是后一种方法。
后一种方法的具体实例如下所示，其不应当被解释为限制性的。
起始化合物的实例包括含有-S-S-键的两个末端羧酸、两个末端羧酸酯、两个末端胺、两个末端异氰酸酯、两个末端醇、具有离去基团诸如MsO(甲磺酸酯基团)等的两个末端醇、具有离去基团诸如pNP(对硝基苯基碳酸酯基团)等的两个末端碳酸酯，等。
例如，当制备对于Xa和Xb含有X1或X2的化合物时，含有-S-S-键的化合物(1)的两个末端官能团与具有-NH-基团和在末端的一个官能团的化合物(2)中的-NH-基团反应，化合物(2)中在末端不促进反应的官能团与含有R3的化合物(3)中的官能团反应，从而可以获得本发明的化合物，其含有-S-S-键、R1a和R1b、Xa和Xb、R2a 和R2b、Ya和Yb以及R3a和R3b。
在化合物(1)和化合物(2)的反应中，碱催化剂，诸如碳酸钾、碳酸钠、叔丁醇钾等可以用作催化剂，或者可以在没有催化剂的情况下进行反应。优选地，碳酸钾或碳酸钠用作催化剂。
相对于化合物(1)，催化剂的量为0.1 - 100摩尔当量，优选0.1 - 20摩尔当量，更优选0.1 - 5摩尔当量。相对于化合物(1)，待投入的化合物(2)的量为1 - 50摩尔当量，优选1 - 10摩尔当量。
待用于化合物(1)和化合物(2)的反应的溶剂没有特别限制，只要它是不抑制反应的溶剂或水溶液。例如，可以提到乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、苯、甲苯等。其中，甲苯和氯仿是优选的。
反应温度为-20至200℃，优选0-80℃，更优选20-50℃，并且反应时间为1 - 48小时，优选2 - 24小时。
当化合物(1)和化合物(2)的反应产物与化合物(3)反应时，可以使用碱催化剂，诸如碳酸钾、碳酸钠、叔丁醇钾等，或酸催化剂诸如PTS(对甲苯磺酸)、MSA (甲磺酸)等，如用于化合物(1)和化合物(2)的反应的催化剂，或者可以在没有催化剂的情况下进行反应。
此外，化合物(1)和化合物(2)的反应产物可以通过使用缩合剂诸如DCC (二环己基碳二亚胺)、DIC (二异丙基碳二亚胺)、EDC (1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)等直接与化合物(3)反应。或者，可以用缩合剂处理化合物(3)而一次转换为酸酐等，然后将其与化合物(1)和化合物(2)的反应产物反应。
相对于化合物(1)和化合物(2)的反应产物，待投入的化合物(3)的量为1 - 50摩尔当量，优选1 - 10摩尔当量。
根据待反应的官能团适当地选择待使用的催化剂。
相对于化合物(1)，催化剂的量为0.05 - 100摩尔当量，优选0.1 - 20摩尔当量，更优选0.2 - 5摩尔当量。
待用于化合物(1)和化合物(2)的反应产物与化合物(3)的反应的溶剂没有特别限制，只要它是不抑制反应的溶剂或水溶液。例如，可以提到乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、苯、甲苯等。其中，甲苯和氯仿是优选的。
反应温度为0至200℃，优选0-120℃，更优选20-50℃，并且反应时间为1 - 48小时，优选2 - 24小时。
通过上述反应获得的反应产物可以通过一般纯化方法适当纯化，所述一般纯化方法例如，用水洗涤、硅胶柱层析、结晶、重结晶、液-液萃取、再沉淀、离子交换柱层析等。
作为具体实例，下面描述了使用在两个末端具有-S-S-键和离去基团诸如MsO(甲磺酸酯基团)等的化合物作为起始原料的实施例，其涉及结合3-(甲基氨基)-1-丙醇和结合脂肪酸或脂溶性维生素(参见实施例1 - 5 )。本领域普通技术人员可以通过根据实施例的方法适当选择起始原料并进行反应而制备本发明的目标化合物。
现在解释本发明的脂质膜结构。本发明的脂质膜结构含有由上述式(1)代表的化合物作为膜构成脂质。此处，本发明中的“脂质膜结构”是指具有膜结构的颗粒，其中两亲性脂质的亲水性基团排列在界面中，面向水相侧。
尽管含有脂质的本发明的脂质膜结构的形式没有特别限制，但是可以提到例如，脂质体(单层脂质体，多层脂质体)、O/W乳剂、W/O/W乳剂、球状胶束、蠕虫状胶束或无序层结构等作为水性溶剂中的分散体形式。脂质膜结构优选为脂质体。
本发明的脂质膜结构可以进一步含有除本发明的化合物以外的分子，例如，脂质(磷脂(磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱等)、糖脂、肽脂、胆固醇、除本发明的化合物以外的阳离子脂质、PEG脂质等)、表面活性剂(例如，CHAPS、胆酸钠、辛基葡糖苷、N-D-葡萄糖-N-甲基烷酰胺等)、聚乙二醇、蛋白等。
尽管待含入本发明的脂质膜结构中的本发明的化合物的含量没有特别限制，但是当脂质膜结构被用作下述用于引入核酸的试剂时，它通常是足以引入核酸的量。例如，以总脂质的5 – 100 mol%、优选10 – 70 mol%、更优选30 – 50 mol%含有本发明的化合物。
此外，可以在用能够为脂质膜结构赋予各种功能的功能元件通过对于各元件已知的方法修饰脂质膜的表面之后使用本发明的脂质膜结构，所述功能元件诸如WO 2005/032593中描述的聚精氨酸肽，WO 2008/105178中描述的GALA肽(其加强对生物组分的抗性)，增强血液中的稳定性的聚亚烷基二醇和其它物质。
本发明的脂质膜结构可以通过在适当的分散介质(例如，水性溶剂和醇溶剂)中分散本发明的化合物和其它组成组分(脂质等)并视需要进行操作来诱导组织来制备。“操作来诱导组织”的实例包括，但不限于，本身已知的方法，诸如乙醇稀释法、简单水化法、超声、加热、涡旋、醚注射法、French压碎法、胆酸法、Ca2+融合法、冻融法、反相蒸发法等。
可以通过将核酸封装在本发明的脂质膜结构中并将脂质膜结构与细胞接触而将核酸体内和/或体外引入细胞。因此，本发明提供了用于引入核酸的试剂，其含有上述本发明的化合物或脂质膜结构。
任何核酸都可以引入细胞。核酸种类的实例包括，但不限于，DNA、RNA、DNA和RNA的嵌合核酸、DNA/RNA杂合体等。尽管可以使用具有1至3条链的任何核酸，但其优选为单链或双链。核酸可以是其它类型的核苷酸，诸如嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷或具有非核苷酸骨架的其它寡聚物(例如，商售的肽核酸(PNA)等)，含有特别键的其它寡聚物(所述寡聚物包含碱基配对或具有允许碱基结合的构型的核苷酸，其存在于DNA和RNA中)等。而且，它可以是添加已知修饰的核酸，例如，具有本领域已知标签的核酸，具有帽的核酸，甲基化的核酸，被类似物取代的一个或多个天然核苷酸，具有分子内核苷酸基修饰的核酸，例如，具有不带电键(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)的核酸，具有带电键或含硫键(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的核酸，例如，具有侧链基团诸如蛋白 (核酸酶、核酸酶抑制剂、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)、糖(例如，单糖等)等的核酸，具有插入性化合物(例如吖啶、补骨脂素等)的核酸，具有螯合化合物(例如，金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的核酸，含有烷基化剂的核酸，或具有修饰键的核酸(例如α异头型核酸等)。
可以根据使用目的视情况选择任何种类的DNA。例如，可以提到质粒DNA、cDNA、反义DNA、染色体DNA、PAC、BAC等。优选的是质粒DNA、cDNA和反义DNA，更优选的是质粒DNA。环状DNA，诸如质粒DNA等可以视情况用限制性内切酶等消化并且还用作线性DNA。而且，可以根据使用目的视情况选择任何种类的RNA。例如，可以提到siRNA、miRNA、shRNA、反义RNA、信使RNA、单链RNA基因组、双链RNA基因组、RNA复制子、转运RNA、核糖体RNA等，优选siRNA、miRNA、shRNA、mRNA、反义RNA和RNA复制子。
本发明中使用的核酸优选通过本领域普通技术人员通常使用的方法进行纯化。
在一个实施方案中，本发明中使用的核酸具有低和抑制的CpG序列频率，并且优选不含CpG序列。使用具有低CpG序列频率的核酸，引入细胞的核酸长时间停留在细胞中，并长时间维持其生理效应。例如，当不含CpG序列的质粒DNA(表达载体)用作本发明中使用的核酸时，目的基因可以以持续的方式表达较长时间。在本说明书中，CpG序列是具有从5’至3’在胞嘧啶之后出现的鸟嘌呤的类型的2碱基序列。例如，本发明中使用的核酸中CpG序列的频率不超过一个/每50个碱基，优选不超过一个/每100个碱基，更优选不超过一个/每1000个碱基，最优选没有。
此外，CpG序列诱导先天免疫应答，并且因此，本发明中可以通过使用具有低和抑制的CpG序列频率的核酸(优选地，不含CpG序列的核酸)来避免先天免疫应答引起的副作用诸如炎症等的发生。特别地，由于本发明的化合物和脂质膜结构本身刺激性较小，并且它们当给药于身体时几乎不诱导产生炎性细胞因子。因此，产生先天免疫应答引起的副作用诸如炎症等的风险可以通过组合使用本发明的脂质膜结构和具有低和抑制的CpG序列频率的核酸(优选地，不含CpG序列的核酸)而抑制到最小。
使用用于引入本发明的核酸的试剂以便将核酸引入体内细胞中的实施方案的实例包括用于将用于预防和/或治疗的核酸给药至身体(体内)，其目的在于预防或治疗疾病，诸如所谓的基因治疗。因此，在本发明的一个优选实施方案中，待通过引入本发明的核酸的试剂引入细胞的核酸具有针对给定疾病的预防和/或治疗活性。
为了通过使用用于引入本发明的核酸的试剂将核酸引入细胞，本发明的封装核酸的脂质结构通过当形成本发明的脂质膜结构时共同存在目标核酸而形成。例如，当脂质体通过乙醇稀释法形成时，水性核酸溶液和本发明的脂质膜结构的构成组分(脂质等)在乙醇中的溶液在涡旋等中剧烈搅拌，并且将混合物用适当缓冲液稀释。当通过简单水化法形成脂质体时，将本发明的脂质膜结构的构成组分(脂质等)溶解于适当有机溶剂中，将溶液置于玻璃容器中，并在减压下干燥以蒸发溶剂，从而获得脂质薄膜。向其中添加水性核酸溶液，并且，水化后，将混合物通过超声仪超声处理。本发明还提供了封装核酸的此类上述脂质膜结构。
作为封装核酸的脂质体的一种形式，可以提到通过在脂质体中封装核酸和聚阳离子(例如，鱼精蛋白)的静电复合物而制备的多官能包膜型纳米装置(MEND；在本说明书下文中有时缩写为“ MEND ” )(Kogure K等人, Multifunctional envelope-type nano device (MEND) as a non-viral gene delivery system. Adv Drug Deliv Rev. 2008)。该结构可以用作用于将核酸等选择性递送到特定细胞中的药物递送系统，并且可通过将抗原基因引入树突状细胞中用于，例如，DNA疫苗，肿瘤的基因治疗等。
封装核酸的本发明的脂质膜结构的表面电荷( ζ电位)优选为-10至+10 mV，更优选为-10 至+5 mV。在常规转基因中，已主要使用带电以具有正表面电位的颗粒。这可用作促进与带负电的细胞表面上的硫酸肝素静电相互作用以增强摄取进入细胞的方法。然而，正表面电荷可以由于与引入基因的细胞内相互作用而诱导转录抑制，并且可以由于与mRNA的细胞内相互作用而诱导翻译抑制。该问题可以通过调节表面电荷以落入上述范围内来解决。表面电荷可以使用Metasizer Nano (Malvern)来测量。脂质膜结构的表面电荷可以由含有本发明化合物的脂质膜结构的构成组分的组合物进行调节。
使如此获得的封装核酸的本发明的脂质膜结构与细胞接触来将封装核酸引入细胞内。细胞种类没有特别限制，可以使用原核或真核细胞，优先真核细胞。真核细胞种类没有特别限制，并且，例如，可以提到脊椎动物，诸如哺乳动物，包括人(人、猴、小鼠、大鼠、仓鼠、牛等)，鸟类(鸡、鸵鸟等)，两栖动物(蛙等)，鱼类(斑马鱼、稻鱼(rice-fish)等)等，无脊椎动物诸如昆虫(蚕蛾、蛾、果蝇等)等，植物，微生物诸如酵母等。更优选地，本发明中的靶细胞是动物或植物细胞，更优选哺乳动物细胞。该细胞可以是培养细胞系，包括癌细胞，或从个体或组织分离的细胞，或组织或组织片的细胞。该细胞可以是贴壁细胞或非贴壁细胞。
