JPWO2013073480A1 - 細胞内動態を改善したカチオン性脂質 - Google Patents
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Abstract
式(1)
(式中、Xa及びXbは独立して、X1又はX2であり;
sは1又は2であり、
R4は炭素数1〜6のアルキル基を表し、
na及びnbは独立して、は0又は1であり、
R1a及び及びR1bは独立して、炭素数1〜6のアルキレン基を表し、
R2a及びR2bは独立して、炭素数1〜6のアルキレン基を表し、
Ya及びYbは独立して、エステル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合又は尿素結合を表し、
R3a及びR3bは独立して、ステロール残基、脂溶性ビタミン残基又は炭素数12〜22の脂肪族炭化水素基を表す)で示される化合物。
Description
[1]式(1)
R4は炭素数1〜6のアルキル基を表し、
na及びnbは独立して、0又は1であり、
R1a及びR1bは独立して、炭素数1〜6のアルキレン基を表し、
R2a及びR2bは独立して、炭素数1〜6のアルキレン基を表し、
Ya及びYbは独立して、エステル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合又は尿素結合を表し、
R3a及びR3bは独立して、ステロール残基、脂溶性ビタミン残基又は炭素数12〜22の脂肪族炭化水素基を表す)で示される化合物。
[2]Xa及びXbが独立して、X1である[1]記載の化合物。
[3]R3a及びR3bが独立して、脂溶性ビタミン残基又は炭素数12〜22の脂肪族炭化水素基である[1]又は[2]記載の化合物。
[4]R3a及びR3bが独立して、脂溶性ビタミン残基である[1]〜[3]のいずれかに記載の化合物。
[5]R3a及びR3bが独立して、炭素数12〜22の脂肪族炭化水素基である[1]〜[3]のいずれかに記載の化合物。
[6][1]〜[5]のいずれかに記載の化合物を膜の構成脂質として含む脂質膜構造体。
[7][1]〜[5]のいずれかに記載の化合物、又は[6]記載の脂質膜構造体を含む核酸導入剤。
[8]生体外において、核酸を内封した[6]記載の脂質膜構造体と細胞とを接触させることを含む、当該核酸を当該細胞内へ導入する方法。
[9]核酸を内封した[6]記載の脂質膜構造体を、標的細胞へ送達されるように、生体へ投与することを含む、当該核酸を当該細胞内へ導入する方法。
Xa及びXbは独立して、X1であり、
R4は炭素数1〜3のアルキル基を表し、na及びnbは1であり、
R1a及びR1bは独立して、炭素数1〜6のアルキレン基を表し、
R2a及びR2bは独立して、炭素数1〜6のアルキレン基を表し、
Ya及びYbはエステル結合を表し、
R3a及びR3bは独立して、炭素数12〜22の脂肪族炭化水素基を表す。
Xa及びXbは、X1であり、
R4は炭素数1〜3のアルキル基を表し、na及びnbは1であり、
R1a及びR1bは、炭素数1〜6のアルキレン基を表し、
R2a及びR2bは、炭素数1〜6のアルキレン基を表し、
Ya及びYbはエステル結合を表し、
R3a及びR3bは、炭素数12〜22の脂肪族炭化水素基を表し、
XaはXbと同一であり、
R1aはR1bと同一であり、
R2aはR2bと同一であり、
R3aはR3bと同一である。
Xa及びXbは、X1であり、
R4はメチル基を表し、na及びnbは1であり、
R1a及びR1bはエチレン基を表し、
R2a及びR2bはトリメチレン基を表し、
Ya及びYbは−CO−O−を表し、
R3a及びR3bは独立して、炭素数13〜17のアルキル基又はアルケニル基を表す。
Xa及びXbは、X1であり、
R4はメチル基を表し、na及びnbは1であり、
R1a及びR1bはエチレン基を表し、
R2a及びR2bはトリメチレン基を表し、
Ya及びYbは−CO−O−を表し、
R3a及びR3bは、炭素数13〜17のアルキル基又はアルケニル基を表し、
R3aはR3bと同一である。
Xa及びXbは独立して、X1であり、
R4は炭素数1〜3のアルキル基を表し、na及びnbは1であり、
R1a及びR1bは独立して、炭素数1〜6のアルキレン基を表し、
R2a及びR2bは独立して、炭素数1〜6のアルキレン基を表し、
Ya及びYbはエステル結合を表し、
R3a及びR3bは独立して、脂溶性ビタミン残基(例、レチノイン酸残基、トコフェロール残基)を表す。
Xa及びXbは、X1であり、
R4は炭素数1〜3のアルキル基を表し、na及びnbは1であり、
R1a及びR1bは、炭素数1〜6のアルキレン基を表し、
R2a及びR2bは、炭素数1〜6のアルキレン基を表し、
Ya及びYbはエステル結合を表し、
R3a及びR3bは、脂溶性ビタミン残基(例、レチノイン酸残基、トコフェロール残基)を表し、
XaはXbと同一であり、
R1aはR1bと同一であり、
R2aはR2bと同一であり、
R3aはR3bと同一である。
Xa及びXbは、X1であり、
R4はメチル基を表し、na及びnbは1であり、
R1a及びR1bはエチレン基を表し、
R2a及びR2bはトリメチレン基を表し、
Ya及びYbは−CO−O−を表し、
R3a及びR3bは独立して、脂溶性ビタミン残基(例、レチノイン酸残基、トコフェロール残基)を表す。
Xa及びXbは、X1であり、
R4はメチル基を表し、na及びnbは1であり、
R1a及びR1bはエチレン基を表し、
R2a及びR2bはトリメチレン基を表し、
Ya及びYbは−CO−O−を表し、
R3a及びR3bは、脂溶性ビタミン残基(例、レチノイン酸残基、トコフェロール残基)を表し、
R3aはR3bと同一である。
R3a−(Ya−R2a)n a−Xa−R1a−SH、及び
R3b−(Yb−R2b)n b−Xb−R1b−SH
を製造後、これを酸化(カップリング)することで−S−S−を含む本発明の化合物を得る方法、−S−S−結合を含む化合物から出発し、必要な部分を順次結合していき、最終的に本発明の化合物を得る方法等が挙げられる。好ましくは、後者の方法である。
