WO2013073480A9 - 細胞内動態を改善したカチオン性脂質 - Google Patents

細胞内動態を改善したカチオン性脂質 Download PDF

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将也 新井
久保　和弘
英万 秋田
原島　秀吉
浩人 畠山
諒平 石破
真実 鵜川
浩揮 田中
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    • C07C323/25—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
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    • C07D311/04—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring
    • C07D311/58—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring other than with oxygen or sulphur atoms in position 2 or 4
    • C07D311/70—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring other than with oxygen or sulphur atoms in position 2 or 4 with two hydrocarbon radicals attached in position 2 and elements other than carbon and hydrogen in position 6
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    • C07C2601/12—Systems containing only non-condensed rings with a six-membered ring
    • C07C2601/16—Systems containing only non-condensed rings with a six-membered ring the ring being unsaturated

Definitions

  • the present invention relates to a cationic lipid having improved intracellular kinetics, a lipid membrane structure containing the cationic lipid, and uses thereof.
  • Viral vectors are nucleic acid delivery carriers with good expression efficiency, but have practical problems from the viewpoint of safety. Therefore, development of a non-viral nucleic acid delivery carrier that can be used more safely has been developed, and among them, a carrier using a cationic lipid is the most commonly used non-viral nucleic acid delivery carrier.
  • Cationic lipids are roughly composed of an amine moiety and a lipid moiety, and a cationic amine moiety and a polyanion nucleic acid interact electrostatically to form a positively charged liposome or lipid membrane structure. Thus, uptake into cells is promoted and nucleic acids are delivered into cells.
  • Non-patent document 1 Examples of known cationic lipids that are widely used include DOTAP and DODAP. These known cationic lipids, when combined with phospholipids, form positively charged liposomes or lipid membrane structures that can interact with nucleic acids electrostatically to deliver nucleic acids to target cells.
  • Patent Document 1 describes a cationic lipid containing a large amount of amino groups for the purpose of increasing the amount taken up into cells. It is claimed in this document that this cationic lipid has a high uptake ability into cells and acts on various cells having different cell membrane compositions.
  • Cationic lipids with improved pharmacokinetics have been developed in this way.
  • nucleic acid delivery carriers that generally introduce foreign substances into cells, it is desirable to exert a large effect with a small amount of uptake. ing. That is, when a lipid membrane structure is used as a carrier for delivering an expression vector into a cell, it is required to increase the expression level per unit lipid membrane structure incorporated into the cell and increase the expression efficiency in the cell. It has been.
  • In order to increase the expression efficiency in the cell it is necessary to improve not only the in vivo kinetics but also the intracellular kinetics such as the uptake process, escape from endosomes, and nuclear membrane permeation.
  • transfer in a cell it is known that it is necessary to dissociate a nucleic acid from a carrier and to improve the binding factor of a transcription factor (nonpatent literature 3).
  • Patent Document 2 As an example of promoting dissociation of nucleic acid from a lipid membrane structure in a cell, a compound in which one amine moiety and two lipid moieties are bonded via a disulfide (Patent Document 2) or one amine moiety Thus, there is a compound in which two lipid sites are bonded via disulfide bonds, respectively (Patent Document 3). These compounds are claimed to have the effect of dissociating nucleic acids interacting with amine sites from lipid membrane structures by utilizing the fact that disulfide bonds are cleaved in cells.
  • Nucleic acid delivery carriers using cationic lipids have the effect of introducing foreign substances into cells, so that they exert a large effect with a small uptake amount, that is, the expression level per unit lipid membrane structure incorporated into the cell. There is a need to increase the expression efficiency in cells.
  • An object of the present invention is to provide a cationic lipid that can achieve high intracellular expression efficiency when used as a nucleic acid delivery carrier.
  • the inventors of the present invention maintain the structure having two lipid sites even after the disulfide bond is cleaved in the compound of Patent Document 2, so that the lipid membrane structure is formed in the cell. It has been found that compounds such as nucleic acids that are not disrupted and are not efficiently released into the cytoplasm. In addition, when the compound of Patent Document 2 is used for nucleic acid introduction, the nucleic acid is released into the cell while interacting with the amine site, which may impede access and binding of the transcription factor to the nucleic acid.
  • X a and X b are independently X 1 or X 2 ;
  • R 4 represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms
  • n a and nb are independently 0 or 1
  • R 1a and R 1b independently represent an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms
  • R 2a and R 2b independently represent an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms
  • Y a and Y b independently represent an ester bond, an amide bond, a carbamate bond, an ether bond or a urea bond
  • R 3a and R 3b independently represent a sterol residue, a fat-soluble vitamin residue, or an aliphatic hydrocarbon group having 12 to 22 carbon atoms).
  • a lipid membrane structure comprising the compound according to any one of [1] to [5] as a constituent lipid of the membrane.
  • a nucleic acid introduction agent comprising the compound according to any one of [1] to [5] or the lipid membrane structure according to [6].
  • a method for introducing the nucleic acid into the cell comprising contacting the cell with the lipid membrane structure according to [6], wherein the nucleic acid is encapsulated in vitro.
  • a method for introducing the nucleic acid into the cell comprising administering the lipid membrane structure according to [6] encapsulating the nucleic acid to a living body so as to be delivered to the target cell.
  • the present invention relates to a compound having two tertiary amino groups, two lipid moieties, and a disulfide bond which is a biodegradable group, and a lipid membrane structure containing the compound.
  • the compound of the present invention can form a stable lipid membrane structure such as a liposome, and the pKa as the lipid membrane structure can be adjusted to around neutrality.
  • the disulfide bond contained in the cationic lipid of the present invention is cleaved in the reducing environment in the cell, and the inclusion is caused by destabilization of the lipid membrane structure. Release of matter (nucleic acid) is promoted. Therefore, not only can the efficiency of expression of the delivery gene in the cell, that is, the expression efficiency per unit lipid membrane structure incorporated into the cell, be achieved, but also efficient gene knockdown via the delivery nucleic acid can be achieved. be able to.
  • FIG. 5 is a graph showing values obtained by normalizing gene expression activities (FIG. 3) of various MENDs prepared from B-2, B-2-1, DODAP, and DOTAP by the amount of cellular uptake (FIG. 4).
  • FIG. 3 shows the gene transfer activity of B-2 and its derivatives (B-2-2, B-2-3).
  • FIG. 3 is a diagram showing the evaluation of the decoating efficiency of genes introduced by various MENDs prepared from B-2, B-2-1 and DOTAP. It is the figure which showed the gene expression activity in the liver after intravenous administration of MEND prepared from B-2 and a cationic lipid. It is the figure which showed the organ specificity of the gene expression of MEND prepared from B-2 and a cationic lipid.
  • 3 is a graph showing gene transfer activity of various MENDs prepared from B-2, B-2-4, and DOTAP. It is a photograph showing the intracellular kinetics of MEND prepared from B-2 and MEND prepared from B-2-4 encapsulating rhodamine-labeled pDNA. It is a graph which shows the endosome escape efficiency of the gene introduce
  • 2 is a graph showing the effect of retinoic acid on the gene expression activity of various MENDs prepared from B-2 and B-2-4. It is a photograph showing the intracellular kinetics of MEND prepared from B-2 and MEND prepared from B-2-4 encapsulating rhodamine-labeled pDNA.
  • 4 is a graph showing the effect of GA on the gene expression activity of various MENDs prepared from B-2 and B-2-4. It is a graph which shows the effect of siRNA introduction
  • the present invention provides a compound represented by the formula (1).
  • the X a and X b are independently X 1 or X 2 shown below, and preferably X 1.
  • R 4 in X 1 represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms and may be linear, branched or cyclic.
  • the alkyl group preferably has 1 to 3 carbon atoms.
  • Specific examples of the alkyl group having 1 to 6 carbon atoms include methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, n-butyl group, sec-butyl group, isobutyl group, tert-butyl group, pentyl group, and isopentyl group.
  • R 4 is preferably a methyl group, an ethyl group, a propyl group or an isopropyl group, and most preferably a methyl group.
  • S in X 2 is 1 or 2.
  • X 2 is preferably a pyrrolidinium group, and when s is 2, X 2 is preferably a piperidinium group.
  • X a may be different be identical to X b, but preferably, X a is X b the same group.
  • n a and nb are independently 0 or 1, preferably 1.
  • n a is 1, R 3a is bonded to X a via Y a and R 2a , and when n a is 0, R 3a —X a —R 1a —S— is exhibited.
  • n b is 1, R 3b is bonded to X b via Y b and R 2b , and when n b is 0, R 3b —X b —R 1b —S— is exhibited. .
  • n a may be different even be identical to the n b, but preferably, n a is the same as n b.
  • R 1a and R 1b independently represent an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms and may be linear or branched, but is preferably linear. Specific examples of the alkylene group having 1 to 6 carbon atoms include a methylene group, an ethylene group, a trimethylene group, an isopropylene group, a tetramethylene group, an isobutylene group, a pentamethylene group, and a neopentylene group.
  • R 1a and R 1b are preferably a methylene group, an ethylene group, a trimethylene group, an isopropylene group or a tetramethylene group, and most preferably an ethylene group.
  • R 1a may be different be the same as R 1b, but preferably, R 1a is the same group as R 1b.
  • R 2a and R 2b independently represent an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms, and may be linear or branched, but is preferably linear. Examples of the alkylene group having 1 to 6 carbon atoms include those listed as examples of the alkylene group having 1 to 6 carbon atoms of R 1a and R 1b .
  • R 2a and R 2b are preferably a methylene group, an ethylene group, a trimethylene group, an isopropylene group or a tetramethylene group, and most preferably a trimethylene group.
  • R 2a may be the be the same or different and R 2b, but preferably, R 2a is the same group as R 2b.
  • Y a and Y b are independently an ester bond, an amide bond, a carbamate bond, an ether bond or a urea bond, preferably an ester bond, an amide bond or a carbamate bond, and most preferably an ester bond.
  • the direction of the bond of Y a and Y b is not limited. However, when Y a is an ester bond, it preferably has a structure of R 3a —CO—O—R 2a —, and when Y b is an ester bond, preferably , R 3b —CO—O—R 2b —.
  • Y a may be different even identical to Y b, but preferably, Y a is Y b and same group.
  • R 3a and R 3b independently represent a sterol residue, a fat-soluble vitamin residue or an aliphatic hydrocarbon group having 12 to 22 carbon atoms, preferably a fat-soluble vitamin residue or an aliphatic group having 12 to 22 carbon atoms It is a hydrocarbon group, most preferably a fat-soluble vitamin residue.
  • sterol residue examples include cholesteryl group (cholesterol residue), cholesteryl group (cholestanol residue), stigmasteryl group (stigmasterol residue), ⁇ -sitosteryl group ( ⁇ -sitosterol residue), lanosteryl group (lanosterol group) Residue), an ergosteryl group (ergosterol residue), and the like.
  • the sterol residue is preferably a cholesteryl group or a cholesteryl group.
  • fat-soluble vitamin residues in addition to residues derived from fat-soluble vitamins, residues derived from derivatives obtained by appropriately converting functional groups in fat-soluble vitamins such as hydroxyl groups, aldehydes, and carboxylic acids to other reactive functional groups are included.
  • a fat-soluble vitamin having a hydroxyl group can be converted into a carboxylic acid by reacting succinic anhydride or glutaric anhydride.
  • fat-soluble vitamins examples include retinoic acid, retinol, retinal, ergosterol, 7-dehydrocholesterol, calciferol, corcalciferol, dihydroergocalciferol, dihydrotaxosterol, tocopherol, tocotrienol and the like.
  • the fat-soluble vitamin is preferably retinoic acid or tocopherol.
  • the aliphatic hydrocarbon group having 12 to 22 carbon atoms may be linear or branched, but is preferably linear.
  • the aliphatic hydrocarbon group may be saturated or unsaturated.
  • the number of unsaturated bonds contained in the aliphatic hydrocarbon group is usually 1 to 6, preferably 1 to 3, and more preferably 1 to 2.
  • Unsaturated bonds include carbon-carbon double bonds and carbon-carbon triple bonds, with carbon-carbon double bonds being preferred.
  • the number of carbon atoms contained in the aliphatic hydrocarbon group is preferably 12-18, and most preferably 13-17.
  • the aliphatic hydrocarbon group includes an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group and the like, and is preferably an alkyl group or an alkenyl group.
  • Specific examples of the aliphatic hydrocarbon group having 12 to 22 carbon atoms include dodecyl, tridecyl, tetradecyl, pentadecyl, hexadecyl, heptadecyl, octadecyl, nonadecyl, icosyl, heicosyl, docosyl , Dodecenyl group, tridecenyl group, tetradecenyl group, pentadecenyl group, hexadecenyl group, heptadecenyl group, octadecenyl group, nonadecenyl group, icocenyl group, henicocenyl group, dococenyl group
  • the aliphatic hydrocarbon group having 12 to 22 carbon atoms is preferably a tridecyl group, a tetradecyl group, a heptadecyl group, an octadecyl group, a heptadecadienyl group or an octadecadienyl group, particularly preferably a tridecyl group, a heptadecyl group, It is a heptadecadienyl group.
  • an aliphatic hydrocarbon group having 12 to 22 carbon atoms derived from a fatty acid, an aliphatic alcohol, or an aliphatic amine is used.
  • R 3a (or R 3b ) is derived from a fatty acid
  • Y a (or Y b ) is an ester bond or an amide bond
  • a carbonyl carbon derived from a fatty acid is contained in Y a (or Y b ).
  • R 3a (or R 3b ) is a heptadecadienyl group.
  • R 3a may be different be the same as R 3b, but preferably, R 3a is the same group as R 3b.
  • X a is identical to X b
  • n a is the same as n b
  • R 1a is the same as R 1b
  • R 2a is the same as R 2b
  • R 3a is a R 3b
  • Y a is the same as Y b .
  • X a and X b are independently X 1
  • R 4 represents an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms
  • n a and nb are 1
  • R 1a and R 1b independently represent an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms
  • R 2a and R 2b independently represent an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms
  • Y a and Y b represent an ester bond
  • R 3a and R 3b independently represent an aliphatic hydrocarbon group having 12 to 22 carbon atoms.
  • X a and X b are X 1
  • R 4 represents an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms
  • n a and nb are 1
  • R 1a and R 1b represent an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms
  • R 2a and R 2b represent an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms
  • Y a and Y b represent an ester bond
  • R 3a and R 3b represent an aliphatic hydrocarbon group having 12 to 22 carbon atoms
  • Xa is the same as Xb
  • R 1a is the same as R 1b
  • R 2a is the same as R 2b
  • R 3a is the same as R 3b .
  • X a and X b are X 1 , R 4 represents a methyl group, n a and n b is 1, R 1a and R 1b represent an ethylene group, R 2a and R 2b represent a trimethylene group, Y a and Y b represent —CO—O—, R 3a and R 3b independently represent an alkyl group or alkenyl group having 13 to 17 carbon atoms.
  • X a and X b are X 1 , R 4 represents a methyl group, n a and n b is 1, R 1a and R 1b represent an ethylene group, R 2a and R 2b represent a trimethylene group, Y a and Y b represent —CO—O—, R 3a and R 3b represent an alkyl group or an alkenyl group having 13 to 17 carbon atoms, R 3a is the same as R 3b .
  • X a and X b are independently X 1
  • R 4 represents an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms
  • n a and nb are 1
  • R 1a and R 1b independently represent an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms
  • R 2a and R 2b independently represent an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms
  • Y a and Y b represent an ester bond
  • R 3a and R 3b independently represent a fat-soluble vitamin residue (eg, retinoic acid residue, tocopherol residue).
  • X a and X b are X 1
  • R 4 represents an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms
  • n a and nb are 1
  • R 1a and R 1b represent an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms
  • R 2a and R 2b represent an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms
  • Y a and Y b represent an ester bond
  • R 3a and R 3b represent a fat-soluble vitamin residue (eg, retinoic acid residue, tocopherol residue)
  • Xa is the same as Xb
  • R 1a is the same as R 1b
  • R 2a is the same as R 2b
  • R 3a is the same as R 3b .
  • X a and X b are X 1 , R 4 represents a methyl group, n a and n b is 1, R 1a and R 1b represent an ethylene group, R 2a and R 2b represent a trimethylene group, Y a and Y b represent —CO—O—, R 3a and R 3b independently represent a fat-soluble vitamin residue (eg, retinoic acid residue, tocopherol residue).
  • a fat-soluble vitamin residue eg, retinoic acid residue, tocopherol residue.
  • X a and X b are X 1 , R 4 represents a methyl group, n a and n b is 1, R 1a and R 1b represent an ethylene group, R 2a and R 2b represent a trimethylene group, Y a and Y b represent —CO—O—, R 3a and R 3b represent a fat-soluble vitamin residue (eg, retinoic acid residue, tocopherol residue), R 3a is the same as R 3b .
  • R 4 represents a methyl group
  • n a and n b is 1
  • R 1a and R 1b represent an ethylene group
  • R 2a and R 2b represent a trimethylene group
  • Y a and Y b represent —CO—O—
  • R 3a and R 3b represent a fat-soluble vitamin residue (eg, retinoic acid residue, tocopherol residue)
  • R 3a is the same as R 3b .
  • Specific examples of the compound of the present invention include the following compounds B-2, B-2-2, B-2-3, B-2-4 and B-2-5.
  • the compound of the present invention has a —SS— (disulfide) bond. Therefore, as a manufacturing method, R 3a- (Y a -R 2a ) n a -X a -R 1a -SH and R 3b- (Y b -R 2b ) n b -X b -R 1b -SH Is prepared by oxidizing (coupling) the compound of the present invention containing -SS-, starting from the compound containing -SS- bond, The method of finally obtaining the compound of this invention etc. is mentioned. The latter method is preferable.
  • the starting compounds include both terminal carboxylic acids containing a —SS— bond, both terminal carboxylic acid esters, both terminal amines, both terminal isocyanates, both terminal alcohols, and both terminals having leaving groups such as MsO (mesylate group). Examples thereof include alcohols and both terminal carbonates having a leaving group such as pNP (p-nitrophenyl carbonate group).
  • both terminal functional groups in the compound (1) containing an —S—S— bond are substituted with one —NH— group and one terminal.
  • the terminal functional group that did not contribute to the reaction in the compound (2) and the functional group in the compound (3) containing R 3
  • reacting a compound of the present invention comprising a -SS- bond R 1a and R 1b , X a and X b , R 2a and R 2b , Y a and Y b , and R 3a and R 3b Obtainable.
  • an alkali catalyst such as potassium carbonate, sodium carbonate, or t-butoxy potassium may be used as a catalyst, or the reaction may be performed without a catalyst.
  • potassium carbonate or sodium carbonate is used as the catalyst.
  • the amount of the catalyst is 0.1 to 100 molar equivalents, preferably 0.1 to 20 molar equivalents, more preferably 0.1 to 5 molar equivalents relative to the compound (1).
  • the amount of compound (2) charged is 1 to 50 mole equivalents, preferably 1 to 10 mole equivalents, relative to compound (1).
  • the solvent used for the reaction of the compound (1) and the compound (2) may be any solvent or aqueous solution that does not inhibit the reaction, and can be used without any particular limitation. Examples thereof include ethyl acetate, dichloromethane, chloroform, benzene and toluene. Of these, toluene and chloroform are preferred.
  • the reaction temperature is ⁇ 20 to 200 ° C., preferably 0 to 80 ° C., more preferably 20 to 50 ° C., and the reaction time is 1 to 48 hours, preferably 2 to 24 hours.
  • potassium carbonate sodium carbonate
  • An alkali catalyst such as t-butoxypotassium may be used, an acid catalyst such as PTS (p-toluenesulfonic acid) or MSA (methanesulfonic acid), or non-catalyst may be used.
  • a condensing agent such as DCC (dicyclohexylcarbodiimide), DIC (diisopropylcarbodiimide), EDC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride), compound (1) and compound (2 )
  • a condensing agent such as DCC (dicyclohexylcarbodiimide), DIC (diisopropylcarbodiimide), EDC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • compound (1) and compound (2 ) ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • the compound (3) may be directly reacted, or the compound (3) is converted to an anhydride etc. once using a condensing agent, and then the compound (1) and the compound (2) You may make it react with the reaction product.
  • the amount of compound (3) charged is 1 to 50 mole equivalents, preferably 1 to 10 mole equivalents, relative to the reaction product of compound (1) and compound (2).
  • the catalyst to be used is appropriately selected depending on the functional groups to be reacted.
  • the amount of the catalyst is 0.05 to 100 mole equivalents, preferably 0.1 to 20 mole equivalents, more preferably 0.2 to 5 mole equivalents relative to the compound (1). .
  • any solvent or aqueous solution that does not inhibit the reaction may be used without particular limitation.
  • examples thereof include ethyl acetate, dichloromethane, chloroform, benzene and toluene. Of these, toluene and chloroform are preferred.
  • the reaction temperature is 0 to 200 ° C., preferably 0 to 120 ° C., more preferably 20 to 50 ° C., and the reaction time is 1 to 48 hours, preferably 2 to 24 hours.
  • the reaction product obtained by the above reaction is appropriately purified by a general purification method such as washing with water, silica gel column chromatography, crystallization, recrystallization, liquid-liquid extraction, reprecipitation, ion exchange column chromatography and the like. be able to.
  • 3- (methylamino) -1-propanol is bound using a compound having —S—S— bond and a leaving group such as MsO (mesylate group) at both ends as a starting material.
  • MsO mesylate group
  • examples in which fatty acids or fat-soluble vitamins are bound will be described later (see Examples 1 to 5).
  • a person skilled in the art can produce a desired compound of the present invention by appropriately selecting a raw material and carrying out a reaction according to the method of this Example.
  • the lipid membrane structure of the present invention contains the compound represented by the general formula (1) as a constituent lipid of the membrane.
  • the “lipid membrane structure” in the present invention means a particle having a membrane structure in which hydrophilic groups of amphiphilic lipids are arranged toward the aqueous phase side of the interface.
  • the form of the lipid membrane structure containing the lipid of the invention is not particularly limited.
  • a liposome single membrane liposome, multilamellar liposome
  • O / W emulsion a W / O / W type
  • W / O / W type examples thereof include emulsions, spherical micelles, string micelles, and amorphous layered structures.
  • the lipid membrane structure is preferably a liposome.
  • the lipid membrane structure of the present invention comprises molecules other than the compound of the present invention, such as lipids (phospholipids (phosphatidylinositol, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, etc.), glycolipids, peptide lipids, cholesterol, compounds of the present invention.
  • lipids phospholipids (phosphatidylinositol, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, etc.), glycolipids, peptide lipids, cholesterol, compounds of the present invention.
  • surfactants eg, CHAPS, sodium cholate, octyl glucoside, ND-gluco-N-methylalkanamides, etc.
  • the content of the compound of the present invention contained in the lipid membrane structure of the present invention is not particularly limited, but is usually sufficient to introduce a nucleic acid when the lipid membrane structure is used as a nucleic acid introduction agent described later.
  • An amount of a compound of the invention is included. For example, 5 to 100 mol%, preferably 10 to 70 mol%, more preferably 30 to 50 mol% of the total lipid.
  • the lipid membrane structure of the present invention includes a polyarginine peptide described in International Publication No. 2005/032593, a GALA peptide that enhances resistance to biological components described in International Publication No. 2008/105178, or blood.
  • a functional element capable of imparting various functions to the lipid membrane structure such as polyalkylene glycol that enhances medium stability, is modified on the surface of the lipid membrane by a known method known for each element, Can be used.
  • the compound of the present invention and other components are dispersed in an appropriate dispersion medium such as an aqueous solvent or an alcoholic solvent, and the organization is induced as necessary. It can be prepared by performing the operation.
  • an appropriate dispersion medium such as an aqueous solvent or an alcoholic solvent
  • the organization is induced as necessary. It can be prepared by performing the operation.
  • Examples of the “operation for inducing organization” include ethanol dilution method, simple hydration method, ultrasonic treatment, heating, vortex, ether injection method, French press method, cholic acid method, Ca 2+ fusion method, freezing ⁇
  • Examples thereof include, but are not limited to, methods known per se such as a melting method and a reverse phase evaporation method.
  • the nucleic acid can be introduced into the cell in vivo and / or in vitro by encapsulating the nucleic acid in the lipid membrane structure of the present invention and bringing it into contact with the cell. Accordingly, the present invention provides a nucleic acid introduction agent comprising the compound of the present invention or a lipid membrane structure.
  • nucleic acid can be introduced into the cell.
  • nucleic acid examples include, but are not limited to, DNA, RNA, chimeric nucleic acid of DNA and RNA, DNA / RNA hybrid, and the like.
  • the nucleic acid can be any one of 1 to 3 strands, but is preferably single strand or double strand.
  • Nucleic acids may be other types of nucleotides that are N-glycosides of purine or pyrimidine bases, or other oligomers having a non-nucleotide backbone (eg, commercially available peptide nucleic acids (PNA), etc.) or other oligomers containing special linkages (However, the oligomer contains a nucleotide having a configuration allowing base pairing or base attachment as found in DNA or RNA).
  • the nucleic acid may be modified with known modifications, such as those with labels known in the art, capped, methylated, and one or more natural nucleotides replaced with analogs.
  • Those with intramolecular nucleotide modifications such as those with uncharged bonds (eg methylphosphonates, phosphotriesters, phosphoramidates, carbamates, etc.), charged bonds or sulfur-containing bonds (eg phosphorothioate) Having side chain groups such as proteins (nucleases, nuclease inhibitors, toxins, antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.) and sugars (eg monosaccharides, etc.) Intercurrent compounds (eg acridine, psoralen ), Containing a chelate compound (eg, metal, radioactive metal, boron, oxidizing metal, etc.), containing an alkylating agent, having a modified bond (eg, ⁇ Anomeric nucleic acids and the like.
  • uncharged bonds eg methylphosphonates, phosphotriesters, phosphoramidates, carbamates, etc.
  • sulfur-containing bonds eg phosphorot
  • Any kind of DNA can be appropriately selected according to the purpose of use, and examples include plasmid DNA, cDNA, antisense DNA, chromosomal DNA, PAC, BAC, etc., preferably plasmid DNA, cDNA, antisense DNA, more preferably plasmid DNA.
  • Circular DNA such as plasmid DNA can be appropriately digested with a restriction enzyme or the like and used as linear DNA.
  • any kind of RNA can be appropriately selected according to the purpose of use.
  • siRNA, miRNA, shRNA, antisense RNA messenger RNA, single-stranded RNA genome, double-stranded RNA genome, RNA replicon , Transfer RNA, ribosomal RNA, and the like, and preferably siRNA, miRNA, shRNA, mRNA, antisense RNA, and RNA replicon.
  • the nucleic acid used in the present invention is preferably purified by a method commonly used by those skilled in the art.
  • the nucleic acid used in the present invention has a low frequency of CpG sequences and is preferably free of CpG sequences.
  • a nucleic acid having a low frequency of CpG sequence the nucleic acid introduced into the cell stays in the cell for a long period of time, and its physiological effect lasts for a long period of time.
  • the target gene can be expressed continuously for a longer period of time.
  • the CpG sequence is a two-base sequence of a type in which guanine appears after cytosine from 5 'to 3'.
  • the frequency of CpG sequences in the nucleic acid used in the present invention is 1 or less per 50 bases, preferably 1 or less per 100 bases, more preferably 1 or less per 1000 bases, most preferably CpG sequences. Not included.
  • a nucleic acid (preferably a nucleic acid not containing the CpG sequence) in which the frequency of the CpG sequence is suppressed to a low level is used in the present invention. Occurrence of side effects such as inflammation can be avoided.
  • the compound of the present invention or the lipid membrane structure itself has low irritation and hardly induces the production of inflammatory cytokines when administered into a living body, the lipid membrane structure of the present invention and the frequency of the CpG sequence are low.
  • the nucleic acid was encapsulated by coexisting the target nucleic acid when forming the lipid membrane structure of the present invention.
  • the lipid structure of the present invention is formed.
  • the aqueous solution of the nucleic acid and the ethanol solution of the components of the lipid membrane structure of the present invention are vigorously mixed by vortexing, and then the mixture is buffered appropriately. Dilute with liquid.
  • the components (lipids, etc.) of the lipid membrane structure of the present invention are dissolved in an appropriate organic solvent, the solution is placed in a glass container and dried under reduced pressure to retain the solvent. Leave to obtain a lipid film. An aqueous solution of nucleic acid is added thereto to hydrate it, followed by sonication with a sonicator.
  • the present invention also provides the above lipid membrane structure in which such a nucleic acid is encapsulated.
  • a multifunctional envelope nanostructure prepared by encapsulating an electrostatic complex between a nucleic acid and a polycation (eg, protamine) with a liposome; Multifunctional envelope-type nano ⁇ device, which may be abbreviated as “MEND” in this specification) (Kogure K et al., Multifunctional envelope-type nano device (MEND) as a non-viral gene delivery system. Adv Drug Deliv Rev. 2008).
  • MEND multifunctional envelope-type nano ⁇ device
  • This structure can be used as a drug delivery system for selectively delivering nucleic acids into specific cells. For example, it is useful for DNA vaccines by introducing antigen genes into dendritic cells and tumor gene therapy. It is.
  • the surface charge (zeta potential) of the lipid membrane structure of the present invention encapsulating nucleic acid is preferably ⁇ 10 to +10 mV, more preferably ⁇ 10 to +5 mV.
