CN108348615B

CN108348615B - O/w型乳液

Info

Publication number: CN108348615B
Application number: CN201680058794.4A
Authority: CN
Inventors: 丹下耕太; 中井悠太; 秋田英万; 田中浩挥; 渡边绫香; 三浦尚也; 原岛秀吉
Original assignee: Hokkaido University NUC; NOF Corp
Current assignee: Hokkaido University NUC; NOF Corp
Priority date: 2015-10-08
Filing date: 2016-06-29
Publication date: 2021-11-12
Anticipated expiration: 2036-06-29
Also published as: US20190110986A1; JP6875685B2; EP3360576B1; CN108348615A; WO2017061150A1; EP3360576A1; JPWO2017061150A1; US11395798B2; EP3360576A4

Abstract

本发明提供O/W型乳液，其体积中值直径为100nm以下，并且包含式(1)所示的化合物(式中，X^a和X^b独立地是X¹、X²或1,4‑哌嗪二基；s是1或2，R⁴表示碳原子数为1~6的烷基，n^a和n^b独立地是0或1；R^1a、R^1b、R^2a、R^2b独立地表示碳原子数为1~6的亚烷基；Y^a和Y^b独立地表示酯键等；R^3a和R^3b独立地表示脂溶性维生素残基等)。

Description

O/W型乳液

技术领域

本发明涉及对细胞内的还原性环境响应从而崩解的O/W型乳液、和其制备方法。此外，本发明涉及该O/W型乳液作为用于将水难溶性药物递送至细胞内的载体的用途。

背景技术

大多数新药候补物质、例如抗恶性肿瘤药、免疫抑制剂、抗生素、抗真菌剂、抗高脂血症剂、抗炎症剂等是水难溶性的。即使在其具有充分的药理活性时，由于其难以配制，因此开发常常暂缓或者中止。

常规而言，当将水难溶性药物应用于医药产品时，已尝试了例如用亲水性表面活性剂或包合物化合物、例如环糊精进行的可溶化、或者使用植物油和卵磷脂的乳化。为了在减少副作用的同时实现期望的药效，进一步需要控制平均粒径和促进细胞内的释放，从而可以提高在目标细胞和组织中的累积性。

具有受控的平均粒径可溶化剂的实例包括非专利文献1中记载的聚合物胶束、以及非专利文献2和非专利文献3中记载的脂质体。这些文献教导了，由于被控制为100nm或更低的平均粒径使得能够通过避免由脾的排出从而增加血中滞留性、并且提高在靶组织、例如肿瘤等中的累积性，因此其对向生物体给药是有利的。但是，这些胶束和脂质体在细胞内的药物的释放效率方面还存在改善的空间。

本发明人开发了具有在细胞内使脂质膜结构体崩解的性质的脂质(专利文献1、专利文献2)。脂质结构体、例如含有该脂质的脂质体等容易在细胞内的还原环境下崩解，并以高效率释放出作为水溶性化合物的核酸。因此，可以将脂质结构体用作用于将核酸高效地递送至细胞内的优异载体。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO 2013/073480

专利文献2：US 20140335157

非专利文献

非专利文献1 : Nat Nanotechnol. 2011 Oct 23;6(12):815-23.Accumulationof sub-100 nm polymeric micelles in poorly permeable tumours depends onsize.Cabral H, Matsumoto Y, Mizuno K, Chen Q, Murakami M, Kimura M, Terada Y,Kano MR, Miyazono K, Uesaka M, Nishiyama N, Kataoka K.

非专利文献2 : Biochimica et Biophysica Acta, 1062 (1991) 142-148Activity of amphipathic poly(ethylene glycol) 5000 to prolong thecirculation time of liposomes depends on the liposome size and is unfavorablefor immunoliposome binding to target.Aleksander L. Klibanov, Kazuo Maruyama,Anne Marie Beckerleg,Vladimir P. Torchilin and Leaf Huang

非专利文献3 : Biochimica et Biophysica Acta 1190 (1994) 99-107Effectof liposome size on the circulation time and intraorgan distribution ofamphipathic poly(ethylene glycol)-containing liposomes.David C. Litzinger,Antoinette M.J. Buiting, Nico van Rooijen, and Leaf Huang。

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的目的在于，提供用于将水难溶性药物高效地递送至细胞内的载体。

用于解决课题的手段

本发明人试图在专利文献1和2中公开的含有脂质的脂质体中替换核酸而内封水难溶性药物，并将其导入细胞内。但是，其无法制造稳定地内封水难溶性药物的脂质体。还难以控制该脂质体的粒径至对于向生物体给药而言有利的100nm或更低。本发明人进一步继续试错并发现，使用专利文献1和2中公开的脂质作为构成组分而制备的O/W型乳液与脂质体不同，可以稳定地内封水难溶性药物、并且响应于细胞内的还原性环境而高效地释放药物。进一步，其发现，通过在特定条件下制备，能够将O/W型乳液的体积中值直径控制为100nm或更低，这对于向生物体给药时在组织深部、例如肿瘤等中的累积是有利的，从而完成了本发明。

即，本发明涵盖下述内容。

[1]O/W型乳液，其具有不大于100nm的体积中值直径，并且包含式(1)所示的化合物作为构成组分，

其中，X^a和X^b各自独立地是X¹、X²或1,4-哌嗪二基；

s是1或2，

R⁴是具有1~6个碳原子的烷基，

n^a和n^b各自独立地是0或1，

R^1a和R^1b各自独立地是具有1~6个碳原子的亚烷基，

R^2a和R^2b各自独立地是具有1~6个碳原子的亚烷基，

Y^a和Y^b各自独立地是酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键或脲键，并且

R^3a和R^3b各自独立地是甾醇残基、脂溶性维生素残基或具有12~23个碳原子的脂肪族烃基。

[2][1]所述的O/W型乳液，其中，体积中值直径是30~50nm。

[3][1]或[2]所述的O/W型乳液，其还包含选自磷脂质、胆固醇和PEG脂质中的至少一种。

[4][1]~[3]中任一项所述的O/W型乳液，其内封有水难溶性药物。

[5][4]所述的O/W型乳液，其中，水难溶性药物是4-甲基伞形酮胆固醇半琥珀酸酯或地塞米松胆固醇半琥珀酸酯。

[6]用于将水难溶性药物递送至细胞内的载体，其包含[1]~[3]中任一项所述的O/W型乳液。

[7]用于将水难溶性药物递送至细胞内的方法，其包括：使[4]所述的O/W型乳液与细胞接触。

[8][7]所述的方法，其中，在体外使O/W型乳液与细胞接触。

[9][7]所述的方法，其中，通过向生物体给药，从而使O/W型乳液与细胞接触。

[10]用于制造[1]~[4]中任一项所述的O/W型乳液的方法，其包括：将具有3.0~7.4的pH和0~0.5M的盐浓度的缓冲水溶液与包含式(1)的化合物的脂质的醇溶液混合。

发明的效果

根据本发明的O/W型乳液，能够稳定地在其中内封水难溶性药物。细胞摄取内封有水难溶性药物的本发明的O/W型乳液时，式(1)所示的化合物被细胞内的还原性环境分解，从而使O/W型乳液崩解，由此包含在其中的水难溶性药物在细胞内被高效地释放。因此，本发明的O/W型乳液作为用于将水难溶性药物递送至细胞内的载体是有用的。此外，由于本发明的O/W型乳液具有100nm或更低的体积中值直径，因此可以避免由脾的排出，可以展示出高的血中滞留性和在靶组织、例如肿瘤等中的高累积性，并且其对于在生物体内将水难溶性药物递送至靶组织而言是有利的。