pDNA: プラスミドDNA
Chol: Cholesterol
NBD-DOPE:1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazole-4-yl)
DMEM: dulbecco’s modified eagle medium
PEG2000-DSG: 1,2-Distearoyl-sn-glycerol, methoxypolyethylene Glycol (PEG MW 2000)
PEG2000-DMG: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycerol, methoxypolyethylene Glycol (PEG MW 2000)
DOPE: 1,2-Dioleyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
SOPE: 1-Stearoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phsophoethanolamine
SOPC: 1-Stearoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
<メシル化>
2,2’−ジチオジエタノール(ACROS社製)15g(97.2mmol)に、アセトニトリル143mlを加え、20〜25℃にて溶解させた。トリエチルアミン33.3g(328mmol)を加え、20〜25℃で5分間攪拌した後に、氷冷下にて塩化メタンスルホニル34.5g(300mmol)を加え、20〜25℃にて3時間反応を行った。TLC分析(展開溶媒:クロロホルム/メタノール=85/15(v/v))を行い、反応生成物のスポットが得られたこと、並びに原料である2,2’−ジチオジエタノールが消失したことを確認し反応を終了した。反応溶液にエタノール29mLを加え反応を停止させた後に、不溶物を濾紙(5A)で濾別した。濾液に、ジクロロメタン150ml、10%重曹水150gを加え5分間攪拌を行った後に10分間静置し、水層を除去した。次に、有機層に水150gを加え5分間攪拌を行った後に10分間静置し、水層を除去した。水洗を4回繰り返した後に、有機層を回収し、硫酸ナトリウム4.5gを加え脱水を行った。脱水処理後に、オプライト、濾紙(5A)にてろ過を行い、エバポレーターを用いて濾液の溶媒を留去し褐色液体29.4gを得た。
ジメシル体5.0g(16mmol)にアセトニトリル127mlを加え40℃にて溶解させ、更に炭酸カリウム5.5g(39.8mmol)を加え25℃で5分間攪拌した。3−(メチルアミノ)−1−プロパノール(東京化成工業社製)7.2g(80.8mmol)をアセトニトリル9.2mlにて25℃で溶解させた後に、上記のジメシル体/アセトニトリル溶液に1.5時間かけて滴下した。滴下終了2時間後にTLC分析(展開溶媒:クロロホルム/メタノール/28%アンモニア水=80/20/2(v/v/v))を行い、反応が終了したことを確認した。濾紙(5A)にて炭酸カリウムを濾別した後にエバポレーターを用いて溶媒を留去し、褐色液体13.2gを得た。得られた褐色液体をクロロホルム132mlを用いて溶解させた後に、10%食塩水132mlを加え洗浄を行った。水層を廃棄し、10%食塩水洗浄を5回繰り返すことで原料である3−(メチルアミノ)−1−プロパノールを除去した。クロロホルム層を回収した後に、エバポレーターを用いて溶媒を留去し、淡黄色透明の液体(以下di−MAP体)4.3gを得た。
ミリスチン酸1.5g(6.7mmol)をジクロロメタン5.8mlに溶解させた後に、DMAP0.082g(0.67mmol)を加え、TEA0.68g(6.7mmol)を氷冷下にて加えた。この溶液に、di−MAP体1g(3.4mmol)、ジイソプロピルカルボジイミド(以下DIC)1.7g(13.5mmol)をジクロロメタン5.8mlに溶解させた溶液を1時間かけて滴下した。滴下終了後から2時間後のTLC分析(展開溶媒:クロロホルム/メタノール=95/5(v/v))を行った結果より、di−MAP体が消失したことを確認し反応を終了した。濾紙(5A)を用いて不溶分を濾別した後に、エバポレーターを用いて溶媒を留去し、無色透明液体7.2gを得た。この液体にアセトニトリル38mlを加え冷却晶析(10℃)を3回行った。得られた結晶をヘキサン45mlで溶解させ、そこにアセトニトリル38mlを加え抽出洗浄を行った。アセトニトリル層を廃棄し、更に抽出洗浄を6回繰り返し、DIC、ミリスチン酸由来の不純物を除去した。ヘキサン層を回収した後に、エバポレーターを用いて溶媒を留去し目的物であるB−2化合物0.73gを得た。
δ0.85〜0.9ppm(t、CH3-CH2-、6H)、δ1.22〜1.35ppm(m、CH3-(CH2)10-、40H)、δ2.67〜2.7ppm(q、-N(CH3)-CH2-CH2-S-、4H)、δ2.78〜2.82(q、-N(CH3)-CH2-CH2-S-、4H)、δ4.10〜4.13 (t、-CH2-C(O)-O-CH2-、4H)
di−MAP体2.0g(6.7mmol)とステアリン酸4.6g(16.2mmol)をクロロホルム20mlに溶解させた後に、DMAP0.33g(2.7mmol)及び1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(以下EDC)3.9g(20.3mmol)を加えた。反応4時間後のTLC分析(展開溶媒:クロロホルム/メタノール=95/5(v/v))を行った結果より、di−MAP体が消失したことを確認し反応を終了した。その後、反応液を5%重曹水10gを用いて抽出洗浄した後に、水層を廃棄した。次に、回収した有機層に水10gを加えることにより水洗を行った。水層廃棄後、有機層に硫酸マグネシウム0.4gを加えることにより脱水処理を行った。オプライト、濾紙(5A)にて不溶分を濾別し、エバポレーターを用いて溶媒を留去し、橙色の液体(以下ジアシル体)7.9gを得た。