  • particles having a positive surface potential have been mainly used. Although this is useful as a method to promote electrostatic interaction with negatively charged cell surface heparin sulfate and promote cellular uptake, positive surface charge is introduced into the cell.
  • the surface charge can be measured using a Metasizer Nano (Malvern).
  • the surface charge of the lipid membrane structure can be adjusted by the composition of the components of the lipid membrane structure containing the compound of the present invention.
  • the encapsulated nucleic acid By bringing the lipid membrane structure of the present invention encapsulating the nucleic acid thus obtained into contact with the cell, the encapsulated nucleic acid can be introduced into the cell.
  • the type of “cell” is not particularly limited, and prokaryotic and eukaryotic cells can be used, but eukaryotic cells are preferable.
  • the type of eukaryote is not particularly limited, and for example, mammals including humans (human, monkey, mouse, rat, hamster, cow, etc.), birds (chicken, ostrich, etc.), amphibians (frog etc.), fish (zebra) Vertebrates such as fish and medaka), invertebrates such as insects (eg, moths, moths, and fruit flies), and microorganisms such as plants and yeasts.
  • the cells targeted by the present invention are animal or plant cells, more preferably mammalian cells.
  • the cell may be a cultured cell line containing cancer cells, a cell isolated from an individual or tissue, or a tissue or tissue piece cell. Further, the cells may be adherent cells or non-adherent cells.
  • the target cell into which the nucleic acid is introduced preferably expresses intracellular retinoic acid binding protein II (CRABPII) It is a cell.
  • CRABPII has a function of transporting retinoic acid to the nucleus in a SUMOylation-dependent manner.
  • R 3a and R 3b are retinoic acid residues
  • the function of CRABPII It is expected that the transport of nucleic acid into the inside will be promoted. Whether a cell expresses CRABPII can be confirmed using Western blotting or the like.
  • organs that express CRABPII include normal tissues such as skin, testicles, uterus, ovary, choroid plexus, and various cancer tissues (retinoblastoma, Wilms tumor), and cells that express CRABPII Specific examples of these include fibrosarcoma cells (HT1080 cells), oral squamous cell carcinoma (BHY cells), breast cancer cells (KATO3 cells, BT474, MCF-7, MDA-MB-134), etc. It is not limited.
  • Cells are suspended in an appropriate medium several days before contact with the lipid membrane structure and cultured under appropriate conditions. Upon contact with the lipid membrane structure, the cell may or may not be in the growth phase.
  • the culture medium at the time of the contact may be a serum-containing medium or a serum-free medium, but the serum concentration in the medium is preferably 30% or less, more preferably 20% or less. If the medium contains an excessive amount of protein such as serum, the contact between the complex and the cell may be inhibited.
  • the cell density at the time of the contact is not particularly limited and can be appropriately set in consideration of the cell type and the like, but is usually in the range of 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 7 cells / mL.
  • the suspension of the lipid membrane structure described above is added to the cells thus prepared.
  • the addition amount of the complex-containing solution is not particularly limited, and can be appropriately set in consideration of the number of cells and the like.
  • the concentration of the lipid membrane structure at the time of contacting with the cell is not particularly limited as long as the target nucleic acid can be introduced into the cell, but the lipid concentration is usually 1 to 100 nmol / ml, preferably 10 to 50 nmol.
  • the concentration of the nucleic acid is usually 0.01 to 100 ⁇ g / ml, preferably 0.1 to 10 ⁇ g / ml.
  • the cells After adding the complex-containing solution, the cells are cultured, and the temperature, humidity, CO 2 concentration, etc. during the culture are appropriately set in consideration of the cell type.
  • the temperature In the case of mammalian cells, the temperature is usually about 37 ° C., the humidity is about 95%, and the CO 2 concentration is about 5%.
  • the culture time can be appropriately set in consideration of conditions such as the type of cells used, but is usually 0.1 to 24 hours, preferably 0.25 to 4 hours, more preferably 0.5 to 4 hours. The range is 2 hours. If the culture time is too short, the nucleic acid is not sufficiently introduced into the cells, and if the culture time is too long, the cells may be weakened.
  • the nucleic acid is introduced into the cells by the above culture, but preferably the medium is replaced with a fresh medium, or the fresh medium is added to the medium and the culture is further continued. If the cells are mammalian cells, the fresh medium preferably contains serum or nutrient factors.
  • the lipid membrane structure of the present invention it is possible to introduce a nucleic acid into a cell not only in vitro (in vitro) but also in vivo (in vivo). That is, by administering to a subject the lipid membrane structure of the present invention in which nucleic acid is encapsulated, the lipid membrane structure reaches and contacts the target cell, and the nucleic acid encapsulated in the lipid membrane structure in vivo Is introduced into the cell.
  • the subject to which the complex can be administered is not particularly limited.
  • mammals including humans (human, monkey, mouse, rat, hamster, cow, etc.), birds (chicken, ostrich, etc.), amphibians (frog, etc.) And vertebrates such as fish (eg zebrafish, medaka), invertebrates such as insects (eg, moths, moths, and fruit flies), and plants.
  • the subject of administration of the complex includes a human or other mammal.
  • the type of target cell is not particularly limited, and by using the lipid membrane structure of the present invention, various tissues (eg, liver, kidney, pancreas, lung, spleen, heart, blood, muscle, bone, brain, stomach, Nucleic acids can be introduced into cells in the small intestine, large intestine, skin, adipose tissue, etc.).
  • various tissues eg, liver, kidney, pancreas, lung, spleen, heart, blood, muscle, bone, brain, stomach, Nucleic acids can be introduced into cells in the small intestine, large intestine, skin, adipose tissue, etc.).
  • the administration method of the complex is not particularly limited as long as the complex reaches / contacts the target cell and the introduced compound contained in the complex can be introduced into the cell.
  • a known administration method oral administration, parenteral administration (intravenous administration, intramuscular administration, local administration, transdermal administration, subcutaneous administration, intraperitoneal administration, spraying, etc.) Etc.) can be selected as appropriate.
  • the dosage of the lipid membrane structure is not particularly limited as long as the introduction of the compound into the cell can be achieved, taking into consideration the type of administration target, the administration method, the type of introduced compound, the type and site of the target cell, etc. And can be selected as appropriate.
  • the compound or lipid membrane structure of the present invention when used as a nucleic acid introduction agent, it can be formulated according to conventional means.
  • the carrier of the present invention can be used as it is or, for example, water or other physiologically acceptable liquids (for example, the above-mentioned water-soluble solvents, ethanol, methanol, DMSO). Or a mixture of an aqueous solvent and an organic solvent, etc.).
  • the agent can appropriately contain physiologically acceptable excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders and the like known per se.
  • the carrier of the present invention is used as it is or is pharmaceutically acceptable such as a carrier, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative, stabilizer, binder and the like. It is manufactured as an oral preparation (for example, tablets, capsules, etc.) or a parenteral preparation (for example, injections, sprays, etc.) by mixing with known additives in a unit dosage form generally required for the practice of the formulation. can do.
  • the nucleic acid introduction agent of the present invention can also be provided in the form of a kit.
  • the kit can contain a reagent used for introducing a nucleic acid.
  • the nucleic acid introduction agent (or kit) of the present invention further comprises a polycation (eg, protamine).
  • a polycation eg, protamine
  • pDNA Plasmid DNA Chol: Cholesterol NBD-DOPE: 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- (7-nitro-2-1,3-benzoxadiazole-4-yl)
  • DMEM dulbecco's modified eagle medium
  • PEG 2000 -DSG 1,2-Distearoyl-sn-glycerol, methoxypolyethylene Glycol (PEG MW 2000)
  • PEG 2000 -DMG 1,2-Dimyristoyl-sn-glycerol, methoxypolyethylene Glycol (PEG MW 2000)
  • DOPE 1,2-Dioleyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
  • SOPE 1-Stearoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phsophoethanolamine
  • SOPC 1-Stearoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho
  • Table 2 shows the names and structures of the compounds produced in the following examples and comparative examples.
  • Example 1 (Synthesis of B-2) ⁇ Mesylation> To 15 g (97.2 mmol) of 2,2′-dithiodiethanol (manufactured by ACROS), 143 ml of acetonitrile was added and dissolved at 20 to 25 ° C. After adding 33.3 g (328 mmol) of triethylamine and stirring at 20 to 25 ° C. for 5 minutes, 34.5 g (300 mmol) of methanesulfonyl chloride was added under ice cooling, and the reaction was performed at 20 to 25 ° C. for 3 hours. .
  • reaction solution was extracted and washed with 10 g of 5% sodium bicarbonate water, and the aqueous layer was discarded.
  • the collected organic layer was washed with water by adding 10 g of water.
  • the organic layer was dehydrated by adding 0.4 g of magnesium sulfate. Insoluble matter was filtered off with Oplite and filter paper (5A), and the solvent was distilled off using an evaporator to obtain 7.9 g of an orange liquid (hereinafter referred to as diacyl derivative).
  • the collected organic layer was washed with water by adding 10 g of water. After discarding the aqueous layer, the organic layer was dehydrated by adding 0.4 g of magnesium sulfate. Insoluble matter was filtered off with Oplite and filter paper (5A), and the solvent was distilled off using an evaporator to obtain 6.0 g of a diacyl compound as an orange liquid.
  • the organic layer was dehydrated by adding 2 g of sodium sulfate. Insoluble matter was filtered off with Oplite and filter paper (5A), and the solvent was distilled off using an evaporator. The obtained concentrate was dissolved in 47 ml of hexane and extracted and washed with 39 ml of acetonitrile. The hexane layer was collected and the solvent was distilled off using an evaporator to obtain 2.83 g of the target B2-2-1 compound.
  • Ethanol solutions of lipids were prepared by mixing 5 mM cationic lipid, 5 mM phospholipid, 5 mM cholesterol (Chol) in an Eppendorf tube at a desired ratio so that the total lipid was 165 nmol.
  • PEG lipid (1 mM ethanol solution) was further added in an amount corresponding to 3 mol% of the total lipid, and ethanol was added to a total volume of 100 ⁇ L.
  • HEPES buffer 1.8 mL was added and diluted until the ethanol concentration was 5%.
  • Amicon Ultra 4 (Millipore)
  • the solution was ultrafiltered to about 50 ⁇ L under centrifugation conditions (room temperature, 2267 rpm, 20 min) and concentrated. Thereafter, the volume was increased to 4 mL using 100 mM HEPES buffer adjusted to pH 7.4, and the mixture was concentrated again by centrifugation (2267 rpm, 20 min) under room temperature conditions. Finally, the volume was increased to the target lipid concentration with 10 mM HEPES buffer (pH 7.4).
  • Rhodamine labeled pDNA was prepared using Label / IT CX-Rhodamine Labeling Kit (Mirus) according to the attached protocol. The concentration of the obtained rhodamine-labeled pDNA solution was calculated using Nano Drop (Thermo Scientific).
  • MEND MEND encapsulating rhodamine-labeled pDNA
  • All the pDNA solutions described in [Test Example 1] (1) are replaced with rhodamine-labeled pDNA, and [Test Example 1] (2), ( MEND was prepared according to the method described in 3).
  • B-2 and DODAP the charge is -10 to +10 mV, which is a preferred form, at physiological pH, whereas in B-2-1, the charge is +12.3 and +10 mV or more.
  • the surface potential of MEND using DOTAP which is a known cationic lipid, was about +50 mV.
  • TNS fluorescence attenuation due to DTT treatment was not observed.
  • B-2 disappearance of fluorescence due to time-dependent TNS was observed.
  • TNS is adsorbed on the surface of particles having a positive surface potential through an electrostatic interaction in an acidic environment at pH 4.0, and emits fluorescence depending on the lipid-soluble environment of the lipid structure site of the liposome. It is.
  • the disappearance of fluorescence in B-2 as in this result is considered to depend on the loss of the fat-soluble environment, suggesting the collapse of the lipid membrane structure accompanying the degradation of the lipid.
  • DOTAP DOTAP
  • 6-well plate was seeded with HT1080 cells at 2 ⁇ 10 5 cells / 2 mL / well, and various sample MENDs were diluted with DMEM (FBS +) to a lipid concentration of 27.5 nmol / 1 mL / well. Wells were transfected. After 1 hour, MEND-containing DMEM was removed, and the cells were washed twice with 1 mL of heparin (20 units / mL), and further washed once with 1 mL of PBS ( ⁇ ). After adding 500 ⁇ L of 0.05% Trypsin solution, it was allowed to stand in a 37 ° C. incubator for 3 minutes.
  • DMEM FBS +
  • NBD-DOPE which is a fluorescently labeled lipid
  • the amount of neutral particles B-2 and DODAP incorporated was higher than that of the untreated group (background), but very low.
  • HT1080 cells were seeded at 4 ⁇ 10 4 cells / 500 ⁇ L / well on a 24-well plate 24 hours ago, and various MENDs were converted to pDNA amounts so that DMEM (FBS 10% + ) And then transfected. After 24 hours, the cells were washed with 500 ⁇ L of PBS ( ⁇ ), 75 ⁇ L of 1 ⁇ lysis buffer was added to each well, and left at ⁇ 80 ° C. for 30 minutes or longer. The frozen 24-well plate was thawed on ice, the cells were detached with a cell scraper, and the entire amount was transferred to an Eppendorf tube (15000 rpm, 4 ° C., 5 min) and centrifuged. 50 ⁇ L of the supernatant was collected in another eppendorf tube and used for luciferase assay and BCA assay.
  • the activity of MEND formed from B-2 and B-2-1 exceeded that of DODAP, which is a conventionally known cationic lipid.
  • the activity of MEND prepared from B-2 was significantly higher than that of MEND formed from B-2-1.
  • activity comparable to that of DOTAP, which is a conventionally known cationic lipid was obtained.
  • FIG. 4 shows the value obtained by dividing the gene transfer activity by the amount of intracellular uptake obtained from [Test Example 4] (1). Compared to conventional DOTAP, DODAP, or B-2-1 that does not have a disulfide group, the value of B-2 is high, so that the intracellular kinetic properties after incorporation into cells are excellent. It has been shown.
  • MEND formed from B-2-2 and B-2-3 was found to exceed the activity of DODAP, a conventional pH-responsive lipid-cationic lipid, although it was inferior to the activity of B-2. .
  • HT1080 cells were seeded at 1 ⁇ 10 5 cells / 2 mL / dish in a glass bottom dish 24 hours ago, and MEND consisting of B-2 and DODAP has a low uptake activity into cells. Therefore, pDNA 8 ⁇ g / 1 mL Krebs buffer / dishes Dilute MEND with Krebs buffer so that B-2-1 and DOTAP MEND with high uptake activity become pDNA 1.6 ⁇ g / 1 mL Krebs buffer / dish. Transfected. After 2.5 hours, Lysotracker Green (Life technologies) was added at 1 ⁇ L / dish, and another 30 minutes later, Hoechst 33342 (Dojindo) was added at 1 ⁇ L / dish.
  • Lysotracker Green Life technologies
  • HT1080 cells were seeded at 1 ⁇ 10 5 cells / 2 mL / dish in a glass bottom dish, and MEND was diluted with Krebs buffer so that B-2 MEND was pDNA 8 ⁇ g / 1 mL Krebs buffer / dish.
  • B-2-1 and DOTAP MEND were transfected by diluting MEND with Krebs buffer so that pDNA was 1.6 ⁇ g / 1 mL Krebs buffer / dish.
  • Hoechst 33342 was added at 1 ⁇ L / dish, and further 30 minutes later, it was washed twice with 2 mL of heparin solution (20 units / mL), 1 mL of Krebs buffer was added, and observed with a confocal laser scanning microscope. The results are shown in FIG.
  • Rhodamine-labeled pDNA, MEND lipid membranes, and nuclei were displayed in pseudo-color in red, green, and blue, respectively. Red dots are conspicuous in B-2 and DOTAP, and the gene is considered to be efficiently dissociated from MEND in the cell. On the other hand, in B-2-1, red and green co-localized clearly, and almost all pDNA was observed as yellow dots. From this, it is considered that the decoating efficiency of the gene of B-2 MEND is superior to that of B-2-1 MEND.
  • 750 ⁇ L of electrostatic complex solution consisting of gene and protamine is mixed with 750 ⁇ L of lipid solution, stirred rapidly, diluted to 15 mL with 10 mM HEPES solution (pH 5.3), and Amicon (R) Ultra-15 100K device is used. Ultrafiltration was performed at 3,000 rpm for 15 minutes at 25 ° C. The solution after ultrafiltration was diluted with 100 mM HEPES buffer (pH 7.4), and ultrafiltration was performed again. This solution was diluted to 750 ⁇ L with 10 mM HEPES buffer.
  • the conventional cationic MEND has poor organ selectivity, and gene expression activity comparable to that in the liver is also observed in the lung and spleen.
  • the gene expression activity in the lung and spleen is at the background level. It was shown that the organ selectivity (particularly liver selectivity) was excellent (FIG. 10).
  • HT1080 cells were seeded at 4 ⁇ 10 4 cells / 500 ⁇ L / well on a 24-well plate 24 hours ago, and bafilomycin A1 was added to a concentration of 0.5 ⁇ M 30 minutes before pretreatment.
  • Various MENDs were diluted with DMEM (FBS 10% +) so that the amount of pDNA was converted to 0.4 ⁇ g / 500 ⁇ L / well, and bafilomycin A1 was added to 0.5 ⁇ M for transfection. After 3 hours, the MEND solution was removed, and DMEM (FBS 10% +) was added to 500 ⁇ L / well to change the medium.
  • the cells were washed with 500 ⁇ L of PBS ( ⁇ ), 75 ⁇ L of 1 ⁇ lysis buffer was added to each well, and left at ⁇ 80 ° C. for 30 minutes or longer.
  • the frozen 24-well plate was thawed on ice, the cells were detached with a cell scraper, and the entire amount was transferred to an Eppendorf tube (15000 rpm, 4 ° C., 5 min) and centrifuged. 50 ⁇ L of the supernatant was collected in another eppendorf tube and used for luciferase assay and BCA assay.
  • the gene expression evaluation was performed by the method described in [Test Example 4] (2).
  • Luciferase mRNA solution was diluted to 0.005 ⁇ g / ⁇ L. To 1 ⁇ L of mRNA solution, various MEND solutions were added to make 0.0625, 0.125, and 0.25 ⁇ g to make the total volume 6.5 ⁇ L.
  • RRL Ragon Reticulocyte Lysate 17.5 ⁇ L
  • AAM Amino Acid Mixture
  • AAM-Leu 0.25 ⁇ L RRI (Recombinant RNase Inhibitor) 0.5 ⁇ L mixed at 90 ° C. and mixed at 90 ° C. did.
  • B-2 has a small interaction with nucleic acid in cells.
  • reaction solution was diluted with 210 ⁇ L of water, mixed with 280 ⁇ L of alkaline phenol / chloroform / isoamyl alcohol, stirred vigorously for about 30 seconds, centrifuged at 15,000 rpm for 15 minutes at 25 ° C., and the supernatant was collected.
  • a 1% agarose gel was used for electrophoresis. 6 ⁇ loading dye 2 ⁇ L was mixed with 12 ⁇ L of the sample, and the entire amount was applied to the well for electrophoresis. The gel was soaked in EtBr aqueous solution for 30 minutes and photographed.
  • Test Example 12 B-2 Evaluation of time-dependent change in gene expression activity by MEND Cationic MEND using R8 / GALA having high gene expression in the MEND solution prepared by the method shown in Test Example 9 (Khalil et al. al., J Control Release., 156 (3) 374-80, 2011), in vivo JetPEI-Gal (PolyPlus-Transfection), a commercially available gene transfer reagent targeting the liver, each 40 ⁇ g DNA equivalent, 5 weeks old Of male ICR mice were administered via tail vein. At this time, the pCpGfree-Luc (0) described in International Publication No.
  • 2011/132713 was used as a pDNA excluding all CpG sequences known to induce an immune response as a DNA to be loaded on the MEND composed of B-2.
  • a plasmid DNA (pcDNA3.1) having a CpG sequence in the backbone of the plasmid DNA and also having a CpG sequence in the start codon to the stop codon of the luciferase sequence which is a marker gene.
  • pCpGfree-Luc (0) was used for gene transfer using cationic MEND and in vivo JetPEI-Gal.
  • luciferin in vivo grade, Promega
  • IVIS Lumina II Caliper Life Sciences
  • the MEND consisting of B-2 was imaged about twice a week even at a time later than 72 hours.
  • the total amount of luminescence in the mouse abdomen was calculated as photon / sec from the acquired image, and this was used as an index of gene expression activity in the liver.
  • the acquired image is shown in FIG. 14 (upper), and the graph of the total light emission amount is shown in FIG. 14 (lower).
  • Anesthesia was performed by intraperitoneally administering 50 mg / mL sodium pentobarbital (Nacalai Tesque) 5-fold diluted with physiological saline to ICR mice (5-week-old mice). About 80 ⁇ L of Griffinia simplicifolia Lectin I-B4 Isolectin, FITC Conjugate (VECTOR Laboratories) was administered to the anesthetized mouse through the tail vein, and vascular endothelial cells were stained. The mouse was laparotomized to expose the liver, and Immersol TM 518F (Carl Zeiss) was dropped into the organ to prevent the organ from drying out.
  • Immersol TM 518F Carl Zeiss
  • a winged vein indwelling needle connected with an extension tube filled with a MEND solution was placed in the mouse tail vein.
  • a confocal microscope using a device that adsorbs and fixes the liver (Shimizu K et al., J Biosci Bioeng. 112 (5): 508-10) Observation was performed with a 60 ⁇ water immersion lens using (Nikon A1).
  • MEND was administered to the mouse so that the concentration of 40 ⁇ g DNA / mouse was about 5 seconds after the start of movie recording, and the movie recording was terminated about 10 minutes later. The results are shown in FIG.
  • TNF- ⁇ was slightly elevated 3 hours after administration, and IFN- ⁇ was elevated 6 hours after administration.
  • B-2 MEND TNF- ⁇ became high after 3 hours and IL-12p70 became high after 6 hours when pcDNA3.1-Luc (+) was used.
  • pCpGfree-Luc (0) was introduced using B-2 MEND, all three cytokines maintained normal values at any time.
  • B-2 MEND prepared using pCpGfree-Luc (0) hardly causes an immune reaction. Therefore, it is considered that gene expression activity decreases due to immune reaction and harmful side effects are unlikely to occur.
  • Cy5-labeled pDNA was prepared using Label / IT Cy5 Labeling Kit (Mirus) according to the attached protocol. The concentration of the obtained Cy5-labeled pDNA solution was calculated using Nano Drop (Thermo Scientific).
  • concentration of the obtained Cy5-labeled pDNA solution was calculated using Nano Drop (Thermo Scientific).
  • Test Example 16 Measurement of particle size and surface potential of various MENDs The particle size and surface potential were measured using a dynamic light scattering method (Zetasizer Nano; Malvern). Table 4 shows the particle diameters and surface potentials of various MENDs prepared by the preparation method of [Test Example 1]. Both B-2-4 and B-2-5 had a preferred charge at physiological pH of ⁇ 10 to +10 mV.
  • the activity of MEND formed from B-2-5 was equivalent to that of B-2.
  • the activity of MEND formed from B-2-4 was significantly higher than B-2 and B-2-5.
  • 6-well plate was seeded with HT1080 cells at 2 ⁇ 10 5 cells / 2 mL / well, and various sample MENDs were diluted with DMEM (FBS +) to a pDNA concentration of 1.6 ⁇ g / 2 mL / well.
  • Wells were transfected. After 1, 3, and 6 hours, MEND-containing DMEM was removed, and the cells were washed twice with 1 mL of heparin (20 units / mL), and further washed once with 1 mL of PBS ( ⁇ ). After adding 500 ⁇ L of 0.05% Trypsin solution, it was allowed to stand in a 37 ° C. incubator for 3 minutes.
  • B-2 which is a neutral particle
  • B-2-4 uptake was low. MEND using B-2-4 was incorporated higher than B-2.
  • HT1080 cells were seeded at 4 ⁇ 10 4 cells / 2 mL / dish in a 3.5 cm cell culture dish 24 hours ago, and various concentrations of MEND were converted to pDNA amounts so that the final concentration was 1.6 ⁇ g / 2 mL / dish.
  • the amount of luminescence for 2 minutes was measured every 20 minutes to obtain luciferase activity (RLU / 2 min). The results are shown in FIG.
  • the activity of MEND formed from B-2-4 was significantly higher than MEND formed from B-2 and DOTAP.
  • the activity of B-2 was equivalent to DOTAP.
  • MEND consisting of B-2-4 was found to have a significantly higher gene expression activity despite a low uptake into cells compared to MEND formed from the cationic lipid DOTAP. Compared to conventional DOTAP and B-2, B-2-4 was shown to have better intracellular kinetic properties after incorporation into cells.
  • HT1080 cells were seeded at 5 ⁇ 10 4 cells / 2 mL / dish in a glass bottom dish 24 hours ago.
  • MEND was diluted with DMEM (FBS 10% +) so that the pDNA was 1.6 ⁇ g / 2 mL, and the cells were transfected.
  • Lysotracker Green (Life technologies) was added at 2 ⁇ L / dish.
  • the plate was washed twice with 2 mL of heparin (20 units / mL), 1 mL of Krebs buffer was added, and observed with a confocal laser scanning microscope. The results are shown in FIG.
  • HT1080 cells were seeded at 5 ⁇ 10 4 cells / 2 mL / dish in a glass bottom dish 24 hours ago.
  • MEND was diluted with DMEM (FBS 10% +) so that the pDNA was 1.6 ⁇ g / 2 mL, and the cells were transfected.
  • a non-transfected MEND was used as a control.
  • Lysotracker Green Life technologies
  • Hoechst 33342 (Dojindo) was added at 2 ⁇ L / dish.
  • the plate was washed twice with 2 mL of heparin (20 units / mL), 1 mL of Krebs buffer was added, and observed with a confocal laser scanning microscope. The results are shown in FIG.
  • the endosome, lysosome, and nucleus were displayed in pseudo-color in green and blue, respectively.
  • the relative endosome amount was calculated according to the following formula.
  • HT1080 cells were seeded at 5 ⁇ 10 4 cells / 2 mL / dish in a glass bottom dish 24 hours ago.
  • MEND was diluted with DMEM (FBS 10% +) so that the pDNA was 1.6 ⁇ g / 2 mL, and the cells were transfected.
  • the plate was washed twice with 2 mL of heparin solution (20 units / mL), 1 mL of Krebs buffer was added, and images after 3, 6, 9, and 12 hours of transfection were read with a confocal laser scanning microscope. I got it. The results are shown in FIG.
  • the rhodamine-labeled pDNA and MEND lipid membranes were pseudo-colored in red and green, respectively.
  • the decoating efficiency was calculated according to the following formula.
  • PEG 2000 -DMG was used as the PEG lipid, and a MEND solution corresponding to 0.55 mM in terms of lipid concentration was prepared.
  • pDNA was fluorescently labeled, it was carried out by the method described in [Test Example 15] (2).
  • HT1080 cells were seeded at 2 ⁇ 10 5 cells / 2 mL / well on a 6-well plate 24 hours ago. Thirty minutes before transfection, the medium was replaced with DMEM (FBS +) containing a final concentration of 10 ⁇ g / ⁇ L filipin. Fifteen minutes before transfection, the medium was replaced with DMEM (FBS +) containing a final concentration of 0.3 M sucrose and 1 mM amylide. At the time of transfection, various MENDs were added to the dish so that the amount of pDNA was 1.6 ⁇ g / 2 mL / dish. Three hours after transfection, the amount of intracellular pDNA was measured by the method described in [Test Example 19] (1). The results are shown in FIG.
  • HT1080 cells were seeded at 4 ⁇ 10 4 cells / 500 ⁇ L / well on a 24-well plate 24 hours ago. Thirty minutes before transfection, the medium was replaced with DMEM (FBS +) containing a final concentration of 10 ⁇ g / ⁇ L filipin. Fifteen minutes before transfection, the medium was replaced with DMEM (FBS +) containing final concentrations of 0.3 M sucrose and 1.5 mM amylide. At the time of transfection, various MENDs were added to the well so as to be 0.8 ⁇ g / 500 ⁇ L / well in terms of pDNA amount. Thereafter, gene expression activity was evaluated according to the method described in [Test Example 4] (2). The results are shown in FIG.
  • B-2 gene expression was inhibited by sucrose and amylide.
  • the gene expression of B-2-4 was inhibited by amylide. This suggests that B-2 and B-2-4 are both taken up by the sucrose and amylide-sensitive pathways, but in B-2-4, the amylide-sensitive pathway contributes greatly to gene expression.
  • HT1080 cells were seeded at 4 ⁇ 10 4 cells / 2 mL / dish in a 3.5 cm cell culture dish 24 hours ago. Thirty minutes before transfection, the medium was changed to DMEM (FBS 10% +) containing 0.5 ⁇ M BafA1 (Bafilomycin A1). After 30 minutes, various MENDs were added to the dish so that the amount of pDNA was 1.6 ⁇ g / 2 mL / dish in terms of the amount of pDNA.
  • DMEM FBS 10% +
  • BafA1 Bafilomycin A1
  • HT1080 cells were seeded at 4 ⁇ 10 4 cells / 2 mL / dish in a 3.5 cm cell culture dish 24 hours ago, and various concentrations of MEND were converted to pDNA amounts so that the final concentration was 1.6 ⁇ g / 2 mL / dish.
  • the amount of luminescence for 2 minutes was measured every 20 minutes to obtain luciferase activity (RLU / 2 min). The results are shown in FIG.
  • the gene expression activity of MEND formed from B-2-4 was decreased by RA in a concentration-dependent manner (FIG. 30 right).
  • the gene expression activity of MEND formed from B-2 did not decrease (FIG. 30 left). It was suggested that the gene expression of B-2-4 is involved in recognition as RA.
  • HT1080 cells were seeded at 5 ⁇ 10 4 cells / 2 mL / dish in a glass bottom dish 24 hours ago.
  • MEND was diluted with DMEM (FBS 10% +) so that the pDNA was 1.6 ⁇ g / 2 mL, and the cells were transfected.
  • DMEM FBS 10% +
  • 1 ⁇ L of hoechst 33342 was added, and after 10 minutes, the plate was washed twice with 2 mL of a heparin solution (20 units / mL), 1 mL of Krebs buffer was added, and obtained with a confocal laser scanning microscope. The results are shown in FIG.
  • B-2 was diffused in the cells, while B-2-4 was observed to accumulate around the nucleus. This suggested the existence of a transport mechanism to the nucleus.
  • HT1080 cells were seeded at 4 ⁇ 10 4 cells / 2 mL / dish in a 3.5 cm cell culture dish 24 hours ago, and various concentrations of MEND were converted to pDNA amounts so that the final concentration was 1.6 ⁇ g / 2 mL / dish.
  • DMEM FBS 10% +, Phenol red free
  • GA Calbiochem
  • the amount of luminescence for 2 minutes was measured every 20 minutes to obtain luciferase activity (RLU / 2 min). The results are shown in FIG.
  • GA had a greater inhibitory effect on B-2-4 than B-2.
  • GA is a small molecule that inhibits sumoylation of intracellular proteins.
  • HT1080 expresses intracellular retinoic acid binding protein II (CRABPII) that transports RA to the nucleus in a SUMOylation-dependent manner. It is conceivable that the significant decrease in the gene expression activity for B-2-4 is caused by the decrease in the activity of CRABPII by GA.
  • CRABPII retinoic acid binding protein II
  • PEG2000-DMG as a PEG lipid was added in an amount corresponding to 3 mol% with respect to the total lipid amount, and ethanol was added so that the total amount was 400 ⁇ L.
  • 400 ⁇ L of the nucleic acid electrostatic complex solution composed of siRNA / protamine prepared in [Test Example 27] was mixed, and then quickly 10 mM HEPES buffer (pH 5.3) 2. 4 mL was added and stirred vigorously.
  • an Amicon Ultra-15 100K device (Millipore)
  • the solution was centrifuged at 1000 g for 10 minutes at 30 ° C. and ultrafiltered. Thereafter, the solution was sufficiently diluted with 10 mM HEPES buffer (pH 7.4), subjected to ultrafiltration again and concentrated. This solution was adjusted with 10 mM HEPES buffer (pH 7.4) to the desired lipid concentration.
  • [Test Example 30] Knockdown effect of siRNA encapsulated MEND The MEND solution prepared by the method shown in [Test Example 28] was administered to 4 weeks old male ICR mice at 3 mg siRNA / kg via tail vein, and blood was collected 24 hours later. did. The blood sample was centrifuged at 1000 g for 10 minutes at 4 ° C., and the supernatant was collected to obtain plasma. The amount of Factor VII (FVII) in plasma was quantified using BIOPHEEN FVII CHROMOGENIC ASSAY (HYPHEN BioMed). The results are shown in FIG. Compared to the untreated group, the FVII expression level was decreased in all of B-2, B-2-4, and B-2-5, and B-2-5 MEND showed the largest knockdown effect among them. .
  • FVII Factor VII
  • the gene knockdown effect peaked one day after administration and then gradually disappeared over about 7 weeks.
  • nucleic acid into cells with high efficiency, which is useful for gene therapy and biochemical experiments.