在一个使用本发明的化合物(其中R3a和R3b是视黄酸残基)的实施方案中，其中待引入核酸的靶细胞优选是表达细胞视黄酸结合蛋白II (CRABPII)的细胞。因为CRABPII具有以SUMO化依赖的方式将视黄酸转运至核的功能，所以期望使用本发明的化合物(其中R3a和R3b是视黄酸残基)由于CRABPII的功能而促进将核酸转运到核中。该细胞是否表达CRABPII可以由Western印迹法等来验证。表达CRABPII的器官的具体实例包括，但不限于，正常组织，诸如皮肤、睾丸、子宫、卵巢、脉络丛等，各种癌组织(视网膜母细胞瘤、Wilms肿瘤)，并且表达CRABPII的细胞的具体实例包括，但不限于，纤维肉瘤细胞(HT1080细胞)，口鳞状细胞癌(BHY细胞)，乳腺癌细胞(KATO3细胞、BT474、MCF-7、MDA-MB-134)等。
下面具体解释将封装核酸的本发明的脂质膜结构与细胞体外接触的步骤。
在与脂质膜结构接触之前几天将细胞悬浮在合适介质中，并在适当条件下培养。在与脂质膜结构接触时，细胞可以是或可以不是在增殖期。
接触的培养基可以是含有血清的培养基或无血清培养基，其中所述培养基的血清浓度优选不超过30％，更优选不超过20％，因为当培养基含有过量蛋白诸如血清等时，复合物与细胞之间的接触可被抑制。
接触的细胞密度没有特别限制，并且可以在考虑细胞种类等的情况下适当地确定。其通常在1×104 - 1×107细胞/mL的范围内。
将上述脂质膜结构的悬浮液添加至由此制备的细胞。待添加的含有复合物的溶液的量没有特别限制，并且可以在考虑细胞数量等的情况下适当地确定。待与细胞接触的脂质膜结构的浓度没有特别限制，只要可以实现期望的将核酸引入细胞中。脂质浓度通常为1 – 100 nmol/ml，优选10 – 50 nmol/ml，并且核酸浓度通常为0.01 – 100 μg/ml，优选0.1 – 10 μg/ml。
含有复合物的溶液添加至培养基和培养细胞时的温度、湿度和CO2浓度在考虑细胞种类的情况下适当地确定。在哺乳动物细胞的情况下，通常采用约37℃的温度，约95%的湿度和约5％的CO2浓度。尽管培养期也可以在考虑条件诸如细胞种类等的情况下适当地确定，但其通常为0.1 - 24小时，优选0.25 - 4小时，更优选0.5 - 2小时。当上述培养时间太短时，核酸不能充分地引入细胞中，并且当培养时间太长时，细胞可能会变弱。
通过上述培养，将核酸引入细胞中。优选通过用新鲜培养基交换培养基或将新鲜培养基添加至培养基而进一步继续培养。当细胞是源自哺乳动物的细胞时，新鲜培养基优选含有血清或营养因子。
如上所提到的，核酸可以通过使用本发明的脂质膜结构不仅在体外(体外)，而且在体内(体内)引入细胞中。即，通过将封装核酸的本发明的脂质膜结构给药至个体，所述脂质膜结构到达并与靶细胞接触，并且将脂质膜结构中封装的核酸体内引入到细胞中。可以给药复合物的个体没有特别限制，并且，例如，可以提到脊椎动物，诸如哺乳动物，包括人(人、猴、小鼠、大鼠、仓鼠、牛等)，鸟类(鸡、鸵鸟等)，两栖动物(蛙等)，鱼类(斑马鱼、稻鱼(rice-fish)等)等，无脊椎动物诸如昆虫(蚕蛾、蛾、果蝇等)等，植物等。给药复合物的个体优选为人或其它哺乳动物。
靶细胞的种类没有特别限制，并且可以通过使用本发明的脂质膜结构将核酸引入各种组织(例如肝、肾、胰腺、肺、脾、心脏、血液、肌肉、骨、脑、胃、小肠、大肠、皮肤、脂肪组织等)的细胞中。
复合物的给药方法没有特别限制，只要该复合物到达并与靶细胞接触，并且复合物中含有的待引入的化合物可以被引入细胞中，并且可以在考虑待引入的化合物种类、靶细胞的种类和部位等的情况下适当地确定本身已知的给药方法(口服给药，胃肠外给药(静脉内给药、肌内给药、局部给药、经皮给药、皮下给药、腹腔内给药、喷雾等)等)。脂质膜结构的剂量没有特别限制，只要可以实现将化合物引入细胞中，并且可以在考虑给药个体的种类、给药方法、待引入的化合物的种类、靶细胞的种类和部位等的情况下适当地确定。
当本发明的化合物或脂质膜结构被用作用于引入核酸的试剂时，它们可以根据常规方法配制。
当所述试剂作为研究试剂提供时，可以原样或以与，例如，水或其它生理上可接受的溶液(例如，上述水性溶剂，有机溶剂诸如乙醇、甲醇、DMSO等或水性溶剂和有机溶剂的混合物等)的无菌溶液或悬浮液的形式提供本发明的载体。所述试剂可以适当地含有本身已知的生理上可接受的赋形剂、媒介物、防腐剂、稳定剂、粘合剂等。
当所述试剂作为药物提供时，本发明的载体可以，原样或通过以对于实施制剂配制所需的常规认可的单位剂型将载体与药学上可接受的已知添加剂诸如载体、调味剂、赋形剂、媒介物、防腐剂、稳定剂、粘合剂等共混而以口服制剂(例如，片剂、胶囊等)或胃肠外剂(例如，注射剂、喷雾剂等)的形式提供。
本发明的用于引入核酸的试剂也可以以试剂盒的形式提供。除了本发明的化合物或脂质膜结构之外，该试剂盒可以含有用于引入核酸的试剂。在一个实施方案中，本发明的用于引入核酸的试剂(或试剂盒)进一步含有聚阳离子(例如，鱼精蛋白)。在该实施方案中使用本发明的用于引入核酸的试剂(或试剂盒)，可以容易地将核酸和聚阳离子(例如，鱼精蛋白)的静电复合物封装在本发明的脂质膜结构中以构成MEND，其可以经受细胞内引入核酸。
(缩写的解释)
pDNA：质粒DNA
Chol：胆固醇
NBD-DOPE：1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)
DMEM：Dulbecco氏改良的Eagle培养基
PEG2000-DSG：1,2-二硬脂酰基-sn-甘油, 甲氧基聚乙二醇 (PEG MW 2000)
PEG2000-DMG：1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油, 甲氧基聚乙二醇 (PEG MW 2000)
DOPE：1,2-二油烯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺
SOPE：1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺
SOPC：1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱。
实施例
下面更详细地解释本发明的实施例。
表2显示在以下实施例和比较例中制备的化合物的名称和结构。
[实施例1] (B-2的合成)
<甲磺酰化>
将乙腈(143 ml) 添加至2,2'-二硫代二乙醇(由ACROS生产)(15 g, 97.2 mmol)，并将混合物在20 - 25℃溶解。添加三乙胺(33.3 g, 328 mmol)，并且在20 - 25℃下搅拌5 min后，在冰冷却下添加甲磺酰氯34.5 g (300 mmol)，并且将混合物在20 - 25℃反应3小时。TLC分析(洗脱液：氯仿/甲醇=85/15(v/v))证实获得该反应产物的斑点，并且起始原料2,2'-二硫代二乙醇消失，以此终止反应。反应通过将乙醇(29 mL)添加至反应溶液而终止，并且不溶性物质使用滤纸(5A)滤出。向滤液中添加二氯甲烷(150 ml)和10％碳酸氢钠水溶液(150 g)，并且将混合物搅拌5 min，静置10 min，并去除水层。向有机层添加水(150 g)，并且将混合物搅拌5 min，静置10 min，并去除水层。用水洗涤4次后，将有机层回收，并通过添加硫酸钠(4.5 g)脱水。脱水处理后，用Opuraito和滤纸(5A)进行过滤。通过蒸发器蒸发滤液的溶剂，以得到棕色液体(29.4 g)。
<叔胺化>
将二甲磺酰化的化合物(5.0 g, 16 mmol)在40℃下溶解在乙腈(127 ml)中，并且添加碳酸钾(5.5 g, 39.8 mmol)，并将该混合物在25℃下搅拌5 min。将3-(甲基氨基)-1-丙醇(由Tokyo Chemical Industry生产) (7.2 g, 80.8 mmol)在25℃下溶解在乙腈(9.2 ml)中，并经1.5小时逐滴添加至上述二甲磺酰化的化合物/乙腈溶液中。在逐滴添加完成后2小时，进行TLC分析(洗脱液：氯仿/甲醇/28%氨水=80/20/2(v/v/v))以证实反应完成。用滤纸(5A)滤出碳酸钾，并通过蒸发器蒸发溶剂，以得到棕色液体(13.2 g)。将获得的棕色液体溶解在氯仿(132 ml)中，并用10％盐水(132 ml)洗涤。弃去水层，并将用10％盐水洗涤重复5次以去除起始原料3-(甲基氨基)-1-丙醇。回收氯仿层，并通过蒸发器蒸发溶剂，以得到浅黄色透明液体(下文称为二-MAP化合物) (4.3 g)。
<酰化>
将肉豆蔻酸(1.5 g, 6.7 mmol)溶解于二氯甲烷(5.8 ml)，添加DMAP (0.082 g, 0.67 mmol)，并在冰冷却下添加TEA (0.68 g, 6.7 mmol)。经1小时向该溶液中逐滴添加二氯甲烷(5.8 ml)中溶解的二-MAP化合物(1 g, 3.4 mmol)和二异丙基碳二亚胺(下文称为DIC)(1.7 g, 13.5 mmol)的溶液。在逐滴添加完成后2小时，进行TLC分析(洗脱液：氯仿/甲醇=95/5(v/v))。结果证实二-MAP化合物的消失，以此终止反应。用滤纸(5A)滤出不溶性物质，并通过蒸发器蒸发溶剂，以得到无色透明液体(7.2 g)。向液体中添加乙腈(38 ml)，并进行3次冷却结晶(10℃)。将获得的晶体溶解在己烷(45 ml)中，并向其中添加乙腈(38 ml)用于萃取洗涤。弃去乙腈层，进一步重复6次萃取洗涤，以去除由DIC和肉豆蔻酸衍生的杂质。回收己烷层，并通过蒸发器蒸发溶剂，以得到目标产物化合物B-2 (0.73 g)。
[实施例2] (B-2-2的合成)
将二-MAP化合物(2.0 g, 6.7 mmol)和硬脂酸(4.6 g, 16.2 mmol)溶解于氯仿(20 ml)中，并添加DMAP (0.33 g, 2.7 mmol)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐 (下文称为EDC) (3.9 g, 20.3 mmol)。在反应后4小时，进行TLC分析(洗脱液：氯仿/甲醇=95/5(v/v))。结果证实二-MAP化合物的消失，以此终止反应。此后，用5％碳酸氢钠水溶液(10 g)萃取洗涤反应混合物，其后弃去水层。然后，向回收的有机层中添加水(10 g)以便用水洗涤该层。弃去水层，并将硫酸镁(0.4 g)添加至有机层以进行脱水处理。用Opuraito和滤纸(5A)通过过滤滤出不溶性物质，并通过蒸发器蒸发溶剂，以得到橙色液体(下文称为二酰化化合物) (7.9 g)。
将二酰化化合物溶解在己烷(45 ml)中，并添加乙腈(38 ml)以进行萃取洗涤。弃去乙腈层，并重复两次己烷/乙腈洗涤。回收己烷层，并通过蒸发器蒸发溶剂，以得到无色透明液体(7.1 g)。将获得的液体通过硅胶柱层析法(洗脱剂：乙酸乙酯)纯化，以得到目标产物化合物B-2-2 (1.4 g)。
[实施例3] (B-2-3的合成)
将二-MAP化合物(2.0 g, 6.7 mmol)和亚油酸(4.5 g, 16.0 mmol)溶解于氯仿(20 ml)中，并添加DMAP (0.33 g, 2.7 mmol)和EDC (3.9 g, 20.3 mmol)。在反应后4小时，进行TLC分析(洗脱液：氯仿/甲醇=95/5(v/v))。结果证实二-MAP化合物的消失，以此终止反应。此后，用5％碳酸氢钠水溶液(10 g)萃取洗涤反应混合物，并弃去水层。然后，向回收的有机层中添加水(10 g)以便用水洗涤该层。弃去水层，并将硫酸镁(0.4 g)添加至有机层以进行脱水处理。用Opuraito和滤纸(5A)通过过滤滤出不溶性物质，并通过蒸发器蒸发溶剂，以得到作为橙色液体的二酰化化合物(6.0 g)。
将获得的液体通过硅胶柱层析法(洗脱剂：己烷/乙酸乙酯=5/5(v/v))纯化，以得到目标产物化合物B-2-3 (0.7 g)。
[实施例4]
(B-2-4的合成)
将二-MAP化合物(0.40 g, 1.35 mmol)和视黄酸(全反式视黄酸，Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (0.97 g, 3.24 mmol)溶解于氯仿(6.00 g)中。添加DMAP (0.07 g, 0.54 mmol)和EDC (0.78 g, 4.05 mmol)，并将混合物在25±3℃反应5小时。TLC分析(洗脱液: 氯仿/甲醇 = 9/1 v/v)证实二-MAP化合物的消失，以此终止反应。通过蒸发器蒸发溶剂，以得到液体(2.70 g)。将液体通过硅胶柱层析法(洗脱液: 氯仿/甲醇 = 98/2 (v/v))纯化，以得到目标产物化合物B-2-4 (0.42 g)。