δ0.85〜0.9ppm(t、CH3-CH2-、6H)、δ1.22〜1.35ppm(m、CH3-(CH2)14-、56H)、δ2.67〜2.7ppm(q、-N(CH3)-CH2-CH2-S-、4H)、δ2.78〜2.82(q、-N(CH3)-CH2-CH2-S-、4H)、δ4.10〜4.13 (t、-CH2-C(O)-O-CH2-、4H)
di−MAP体2.0g(6.7mmol)、リノール酸4.5g(16.0mmol)をクロロホルム20mlに溶解させた後に、DMAP0.33g(2.7mmol)、EDC3.9g(20.3mmol)を加えた。反応4時間後のTLC分析(展開溶媒:クロロホルム/メタノール=95/5(v/v))を行った結果より、di−MAP体が消失したことを確認し反応を終了した。その後、反応液を5%重曹水10gを用いて抽出洗浄した後に、水層を廃棄した。次に、回収した有機層に水10gを加えることにより水洗を行った。水層廃棄後、有機層に硫酸マグネシウム0.4gを加えることにより脱水処理を行った。オプライト、濾紙(5A)にて不溶分を濾別し、エバポレーターを用いて溶媒を留去し、橙色の液体であるジアシル体6.0gを得た。
δ0.85〜0.9ppm(t、CH3-CH2-、6H)、δ1.22〜1.35ppm(m、CH3-(CH2)3-、(CH2)4-CH2-CH2-C(O)-O-、28H)、δ2.67〜2.7ppm(q、-N(CH3)-CH2-CH2-S-、4H)、δ4.10〜4.13 (t、-CH2-C(O)-O-CH2-、4H) 、δ5.30〜5.40(m、- CH2- CH- CH- CH2-、8H)
(B-2-4の合成)
di-MAP 体0.40 g (1.35 mmol)とレチノイン酸 (all-trans-retinoic acid,和光純薬工業) 0.97 g (3.24mmol)をクロロホルム 6.00 gに溶解させた後に、DMAP 0.07 g (0.54mmol)、EDC 0.78 g (4.05mmol) を加え、25±3℃ にて5 時間反応させた。TLC分析(展開溶媒:クロロホルム/メタノール = 9/1 v/v )により、di-MAP体が消失したことを確認し反応を終了した。エバポレーターを用いて溶媒を留去し、2.70 g の液体を得た。この液体をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製(溶離液:クロロホルム/メタノール = 98/2 (v/v))し、目的物であるB-2-4化合物0.42gを得た。
δ1.00〜1.10ppm(s、(CH3)2C-、12H)、δ1.45〜1.50ppm(t、(CH3)2C-CH2-CH2-、4H)、δ1.55〜1.65ppm (m、-CH2-CH2-CH2-、4H)、δ1.70〜1.75 (s、-CH2-C(CH3)=C-、6H) 、δ1.80〜1.90(t、-N(CH3)-CH2-CH2-CH2-O-C(O)-、4H)、δ1.95〜2.0.5(m、-CH2-CH2-C(CH3)=C-、=CH-CH(CH3)=CH-、10H)、δ2.20〜2.30(s、-N(CH3)-、6H)、δ2.30〜2.40(s、-C(CH3)=CH-C(O)-O-、6H)、δ2.45〜2.55(t、-N(CH3)-CH2-CH2-CH2-O-C(O)-、4H)、δ2.65〜2.75(t、-N(CH3)-CH2-CH2-S-、4H)、δ2.75〜2.85(t、-N(CH3)-CH2-CH2-S-、4H)、δ4.10〜4.25(t、-N(CH3)-CH2-CH2- CH2-O-C(O)-、4H) 、δ5.75〜5.85(t、-C(O)-O-CH2-CH2-O-C(O)-、4H)
(B-2-5の合成)
di-MAP 体 0.50 g (1.69 mmol)とD-α-tocopherol succinate (SIGMA-ALDRICH) 2.15 g (4.06mmol)をクロロホルム 7.50 g,に溶解させた後に、DMAP 0.08 g (0.62mmol)、EDC 0.97 g (5.07mmol) を加え、25±3℃ にて4 時間反応させた。TLC分析(展開溶媒:クロロホルム/メタノール = 9/1 v/v )により、di-MAP体が消失したことを確認し反応を終了した。エバポレーターを用いて溶媒を留去し、2.23gの液体を得た。この液体をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製(溶離液:クロロホルム/メタノール = 98.5/1.5 (v/v))し、目的物であるB-2-5化合物 0.94gを得た。
δ0.85〜0.9ppm(t、CH3-CH2-、-CH2-(CH3-)CH-CH2-、24H)、δ1.00〜1.75ppm(m、CH3-CH(CH3)-(CH2)3-CH(CH3)-(CH2)3-CH(CH3)-(CH2)3-、42H)、δ1.75〜1.85ppm (q、-N(CH3)-CH2-CH2- CH2-O-C(O)-、4H)、δ1.95〜2.15 (s、-C=C(CH3)-、18H) 、δ2.20〜2.30(s、-N(CH3)-、6H)、δ2.40〜2.50(t、-N(CH3)-CH2-CH2-S-、4H)、δ2.50〜2.63(t、-CH2-CH2-CH=CH-、4H)、δ2.63〜2.70(t、-N(CH3)-CH2-CH2-S-、4H)、δ2.70〜2.85(m、-N(CH3)-CH2-CH2- CH2-O-C(O)-、-C(O)-O-CH2-CH2-O-C(O)-、8H)、δ2.85〜3.00(t、-C(O)-O-CH2-CH2-O-C(O)-、4H)、δ4.10〜4.25(t、-N(CH3)-CH2-CH2-CH2-O-C(O)-、4H)
(B−2−1の合成)
ジスルフィド結合を有する本発明との比較を行う意図で、実施例1の化合物のジスルフィド結合を炭素結合に置換した化合物の合成を行った。