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Abstract

核酸送達キャリアとして使用した場合に、高い細胞内発現効率を達成できるカチオン性脂質を提供すること。 式（１）（式中、Ｘａ及びＸｂは独立して、Ｘ１又はＸ２であり；ｓは１又は２であり、 Ｒ４は炭素数１～６のアルキル基を表し、 ｎａ及びｎｂは独立して、は０又は１であり、 Ｒ１ａ及び及びＲ１ｂは独立して、炭素数１～６のアルキレン基を表し、 Ｒ２ａ及びＲ２ｂは独立して、炭素数１～６のアルキレン基を表し、 Ｙａ及びＹｂは独立して、エステル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合又は尿素結合を表し、 Ｒ３ａ及びＲ３ｂは独立して、ステロール残基、脂溶性ビタミン残基又は炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基を表す）で示される化合物。

Description

細胞内動態を改善したカチオン性脂質
　本発明は細胞内動態を改善したカチオン性脂質、これを含む脂質膜構造体、及びこれらの用途に関する。
　核酸治療を実用化するために、効果的で安全な核酸送達キャリアが求められている。ウイルスベクターは、発現効率のよい核酸送達キャリアであるが、安全性の観点から実用上問題がある。そのため、より安全に使用できる非ウイルス核酸送達キャリアの開発が進められており、そのなかでもカチオン性脂質を用いたキャリアは、現在最も一般的に使用されている非ウイルス核酸送達キャリアである。
　カチオン性脂質は大別してアミン部位と脂質部位から構成されており、カチオン性を示すアミン部位とポリアニオンである核酸が静電的に相互作用し、正に帯電したリポソーム又は脂質膜構造体を形成することで、細胞への取り込みを促進し、核酸を細胞内へ送達するものである。
　一般に広く用いられている公知のカチオン性脂質としてはＤＯＴＡＰやＤＯＤＡＰが挙げられる。これらの公知のカチオン性脂質はリン脂質と組み合わせることによって、正に帯電したリポソーム又は脂質膜構造体を形成し、核酸と静電的に相互作用することで、標的細胞に核酸を送達し得る（非特許文献１）。
　また、特許文献１に、細胞への取り込み量を増加させる目的でアミノ基を多く含有したカチオン性脂質が記載されている。このカチオン性脂質は細胞への取り込み能が高く、細胞膜組成が異なる種々の細胞に作用することが、この文献で主張されている。
　一方で、カチオン性脂質を用いた核酸送達キャリアが生体内で実用的な効果を発揮するためには、体内動態が良いこと、具体的には血中での安定性が高いこと、腫瘍等の標的への集積性が高いことなどの要件を満たす必要がある。この課題に対し、ＷｈｅｅｌｅｒらはｐＫａを中性付近に調整したカチオン性脂質を含む脂質膜構造体が静脈内注射後に長い血中寿命を示すこと、腫瘍部位に集積すること、かつこれら腫瘍部位での核酸の発現を媒介できることを示している（非特許文献２）。
　このように体内動態を改善したカチオン性脂質が開発されているが、一般的に外来物質を細胞内に導入するという核酸送達キャリアの性質上、少ない取り込み量で大きな効果を発揮することが望まれている。即ち、脂質膜構造体を発現ベクターの細胞内への送達キャリアとして用いた場合、細胞内に取り込まれた単位脂質膜構造体当たりの発現量を高め、細胞内での発現効率を高めることが求められている。細胞内での発現効率を高めるためには、体内動態の他、取り込み過程、エンドソームなどからの脱出、核膜透過などの細胞内動態についても改善する必要がある。さらに細胞内における転写を促進する上では、核酸をキャリアから解離させ、転写因子の結合性を高める必要があることがわかっている（非特許文献３）。
　細胞内での核酸の脂質膜構造体からの解離を促進させた例として、１つのアミン部位と２つの脂質部位をジスルフィドを介して結合させた化合物（特許文献２）や１つのアミン部位に対して二つの脂質部位をそれぞれジスルフィド結合を介して結合させた化合物がある（特許文献３）。これらの化合物は、細胞内でジスルフィド結合が切断されることを利用し、アミン部位と相互作用している核酸を脂質膜構造体から解離させる効果を有することが主張されている。
　しかしながら、当該分野での進歩にも関わらず、従来のカチオン性脂質を用いた核酸送達キャリアにより達成される細胞内での発現効率は十分に満足できるものではない。
特開２０１１－１２１９６６号公報 国際公開第９９／５８１５２号 国際公開第２０１０／１５４４０５号
Biomaterials 29(24-25):3477-96,2008 Gene Therapy 6:271-281,1999 Molecular Therapy 13(4):786-794,2006
　カチオン性脂質を用いた核酸送達キャリアは外来物質を細胞内に導入するという性質上、少ない取り込み量で大きな効果を発揮すること、即ち細胞内に取り込まれた単位脂質膜構造体当たりの発現量を高め、細胞内における発現効率を高めることが求められている。本発明の目的は、核酸送達キャリアとして使用した場合に、高い細胞内発現効率を達成できるカチオン性脂質を提供することである。
　本発明者らは上記課題に鑑み鋭意検討した結果、特許文献２の化合物では、ジスルフィド結合が切断された後も脂質部位を２つ有する構造が維持されるため、細胞内において脂質膜構造体が崩壊されず、内封された核酸などの化合物が細胞質中に効率的に放出されないことを見出した。また、特許文献２の化合物を核酸導入に用いた場合、核酸がアミン部位と相互作用した状態で細胞内に放出させるため、転写因子の核酸へのアクセス及び結合が妨げられる可能性がある。
　更に、特許文献２や３の化合物を用いた場合、細胞内においてジスルフィド結合が切断されると、生成される残基が極性基であるアミン部位と非極性基である脂質部位とに別れるため、残基が界面活性能を失う。このような界面活性能の消失は、細胞内での脂質膜構造体の崩壊を誘導する上では有利であるが、エンドソーム膜の不安定化、及びそれに伴うエンドソーム脱出促進効果は期待できない。
　そこで、これらの新たな技術的な問題点に着目して更に検討を進めた結果、アミン部位と脂質部位とをジスルフィド結合で結合する代わりに、アミン部位と脂質部位とを細胞内で切断され難い安定な結合様式で結合し、得られる２分子の界面活性化合物をジスルフィド結合で結合することにより、これらの問題点を解決し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は、以下の内容を包含する。
［１］式（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
（式中、Ｘａ及びＸｂは独立して、Ｘ１又はＸ２であり；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
ｓは１又は２であり、
Ｒ４は炭素数１～６のアルキル基を表し、
ｎａ及びｎｂは独立して、０又は１であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは独立して、炭素数１～６のアルキレン基を表し、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは独立して、炭素数１～６のアルキレン基を表し、
Ｙａ及びＹｂは独立して、エステル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合又は尿素結合を表し、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは独立して、ステロール残基、脂溶性ビタミン残基又は炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基を表す）で示される化合物。
［２］Ｘａ及びＸｂが独立して、Ｘ１である［１］記載の化合物。
［３］Ｒ３ａ及びＲ３ｂが独立して、脂溶性ビタミン残基又は炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基である［１］又は［２］記載の化合物。
［４］Ｒ３ａ及びＲ３ｂが独立して、脂溶性ビタミン残基である［１］～［３］のいずれかに記載の化合物。
［５］Ｒ３ａ及びＲ３ｂが独立して、炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基である［１］～［３］のいずれかに記載の化合物。
［６］［１］～［５］のいずれかに記載の化合物を膜の構成脂質として含む脂質膜構造体。
［７］［１］～［５］のいずれかに記載の化合物、又は［６］記載の脂質膜構造体を含む核酸導入剤。
［８］生体外において、核酸を内封した［６］記載の脂質膜構造体と細胞とを接触させることを含む、当該核酸を当該細胞内へ導入する方法。
［９］核酸を内封した［６］記載の脂質膜構造体を、標的細胞へ送達されるように、生体へ投与することを含む、当該核酸を当該細胞内へ導入する方法。
　本発明は、２つの三級アミノ基と２つの脂質部位、そして生分解性基であるジスルフィド結合を有する化合物、またそれを含む脂質膜構造体に関するものである。本発明の化合物は、リポソームなどの安定な脂質膜構造体を形成することが出来、脂質膜構造体としてのｐＫａを中性付近に調整できる。さらに、本発明のカチオン性脂質を用いて遺伝子導入を行うと、細胞内の還元的環境においては本発明のカチオン性脂質に含まれるジスルフィド結合が切断され、脂質膜構造体の不安定化により内包物（核酸）の放出が促進される。そのため、送達遺伝子の細胞内での発現効率、即ち細胞内に取り込まれた単位脂質膜構造体当たりの発現効率を高めることができるだけでなく、送達核酸を介した効率的な遺伝子ノックダウンを達成することができる。
　本発明の化合物、またはそれを含む脂質膜構造体を用いて、遺伝子導入を行うと、血清成分による核酸の分解が抑制されるので、血清存在下での遺伝子導入や、生体内での遺伝子導入に有利である。
還元剤存在下における各種脂質膜の崩壊性を示す図である。 Ｂ－２、Ｂ－２－１、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＴＡＰから調製される各種ＭＥＮＤの細胞内取り込みの相対値を示した図である。 Ｂ－２、Ｂ－２－１、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＴＡＰから調製される各種ＭＥＮＤの遺伝子導入活性を示した図である。 Ｂ－２、Ｂ－２－１、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＴＡＰから調製される各種ＭＥＮＤの遺伝子発現活性（図３）を細胞内取り込み量（図４）で規格化した値を示した図である。 Ｂ－２及びその誘導体（Ｂ－２－２、Ｂ－２－３）の遺伝子導入活性を示した図である。 Ｂ－２、Ｂ－２－１、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＴＡＰから調製される各種ＭＥＮＤにより導入された遺伝子のエンドソームからの脱出を評価した図である。 Ｂ－２、Ｂ－２－１、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＴＡＰから調製される各種ＭＥＮＤにより導入された遺伝子のエンドソームからの脱出効率を示すグラフである。 Ｂ－２、Ｂ－２－１、ＤＯＴＡＰから調製される各種ＭＥＮＤにより導入された遺伝子の脱被覆化効率を評価した図である。 Ｂ－２、及びカチオン性脂質から調製されるＭＥＮＤの静脈内投与後の肝臓における遺伝子発現活性を示した図である。 Ｂ－２、及びカチオン性脂質から調製されるＭＥＮＤの遺伝子発現の臓器特異性を示した図である。 Ｂ－２、Ｂ－２－１、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＴＡＰから調製される各種ＭＥＮＤの遺伝子発現活性への、エンドソーム、ライソソーム酸性化阻害の影響を示すグラフである。 Ｂ－２、ＤＯＴＡＰから調製される各種ＭＥＮＤの試験管内翻訳反応に対に対する影響を示すグラフである。 血清による核酸分解に対する、Ｂ－２から調製されるＭＥＮＤの耐性効果を示す図である。 Ｂ－２から調製されるＭＥＮＤ、Ｒ８／ＧＡＬＡから調製されるＭＥＮＤ、及びｉｎ ｖｉｖｏ ＪｅｔＰＥＩ－Ｇａｌの静脈内投与により肝臓へ導入された発現ベクター（ＣｐＧ（＋）又はＣｐＧ（－））の遺伝子発現活性の経時的変化を示す図である。 Ｂ－２から調製されるＭＥＮＤ及びＲ８／ＧＡＬＡから調製されるＭＥＮＤの肝臓内挙動を示す写真である。 発現ベクター（ＣｐＧ（＋）又はＣｐＧ（－））を含む、Ｂ－２から調製されるＭＥＮＤ又はＲ８／ＧＡＬＡから調製されるＭＥＮＤの投与後の、サイトカインの血中濃度推移を示すグラフである。 Ｂ－２、Ｂ－２－４から調製される各種ＭＥＮＤの電子顕微鏡写真である。 Ｂ－２、Ｂ－２－４、Ｂ－２－５から調製される各種ＭＥＮＤにより導入された遺伝子の発現活性を示すグラフである。 Ｂ－２、Ｂ－２－４、ＤＯＴＡＰから調製される各種ＭＥＮＤの細胞内取り込みの経時的変化を示すグラフである。白丸はＢ－２を、黒丸はＢ－２－４を、白四角はＤＯＴＡＰを、それぞれ示す。 Ｂ－２、Ｂ－２－４、ＤＯＴＡＰから調製される各種ＭＥＮＤの遺伝子導入活性を示すグラフである。 ローダミン標識されたｐＤＮＡを封入した、Ｂ－２から調製されたＭＥＮＤ及びＢ－２－４から調製されたＭＥＮＤの細胞内動態を示す写真である。 Ｂ－２、Ｂ－２－４から調製された各種ＭＥＮＤにより導入された遺伝子のエンドソーム脱出効率を示すグラフである。 Ｂ－２、Ｂ－２－４から調製された各種ＭＥＮＤで処理された細胞のエンドソーム量を評価した写真である。 Ｂ－２、Ｂ－２－４から調製された各種ＭＥＮＤで処理された細胞の相対的エンドソーム量を示すグラフである。 Ｂ－２、Ｂ－２－４から調製される各種ＭＥＮＤにより導入された遺伝子の脱被覆効率を評価した写真である。 Ｂ－２、Ｂ－２－４から調製される各種ＭＥＮＤにより導入された遺伝子の脱被覆効率を示すグラフである。 Ｂ－２、Ｂ－２－４から調製される各種ＭＥＮＤの細胞内取り込みへのシュクロース、アミロライド及びフィリピンの影響を示すグラフである。 Ｂ－２、Ｂ－２－４から調製される各種ＭＥＮＤの遺伝子発現活性へのシュクロース、アミロライド及びフィリピンの影響を示すグラフである。 Ｂ－２、Ｂ－２－４から調製される各種ＭＥＮＤの遺伝子発現活性への、エンドソーム酸性化阻害の影響を示すグラフである。 Ｂ－２、Ｂ－２－４から調製される各種ＭＥＮＤの遺伝子発現活性へのレチノイン酸の影響を示すグラフである。 ローダミン標識されたｐＤＮＡを封入した、Ｂ－２から調製されたＭＥＮＤ及びＢ－２－４から調製されたＭＥＮＤの細胞内動態を示す写真である。 Ｂ－２、Ｂ－２－４から調製される各種ＭＥＮＤの遺伝子発現活性へのＧＡの影響を示すグラフである。 Ｂ－２、Ｂ－２－４、Ｂ－２－５から調製される各種ＭＥＮＤによる、ＦＶＩＩに対するｓｉＲＮＡ導入の効果を示すグラフである。 Ｂ－２－５から調製される各種ＭＥＮＤにより導入されたＦＶＩＩに対するｓｉＲＮＡの、遺伝子ノックダウン効果の持続性を評価したグラフである。
　以下、本発明の実施形態を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　本発明は、式（１）で表される化合物を提供するものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　式（１）中、Ｘａ及びＸｂは独立して、以下に示すＸ１又はＸ２であり、好ましくはＸ１である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　Ｘ１中のＲ４は炭素数１～６のアルキル基を表し、直鎖状であっても分岐状であっても環状であっても良い。該アルキル基の炭素数は、好ましくは１～３である。炭素数１～６のアルキル基としては、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔ－ペンチル基、１，２－ジメチルプロピル基、２－メチルブチル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、２，２－ジメチルブチル基、２，３－ジメチルブチル基、シクロヘキシル基等を挙げることができる。Ｒ４は好ましくはメチル基、エチル基、プロピル基又はイソプロピル基であり、最も好ましくはメチル基である。
　Ｘ２中のｓは１又は２である。ｓが１のときＸ２は好ましくはピロリジニウム基であり、ｓが２のときＸ２は好ましくはピペリジニウム基である。
　ＸａはＸｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、ＸａはＸｂと同一の基である。
　ｎａ及びｎｂは独立して、０又は１であり、好ましくは１である。ｎａが１の場合、Ｒ３ａはＹａ及びＲ２ａを介してＸａと結合し、ｎａが０の場合にはＲ３ａ－Ｘａ―Ｒ１ａ―Ｓ－の構造を呈する。同様に、ｎｂが１の場合、Ｒ３ｂはＹｂ及びＲ２ｂを介してＸｂと結合し、ｎｂが０の場合にはＲ３ｂ－Ｘｂ―Ｒ１ｂ―Ｓ－の構造を呈する。
　ｎａはｎｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、ｎａはｎｂと同一である。
　Ｒ１ａ及びＲ１ｂは独立して、炭素数１～６のアルキレン基を表し、直鎖状であっても良く、分岐を有していても良いが、好ましくは直鎖状である。炭素数１～６のアルキレン基としては、具体的にはメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、イソプロピレン基、テトラメチレン基、イソブチレン基、ペンタメチレン基、ネオペンチレン基等を挙げることができる。Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、好ましくはメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、イソプロピレン基又はテトラメチレン基であり、最も好ましくはエチレン基である。
　Ｒ１ａはＲ１ｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、Ｒ１ａはＲ１ｂと同一の基である。
　Ｒ２ａ及びＲ２ｂは独立して、炭素数１～６のアルキレン基を表し、直鎖状であっても良く、分岐を有していても良いが、好ましくは直鎖状である。炭素数１～６のアルキレン基としては、Ｒ１ａ及びＲ１ｂの炭素数１～６のアルキレン基の例として列挙したものを挙げることができる。Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、好ましくはメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、イソプロピレン基又はテトラメチレン基であり、最も好ましくはトリメチレン基である。
　Ｒ２ａはＲ２ｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、Ｒ２ａはＲ２ｂと同一の基である。
　Ｙａ及びＹｂは独立して、エステル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合、尿素結合であり、好ましくはエステル結合、アミド結合、カーバメート結合であり、最も好ましくはエステル結合である。Ｙａ及びＹｂの結合の向きは制限されないが、Ｙａがエステル結合の場合、好ましくは、Ｒ３ａ－ＣＯ－Ｏ－Ｒ２ａ－の構造を呈し、Ｙｂがエステル結合の場合、好ましくは、Ｒ３ｂ－ＣＯ－Ｏ－Ｒ２ｂ－の構造を呈する。
　ＹａはＹｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、ＹａはＹｂと同一の基である。
　Ｒ３ａ及びＲ３ｂは独立して、ステロール残基、脂溶性ビタミン残基又は炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基を表し、好ましくは脂溶性ビタミン残基又は炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基であり、最も好ましくは脂溶性ビタミン残基である。
　ステロール残基としては、例えばコレステリル基（コレステロール残基）、コレスタリル基（コレスタノール残基）、スチグマステリル基（スチグマステロール残基）、β－シトステリル基（β－シトステロール残基）、ラノステリル基（ラノステロール残基）、及びエルゴステリル基（エルゴステロール残基）などが挙げられる。ステロール残基は、好ましくはコレステリル基又はコレスタリル基である。
　脂溶性ビタミン残基としては、脂溶性ビタミン由来の残基の他、脂溶性ビタミン中の官能基である水酸基、アルデヒド、カルボン酸を他の反応性官能基に適宜変換した誘導体由来の残基を用いることができる。例えば水酸基を有する脂溶性ビタミンについてはコハク酸無水物やグルタル酸無水物などを反応させることにより、水酸基をカルボン酸に変換できる。脂溶性ビタミンとしては、レチノイン酸、レチノール、レチナール、エルゴステロール、７－デヒドロコレステロール、カルシフェロール、コルカルシフェロール、ジヒドロエルゴカルシフェロール、ジヒドロタキステロール、トコフェロール、トコトリエノール等を挙げることができる。脂溶性ビタミンは好ましくはレチノイン酸又はトコフェロールである。
　炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基は、直鎖状であっても、分岐を有していても良いが、好ましくは直鎖状である。当該脂肪族炭化水素基は、飽和であっても不飽和であっても良い。不飽和脂肪族炭化水素基の場合、当該脂肪族炭化水素基に含まれる不飽和結合の数は通常１～６個、好ましくは１～３個、より好ましくは１～２個である。不飽和結合には炭素－炭素二重結合及び炭素－炭素三重結合が含まれるが、好ましくは炭素－炭素二重結合である。当該脂肪族炭化水素基に含まれる炭素数は、好ましくは１２～１８であり、最も好ましくは１３～１７である。脂肪族炭化水素基には、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基等が含まれるが、好ましくはアルキル基又はアルケニル基である。炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基としては、具体的にはドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、イコシル基、ヘンイコシル基、ドコシル基、ドデセニル基、トリデセニル基、テトラデセニル基、ペンタデセニル基、ヘキサデセニル基、ヘプタデセニル基、オクタデセニル基、ノナデセニル基、イコセニル基、ヘンイコセニル基、ドコセニル基、デカジエニル基、トリデカジエニル基、テトラデカジエニル基、ペンタデカジエニル基、ヘキサデカジエニル基、ヘプタデカジエニル基、オクタデカジエニル基、ノナデカジエニル基、イコサジエニル基、ヘンイコサジエニル基、ドコサジエニル基、オクタデカトリエニル基、イコサトリエニル基、イコサテトラエニル基、イコサペンタエニル基、ドコサヘキサエニル基、イソステアリル基等を挙げることができる。炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基は、好ましくはトリデシル基、テトラデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ヘプタデカジエニル基又はオクタデカジエニル基であり、特に好ましくはトリデシル基、ヘプタデシル基、ヘプタデカジエニル基である。
　一態様において、炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基は脂肪酸、脂肪族アルコール、又は脂肪族アミンに由来するものが用いられる。Ｒ３ａ（又はＲ３ｂ）が脂肪酸由来の場合、Ｙａ（又はＹｂ）はエステル結合、又はアミド結合であり、脂肪酸由来のカルボニル炭素はＹａ（又はＹｂ）に含まれる。例えば、リノール酸を用いた場合、Ｒ３ａ（又はＲ３ｂ）はヘプタデカジエニル基である。
　Ｒ３ａはＲ３ｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、Ｒ３ａはＲ３ｂと同一の基である。
　一態様において、ＸａはＸｂと同一であり、ｎａはｎｂと同一であり、Ｒ１ａはＲ１ｂと同一であり、Ｒ２ａはＲ２ｂと同一であり、Ｒ３ａはＲ３ｂと同一であり、ＹａはＹｂと同一である。
　一態様において、
Ｘａ及びＸｂは独立して、Ｘ１であり、
Ｒ４は炭素数１～３のアルキル基を表し、ｎａ及びｎｂは１であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは独立して、炭素数１～６のアルキレン基を表し、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは独立して、炭素数１～６のアルキレン基を表し、
Ｙａ及びＹｂはエステル結合を表し、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは独立して、炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基を表す。
　一態様において、
Ｘａ及びＸｂは、Ｘ１であり、
Ｒ４は炭素数１～３のアルキル基を表し、ｎａ及びｎｂは１であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、炭素数１～６のアルキレン基を表し、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、炭素数１～６のアルキレン基を表し、
Ｙａ及びＹｂはエステル結合を表し、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基を表し、
ＸａはＸｂと同一であり、
Ｒ１ａはＲ１ｂと同一であり、
Ｒ２ａはＲ２ｂと同一であり、
Ｒ３ａはＲ３ｂと同一である。
　一態様において、
Ｘａ及びＸｂは、Ｘ１であり、
Ｒ４はメチル基を表し、ｎａ及びｎｂは１であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂはエチレン基を表し、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂはトリメチレン基を表し、
Ｙａ及びＹｂは－ＣＯ－Ｏ－を表し、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは独立して、炭素数１３～１７のアルキル基又はアルケニル基を表す。
　一態様において、
Ｘａ及びＸｂは、Ｘ１であり、
Ｒ４はメチル基を表し、ｎａ及びｎｂは１であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂはエチレン基を表し、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂはトリメチレン基を表し、
Ｙａ及びＹｂは－ＣＯ－Ｏ－を表し、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、炭素数１３～１７のアルキル基又はアルケニル基を表し、
Ｒ３ａはＲ３ｂと同一である。
　一態様において、
Ｘａ及びＸｂは独立して、Ｘ１であり、
Ｒ４は炭素数１～３のアルキル基を表し、ｎａ及びｎｂは１であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは独立して、炭素数１～６のアルキレン基を表し、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは独立して、炭素数１～６のアルキレン基を表し、
Ｙａ及びＹｂはエステル結合を表し、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは独立して、脂溶性ビタミン残基（例、レチノイン酸残基、トコフェロール残基）を表す。
　一態様において、
Ｘａ及びＸｂは、Ｘ１であり、
Ｒ４は炭素数１～３のアルキル基を表し、ｎａ及びｎｂは１であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、炭素数１～６のアルキレン基を表し、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、炭素数１～６のアルキレン基を表し、
Ｙａ及びＹｂはエステル結合を表し、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、脂溶性ビタミン残基（例、レチノイン酸残基、トコフェロール残基）を表し、
ＸａはＸｂと同一であり、
Ｒ１ａはＲ１ｂと同一であり、
Ｒ２ａはＲ２ｂと同一であり、
Ｒ３ａはＲ３ｂと同一である。
　一態様において、
Ｘａ及びＸｂは、Ｘ１であり、
Ｒ４はメチル基を表し、ｎａ及びｎｂは１であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂはエチレン基を表し、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂはトリメチレン基を表し、
Ｙａ及びＹｂは－ＣＯ－Ｏ－を表し、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは独立して、脂溶性ビタミン残基（例、レチノイン酸残基、トコフェロール残基）を表す。
　一態様において、
Ｘａ及びＸｂは、Ｘ１であり、
Ｒ４はメチル基を表し、ｎａ及びｎｂは１であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂはエチレン基を表し、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂはトリメチレン基を表し、
Ｙａ及びＹｂは－ＣＯ－Ｏ－を表し、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、脂溶性ビタミン残基（例、レチノイン酸残基、トコフェロール残基）を表し、
Ｒ３ａはＲ３ｂと同一である。
　本発明の化合物の具体例として、以下のＢ－２、Ｂ－２－２、Ｂ－２－３、Ｂ－２－４及びＢ－２－５の化合物を挙げることができる。
[規則91に基づく訂正 26.04.2013]　
Figure WO-DOC-TABLE-1
 