[实施例5]
(B-2-5的合成)
将二-MAP化合物(0.50 g, 1.69 mmol)和D-α-生育酚琥珀酸酯(SIGMA-ALDRICH) (2.15 g, 4.06 mmol)溶解于氯仿(7.50 g)中，添加DMAP (0.08 g, 0.62 mmol)和EDC (0.97 g, 5.07 mmol)，并将混合物在25±3℃反应4小时。TLC分析(洗脱液: 氯仿/甲醇 = 9/1 v/v)证实二-MAP化合物的消失，以此终止反应。通过蒸发器蒸发溶剂，以得到液体(2.23 g)。将液体通过硅胶柱层析法(洗脱液: 氯仿/甲醇 = 98.5/1.5 (v/v))纯化，以得到目标产物化合物B-2-5 (0.94 g)。
[比较例1]
(B-2-1的合成)
为了与具有二硫键的本发明进行比较，合成其中实施例1的化合物的二硫键被碳键替代的化合物。
<叔胺化>
将1,6-二溴己烷(由Tokyo Chemical Industry生产)(6.0 g, 24.6 mmol)溶解在DMF (12.7 ml)中，添加3-(甲基氨基)-1-丙醇(由Tokyo Chemical Industry生产) (6.6 g, 73.7 mmol)和碳酸钾(1.7 g, 12.3 mmol)，并将该混合物在20 - 25℃搅拌3小时。通过TLC(洗脱液：氯仿/甲醇/28%氨水溶液=80/20/2(v/v/v))证实反应进程。使用滤纸(5A)滤出反应混合物中的碳酸钾，并通过蒸发器蒸发溶剂，以得到棕色液体。将获得的棕色液体溶解在氯仿(20 ml)中，并用水(30 g)萃取洗涤混合物。通过蒸发器蒸发有机层中的溶剂，以得到棕色液体(3.6 g)。
<酰化>
将获得的液体(2.0 g)和肉豆蔻酸(4.0 g, 18.4 mmol)溶解于氯仿(20 ml)，并添加DMAP (0.37 g, 3.0 mmol)和EDC (4.4 g, 23.1 mmol)。在反应后4小时，进行TLC分析(洗脱液：氯仿/甲醇=85/15(v/v))。结果证实起始原料的消失，以此终止反应。此后，用5％碳酸氢钠水溶液(10 g)萃取洗涤反应混合物，并弃去水层。然后，向回收的有机层中添加水(10 g)以便用水洗涤该层。弃去水层，并将硫酸钠(2 g)添加至有机层以进行脱水处理。用Opuraito和滤纸(5A)通过过滤滤出不溶性物质，并通过蒸发器蒸发溶剂。将获得的浓缩产物溶解在己烷(47 ml)中，并用乙腈(39 ml)萃取洗涤混合物。回收己烷层，并通过蒸发器蒸发溶剂，以得到目标产物化合物B2-2-1 (2.83 g)。
[实验例1] 各种MEND的制备
(1) 形成由质粒DNA(pDNA)和鱼精蛋白构成的核酸静电复合物
用10 mM HEPES缓冲液将编码荧光素酶基因的pDNA的溶液和鱼精蛋白(CALBIOCHEM)溶液分别稀释至0.3 mg/mL和0.05 mg/mL。搅拌0.3 mg/mL pDNA (125 μL)的同时，以小份逐滴添加0.24 mg/mL鱼精蛋白(125 μL)，以制备作为载体核心的鱼精蛋白和pDNA (N/P比率=1.2)的静电复合物。在以下(2)中描述的方法中，使用10 mM HEPES缓冲液(pH 5.3)，并且，在(3)中描述的方法中，使用10 mM HEPES缓冲液(pH 7.4)。
(2) 通过乙醇稀释法制备MEND
如下制备乙醇中的脂质溶液：以所需比例混合5 mM阳离子脂质、5 mM磷脂和5 mM胆固醇(Chol)以获得在Eppendorf管中的165 nmol总脂质，进一步添加对应于3 mol%总脂质的量的各种PEG脂质(乙醇中的1 mM溶液)，并添加乙醇以获得100 μL的总体积。在涡旋混合器中搅拌脂质溶液的同时，迅速添加100 μL[实验例1](1)中制备的核酸静电复合物(10 mM HEPES; pH 5.3)，并且此后添加10 mM HEPES缓冲液(1.8 mL, 调节至pH 5.3)以便将混合物稀释至5％的乙醇浓度。在离心条件下(室温，2267 rpm，20 min)使用Amicon Ultra 4 (Millipore)通过超滤将混合物浓缩至约50 μL。此后，将其用100 mM HEPES缓冲液(调节至pH 7.4)稀释至4 mL，并再次在室温条件下通过离心(2267 rpm, 20 min)浓缩。最后，将其用10 mM HEPES缓冲液(pH 7.4)稀释至所需脂质浓度。
(3) 通过简单水化法制备MEND
将各脂质在氯仿中的溶液(5 mM DOTAP 24.75 μL, 5 mM DOPE 33 μL, 5 mM Chol 24.75 μL)以DOTAP:DOPE:Chol=3:4:3在玻璃试管中混合以获得412.5 nmol总脂质。将乙醇添加至250 μL的总量，并将混合物在干燥器中在减压下干燥。蒸发溶剂，以得到脂质薄膜。向脂质薄膜中添加250 μL[实验例1](1)中制备的基因静电复合物(在10 mM HEPES; pH 7.4中)至1.65 mM的总脂质浓度，并将混合物在室温下放置10 min以使其水化，并通过超声仪(AIWA MEDICAL INDUSTRY CO., LTD.)超声处理1 min。
(4) 使用罗丹明标记的pDNA制备MEND
根据附带的方案使用Label/IT CX-罗丹明标记试剂盒(Mirus)制备罗丹明标记的pDNA。使用Nano Drop (Thermo Scientific)计算获得的罗丹明标记的pDNA溶液的浓度。为了制备封装罗丹明标记的pDNA的MEND，用罗丹明标记的pDNA完全替代[实验例1] (1)中描述的pDNA溶液，并且进行[实验例1] (2), (3)中描述的方法以制备MEND。
(5) 使用荧光标记的脂质膜制备MEND
[实验例1]
通过以对应于(2), (3)中描述的制备MEND的过程中总脂质的1 mol%的量添加乙醇中的NBD-DOPE (Avanti Polar Lipids)的溶液制备具有荧光标记的脂质膜的MEND。
[实验例2]
测量各种MEND的粒径和表面电位
通过动态光散射方法(Zetasizer Nano; Malve Rn)测量粒径和表面电位。通过[实验例1]的制备方法制备的各种MEND的粒径和表面电位显示在表3中。B-2和DODAP在生理pH的电荷处于-10至+10 mV的优选模式，然而B-2-1在生理pH的电荷为+12.3，其不小于+10 mV。
使用已知阳离子脂质DOTAP的MEND的表面电位为约+50 mV。
[实验例3]
在还原环境中的脂质体去稳定测试
使用TNS在各种MEND的还原环境下评估脂质膜不稳定性
将DTT添加至各MEND溶液至10 mM的最终浓度，并将混合物放置在37℃。在0、1、2、4、8、24小时后的时间点使用TNS (6-(对甲苯胺基)-2-萘磺酸)测量荧光强度。将MEND溶液稀释至0.5 mM。将0.5 mM MEND溶液(12 μL)、20 mM柠檬酸盐缓冲液(186 μL, 含有150 mM NaCl, 酸性pH (pH 4.0))和0.6 mM TNS (2 μL)添加至96孔板用于荧光测量(Nunc)，并在37℃以激发波长321 nm、检测波长447 nm测量荧光强度。作为对照，使用在0小时添加相同量的不含DTT的10 mM HEPES缓冲液并每次在37℃放置的MEND溶液，并且通过相同处理使用TNS测量荧光强度。将还原环境下的荧光强度除以对照的荧光强度并用作脂质膜的去稳定化的指标。结果显示在图1中。
作为结果，在不具有二硫键的DODAP和B-2-1中没有观察到由于DTT处理导致的TNS荧光的衰减。另一方面，B-2显示以时间依赖性方式的TNS荧光的消失。TNS在pH 4.0的酸性环境下经由静电相互作用被吸附至具有正表面电位的颗粒表面，并根据脂质体的脂质结构部分的脂溶性环境发射荧光。该结果中B-2的荧光消失被认为源自脂溶性环境的丢失，并表明由于脂质降解导致的脂质膜结构的瓦解。
[实验例4]
评估基因表达和细胞内摄取活性
(1) 评估MEND的细胞内摄取量
使用B-2 (实施例1)、B-2-1 (比较例1)和DODAP (比较例2)作为阳离子脂质，通过[实验例1] (2)中描述的方法制备具有阳离子脂质:SOPE:Chol=3:4:3组成的MEND。对于制备，PEG2000DSG被用作PEG脂质，并且制备对应于0.55 mM脂质浓度的MEND溶液。对于阳离子MEND，使用具有DOTAP(比较例3):DOPE:Chol=3:4:3的组成的脂质，并且根据[实验例1] (3)中描述的方法制备阳离子MEND。根据[实验例1] (5)中描述的方法用荧光标记各种MEND的脂质。
24小时之前将HT1080细胞以2×105细胞/2 mL/孔铺板在6孔板上，将各种样品MEND用DMEM (FBS+)稀释至27.5 nmol/1 mL/孔的脂质浓度，并转染至孔中。1小时后，去除含有MEND的DMEM，并将细胞用肝素(20单位/mL, 1 mL)洗涤两次，并进一步用PBS(-) (1 mL)洗涤一次。添加0.05%胰蛋白酶溶液(500 μL)，并将混合物在37℃下在培养箱中放置3 min。添加DMEM (FBS+) (1 mL)，并将混合物离心(700 g, 4℃, 5 min)。去除上清液，并将细胞在FACS缓冲液(1 mL)中悬浮。将悬浮液离心(700 g, 4℃, 5 min)，去除上清液，将细胞在FACS缓冲液(500 μL)中重悬浮。在临测量之前将悬浮液通过44 μm尼龙网，并测量细胞内NBD的荧光强度。结果显示在图2中。
用荧光标记的脂质NBD-DOPE修饰MEND中的脂质膜，并评估MEND的细胞内摄取。作为结果，与使用在生理pH(pH=7.4)为阳离子的B-2-1和DOTAP的MEND相比，中性颗粒B-2和DODAP的摄取量极低，尽管比非处理组(背景)的摄取量明显更高。
(2) 评估MEND的基因表达
使用B-2 (实施例1)、B-2-1 (比较例1)和DODAP (比较例2)作为阳离子脂质，通过[实验例1] (2)中描述的方法制备具有阳离子脂质:SOPE:Chol=3:4:3组成的MEND。对于制备，PEG2000DSG被用作PEG脂质，并且制备对应于0.55 mM脂质浓度的MEND溶液。对于阳离子MEND，使用具有DOTAP:DOPE:Chol=3:4:3的组成的脂质，并且根据[实验例1] (3)中描述的方法制备阳离子MEND。
24小时之前将HT1080细胞以4×104细胞/500 μL/孔铺板在24孔板上，将各种MEND用DMEM (FBS 10%+)稀释至0.4 μg/500 μL/孔的pDNA量，并转染。24小时后，将细胞用PBS(-) (500 μL)洗涤，以75 μL 向每孔添加1×裂解缓冲液，并将混合物在-80℃放置30 min或更长。将冷冻的24孔板在冰上解冻，用细胞刮棒将细胞分离，并且将其总量转移至Eppendorf管中，并在15000 rpm, 4℃, 5 min 的条件下离心。回收不同Eppendorf管中的上清液(50 μL)，并用于荧光素酶测定和BCA测定。
将20 μL上清液与荧光素酶测定底物(50 μL)混合，并通过光度计测量给定时间内的荧光素酶活性。将获得的裂解物用DDW稀释5倍，以获得25 μL总体积。向其中添加BCA蛋白测定试剂(200 μL)，并将混合物在37℃下放置30 min。此后，测量562 nm的吸光度，并根据具有已知浓度的BSA溶液的吸光度来计算样品的蛋白量。荧光素酶活性(RLU)通过除以蛋白量(mg)进行调节，并且计算荧光素酶活性/每细胞蛋白量(RLU/mg蛋白)。结果显示在图3中。
从B-2和B-2-1形成的MEND的活性超过常规已知的阳离子脂质DODAP的活性。此外，从B-2制备的MEND的活性明显高于从B-2-1制备的MEND的活性。具体而言，在B-2中可以获得等同于常规已知的阳离子脂质DOTAP的活性的活性。
已经阐明，由B-2构成的MEND显示等同于由阳离子脂质DOTAP构成的MEND的基因表达活性的基因表达活性，即使前者显示了与后者相比较低摄取到细胞中。将基因转移活性除以[实验例4] (1)中获得的细胞内摄取量，并且获得值显示在图4中。由于B-2的值与不含二硫基的常规DOTAP、DODAP和B-2-1相比较高，所以显示摄取进入细胞后优异的细胞内动力学特性。
[实验例5]
基因表达活性