1,6−ジブロモヘキサン(東京化成工業社製)6.0g(24.6mmol)をDMF12.7mlに溶解させ、3−(メチルアミノ)−1−プロパノール(東京化成工業社製)6.6g(73.7mmol)と炭酸カリウム1.7g(12.3mmol)を加え、20〜25℃にて3時間攪拌した。TLC(展開溶媒:クロロホルム/メタノール/28%アンモニア水溶液=80/20/2(v/v/v))にて反応の進行を確認した。反応液中の炭酸カリウムを濾紙(5A)を用いて濾別した後、エバポレーターを用いて溶媒を留去し、褐色液体を得た。得られた褐色液体をクロロホルム20mlで溶解させ、水30gを用いて抽出洗浄した。有機層の溶媒をエバポレーターを用いて留去し、褐色液体3.6gを得た。
得られた液体2.0g、ミリスチン酸4.0g(18.4mmol)をクロロホルム20mlに溶解させた後に、DMAP0.37g(3.0mmol)、EDC4.4g(23.1mmol)を加えた。反応4時間後のTLC分析(展開溶媒:クロロホルム/メタノール=85/15(v/v))を行った結果より、原料が消失したことを確認し反応を終了した。その後、反応液を5%重曹水10gを用いて抽出洗浄した後に、水層を廃棄した。次に、回収した有機層に水10gを加えることにより水洗を行った。水層廃棄後、有機層に硫酸ナトリウム2gを加えることにより脱水処理を行った。オプライト、濾紙(5A)にて不溶分を濾別し、エバポレーターを用いて溶媒を留去した。得られた濃縮物をヘキサン47mlに溶解し、アセトニトリル39mlを用いて抽出洗浄した。ヘキサン層を回収し、エバポレーターを用いて溶媒を留去し、目的物であるB2−2−1化合物2.83gを得た。
δ0.85〜0.9ppm(t、CH3-CH2-、6H)、δ1.22〜1.35ppm(m、CH3-(CH2)10-、-N(CH3)-CH2-CH2-CH2-、44H)、δ1.40〜1.50ppm(m、-N(CH3)-CH2-CH2-CH2-、4H)、δ2.37〜2.41(t、-N(CH3)-CH2-CH2-CH2-、4H)、δ4.08〜4.12 (t、-CH2-C(O)-O-CH2-、4H)
(1)プラスミドDNA(pDNA)とプロタミンからなる核酸静電的複合体の形成
ベクターのコアとして、ルシフェラーゼ遺伝子をコードするpDNA溶液、プロタミン(CALBIOCHEM)溶液を、10mM HEPES緩衝液でそれぞれ0.3mg/mL、0.05mg/mLに希釈し、0.3mg/mL pDNA125μLを攪拌しながら0.24mg/mL プロタミン125μLを少量ずつ滴下してプロタミンとpDNAの静電的複合体を調製した(N/P比=1.2)。下記の(2)記載の方法による方法においては、pHが5.3の10mM HEPES緩衝液を用い、また、(3)記載の方法においては、pHが7.4の10mM HEPES緩衝液を用いた。
脂質のエタノール溶液は、エッペンドルフチューブに5mMのカチオン性脂質、5mMリン脂質、5mM コレステロール(Chol)を総脂質165nmolになるように目的の割合で混合し、各種PEG脂質(1mM エタノール溶液)をさらに総脂質の3モル%相当量添加し、全量で100μLとなるようにエタノールを加えた。脂質溶液をボルテックスミキサーを用いて攪拌しながら、[試験例1](1)で調製した核酸静電的複合体100μL(10mM HEPES;pH5.3)を素早く加え、その後pH5.3に調製した10mM HEPES緩衝液1.8mLを加え、エタノール濃度が5%になるまで希釈した。Amicon Ultra 4(Millipore社)を用い、遠心条件(室温,2267rpm,20min)で約50μLまで限外濾過し濃縮した。その後、pH7.4に調製した100mM HEPES緩衝液を用いて4mLまでメスアップし、再度、室温条件で遠心(2267rpm,20min)を行うことで濃縮した。最後に、10mM HEPES緩衝液(pH7.4)で目的の脂質濃度になるようメスアップした。
ガラス試験管にDOTAP:DOPE:Chol=3:4:3となるように、各脂質のクロロホルム溶液5mM DOTAP24.75μL、5mM DOPE33μL、5mM Chol24.75μLを混ぜ、総脂質量は412.5nmolとなるようにした。全量で250μLとなるようにエタノールを加え、デシケーターで減圧乾燥し、溶媒を留去して脂質薄膜を得た。脂質薄膜に総脂質濃度が1.65mMとなるように[試験例1](1)で調製した遺伝子静電的複合体250μL(10mM HEPES;pH7.4)を添加し、室温で10min静置し水和させた後、ソニケーター(アイワ医科工業株式会社)で1分間超音波処理した。
ローダミン標識pDNAは、Label/IT CX−Rhodamine Labeling Kit(Mirus)を用いて添付プロトコルに従い調製した。得られたローダミン標識pDNA溶液は、Nano Drop(Thermo Scientific)を用いて、濃度を算出した。ローダミン標識されたpDNAが封入されたMENDを調製する際には、[試験例1](1)に記載したpDNA溶液をすべてローダミン標識されたpDNAに置き換え、[試験例1](2)、(3)に記載の方法に従いMENDを調製した。
[試験例1]
(2)、(3)に記載されたMENDの調製時に、NBD−DOPE(Avanti Polar Lipids)のエタノール溶液を総脂質量の1モル%相当分加えることで、脂質膜が蛍光ラベルされたMENDの調製を行った。
各種MENDの粒子径、及び表面電位の測定
粒子径並びに表面電位は、動的光散乱法(Zetasizer Nano;Malve Rn社)を用いて測定した。[試験例1]の調製法により調製された各種MENDの粒子径、表面電位を表3に示す。B−2やDODAPでは、生理的pHにおいて、電荷は好ましい形態である−10〜+10mVであるのに対し、B−2−1においては、+12.3と+10mV以上の電荷を帯びていた。
また、公知のカチオン性脂質であるDOTAPを用いたMENDでは表面電位は+50mV程度であった。
還元的環境でのリポソーム崩壊試験
TNSを用いた各種MENDの還元的環境下における脂質膜不安定性の評価