附图说明

图1示出由B-2、B-2-5、O-C3M、B-2-3、或TS-P4C2制备的各种乳液的基于体积的粒径分布。

图2示出由DODAP、或EPC制备的各种颗粒悬浮液的基于体积的粒径分布。

图3示出除了B-2、胆固醇之外还含有DOPC或DOPE的乳液的制备时pH对粒径的影响。

图4示出含有B-2、DOPE、和胆固醇的乳液的制备时盐浓度对粒径分布的影响。

图5示出含有B-2、DOPE、和胆固醇的乳液的制备时盐浓度与体积中值直径之间的关系。

图6示出由B-2、B-2-5、O-C3M、B-2-3、或TS-P4C2制备的各种乳液在还原条件下和非还原环境下的药物释放。

图7示出由DODAP、或EPC制备的各种颗粒悬浮液在还原条件下和非还原环境下的药物释放。

图8示出将由B-2、B-2-5、EPC、或DODAP制备的各种乳液或颗粒悬浮液静脉内注射时颗粒(油滴)的主要脏器分布。

图9示出图8中示出的主要脏器分布的定量评价。

图10示出粒径对由B-2制备的乳液的肿瘤累积性的影响。

图11示出由B-2、B-2-5、DODAP、或EPC制备的各种颗粒(油滴)的肿瘤内分布的荧光显微镜图像。

图12示出由B-2、B-2-5、DODAP、或EPC制备的各种颗粒(油滴)的肿瘤内分布的定量不均匀性。

图13示出用由B-2、DODAP、或EPC制备的各种颗粒给药的组与对比对照组的肿瘤体积增加率。

图14示出在还原条件下(GSH(+))和非还原环境下(GSH(-))的从由L-PZ4C2制备的乳液中的药物释放。

图15示出由B-2、和4-甲基伞形酮棕榈酸酯或4-甲基伞形酮胆固醇半琥珀酸酯制备的乳液中、脂质和药物的血中滞留性的对比。

图16示出由B-2、和4-甲基伞形酮胆固醇半琥珀酸酯制备的乳液中、在血中的药物浓度和在肿瘤中的药物浓度的对比。

图17示出由B-2、和4-甲基伞形酮胆固醇半琥珀酸酯制备的乳液的脏器分布的对比。

图18示出由B-2、和地塞米松棕榈酸酯或者地塞米松胆固醇半琥珀酸酯组成的乳液中药物的血中滞留性的对比。

图19示出由B-2和地塞米松胆固醇半琥珀酸酯组成的乳液在各种PEG脂质浓度下的血中滞留性的对比。

图20示出将由B-2和地塞米松胆固醇半琥珀酸酯组成的乳液对小鼠给药时各种mRNA的表达水平的评价。

图21示出将由B-2和地塞米松胆固醇半琥珀酸酯组成的乳液对小鼠给药时抗肿瘤效果的评价。

图22是4-甲基伞形酮胆固醇半琥珀酸酯的¹H-NMR谱的分析结果。

图23是地塞米松胆固醇半琥珀酸酯的¹H-NMR谱的分析结果。

具体实施方式

尽管在下文中说明了本发明的实施方式，但本发明不限定于此。

本发明提供O/W型乳液，其含有式(1)所示的化合物，

。

式(1)中，X^a和X^b各自独立地是下文所示的X¹、X²或1,4-哌嗪二基，

。

X¹中的R⁴是具有1~6个碳原子的烷基，其可以是直链、支链或环状。烷基优选具有1~3的碳原子数。具有1~6个碳原子的烷基的具体实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、1,2-二甲基丙基、2-甲基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、环己基等。R⁴优选是甲基、乙基、丙基或异丙基，最优选是甲基。

X²中的s是1或2。s是1时，X²是吡咯烷鎓基，s是2时，X²是哌啶鎓基。s优选是2。尽管X²的键合方向没有限制，但X²中的氮原子优选键合于R^1a和R^1b。

X^a与X^b可以相同或不同，并且X^a优选是与X^b相同的基团。

n^a和n^b各自独立地是0或1，优选是1。n^a是1时，R^3a借助Y^a和R^2a键合于X^a，并且n^a是0时，采取R^3a-X^a-R^1a-S-的结构。类似地，n^b是1时，R^3b借助Y^b和R^2b而键合于X^b，并且n^b是0时，采取R^3b-X^b-R^1b-S-的结构。

n^a与n^b可以相同或不同，并且n^a优选与n^b相同。

R^1a和R^1b各自独立地是具有1~6个碳原子的亚烷基，其可以是直链或支链，优选是直链。具有1~6个碳原子的亚烷基的具体实例包括亚甲基、亚乙基、三亚甲基、亚异丙基、四亚甲基、亚异丁基、五亚甲基、亚新戊基等。R^1a和R^1b各自优选是亚甲基、亚乙基、三亚甲基、亚异丙基或四亚甲基，最优选是亚乙基。

R^1a与R^1b可以相同或不同，并且R^1a优选是与R^1b相同的基团。

R^2a和R^2b各自独立地是具有1~6个碳原子的亚烷基，其可以是直链或支链，优选是直链。具有1~6个碳原子的亚烷基的实例包括对于R^1a和R^1b而引述为具有1~6个碳原子的亚烷基的实例的那些。

R^2a和R^2b各自优选是亚甲基、亚乙基、三亚甲基、亚异丙基或四亚甲基。

X^a和X^b各自是X¹时，R^2a和R^2b各自优选是亚甲基、亚乙基、三亚甲基、亚异丙基或四亚甲基，最优选是三亚甲基。

X^a和X^b各自是X²时，R^2a和R^2b各自优选是亚甲基、亚乙基、三亚甲基或四亚甲基，最优选是亚乙基。

X^a和X^b是1,4-哌嗪二基时，R^2a和R^2b各自优选是亚甲基、亚乙基、三亚甲基或四亚甲基，且最优选是亚乙基。

R^2a与R^2b可以相同或不同，并且R^2a优选是与R^2b相同的基团。

Y^a和Y^b各自独立地是酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键、或脲键，优选是酯键、酰胺键、或氨基甲酸酯键，最优选是酯键。尽管Y^a和Y^b的键合方向没有限制，但Y^a是酯键时，优选是R^3a-CO-O-R^2a-的结构，并且Y^b是酯键时，优选是R^3b-CO-O-R^2b-的结构。

Y^a与Y^b可以相同或不同，并且Y^a优选是与Y^b相同的基团。

R^3a和R^3b各自独立地是甾醇残基、脂溶性维生素残基或具有12~23个碳原子的脂肪族烃基，优选是脂溶性维生素残基或具有12~23个碳原子的脂肪族烃基。

作为“甾醇残基”，可以提及去除了在与Y^a或Y^b的键合中参与的反应性官能团(例如羟基)的源自甾醇或甾醇衍生物的残基，并且优选是源自甾醇衍生物的残基。甾醇衍生物是例如通过使甾醇的羟基与二羧酸中的一个羧酸反应而得到的甾醇半酯(在该情况中，另一个羧酸变为反应性官能团)。甾醇的实例包括例如胆固醇、胆甾烷醇、豆甾醇、β-谷甾醇、羊毛甾醇、麦角甾醇等，优选地给出胆固醇和胆甾烷醇。二羧酸的实例包括丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸等，优选地给出琥珀酸和戊二酸。甾醇衍生物的具体实例包括胆固醇半琥珀酸酯、胆固醇半戊二酸酯等。

作为“脂溶性维生素残基”，可以提及去除了在与Y^a或Y^b的键合中参与的反应性官能团(例如羟基)的源自脂溶性维生素或脂溶性维生素衍生物的残基，并且优选是源自脂溶性维生素衍生物的残基。脂溶性维生素衍生物是例如通过使其反应性官能团为羟基的脂溶性维生素的羟基与二羧酸中的一个羧酸反应而得到的脂溶性维生素半酯(在该情况中，另一个羧酸变为反应性官能团)。脂溶性维生素的实例包括视黄酸、视黄醇、视黄醛、麦角甾醇、7-脱氢胆固醇、钙化醇、胆钙化醇、二氢麦角钙化醇、二氢速甾醇、生育酚、生育三烯酚等。脂溶性维生素优选是视黄酸、或生育酚，最优选是生育酚。二羧酸的实例包括丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸等，优选地给出琥珀酸和戊二酸。脂溶性维生素衍生物的具体实例包括生育酚半琥珀酸酯、生育酚半戊二酸酯等。

具有12~23个碳原子的脂肪族烃基可以是直链或支链，优选是直链。脂肪族烃基可以是饱和的或不饱和的。不饱和烃基的情况中，脂肪族烃基含有1~6个、优选1~3个、最优选1~2个不饱和键。尽管不饱和键包括碳-碳双键和三键，但其优选是双键。脂肪族烃基具有优选13~21、最优选13~17的碳原子数。尽管脂肪族烃基包括烷基、烯基、炔基等，但其优选是烷基或烯基。具有12~23个碳原子的脂肪族烃基的实例包括十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基、十二碳烯基、二十三烷基、十三碳烯基、十四碳烯基、十五碳烯基、十六碳烯基、十七碳烯基、十八碳烯基、十九碳烯基、二十碳烯基、二十一碳烯基、二十二碳烯基、二十三碳烯基、十三碳二烯基、十四碳二烯基、十五碳二烯基、十六碳二烯基、十七碳二烯基、十八碳二烯基、十九碳二烯基、二十碳二烯基、二十一碳二烯基、二十二碳烯基、十八碳三烯基、二十碳三烯基、二十碳四烯基、二十碳五烯基、二十二碳六烯基、甲基十二烷基、甲基十三烷基、甲基十四烷基、甲基十五烷基、甲基十七烷基、甲基十八烷基、甲基十九烷基、甲基二十烷基、甲基二十一烷基、甲基二十二烷基、乙基十一烷基、乙基十二烷基、乙基十三烷基、乙基十四烷基、乙基十五烷基、乙基十七烷基、乙基十八烷基、乙基十九烷基、乙基二十烷基、乙基二十一烷基、己基庚基、己基壬基、庚基辛基、庚基癸基、辛基壬基、辛基十一烷基、壬基癸基、癸基十一烷基、十一烷基十二烷基、六甲基十一烷基等。作为直链的基团，优选是十二烷基、十三烷基、十五烷基、十七烷基、十九烷基、二十一烷基、十七碳烯基、十七碳二烯基，特别优选是十三烷基、十七烷基、十七碳烯基、和十七碳二烯基。作为支链的基团，优选是甲基十五烷基、己基壬基、庚基癸基、辛基十一烷基、和六甲基十一烷基，并且特别优选是甲基十五烷基、己基壬基、或庚基癸基。

在一个实施方案中，使用源自脂肪酸、脂肪族醇、或脂肪族胺的具有12~23个碳原子的脂肪族烃基。R^3a(或R^3b)源自脂肪酸时，Y^a(或Y^b)是酯键、或酰胺键，并且源自脂肪酸的羰基碳被包括在Y^a(或Y^b)中。例如，使用亚油酸时，R^3a(或R^3b)是十七碳二烯基。