　次に本発明の化合物の製造方法について説明する。
　本発明の化合物は、－Ｓ－Ｓ－（ジスルフィド）結合を有している。そのため、製造方法としては、
Ｒ３ａ－（Ｙａ－Ｒ２ａ）ｎ ａ－Ｘａ－Ｒ１ａ－ＳＨ、及び
Ｒ３ｂ－（Ｙｂ－Ｒ２ｂ）ｎ ｂ－Ｘｂ－Ｒ１ｂ－ＳＨ
を製造後、これを酸化（カップリング）することで－Ｓ－Ｓ－を含む本発明の化合物を得る方法、－Ｓ－Ｓ－結合を含む化合物から出発し、必要な部分を順次結合していき、最終的に本発明の化合物を得る方法等が挙げられる。好ましくは、後者の方法である。
　後者の方法の具体例を以下に挙げるが、これらの方法には限定されない。
　出発化合物としては、－Ｓ－Ｓ－結合を含む両末端カルボン酸、両末端カルボン酸エステル、両末端アミン、両末端イソシアネート、両末端アルコール、ＭｓＯ（メシレート基）などの脱離基を有する両末端アルコール、ｐＮＰ（ｐ－ニトロフェニルカーボネート基）などの脱離基を有する両末端カーボネート、などが挙げられる。
　例えば、Ｘａ及びＸｂとしてＸ１又はＸ２を含む化合物を製造する場合、－Ｓ－Ｓ－結合を含む化合物（１）中の両末端官能基を、－ＮＨ－基と末端に１つの官能基を有する化合物（２）中の－ＮＨ－基に反応させた後、化合物（２）中の反応に寄与しなかった末端の官能基と、Ｒ３を含む化合物（３）中の官能基を反応させることにより、－Ｓ－Ｓ－結合、Ｒ１ａ及びＲ１ｂ、Ｘａ及びＸｂ、Ｒ２ａ及びＲ２ｂ、Ｙａ及びＹｂ、並びにＲ３ａ及びＲ３ｂを含む本発明の化合物を得ることができる。
　化合物（１）と化合物（２）の反応には、触媒として、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、ｔ－ブトキシカリウムなどのアルカリ触媒を使用しても良く、無触媒で行ってもよい。好ましくは、炭酸カリウム又は炭酸ナトリウムが触媒として用いられる。
　触媒量としては、化合物（１）に対して０．１～１００モル等量であり、好ましくは、０．１～２０モル等量であり、より好ましくは０．１～５モル等量である。化合物（２）の仕込み量は、化合物（１）に対して、１～５０モル等量であり、好ましくは１～１０モル等量である。
　また、化合物（１）と化合物（２）の反応に使用する溶媒としては、反応を阻害しない溶媒や水溶液であればよく、特に制限なく使用することができる。例えば酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、ベンゼンおよびトルエンなどが挙げられる。これらの中ではトルエン、クロロホルムが好ましい。
　反応温度は、－２０～２００℃、好ましくは０～８０℃であり、より好ましくは２０～５０℃であり、反応時間は１時間～４８時間、好ましくは２～２４時間とするのが良い。
　化合物（１）と化合物（２）との反応産物と、化合物（３）を反応させる場合には、化合物（１）と化合物（２）の反応に使用した触媒のように、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、ｔ－ブトキシカリウムなどのアルカリ触媒を使用しても良く、ＰＴＳ（ｐ－トルエンスルホン酸）やＭＳＡ（メタンスルホン酸）などの酸触媒、又は、無触媒で行ってもよい。
　また、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）、ＤＩＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）、ＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）などの縮合剤を使用して、化合物（１）と化合物（２）との反応産物と、化合物（３）を直接反応させてもよく、又は、化合物（３）を縮合剤を使用させ、一旦無水物などに変換した後、化合物（１）と化合物（２）との反応産物と反応させてもよい。
　化合物（３）の仕込み量は、化合物（１）と化合物（２）との反応産物に対して、１～５０モル等量であり、好ましくは１～１０モル等量である。
　使用される触媒は、反応させる官能基同士によって、適宜選択される。
　触媒量としては、化合物（１）に対して０．０５～１００モル等量であり、好ましくは、０．１～２０モル等量であり、より好ましくは０．２～５モル等量である。
　また、化合物（１）と化合物（２）との反応産物と、化合物（３）の反応に使用する溶媒としては、反応を阻害しない溶媒や水溶液であればよく、特に制限なく使用することができる。例えば酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、ベンゼンおよびトルエンなどが挙げられる。これらの中ではトルエン、クロロホルムが好ましい。
　反応温度は、０～２００℃、好ましくは０～１２０℃であり、より好ましくは２０～５０℃であり、反応時間は１～４８時間、好ましくは２～２４時間とするのが良い。
　上記反応によって得られた反応物は、一般的な精製法、例えば、水洗、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、晶析、再結晶、液－液抽出、再沈殿、イオン交換カラムクロマトグラフィーなどによって、適宜精製することができる。
　具体的な実施例として、－Ｓ－Ｓ－結合を有し、両末端にＭｓＯ（メシレート基）などの脱離基を有する化合物を出発物質とし、３－（メチルアミノ）－１－プロパノールを結合させた後、脂肪酸又は脂溶性ビタミンを結合させた実施例を後述する（実施例１～５参照）。当業者であれば、適宜原料を選択し、この実施例の方法に準じて反応を行うことにより、所望の本発明の化合物を製造することができる。
　次に本発明の脂質膜構造体について説明する。本発明の脂質膜構造体は、上記一般式（１）で表される化合物を膜の構成脂質として含有するものである。ここで、本発明における「脂質膜構造体」とは、両親媒性脂質の親水基が界面の水相側に向かって配列した膜構造を有する粒子を意味する。
　発明の脂質を含む脂質膜構造体の形態は特に限定されないが、例えば、水系溶媒に分散した形態としてリポソーム（一枚膜リポソーム、多重層リポソーム）、Ｏ／Ｗ型エマルション、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルション、球状ミセル、ひも状ミセル、又は不定型の層状構造物などを挙げることができる。脂質膜構造体は、好ましくはリポソームである。
　本発明の脂質膜構造体は、本発明の化合物以外の分子、例えば、脂質（リン脂質（ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン等）、糖脂質、ペプチド脂質、コレステロール、本発明の化合物以外のカチオン性脂質、ＰＥＧ脂質等）、界面活性剤（例えば、ＣＨＡＰＳ、コール酸ナトリウム、オクチルグルコシド、Ｎ－Ｄ－グルコ－Ｎ－メチルアルカンアミド類等）、ポリエチレングリコール、蛋白質などをさらに含有してもよい。
　本発明の脂質膜構造体に含まれる本発明の化合物の含有量は特に限定されないが、通常は、脂質膜構造体を後述の核酸導入剤として用いた場合に、核酸を導入するのに十分な量の本発明の化合物が含まれる。例えば、総脂質の５～１００モル％、好ましくは１０～７０モル％、より好ましくは３０～５０モル％である。
　また、本発明の脂質膜構造体には、国際公開第２００５／０３２５９３号に記載されたポリアルギニンペプチド、国際公開第２００８／１０５１７８号に記載された生体成分に対する抵抗性を増強するＧＡＬＡペプチド又は血中安定性を高めるポリアルキレングリコールその他の、脂質膜構造体に対して様々な機能を付与することができる機能性素子を、それぞれの素子について知られる公知の方法によって脂質膜の表面に修飾させ、使用することができる。
　本発明の脂質膜構造体は、本発明の化合物及びその他の構成成分（脂質等）を適当な分散媒、例えば、水性溶媒やアルコール性溶媒中に分散させ、必要に応じて組織化を誘導する操作を行うことにより調製することができる。「組織化を誘導する操作」としては、例えば、エタノール希釈法、単純水和法、超音波処理、加熱、ボルテックス、エーテル注入法、フレンチ・プレス法、コール酸法、Ｃａ２＋融合法、凍結－融解法、逆相蒸発法等の自体公知の方法が挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明の脂質膜構造体に核酸を内封させ、これを細胞へ接触させることにより、生体内及び／又は生体外において該核酸を該細胞内へ導入することができる。従って、本発明は、上記本発明の化合物又は脂質膜構造体を含む、核酸導入剤を提供するものである。
　任意の核酸を細胞内へ導入することができる。核酸の種類としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡのキメラ核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡのハイブリッド等を挙げることができるがこれらに限定されない。また、核酸は１～３本鎖のいずれも用いることができるが、好ましくは１本鎖又は２本鎖である。核酸は、プリンまたはピリミジン塩基のＮ－グリコシドであるその他のタイプのヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のオリゴマー（例えば、市販のペプチド核酸（ＰＮＡ）等）または特殊な結合を含有するその他のオリゴマー（但し、該オリゴマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などであってもよい。さらに該核酸は、公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えば蛋白質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ－Ｌ－リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例えば、アクリジン、プソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。
　任意の種類のＤＮＡを、使用の目的に応じて適宜選択することができ、例えばプラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、ＰＡＣ、ＢＡＣ等が挙げられ、好ましくはプラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡであり、より好ましくはプラスミドＤＮＡである。プラスミドＤＮＡ等の環状ＤＮＡは適宜制限酵素等により消化され、線形ＤＮＡとして用いることもできる。また、任意の種類のＲＮＡを、使用の目的に応じて適宜選択することができ、例えばｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡゲノム、二本鎖ＲＮＡゲノム、ＲＮＡレプリコン、トランスファーＲＮＡ、リボゾーマルＲＮＡ等が挙げられ、好ましくはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡレプリコンである。
　本発明において用いられる核酸は、当業者が通常用いる方法により精製されていることが好ましい。
　一態様において、本発明において用いられる核酸は、ＣｐＧ配列の頻度が低く抑制されており、好ましくはＣｐＧ配列を含まない。ＣｐＧ配列の頻度が低い核酸を用いることにより、細胞内へ導入された核酸が長い期間細胞内へとどまり、その生理的効果が長い期間持続する。例えば、本発明において用いられる核酸としてＣｐＧ配列を含まないプラスミドＤＮＡ（発現ベクター）を用いた場合、目的とする遺伝子をより長い期間持続的に発現させることが可能である。本明細書において、ＣｐＧ配列とは、５’から３’へ向かって、シトシンの次にグアニンが現れるタイプの２塩基配列である。例えば、本発明において用いられる核酸におけるＣｐＧ配列の頻度は、５０塩基につき１個以下、好ましくは１００塩基につき１個以下、よりこのましくは１０００塩基につき１個以下、最も好ましくは、ＣｐＧ配列を含まない。
　また、ＣｐＧ配列は、自然免疫反応を惹起するので、ＣｐＧ配列の頻度が低く抑制された核酸（好ましくは、ＣｐＧ配列を含まない核酸）を本発明において用いることにより、自然免疫反応に起因する、炎症等の副作用の発生を回避することができる。特に、本発明の化合物または脂質膜構造体自体、刺激性が低く、生体内へ投与された時に炎症性サイトカインの産生をほとんど誘導しないため、本発明の脂質膜構造体と、ＣｐＧ配列の頻度が低く抑制された核酸（好ましくは、ＣｐＧ配列を含まない核酸）とを組み合わせて用いることにより、自然免疫反応に起因する炎症等の副作用の発生リスクを最小限に抑制することができる。
　本発明の核酸導入剤を生体内の細胞へ核酸を導入するために用いる態様としては、例えば、疾患の予防および／または治療を目的とした、いわゆる遺伝子治療をはじめとする予防・治療用核酸の生体内（in vivo）投与における使用が挙げられる。従って、本発明の好ましい一実施態様においては、本発明の核酸導入剤により細胞内へ導入される核酸は、ある所定の疾患に対して予防及び／又は治療活性を有するものである。
　本発明の核酸導入剤を用いて、核酸を細胞内へ導入するためには、本発明の脂質膜構造体を形成する際に、目的とする核酸を共存させることにより、該核酸を内封した本発明の脂質構造体を形成させる。例えば、エタノール希釈法によりリポソームを形成する場合、核酸の水溶液と、本発明の脂質膜構造体の構成成分（脂質等）のエタノール溶液とをボルテックス等で激しく混合した後で、混合物を適切な緩衝液で希釈する。単純水和法によりリポソームを形成する場合、本発明の脂質膜構造体の構成成分（脂質等）を適切な有機溶媒に溶解し、該溶液をガラス容器に入れ、減圧乾燥することにより溶媒を留去し、脂質薄膜を得る。ここに、核酸の水溶液を加え、水和させた後に、ソニケーターで超音波処理する。本発明はこのような核酸を内封した上記脂質膜構造体をも提供するものである。
　核酸を内封したリポソームの一形態として、核酸とポリカチオン（例、プロタミン）との間の静電的複合体をリポソームによって封入することで調製される多機能性エンベロープ型ナノ構造体（ＭＥＮＤ；Multifunctional envelope-type nano device、以下、本明細書において「ＭＥＮＤ」と略す場合がある。)を挙げることが出来る（Kogure K et al., Multifunctional envelope-type nano device (MEND) as a non-viral gene delivery system. Adv Drug Deliv Rev. 2008）。この構造体は、核酸などを特定の細胞内に選択的に送達するためのドラッグデリバリーシステムとして用いることができ、例えば、樹状細胞への抗原遺伝子導入によるＤＮＡワクチンや腫瘍の遺伝子治療などに有用である。
　核酸を内封した本発明の脂質膜構造体の表面電荷（ゼータ電位）は、好ましくは－１０～＋１０ｍＶ、さらに好ましくは－１０～＋５ｍＶである。従前の遺伝子導入においては、表面電位がプラスに荷電された粒子が主に用いられてきた。これは、負電荷を有する細胞表面のヘパリン硫酸との静電的相互作用を促進し、細胞への取り込みを促進するための方法としては有用であるが、正の表面電荷は、細胞内において導入遺伝子との相互作用による転写抑制やｍＲＮＡとの相互作用による翻訳抑制を生み出す可能性がある。表面電荷を上記の範囲内に調整することによりこの問題を解決し得る。表面電荷の測定は、Metasizer Nano（Malvern社）を用いて行うことができる。脂質膜構造体の表面電荷は、本発明の化合物を含む脂質膜構造体の構成成分の組成により、調整することができる。
　こうして得られた、核酸を内封した本発明の脂質膜構造体と細胞とを接触させることで、内封された核酸を細胞内へ導入することができる。「細胞」の種類は、特に限定されず、原核生物及び真核生物の細胞を用いることができるが、好ましくは真核生物である。真核生物の種類も、特に限定されず、例えば、ヒトを含む哺乳類（ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウシ等）、鳥類（ニワトリ、ダチョウ等）、両生類（カエル等）、魚類（ゼブラフィッシュ、メダカ等）などの脊椎動物、昆虫（蚕、蛾、ショウジョウバエ等）などの非脊椎動物、植物、酵母等の微生物等が挙げられる。より好ましくは、本発明で対象とされる細胞は、動物もしくは植物細胞、さらに好ましくは哺乳動物細胞である。当該細胞は、癌細胞を含む培養細胞株であっても、個体や組織より単離された細胞、あるいは組織もしくは組織片の細胞であってもよい。また、細胞は接着細胞であっても、非接着細胞であってもよい。
　一態様において、Ｒ３ａ及びＲ３ｂがレチノイン酸残基である、本発明の化合物を用いる場合、核酸を導入する標的となる細胞は、好ましくは細胞内レチノイン酸結合タンパク質ＩＩ（ＣＲＡＢＰＩＩ）を発現する細胞である。ＣＲＡＢＰＩＩは、レチノイン酸をＳＵＭＯ化依存的に核へ輸送する機能を有しており、Ｒ３ａ及びＲ３ｂがレチノイン酸残基である、本発明の化合物を用いた場合、ＣＲＡＢＰＩＩの機能により、核内への核酸の輸送が促進されることが期待される。細胞がＣＲＡＢＰＩＩを発現するか否かは、ウェスタンブロッティング等を用いて確認することができる。ＣＲＡＢＰＩＩを発現する臓器の具体例としては、肌、睾丸、子宮、卵巣、脈絡叢などの正常組織や、種々の癌組織（網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍）であり、また、ＣＲＡＢＰＩＩを発現する細胞の具体例として繊維肉腫細胞（HT1080細胞）、口腔内扁平上皮癌（BHY細胞）、乳癌細胞（KATO3細胞、BT474、MCF-7、MDA-MB-134）等を挙げることができるが、これらに限定されない。
　生体外において核酸を内封した本発明の脂質膜構造体と細胞とを接触させる工程を以下においてより具体的に説明する。
　細胞は当該脂質膜構造体との接触の数日前に適当な培地に懸濁し、適切な条件で培養する。脂質膜構造体との接触時において、細胞は増殖期にあってもよいし、そうでなくてもよい。
　当該接触時の培養液は、血清含培地であっても血清不含培地であってもよいが、培地中の血清濃度は３０％以下が好ましく、２０％以下であることがより好ましい。培地中に過剰な血清等の蛋白質が含まれていると、複合体と細胞との接触が阻害される可能性がある。
　当該接触時の細胞密度は、特に限定されず、細胞の種類等を考慮して適宜設定することが可能であるが、通常１×１０４～１×１０７細胞／ｍＬの範囲である。
　このように調製された細胞に、上述の脂質膜構造体の懸濁液を添加する。複合体含有溶液の添加量は、特に限定されず、細胞数等を考慮して適宜設定することが可能である。細胞へ接触させる際の脂質膜構造体の濃度は、目的とする核酸の細胞内への導入が達成可能な限り特に限定されないが、脂質濃度として、通常１～１００ｎｍｏｌ／ｍｌ、好ましくは１０～５０ｎｍｏｌ／ｍｌであり、核酸の濃度として、通常０．０１～１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．１～１０μｇ／ｍｌである。
　複合体含有溶液を添加後、細胞を培養する、培養時の温度、湿度、ＣＯ２濃度等は、細胞の種類を考慮して適宜設定する。哺乳動物の細胞の場合は、通常約３７℃、湿度約９５％、ＣＯ２濃度は約５％である。また、培養時間も用いる細胞の種類等の条件を考慮して適宜設定することが可能であるが、通常０．１～２４時間、好ましくは０．２５～４時間、より好ましくは０．５～２時間の範囲である。上記培養時間が短すぎると、核酸が十分細胞内へ導入されず、培養時間が長すぎると、細胞が弱ることがある。
　上記培養により、核酸が細胞内へ導入されるが、好ましくは培地を新鮮な培地と交換するか、培地に新鮮な培地を添加して更に培養を続ける。細胞が哺乳動物由来の細胞である場合は、新鮮な培地は血清又は栄養因子を含むことが好ましい。
　また、上記の通り、本発明の脂質膜構造体を用いることで、生体外（in vitro）のみならず、生体内（in vivo）においても核酸を細胞内へ導入することが可能である。即ち、核酸を内封した本発明の脂質膜構造体を対象に投与することにより、該脂質膜構造体が標的細胞へ到達・接触し、生体内で該脂質膜構造体に内封された核酸が細胞内へ導入される。該複合体を投与可能な対象としては、特に限定されず、例えば、ヒトを含む哺乳類（ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウシ等）、鳥類（ニワトリ、ダチョウ等）、両生類（カエル等）、魚類（ゼブラフィッシュ、メダカ等）などの脊椎動物、昆虫（蚕、蛾、ショウジョウバエ等）などの無脊椎動物、植物等を挙げることが出来る。好ましくは、該複合体の投与対象としては、ヒトまたは他の哺乳動物が挙げられる。
　標的細胞の種類は特に限定されず、本発明の脂質膜構造体を用いることで、種々の組織（例、肝臓、腎臓、膵臓、肺、脾臓、心臓、血液、筋肉、骨、脳、胃、小腸、大腸、皮膚、脂肪組織等）中の細胞へ、核酸を導入することが可能である。
　また、該複合体の投与方法は、標的細胞へ該複合体が到達・接触し、該複合体に含まれる導入化合物を細胞内へ導入可能な範囲で特に限定されず、導入化合物の種類や、ターゲット細胞の種類や部位等を考慮して、自体公知の投与方法（経口投与、非経口投与（静脈内投与、筋肉内投与、局所投与、経皮投与、皮下投与、腹腔内投与、スプレー等）等）を適宜選択することができる。該脂質膜構造体の投与量は、化合物の細胞内への導入を達成可能な範囲で特に限定されず、投与対象の種類、投与方法、導入化合物の種類、ターゲット細胞の種類や部位等を考慮して適宜選択することができる。
　本発明の化合物又は脂質膜構造体を、核酸導入剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
　該剤が研究用試薬として提供される場合は、本発明のキャリアは、そのままで、あるいは例えば水もしくはそれ以外の生理学的に許容し得る液（例えば、上述の水溶性溶媒、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯなどの有機溶媒もしくは水溶性溶媒と有機溶媒との混合液等）との無菌性溶液もしくは懸濁液として提供され得る。該剤は適宜、自体公知の生理学的に許容し得る、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤等を含むことが出来る。
　また、該剤が医薬として提供される場合は、本発明のキャリアは、そのままで、あるいは担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などのような医薬上許容される公知の添加剤とともに、一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって経口剤（例えば錠剤、カプセル剤等）あるいは非経口剤（例えば注射剤、スプレー剤等）として製造することができる。