各種MEND溶液に終濃度10mMとなるようにDTTを加え37℃で静置した。0、1、2、4、8、24時間後のタイムポイントにおいてTNS(6−(p−Toludino)−2−Naphthalene Sulfonic acid)による蛍光強度を測定した。MEND溶液を0.5mMへと希釈し、0.5mM MEND溶液12μL、酸性pH(pH4.0)の20mMクエン酸緩衝液(150mM NaCl含有)を186μL、0.6mM TNS2μLを蛍光測定用96−well plate(nunc社)へ加え、励起波長321nm、検出波長447nmで、37℃での蛍光強度を測定した。コントロールとして、DTTを含んでいない同量の10mM HEPES緩衝液を0時間で加え、各時間37℃で静置したMEND溶液を用い、同様の処理によりTNSによる蛍光強度測定を行った。コントロールの蛍光強度で還元環境下の蛍光強度を除したものを、脂質膜の不安定化の指標としている。結果を図1に示す。
遺伝子発現及び細胞内取り込み活性評価
(1)MENDの細胞内取り込み量評価
カチオン性脂質としてB−2(実施例1)、B−2−1(比較例1)、DODAP(比較例2)を用い、カチオン性脂質:SOPE:Chol=3:4:3からなる組成のMENDを[試験例1](2)に記載の方法に従い調製した。本調製においては、PEG脂質としてPEG2000DSGを用い、脂質濃度に換算して0.55mM相当のMEND溶液を調製した。また、カチオン性MENDにおいては、DOTAP(比較例3):DOPE:Chol:=3:4:3の組成からなる脂質を用い、[試験例1](3)に記載の方法に従い調製した。各種MENDの脂質を蛍光ラベルする際には、[試験例1](5)に記載の方法で行った。
カチオン性脂質としてB−2(実施例1)、B−2−1(比較例1)、DODAP(比較例2)を用い、カチオン性脂質:SOPE:Chol=3:4:3からなる組成のMENDを[試験例1](2)に記載の方法に従い調製した。本調製においては、PEG脂質としてPEG2000DSGを用い、脂質濃度に換算して0.55mM相当のMEND溶液を調製した。また、カチオン性MENDにおいては、DOTAP:DOPE:Chol:=3:4:3の組成からなる脂質を用い、[試験例1](3)に記載の方法に従い調製した。
遺伝子発現活性
B−2(実施例1)及び、B−2−2(実施例2)、B−2−3(実施例3)をカチオン性脂質として、カチオン性脂質:SOPE:Chol=3:4:3からなる組成のMENDを[試験例1](2)に記載の方法に従い調製した。本調製においては、PEG脂質としてPEG2000−DSGを用い、脂質濃度に換算して0.55mM相当のMEND溶液を調製した。遺伝子発現評価は、[実施例4](2)に記載の方法で行った。結果を図5に示す。
細胞内動態(エンドソーム脱出効率)
MEND調製には、[試験例1](4)の方法で調製されたRhodamine標識pDNAを用いた。 カチオン性脂質:SOPE:Chol=5:3:2からなる組成のMENDを[試験例1](2)に記載の方法に従い調製した。本調製においては、PEG脂質としてPEG2000−DMGを用い、脂質濃度に換算して0.55mM相当のMEND溶液を調製した。また、カチオン性MENDにおいては、DOTAP(比較例3):DOPE:Chol:=3:4:3の組成からなる脂質を用い、[試験例1](3)に記載の方法に従い調製した。また、DOTAP:DOPE:Chol:=3:4:3の脂質組成を有するカチオン性MENDも単純水和法により調製し、脂質濃度として0.55mMとした。
細胞内動態(脱被覆効率)
MEND調製には、[試験例1](4)の方法で調製されたRhodamine標識pDNAを用いた。また、MENDを構成する脂質の蛍光ラベル化は、[試験例1](3)に記載の方法により行った。カチオン性脂質:SOPE:Chol=5:3:2からなる組成のMENDを[試験例1](2)に記載の方法に従い調製した。本調製においては、PEG脂質としてPEG2000−DMGを用い、脂質濃度に換算して0.55mM相当のMEND溶液を調製した。また、カチオン性MENDにおいては、DOTAP:DOPE:Chol:=3:4:3の組成からなる脂質を用い、[試験例1](3)に記載の方法に従い調製した。
in vivoにおける遺伝子発現活性、及び活性持続時間
(1)in vivo投与用MENDの調製
ベクターのコアとして、ルシフェラーゼ遺伝子をコードするpDNA溶液、プロタミン(メーカー)溶液をそれぞれ、10mM HEPES緩衝液でそれぞれ0.3mg/mL、0.24mg/mLに希釈し、0.3mg/mL pDNA400μLを攪拌しながら0.23mg/mLのプロタミン溶液を400μLを少量ずつ滴下してプロタミンとpDNAの静電的複合体を調製した(N/P比=1.2)。
(1)の項で示した方法で調製したMEND溶液、及び肝臓で高い遺伝子発現を有している、MPC/GALAを使用したカチオン性MEND(Ukawa et al., Biomaterials., 31(24) 6355-6362(2010))を各々40μg DNA相当、5週齢の雄のICRマウスに尾静脈投与した。6、24、48、72時間後にマウスを頸椎脱臼法によって安楽死させ、肝臓・肺・脾臓を摘出し、液体窒素で凍結処理した。これをLysis緩衝液中で融解させ、ホモジネートの作製を行った。これを13,000rpm,10分,4℃で遠心し、上清を採取し、これを測定サンプルとした。サンプル溶液20μLをルシフェラーゼ基質50μLと混合し、Luminescenser−PSN(AB2200 ATTO)を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。また、サンプル中のタンパク質濃度を、BCA protein assay kitを用いて定量し、遺伝子発現活性をRLU/mg proteinとして測定した。結果を図9及び図10に示す。
エンドソーム、ライソソーム酸性化阻害による遺伝子発現活性への影響
カチオン性脂質としてB−2(実施例1)、B−2−1(比較例1)、DODAP(比較例2)を用い、カチオン性脂質:SOPE:Chol=5:3:2からなる組成のMENDを[試験例1](2)に記載の方法に従い調製した。本調製においては、PEG脂質としてPEG2000−DMGを用い、脂質濃度に換算して0.55mM相当のMEND溶液を調製した。また、カチオン性MENDにおいては、DOTAP(比較例3):DOPE:Chol:=3:4:3の組成からなる脂質を用い、[試験例1](3)に記載の方法に従い調製した。