使用B-2 (实施例1)、B-2-2 (实施例2)和B-2-3(实施例3)作为阳离子脂质，通过[实验例1] (2)中描述的方法制备具有阳离子脂质:SOPE:Chol=3:4:3组成的MEND。对于制备，PEG2000DSG被用作PEG脂质，并且制备对应于0.55 mM脂质浓度的MEND溶液。通过[实施例4] (2)中描述的方法评估基因表达。结果显示在图5中。
已经阐明，由B-2-2和B-2-3形成的MEND的活性差于由B-2形成的MEND的活性，但超过常规pH响应性脂质阳离子脂质DODAP的活性。
[实验例6]
细胞内动力学(内体逃逸效率)
对于MEND制备，使用通过[实验例1] (4)的方法制备的罗丹明标记的pDNA。通过[实验例1] (2)中描述的方法制备具有阳离子脂质:SOPE:Chol=5:3:2组成的MEND。对于制备，PEG2000-DMG被用作PEG脂质，并且制备对应于0.55 mM脂质浓度的MEND溶液。对于阳离子MEND，使用具有DOTAP(比较例3):DOPE:Chol=3:4:3的组成的脂质，并且根据[实验例1] (3)中描述的方法制备阳离子MEND。此外，还通过简单水化方法制备具有DOTAP:DOPE:Chol=3:4:3的脂质组成的阳离子MEND以具有0.55 mM的脂质浓度。
24小时之前，将HT1080细胞以1×105细胞/2 mL/培养皿铺板在玻璃底培养皿中。由于由B-2或DODAP构成的MEND显示低摄取进入细胞活性，所以MEND用Krebs缓冲液稀释至pDNA 8 μg/1 mL Krebs缓冲液/培养皿。对于具有高摄取活性的B-2-1或DOTAP MEND，MEND用Krebs缓冲液稀释至pDNA 1.6 μg/1 mL Krebs缓冲液/培养皿并转染至细胞中。2.5小时后，以1 μL/培养皿添加Lysotracker Green (Life technologies)，30 min后，以1 μL/培养皿进一步添加Hoechst 33342 (Dojindo)。转染后3小时，将细胞用肝素(20单位/mL, 2 mL)洗涤两次，添加Krebs缓冲液(1 mL)，并通过共聚焦激光扫描显微镜观察混合物。结果显示在图6中。结果定量并显示在图7中。
罗丹明标记的pDNA、内体/溶酶体和核分别以红色、绿色和蓝色的伪彩色显示。内体逃逸效力通过红色和绿色的共定位来评估。单独的红色信号存在于B-2、B-2-1和DOTAP中，这似乎表明各MEND的高内体逃逸效力。另一方面，红色和绿色的共定位在DODAP中是显著的，并且观察到黄色点。由此提出，使用B-2或B-2-1形成的MEND中的内体逃逸效力优于使用DODAP的MEND。此外，定量基因内体逃逸效率，发现以DODAP<B-2-1<B-2的顺序的更高效率。
[实验例7]
细胞内动力学(去封装效率)
对于MEND制备，使用通过[实验例1] (4)的方法制备的罗丹明标记的pDNA。此外，通过[实验例1] (3)中描述的方法测量构成MEND的脂质的荧光标记。通过[实验例1] (2)中描述的方法制备具有阳离子脂质:SOPE:Chol=5:3:2组成的MEND。对于制备，PEG2000-DMG被用作PEG脂质，并且制备对应于0.55 mM脂质浓度的MEND溶液。对于阳离子MEND，使用具有DOTAP:DOPE:Chol=3:4:3的组成的脂质，并且根据[实验例1] (3)中描述的方法制备阳离子MEND。具有DOTAP:DOPE:Chol=3:4:3的组成的脂质用于阳离子MEND，其通过[实验例1] (3)中描述的方法制备。
24小时之前，将HT1080细胞以1×105细胞/2 mL/培养皿铺板在玻璃底培养皿中。将B-2 MEND用Krebs缓冲液稀释以获得pDNA 8 μg/1 mL Krebs缓冲液/培养皿。对于B-2-1或DOTAP MEND，将MEND用Krebs缓冲液稀释以获得pDNA 1.6 μg/1 mL Krebs缓冲液/培养皿并转染。2.5小时后，以1 μL/培养皿添加Hoechst 33342，并且30 min后，将细胞用肝素溶液(20单位/mL, 2 mL)洗涤两次，添加Krebs缓冲液(1 mL)，并通过共聚焦激光扫描显微镜观察细胞。结果显示在图8中。
罗丹明标记的pDNA、MEND的脂质膜和核分别以红色、绿色和蓝色的伪彩色显示。红色点在B-2和DOTAP中是显著的，并且基因被认为已经在细胞中从MEND有效解离。另一方面，B-2-1显示红色和绿色的清楚共定位，并且观察到几乎所有pDNA都是黄色点。由此认为，B-2 MEND的基因去封装效率优于B-2-1 MEND的基因去封装效率。
[实验例8]
体内基因表达活性和活性持续时间
(1) 制备用于体内给药的MEND
用10 mM HEPES缓冲液将编码荧光素酶基因的pDNA的溶液和鱼精蛋白(制造商)溶液分别稀释至0.3 mg/mL和0.24 mg/mL。搅拌0.3 mg/mL pDNA (400 μL)的同时，以小份逐滴添加0.23 mg/mL鱼精蛋白溶液(400 μL)，以制备作为载体核心的鱼精蛋白和pDNA (N/P比率=1.2)的静电复合物。
通过以B-2:SOPC:Chol=3:4:3的比率混合5 mM B-2、5 mM SOPC和5 mM Chol而制备乙醇中的脂质溶液，以获得Eppendorf 管中的165 mM总脂质。此外，以对应于总脂质的10 mol%的量添加PEG2000-DSG作为PEG脂质，并添加乙醇以获得750 μL的总体积。将基因和鱼精蛋白构成的静电复合物溶液(750 μL)与脂质溶液(750 μL)混合，并将混合物快速搅拌，用10 mM HEPES溶液(pH 5.3)稀释至15 mL，并使用Amicon(R) Ultra-15 100K装置以3,000 rpm, 15 min, 25℃进行超滤。超滤后的溶液用100 mM HEPES缓冲液(pH 7.4)稀释，再次进行超滤。将溶液用10 mM HEPES缓冲液稀释至750 μL。
(2) 研究B-2 MEND的基因表达活性的时间依赖性
将通过(1)中显示的方法制备的MEND溶液和使用MPC/GALA的阳离子MEND(其显示基因在肝脏中的高表达(Ukawa等人, Biomaterials., 31(24) 6355-6362 (2010))各自从尾静脉以对应于40 μg DNA的量给药于5周龄的雄性ICR小鼠。6、24、48、72小时后，通过脱颈椎方法使小鼠安乐死，并且分离肝、肺和脾并用液氮冷冻。将它们在裂解缓冲液中解冻以制备匀浆。将它们以13,000 rpm, 10 min, 4℃离心，收集上清液，并用作测量样品。将样品溶液(20 μL)与荧光素酶底物(50 μL)混合，并使用Luminescenser-PSN (AB2200 ATTO)测量荧光素酶活性。此外，样品中的蛋白浓度使用BCA蛋白测定试剂盒进行定量，并且将基因表达活性测定为RLU/mg蛋白。结果显示于图9和图10中。
据阐明，使用MPC/GALA的阳离子MEND显示6小时后基因表达活性的峰值，并且随后显示基因表达随时间的快速下降。该趋势与一般阳离子脂质复合物的趋势是相同的(Sakurai等人, Journal of Controlled Release 17 (2007) 430-437)。另一方面，B-2 MEND显示基因表达活性的逐渐增加，其在48小时后达到最高。这些结果表明，B-2 MEND具有优于常规载体的表达持续性(图9)。
尽管常规的阳离子MEND的器官选择性差并在肺和脾中显示与肝中相同水平的基因表达活性，但B-2 MEND在肺和脾中显示背景水平的基因表达活性并且在器官选择性(特别是肝选择性)方面是优异的(图10)。
[实验例9]
内体和溶酶体酸化抑制对基因表达活性的影响
使用B-2 (实施例1)、B-2-1 (比较例1)和DODAP (比较例2)作为阳离子脂质，通过[实验例1] (2)中描述的方法制备具有阳离子脂质:SOPE:Chol=5:3:2组成的MEND。对于制备，PEG2000-DMG被用作PEG脂质，并且制备对应于0.55 mM脂质浓度的MEND溶液。对于阳离子MEND，使用具有DOTAP(比较例3):DOPE:Chol=3:4:3的组成的脂质，并且根据[实验例1] (3)中描述的方法制备阳离子MEND。
24小时之前将HT1080细胞以4×104细胞/500 μL/孔铺板在24孔板上，在预处理之前30 min添加0.5 μM的巴弗洛霉素A1。将各种MEND用DMEM (FBS 10%+)稀释至0.4 μg/500 μL/孔的pDNA量，添加0.5 μM的巴弗洛霉素A1，并进行转染。3小时后，去除MEND溶液，并添加500 μL/孔的DMEM (FBS 10%+)以改变培养基。24小时后，将细胞用PBS(-) (500 μL)洗涤，以75 μL 向每孔添加1×裂解缓冲液，并将混合物在-80℃放置30 min或更长。将冷冻的24孔板在冰上解冻，用细胞刮棒将细胞分离，并且将其总量转移至Eppendorf管中，并在15000 rpm, 4℃, 5 min 的条件下离心。回收不同Eppendorf管中的上清液(50 μL)，并用于荧光素酶测定和BCA测定。通过[实施例4] (2)中描述的方法评估基因表达。
作为结果，在生理pH环境下为阳离子的B-2-1和DOTAP没有显示基因表达活性的降低。另一方面，B-2, DODAP显示基因表达活性的降低。这些结果表明，通过内体酸化使脂质膜带正电荷有助于B-2, DODAP的基因表达活性(图11)。
[实验例10]
评估对体外翻译反应的影响
使用核酸酶处理的兔网织红细胞裂解物系统(Promega KK)评估对体外翻译系统的抑制作用
通过[实验例1] (2)中描述的方法制备具有B-2:SOPE:Chol=5:3:2组成的MEND。对于制备，PEG2000-DMG被用作PEG脂质，并且制备对应于0.55 mM脂质浓度的MEND溶液。对于阳离子MEND，使用具有DOTAP:DOPE:Chol=3:4:3的组成的脂质，并且根据[实验例1] (3)中描述的方法制备阳离子MEND。
将荧光素酶-mRNA溶液稀释至0.005 μg/μL。相对于1 μL mRNA溶液以0.0625、0.125、0.25 μg添加各种MEND溶液，以调节总量至6.5 μL。添加RRL(兔网织红细胞裂解物，17.5 μL)、AAM(氨基酸混合物) -Met (0.25 μL)、AAM-Leu (0.25 μL)和RRI (重组RNase抑制剂，0.5 μL)的混合物，并将该混合物在30℃放置90 min。
将10 μL混合物与荧光素酶测定底物(50 μL)混合，并通过光度计测量给定时间内的荧光素酶活性。将获得的反应溶液用DDW稀释500倍，以获得25 μL总体积。向其中添加BCA蛋白测定试剂(200 μL)，并将混合物在37℃下放置30 min。此后，测量562 nm的吸光度，并根据具有已知浓度的BSA溶液的吸光度来计算样品的蛋白量。荧光素酶活性(RLU)通过除以蛋白量(mg)进行调节，并且计算荧光素酶活性/每细胞蛋白量(RLU/mg蛋白)。结果显示在图12中。
作为结果，在使用DOTAP的MEND中观察到对体外翻译反应的显著抑制作用。然而，在使用B-2的MEND中没有观察到此类作用。由此，B-2被认为显示较少与核酸的细胞内相互作用。
[实验例11]
评估血清耐受性
通过[实验例1] (2)中描述的方法制备具有B-2 (实施例1):SOPE:Chol=3:4:3或B-2 (实施例1):SOPC:Chol=3:4:3组成的MEND。对于制备，PEG2000-DMG被用作PEG脂质，并且制备对应于0.55 mM脂质浓度的MEND溶液。
从4周龄雄性ICR小鼠的腹腔收集血液样品，并在室温放置30 min，以使血液完全凝固。血液凝块通过拍打从壁脱离，并以4,000 rpm, 15 min, 25℃离心，由此回收上清液。将裸pDNA、核心、MEND溶液和小鼠血清混合，以得到90％小鼠血清，将其以650 rpm处理并放置在37℃。0、1、3、6、24小时后，将70 μL混合物在-20℃冷冻和保存。反应混合物用水(210 μL)稀释，向其中添加280 μL碱性酚/氯仿/异戊醇溶液，并将混合物剧烈搅拌约30秒，以15,000 rpm, 15 min, 25℃离心，并回收上清液。1％琼脂糖凝胶被用于电泳。将样品(12 μL)与6x上样染料(2 μL)混合，并将其总量施加至孔以进行电泳。将凝胶通过浸入EtBr 水溶液中30 min进行染色，并拍照。
在裸pDNA和核心中，将pDNA在与血清混合后1小时内裂解，并且没有观察到条带。然而，当它们被制备为MEND时，甚至在24小时后也观察到条带。结果证实，使用B-2制备的MEND具有血清耐受性，并且可以防止pDNA在血清中的降解(图13)。