　本発明の核酸導入剤はキットの態様で提供することも可能である。当該キットには、本発明の化合物又は脂質膜構造体に加えて、核酸導入の際に使用する試薬を含むことができる。一態様において、本発明の核酸導入剤（又はキット）は、ポリカチオン（例、プロタミン）を更に含む。当該態様の本発明の核酸導入剤（又はキット）を用いることにより、容易に核酸とポリカチオン（例、プロタミン）との間の静電的複合体を、本発明の脂質膜構造体に封入し、ＭＥＮＤを構成し、核酸の細胞内導入へ供することができる。
（略語の説明）
pDNA: プラスミドＤＮＡ
Chol: Cholesterol
NBD-DOPE:1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazole-4-yl)
DMEM: dulbecco’s modified eagle medium
PEG2000-DSG: 1,2-Distearoyl-sn-glycerol, methoxypolyethylene Glycol (PEG MW 2000)
PEG2000-DMG: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycerol, methoxypolyethylene Glycol (PEG MW 2000)
DOPE: 1,2-Dioleyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
SOPE: 1-Stearoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phsophoethanolamine
SOPC: 1-Stearoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
　以下に本発明の実施例についてさらに詳細に説明する。
　表２に、以下の実施例及び比較例において製造した化合物名称と構造を示した。
[規則91に基づく訂正 26.04.2013]　
Figure WO-DOC-TABLE-2
 
［実施例１］（Ｂ－２の合成）
＜メシル化＞
　２，２’－ジチオジエタノール（ＡＣＲＯＳ社製）１５ｇ（９７．２ｍｍｏｌ）に、アセトニトリル１４３ｍｌを加え、２０～２５℃にて溶解させた。トリエチルアミン３３．３ｇ（３２８ｍｍｏｌ）を加え、２０～２５℃で５分間攪拌した後に、氷冷下にて塩化メタンスルホニル３４．５ｇ（３００ｍｍｏｌ）を加え、２０～２５℃にて３時間反応を行った。ＴＬＣ分析（展開溶媒：クロロホルム／メタノール＝８５／１５（ｖ／ｖ））を行い、反応生成物のスポットが得られたこと、並びに原料である２，２’－ジチオジエタノールが消失したことを確認し反応を終了した。反応溶液にエタノール２９ｍＬを加え反応を停止させた後に、不溶物を濾紙（５Ａ）で濾別した。濾液に、ジクロロメタン１５０ｍｌ、１０％重曹水１５０ｇを加え５分間攪拌を行った後に１０分間静置し、水層を除去した。次に、有機層に水１５０ｇを加え５分間攪拌を行った後に１０分間静置し、水層を除去した。水洗を４回繰り返した後に、有機層を回収し、硫酸ナトリウム４．５ｇを加え脱水を行った。脱水処理後に、オプライト、濾紙（５Ａ）にてろ過を行い、エバポレーターを用いて濾液の溶媒を留去し褐色液体２９．４ｇを得た。
＜３級アミノ化＞
　ジメシル体５．０ｇ（１６ｍｍｏｌ）にアセトニトリル１２７ｍｌを加え４０℃にて溶解させ、更に炭酸カリウム５．５ｇ（３９．８ｍｍｏｌ）を加え２５℃で５分間攪拌した。３－（メチルアミノ）－１－プロパノール（東京化成工業社製）７．２ｇ（８０．８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル９．２ｍｌにて２５℃で溶解させた後に、上記のジメシル体／アセトニトリル溶液に１．５時間かけて滴下した。滴下終了２時間後にＴＬＣ分析（展開溶媒：クロロホルム／メタノール／２８％アンモニア水＝８０／２０／２（ｖ／ｖ／ｖ））を行い、反応が終了したことを確認した。濾紙（５Ａ）にて炭酸カリウムを濾別した後にエバポレーターを用いて溶媒を留去し、褐色液体１３．２ｇを得た。得られた褐色液体をクロロホルム１３２ｍｌを用いて溶解させた後に、１０％食塩水１３２ｍｌを加え洗浄を行った。水層を廃棄し、１０％食塩水洗浄を５回繰り返すことで原料である３－（メチルアミノ）－１－プロパノールを除去した。クロロホルム層を回収した後に、エバポレーターを用いて溶媒を留去し、淡黄色透明の液体（以下ｄｉ－ＭＡＰ体）４．３ｇを得た。
＜アシル化＞
　ミリスチン酸１．５ｇ（６．７ｍｍｏｌ）をジクロロメタン５．８ｍｌに溶解させた後に、ＤＭＡＰ０．０８２ｇ（０．６７ｍｍｏｌ）を加え、ＴＥＡ０．６８ｇ（６．７ｍｍｏｌ）を氷冷下にて加えた。この溶液に、ｄｉ－ＭＡＰ体１ｇ（３．４ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルカルボジイミド（以下ＤＩＣ）１．７ｇ（１３．５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン５．８ｍｌに溶解させた溶液を１時間かけて滴下した。滴下終了後から２時間後のＴＬＣ分析（展開溶媒：クロロホルム／メタノール＝９５／５（ｖ／ｖ））を行った結果より、ｄｉ－ＭＡＰ体が消失したことを確認し反応を終了した。濾紙（５Ａ）を用いて不溶分を濾別した後に、エバポレーターを用いて溶媒を留去し、無色透明液体７．２ｇを得た。この液体にアセトニトリル３８ｍｌを加え冷却晶析（１０℃）を３回行った。得られた結晶をヘキサン４５ｍｌで溶解させ、そこにアセトニトリル３８ｍｌを加え抽出洗浄を行った。アセトニトリル層を廃棄し、更に抽出洗浄を６回繰り返し、ＤＩＣ、ミリスチン酸由来の不純物を除去した。ヘキサン層を回収した後に、エバポレーターを用いて溶媒を留去し目的物であるＢ－２化合物０．７３ｇを得た。
1H-NMR(400MHz　CDCl3)分析を行った結果
δ0.85～0.9ppm(t、CH3-CH2-、6H)、δ1.22～1.35ppm(m、CH3-(CH2)10-、40H)、δ2.67～2.7ppm(q、-N(CH3)-CH2-CH2-S-、4H)、δ2.78～2.82(q、-N(CH3)-CH2-CH2-S-、4H)、δ4.10～4.13 (t、-CH2-C(O)-O-CH2-、4H)
［実施例２］（Ｂ－２－２の合成）
　ｄｉ－ＭＡＰ体２．０ｇ（６．７ｍｍｏｌ）とステアリン酸４．６ｇ（１６．２ｍｍｏｌ）をクロロホルム２０ｍｌに溶解させた後に、ＤＭＡＰ０．３３ｇ（２．７ｍｍｏｌ）及び１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（以下ＥＤＣ）３．９ｇ（２０．３ｍｍｏｌ）を加えた。反応４時間後のＴＬＣ分析（展開溶媒：クロロホルム／メタノール＝９５／５（ｖ／ｖ））を行った結果より、ｄｉ－ＭＡＰ体が消失したことを確認し反応を終了した。その後、反応液を５％重曹水１０ｇを用いて抽出洗浄した後に、水層を廃棄した。次に、回収した有機層に水１０ｇを加えることにより水洗を行った。水層廃棄後、有機層に硫酸マグネシウム０．４ｇを加えることにより脱水処理を行った。オプライト、濾紙（５Ａ）にて不溶分を濾別し、エバポレーターを用いて溶媒を留去し、橙色の液体（以下ジアシル体）７．９ｇを得た。
　ジアシル体をヘキサン４５ｍｌに溶解させた後に、アセトニトリル３８ｍｌを加え、抽出洗浄を行った。アセトニトリル層を廃棄し、更にヘキサン／アセトニトリル洗浄を２回繰り返した。ヘキサン層を回収し、エバポレーターを用いて溶媒を留去し、無色透明の液体７．１ｇを得た。得られた液体をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製（溶離液：酢酸エチル）し、目的物であるＢ－２－２化合物１．４ｇを得た。
1H-NMR(400MHz　CDCl3)分析を行った結果
δ0.85～0.9ppm(t、CH3-CH2-、6H)、δ1.22～1.35ppm(m、CH3-(CH2)14-、56H)、δ2.67～2.7ppm(q、-N(CH3)-CH2-CH2-S-、4H)、δ2.78～2.82(q、-N(CH3)-CH2-CH2-S-、4H)、δ4.10～4.13 (t、-CH2-C(O)-O-CH2-、4H)
［実施例３］（Ｂ－２－３の合成）
　ｄｉ－ＭＡＰ体２．０ｇ（６．７ｍｍｏｌ）、リノール酸４．５ｇ（１６．０ｍｍｏｌ）をクロロホルム２０ｍｌに溶解させた後に、ＤＭＡＰ０．３３ｇ（２．７ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ３．９ｇ（２０．３ｍｍｏｌ）を加えた。反応４時間後のＴＬＣ分析（展開溶媒：クロロホルム／メタノール＝９５／５（ｖ／ｖ））を行った結果より、ｄｉ－ＭＡＰ体が消失したことを確認し反応を終了した。その後、反応液を５％重曹水１０ｇを用いて抽出洗浄した後に、水層を廃棄した。次に、回収した有機層に水１０ｇを加えることにより水洗を行った。水層廃棄後、有機層に硫酸マグネシウム０．４ｇを加えることにより脱水処理を行った。オプライト、濾紙（５Ａ）にて不溶分を濾別し、エバポレーターを用いて溶媒を留去し、橙色の液体であるジアシル体６．０ｇを得た。
　得られた液体をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝５／５（ｖ／ｖ））し、目的物であるＢ－２－３化合物０．７ｇを得た。
1H-NMR(400MHz　CDCl3)分析を行った結果
δ0.85～0.9ppm(t、CH3-CH2-、6H)、δ1.22～1.35ppm(m、CH3-(CH2)3-、(CH2)4-CH2-CH2-C(O)-O-、28H)、δ2.67～2.7ppm(q、-N(CH3)-CH2-CH2-S-、4H)、δ4.10～4.13 (t、-CH2-C(O)-O-CH2-、4H) 、δ5.30～5.40(m、- CH2- CH- CH- CH2-、8H)
［実施例４］
(B-2-4の合成)
　di-MAP 体0.40 g （1.35 mmol）とレチノイン酸 (all-trans-retinoic acid,和光純薬工業) 0.97 g (3.24mmol)をクロロホルム 6.00 gに溶解させた後に、DMAP 0.07 g (0.54mmol)、EDC 0.78 g (4.05mmol) を加え、25±3℃ にて5 時間反応させた。TLC分析(展開溶媒：クロロホルム/メタノール = 9/1 v/v )により、di-MAP体が消失したことを確認し反応を終了した。エバポレーターを用いて溶媒を留去し、2.70 g の液体を得た。この液体をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製（溶離液：クロロホルム/メタノール = 98/2 (v/v)）し、目的物であるB-2-4化合物0.42gを得た。
1H-NMR(400MHｚ　CDCl3)分析を行った結果
δ1.00～1.10ppm(s、(CH3)2C-、12H)、δ1.45～1.50ppm(t、(CH3)2C-CH2-CH2-、4H)、δ1.55～1.65ppm (m、-CH2-CH2-CH2-、4H)、δ1.70～1.75 (s、-CH2-C(CH3)=C-、6H) 、δ1.80～1.90(t、-N(CH3)-CH2-CH2-CH2-O-C(O)-、4H)、δ1.95～2.0.5(m、-CH2-CH2-C(CH3)=C-、=CH-CH(CH3)=CH-、10H)、δ2.20～2.30(s、-N(CH3)-、6H)、δ2.30～2.40(s、-C(CH3)=CH-C(O)-O-、6H)、δ2.45～2.55(ｔ、-N(CH3)-CH2-CH2-CH2-O-C(O)-、4H)、δ2.65～2.75(t、-N(CH3)-CH2-CH2-S-、4H)、δ2.75～2.85(t、-N(CH3)-CH2-CH2-S-、4H)、δ4.10～4.25(t、-N(CH3)-CH2-CH2- CH2-O-C(O)-、4H) 、δ5.75～5.85(t、-C(O)-O-CH2-CH2-O-C(O)-、4H)
［実施例５］
(B-2-5の合成)
　di-MAP 体 0.50 g (1.69 mmol)とD-α-tocopherol succinate (SIGMA-ALDRICH) 2.15 g (4.06mmol)をクロロホルム 7.50 g,に溶解させた後に、DMAP 0.08 g (0.62mmol)、EDC 0.97 g (5.07mmol) を加え、25±3℃ にて4 時間反応させた。TLC分析(展開溶媒：クロロホルム/メタノール = 9/1 v/v )により、di-MAP体が消失したことを確認し反応を終了した。エバポレーターを用いて溶媒を留去し、2.23gの液体を得た。この液体をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製（溶離液：クロロホルム/メタノール = 98.5/1.5 (v/v)）し、目的物であるB-2-5化合物 0.94gを得た。
1H-NMR(400MHｚ　CDCl3)分析を行った結果
δ0.85～0.9ppm(t、CH3-CH2-、-CH2-(CH3-)CH-CH2-、24H)、δ1.00～1.75ppm(m、CH3-CH(CH3)-(CH2)3-CH(CH3)-(CH2)3-CH(CH3)-(CH2)3-、42H)、δ1.75～1.85ppm (q、-N(CH3)-CH2-CH2- CH2-O-C(O)-、4H)、δ1.95～2.15 (s、-C=C(CH3)-、18H) 、δ2.20～2.30(s、-N(CH3)-、6H)、δ2.40～2.50(t、-N(CH3)-CH2-CH2-S-、4H)、δ2.50～2.63(t、-CH2-CH2-CH=CH-、4H)、δ2.63～2.70(t、-N(CH3)-CH2-CH2-S-、4H)、δ2.70～2.85(m、-N(CH3)-CH2-CH2- CH2-O-C(O)-、-C(O)-O-CH2-CH2-O-C(O)-、8H)、δ2.85～3.00(t、-C(O)-O-CH2-CH2-O-C(O)-、4H)、δ4.10～4.25(t、-N(CH3)-CH2-CH2-CH2-O-C(O)-、4H)
［比較例１］
（Ｂ－２－１の合成）
　ジスルフィド結合を有する本発明との比較を行う意図で、実施例１の化合物のジスルフィド結合を炭素結合に置換した化合物の合成を行った。
＜三級アミノ化＞
　１，６－ジブロモヘキサン（東京化成工業社製）６．０ｇ（２４．６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ１２．７ｍｌに溶解させ、３－（メチルアミノ）－１－プロパノール（東京化成工業社製）６．６ｇ（７３．７ｍｍｏｌ）と炭酸カリウム１．７ｇ（１２．３ｍｍｏｌ）を加え、２０～２５℃にて３時間攪拌した。ＴＬＣ（展開溶媒：クロロホルム／メタノール／２８％アンモニア水溶液＝８０／２０／２（ｖ／ｖ／ｖ））にて反応の進行を確認した。反応液中の炭酸カリウムを濾紙（５Ａ）を用いて濾別した後、エバポレーターを用いて溶媒を留去し、褐色液体を得た。得られた褐色液体をクロロホルム２０ｍｌで溶解させ、水３０ｇを用いて抽出洗浄した。有機層の溶媒をエバポレーターを用いて留去し、褐色液体３．６ｇを得た。
＜アシル化＞
　得られた液体２．０ｇ、ミリスチン酸４．０ｇ（１８．４ｍｍｏｌ）をクロロホルム２０ｍｌに溶解させた後に、ＤＭＡＰ０．３７ｇ（３．０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ４．４ｇ（２３．１ｍｍｏｌ）を加えた。反応４時間後のＴＬＣ分析（展開溶媒：クロロホルム／メタノール＝８５／１５（ｖ／ｖ））を行った結果より、原料が消失したことを確認し反応を終了した。その後、反応液を５％重曹水１０ｇを用いて抽出洗浄した後に、水層を廃棄した。次に、回収した有機層に水１０ｇを加えることにより水洗を行った。水層廃棄後、有機層に硫酸ナトリウム２ｇを加えることにより脱水処理を行った。オプライト、濾紙（５Ａ）にて不溶分を濾別し、エバポレーターを用いて溶媒を留去した。得られた濃縮物をヘキサン４７ｍｌに溶解し、アセトニトリル３９ｍｌを用いて抽出洗浄した。ヘキサン層を回収し、エバポレーターを用いて溶媒を留去し、目的物であるＢ２－２－１化合物２．８３ｇを得た。
1H-NMR(400MHz　CDCl3)分析を行った結果
δ0.85～0.9ppm(t、CH3-CH2-、6H)、δ1.22～1.35ppm(m、CH3-(CH2)10-、-N(CH3)-CH2-CH2-CH2-、44H)、δ1.40～1.50ppm(m、-N(CH3)-CH2-CH2-CH2-、4H)、δ2.37～2.41(t、-N(CH3)-CH2-CH2-CH2-、4H)、δ4.08～4.12 (t、-CH2-C(O)-O-CH2-、4H)
［試験例１］　各種ＭＥＮＤの調製
（１）プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）とプロタミンからなる核酸静電的複合体の形成
　ベクターのコアとして、ルシフェラーゼ遺伝子をコードするｐＤＮＡ溶液、プロタミン（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）溶液を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液でそれぞれ０．３ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬに希釈し、０．３ｍｇ／ｍＬ ｐＤＮＡ１２５μＬを攪拌しながら０．２４ｍｇ／ｍＬ プロタミン１２５μＬを少量ずつ滴下してプロタミンとｐＤＮＡの静電的複合体を調製した（Ｎ／Ｐ比＝１．２）。下記の（２）記載の方法による方法においては、ｐＨが５．３の１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液を用い、また、（３）記載の方法においては、ｐＨが７．４の１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液を用いた。
（２）エタノール希釈法によるＭＥＮＤの調製
　脂質のエタノール溶液は、エッペンドルフチューブに５ｍＭのカチオン性脂質、５ｍＭリン脂質、５ｍＭ コレステロール（Ｃｈｏｌ）を総脂質１６５ｎｍｏｌになるように目的の割合で混合し、各種ＰＥＧ脂質（１ｍＭ エタノール溶液）をさらに総脂質の３モル％相当量添加し、全量で１００μＬとなるようにエタノールを加えた。脂質溶液をボルテックスミキサーを用いて攪拌しながら、［試験例１］（１）で調製した核酸静電的複合体１００μＬ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ；ｐＨ５．３）を素早く加え、その後ｐＨ５．３に調製した１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液１．８ｍＬを加え、エタノール濃度が５％になるまで希釈した。Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ４（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用い、遠心条件（室温，２２６７ｒｐｍ，２０ｍｉｎ）で約５０μＬまで限外濾過し濃縮した。その後、ｐＨ７．４に調製した１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液を用いて４ｍＬまでメスアップし、再度、室温条件で遠心（２２６７ｒｐｍ，２０ｍｉｎ）を行うことで濃縮した。最後に、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で目的の脂質濃度になるようメスアップした。
（３）単純水和法によるＭＥＮＤの調製
　ガラス試験管にＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ＝３：４：３となるように、各脂質のクロロホルム溶液５ｍＭ ＤＯＴＡＰ２４．７５μＬ、５ｍＭ ＤＯＰＥ３３μＬ、５ｍＭ Ｃｈｏｌ２４．７５μＬを混ぜ、総脂質量は４１２．５ｎｍｏｌとなるようにした。全量で２５０μＬとなるようにエタノールを加え、デシケーターで減圧乾燥し、溶媒を留去して脂質薄膜を得た。脂質薄膜に総脂質濃度が１．６５ｍＭとなるように［試験例１］（１）で調製した遺伝子静電的複合体２５０μＬ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ；ｐＨ７．４）を添加し、室温で１０ｍｉｎ静置し水和させた後、ソニケーター（アイワ医科工業株式会社）で１分間超音波処理した。
（４）ローダミン標識化ｐＤＮＡを用いたＭＥＮＤの調製
　ローダミン標識ｐＤＮＡは、Ｌａｂｅｌ／ＩＴ ＣＸ－Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｍｉｒｕｓ）を用いて添付プロトコルに従い調製した。得られたローダミン標識ｐＤＮＡ溶液は、Ｎａｎｏ Ｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、濃度を算出した。ローダミン標識されたｐＤＮＡが封入されたＭＥＮＤを調製する際には、［試験例１］（１）に記載したｐＤＮＡ溶液をすべてローダミン標識されたｐＤＮＡに置き換え、［試験例１］（２）、（３）に記載の方法に従いＭＥＮＤを調製した。
（５）脂質膜が蛍光標識されたＭＥＮＤの調製
［試験例１］
　（２）、（３）に記載されたＭＥＮＤの調製時に、ＮＢＤ－ＤＯＰＥ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）のエタノール溶液を総脂質量の１モル％相当分加えることで、脂質膜が蛍光ラベルされたＭＥＮＤの調製を行った。
［試験例２］
　各種ＭＥＮＤの粒子径、及び表面電位の測定
　粒子径並びに表面電位は、動的光散乱法（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ；Ｍａｌｖｅ　Ｒｎ社）を用いて測定した。［試験例１］の調製法により調製された各種ＭＥＮＤの粒子径、表面電位を表３に示す。Ｂ－２やＤＯＤＡＰでは、生理的ｐＨにおいて、電荷は好ましい形態である－１０～＋１０ｍＶであるのに対し、Ｂ－２－１においては、＋１２．３と＋１０ｍＶ以上の電荷を帯びていた。
　また、公知のカチオン性脂質であるＤＯＴＡＰを用いたＭＥＮＤでは表面電位は＋５０ｍＶ程度であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
  