試験管内翻訳反応に対する影響の評価
Rabbit Reticulocyte Lysate Systems, Nuclease Treated(promega社)を用いた試験管内翻訳系に対する阻害効果の評価
B−2:SOPE:Chol=5:3:2からなる組成のMENDを[試験例1](2)に記載の方法に従い調製した。本調製においては、PEG脂質としてPEG2000−DMGを用い、脂質濃度に換算して0.55mM相当のMEND溶液を調製した。また、カチオン性MENDにおいては、DOTAP:DOPE:Chol:=3:4:3の組成からなる脂質を用い、[試験例1](3)に記載の方法に従い調製した。
血清耐性評価
B−2(実施例1):SOPE:Chol=3:4:3あるいは、B−2(実施例1):SOPC:Chol=3:4:3からなる組成のMENDを[試験例1](2)に記載の方法に従い調製した。本調製においては、PEG脂質としてPEG2000−DMGを用い、脂質濃度に換算して0.55mM相当のMEND溶液を調製した。
B−2 MENDによる遺伝子発現活性の経時変化の評価
試験例9で示した方法で調製したMEND溶液、及び肝臓で高い遺伝子発現を有している、R8/GALAを使用したカチオン性MEND(Khalil et al., J Control Release., 156(3) 374-80, 2011)、肝臓を標的とした市販の遺伝子導入試薬であるin vivo JetPEI−Gal (PolyPlus−Transfection)を各々40μg DNA相当、5週齢の雄のICRマウスに尾静脈投与した。この際、B−2からなるMENDに搭載するDNAとして、免疫応答を誘起することが知られているCpG配列をすべて除外したpDNAとして、国際公開第2011/132713号に記載のpCpGfree-Luc(0)を、また、CpG配列を有する一般的なpDNAとして、プラスミドDNAのバックボーンにCpG配列を含み、かつマーカー遺伝子であるルシフェラーゼ配列の開始コドンからストップコドンにもCpG配列を有するプラスミドDNA(pcDNA3.1-Luc(+);CpG配列合計425個)を用いた。カチオン性MENDおよび、in vivo JetPEI−Galを用いた遺伝子導入においては、pCpGfree-Luc(0)のみを用いた。6,24, 72時間後に3mg相当のルシフェリン(in vivo grade, Promega)をマウスに腹腔内投与し、IVIS LuminaII(Caliper Life Sciences)を用いてイメージングを行った。なお、B−2からなるMENDについては72時間より後の時刻においても週に2回程度イメージングを行った。取得した画像からマウス腹部における総発光量をphoton/secとして算出し、これを肝臓における遺伝子発現活性の指標とした。取得した画像を図14(上段)に、総発光量のグラフを図14(下段)に示した。
MENDの肝臓内挙動の評価
試験例9で示した方法で調製したMEND、及び肝臓で高い遺伝子発現を有しているR8/GALAを使用したカチオン性MEND(Khalil et al., J Control Release., 156(3) 374-80)に対し、それぞれ調製段階で脂質溶液にRhodamine−DOPE(Avanti polar lipids)を加えることによって蛍光ラベルした。なお、R8/GALA−MENDに対しては総脂質濃度の0.1%、B−2 MENDに対しては総脂質濃度の1%となるようにRhodamine−DOPEを加えた。50mg/mLのペントバルビタールナトリウム(ナカライテスク)を生理食塩水で5倍希釈したものをICRマウス(5週齢♂)に腹腔内投与し、麻酔を行った。麻酔下のマウスにGriffonia simplicifolia Lectin I−B4 Isolectin, FITC Conjugate (VECTOR Laboratories)を80μL程度尾静脈投与し、血管内皮細胞の染色を行った。マウスの開腹を行い、肝臓を露出させ、臓器の乾燥を防止するためにImmersolTM518F(Carl Zeiss)を臓器に滴下した。マウス尾静脈にMEND溶液で満たした延長チューブを接続した翼付静脈留置針を留置した。マウスの心臓の拍動による観察部位のずれを防止するため、肝臓を吸着させて固定するデバイス(Shimizu K et al., J Biosci Bioeng. 112(5):508-10)を用い、共焦点顕微鏡(Nikon A1)を用いて60倍水浸レンズで観察を行った。動画の撮影開始後約5秒で40μg DNA/mouseとなるようにマウスにMENDを投与し、約10分後に動画の撮影を終了した。結果を図15に示した。
MEND投与によるサイトカイン産生評価
[試験例12]において用いたMENDを各々40μg DNA相当、5週齢の雄のICRマウスに尾静脈投与した。1,3,6, 24時間後に心臓より血液を採取し、Quantikine ELISA kit(R&D Systems)を用い、TNF−α、IFN−γ、IL−12p70を測定した。各々の血中濃度推移を図16に示す。
B−2−4、B−2−5を用いたMENDの調製
(1)B−2−4(実施例4):DOPE:Chol=3:3:4、B−2−5(実施例5):POPE:Chol=3:4:3からなる組成のMENDを[試験例1](1)、(2)に記載の方法に従い調製した。
Cy5標識pDNAは、Label/IT Cy5 Labeling Kit(Mirus)を用いて添付プロトコルに従い調製した。得られたCy5標識pDNA溶液は、Nano Drop(Thermo Scientific)を用いて、濃度を算出した。Cy5標識されたpDNAが封入されたMENDを調製する際には、[試験例1](1)に記載したpDNA溶液のうち10%をCy5標識されたpDNAに置き換え、[試験例1](2)、(3)に記載の方法に従いMENDを調製した。
各種MENDの粒子径、及び表面電位の測定