[实验例12]
评估B-2 MEND的基因表达活性的时程变化
将通过实验例9中显示的方法制备的MEND溶液、使用R8/GALA的阳离子MEND(其显示基因在肝脏中的高表达特性(Khalil等人, J Control Release., 156(3) 374-80, 2011))和体内JetPEI-Gal (PolyPlus-Transfection)(其是商售的靶向肝脏的转基因试剂)各自从尾静脉以对应于40 μg DNA的量给药于5周龄的雄性ICR小鼠。作为在这种情况下待装至由B-2构成的MEND的DNA，WO 2011/132713中描述的pCpGfree-Luc(0)被用作完全排除已知诱导免疫应答的CpG序列的pDNA，并且作为具有CpG序列的一般pDNA，使用在质粒DNA的骨架中含有CpG序列并且甚至在萤光素酶序列(标记基因)的起始密码子和终止密码子之间具有CpG序列的质粒DNA (pcDNA3.1-Luc(+)；CpG序列总共425)。在使用阳离子MEND和体内JetPEI-Gal的基因转移中，使用单独的pCpGfree-Luc(0)。6、24、72小时后，将对应于3 mg的荧光素(体内级，Promega)在腹膜内给药于小鼠，并使用IVIS LuminaII (Caliper Life Sciences)进行成像。至于由B-2构成的MEND，甚至在72小时后约一周两次进行成像。将小鼠腹部的总发光量计算为来自获得图像的光子/秒，并用作肝脏中基因表达活性的指标。获得的图像显示在图14 (上部小图)中，并且总发光量的图显示在图14(下部小图)中。
使用R8/GALA的阳离子MEND在6小时后显示强烈发光，此后基因表达随时间迅速降低，并且在72小时后完全没有看到发光。体内JetPEI-Gal显示非常高的源自肺的发光和对于肝脏的低器官选择性，尤其是6小时后。此外，使用该载体的基因表达的持续性也差。另一方面，使用pcDNA3.1-Luc(+)的B-2 MEND在6小时后显示弱发光，此后基因表达降低。当使用pCpGfree-Luc(0)时，发光量从6小时后增加至24小时后，此后发光量保留随后1周，并且发光在18天后完全消失。这些结果显示，组合不含CpG序列的pDNA 的B-2 MEND在持续性方面优于常规类型的载体。
[实验例13]
评估MEND的肝内行为
将通过实验例9中显示的方法制备的MEND和使用R8/GALA的阳离子MEND(其显示基因在肝脏中的高表达(Khalil等人, J Control Release., 156(3) 374-80)各自通过在制备阶段将罗丹明-DOPE(Avanti极性脂质)添加至脂质溶液而用荧光标记。将罗丹明-DOPE以总脂质浓度的0.1％的量添加至R8/GALA-MEND，并且以总脂质浓度的1％的量添加至B-2 MEND。将50 mg/mL戊巴比妥钠(Nacalai Tesque)以盐水稀释5倍并腹腔内给药于ICR小鼠(5周龄雄性)用于麻醉。将Griffonia simplicifolia凝集素I-B4同工凝集素FITC缀合物(VECTOR Laboratories，约80 μL)在麻醉下从尾静脉给药于小鼠以便将血管内皮细胞染色。小鼠经受剖腹手术以暴露肝脏，将ImmersolTM518F (Carl Zeiss)逐滴添加至器官以防止器官干燥。将与充满MEND溶液的延长管连接的有翅静脉留置针留置在小鼠尾静脉中。为了防止观察部位由于小鼠的心脏跳动而错位，使用通过吸附而固定肝脏的装置(Shimizu K等人, J Biosci Bioeng.112(5):508-10)，并使用具有60倍的水浸没透镜的共聚焦显微镜(Nikon A1)观察小鼠。将MEND给药于小鼠，从而使得从拍摄开始约5秒内实现40 μg DNA/小鼠和在约10 min内完成拍摄。结果显示在图15中。
当使用以R8/GALA修饰的MEND时，大量凝固物流入肝脏血液且许多颗粒主要沿血管壁吸附，而当使用B-2时，观察到没有形成凝固且MEND均匀地流过血管，以及随时间从血管渗出去，并转移至肝脏。
[实验例14]
评估MEND给药的细胞因子产生
将[实验例12 ]中使用的MEND各自以对应于40 μg DNA的量从尾静脉给药于5周龄的雄性ICR小鼠。1、3、6、24小时后，从心脏收集血液，并使用Quantikine ELISA试剂盒(R&D Systems)测量TNF-α、IFN-γ、IL-12p70。各血液浓度曲线显示在图16中。
阳离子MEND在给药后3小时显示略微高的TNF-α值，即使其含有pCpGfree-Luc(0)，并且IFN-γ值在6小时后变高。另一方面，使用pcDNA3.1-Luc(+)的B-2 MEND在3小时后显示高TNF-α值，并且在6小时后显示高IL-12p70值。同时，当使用B-2 MEND引入pCpGfree-Luc(0)时，3种细胞因子在任何时间点都保持正常值。
这些结果表明，使用pCpGfree-Luc(0)制备的B-2 MEND不容易诱导免疫应答。因此，据认为，由于免疫应答、有害副作用等导致的基因表达活性的降低不容易发生。
[实验例15]
使用B-2-4、B-2-5制备MEND
(1) 根据[实验例1] (1)和(2)中描述的方法制备具有B-2-4 (实施例4):DOPE:Chol=3:3:4或B-2-5 (实施例5):POPE:Chol=3:4:3组成的MEND。
(2) 使用Cy5标记的pDNA制备MEND
根据附带的方案使用Label/IT Cy5标记试剂盒(Mirus)制备Cy5标记的pDNA。使用Nano Drop (Thermo Scientific)计算获得的Cy5标记的pDNA溶液的浓度。当制备封装Cy5标记的pDNA的MEND时，用Cy5标记的pDNA替代10%的[实验例1] (1)中描述的pDNA溶液，并且根据[实验例1] (2)和(3)中描述的方法制备MEND。
[实验例16]
测量各种MEND的粒径和表面电位
通过动态光散射方法(Zetasizer Nano; Malvern)测量粒径和表面电位。通过[实验例1]的制备方法制备的各种MEND的粒径和表面电位显示在表4中。B-2-4和B-2-5两者在生理pH值下都显示-10至+10 mV的优选电荷。
[实验例17]
通过染色方法的电镜观察
根据[实验例1] (1), (2)和[实验例15]制备B-2 (实施例1)和B-2-4 (实施例4)的MEND。对于制备，PEG2000-DMG被用作PEG脂质，并且制备对应于1.38 mM脂质浓度的MEND溶液。将50％蔗糖溶液(pH 5.3) (5 mL)添加至离心管中，其上铺有10％蔗糖溶液(pH 5.3) (5 mL)，并且进一步覆盖MEND溶液(1.5 mL)以形成不连续密度梯度。通过超速离心(110000 g, 2h, 25℃) (OptimaTM L-90K Ultracentrifuge, Sw41Ti, BECKMAN)进行纯化。回收蔗糖密度10％和50％的界面(4 mL)，并通过超滤(1000 g, 3 min, 25℃)去除蔗糖，以得到样品溶液。将2倍稀释的样品溶液吸附至400目碳膜TEM网格，其通过滤纸吸收。添加2％磷钨酸溶液(pH 7.0)，并将混合物放置10秒。对于观察，使用透射电子显微镜(JEM-1200EX, JEOL Ltd.)。将加速电压设定为80 kV，并通过CCD照相机(VELETA, JEOL Ltd.)采集图像。结果显示在图17中。
上部小图中的B-2和下部小图中的B-2-4两者中，观察到包被单层脂质膜的结构。
[实验例18]
评估基因表达活性
使用B-2-4 (实施例4):DOPE:Chol=3:3:4、B-2-5 (实施例5):POPE:Chol=3:3:4、B-2 (实施例1):SOPE:Chol=5:3:2的组合物作为脂质，根据[实验例1] (1)和(2)制备MEND。对于制备，PEG2000-DMG被用作PEG脂质，并且制备对应于0.55 mM脂质浓度的MEND溶液。
通过[实验例4] (2)中描述的方法评估基因表达活性。结果显示在图18中。
从B-2-5形成的MEND的活性等同于B-2的活性。从B-2-4形成的MEND的活性明显高于B-2和B-2-5的活性。
[实验例19]
时程评估基因表达活性和细胞内摄取量
(1) 时程观察MEND的细胞内摄取量
根据[实验例1] (1)、(2)、[实验例15]制备B-2-4 (实施例4)和B-2 (实施例1)的MEND。对于制备，PEG2000-DMG被用作PEG脂质，并且制备对应于0.55 mM脂质浓度的MEND溶液。对于阳离子MEND，使用具有DOTAP(比较例3):DOPE:Chol=3:4:3的组成的脂质，并且根据[实验例1] (3)中描述的方法制备阳离子MEND。根据[实验例15] (2)中描述的方法用荧光标记pDNA。
24小时之前将HT1080细胞以2×105细胞/2 mL/孔铺板在6孔板上，将各种样品MEND用DMEM (FBS+)稀释至1.6 μg/2 mL/孔的pDNA浓度，并转染至孔中。1、3、6小时后，去除含有MEND的DMEM，并将细胞用肝素(20单位/mL, 1 mL)洗涤两次，并进一步用PBS(-) (1 mL)洗涤一次。添加0.05%胰蛋白酶溶液(500 μL)，并将细胞在37℃下在培养箱中放置3 min。添加DMEM (FBS+) (1 mL)，并将混合物离心(700 g, 4℃, 5 min)。去除上清液，并将细胞在FACS缓冲液(1 mL)中悬浮。将悬浮液离心(700 g, 4℃, 5 min)，去除上清液，将细胞在FACS缓冲液(500 μL)中重悬浮。在临测量之前将悬浮液通过44 μm尼龙网，并测量细胞内Cy5的荧光强度。结果显示在图19中。
用Cy5荧光修饰pDNA，并评估MEND的细胞内摄取。作为结果，与使用在生理pH(pH=7.4)为阳离子的DOTAP的MEND相比，中性颗粒B-2和B-2-4的摄取量较低。使用B-2-4的MEND相比B-2被更高摄取。
(2) 使用AB-2550 Kronos Dio (Atto)时程评估基因表达
根据[实验例1] (1)、(2)和[实验例18]制备B-2-4 (实施例4)、B-2 (实施例1)的MEND。对于制备，PEG2000-DMG被用作PEG脂质，并且制备对应于0.55 mM脂质浓度的MEND溶液。对于阳离子MEND，使用具有DOTAP(比较例3):DOPE:Chol=3:4:3的组成的脂质，并且根据[实验例1] (3)中描述的方法制备阳离子MEND。
24小时之前将HT1080细胞以4×104细胞/2 mL/培养皿铺板在3.5 cm细胞培养皿上，将各种MEND用含有200 μM最终浓度的D-荧光素钾的DMEM (FBS 10%+，无酚红)稀释，以实现基于pDNA量1.6 μg/2 mL/培养皿，并进行转染。根据Kronos Dio包装说明书，将发光量每20 min测量2 min，并取作荧光素酶活性(RLU/2 min)。结果显示在图20中。
从B-2-4形成的MEND的活性明显高于从B-2-1和DOTAP形成的MEND的活性。B-2的活性等同于DOTAP的活性。
已经阐明，由B-2-4构成的MEND显示与由阳离子脂质DOTAP构成的MEND的基因表达活性相比明显更高的基因表达活性，即使前者显示与后者相比较低摄取到细胞中。据显示，B-2-4在摄取进入细胞后的细胞内动力学特性方面进一步优于B-2和常规DOTAP。
[实验例20]
细胞内动力学(内体逃逸效率)
(1) 评估内体逃逸效率
对于MEND制备，使用通过[实验例1] (4)的方法制备的罗丹明标记的pDNA。当制备封装罗丹明标记的pDNA的MEND时，用罗丹明标记的pDNA替代50%的[实验例1] (1)中描述的pDNA溶液。
通过[实验例1] (2)中描述的方法制备具有B-2-4 (实施例4):DOPE:Chol=3:3:4、B-2 (实施例1):SOPE:Chol=5:3:2组成的MEND。对于制备，PEG2000-DMG被用作PEG脂质，并且制备对应于0.55 mM脂质浓度的MEND溶液。
24小时之前，将HT1080细胞以5×104细胞/2 mL/培养皿铺板在玻璃底培养皿中。将MEND用DMEM (FBS 10%+)稀释以获得pDNA 1.6 μg/2 mL，并转染至细胞中。5.5小时后，以2 μL/培养皿添加Lysotracker Green (Life technologies)。转染后6小时，将细胞用肝素(20单位/mL, 2 mL)洗涤两次，添加Krebs缓冲液(1 mL)，并通过共聚焦激光扫描显微镜观察细胞。结果显示在图21中。