R^3a与R^3b可以相同或不同，并且R^3a优选是与R^3b相同的基团。

在一个实施方案中，X^a与X^b相同，n^a与n^b相同，R^1a与R^1b相同，R^2a与R^2b相同，R^3a与R^3b相同，并且Y^a与Y^b相同。

在一个实施方案中，

X^a和X^b各自独立地是X¹，

R⁴是具有1~3个碳原子的烷基，n^a和n^b各自是1，

R^1a和R^1b各自独立地是具有1~6个碳原子的亚烷基，

R^2a和R^2b各自独立地是具有1~6个碳原子的亚烷基，

Y^a和Y^b是各自酯键，并且

R^3a和R^3b各自独立地是具有12~23个碳原子的脂肪族烃基。

在一个实施方案中，

X^a和X^b各自是X¹，

R⁴是具有1~3个碳原子的烷基，n^a和n^b各自是1，

R^1a和R^1b各自是具有1~6个碳原子的亚烷基，

R^2a和R^2b各自是具有1~6个碳原子的亚烷基，

Y^a和Y^b各自是酯键，

R^3a和R^3b各自是具有12~23个碳原子的脂肪族烃基，

X^a与X^b相同，

R^1a与R^1b相同，

R^2a与R^2b相同，并且

R^3a与R^3b相同。

在一个实施方案中，

X^a和X^b各自是X¹，

R⁴是甲基，n^a和n^b各自是1，

R^1a和R^1b各自是亚乙基，

R^2a和R^2b各自是三亚甲基，

Y^a和Y^b各自是-CO-O-，并且

R^3a和R^3b各自独立地是具有13~17个碳原子的烷基或烯基。

在一个实施方案中，

X^a和X^b各自是X¹，

R⁴是甲基，n^a和n^b各自是1，

R^1a和R^1b各自是亚乙基，

R^2a和R^2b各自是三亚甲基，

Y^a和Y^b各自是-CO-O-，

R^3a和R^3b各自是具有13~17个碳原子的烷基或烯基，并且

R^3a与R^3b相同。

在一个实施方案中，

X^a和X^b各自独立地是X¹，

R⁴是具有1~3个碳原子的烷基，n^a和n^b各自是1，

R^1a和R^1b各自独立地是具有1~6个碳原子的亚烷基，

R^2a和R^2b各自独立地是具有1~6个碳原子的亚烷基，

Y^a和Y^b各自是酯键，并且

R^3a和R^3b各自独立地是脂溶性维生素残基(例如视黄酸残基、生育酚残基、源自生育酚半琥珀酸酯的基团)。

在一个实施方案中，

X^a和X^b各自是X¹，

R⁴是具有1~3个碳原子的烷基，n^a和n^b各自是1，

R^1a和R^1b各自是具有1~6个碳原子的亚烷基，

R^2a和R^2b各自是具有1~6个碳原子的亚烷基，

Y^a和Y^b各自是酯键，

R^3a和R^3b各自是脂溶性维生素残基(例如视黄酸残基、生育酚残基、源自生育酚半琥珀酸酯的基团)，

X^a与X^b相同，

R^1a与R^1b相同，

R^2a与R^2b相同，并且

R^3a与R^3b相同。

在一个实施方案中，

X^a和X^b各自是X¹，

R⁴是甲基，n^a和n^b各自是1，

R^1a和R^1b各自是亚乙基，

R^2a和R^2b各自是三亚甲基，

Y^a和Y^b各自是-CO-O-，并且

在一个实施方案中，

X^a和X^b各自是X¹，

R⁴是甲基，n^a和n^b各自是1，

R^1a和R^1b各自是亚乙基，

R^2a和R^2b各自是三亚甲基，

Y^a和Y^b各自是-CO-O-，

R^3a和R^3b各自是脂溶性维生素残基(例如视黄酸残基、生育酚残基、源自生育酚半琥珀酸酯的基团)，并且

R^3a与R^3b相同。

在一个实施方案中，

X^a和X^b各自独立地是X²，

t是2，

n^a和n^b各自是1，

R^1a和R^1b各自独立地是具有1~6个碳原子的亚烷基，

R^2a和R^2b各自独立地是具有1~6个碳原子的亚烷基，

Y^a和Y^b各自是酯键，并且

R^3a和R^3b各自独立地是脂溶性维生素残基(例如视黄酸残基、生育酚残基、源自生育酚半琥珀酸酯的基团)、或具有12~23个碳原子的脂肪族烃基(例如具有12~23个碳原子的烷基)。

在一个实施方案中，

X^a和X^b各自独立地是X²，

t是2，

n^a和n^b各自是1，

R^1a和R^1b各自独立地是具有1~6个碳原子的亚烷基，

R^2a和R^2b各自独立地是具有1~6个碳原子的亚烷基，

Y^a和Y^b各自是酯键，

R^3a和R^3b各自独立地是脂溶性维生素残基(例如视黄酸残基、生育酚残基、源自生育酚半琥珀酸酯的基团)、或具有12~23个碳原子的脂肪族烃基(例如具有12~23个碳原子的烷基)，

X^a与X^b相同，

R^1a与R^1b相同，

R^2a与R^2b相同，并且

R^3a与R^3b相同。

在一个实施方案中，

X^a和X^b各自独立地是X²，

t是2，

n^a和n^b各自是1，

R^1a和R^1b各自是亚乙基，

R^2a和R^2b各自独立地是具有1~6个碳原子的亚烷基，

Y^a和Y^b各自是酯键，

X^a与X^b相同，

R^2a与R^2b相同，并且

R^3a与R^3b相同。

在一个实施方案中，

X^a和X^b是1,4-哌嗪二基，

n^a和n^b各自是1，

R^1a和R^1b各自独立地是具有1~6个碳原子的亚烷基，

R^2a和R^2b各自独立地是具有1~6个碳原子的亚烷基，

Y^a和Y^b各自是酯键，并且

R^3a和R^3b各自独立地是脂溶性维生素残基(例如视黄酸残基、生育酚残基、源自生育酚半琥珀酸酯的基团)、或具有12~23个碳原子的脂肪族烃基(例如具有12~23个(优选13~17个)碳原子的烷基或烯基)。

在一个实施方案中，

X^a和X^b是1,4-哌嗪二基，

n^a和n^b各自是1，

R^1a和R^1b各自独立地是具有1~6个碳原子的亚烷基，

R^2a和R^2b各自独立地是具有1~6个碳原子的亚烷基，

Y^a和Y^b各自是酯键，

R^3a和R^3b各自独立地是脂溶性维生素残基(例如视黄酸残基、生育酚残基、源自生育酚半琥珀酸酯的基团)、或具有12~23个碳原子的脂肪族烃基(例如具有12~23个(优选13~17个)碳原子的的烷基或烯基)，

R^2a与R^2b相同，并且

R^3a与R^3b相同。

在一个实施方案中，

X^a和X^b是1,4-哌嗪二基，

n^a和n^b各自是1，

R^1a和R^1b各自是亚乙基，

R^2a和R^2b各自是亚乙基，

Y^a和Y^b各自是-CO-O-，并且

在一个实施方案中，

X^a和X^b是1,4-哌嗪二基，

n^a和n^b各自是1，

R^1a和R^1b是亚乙基，

R^2a和R^2b是亚乙基，

Y^a和Y^b各自是-CO-O-，并且

R^3a和R^3b各自独立地是脂溶性维生素残基(例如视黄酸残基、生育酚残基、源自生育酚半琥珀酸酯的基团)、或具有12~23个碳原子的脂肪族烃基(例如具有12~23个(优选13~17个)碳原子的的烷基或烯基)，并且

R^3a与R^3b相同。

式(1)的化合物的具体实例包括下述B-2、B-2-2、B-2-3、B-2-4、B-2-5、TS-C4E、TS-C5P、TS-P2C1、TS-P3C1、TS-P4C1、TS-P4C2、TS-P4C3、TS-P4C4、TG-C3M、TSamide-C3M、TS-PZ4C2、O-C3M、L-PZ4C2的化合物。

[表1-1]

。

[表1-2]

。

[表1-3]

。

[表1-4]

。

式(1)所示的化合物之中，其中X^a和X^b分别是X¹或X²的化合物可以通过WO2013/073480A1或US2014/0335157A1中记载的方法制造。

说明其中X^a和X^b是1,4-哌嗪二基的式(1)所示的化合物的制造方法。

式(1)的化合物具有-S-S-(二硫醚)键。因此，其制造方法包括例如：包括制造具有R^3a-(Y^a-R^2a)n^a-X^a-R^1a-的SH(硫醇)化合物、和具有R^3b-(Y^b-R^2b)n^b-X^b-R^1b-的SH(硫醇)化合物、使其经受氧化(偶联)从而给出含有-S-S-键的本发明的化合物的方法；包括依次将所需部分键合于含有-S-S-键的化合物从而最终获得本发明的化合物的方法等。优选是后一方法。

后一方法的一个具体实例示于下文，但制造方法不限于此。

起始化合物的实例包括双末端羧酸、双末端胺、双末端异氰酸酯、双末端醇、具有脱离基例如甲磺酰基等的双末端醇、具有脱离基例如对硝基苯基碳酸酯基等的双末端碳酸酯等，其各自具有-S-S-键。