粒子径並びに表面電位は、動的光散乱法(Zetasizer Nano;Malvern社)を用いて測定した。[試験例1]の調製法により調製された各種MENDの粒子径、表面電位を表4に示す。B−2−4、B−2−5ともに、生理的pHにおいて好ましい電荷である−10〜+10mVであった。
染色法による電子顕微鏡観察
B−2(実施例1)、B−2−4(実施例4)について[試験例1](1)、(2)、[試験例15]に従いMENDを調製した。本調製においては、PEG脂質としてPEG2000−DMGを用い、脂質濃度に換算して1.38mM相当のMEND溶液を調製した。遠心チューブに50%ショ糖溶液(pH5.3)を5mL加え10%ショ糖溶液(pH5.3)を5mL重層し、さらにMEND溶液1.5mLを重層し不連続密度勾配を形成した。超遠心(110000g、2h、25℃)により精製を行った(OptimaTM L−90K Ultracentrifuge、Sw41Ti、BECKMAN)。ショ糖密度10%と50%の界面を4mL回収し、限外濾過(1000g、3min、25℃)によりショ糖を除きサンプル溶液とした。2倍希釈したサンプル溶液を400メッシュカーボンフィルムTEMグリッドに吸着させ、ろ紙で吸い取った後、2%リンタングステン酸溶液(pH7.0)を加え10秒間静置した。観察は透過型電子顕微鏡(JEM−1200EX、日本電子)で行った。加速電圧は80kVとし、画像はCCDカメラ(VELETA、日本電子)を用いて撮影した。結果を図17に示す。
遺伝子発現活性評価
脂質としてB−2−4(実施例4):DOPE:Chol=3:3:4、B−2−5(実施例5):POPE:Chol=3:3:4、B−2(実施例1):SOPE:Chol=5:3:2からなる組成を用い、[試験例1](1)、(2)に従ってMENDの調製を行った。本調製においては、PEG脂質としてPEG2000−DMGを用い、脂質濃度に換算して0.55mM相当のMEND溶液を調製した。
遺伝子発現活性および細胞内取り込み量の経時的評価
(1)MEND細胞内取り込み量の経時的観察
B−2−4(実施例4)、B−2(実施例1)について、[試験例1](1)、(2)、[試験例15]に従いMENDを調製した。本調製においては、PEG脂質としてPEG2000−DMGを用い、脂質濃度に換算して0.55mM相当のMEND溶液を調製した。また、カチオン性MENDにおいては、DOTAP(比較例3):DOPE:Chol:=3:4:3の組成からなる脂質を用い、[試験例1](3)に記載の方法に従い調製した。pDNAを蛍光ラベルする際には[試験例15](2)に記載の方法で行った。
B−2−4(実施例4)、B−2(実施例1)について、[試験例1](1)、(2)、[試験例18]に従いMENDを調製した。本調製においては、PEG脂質としてPEG2000−DMGを用い、脂質濃度に換算して0.55mM相当のMEND溶液を調製した。また、カチオン性MENDにおいては、DOTAP(比較例3):DOPE:Chol:=3:4:3の組成からなる脂質を用い、[試験例1](3)に記載の方法に従い調製した。
細胞内動態(エンドソーム脱出効率)
(1)エンドソーム脱出効率評価
MEND調製には、[試験例1](4)の方法で調製されたRhodamine標識pDNAを用いた。ローダミン標識されたpDNAが封入されたMENDを調製する際には、[試験例1](1)に記載したpDNA溶液のうち50%をローダミン標識されたpDNAに置き換えた。
B−2−4(実施例4):DOPE:Chol=3:3:4、B−2(実施例1):SOPE:Chol=5:3:2からなる組成のMENDを[試験例1](2)に記載の方法に従い調製した。本調製においては、PEG脂質としてPEG2000−DMGを用い、脂質濃度に換算して0.55mM相当のMEND溶液を調製した。
細胞内動態(脱被覆効率)
MEND調製には、[試験例1](4)の方法で調製されたRhodamine標識pDNAを用いた。ローダミン標識されたpDNAが封入されたMENDを調製する際には、[試験例1](1)に記載したpDNA溶液のうち50%をローダミン標識されたpDNAに置き換えた。また、MENDを構成する脂質の蛍光ラベル化は、[試験例1](3)に記載の方法により行った。B−2−4(実施例1):DOPE:Chol=3:3:4、B−2(比較例2):SOPE:Chol=5:3:2からなる組成のMENDを[試験例1](2)に記載の方法に従い調製した。本調製においては、PEG脂質としてPEG2000−DMGを用い、脂質濃度に換算して0.55mM相当のMEND溶液を調製した。
細胞内動態(細胞内取り込み経路)
(1)細胞内取り込み量への影響
B−2−4(実施例4)、B−2(実施例1)について、[試験例1](1)、(2)、[試験例18]に従いMENDを調製した。本調製においては、PEG脂質としてPEG2000−DMGを用い、脂質濃度に換算して0.55mM相当のMEND溶液を調製した。pDNAを蛍光ラベルする際には[試験例15](2)に記載の方法で行った。
脂質としてB−2−4(実施例4):DOPE:Chol=3:3:4、B−2(実施例1):SOPE:Chol=5:3:2からなる組成を用い、[試験例1](1)、(2)に従ってMENDの調製を行った。本調製においては、PEG脂質としてPEG2000−DMGを用い、脂質濃度に換算して0.55mM相当のMEND溶液を調製した。
エンドソーム酸性化阻害剤の影響評価
B−2−4(実施例4)、B−2(実施例1)について、[試験例1](1)、(2)、[試験例N8]に従いMENDを調製した。本調製においては、PEG脂質としてPEG2000−DMGを用い、脂質濃度に換算して0.55mM相当のMEND溶液を調製した。
レチノイン酸(RA)による阻害効果の評価
(1)遺伝子発現阻害効果
B−2−4(実施例4)、B−2(実施例1)について、[試験例1](1)、(2)、[試験例18]に従いMENDを調製した。本調製においては、PEG脂質としてPEG2000−DMGを用い、脂質濃度に換算して0.55mM相当のMEND溶液を調製した。
細胞内動態(核輸送)