罗丹明标记的pDNA、内体/溶酶体和核分别以红色、绿色和蓝色的伪彩色显示。根据下式计算内体逃逸效率。
结果显示在图22中。由此阐明，B-2-4显示比B-2显著更高的内体逃逸效率。
(2) 评估内体量
通过[实验例1] (2)中描述的方法制备具有B-2-4 (实施例4):DOPE:Chol=3:3:4、B-2 (实施例1):SOPE:Chol=5:3:2组成的MEND。对于制备，PEG2000-DMG被用作PEG脂质，并且制备对应于0.55 mM脂质浓度的MEND溶液。
24小时之前，将HT1080细胞以5×104细胞/2 mL/培养皿铺板在玻璃底培养皿中。将MEND用DMEM (FBS 10%+)稀释以获得pDNA 1.6 μg/2 mL，并转染至细胞中。未转染MEND的细胞用作对照。5.5小时后，以2 μL/培养皿添加Lysotracker Green (Life technologies)，30 min后，以2 μL/培养皿进一步添加Hoechst 33342 (Dojindo)。转染后6小时，将细胞用肝素(20单位/mL, 2 mL)洗涤两次，添加Krebs缓冲液(1 mL)，并通过共聚焦激光扫描显微镜观察细胞。结果显示在图23中。
内体/溶酶体和核分别以绿色和蓝色的伪彩色显示。根据下式计算相对内体量。
结果显示在图24中。由此阐明，与未处理组和B-2处理组相比，用B-2-4转染的细胞显示内体的显著减少。表明[实验例20] (1)中显示的高内体逃逸效率由内体破坏作用引起。
[实验例21]
细胞内动力学(去封装效率)
对于MEND制备，使用通过[实验例1] (4)的方法制备的罗丹明标记的pDNA。为了制备封装罗丹明标记的pDNA的MEND，用罗丹明标记的pDNA替代50%的[实验例1] (1)中描述的pDNA溶液。此外，通过[实验例1] (3)中描述的方法用荧光标记构成MEND的脂质。通过[实验例1] (2)中描述的方法制备具有B-2-4 (实施例1):DOPE:Chol=3:3:4、B-2 (比较例2):SOPE:Chol=5:3:2组成的MEND。对于制备，PEG2000-DMG被用作PEG脂质，并且制备对应于0.55 mM脂质浓度的MEND溶液。
24小时之前，将HT1080细胞以5×104细胞/2 mL/培养皿铺板在玻璃底培养皿中。将MEND用DMEM (FBS 10%+)稀释以获得pDNA 1.6 μg/2 mL，并转染至细胞中。3、6、9、12小时后，将细胞用肝素溶液(20单位/mL, 2 mL)洗涤两次，添加Krebs缓冲液(1 mL)，并且通过共聚焦激光扫描显微镜获得转染后3、6、9、12小时的图像。结果显示在图25中。
罗丹明标记的pDNA和MEND的脂质膜分别以红色和绿色的伪彩色显示。根据下式计算去封装效率。
结果显示在图26中。表明B-2引起从早期阶段的良好去封装。表明B-2-4引起随着时间推移的逐渐去封装。
[实验例22]
细胞内动力学(细胞内摄取途径)
(1) 对细胞内摄取量的影响
根据[实验例1] (1)、(2)、[实验例18]制备B-2-4 (实施例4)，B-2 (实施例1)的MEND。对于制备，PEG2000-DMG被用作PEG脂质，并且制备对应于0.55 mM脂质浓度的MEND溶液。根据[实验例15] (2)中描述的方法用荧光标记pDNA。
24小时之前，将HT1080细胞以2×105细胞/2 mL/孔铺板在6孔板上。在转染前30 min，将培养基更换为含有10 μg/μL最终浓度的菲律宾菌素的DMEM (FBS+)。在转染前15 min，将培养基更换为含有最终浓度0.3M蔗糖和1 mM阿米洛利的DMEM (FBS+)。对于转染，基于pDNA量以1.6 μg/2 mL/培养皿将各种MEND添加至培养皿。转染后3小时，通过[实验例19] (1)中描述的方法测量细胞内pDNA量。结果显示在图27中。
对于B-2和B-2-4两者，细胞内摄取都是蔗糖和阿米洛利敏感的，表明网格蛋白介导的内吞作用和巨胞饮作用的参与。
(2) 对基因表达活性的影响
使用B-2-4 (实施例4):DOPE:Chol=3:3:4、B-2 (实施例1):SOPE:Chol=5:3:2的组合物作为脂质，根据[实验例1] (1), (2)制备MEND。对于制备，PEG2000-DMG被用作PEG脂质，并且制备对应于0.55 mM脂质浓度的MEND溶液。
24小时之前，将HT1080细胞以4×104细胞/500 μL/孔铺板在24孔板上。在转染前30 min，将培养基更换为含有10 μg/μL最终浓度的菲律宾菌素的DMEM (FBS+)。在转染前15 min，将培养基更换为含有最终浓度0.3M蔗糖和1.5 mM阿米洛利的DMEM (FBS+)。对于转染，基于pDNA量以0.8 μg/500 μL/孔将各种MEND添加至孔。此后，通过[实验例4] (2)中描述的方法评估基因表达活性。结果显示在图28中。
B-2的基因表达受到蔗糖和阿米洛利的抑制。B-2-4的基因表达受到阿米洛利的抑制。作为结果，B-2、B-2-4两者都被蔗糖和阿米洛利敏感性途径引入。表明阿米洛利敏感性途径大大有助于B-2-4的基因表达。
[实验例23]
评估内体酸化抑制剂的影响
根据[实验例1] (1)、(2)、[实验例N8]制备B-2-4 (实施例4)、B-2 (实施例1)的MEND。对于制备，PEG2000-DMG被用作PEG脂质，并且制备对应于0.55 mM脂质浓度的MEND溶液。
24小时之前，将HT1080细胞以4×104细胞/2 mL/培养皿铺板在3.5 cm细胞培养皿上。在转染前30 min，将培养基更换为含有0.5 μM BafA1 (巴弗洛霉素A1)的DMEM (FBS 10%+)。30 min后，基于pDNA量以1.6 μg/2 mL/培养皿将各种MEND添加至培养皿。转染后3小时，将培养基更换为含有最终浓度200 μM的D-荧光素钾的DMEM (FBS 10%+，无酚红)。根据Kronos Dio包装说明书，将发光量每20 min测量2 min，并取作荧光素酶活性(RLU/2 min)。结果显示在图29中。
使用BafA1的内体酸化抑制抑制B-2-4和B-2的活性。表明B-2-4由内体酸化激活并引起基因表达。
[实验例24]
评估视黄酸(RA)的抑制效果
(1) 基因表达抑制效果
根据[实验例1] (1)、(2)、[实验例18]制备B-2-4 (实施例4)和B-2 (实施例1)的MEND。对于制备，PEG2000-DMG被用作PEG脂质，并且制备对应于0.55 mM脂质浓度的MEND溶液。
24小时之前，将HT1080细胞以4×104细胞/2 mL/培养皿铺板在3.5 cm细胞培养皿上，将各种MEND用含有最终浓度200 μM的D-荧光素钾和0、5、7.5、10 μM的RA (sigma)的DMEM (FBS 10%+，无酚红)稀释，以实现基于pDNA量1.6 μg/2 mL/培养皿，并进行转染。根据Kronos Dio包装说明书，将发光量每20 min测量2 min，并取作荧光素酶活性(RLU/2 min)。结果显示在图30中。
RA以浓度依赖的方式使由B-2-4形成的MEND的基因表达活性降低(图30，右侧)。由B-2形成的MEND的基因表达活性没有降低(图30，左侧)。表明RA的识别参与由于B-2-4的基因表达。
[实验例25]
细胞内动力学(核转运)
对于MEND制备，使用通过[实验例1] (4)的方法制备的罗丹明标记的pDNA。为了制备封装罗丹明标记的pDNA的MEND，用罗丹明标记的pDNA完全替代[实验例1] (1)中描述的pDNA溶液。此外，通过[实验例1] (3)中描述的方法用荧光标记构成MEND的脂质。通过[实验例1] (2)中描述的方法制备具有B-2-4 (实施例4):DOPE:Chol=3:3:4、B-2 (实施例1):SOPE:Chol=5:3:2组成的MEND。对于制备，PEG2000-DMG被用作PEG脂质，并且制备对应于0.55 mM脂质浓度的MEND溶液。
24小时之前，将HT1080细胞以5×104细胞/2 mL/培养皿铺板在玻璃底培养皿中。将MEND用DMEM (FBS 10%+)稀释以获得pDNA 1.6 μg/2 mL，并转染至细胞中。3小时后，添加hoechst33342 (1 μL)，并且10 min后，将细胞用肝素溶液(20单位/mL, 2 mL)洗涤两次。添加Krebs缓冲液(1 mL)，并且通过共聚焦激光扫描显微镜获得图像。结果显示在图31中。
当B-2扩散到细胞中时，观察到B-2-4在核附近积聚。这表明核转运机制的存在。
[实验例26]
评估GA(银杏酸)的抑制效果
根据[实验例16]、[实验例1] (1), (2)制备B-2-4 (实施例4)、B-2 (实施例1)的MEND。对于制备，PEG2000-DMG被用作PEG脂质，并且制备对应于0.55 mM脂质浓度的MEND溶液。
24小时之前，将HT1080细胞以4×104细胞/2 mL/培养皿铺板在3.5 cm细胞培养皿上，将各种MEND用含有最终浓度200 μM的D-荧光素钾和0、25、50、100 μM的GA (Calbiochem)的DMEM (FBS 10%+，无酚红)稀释，以实现基于pDNA量1.6 μg/2 mL/培养皿，并进行转染。根据Kronos Dio包装说明书，将发光量每20 min测量2 min，并取作荧光素酶活性(RLU/2 min)。结果显示在图32中。
GA显示对B-2-4比对B-2更高的抑制效果。GA是一种抑制细胞内蛋白的SUMO化的小分子。HT1080表达以SUMO化依赖的方式将RA转运至核的细胞内视黄酸结合蛋白II (CRABPII)。B-2-4的基因表达活性的急剧降低被认为是由于GA导致的CRABPII的活性降低所引起的。
[实验例27]
形成由siRNA和鱼精蛋白构成的核酸静电复合物
用10 mM HEPES缓冲液(pH 5.3)将siRNA溶液和鱼精蛋白(CALBIOCHEM)溶液分别稀释至0.3 mg/mL和0.2 mg/mL。搅拌0.3 mg/mL siRNA溶液的同时，以小份逐滴添加0.2 mg/mL鱼精蛋白溶液(250 μL)，以制备作为载体核心的siRNA和鱼精蛋白(N/P比率=1.0)的静电复合物。
作为因子VII (FVII)的siRNA序列，使用Akinc等人, Molecular Therapy, 17(5) 872-879 (2009)中描述的无化学修饰的序列。
[实验例28]
通过乙醇稀释法制备封装siRNA的MEND
对于B-2 MEND (实施例1)以B-2:SOPE:Chol=5:3:2的比率，对于B-2-4 MEND (实施例4)以B-2-4:DOPE:Chol=3:3:4的比率，且对于B-2-5 MEND (实施例5)以B-2-5:POPE:Chol=3:4:3的比率，将乙醇中的脂质溶液混合得到5 mL管中的660 nmol总脂质。进一步，以等同于总脂质的3 mol%的量添加PEG2000-DSG作为PEG脂质，并添加乙醇至各400 μL的总体积。在通过涡旋混合器搅拌脂质溶液的同时，混合[实验例27]中制备的由siRNA/鱼精蛋白构成的核酸静电复合物的溶液(400 μL)，然后迅速添加10 mM HEPES缓冲液(pH 5.3, 2.4 mL)，并剧烈搅拌混合物。使用Amicon Ultra-15 100K装置(Millipore)以1000 g, 10 min, 30℃使混合物进行离心超滤。将混合物用10 mM HEPES缓冲液(pH 7.4)充分稀释，并再次进行离心超滤。用10 mM HEPES缓冲液(pH 7.4)将该溶液调节至目标脂质浓度。
[实验例29]
测量封装siRNA的MEND的粒径和表面电位
使用动态光散射方法(Zetasizer Nano; Malvern)测量粒径和表面电位。通过[实验例28]的制备方法制备的各种MEND的粒径和表面电位显示在表5中。它们都显示在生理pH下的弱负电荷。
[实验例30]
封装siRNA的MEND的敲低效果
将通过[实验例28 ]中显示的方法制备的MEND溶液以3 mg siRNA/kg从尾静脉给药于4周龄的雄性ICR小鼠，并在24小时后收集血液。将该血液样品以1000 g, 10 min, 4℃离心，并回收上清液以获得血浆。通过BIOPHEN FVII CHROMOGENIC ASSAY (HYPHEN BioMed)定量血浆中的因子VII (FVII)的量。结果显示在图33中。B-2、B-2-4、B-2-5都显示与非处理组相比FVII表达水平的降低。其中，B-2-5 MEND显示最大的敲低效果。