［試験例３］
　還元的環境でのリポソーム崩壊試験
　ＴＮＳを用いた各種ＭＥＮＤの還元的環境下における脂質膜不安定性の評価
　各種ＭＥＮＤ溶液に終濃度１０ｍＭとなるようにＤＴＴを加え３７℃で静置した。０、１、２、４、８、２４時間後のタイムポイントにおいてＴＮＳ（６－（ｐ－Ｔｏｌｕｄｉｎｏ）－２－Ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ Ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）による蛍光強度を測定した。ＭＥＮＤ溶液を０．５ｍＭへと希釈し、０．５ｍＭ ＭＥＮＤ溶液１２μＬ、酸性ｐＨ（ｐＨ４．０）の２０ｍＭクエン酸緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有）を１８６μＬ、０．６ｍＭ ＴＮＳ２μＬを蛍光測定用９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（ｎｕｎｃ社）へ加え、励起波長３２１ｎｍ、検出波長４４７ｎｍで、３７℃での蛍光強度を測定した。コントロールとして、ＤＴＴを含んでいない同量の１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液を０時間で加え、各時間３７℃で静置したＭＥＮＤ溶液を用い、同様の処理によりＴＮＳによる蛍光強度測定を行った。コントロールの蛍光強度で還元環境下の蛍光強度を除したものを、脂質膜の不安定化の指標としている。結果を図１に示す。
　この結果、ジスルフィド結合を持たないＤＯＤＡＰ及びＢ－２－１においては、ＤＴＴ処理によるＴＮＳの蛍光減弱は観察されなかった。一方、Ｂ－２においては、時間依存的なＴＮＳによる蛍光の消失が認められた。ＴＮＳは、ｐＨ４．０の酸性環境下において、正の表面電位を有する粒子表面に静電的相互作用を介して吸着し、また、リポソームの脂質構造部位の脂溶性環境に応じて蛍光を発するものである。本結果のような、Ｂ－２における蛍光の消失は、脂溶性環境の喪失に依存したものであると考えられ、脂質の分解に伴う脂質膜構造の崩壊を示唆するものである。
［試験例４］
　遺伝子発現及び細胞内取り込み活性評価
（１）ＭＥＮＤの細胞内取り込み量評価
　カチオン性脂質としてＢ－２（実施例１）、Ｂ－２－１（比較例１）、ＤＯＤＡＰ（比較例２）を用い、カチオン性脂質：ＳＯＰＥ：Ｃｈｏｌ＝３：４：３からなる組成のＭＥＮＤを［試験例１］（２）に記載の方法に従い調製した。本調製においては、ＰＥＧ脂質としてＰＥＧ２０００ＤＳＧを用い、脂質濃度に換算して０．５５ｍＭ相当のＭＥＮＤ溶液を調製した。また、カチオン性ＭＥＮＤにおいては、ＤＯＴＡＰ（比較例３）：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ：＝３：４：３の組成からなる脂質を用い、［試験例１］（３）に記載の方法に従い調製した。各種ＭＥＮＤの脂質を蛍光ラベルする際には、［試験例１］（５）に記載の方法で行った。
　２４時間前に６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに、ＨＴ１０８０細胞を２×１０５ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／ｗｅｌｌで播種し、各種サンプルＭＥＮＤを脂質濃度２７．５ｎｍｏｌ／１ｍＬ／ｗｅｌｌになるようにＤＭＥＭ（ＦＢＳ＋）で希釈しウェルにトランスフェクションした。１時間後にＭＥＮＤ含有ＤＭＥＭを除去し、ヘパリン（２０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）１ｍＬで２回細胞を洗浄し、さらにＰＢＳ（－）１ｍＬで１回洗浄した。０．０５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ溶液５００μＬを添加した後、３７℃インキュベーターに３分静置した。ＤＭＥＭ（ＦＢＳ＋）１ｍＬを入れて遠心（７００ｇ、４℃、５ｍｉｎ）したのち、上清を除去してＦＡＣＳ緩衝液１ｍＬに懸濁させた。懸濁液を遠心（７００ｇ、４℃、５分）し、上清を除去した後再びＦＡＣＳ緩衝液５００μＬに懸濁させた。測定直前に４４μｍのナイロンメッシュに通し、細胞内のＮＢＤの蛍光強度を測定した。結果を図２に示す。
　蛍光標識した脂質であるＮＢＤ－ＤＯＰＥをＭＥＮＤの脂質膜に修飾し、ＭＥＮＤの細胞内取り込みを評価した結果、生理的ｐＨ（ｐＨ＝７．４）でカチオン性を有するＢ－２－１及びＤＯＴＡＰを用いたものに比べ、中性の粒子であるＢ－２及びＤＯＤＡＰの取り込み量は、未処理群（バックグラウンド）よりも優位に高いものの極めて低いものであった。
（２）ＭＥＮＤの遺伝子発現評価
　カチオン性脂質としてＢ－２（実施例１）、Ｂ－２－１（比較例１）、ＤＯＤＡＰ（比較例２）を用い、カチオン性脂質：ＳＯＰＥ：Ｃｈｏｌ＝３：４：３からなる組成のＭＥＮＤを［試験例１］（２）に記載の方法に従い調製した。本調製においては、ＰＥＧ脂質としてＰＥＧ２０００ＤＳＧを用い、脂質濃度に換算して０．５５ｍＭ相当のＭＥＮＤ溶液を調製した。また、カチオン性ＭＥＮＤにおいては、ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ：＝３：４：３の組成からなる脂質を用い、［試験例１］（３）に記載の方法に従い調製した。
　２４時間前に２４－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにＨＴ１０８０細胞を４×１０４ ｃｅｌｌ／５００μＬ／ｗｅｌｌで播種し、各種ＭＥＮＤをｐＤＮＡ量に換算して０．４μｇ／５００μＬ／ｗｅｌｌとなるようにＤＭＥＭ（ＦＢＳ１０％＋）で希釈し、トランスフェクションした。２４時間後、ＰＢＳ（－）５００μＬで細胞を洗浄した後、１×ｌｙｓｉｓ緩衝液を各ｗｅｌｌに対して７５μＬずつ加え、－８０℃で３０分以上放置した。凍結させた２４－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅを氷上で解凍し、セルスクレーパーで細胞を剥がし、全量をエッペンドルフチューブに移し（１５０００ｒｐｍ、４℃、５ｍｉｎ）の条件で遠心分離した。上清５０μＬを別のエッペンドルフチューブに回収し、これをルシフェラーゼアッセイとＢＣＡアッセイに用いた。
　２０μＬをＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ５０μＬと混合し、ルミノメーターで一定時間内におけるルシフェラーゼ活性を測定した。また、得られたライセートをＤＤＷで５倍希釈し、全体で２５μＬとした。そこにＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔを２００μＬ添加、混合し３７℃で３０分静置した。その後、５６２ｎｍにおける吸光度を測定し、濃度既知のＢＳＡ溶液の吸光度から、サンプルのタンパク質量を算出した。ルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ）をタンパク質量（ｍｇ）で除することで補正を行い、細胞タンパク量あたりのルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）を算出した。結果を図３に示す。
　Ｂ－２及びＢ－２－１から形成されるＭＥＮＤの活性は、従来公知のカチオン性脂質であるＤＯＤＡＰの活性を上回った。また、Ｂ－２から調製されるＭＥＮＤの活性は、Ｂ－２－１から形成されるＭＥＮＤと比較して有意に高かった。特にＢ－２においては、従来公知のカチオン性脂質であるＤＯＴＡＰと同程度の活性が得られた。
　Ｂ－２からなるＭＥＮＤは、カチオン性脂質ＤＯＴＡＰから形成されるＭＥＮＤと比較して細胞内への取り込みが低いのに関わらず、同等の遺伝子発現活性を有することが明らかとなった。遺伝子導入活性を［試験例４］（１）から得られた細胞内取り込み量で除した値を図４に示す。従来のＤＯＴＡＰやＤＯＤＡＰあるいは、ジスルフィド基をもたないＢ－２－１と比較して、Ｂ－２の値が高いことから、細胞内に取り込まれた後の細胞内動態特性が優れていることが示された。
［試験例５］
　遺伝子発現活性
　Ｂ－２（実施例１）及び、Ｂ－２－２（実施例２）、Ｂ－２－３（実施例３）をカチオン性脂質として、カチオン性脂質：ＳＯＰＥ：Ｃｈｏｌ＝３：４：３からなる組成のＭＥＮＤを［試験例１］（２）に記載の方法に従い調製した。本調製においては、ＰＥＧ脂質としてＰＥＧ２０００－ＤＳＧを用い、脂質濃度に換算して０．５５ｍＭ相当のＭＥＮＤ溶液を調製した。遺伝子発現評価は、［実施例４］（２）に記載の方法で行った。結果を図５に示す。
　Ｂ－２－２及びＢ－２－３から形成されるＭＥＮＤは、Ｂ－２の活性には劣るものの、従来型のｐＨ応答脂質カチオン性脂質であるＤＯＤＡＰの活性を超えることが明らかとなった。
［試験例６］
　細胞内動態（エンドソーム脱出効率）
　ＭＥＮＤ調製には、［試験例１］（４）の方法で調製されたＲｈｏｄａｍｉｎｅ標識ｐＤＮＡを用いた。　カチオン性脂質：ＳＯＰＥ：Ｃｈｏｌ＝５：３：２からなる組成のＭＥＮＤを［試験例１］（２）に記載の方法に従い調製した。本調製においては、ＰＥＧ脂質としてＰＥＧ２０００－ＤＭＧを用い、脂質濃度に換算して０．５５ｍＭ相当のＭＥＮＤ溶液を調製した。また、カチオン性ＭＥＮＤにおいては、ＤＯＴＡＰ（比較例３）：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ：＝３：４：３の組成からなる脂質を用い、［試験例１］（３）に記載の方法に従い調製した。また、ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ：＝３：４：３の脂質組成を有するカチオン性ＭＥＮＤも単純水和法により調製し、脂質濃度として０．５５ｍＭとした。
　２４時間前にガラスボトムディッシュにＨＴ１０８０細胞を１×１０５ｃｅｌｌ／２ｍＬ／ｄｉｓｈで播種し、Ｂ－２、ＤＯＤＡＰからなるＭＥＮＤは細胞への取り込み活性が低いことからｐＤＮＡ８μｇ／１ｍＬ Ｋｒｅｂｓ緩衝液／ｄｉｓｈとなるようＭＥＮＤをＫｒｅｂｓ緩衝液で希釈し、また、取り込み活性の高いＢ－２－１、ＤＯＴＡＰ ＭＥＮＤはｐＤＮＡ１．６μｇ／１ｍＬ Ｋｒｅｂｓ緩衝液／ｄｉｓｈとなるようＭＥＮＤをＫｒｅｂｓ緩衝液で希釈して細胞にトランスフェクションした。２．５時間後、Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を１μＬ／ｄｉｓｈで添加し、さらに３０分後にＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｄｏｊｉｎｄｏ）を１μＬ／ｄｉｓｈで添加した。トランスフェクションの３時間後に、ヘパリン（２０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）２ｍＬで２度洗浄し、Ｋｒｅｂｓ緩衝液を１ｍＬ加え、共焦点レーザースキャン顕微鏡で観察した。結果を図６に示す。また、本結果を定量化した結果を図７に示す。
　Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ標識したｐＤＮＡ、エンドソーム・ライソソーム、核をそれぞれ赤、緑、青色で擬似カラー表示した。赤と緑の共局在を見ることでエンドソーム脱出能を評価した。Ｂ－２、Ｂ－２－１及びＤＯＴＡＰは赤色単独のシグナルが存在し、エンドソーム脱出能は各ＭＥＮＤとも高いと思われる。一方、ＤＯＤＡＰは赤と緑の共局在が目立ち、黄色のドットが観察された。これより、エンドソーム脱出能は、Ｂ－２やＢ－２－１を用いて形成されるＭＥＮＤのほうがＤＯＤＡＰを用いたＭＥＮＤと比較して良好であることが示唆された。さらに遺伝子のエンドソーム脱出効率を定量化した結果、ＤＯＤＡＰ＜Ｂ－２－１＜Ｂ－２の順に高くなることが示された。
［試験例７］
　細胞内動態（脱被覆効率）
　ＭＥＮＤ調製には、［試験例１］（４）の方法で調製されたＲｈｏｄａｍｉｎｅ標識ｐＤＮＡを用いた。また、ＭＥＮＤを構成する脂質の蛍光ラベル化は、［試験例１］（３）に記載の方法により行った。カチオン性脂質：ＳＯＰＥ：Ｃｈｏｌ＝５：３：２からなる組成のＭＥＮＤを［試験例１］（２）に記載の方法に従い調製した。本調製においては、ＰＥＧ脂質としてＰＥＧ２０００－ＤＭＧを用い、脂質濃度に換算して０．５５ｍＭ相当のＭＥＮＤ溶液を調製した。また、カチオン性ＭＥＮＤにおいては、ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ：＝３：４：３の組成からなる脂質を用い、［試験例１］（３）に記載の方法に従い調製した。
　２４時間前にガラスボトムディッシュにＨＴ１０８０細胞を１×１０５ｃｅｌｌ／２ｍＬ／ｄｉｓｈで播種し、Ｂ－２ ＭＥＮＤはｐＤＮＡ８μｇ／１ｍＬ Ｋｒｅｂｓ緩衝液／ｄｉｓｈとなるようＭＥＮＤをＫｒｅｂｓ緩衝液で希釈した。Ｂ－２－１、ＤＯＴＡＰ　ＭＥＮＤはｐＤＮＡ１．６μｇ／１ｍＬ Ｋｒｅｂｓ緩衝液／ｄｉｓｈとなるようＭＥＮＤをＫｒｅｂｓ緩衝液で希釈してトランスフェクションした。２．５時間後にＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２を１μＬ／ｄｉｓｈで添加し、さらに３０分後にヘパリン溶液（２０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）２ｍＬで２度洗浄し、Ｋｒｅｂｓ緩衝液を１ｍＬ加え、共焦点レーザースキャン顕微鏡で観察した。結果を図８に示す。
　Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ標識したｐＤＮＡ、ＭＥＮＤの脂質膜、核をそれぞれ赤、緑、青色で擬似カラー表示した。Ｂ－２とＤＯＴＡＰは赤のドットが目立ち、遺伝子は細胞内で効率的にＭＥＮＤから解離していると考えられる。一方、Ｂ－２－１は明らかに赤と緑が共局在し、ほぼすべてのｐＤＮＡが黄色のドットとして観察された。これより、Ｂ－２ ＭＥＮＤの遺伝子の脱被覆化効率はＢ－２－１ ＭＥＮＤより優れていると考えられる。
［試験例８］
　ｉｎ ｖｉｖｏにおける遺伝子発現活性、及び活性持続時間
（１）ｉｎ ｖｉｖｏ投与用ＭＥＮＤの調製
　ベクターのコアとして、ルシフェラーゼ遺伝子をコードするｐＤＮＡ溶液、プロタミン（メーカー）溶液をそれぞれ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液でそれぞれ０．３ｍｇ／ｍＬ、０．２４ｍｇ／ｍＬに希釈し、０．３ｍｇ／ｍＬ ｐＤＮＡ４００μＬを攪拌しながら０．２３ｍｇ／ｍＬのプロタミン溶液を４００μＬを少量ずつ滴下してプロタミンとｐＤＮＡの静電的複合体を調製した（Ｎ／Ｐ比＝１．２）。
　脂質のエタノール溶液は、エッペンドルフチューブに５ｍＭのＢ－２、５ｍＭ ＳＯＰＣ、５ｍＭ ＣｈｏｌをＢ－２：ＳＯＰＣ：Ｃｈｏｌ＝３：４：３の比率で、総脂質１．６５ｍＭになるように混合した。さらにＰＥＧ脂質としてＰＥＧ２０００－ＤＳＧを総脂質量に対して１０モル％相当量加え、全量で７５０μＬとなるようにエタノールを加えた。遺伝子・プロタミンからなる静電的複合体溶液７５０μＬを脂質溶液７５０μＬと混合し、素早く撹拌した後、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ溶液（ｐＨ５．３）で１５ｍＬに希釈し、Ａｍｉｃｏｎ(R) Ｕｌｔｒａ－１５ １００Ｋ ｄｅｖｉｃｅを用い、３，０００ｒｐｍ，１５分，２５℃で限外ろ過を行った。限外ろ過後の溶液を１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈し、再び限外ろ過を行った。この溶液を１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液で７５０μＬに希釈した。
（２）Ｂ－２ ＭＥＮＤの遺伝子発現活性の時間依存性の検討
　（１）の項で示した方法で調製したＭＥＮＤ溶液、及び肝臓で高い遺伝子発現を有している、ＭＰＣ／ＧＡＬＡを使用したカチオン性ＭＥＮＤ（Ukawa et al., Biomaterials., 31(24) 6355-6362(2010)）を各々４０μｇ ＤＮＡ相当、５週齢の雄のＩＣＲマウスに尾静脈投与した。６、２４、４８、７２時間後にマウスを頸椎脱臼法によって安楽死させ、肝臓・肺・脾臓を摘出し、液体窒素で凍結処理した。これをＬｙｓｉｓ緩衝液中で融解させ、ホモジネートの作製を行った。これを１３，０００ｒｐｍ，１０分，４℃で遠心し、上清を採取し、これを測定サンプルとした。サンプル溶液２０μＬをルシフェラーゼ基質５０μＬと混合し、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｅｒ－ＰＳＮ（ＡＢ２２００ ＡＴＴＯ）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。また、サンプル中のタンパク質濃度を、ＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔを用いて定量し、遺伝子発現活性をＲＬＵ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎとして測定した。結果を図９及び図１０に示す。
　ＭＰＣ／ＧＡＬＡを使用したカチオン性ＭＥＮＤでは、６時間後に遺伝子発現活性がピークとなり、その後、時間とともに急速に遺伝子発現が低下することが明らかとなった。一般的なカチオン性リポプレックスと同じ傾向であった（Sakurai et al., Journal of Controlled Release 17 (2007) 430-437)。一方、Ｂ－２ ＭＥＮＤでは、緩やかに遺伝子発現活性が上昇していき、４８時間後に最大となった。これらの結果より、Ｂ－２ ＭＥＮＤは従来型のベクターよりも発現持続性に富んでいることが示唆された（図９）。
　また、従来のカチオン性ＭＥＮＤでは臓器選択性が乏しく、肝臓と同等程度の遺伝子発現活性が肺や脾臓においてもみられるが、Ｂ－２ ＭＥＮＤでは、肺や脾臓における遺伝子発現活性はバックグラウンドレベルであり、臓器選択性（特に、肝臓選択性）に優れていることが示された（図１０）。
［試験例９］
　エンドソーム、ライソソーム酸性化阻害による遺伝子発現活性への影響
　カチオン性脂質としてＢ－２（実施例１）、Ｂ－２－１（比較例１）、ＤＯＤＡＰ（比較例２）を用い、カチオン性脂質：ＳＯＰＥ：Ｃｈｏｌ＝５：３：２からなる組成のＭＥＮＤを［試験例１］（２）に記載の方法に従い調製した。本調製においては、ＰＥＧ脂質としてＰＥＧ２０００－ＤＭＧを用い、脂質濃度に換算して０．５５ｍＭ相当のＭＥＮＤ溶液を調製した。また、カチオン性ＭＥＮＤにおいては、ＤＯＴＡＰ（比較例３）：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ：＝３：４：３の組成からなる脂質を用い、［試験例１］（３）に記載の方法に従い調製した。
　２４時間前に２４－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにＨＴ１０８０細胞を４×１０４ ｃｅｌｌ／５００μＬ／ｗｅｌｌで播種し、３０分前にバフィロマイシンＡ１を０．５μＭになるよう添加し、前処理を行った。各種ＭＥＮＤをｐＤＮＡ量に換算して０．４μｇ／５００μＬ／ｗｅｌｌとなるようにＤＭＥＭ（ＦＢＳ１０％＋）で希釈し、バフィロマイシンＡ１を０．５μＭになるよう添加し、トランスフェクションした。３時間後にＭＥＮＤ溶液を除去し、ＤＭＥＭ（ＦＢＳ１０％＋）を５００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう添加し、メディウムチェンジした。２４時間後、ＰＢＳ（－）５００μＬで細胞を洗浄した後、１×ｌｙｓｉｓ緩衝液を各ｗｅｌｌに対して７５μＬずつ加え、－８０℃で３０分以上放置した。凍結させた２４－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅを氷上で解凍し、セルスクレーパーで細胞を剥がし、全量をエッペンドルフチューブに移し（１５０００ｒｐｍ、４℃、５ｍｉｎ）の条件で遠心分離した。上清５０μＬを別のエッペンドルフチューブに回収し、これをルシフェラーゼアッセイとＢＣＡアッセイに用いた。遺伝子発現評価は、［試験例４］（２）に記載の方法で行った。
　この結果、生理的ｐＨ環境下でカチオン性であるＢ－２－１及びＤＯＴＡＰにおいては、遺伝子発現活性の低下は観察されなかった。一方、Ｂ－２、ＤＯＤＡＰにおいては、遺伝子発現活性の低下が認められた。本結果から、Ｂ－２、ＤＯＤＡＰにおける遺伝子発現活性には、エンドソーム酸性化による脂質膜の正電荷帯電が寄与することが示唆された(図１１)。
［試験例１０］
　試験管内翻訳反応に対する影響の評価
　Ｒａｂｂｉｔ　Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ　Ｌｙｓａｔｅ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｔｒｅａｔｅｄ（ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いた試験管内翻訳系に対する阻害効果の評価
　Ｂ－２：ＳＯＰＥ：Ｃｈｏｌ＝５：３：２からなる組成のＭＥＮＤを［試験例１］（２）に記載の方法に従い調製した。本調製においては、ＰＥＧ脂質としてＰＥＧ２０００－ＤＭＧを用い、脂質濃度に換算して０．５５ｍＭ相当のＭＥＮＤ溶液を調製した。また、カチオン性ＭＥＮＤにおいては、ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ：＝３：４：３の組成からなる脂質を用い、［試験例１］（３）に記載の方法に従い調製した。
　ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅのｍＲＮＡ溶液を０．００５μｇ／μＬとなるよう希釈した。ｍＲＮＡ溶液１μＬに対し、各種ＭＥＮＤ溶液を０．０６２５、０．１２５、０．２５μｇとなるよう加え全量を６．５μＬとした。　ＲＲＬ（Ｒａｂｉｔ　Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ　Ｌｙｓａｔｅ）１７．５μＬ、ＡＡＭ（Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄ　Ｍｉｘｔｕｒｅ）－Ｍｅｔ０．２５μＬ、ＡＡＭ－Ｌｅｕ０．２５μＬ、ＲＲＩ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）０．５μＬを混合したものを加え、３０℃で９０分静置した。
　１０μＬをＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ５０μＬと混合し、ルミノメーターで一定時間内におけるルシフェラーゼ活性を測定した。また、得られた反応溶液をＤＤＷで５００倍希釈し、全体で２５μＬとした。そこにＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔを２００μＬ添加、混合し３７℃で３０分静置した。その後、５６２ｎｍにおける吸光度を測定し、濃度既知のＢＳＡ溶液の吸光度から、サンプルのタンパク質量を算出した。ルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ）をタンパク質量（ｍｇ）で除することで補正を行い、細胞タンパク量あたりのルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）を算出した。結果を(図１２)に示す。
　この結果、ＤＯＴＡＰを用いたＭＥＮＤにおいて試験管内翻訳反応に有意な阻害効果が観察されたが、Ｂ－２を用いたものでは観察されなかった。これより、Ｂ－２は細胞内における核酸との相互作用が小さいと考えられる。
［試験例１１］
血清耐性評価
　Ｂ－２（実施例１）：ＳＯＰＥ：Ｃｈｏｌ＝３：４：３あるいは、Ｂ－２（実施例１）：ＳＯＰＣ：Ｃｈｏｌ＝３：４：３からなる組成のＭＥＮＤを［試験例１］（２）に記載の方法に従い調製した。本調製においては、ＰＥＧ脂質としてＰＥＧ２０００－ＤＭＧを用い、脂質濃度に換算して０．５５ｍＭ相当のＭＥＮＤ溶液を調製した。
　４週齢の雄のＩＣＲマウスの腹腔から採血し、室温で３０分静置して血液を完全に凝固させた。タッピングによって血餅を壁からはがし、４，０００ｒｐｍ，１５分，２５℃で遠心し、上清を回収した。Ｎａｋｅｄ　ｐＤＮＡ、Ｃｏｒｅ、ＭＥＮＤ溶液とマウス血清を混合することで９０％マウス血清とし、６５０ｒｐｍ、３７℃で静置した。０，１，３，６，２４時間後において７０μＬずつ－２０℃で凍結し、保存した。反応液に水２１０μＬを加えて希釈し、２８０μＬのアルカリ性フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールを混合して３０秒ほど激しく撹拌し、１５，０００ｒｐｍ，１５分，２５℃で遠心し、上清を回収した。電気泳動には１％アガロースゲルを用いた。サンプル１２μＬに６ｘｌｏａｄｉｎｇ　ｄｙｅ　２μＬを混合し、全量をウェルにアプライし泳動した。ゲルをＥｔＢｒ水溶液に３０分浸して染色し、撮影を行なった。
　Ｎａｋｅｄ　ｐＤＮＡとＣｏｒｅでは血清混合後、１時間でｐＤＮＡは分解されバンドは観察されなかったが、ＭＥＮＤ化することで２４時間後にもバンドが確認された。本結果から、Ｂ－２を用いて調製したＭＥＮＤは血清耐性を持ち、ｐＤＮＡの血清中での分解を防ぐことができることを確認した(図１３)。
［試験例１２］
　Ｂ－２　ＭＥＮＤによる遺伝子発現活性の経時変化の評価
　試験例９で示した方法で調製したＭＥＮＤ溶液、及び肝臓で高い遺伝子発現を有している、Ｒ８／ＧＡＬＡを使用したカチオン性ＭＥＮＤ（Khalil et al., J Control Release., 156(3) 374-80, 2011）、肝臓を標的とした市販の遺伝子導入試薬であるｉｎ ｖｉｖｏ ＪｅｔＰＥＩ－Ｇａｌ （ＰｏｌｙＰｌｕｓ－Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を各々４０μｇ ＤＮＡ相当、５週齢の雄のＩＣＲマウスに尾静脈投与した。この際、Ｂ－２からなるＭＥＮＤに搭載するＤＮＡとして、免疫応答を誘起することが知られているＣｐＧ配列をすべて除外したｐＤＮＡとして、国際公開第2011/132713号に記載のpCpGfree-Luc(0)を、また、ＣｐＧ配列を有する一般的なｐＤＮＡとして、プラスミドDNAのバックボーンにCpG配列を含み、かつマーカー遺伝子であるルシフェラーゼ配列の開始コドンからストップコドンにもCpG配列を有するプラスミドDNA（pcDNA3.1-Luc(+);CpG配列合計425個）を用いた。カチオン性ＭＥＮＤおよび、ｉｎ ｖｉｖｏ ＪｅｔＰＥＩ－Ｇａｌを用いた遺伝子導入においては、pCpGfree-Luc(0)のみを用いた。６，２４, ７２時間後に３ｍｇ相当のルシフェリン（ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｇｒａｄｅ，　Ｐｒｏｍｅｇａ）をマウスに腹腔内投与し、ＩＶＩＳ　ＬｕｍｉｎａＩＩ(Ｃａｌｉｐｅｒ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ)を用いてイメージングを行った。なお、Ｂ－２からなるＭＥＮＤについては７２時間より後の時刻においても週に２回程度イメージングを行った。取得した画像からマウス腹部における総発光量をｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃとして算出し、これを肝臓における遺伝子発現活性の指標とした。取得した画像を図１４（上段）に、総発光量のグラフを図１４（下段）に示した。
　Ｒ８／ＧＡＬＡを使用したカチオン性ＭＥＮＤでは、６時間後に強い発光がみられた後、時間とともに急速に遺伝子発現が低下し、７２時間後には全く発光がみられなくなった。また、ｉｎ　ｖｉｖｏ　ＪｅｔＰＥＩ－Ｇａｌにおいては、特に６時間後において肺由来の発光が非常に高く、肝臓への臓器選択性が低いことが示された。さらに、本ベクターを用いた際の遺伝子発現の持続性も乏しいものであった。一方、Ｂ－２ ＭＥＮＤでは、pcDNA3.1-Luc(+)を用いたものでは６時間後に弱い発光がみられた後、遺伝子発現が低下するが、pCpGfree-Luc(0)を用いたものでは６時間後から２４時間後にかけて発光量が上昇し、その後1週間、発光量が持続し、さらに完全に発光が消失したのは１８日後であった。これらの結果より、Ｂ－２ ＭＥＮＤはＣｐＧ配列を除いたｐＤＮＡを組み合わせることにより、従来型キャリアよりも持続性に富んでいることが示された。
［試験例１３］
　ＭＥＮＤの肝臓内挙動の評価
　試験例９で示した方法で調製したＭＥＮＤ、及び肝臓で高い遺伝子発現を有しているＲ８／ＧＡＬＡを使用したカチオン性ＭＥＮＤ（Khalil et al., J Control Release., 156(3) 374-80）に対し、それぞれ調製段階で脂質溶液にＲｈｏｄａｍｉｎｅ－ＤＯＰＥ（Ａｖａｎｔｉ　ｐｏｌａｒ　ｌｉｐｉｄｓ）を加えることによって蛍光ラベルした。なお、Ｒ８／ＧＡＬＡ－ＭＥＮＤに対しては総脂質濃度の０．１％、Ｂ－２　ＭＥＮＤに対しては総脂質濃度の１％となるようにＲｈｏｄａｍｉｎｅ－ＤＯＰＥを加えた。５０ｍｇ／ｍＬのペントバルビタールナトリウム（ナカライテスク）を生理食塩水で５倍希釈したものをＩＣＲマウス（５週齢♂）に腹腔内投与し、麻酔を行った。麻酔下のマウスにＧｒｉｆｆｏｎｉａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ Ｌｅｃｔｉｎ Ｉ－Ｂ４ Ｉｓｏｌｅｃｔｉｎ, ＦＩＴＣ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　（ＶＥＣＴＯＲ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を８０μＬ程度尾静脈投与し、血管内皮細胞の染色を行った。マウスの開腹を行い、肝臓を露出させ、臓器の乾燥を防止するためにＩｍｍｅｒｓｏｌTM５１８Ｆ（Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ）を臓器に滴下した。マウス尾静脈にＭＥＮＤ溶液で満たした延長チューブを接続した翼付静脈留置針を留置した。マウスの心臓の拍動による観察部位のずれを防止するため、肝臓を吸着させて固定するデバイス（Shimizu K et al., J Biosci Bioeng. 112(5):508-10）を用い、共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ　Ａ１）を用いて６０倍水浸レンズで観察を行った。動画の撮影開始後約５秒で４０μｇ　ＤＮＡ／ｍｏｕｓｅとなるようにマウスにＭＥＮＤを投与し、約１０分後に動画の撮影を終了した。結果を図１５に示した。
　Ｒ８/ＧＡＬＡを修飾したＭＥＮＤにおいては、肝臓の血液内を巨大な凝集体の状態で流れ込み、多くの粒子が主に血管壁に沿って吸着するのに対し、Ｂ－２を用いた場合には、凝集体形成なく血管内を均一に流れるとともに、時間と共に血管から漏出して肝臓に移行する様子が観察された。
［試験例１４］
　ＭＥＮＤ投与によるサイトカイン産生評価
　［試験例１２］において用いたＭＥＮＤを各々４０μｇ ＤＮＡ相当、５週齢の雄のＩＣＲマウスに尾静脈投与した。１，３，６, ２４時間後に心臓より血液を採取し、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ　ＥＬＩＳＡ　ｋｉｔ(Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ)を用い、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１２ｐ７０を測定した。各々の血中濃度推移を図１６に示す。
　カチオン性ＭＥＮＤにおいては、pCpGfree-Luc(0)をもちいているのにも関わらず、投与３時間後にＴＮＦ－αがやや高値となり、６時間後にはＩＦＮ－γが高値となった。一方、Ｂ－２　ＭＥＮＤにおいては、pcDNA3.1-Luc(+)を用いたものでは３時間後にＴＮＦ－αが高値となり、６時間後にはＩＬ－１２ｐ７０が高値となった。一方で、Ｂ－２　ＭＥＮＤをもちいてpCpGfree-Luc(0)を導入した場合、どの時刻においても、３種のサイトカイン全てが正常値を維持した。
　これらの結果より、pCpGfree-Luc(0)を用いて調製されたＢ－２　ＭＥＮＤは免疫反応を引き起こしにくいことが示唆された。よって、免疫反応による遺伝子発現活性の低下、有害な副作用などが起こりにくいと考えられる。
［試験例１５］
　Ｂ－２－４、Ｂ－２－５を用いたＭＥＮＤの調製
（１）Ｂ－２－４（実施例４）：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ＝３：３：４、Ｂ－２－５（実施例５）：ＰＯＰＥ：Ｃｈｏｌ＝３：４：３からなる組成のＭＥＮＤを［試験例１］（１）、（２）に記載の方法に従い調製した。
（２）Ｃｙ５標識化ｐＤＮＡを用いたＭＥＮＤの調製
　Ｃｙ５標識ｐＤＮＡは、Ｌａｂｅｌ／ＩＴ Ｃｙ５ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｍｉｒｕｓ）を用いて添付プロトコルに従い調製した。得られたＣｙ５標識ｐＤＮＡ溶液は、Ｎａｎｏ Ｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、濃度を算出した。Ｃｙ５標識されたｐＤＮＡが封入されたＭＥＮＤを調製する際には、［試験例１］（１）に記載したｐＤＮＡ溶液のうち１０％をＣｙ５標識されたｐＤＮＡに置き換え、［試験例１］（２）、（３）に記載の方法に従いＭＥＮＤを調製した。
［試験例１６］
　各種ＭＥＮＤの粒子径、及び表面電位の測定
　粒子径並びに表面電位は、動的光散乱法（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ；Ｍａｌｖｅｒｎ社）を用いて測定した。［試験例１］の調製法により調製された各種ＭＥＮＤの粒子径、表面電位を表４に示す。Ｂ－２－４、Ｂ－２－５ともに、生理的ｐＨにおいて好ましい電荷である－１０～＋１０ｍＶであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
  