MEND調製には、[試験例1](4)の方法で調製されたRhodamine標識pDNAを用いた。ローダミン標識されたpDNAが封入されたMENDを調製する際には、[試験例1](1)に記載したpDNA溶液のうち全てをローダミン標識されたpDNAに置き換えた。また、MENDを構成する脂質の蛍光ラベル化は、[試験例1](3)に記載の方法により行った。B−2−4(実施例4):DOPE:Chol=3:3:4、B−2(実施例1):SOPE:Chol=5:3:2からなる組成のMENDを[試験例1](2)に記載の方法に従い調製した。本調製においては、PEG脂質としてPEG2000−DMGを用い、脂質濃度に換算して0.55mM相当のMEND溶液を調製した。
GA(Ginkgolic Acid)による阻害効果の評価
B−2−4(実施例4)、B−2(実施例1)について、[試験例16]、[試験例1](1)、(2)に従いMENDを調製した。本調製においては、PEG脂質としてPEG2000−DMGを用い、脂質濃度に換算して0.55mM相当のMEND溶液を調製した。
siRNAとプロタミンからなる核酸静電的複合体の形成
ベクターのコアとして、siRNA溶液、プロタミン溶液(CALBIOCHEM)溶液を、10mM HEPES緩衝液(pH5.3)でそれぞれ0.3mg/mL、0.2mg/mLに希釈し、0.3mg/mL siRNA溶液250μLを攪拌しながら0.2mg/mL プロタミン溶液250μLを少量ずつ滴下してsiRNAとプロタミンの静電的複合体を調製した(N/P比=1.0)。
エタノール希釈法によるsiRNA封入MENDの調製
脂質のエタノール溶液を、B−2 MEND(実施例1)はB−2:SOPE:Chol=5:3:2、B−2−4 MEND(実施例4)はB−2−4:DOPE:Chol=3:3:4、B−2−5 MEND(実施例5)はB−2−5:POPE:Chol=3:4:3の比率で、総脂質660nmolになるように5mLチューブに混合した。さらにPEG脂質としてPEG2000−DMGを総脂質量に対して3モル%相当量添加し、それぞれ全量で400μLとなるようにエタノールを加えた。脂質溶液をボルテックスミキサーを用いて攪拌しながら、[試験例27]で調製したsiRNA・プロタミンからなる核酸静電的複合体溶液400μLを混合し、その後素早く10mM HEPES緩衝液(pH5.3)2.4mLを加え、激しく攪拌した。Amicon Ultra−15 100K device(Millipore社)を用い、1000g,10分,30℃で遠心し限外濾過した。その後、10mM HEPES緩衝液(pH7.4)で十分希釈し、再び限外濾過を行い濃縮した。この溶液を10mM HEPES緩衝液(pH7.4)で目的の脂質濃度になるよう調整した。
siRNA封入MENDの粒子径、及び表面電位の測定
粒子径並びに表面電位は、動的光散乱法(Zetasizer Nano;Malvern社)を用いて測定した。[試験例28]の調製法により調製された各種MENDの粒子径、表面電位を表5に示す。いずれにおいても生理的pHでは、弱い負電荷を示した。
siRNA封入MENDのノックダウン効果
[試験例28]で示した方法で調製したMEND溶液を、4週齢の雄のICRマウスに、3mg siRNA/kgで尾静脈投与し、24時間後に、血液を採取した。本血液サンプルを1000g、10分、4℃で遠心し、上清を回収することで血漿を得た。血漿中のFactor VII(FVII)量を、BIOPHEN FVII CHROMOGENIC ASSAY(HYPHEN BioMed)を用いて定量した。結果を図33に示す。未処理群に比べ、B−2、B−2−4、B−2−5いずれにおいてもFVII発現量の低下が見られ、その中でもB−2−5 MENDが最も大きいノックダウン効果を示した。
siRNA封入MENDの持続性評価
[試験例28]で示した方法で調製したMEND溶液を、4週齢の雄のICRマウスに、3mg siRNA/kgで尾静脈投与してから6日目まで、24時間後ごとに尾静脈より継時的に血液を採取し、FVIIの発現量を経時的に追った。結果を図34に示す。
Claims (9)
- 式(1)
(式中、Xa及びXbは独立して、X1又はX2であり;
sは1又は2であり、
R4は炭素数1〜6のアルキル基を表し、
na及びnbは独立して、0又は1であり、
R1a及びR1bは独立して、炭素数1〜6のアルキレン基を表し、
R2a及びR2bは独立して、炭素数1〜6のアルキレン基を表し、
Ya及びYbは独立して、エステル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合又は尿素結合を表し、
R3a及びR3bは独立して、ステロール残基、脂溶性ビタミン残基又は炭素数12〜22の脂肪族炭化水素基を表す)で示される化合物。 - Xa及びXbが独立して、X1である請求項1記載の化合物。
- R3a及びR3bが独立して、脂溶性ビタミン残基又は炭素数12〜22の脂肪族炭化水素基である請求項1又は2記載の化合物。
- R3a及びR3bが独立して、脂溶性ビタミン残基である請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物。
- R3a及びR3bが独立して、炭素数12〜22の脂肪族炭化水素基である請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の化合物を膜の構成脂質として含む脂質膜構造体。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の化合物、又は請求項6記載の脂質膜構造体を含む核酸導入剤。
- 生体外において、核酸を内封した請求項6記載の脂質膜構造体と細胞とを接触させることを含む、当該核酸を当該細胞内へ導入する方法。
- 核酸を内封した請求項6記載の脂質膜構造体を、標的細胞へ送達されるように、生体へ投与することを含む、当該核酸を当該細胞内へ導入する方法。
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