例如，制造其中X^a和X^b是1,4-哌嗪二基、R^1a和R^1b是亚乙基、n^a和n^b各自是1、R^2a和R^2b是亚乙基、Y^a和Y^b相同且是Y(酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、或醚键)、并且R^3a和R^3b相同且为R³(甾醇残基、脂溶性维生素残基、或具有13~23个碳原子的脂肪族烃基)的化合物时，使含有-S-S-键的化合物(I)中的双末端官能团与在4位上借助亚乙基而具有官能团的哌嗪衍生物(以下称为“化合物(II)”)的1位上的仲氨基反应，并且使衍生物(II)中的官能团与含有R³-Y的化合物(III)中的官能团反应，由此可以获得含有-S-S-键、R^1a和R^1b、2个哌嗪骨架、R^2a和R^2b、Y^a和Y^b、以及R^3a和R^3b的式(1)的化合物。

在化合物(I)和化合物(II)的反应中，作为催化剂，可以使用碱催化剂、例如碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钾等，或者可以不使用催化剂而进行反应。优选地，将碳酸钾或碳酸钠用作催化剂。

催化剂的量相对于化合物(I)是0.1~100摩尔当量、优选是0.1~20摩尔当量、更优选是0.1~5摩尔当量。投料的化合物(II)的量相对于化合物(I)是1~50摩尔当量、优选是1~10摩尔当量。

用于化合物(I)和化合物(II)的反应的溶剂只要是不抑制反应的溶剂或水溶液，则没有特别限制。例如，可以提及乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲苯等。这些之中，优选是甲苯、氯仿和乙腈。

反应温度是-20~150℃、优选是0~80℃、更优选是20~50℃，并且反应时间是1~48小时、优选是2~24小时。

使化合物(I)和化合物(II)的反应产物(以下称为反应产物(I))与化合物(III)反应时，可以使用如用于化合物(I)和化合物(II)的反应的催化剂那样的碱催化剂、例如碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钾等；或者酸催化剂、例如对甲苯磺酸、甲磺酸等，或者可以不使用催化剂而进行反应。

此外，可以通过使用缩合剂、例如二环己基碳二亚胺(以下称为“DCC”)、二异丙基碳二亚胺(以下称为“DIC”)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(以下称为“EDC”)等，使反应产物(I)与化合物(III)直接反应。替代地，可以用缩合剂处理化合物(III)从而转化为酸酐等，其后使其与反应产物(I)反应。

投料的化合物(III)的量相对于反应产物(I)是1~50摩尔当量、优选是1~10摩尔当量。

用于反应产物(I)和化合物(III)的反应的催化剂根据要反应的官能团而适当选择。

催化剂的量相对于反应产物(I)是0.05~100摩尔当量、优选是0.1~20摩尔当量、更优选是0.2~5摩尔当量。

用于反应产物(I)和化合物(III)的反应的溶剂只要是不抑制反应的溶剂或水溶液，则没有特别限制。例如，可以提及乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲苯等。这些之中，优选是氯仿和甲苯。

反应温度是0~150℃、优选是0~80℃、更优选是20~50℃，并且反应时间是1~48小时、优选是2~24小时。

通过上述反应获得的反应产物可以通过一般的提纯方法、例如萃取提纯、重结晶、吸附提纯、再沉淀、柱色谱、离子交换色谱等，从而适当提纯。

本领域技术人员可以根据通过适当选择起始材料、并根据本说明书中的实施例的方法实施反应，从而制造期望的式(1)的化合物。

下文说明本发明的O/W型乳液。

O/W型乳液是指其中油滴分散于水相中的乳液。油滴可以含有或不含有未成形的层状结构物(层状的脂质二重膜)。油滴含有层状的脂质二重膜时，在脂质二重膜与脂质二重膜之间可以存在水相。本发明的O/W型乳液在构成乳液的油滴中含有式(1)的化合物。

本发明的O/W型乳液在油滴中，除了含有式(1)的化合物之外，还可以含有其他脂质(例如磷脂质、甾醇、PEG脂质、糖脂质、肽脂质、除了式(1)的化合物之外的阳离子性脂质)。本发明的O/W型乳液在油滴中，除了含有式(1)的化合物之外，优选还含有选自PEG脂质、磷脂质和甾醇中的至少一种脂质，更优选含有PEG脂质。在一个实施方案中，本发明的O/W型乳液在油滴中，除了含有式(1)的化合物之外，还含有PEG脂质、以及选自磷脂质和甾醇中的至少一种脂质。在一个优选的实施方案中，本发明的O/W型乳液在油滴中，除了含有式(1)的化合物之外，还含有磷脂质、PEG脂质和甾醇。

PEG脂质是指含有由PEG进行的修饰的脂质。PEG脂质被包含在本发明的O/W型乳液的油滴中时，其在界面处形成PEG水合层，防止颗粒间、和颗粒与蛋白质间的凝集，并且在制备过程中和制备后将体积中值直径稳定地维持为100nm或更低。用于本发明的O/W型乳液的PEG脂质的实例包括：其中聚乙二醇键合于上述磷脂质的PEG磷脂质、和其中聚乙二醇键合于键合有上述具有8~24个碳原子的酰基的二酰基甘油的二酰基甘油PEG。构成PEG脂质的聚乙二醇的分子量没有特别限定。其优选是200~10000、更优选是2000~5000。用于本发明的O/W型乳液的PEG脂质优选是其中酰基是饱和的二酰基甘油PEG，更优选是其中酰基是肉豆蔻酰基或硬脂酰基的二酰基甘油PEG，进一步优选是其中肉豆蔻酰基与具有2000的分子量的聚乙二醇键合的二酰基甘油PEG(DMG-PEG2000)、或其中硬脂酰基与具有2000的分子量的聚乙二醇键合的二酰基甘油PEG(DSG-PEG2000)。

磷脂质被包含在本发明的O/W型乳液的油滴中时，其将水/油界面稳定化，在例如血液中或培养基中的蛋白质的存在下提供稳定性，并且稳定地将体积中值直径降低至适合于向生物体给药的不大于100nm。磷脂质的实例包括：天然或者合成的磷脂质，例如磷脂酰基胆碱(PC)、磷脂酰基乙醇胺(PE)、磷脂酰基丝氨酸(PS)、磷脂酰基肌醇(PI)、磷脂酰基甘油(PG)、磷脂酸(PA)、二鲸蜡基磷酸、鞘磷脂(SPM)、心磷脂等；这些磷脂质的部分或完全氢化物；作为这些磷脂质的混合物的天然卵磷脂，例如大豆卵磷脂、玉米卵磷脂、棉籽油卵磷脂、蛋黄卵磷脂等；和氢化大豆卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂等。构成这些磷脂质的烃基具有可以相同或不同的1-位和2-位，并且由具有8~24个碳原子的酰基构成。具有8~24个碳原子的酰基的实例包括通过从脂肪酸、例如辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、月桂酸、十三烷酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、十九烷酸、花生酸、二十一烷酸、山嵛酸、二十三烷酸、木蜡酸、肉豆蔻油酸、棕榈油酸、油酸、二十碳烯酸、芥酸、十六碳二烯酸、亚油酸、二十碳二烯酸、二十二碳烯酸、十六碳三烯酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、二十碳三烯酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳四烯酸、二十二碳六烯酸等中去除羟基而获得的残基。

用于本发明的O/W型乳液的磷脂质优选是合成磷脂质，更优选是在酰基中含有不饱和键的合成磷脂质，进一步优选是二油酰基磷脂酰基胆碱(DOPC)或二油酰基磷脂酰基乙醇胺(DOPE)，进一步优选是二油酰基磷脂酰基胆碱(DOPC)。

甾醇被包含在本发明的O/W型乳液的油滴中时，其结构性地将作为分子集合体的乳液稳定化，并且稳定地将粒径(体积中值直径)降低至适合于向生物体给药的不大于100nm。用于本发明的O/W型乳液的甾醇的实例包括胆固醇、植物甾醇、二氢胆固醇、硬脂酸胆固醇酯、壬酸胆固醇酯、羟基硬脂酸胆固醇酯、油酸二氢胆固醇酯等，优选是胆固醇、植物甾醇、硬脂酸胆固醇酯，进一步优选是胆固醇。

本发明的O/W型乳液中包含的脂质的含量只要可以将水难溶性药物在细胞内导入并释放，则没有特别限定。通常而言，乳液的总脂质(PEG脂质除外)浓度是0.5mM~10mM、优选是1mM~8mM。

本发明的O/W型乳液中含有的式(1)的化合物的含量没有特别限制。通常而言，将O/W型乳液用作用于将后述水难溶性药物递送至细胞内的载体时，本发明的O/W型乳液中以对于在细胞内导入并释放水难溶性药物而言充分的量含有式(1)的化合物。例如，其为构成油滴的总脂质(PEG脂质除外)的5~100摩尔%、优选10~70摩尔%、更优选30~50摩尔%。