[实验例31]
评估封装siRNA的MEND的持续性
将通过[实验例28 ]中显示的方法制备的MEND溶液以3 mg siRNA/kg从尾静脉给药于4周龄的雄性ICR小鼠，并从给药开始每隔24小时直至第6天相继从尾静脉收集血液，以遵循FⅦ随时间的表达水平。结果显示在图34中。
据阐明，基因敲低效果在给药后一天达到峰值，并且此后在约7周内逐渐消失。
工业适用性
根据本发明，由于核酸可以以高效率引入细胞内，所以其可用于基因治疗和生物化学实验。
本申请基于在日本提交的专利申请号2011-252309(申请日：2011年11月18日)，其内容完全并入本文。

Claims (9)

1.式(1)代表的化合物
其中Xa和Xb各自独立地是X1或X2；
s是1或2，
R4是具有1 - 6个碳原子的烷基，
na和nb各自独立地是0或1，
R1a和R1b各自独立地是具有1 - 6个碳原子的亚烷基，
R2a和R2b各自独立地是具有1 - 6个碳原子的亚烷基，
Ya和Yb各自独立地是酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键或脲键，且
R3a和R3b各自独立地是甾醇残基、脂溶性维生素残基或具有12 - 22个碳原子的脂肪族烃基。
2.根据权利要求1的化合物，其中Xa和Xb各自独立地是X1。
3.根据权利要求1或2的化合物，其中R3a和R3b各自独立地是脂溶性维生素残基或具有12 - 22个碳原子的脂肪族烃基。
4.根据权利要求1-3中任一项的化合物，其中R3a和R3各自独立地是脂溶性维生素残基。
5.根据权利要求1-3中任一项的化合物，其中R3a和R3b各自独立地是具有12 - 22个碳原子的脂肪族烃基。
6.包含根据权利要求1-5中任一项的化合物作为膜构成脂质的脂质膜结构。
7.用于引入核酸的试剂，其包含根据权利要求1-5中任一项的化合物或根据权利要求6的脂质膜结构。
8.将核酸引入细胞内的方法，其包括使封装所述核酸的根据权利要求6的脂质膜结构与细胞接触。
9.将核酸引入细胞内的方法，其包括将封装所述核酸的根据权利要求6的脂质膜结构给药于活生物体，从而使得其被递送至靶细胞。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107406396A (zh) * 2015-01-30 2017-11-28 日油株式会社 阳离子性脂质
CN108348615A (zh) * 2015-10-08 2018-07-31 日油株式会社 O/w型乳液
CN110506035A (zh) * 2018-03-16 2019-11-26 株式会社东芝 生物降解性化合物、脂质粒子、含有脂质粒子的组合物、和试剂盒
CN110650742A (zh) * 2017-03-17 2020-01-03 国立大学法人千叶大学 使用经结构强化的S-TuD的新的癌症治疗方法
CN111902397A (zh) * 2018-03-27 2020-11-06 日油株式会社 改进了细胞内动力学的阳离子脂质
CN111971066A (zh) * 2018-01-18 2020-11-20 伊泽阿恩埃免疫疗法股份有限公司 脂质纳米颗粒

Families Citing this family (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015098907A1 (ja) * 2013-12-24 2015-07-02 国立大学法人北海道大学 核内移行性を有する脂質膜構造体
KR101687735B1 (ko) * 2015-09-18 2016-12-19 서울대학교 산학협력단 신규의 동결건조보조제 및 새로운 인지질 용해용 혼합용매를 이용한 리포좀 동결분체의 제조방법
EP3315125A1 (en) 2016-10-31 2018-05-02 Silence Therapeutics (London) Ltd Lipid nanoparticle formulation
WO2019103151A1 (ja) * 2017-11-27 2019-05-31 国立大学法人千葉大学 核酸を細胞内に送達するための脂質膜構造体
CN112533909A (zh) * 2018-05-30 2021-03-19 川斯勒佰尔公司 维生素阳离子脂质
JP6997862B2 (ja) 2018-08-21 2022-02-10 株式会社東芝 生分解性化合物、脂質粒子、脂質粒子を含む組成物、およびキット
WO2020237227A1 (en) 2019-05-22 2020-11-26 Massachusetts Institute Of Technology Circular rna compositions and methods
JP2022546597A (ja) 2019-09-06 2022-11-04 ジェネレーション バイオ カンパニー 閉端ｄｎａおよび切断可能脂質を含む脂質ナノ粒子組成物ならびにそれらの使用方法
JP7204890B2 (ja) 2019-09-10 2023-01-16 株式会社東芝 電極の製造方法および光電変換素子の製造方法
EP4035686A4 (en) 2019-09-26 2023-11-01 NOF Corporation FREEZE DRIED COMPOSITION OF LIPID NANOPARTICLES
JP2023502576A (ja) * 2019-11-22 2023-01-25 ジェネレーション バイオ カンパニー イオン化可能な脂質およびそれらのナノ粒子組成物
EP4076647A1 (en) * 2019-12-20 2022-10-26 CureVac AG Lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids
WO2021193397A1 (ja) 2020-03-27 2021-09-30 日油株式会社 シスチン骨格を有する新規カチオン性脂質
CA3179420A1 (en) 2020-05-20 2021-11-25 Avak Kahvejian Coronavirus antigen compositions and their uses
EP4153223A1 (en) 2020-05-20 2023-03-29 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Immunogenic compositions and uses thereof
US20230203510A1 (en) 2020-05-29 2023-06-29 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Trem compositions and methods relating thereto
WO2021243301A2 (en) 2020-05-29 2021-12-02 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc. Trem compositions and methods relating thereto
AU2021336976A1 (en) 2020-09-03 2023-03-23 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Immunogenic compositions and uses thereof
CA3206285A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Flagship Pioneering, Inc. Compositions of modified trems and uses thereof
WO2022152109A2 (en) * 2021-01-14 2022-07-21 Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. Lipid compounds and lipid nanoparticle compositions
US20220325287A1 (en) 2021-03-31 2022-10-13 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer
WO2022247755A1 (en) 2021-05-24 2022-12-01 Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. Lipid compounds and lipid nanoparticle compositions
WO2023009547A1 (en) 2021-07-26 2023-02-02 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Trem compositions and uses thereof
WO2023015200A1 (en) * 2021-08-04 2023-02-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Amniotic fluid stabilized compositions and methods for in utero delivery of therapeutic agents
TW202330916A (zh) 2021-09-17 2023-08-01 美商旗艦先鋒創新有限責任公司 用於產生環狀多核糖核苷酸之組成物和方法
TW202322826A (zh) 2021-10-18 2023-06-16 美商旗艦先鋒創新有限責任公司 用於純化多核糖核苷酸之組成物及方法
CA3236235A1 (en) 2021-11-08 2023-05-11 Orna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle compositions for delivering circular polynucleotides
WO2023096963A1 (en) 2021-11-24 2023-06-01 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Varicella-zoster virus immunogen compositions and their uses
WO2023096990A1 (en) 2021-11-24 2023-06-01 Flagship Pioneering Innovation Vi, Llc Coronavirus immunogen compositions and their uses
WO2023097003A2 (en) 2021-11-24 2023-06-01 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Immunogenic compositions and their uses
TW202340460A (zh) 2021-12-17 2023-10-16 美商旗艦先鋒創新有限責任公司 用於在變性條件下富集環狀ｒｎａ之方法
TW202340461A (zh) 2021-12-22 2023-10-16 美商旗艦先鋒創新有限責任公司 用於純化多核糖核苷酸之組成物和方法
WO2023122789A1 (en) 2021-12-23 2023-06-29 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Circular polyribonucleotides encoding antifusogenic polypeptides
WO2023183616A1 (en) 2022-03-25 2023-09-28 Senda Biosciences, Inc. Novel ionizable lipids and lipid nanoparticles and methods of using the same