［試験例１７］
　染色法による電子顕微鏡観察
　Ｂ－２（実施例１）、Ｂ－２－４（実施例４）について［試験例１］（１）、（２）、［試験例１５］に従いＭＥＮＤを調製した。本調製においては、ＰＥＧ脂質としてＰＥＧ２０００－ＤＭＧを用い、脂質濃度に換算して１．３８ｍＭ相当のＭＥＮＤ溶液を調製した。遠心チューブに５０％ショ糖溶液（ｐＨ５．３）を５ｍＬ加え１０％ショ糖溶液（ｐＨ５．３）を５ｍＬ重層し、さらにＭＥＮＤ溶液１．５ｍＬを重層し不連続密度勾配を形成した。超遠心（１１００００ｇ、２ｈ、２５℃）により精製を行った（ＯｐｔｉｍａＴＭ　Ｌ－９０Ｋ　Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ、Ｓｗ４１Ｔｉ、ＢＥＣＫＭＡＮ）。ショ糖密度１０％と５０％の界面を４ｍＬ回収し、限外濾過（１０００ｇ、３ｍｉｎ、２５℃）によりショ糖を除きサンプル溶液とした。２倍希釈したサンプル溶液を４００メッシュカーボンフィルムＴＥＭグリッドに吸着させ、ろ紙で吸い取った後、２％リンタングステン酸溶液（ｐＨ７．０）を加え１０秒間静置した。観察は透過型電子顕微鏡（ＪＥＭ－１２００ＥＸ、日本電子）で行った。加速電圧は８０ｋＶとし、画像はＣＣＤカメラ（ＶＥＬＥＴＡ、日本電子）を用いて撮影した。結果を図１７に示す。
　上段のＢ－２、下段のＢ－２－４共に、１枚膜の脂質膜で被覆された構造体が確認された。
［試験例１８］
　遺伝子発現活性評価
　脂質としてＢ－２－４（実施例４）：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ＝３：３：４、Ｂ－２－５（実施例５）：ＰＯＰＥ：Ｃｈｏｌ＝３：３：４、Ｂ－２（実施例１）：ＳＯＰＥ：Ｃｈｏｌ＝５：３：２からなる組成を用い、［試験例１］（１）、（２）に従ってＭＥＮＤの調製を行った。本調製においては、ＰＥＧ脂質としてＰＥＧ２０００－ＤＭＧを用い、脂質濃度に換算して０．５５ｍＭ相当のＭＥＮＤ溶液を調製した。
　［試験例４］（２）に記載の方法に従い遺伝子発現活性を評価した。結果を図１８に示す。
　Ｂ－２－５から形成されるＭＥＮＤの活性はＢ－２の活性と同等であった。Ｂ－２－４から形成されるＭＥＮＤの活性はＢ－２およびＢ－２－５を有意に上回っていた。
［試験例１９］
　遺伝子発現活性および細胞内取り込み量の経時的評価
（１）ＭＥＮＤ細胞内取り込み量の経時的観察
　Ｂ－２－４（実施例４）、Ｂ－２（実施例１）について、［試験例１］（１）、（２）、［試験例１５］に従いＭＥＮＤを調製した。本調製においては、ＰＥＧ脂質としてＰＥＧ２０００－ＤＭＧを用い、脂質濃度に換算して０．５５ｍＭ相当のＭＥＮＤ溶液を調製した。また、カチオン性ＭＥＮＤにおいては、ＤＯＴＡＰ（比較例３）：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ：＝３：４：３の組成からなる脂質を用い、［試験例１］（３）に記載の方法に従い調製した。ｐＤＮＡを蛍光ラベルする際には［試験例１５］（２）に記載の方法で行った。
　２４時間前に６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに、ＨＴ１０８０細胞を２×１０５ ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／ｗｅｌｌで播種し、各種サンプルＭＥＮＤをｐＤＮＡ濃度１．６μｇ／２ｍＬ／ｗｅｌｌになるようにＤＭＥＭ（ＦＢＳ＋）で希釈しウェルにトランスフェクションした。１、３、６時間後にＭＥＮＤ含有ＤＭＥＭを除去し、ヘパリン（２０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）１ｍＬで２回細胞を洗浄し、さらにＰＢＳ（－）１ｍＬで１回洗浄した。０．０５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ溶液５００μＬを添加した後、３７℃インキュベーターに３分静置した。ＤＭＥＭ（ＦＢＳ＋）１ｍＬを入れて遠心（７００ｇ、４℃、５ｍｉｎ）したのち、上清を除去してＦＡＣＳ緩衝液１ｍＬに懸濁させた。懸濁液を遠心（７００ｇ、４℃、５分）し、上清を除去した後再びＦＡＣＳ緩衝液５００μＬに懸濁させた。測定直前に４４μｍのナイロンメッシュに通し、細胞内のＣｙ５の蛍光強度を測定した。結果を図１９に示す。
　ｐＤＮＡをＣｙ５により蛍光修飾し、ＭＥＮＤの細胞内取り込みを評価した結果、生理的ｐＨ（ｐＨ＝７．４）でカチオン性を有するＤＯＴＡＰを用いたものに比べ、中性の粒子であるＢ－２及びＢ－２－４の取り込み量は低いものであった。Ｂ－２－４を用いたＭＥＮＤはＢ－２よりも高く取り込まれた。
（２）ＡＢ‐２５５０　クロノスＤｉｏ（アトー）を用いた遺伝子発現の経時的評価
　Ｂ－２－４（実施例４）、Ｂ－２（実施例１）について、［試験例１］（１）、（２）、［試験例１８］に従いＭＥＮＤを調製した。本調製においては、ＰＥＧ脂質としてＰＥＧ２０００－ＤＭＧを用い、脂質濃度に換算して０．５５ｍＭ相当のＭＥＮＤ溶液を調製した。また、カチオン性ＭＥＮＤにおいては、ＤＯＴＡＰ（比較例３）：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ：＝３：４：３の組成からなる脂質を用い、［試験例１］（３）に記載の方法に従い調製した。
　２４時間前に３.５ｃｍ細胞培養用ｄｉｓｈにＨＴ１０８０細胞を４×１０４ ｃｅｌｌ／２ｍＬ／ｄｉｓｈで播種し、各種ＭＥＮＤをｐＤＮＡ量に換算して１．６μｇ／２ｍＬ／ｄｉｓｈとなるよう、終濃度２００μＭ　Ｄ‐ルシフェリンカリウムを含むＤＭＥＭ（ＦＢＳ１０％＋、Ｐｈｅｎｏｌ　ｒｅｄ　ｆｒｅｅ）で希釈し、トランスフェクションした。クロノスＤｉｏ添付文書に従い、２０分ごとに２分間の発光量を測定しルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ／２ｍｉｎ）とした。結果を図２０に示す。
　Ｂ－２－４から形成されるＭＥＮＤの活性はＢ－２およびＤＯＴＡＰから形成されるＭＥＮＤと比較し有意に高かった。Ｂ－２の活性はＤＯＴＡＰと同等であった。
　Ｂ－２－４からなるＭＥＮＤは、カチオン性脂質ＤＯＴＡＰから形成されるＭＥＮＤと比較して細胞内への取り込みが低いにも関わらず、有意に高い遺伝子発現活性を有することが明らかとなった。従来のＤＯＴＡＰやＢ－２と比較して、Ｂ－２－４は細胞内に取り込まれた後の細胞内動態特性がさらに優れていることが示された。
［試験例２０］
　細胞内動態（エンドソーム脱出効率）
（１）エンドソーム脱出効率評価
　ＭＥＮＤ調製には、［試験例１］（４）の方法で調製されたＲｈｏｄａｍｉｎｅ標識ｐＤＮＡを用いた。ローダミン標識されたｐＤＮＡが封入されたＭＥＮＤを調製する際には、［試験例１］（１）に記載したｐＤＮＡ溶液のうち５０％をローダミン標識されたｐＤＮＡに置き換えた。
　Ｂ－２－４（実施例４）：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ＝３：３：４、Ｂ－２（実施例１）：ＳＯＰＥ：Ｃｈｏｌ＝５：３：２からなる組成のＭＥＮＤを［試験例１］（２）に記載の方法に従い調製した。本調製においては、ＰＥＧ脂質としてＰＥＧ２０００－ＤＭＧを用い、脂質濃度に換算して０．５５ｍＭ相当のＭＥＮＤ溶液を調製した。
　２４時間前にガラスボトムディッシュにＨＴ１０８０細胞を５×１０４ｃｅｌｌ／２ｍＬ／ｄｉｓｈで播種した。ｐＤＮＡ１．６μｇ／２ｍＬとなるようＭＥＮＤをＤＭＥＭ（ＦＢＳ１０％＋）で希釈し細胞にトランスフェクションした。５．５時間後、Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を２μＬ／ｄｉｓｈで添加した。トランスフェクションの６時間後に、ヘパリン（２０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）２ｍＬで２度洗浄し、Ｋｒｅｂｓ緩衝液を１ｍＬ加え、共焦点レーザースキャン顕微鏡で観察した。結果を図２１に示す。
　ローダミン標識したｐＤＮＡ、エンドソーム・ライソソーム、核をそれぞれ赤、緑、青色で擬似カラー表示した。以下の式に従いエンドソーム脱出効率を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000011
  