本发明的O/W型乳液含有PEG脂质时，其含量只要本发明的O/W型乳液可以将水难溶性药物在细胞内导入并释放，则没有特别限制。构成本发明的O/W型乳液中含有的油滴的除了PEG脂质之外的脂质的总计含量为100摩尔当量时，例如，本发明的O/W型乳液中额外地含有不小于1摩尔当量、优选不小于3摩尔当量、更优选不小于5摩尔当量的PEG脂质。PEG脂质的含量的上限值只要不阻碍通过本发明的O/W型乳液将水难溶性药物在细胞内导入并释放，则没有特别限制。构成本发明的O/W型乳液中含有的油滴的除了PEG脂质之外的脂质的总计含量为100摩尔当量时，本发明的O/W型乳液中的PEG脂质的含量是例如不大于20摩尔当量、优选不大于18摩尔当量、更优选不大于15摩尔当量。在一个进一步的方面中，构成本发明的O/W型乳液中含有的油滴的除了PEG脂质之外的脂质的总计含量为100摩尔当量时，本发明的O/W型乳液中的PEG脂质的含量是例如不大于30摩尔当量、优选不大于25摩尔当量、更优选不大于20摩尔当量。因此，构成本发明的O/W型乳液中含有的油滴的除了PEG脂质之外的脂质的总计含量是100摩尔当量时，例如，本发明的O/W型乳液中额外地含有1~20摩尔当量、优选3~18摩尔当量、更优选5~15摩尔当量的PEG脂质。在一个进一步的方面中，构成本发明的O/W型乳液中含有的油滴的除了PEG脂质之外的脂质的总计含量是100摩尔当量时，例如，本发明的O/W型乳液中额外地含有1~30摩尔当量、优选3~25摩尔当量、更优选5~20摩尔当量的PEG脂质。

本发明的O/W型乳液含有磷脂质时，其含量只要不阻碍通过本发明的O/W型乳液将水难溶性药物在细胞内导入并释放，则没有特别限制。例如，其是构成本发明的O/W型乳液中含有的油滴的总脂质(PEG脂质除外)的10~70摩尔%、优选20~60摩尔%、更优选30~50摩尔%。

本发明的O/W型乳液含有甾醇时，其含量只要不阻碍通过本发明的O/W型乳液将水难溶性药物在细胞内导入并释放，则没有特别限制。例如，其是构成本发明的O/W型乳液中含有的油滴的总脂质(PEG脂质除外)的10~50摩尔%、优选20~40摩尔%。

本发明的O/W型乳液可以进一步在构成其的油滴中含有除了脂质之外的成分，例如表面活性剂(例如CHAPS、胆酸钠、辛基葡糖苷、N-D-葡萄糖-N-甲基烷酰胺类等)、聚乙二醇、蛋白质、水难溶性药物(后述)等。

本发明的O/W型乳液可以在构成其的水相中除了含有水之外还含有适当的缓冲剂(例如磷酸或其盐、苹果酸或其盐、碳酸或其盐)、盐(例如NaCl、KCl)、除了水之外的亲水性溶剂(例如丙酮；醚溶剂、例如1,2-二甲氧基乙烷、1,4-二氧杂环己烷、四氢呋喃等；醇溶剂、例如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇、叔丁醇等；优选是醇溶剂；更优选是乙醇或叔丁醇)等。

本发明的O/W型乳液的体积中值直径(构成本发明的O/W型乳液的油滴的体积中值直径)不大于100nm、优选不大于70nm、更优选不大于50nm。体积中值直径被设为不大于100nm，并且向生物体内给药时，可以避免由脾的排出，血中滞留性变高，并且向组织深部、例如肿瘤等的高效递送变得可能。本发明的O/W型乳液的体积中值直径的下限值没有特别限制。但是，从制造技术的方面出发，其通常不小于20nm、优选不小于25nm、更优选不小于30nm。本发明的O/W型乳液的体积中值直径通常是20~100nm、优选是25~70nm、更优选是30~50nm。

本发明的O/W型乳液可以通过将式(1)的化合物和其他构成组分(脂质等)溶解于适合的溶剂中、将所得脂质溶液与缓冲水溶液混合、并将所得脂质溶液分散于水体系中从而制备。用于将脂质溶液和缓冲水溶液混合的方法没有特别限制，并且优选是能够迅速提供均匀乳液的方法。用于将脂质溶液和缓冲水溶液混合的方法通过包括使用微通道等连续混合的方法、和包括通过使用涡旋混合器等进行强烈搅拌而非连续混合的方法而例示。通过使用涡旋混合器等的非连续方法实施混合时，在将脂质溶液或缓冲水溶液中的一者进行搅拌的同时，将另一者的总量进行添加。直至实现均匀乳化为止的混合时间优选尽可能短，并且其例如是10秒以内、优选是5秒以内、更优选是3秒以内。

作为用于制备脂质溶液的溶剂，只要其溶解脂质且可与水混溶，则可以使用任意溶剂。这样的溶剂的实例包括醚溶剂、例如1,2-二甲氧基乙烷、1,4-二氧杂环己烷、四氢呋喃等；醇溶剂、例如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇、叔丁醇等，优选是醇溶剂，更优选是乙醇或叔丁醇等。尽管脂质溶液的脂质浓度只要可以制备本发明的O/W型乳液则没有特别限制，但总脂质(PEG脂质除外)的总计浓度被调整为例如1~12.5mM、优选2~3mM。

缓冲水溶液的pH只要可以制备本发明的O/W型乳液则没有特别限制。为了稳定地将O/W型乳液的体积中值直径控制为100nm或更低，优选将缓冲水溶液调整为弱酸性至中性、优选弱酸性。缓冲水溶液的pH例如是3.0~7.4、优选是3.0~5.0。

只要不示出还原性则缓冲水溶液的种类没有特别限制，但优选在上述pH区域中具有缓冲作用的种类。其实例包括碳酸、HEPES、MES、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、乳酸、邻苯二甲酸、乙酸、磷酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸等的缓冲水溶液。缓冲水溶液优选是苹果酸缓冲水溶液。这些缓冲水溶液可以通过使用碱、例如NaOH、KOH等从而调整至适当的pH。

缓冲水溶液中的缓冲剂的浓度只要溶液具有适当的缓冲作用、且不在脂质溶液/缓冲水溶液中沉淀则没有特别限制。例如在苹果酸缓冲水溶液的情况中，其通常是1~100mM、优选是10~30mM。

缓冲水溶液中可以溶解有无机盐。无机盐没有特别限制。其实例包括碱金属(Li、Na、K等)或碱土金属(Ca等)的卤化物(氯化物等)和硫酸盐。无机盐优选是NaCl或KCl、更优选是NaCl。盐浓度高时，O/W型乳液的体积中值直径倾向于更高。因此，为了稳定地将O/W型乳液的体积中值直径控制为100nm或更低，盐浓度以总卤素离子浓度计优选是0~0.5M、更优选是0~0.08M。

缓冲水溶液与脂质溶液的混合体积比只要可以制备本发明的O/W型乳液，则没有特别限制。通常而言，相对于脂质溶液100体积份，混合通常25~400体积份、优选42~233体积份、更优选66~150体积份、进一步优选100体积份的缓冲水溶液。脂质溶液和缓冲水溶液的总体积没有限制。

在一个优选的实施方案中，将含有式(1)的化合物的脂质的醇溶液与具有3.0~7.4的pH和0~0.5M的盐浓度的缓冲水溶液混合并乳化，从而给出本发明的O/W型乳液。

通过乳化获得的O/W型乳液的水相可以含有相当量的脂质溶液的溶剂。因此，在乳化结束之后，可以通过使乳化产物经受透析或超滤，用生物适应性的缓冲水溶液替代O/W型乳液的水相。生物适应性缓冲液只要其不对生物体显示出毒性则没有限定，并且使用例如PBS等。在该情况中，可以在透析或超滤处理之前向乳化产物添加生物适应性缓冲液。例如，以乳化产物的约3.2倍至4.0倍的体积添加生物适应性缓冲液，并且实施透析或超滤处理。缓冲液的替代处理优选与乳化处理连续地实施，并且在乳化结束后的例如30分钟以内、优选10分钟以内、更优选1分钟以内开始透析或超滤处理。为了尽可能多地去除脂质溶液中含有的溶剂，可以实施两次或更多次替代操作。替代次数的上限没有限制。

本发明的O/W型乳液可以稳定地含有内封于构成其的油滴中的任意水难溶性药物。本发明的内封了水难溶性药物的O/W型乳液在细胞内容易被摄取，并且高效地向细胞内导入水难溶性药物。通常而言，通过使用载体来向细胞内导入水难溶性药物时，即使成功地向细胞内导入水难溶性药物，在细胞内，水难溶性药物在被并入载体中时也无法充分发挥其药效。但是，本发明的O/W型乳液的情况中，由于式(1)所示的化合物因细胞内的还原性环境而迅速分解，因此O/W型乳液崩解，并且迅速地在细胞内释放所内封的水难溶性药物，并且能够发挥出其药效。因此，本发明的O/W型乳液作为用于将水难溶性药物递送至细胞内的载体是有用的。

可以通过在上述O/W型乳液的制备中使用含有溶解于其中的水难溶性药物的脂质溶液实施乳化，从而在本发明的O/W型乳液中内封水难溶性药物。本发明还提供内封了水难溶性药物的上述本发明的O/W型乳液。