WO2023190175A1 (ja) * 2022-03-28 2023-10-05 日油株式会社 末梢血単核細胞へ核酸を送達するための脂質ナノ粒子およびこれを用いて末梢血単核細胞へ核酸を送達する方法
WO2023190170A1 (ja) * 2022-03-28 2023-10-05 日油株式会社 核酸内封脂質ナノ粒子の製造方法及びこれを含む医薬品組成物の製造方法、並びに、核酸を細胞内又は標的細胞内に導入する方法
WO2023190166A1 (ja) * 2022-03-28 2023-10-05 日油株式会社 ジスルフィド結合を有するカチオン性脂質、これを含む脂質膜構造体、これらのいずれかを含む核酸導入剤及び医薬品組成物、核酸を細胞又は標的細胞内へ導入する方法、及び細胞医薬品の製造方法
WO2023196634A2 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Vaccines and related methods
WO2023220083A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Trem compositions and methods of use for treating proliferative disorders
WO2023220729A2 (en) 2022-05-13 2023-11-16 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Double stranded dna compositions and related methods
WO2023239756A1 (en) 2022-06-07 2023-12-14 Generation Bio Co. Lipid nanoparticle compositions and uses thereof
WO2023250112A1 (en) 2022-06-22 2023-12-28 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions of modified trems and uses thereof
US20240042021A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Immunomodulatory proteins and related methods
WO2024035952A1 (en) 2022-08-12 2024-02-15 Remix Therapeutics Inc. Methods and compositions for modulating splicing at alternative splice sites
WO2024049979A2 (en) 2022-08-31 2024-03-07 Senda Biosciences, Inc. Novel ionizable lipids and lipid nanoparticles and methods of using the same
WO2024077191A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additionalpolypeptides and their use in treating cancer

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1513671A (en) * 1974-05-16 1978-06-07 Oreal Quaternised polymers and a process for their preparation
WO1999058152A1 (en) * 1998-05-12 1999-11-18 University Of Florida Cationic lipids with disulphide bonds for the intracellular delivery of therapeutic substances
WO2001054405A1 (de) * 2000-01-24 2001-07-26 Thomas Lemke Verfahren und vorrichtung zur wiedergabe von informationen
US20050164391A1 (en) * 1998-11-12 2005-07-28 Yongliang Chu Transfection reagents
CN101039701A (zh) * 2004-08-26 2007-09-19 尼古拉斯皮拉马尔印度有限公司 含有生物可裂解二硫化物连接物的前药和共药
WO2008045486A2 (en) * 2006-10-09 2008-04-17 The University Of North Carolina At Chapel Hill Nanoparticle compositions for controlled delivery of nucleic acids

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE1816572A1 (de) * 1968-12-23 1970-07-09 Agfa Gevaert Ag Photographische Halogensilberemulsion mit erhoehter Empfindlichkeit und vermindertemSchleier
US4217914A (en) * 1974-05-16 1980-08-19 L'oreal Quaternized polymer for use as a cosmetic agent in cosmetic compositions for the hair and skin
JP4628955B2 (ja) 2003-10-01 2011-02-09 独立行政法人科学技術振興機構 核移行能を有するポリアルギニン修飾リポソーム
CA2577490A1 (en) 2004-08-26 2006-03-16 Nicholas Piramal India Limited Prodrugs containing alkyldisulfide linker groups
US7404969B2 (en) 2005-02-14 2008-07-29 Sirna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle based compositions and methods for the delivery of biologically active molecules
WO2008105178A1 (ja) 2007-02-28 2008-09-04 National University Corporation Hokkaido University リポソーム用生体成分抵抗性増強剤及びこれにより修飾されたリポソーム
FR2921256B1 (fr) * 2007-09-24 2009-12-04 Oreal Composition pour la coloration de fibres keratiniques comprenant au moins un colorant direct a fonction disulfure/thiol et au moins un polymere a fonction thiol et procede utilisant la composition
JP5747282B2 (ja) 2008-11-10 2015-07-15 テクミラ ファーマシューティカルズ コーポレイションＴｅｋｍｉｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 治療薬を送達するための新規な脂質及び組成物
CN103037840A (zh) 2010-04-21 2013-04-10 国立大学法人北海道大学 具有核内转运性的脂质膜结构体

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1513671A (en) * 1974-05-16 1978-06-07 Oreal Quaternised polymers and a process for their preparation
WO1999058152A1 (en) * 1998-05-12 1999-11-18 University Of Florida Cationic lipids with disulphide bonds for the intracellular delivery of therapeutic substances
US20050164391A1 (en) * 1998-11-12 2005-07-28 Yongliang Chu Transfection reagents
WO2001054405A1 (de) * 2000-01-24 2001-07-26 Thomas Lemke Verfahren und vorrichtung zur wiedergabe von informationen
CN101039701A (zh) * 2004-08-26 2007-09-19 尼古拉斯皮拉马尔印度有限公司 含有生物可裂解二硫化物连接物的前药和共药
WO2008045486A2 (en) * 2006-10-09 2008-04-17 The University Of North Carolina At Chapel Hill Nanoparticle compositions for controlled delivery of nucleic acids

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107406396A (zh) * 2015-01-30 2017-11-28 日油株式会社 阳离子性脂质
CN107406396B (zh) * 2015-01-30 2021-02-26 日油株式会社 阳离子性脂质
CN108348615A (zh) * 2015-10-08 2018-07-31 日油株式会社 O/w型乳液
CN108348615B (zh) * 2015-10-08 2021-11-12 日油株式会社 O/w型乳液
US11395798B2 (en) 2015-10-08 2022-07-26 Nof Corporation O/W type emulsion
CN110650742A (zh) * 2017-03-17 2020-01-03 国立大学法人千叶大学 使用经结构强化的S-TuD的新的癌症治疗方法
CN111971066A (zh) * 2018-01-18 2020-11-20 伊泽阿恩埃免疫疗法股份有限公司 脂质纳米颗粒
CN110506035A (zh) * 2018-03-16 2019-11-26 株式会社东芝 生物降解性化合物、脂质粒子、含有脂质粒子的组合物、和试剂盒
CN110506035B (zh) * 2018-03-16 2022-08-12 株式会社东芝 生物降解性化合物、脂质粒子、含有脂质粒子的组合物、和试剂盒
CN111902397A (zh) * 2018-03-27 2020-11-06 日油株式会社 改进了细胞内动力学的阳离子脂质
CN111902397B (zh) * 2018-03-27 2024-04-12 日油株式会社 改进了细胞内动力学的阳离子脂质

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2013073480A1 (ja) 2015-04-02
EP2781507B1 (en) 2017-03-22
US9708628B2 (en) 2017-07-18
EP2781507A4 (en) 2015-10-14
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