　結果を図２２に示す。これより、Ｂ－２－４はＢ－２に比べ有意に高いエンドソーム脱出効率を示すことが明らかとなった。
（２）エンドソーム量評価
　Ｂ－２－４（実施例４）：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ＝３：３：４、Ｂ－２（実施例1）：ＳＯＰＥ：Ｃｈｏｌ＝５：３：２からなる組成のＭＥＮＤを［試験例１］（２）に記載の方法に従い調製した。本調製においては、ＰＥＧ脂質としてＰＥＧ２０００－ＤＭＧを用い、脂質濃度に換算して０．５５ｍＭ相当のＭＥＮＤ溶液を調製した。
　２４時間前にガラスボトムディッシュにＨＴ１０８０細胞を５×１０４ｃｅｌｌ／２ｍＬ／ｄｉｓｈで播種した。ｐＤＮＡ１．６μｇ／２ｍＬとなるようＭＥＮＤをＤＭＥＭ（ＦＢＳ１０％＋）で希釈し細胞にトランスフェクションした。ＭＥＮＤをトランスフェクションしないものをコントロールとした。５．５時間後、Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を２μＬ／ｄｉｓｈで添加し、さらに３０分後にＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｄｏｊｉｎｄｏ）を２μＬ／ｄｉｓｈで添加した。トランスフェクションの６時間後に、ヘパリン（２０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）２ｍＬで２度洗浄し、Ｋｒｅｂｓ緩衝液を１ｍＬ加え、共焦点レーザースキャン顕微鏡で観察した。結果を図２３に示す。
　エンドソーム・ライソソーム、核をそれぞれ緑、青色で擬似カラー表示した。以下の式に従い相対的エンドソーム量を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000012
  
　結果を図２４に示す。これより、Ｂ－２－４をトランスフェクションした細胞では未処理およびＢ－２処理群に比べエンドソームが有意に減少することが明らかとなった。［試験例２０］（１）で示された高いエンドソーム脱出効率はエンドソーム破壊効果に起因することが示唆された。
［試験例２１］
　細胞内動態（脱被覆効率）
　ＭＥＮＤ調製には、［試験例１］（４）の方法で調製されたＲｈｏｄａｍｉｎｅ標識ｐＤＮＡを用いた。ローダミン標識されたｐＤＮＡが封入されたＭＥＮＤを調製する際には、［試験例１］（１）に記載したｐＤＮＡ溶液のうち５０％をローダミン標識されたｐＤＮＡに置き換えた。また、ＭＥＮＤを構成する脂質の蛍光ラベル化は、［試験例１］（３）に記載の方法により行った。Ｂ－２－４（実施例１）：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ＝３：３：４、Ｂ－２（比較例２）：ＳＯＰＥ：Ｃｈｏｌ＝５：３：２からなる組成のＭＥＮＤを［試験例１］（２）に記載の方法に従い調製した。本調製においては、ＰＥＧ脂質としてＰＥＧ２０００－ＤＭＧを用い、脂質濃度に換算して０．５５ｍＭ相当のＭＥＮＤ溶液を調製した。
　２４時間前にガラスボトムディッシュにＨＴ１０８０細胞を５×１０４ｃｅｌｌ／２ｍＬ／ｄｉｓｈで播種した。ｐＤＮＡ１．６μｇ／２ｍＬとなるようＭＥＮＤをＤＭＥＭ（ＦＢＳ１０％＋）で希釈し細胞にトランスフェクションした。３、６、９、１２時間後にヘパリン溶液（２０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）２ｍＬで２度洗浄し、Ｋｒｅｂｓ緩衝液を１ｍＬ加え、トランスフェクション３、６、９、１２時間後の画像を共焦点レーザースキャン顕微鏡で取得した。結果を図２５に示す。
　ローダミン標識したｐＤＮＡ、ＭＥＮＤの脂質膜をそれぞれ赤、緑で擬似カラー表示した。以下の式に従い脱被覆効率を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000013
  
　結果を図２６に示す。Ｂ－２は早い段階から良好な脱被覆を起こすことが示唆された。Ｂ－２－４は時間を経るに従って徐々に脱被覆を起こすことが示唆された。
［試験例２２］
　細胞内動態（細胞内取り込み経路）
　（１）細胞内取り込み量への影響
　Ｂ－２－４（実施例４）、Ｂ－２（実施例１）について、［試験例１］（１）、（２）、［試験例１８］に従いＭＥＮＤを調製した。本調製においては、ＰＥＧ脂質としてＰＥＧ２０００－ＤＭＧを用い、脂質濃度に換算して０．５５ｍＭ相当のＭＥＮＤ溶液を調製した。ｐＤＮＡを蛍光ラベルする際には［試験例１５］（２）に記載の方法で行った。
　２４時間前に６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに、ＨＴ１０８０細胞を２×１０５ ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／ｗｅｌｌで播種した。トランスフェクション３０分前に終濃度１０μｇ／μＬ　ｆｉｌｉｐｉｎを含むＤＭＥＭ（ＦＢＳ＋）に培地を交換した。トランスフェクション１５分前に終濃度０．３Ｍ　ｓｕｃｒｏｓｅ、および１ｍＭ　ａｍｉｌｏｒｉｄｅを含むＤＭＥＭ（ＦＢＳ＋）に培地を交換した。トランスフェクション時、各種ＭＥＮＤをｐＤＮＡ量に換算して１．６μｇ／２ｍＬ／ｄｉｓｈとなるようｄｉｓｈに加えた。トランスフェクション三時間後、［試験例１９］（１）に記載の方法で細胞内ｐＤＮＡ量を測定した。結果を図２７に示す。
　細胞内への取り込みはＢ－２、Ｂ－２－４ともにｓｕｃｒｏｓｅおよびａｍｉｌｏｒｉｄｅ感受性であり、クラスリン介在性エンドサイトーシスおよびマクロピノサイトーシスの関与が示唆された。
（２）遺伝子発現活性への影響
　脂質としてＢ－２－４（実施例４）：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ＝３：３：４、Ｂ－２（実施例１）：ＳＯＰＥ：Ｃｈｏｌ＝５：３：２からなる組成を用い、［試験例１］（１）、（２）に従ってＭＥＮＤの調製を行った。本調製においては、ＰＥＧ脂質としてＰＥＧ２０００－ＤＭＧを用い、脂質濃度に換算して０．５５ｍＭ相当のＭＥＮＤ溶液を調製した。
　２４時間前に２４－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにＨＴ１０８０細胞を４×１０４ ｃｅｌｌ／５００μＬ／ｗｅｌｌで播種した。トランスフェクション３０分前に終濃度１０μｇ／μＬ　ｆｉｌｉｐｉｎを含むＤＭＥＭ（ＦＢＳ＋）に培地を交換した。トランスフェクション１５分前に終濃度０．３Ｍ　ｓｕｃｒｏｓｅ、および１．５ｍＭ　ａｍｉｌｏｒｉｄｅを含むＤＭＥＭ（ＦＢＳ＋）に培地を交換した。トランスフェクション時、各種ＭＥＮＤをｐＤＮＡ量に換算して０．８μｇ／５００μＬ／ｗｅｌｌとなるようｗｅｌｌに加えた。その後［試験例４］（２）に記載の方法に従い遺伝子発現活性を評価した。結果を図２８に示す。
　Ｂ－２の遺伝子発現はｓｕｃｒｏｓｅおよびａｍｉｌｏｒｉｄｅで阻害された。Ｂ－２－４の遺伝子発現はａｍｉｌｏｒｉｄｅにより阻害された。これより、Ｂ－２、Ｂ－２－４はどちらもｓｕｃｒｏｓｅおよびａｍｉｌｏｒｉｄｅ感受性経路で取り込まれるが、Ｂ－２－４においてはａｍｉｌｏｒｉｄｅ感受性経路が遺伝子発現へ大きく寄与していることが示唆された。
［試験例２３］
　エンドソーム酸性化阻害剤の影響評価
　Ｂ－２－４（実施例４）、Ｂ－２（実施例１）について、［試験例１］（１）、（２）、［試験例Ｎ８］に従いＭＥＮＤを調製した。本調製においては、ＰＥＧ脂質としてＰＥＧ２０００－ＤＭＧを用い、脂質濃度に換算して０．５５ｍＭ相当のＭＥＮＤ溶液を調製した。
　２４時間前に３.５ｃｍ細胞培養用ｄｉｓｈにＨＴ１０８０細胞を４×１０４ｃｅｌｌ／２ｍＬ／ｄｉｓｈで播種した。トランスフェクション３０分前に０．５μＭ　ＢａｆＡ１（Ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ　Ａ１）を含むＤＭＥＭ（ＦＢＳ１０％＋）へ培地を交換した。３０分後、各種ＭＥＮＤをｐＤＮＡ量に換算して１．６μｇ／２ｍＬ／ｄｉｓｈとなるようｄｉｓｈに加えた。トランスフェクション３時間後、終濃度２００μＭ　Ｄ‐ルシフェリンカリウムを含むＤＭＥＭ（ＦＢＳ１０％＋、Ｐｈｅｎｏｌ　ｒｅｄ　ｆｒｅｅ）へ培地を交換し、クロノスＤｉｏ添付文書に従い、２０分ごとに２分間の発光量を測定しルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ／２ｍｉｎ）とした。結果を図２９に示す。
　ＢａｆＡ１を用いたエンドソーム酸性化阻害により、Ｂ－２－４とＢ－２の活性は阻害された。Ｂ－２－４はエンドソーム酸性化により活性化され、遺伝子発現を示すことが示唆された。
［試験例２４］
　レチノイン酸（ＲＡ）による阻害効果の評価
（１）遺伝子発現阻害効果
　Ｂ－２－４（実施例４）、Ｂ－２（実施例１）について、［試験例１］（１）、（２）、［試験例１８］に従いＭＥＮＤを調製した。本調製においては、ＰＥＧ脂質としてＰＥＧ２０００－ＤＭＧを用い、脂質濃度に換算して０．５５ｍＭ相当のＭＥＮＤ溶液を調製した。
　２４時間前に３.５ｃｍ細胞培養用ｄｉｓｈにＨＴ１０８０細胞を４×１０４ｃｅｌｌ／２ｍＬ／ｄｉｓｈで播種し、各種ＭＥＮＤをｐＤＮＡ量に換算して１．６μｇ／２ｍＬ／ｄｉｓｈとなるよう、終濃度２００μＭ　Ｄ‐ルシフェリンカリウム、および０、５、７．５、１０μＭ　ＲＡ（ｓｉｇｍａ）を含むＤＭＥＭ（ＦＢＳ１０％＋、Ｐｈｅｎｏｌ　ｒｅｄ　ｆｒｅｅ）で希釈しトランスフェクションした。クロノスＤｉｏ添付文書に従い、２０分ごとに２分間の発光量を測定しルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ／２ｍｉｎ）とした。結果を図３０に示す。
　Ｂ－２－４から形成されたＭＥＮＤの遺伝子発現活性はＲＡにより濃度依存的に減少した（図３０右）。Ｂ－２から形成されたＭＥＮＤの遺伝子発現活性は減少しなかった（図３０左）。Ｂ－２－４の遺伝子発現はＲＡとしての認識が関与することが示唆された。
［試験例２５］
　細胞内動態（核輸送）
　ＭＥＮＤ調製には、［試験例１］（４）の方法で調製されたＲｈｏｄａｍｉｎｅ標識ｐＤＮＡを用いた。ローダミン標識されたｐＤＮＡが封入されたＭＥＮＤを調製する際には、［試験例１］（１）に記載したｐＤＮＡ溶液のうち全てをローダミン標識されたｐＤＮＡに置き換えた。また、ＭＥＮＤを構成する脂質の蛍光ラベル化は、［試験例１］（３）に記載の方法により行った。Ｂ－２－４（実施例４）：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ＝３：３：４、Ｂ－２（実施例１）：ＳＯＰＥ：Ｃｈｏｌ＝５：３：２からなる組成のＭＥＮＤを［試験例１］（２）に記載の方法に従い調製した。本調製においては、ＰＥＧ脂質としてＰＥＧ２０００－ＤＭＧを用い、脂質濃度に換算して０．５５ｍＭ相当のＭＥＮＤ溶液を調製した。
　２４時間前にガラスボトムディッシュにＨＴ１０８０細胞を５×１０４ｃｅｌｌ／２ｍＬ／ｄｉｓｈで播種した。ｐＤＮＡ１．６μｇ／２ｍＬとなるようＭＥＮＤをＤＭＥＭ（ＦＢＳ１０％＋）で希釈し細胞にトランスフェクションした。３時間後にｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を１μＬ加え、１０分後にヘパリン溶液（２０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）２ｍＬで２度洗浄し、Ｋｒｅｂｓ緩衝液を１ｍＬ加え、共焦点レーザースキャン顕微鏡で取得した。結果を図３１に示す。
　Ｂ－２が細胞内に拡散しているのに対し、Ｂ－２－４は核周辺に集積している様子が観察された。これは核への輸送機構の存在を示唆するものであった。
［試験例２６］
　ＧＡ（Ｇｉｎｋｇｏｌｉｃ　Ａｃｉｄ）による阻害効果の評価
　Ｂ－２－４（実施例４）、Ｂ－２（実施例１）について、［試験例１６］、［試験例１］（１）、（２）に従いＭＥＮＤを調製した。本調製においては、ＰＥＧ脂質としてＰＥＧ２０００－ＤＭＧを用い、脂質濃度に換算して０．５５ｍＭ相当のＭＥＮＤ溶液を調製した。
　２４時間前に３.５ｃｍ細胞培養用ｄｉｓｈにＨＴ１０８０細胞を４×１０４ｃｅｌｌ／２ｍＬ／ｄｉｓｈで播種し、各種ＭＥＮＤをｐＤＮＡ量に換算して１．６μｇ／２ｍＬ／ｄｉｓｈとなるよう、終濃度２００μＭ　Ｄ‐ルシフェリンカリウム、および０、２５、５０、１００μＭ　ＧＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を含むＤＭＥＭ（ＦＢＳ１０％＋、Ｐｈｅｎｏｌ　ｒｅｄ　ｆｒｅｅ）で希釈しトランスフェクションした。クロノスＤｉｏ添付文書に従い、２０分ごとに２分間の発光量を測定しルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ／２ｍｉｎ）とした。結果を図３２に示す。
　ＧＡはＢ－２にくらべＢ－２－４に対する阻害効果が大きかった。ＧＡは細胞内タンパク質のＳＵＭＯ化を阻害する小分子である。ＨＴ１０８０にはＲＡをＳＵＭＯ化依存的に核へ輸送する細胞内レチノイン酸結合タンパク質II（ＣＲＡＢＰII）が発現している。Ｂ－２－４に対する遺伝子発現活性の大幅な低下はＧＡによるＣＲＡＢＰIIの活性低下に起因することが考えられる。
[試験例２７]
　ｓｉＲＮＡとプロタミンからなる核酸静電的複合体の形成
　ベクターのコアとして、ｓｉＲＮＡ溶液、プロタミン溶液（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）溶液を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ５．３）でそれぞれ０．３ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬに希釈し、０．３ｍｇ／ｍＬ ｓｉＲＮＡ溶液２５０μＬを攪拌しながら０．２ｍｇ／ｍＬ プロタミン溶液２５０μＬを少量ずつ滴下してｓｉＲＮＡとプロタミンの静電的複合体を調製した（Ｎ／Ｐ比＝１．０）。
　Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ（ＦＶＩＩ）に対するｓｉＲＮＡ配列としては、Ａｋｉｎｃ　ｅｔ　ａｌ，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ，　１７（５）　８７２－８７９（２００９）に記載のもの（ただし、化学修飾のないもの）をもちいた。
[試験例２８]
　エタノール希釈法によるｓｉＲＮＡ封入ＭＥＮＤの調製
　脂質のエタノール溶液を、Ｂ－２ ＭＥＮＤ(実施例１)はＢ－２：ＳＯＰＥ：Ｃｈｏｌ＝５：３：２、Ｂ－２－４ ＭＥＮＤ(実施例４)はＢ－２－４：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ＝３：３：４、Ｂ－２－５ ＭＥＮＤ(実施例５)はＢ－２－５：ＰＯＰＥ：Ｃｈｏｌ＝３：４：３の比率で、総脂質６６０ｎｍｏｌになるように５ｍＬチューブに混合した。さらにＰＥＧ脂質としてＰＥＧ２０００－ＤＭＧを総脂質量に対して３モル％相当量添加し、それぞれ全量で４００μＬとなるようにエタノールを加えた。脂質溶液をボルテックスミキサーを用いて攪拌しながら、[試験例２７]で調製したｓｉＲＮＡ・プロタミンからなる核酸静電的複合体溶液４００μＬを混合し、その後素早く１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ５．３）２．４ｍＬを加え、激しく攪拌した。Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５ １００Ｋ ｄｅｖｉｃｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用い、１０００ｇ，１０分，３０℃で遠心し限外濾過した。その後、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で十分希釈し、再び限外濾過を行い濃縮した。この溶液を１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で目的の脂質濃度になるよう調整した。
［試験例２９］
　ｓｉＲＮＡ封入ＭＥＮＤの粒子径、及び表面電位の測定
　粒子径並びに表面電位は、動的光散乱法（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ；Ｍａｌｖｅｒｎ社）を用いて測定した。[試験例２８]の調製法により調製された各種ＭＥＮＤの粒子径、表面電位を表５に示す。いずれにおいても生理的ｐＨでは、弱い負電荷を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
  
[試験例３０]
　ｓｉＲＮＡ封入ＭＥＮＤのノックダウン効果
　[試験例２８]で示した方法で調製したＭＥＮＤ溶液を、４週齢の雄のＩＣＲマウスに、３ｍｇ ｓｉＲＮＡ／ｋｇで尾静脈投与し、２４時間後に、血液を採取した。本血液サンプルを１０００ｇ、１０分、４℃で遠心し、上清を回収することで血漿を得た。血漿中のＦａｃｔｏｒ ＶＩＩ（ＦＶＩＩ）量を、ＢＩＯＰＨＥＮ ＦＶＩＩ ＣＨＲＯＭＯＧＥＮＩＣ ＡＳＳＡＹ（ＨＹＰＨＥＮ ＢｉｏＭｅｄ）を用いて定量した。結果を図３３に示す。未処理群に比べ、Ｂ－２、Ｂ－２－４、Ｂ－２－５いずれにおいてもＦＶＩＩ発現量の低下が見られ、その中でもＢ－２－５ ＭＥＮＤが最も大きいノックダウン効果を示した。
[試験例３１]
　ｓｉＲＮＡ封入ＭＥＮＤの持続性評価
　[試験例２８]で示した方法で調製したＭＥＮＤ溶液を、４週齢の雄のＩＣＲマウスに、３ｍｇ ｓｉＲＮＡ／ｋｇで尾静脈投与してから６日目まで、２４時間後ごとに尾静脈より継時的に血液を採取し、ＦＶＩＩの発現量を経時的に追った。結果を図３４に示す。
　遺伝子ノックダウン効果は、投与後１日後がピークとなり、その後、約７週間かけて徐々に効果を消失することが明らかとなった。
　本発明によると、高効率で核酸を細胞内へ導入することが可能であるので、遺伝子治療や生化学実験に有用である。
　本出願は日本で出願された特願２０１１－２５２３０９（出願日：２０１１年１１月１８日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (9)

  1. 　式（１）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    （式中、Ｘａ及びＸｂは独立して、Ｘ１又はＸ２であり；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    ｓは１又は２であり、
    Ｒ４は炭素数１～６のアルキル基を表し、
    ｎａ及びｎｂは独立して、０又は１であり、
    Ｒ１ａ及びＲ１ｂは独立して、炭素数１～６のアルキレン基を表し、
    Ｒ２ａ及びＲ２ｂは独立して、炭素数１～６のアルキレン基を表し、
    Ｙａ及びＹｂは独立して、エステル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合又は尿素結合を表し、
    Ｒ３ａ及びＲ３ｂは独立して、ステロール残基、脂溶性ビタミン残基又は炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基を表す）で示される化合物。
  2. 　Ｘａ及びＸｂが独立して、Ｘ１である請求項１記載の化合物。
  3. 　Ｒ３ａ及びＲ３ｂが独立して、脂溶性ビタミン残基又は炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基である請求項１又は２記載の化合物。
  4. 　Ｒ３ａ及びＲ３ｂが独立して、脂溶性ビタミン残基である請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物。
  5. 　Ｒ３ａ及びＲ３ｂが独立して、炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基である請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物。
  6. 　請求項１～５のいずれか１項に記載の化合物を膜の構成脂質として含む脂質膜構造体。
  7. 　請求項１～５のいずれか１項に記載の化合物、又は請求項６記載の脂質膜構造体を含む核酸導入剤。
  8. 　生体外において、核酸を内封した請求項６記載の脂質膜構造体と細胞とを接触させることを含む、当該核酸を当該細胞内へ導入する方法。
  9. 　核酸を内封した請求項６記載の脂質膜構造体を、標的細胞へ送達されるように、生体へ投与することを含む、当該核酸を当該細胞内へ導入する方法。
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