本发明中，水难溶性药物是指具有不小于4的用于评价化合物的疏水性的水/辛醇分配系数LogPow的药物。这样的水难溶性药物的实例包括他克莫司(LogPow：4.79)、熊去氧胆酸 (LogPow：4.76)、奥西卡因(LogPow：4.38)、辛伐他汀(LogPow：4.72)、炔雌醇(LogPow：4.11)、克霉唑(LogPow：4.93)、扎托洛芬(LogPow：4.25)、戊酸倍他米松 (LogPow：4.14)、戊唑辛(LogPow：4.15)、碘羟拉酸(LogPow：4.32)、吲哚美辛(LogPow：4.25)、酮康唑(LogPow：4.04)、达那唑(4.94)、联苯苄唑(LogPow：4.69)、丙酸倍氯米松(beclopetasonepropionate)(LogPow：4.07)、美雌醇(LogPow：4.94)、阿西美辛(LogPow：4.49)、依普黄酮(LogPow：4.25)、卡维地洛(LogPow：4.07)、多潘立酮(LogPow：4.05)、甲灭酸(LogPow：4.83)、伊曲康唑 (LogPow：5.00)、利血平(LogPow：4.45)、氯己定(LogPow：4.58)、克利贝特(LogPow：6.33)、丁酸核黄素(LogPow：6.25)、西卡宁(LogPow：6.10)、美喹他嗪(LogPow：5.20)、依巴斯汀(LogPow：6.81)、贝尼地平(LogPow：5.56)、苯溴马隆(LogPow：6.65)、苯甲酸雌二醇(LogPow：5.10)、匹莫齐特(LogPow：5.76)、醋酸麦迪霉素(LogPow：5.58)、托萘酯(LogPow：5.14)、美雄烷(LogPow：6.89)、地塞米松棕榈酸酯(LogPow：8.13)、4-甲基伞形酮棕榈酸酯(LogPow：7.92)、麦角钙化醇(LogPow：9.15)、胆钙化醇(LogPow：9.08)、生育酚(LogPow：10.96)、生育酚乙酸酯(LogPow：10.69)、生育酚烟酸酯(LogPow：11.33)、植物甲萘醌(LogPow：10.31)、氟奋乃静庚酸酯(LogPow：7.29)、四烯甲萘醌(LogPow：8.79)、视黄醇乙酸酯(LogPow：7.19)、氯霉素棕榈酸酯(LogPow：8.69)、坎地沙坦酯(7.21)、视黄醇棕榈酸酯(LogPow：14.32)、泛癸利酮(LogPow：19.12)、地塞米松胆固醇半琥珀酸酯(LogPow：9.37)、4-甲基伞形酮胆固醇半琥珀酸酯(LogPow：9.16)等。

在一个进一步的方面中，本发明甚至还提供地塞米松胆固醇半琥珀酸酯、和4-甲基伞形酮胆固醇半琥珀酸酯。所述化合物作为抗肿瘤剂等是有用的。在本发明中，将所述化合物用作水难溶性药物时，由于胆固醇半琥珀酸酯的效果而血中滞留性高，并且与未酯化的地塞米松和4-甲基伞形酮相比，可以期待高的药效。以下，提出地塞米松胆固醇半琥珀酸酯、和4-甲基伞形酮胆固醇半琥珀酸酯的合成的具体实例，但制造方法不限于此。

可以通过使地塞米松或4-甲基伞形酮的羟基与胆固醇半琥珀酸酯的羧酸反应从而合成期望的化合物。对于该反应，可以使用碱催化剂、例如碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钾等；或酸催化剂、例如对甲苯磺酸、甲磺酸等，或者可以不使用催化剂而进行反应。

此外，可以使用缩合剂、例如二环己基碳二亚胺(以下称为“DCC”)、二异丙基碳二亚胺(以下称为“DIC”)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(以下称为“EDC”)、N,N-二甲基-4-氨基吡啶(以下有时称为“DMAP”)、N,N-二异丙基乙基胺(以下有时称为“DIPEA”)等。还可以通过使用缩合剂将胆固醇半琥珀酸酯转化为酸酐等，并且使其与地塞米松或4-甲基伞形酮的羟基反应。

添加的胆固醇半琥珀酸酯的量相对于具有羟基的药物是1~50摩尔当量、优选是1~10摩尔当量。

催化剂的量相对于反应产物是0.05~100摩尔当量、优选是0.1~20摩尔当量、更优选是0.2~5摩尔当量。

用于反应的溶剂只要是不抑制反应的溶剂，则没有特别限制。其实例包括乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲苯、二甲基甲酰胺等。这些之中，优选是氯仿、甲苯和二甲基甲酰胺。

本领域技术人员可以根据通过适当选择起始材料、并根据本说明书的参考实施例的方法实施反应，从而制造期望的化合物。

水难溶性药物具有更高的疏水性时，预期其更容易被内封在本发明的O/W型乳液中。因此，本发明中使用的水难溶性药物的LogPow优选更高，优选是不小于5、更优选是不小于7、进一步优选是不小于9。但是，无法溶解于O/W型乳液的制备中使用的脂质溶液的溶剂中的药物可能使得内封操作困难。因此，作为本发明中使用的水难溶性药物与脂质溶液的溶剂的组合，使用具有优选不小于1mM、更优选不小于5mM的溶解度(25℃)的水难溶性药物。

在一个优选的实施方案中，作为水难溶性药物，使用具有用于在细胞内表达药效的活性位点(靶分子)的药物。

构成本发明的O/W型乳液的脂质和表面活性剂不包括在“水难溶性药物”中。

通过使内封了水难溶性药物的本发明的O/W型乳液与细胞接触，可以在体内和/或体外将水难溶性药物向目标细胞内导入并释放。本发明还提供这样的水难溶性药物向细胞内的递送方法。

细胞的种类没有特别限制，并且可以使用原核细胞或真核细胞，优选地给出真核细胞。真核细胞的种类没有特别限制，并且可以提及例如：脊椎动物，例如包括人在内的哺乳类(例如人、猴、小鼠、大鼠、仓鼠、牛等)、鸟类(例如鸡、鸵鸟等)、两栖类(例如蛙等)、鱼类(例如斑马鱼、青鳉等)等；无脊椎动物，例如昆虫(蚕、蛾、果蝇等)等；植物、微生物(例如酵母等)等。更优选地，本发明中的靶细胞是动物或植物细胞，更优选是哺乳动物细胞。该细胞可以是包括癌细胞的培养细胞系、或者从个体或组织中分离出的细胞、或者组织或组织片的细胞。此外，细胞可以是粘附细胞或非粘附细胞。

在生物体外(in vitro，体外)，使内封了水难溶性药物的本发明的O/W型乳液与细胞接触的步骤具体说明如下。

细胞在与O/W型乳液接触的数天前被悬浮于适当的培养基中，并在适当的条件下培养。在与O/W型乳液接触时，细胞可以处于或者不处于增殖期。

接触时的培养基可以是含血清的培养基或不含血清的培养基。

接触时的细胞密度没有特别限制，并且可以考虑细胞的种类等而适当决定。其通常处于1×10⁴~1×10⁷细胞/mL的范围内。

向由此制备的细胞添加内封了上述水难溶性药物的本发明的O/W型乳液。添加的所述悬浮液的量没有特别限制，可以考虑细胞数等而适当决定。与细胞接触的O/W型乳液的浓度只要可以实现将目标水难溶性药物向细胞内导入，则没有特别限制。脂质浓度通常是1~10nmol/mL、优选是10~50nmol/mL。

将上述悬浮液添加至细胞，并培养所述细胞。培养中的温度、湿度、CO₂浓度等考虑细胞的种类而适当决定。细胞源自哺乳动物时，通常温度是约37℃、湿度是约95%、CO₂浓度是约5%。尽管也可以考虑例如细胞的种类等条件而适当决定培养时间，但通常是0.1~24小时、优选是0.2~4小时、更优选是0.5~2小时。上述培养时间过短时，水难溶性药物未被充分导入至细胞内，并且培养时间过长时，细胞可能变得脆弱。

通过上述培养，水难溶性药物被导入至细胞内。优选通过用新鲜培养基交换培养基、或向培养基添加新鲜培养基，从而进一步继续培养。细胞源自哺乳动物时，新鲜培养基优选含有血清或营养因子。

如上所述，通过使用本发明的O/W型乳液，不仅在生物体外(in vitro，体外)，而且在生物体内(in vivo，体内)也可以将水难溶性药物导入至细胞内。即，通过将内封了水难溶性药物的本发明的O/W型乳液向对象给药，该O/W型乳液到达并接触靶细胞，并且在体内将所述O/W型乳液中内封的水难溶性药物导入至细胞内。可以给药O/W型乳液的对象没有特别限制，并且可以提及例如：脊椎动物，例如哺乳类(例如人、猴、小鼠、大鼠、仓鼠、牛等)、鸟类(例如鸡、鸵鸟等)、两栖类(例如蛙等)、鱼类(例如斑马鱼、稻鱼等)等；无脊椎动物，例如昆虫(例如蚕、蛾、果蝇等)等；植物等。本发明的O/W型乳液的给药对象优选是人或其他哺乳动物。

靶细胞的种类没有特别限制，并且通过使用本发明的O/W型乳液，可以将水难溶性药物导入至多种组织(例如肝、肾、胰、肺、脾、心脏、血液、肌肉、骨、脑、胃、小肠、大肠、皮肤、脂肪组织等)中的细胞中。

通过将体积中值直径设为不大于100nm，本发明的O/W型乳液可以被高效地递送至组织深部、例如肿瘤等。因此，其对于将水难溶性药物(例如水难溶性的抗肿瘤剂)递送至肿瘤组织(例如实体肿瘤组织)中的肿瘤细胞而言是有利的。

含有B-2-5作为式(1)的化合物的本发明的O/W型乳液在肝中的累积性优异。因此，其对于将水难溶性药物(例如水难溶性的肝疾病治疗剂)递送至肝组织中的细胞(例如肝细胞)而言是有利的。

将本发明的内封了水难溶性药物的O/W型乳液向目标(例如脊椎动物、无脊椎动物等)给药的方法只要所述O/W型乳液到达并接触靶细胞、且所述O/W型乳液中内封的水难溶性药物可以被导入至细胞内，则没有特别限制，并且可以考虑水难溶性药物的种类、靶细胞的种类和部位等，适当选择本身公知的给药方法(例如经口给药、肠胃外给药(例如静脉内给药、肌肉内给药、局部给药、经皮给药、皮下给药、腹腔内给药、喷雾等)等)。O/W型乳液的剂量只要可以实现将水难溶性药物导入至细胞内，则没有特别限制，并且可以考虑给药对象的种类、给药方法、水难溶性药物的种类、靶细胞的种类和部位等而适当选择。

将本发明的O/W型乳液用作用于将水难溶性药物递送至细胞内的载体时，可以按照常规方法进行配制。

将载体作为用于研究的试剂而提供时，本发明的载体以其原样提供本发明的O/W型乳液，或者例如以与水或除此之外的生理学上可接受的液体(例如水溶性溶剂(例如苹果酸缓冲液等)、有机溶剂(例如乙醇、甲醇、DMSO等)、或者水溶性溶剂与有机溶剂的混合物等)形成的悬浮液形式提供。本发明的载体可以适当含有本身公知的生理学上可接受的添加剂(例如赋形剂、媒介物(vehicle)、防腐剂、稳定剂、结合剂等)。

此外，将载体作为药物提供时，本发明的载体可以以其原样使用本发明的O/W型乳液，或者通过将所述载体与药学上可接受的公知的添加剂、例如载体、香味剂、赋形剂、媒介物、防腐剂、稳定剂、结合剂等以常规批准的实施制剂所要求的单位剂型共混，从而制造为口服制剂(例如片剂、胶囊剂等)或者非肠胃外制剂(例如注射剂、喷雾剂等)、优选肠胃外制剂(更优选是注射剂)。

在本说明书中陈述的任意出版物、包括专利、专利申请、科学文献中公开的内容在此通过参考的方式，以它们已在本文中公开的程度以其整体被并入本文中。

以下，进一步详细说明本发明的实施例，但本发明不以任何方式受到实施例限制。

实施例

[实施例1] 制备微细O/W型乳液

作为阳离子性脂质，使用B-2、B-2-5、O-C3M、B-2-3、TS-P4C2或L-PZ4C2，制备具有阳离子性脂质:DOPE:胆固醇=3:4:3(摩尔比)的组成的O/W型乳液。在该制备中，作为模型药物，使用4-甲基伞形酮(10摩尔%)，并且作为PEG脂质，使用DMG-PEG2000(10摩尔%)和DSG-PEG2000(2.5摩尔%)，并且制备1.0mM(基于脂质浓度)的乳液。

制备含有以阳离子性脂质、DOPE、和胆固醇的总量计1000nmol的乙醇溶液，并且以上述量添加模型药物和PEG脂质。添加乙醇以使得总量为400μL，并且将混合物在冰温下静置15分钟。将类似地冰冷的苹果酸缓冲液(20mM，pH3.0，30mM NaCl)(400μL)在涡旋下在3秒以内混合。向其中立刻添加PBS(NISSUI)(3200μL)。使混合物经受使用Amicon Ultra(Millipore)的超滤。离心条件是1000g、25℃。重复两次包括离心10分钟后添加3200μL的PBS的操作，并将样品浓缩至约500μL。将浓缩物用PBS稀释至1000mg的质量，从而给出1mM(基于脂质浓度)的乳液。

通过使用Zetasizer Nano ZS的动态光散射测量所制备的乳液的粒径分布。测量条件是在25℃下1mM的乳液(40μL)。其结果是，所有组成中，体积中值直径不大于100nm，并且使用直链头部(即其中X^a和X^b各自是X¹的式(I))时，粒径不大于50nm。药物回收率不小于85%(图1、表2)。

[表2]

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[对比实施例1] 使用以往的脂质DODAP和EPC的制备

作为阳离子性脂质，使用DODAP，制备具有DODAP:DOPE:胆固醇=3:4:3(摩尔比)的组成的颗粒。在该制备中，作为模型药物，使用4-甲基伞形酮(10摩尔%)，并且作为PEG脂质，使用DMG-PEG2000(10摩尔%)和DSG-PEG2000(2.5摩尔%)，并且制备1.0mM(基于脂质浓度)的颗粒悬浮液。颗粒的制备、粒径分布的获得根据实施例1中记载的方法实施。

作为中性脂质，使用EPC，制备具有EPC:胆固醇=3:2的组成的颗粒。在该制备中，作为模型药物，使用4-甲基伞形酮(10摩尔%)，并且作为PEG脂质，使用DSG-PEG2000(2.5摩尔%)，并且制备1.0mM(基于脂质浓度)的颗粒悬浮液。

混合EPC和胆固醇以实现1000nmol，并且添加PEG脂质。添加与脂质乙醇溶液等量的氯仿，并将混合物在氮气通气下干燥。向干燥后的脂质膜添加PBS(1mL)并将混合物静置10分钟，并通过浴型超声仪超声3分钟从而给出颗粒悬浮液。以与实施例1中相同的方式，通过动态光散射测量所制备的颗粒的粒径分布。

其结果是，DODAP的体积中值直径是34.8nm，PdI是0.418，并且模型药物回收率是76.7%。EPC的体积中值直径是48.1nm，并且通过目视观察发现了凝集块(图2、表3)。

[表3]

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[实施例2] pH对O/W型乳液的影响

作为阳离子性脂质，使用B-2，制备具有阳离子性脂质:DOPE:胆固醇=3:4:3(摩尔比)或阳离子性脂质:DOPC:胆固醇=3:4:3(摩尔比)的组成的O/W型乳液。在该制备中，作为PEG脂质，使用DMG-PEG2000(15摩尔%)，并且制备0.5mM(基于脂质浓度)的乳液。

制备含有以B-2、DOPE、和胆固醇的总量计500nmol的乙醇溶液，并且以上述量添加PEG脂质。添加乙醇以使得总量为200μL，并且将混合物在冰温下静置15分钟。将类似地冰冷的苹果酸缓冲液(20mM，pH3.0-pH5.0)(200μL)在涡旋下在3秒以内混合。向其中立刻添加PBS(NISSUI)(3600μL)。使混合物经受使用Amicon Ultra(Millipore)的超滤。离心条件是1000G、25℃。重复两次包括离心10分钟后添加3200μL的PBS的操作，并将样品浓缩至约500μL。将浓缩物用PBS稀释至1000mg的质量，从而给出0.5mM的乳液溶液。

以与实施例1类似的方式，通过动态光散射测量所制造的乳液溶液的粒径分布。其结果是，使用DOPC时，体积中值直径无关pH地在40nm附近。使用DOPE时，体积中值直径显示出pH依赖性，并且在pH3.0处获得了约40nm的最小颗粒。因此，作为用于形成微小颗粒的条件，pH3.0是优异的(图3、表4)。

[表4]

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[实施例3] 盐浓度对B-2 O/W型乳液的影响

作为阳离子性脂质，使用B-2，制备具有阳离子性脂质:DOPE:胆固醇=3:4:3(摩尔比)的组成的O/W型乳液。在该制备中，作为PEG脂质，使用DMG-PEG2000(15摩尔%)，并且制备0.5mM(基于脂质浓度)的乳液。

制备含有以B-2、DOPE、和胆固醇的总量计500nmol的乙醇溶液，并且以上述量添加PEG脂质。添加乙醇以使得总量为200μL，并且将混合物在冰温下静置15分钟。将类似地冰冷的苹果酸缓冲液(20mM，pH3.0，0-1000mM NaCl)(200μL)在涡旋下在3秒以内混合。向其中立刻添加PBS(NISSUI)(3600μL)。使混合物经受使用Amicon Ultra(Millipore)的超滤。离心条件是1000G、25℃。重复两次包括离心10分钟后添加3200μL的PBS的操作，并将样品浓缩至约500μL。将浓缩物用PBS稀释至1000mg的质量，从而给出0.5mM(脂质浓度)的乳液。以与实施例1类似的方式，通过动态光散射测量所制造的乳液的粒径分布。

其结果是，在60mM或更低的NaCl浓度下，体积中值直径显示出为30~50nm。在500mM或更低的盐浓度下，体积中值直径显示出可被控制为100nm或更低(图4、图5)。

[实施例4] 药物释放与还原响应性测试

作为阳离子性脂质，使用B-2、B-2-5、O-C3M、B-2-3、TS-P4C2或L-PZ4C2，制备具有阳离子性脂质:DOPC:胆固醇=3:4:3(摩尔比)的组成的O/W型乳液。在该制备中，作为PEG脂质，使用DSG-PEG2000(9摩尔%)。作为药物模型分子，使用4-甲基伞形酮棕榈酸酯(30摩尔%)，并且将荧光探针DiD(1摩尔%)用于通过颗粒浓度进行的校正。

制备含有以阳离子性脂质、DOPE、和胆固醇的总量计1000nmol的乙醇溶液，并且以上述量添加PEG脂质、药物模型分子和荧光探针。添加乙醇以使得总量为400μL，并且将混合物在37℃下静置15分钟。将类似地加热的苹果酸缓冲液(20mM，pH3.0，30mM NaCl)(400μL)在涡旋下在3秒以内混合。向其中立刻添加PBS(NISSUI)(3200μL)。使混合物经受使用Amicon Ultra(Millipore)的超滤。离心条件是1000g、25℃。重复两次包括离心10分钟后添加3200μL的PBS的操作，并将样品浓缩至约500μL。将浓缩物用PBS稀释至1000mg的质量，从而给出1mM(脂质浓度)的乳液。

将400μL的所制备的乳液放入具有1000的分子量截止的透析膜(Spectrum Lab)，并且对40mL的PBS在37℃下进行透析。在该情况中，为了检验在还原下的响应性，还类似地对含有10mM谷胱甘肽的40mL的PBS进行透析。在各时点回收30μL的透析管内的溶液。将回收样品用PBS稀释3倍，并且将5μL与300μL的硼酸盐缓冲液(100mM，pH10.4)、150μL的乙醇、和50μL的10%SDS混合(总计505μL)。在60℃下浸透并搅拌30分钟后，通过荧光测量对溶液中的4MU和DiD量进行定量(4MU：Ex385、Em450 DiD：Ex645、Em665)。将4MU的残留量除以DiD的残留量，并用作相对于颗粒的药物残留量。

其结果是，在非还原环境下，O/W型乳液稳定地将药物维持24小时，而在还原条件下，在24小时处发现药物几乎完全释放(图6、图14)。由此，可以认为，O/W型乳液在细胞内还原环境下具有药物可释放性。

[对比实施例2] 药物释放与还原响应性测试(DODAP、EPC)

作为常规的脂质，使用DODAP或EPC，制备具有常规的脂质:DOPC:胆固醇=3:4:3(摩尔比)的组成的颗粒悬浮液。在该制备中，作为PEG脂质，使用DSG-PEG2000(9摩尔%)。作为药物模型分子，使用4-甲基伞形酮棕榈酸酯(30摩尔%)，并且将荧光探针DiD(1摩尔%)用于通过颗粒浓度进行的校正。

通过实施例3中记载的方法实施颗粒的制备和药物释放测试。

其结果是，未发现在还原下的响应性，并且药物模型物质在任意条件下经24小时几乎没有释放(图7)。

[实验实施例1] O/W型乳液的颗粒的脏器累积性

作为阳离子性脂质，使用B-2和B-2-5。作为常规的脂质，使用DODAP和EPC。O/W型乳液和颗粒悬浮液(DODAP、EPC)的制备方法按照实施例1和对比实施例1中记载的方法。为了将构成O/W型乳液或颗粒悬浮液(DODAP、EPC)的油滴的药代动力学可视化，以脂质的0.2摩尔%的量添加荧光色素DiR。颗粒浓度被调整为以脂质浓度计4mM。

作为荷瘤小鼠，使用4T1细胞(小鼠乳腺癌)。向Balb/c小鼠(♀，4周龄)的右腋，皮下移植1×10⁶个4T1细胞。移植起7天时，将200μL(脂质800nmol)的含有荧光修饰颗粒的O/W型乳液或颗粒悬浮液(DODAP、EPC)静脉内给药。在给药24小时后，实施肝破裂脱血，并回收脾、肝和肿瘤，并且通过IVIS获得图像。平均荧光强度使用Living Image Software计算。

其结果是，发现B-2-5在肝中的累积。发现EPC在脾中的累积，并且认为这是粗大的凝集块的贡献。示出B-2和DODAP良好地向肿瘤转移(图8、9)。

[实验实施例2] 肿瘤累积性的O/W型乳液的粒径依赖性

作为阳离子性脂质，使用B-2。O/W型乳液按照实施例3制备。在该制备中，作为模型药物，使用4-甲基伞形酮(10摩尔%)，并且作为PEG脂质，使用DMG-PEG2000(10摩尔%)和DSG-PEG2000(2.5摩尔%)，并且制备4.0mM(基于脂质浓度)的乳液。为了将构成O/W型乳液或颗粒悬浮液(DODAP、EPC)的油滴的药代动力学可视化，以脂质的0.2摩尔%的量添加荧光色素DiR。作为制备颗粒的过程中的盐(NaCl)浓度，选择30mM、150mM、750mM，并且分别记作“小”、“中”、“大”。颗粒浓度被调整为以脂质浓度计4mM。

以与实验实施例1中相同的方式评价荷瘤小鼠中的脏器的分布性。其结果是，随着粒径变小，在脾、肝中的累积减少。另一方面，粒径变小时，在肿瘤中的累积增加，并且示出最高累积的颗粒是“小”。由此，暗示了微细O/W乳液适合于对肿瘤的药物递送(图10)。

[实验实施例3] 肿瘤内颗粒分布

作为阳离子性脂质，使用B-2和B-2-5。作为常规的脂质，使用DODAP和EPC。O/W型乳液和颗粒悬浮液(DODAP、EPC)通过实施例1和对比实施例1中记载的方法制备。为了将构成O/W型乳液或颗粒悬浮液(DODAP、EPC)的油滴的药代动力学可视化，以脂质的1.0摩尔%的量添加荧光色素DiD。颗粒浓度被调整为以脂质浓度计4mM。

以与实验实施例1相同的方式实施荷瘤小鼠的制备和静脉内给药。给药后24小时处，回收肿瘤并用微切片机制造400μm厚的切片。通过共焦激光扫描显微镜(Nikon A-1)获得DiD的荧光。图像使用10倍透镜，以肿瘤整体的大图像的形式获得。图像的定量通过ImageJ进行。变异系数(Coefficiency of variance，CV，图像内的不均匀度的指标)通过将全部像素强度的离差(dispersion)除以像素强度的平均值而计算。

其结果是，明确了B-2和DODAP具有低的显示出图像不均匀性的的CV值。这可以认为是由于因颗粒的微小化从而提高了肿瘤中的浸透性而导致的(图11、图12)。

[实验实施例4] 载有地塞米松棕榈酸酯(DexPal)的颗粒的抗肿瘤效果

1.载有DexPal的颗粒的制备

作为阳离子性脂质，使用B-2或DODAP，并且作为脂质的乙醇溶液，将5mM阳离子性脂质(60μL)、5mM DOPC(80μL)、5mM Chol(60μL)、1mM DMG-PEG2000(100μL)、1mM DSG-PEG2000(30μL)、和10mM DexPal(30μL)在5mL管内混合，并添加乙醇至400μL。作为中性脂质，使用EPC，将5mM EPC(140μL)、5mM Chol(60μL)、1mM DMG-PEG2000(100μL)、1mM DSG-PEG2000(30μL)、和10mM DexPal(30μL)在5mL管内混合，并添加乙醇至400μL。将所述脂质乙醇溶液在冰上静置10分钟。在搅拌脂质乙醇溶液的同时，添加冰冷的20mM 苹果酸缓冲液(pH 3.0，30mM NaCl)(400μL)，并将混合物搅拌数秒。然后，添加冰冷的磷酸盐缓冲液(pH7.4)(2000μL)，并将混合物搅拌数秒。添加磷酸盐缓冲液(pH 7.4)(1200μL)，并将混合物通过使用Amicon Ultra 4(Millipore)在下述离心条件(室温，1000g，3分钟)下反复进行的超滤从而浓缩至约500μL。添加磷酸盐缓冲液(pH 7.4)(4000μL)，并将混合物在相同条件下通过超滤再次浓缩至约500μL。再次重复该操作。将浓缩物用磷酸盐缓冲液(pH 7.4)在容量瓶中稀释至1000μL，从而给出各自含有载有1mM DexPal的颗粒(油滴)的O/W型乳液和颗粒悬浮液。

2.载有DexPal的颗粒的粒径、和表面电位的测量

以与实施例1相同的方式，使用动态光散射法(Zetasizer Nano；Malvern)测量体积中值直径以及表面电位。所制备的各种颗粒的体积中值直径和表面电位示于表5。

[表5]

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3.载有DexPal的LNP的DexPal的搭载率的测量

将1mM 载有DexPal的LNP(50μL)与磷酸盐缓冲液(pH 7.4)(50μL)混合，并将其中50μL与MeOH(50μL)混合。添加0.1%三氟乙酸/乙腈(400μL)，并通过高效液相色谱检测DexPal(柱：InertSustain C18，5μm，4.6mm×250mm(GL Sciences Inc.)，流动相：MeOH:0.1%三氟乙酸/乙腈=70:30，流速：1mL/分钟，检测器：240nm，注入量：200μL)。作为DexPal的分析曲线，将0.5mM、0.25mM、0.125mM、0.0625mM的DexPal乙醇溶液(50μL)与MeOH(50μL)混合，并将其中50μL与磷酸盐缓冲液(pH 7.4)(50μL)混合。添加0.1%三氟乙酸/乙腈(400μL)，通过类似于载有DexPal的LNP的方法，检测DexPal。对峰面积和浓度描点，并计算载有DexPal的LNP中的DexPal浓度、和搭载率。各种载有DexPal的LNP的搭载率示于表6。

[表6]

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4.载有DexPal的LNP对EG7-OVA淋巴瘤的抗肿瘤效果的验证

将EG7-OVA(表达OVA的EL4淋巴瘤)(8.0×10⁵个细胞)皮下移植至C57BL/6L(6~8周龄，♀)的右腋，并且1周后，根据下述式计算肿瘤体积：(长轴(mm³))×(短轴(mm³))²×0.52)。将具有100~200mm³的肿瘤体积的荷瘤小鼠随机分组。24小时后，以基于地塞米松为1mg/mL的量，从尾静脉给药上述制备的含有B-2、DODAP、或EPC的载有DexPal的LNP、和作为水溶性地塞米松制剂的地塞米松磷酸钠(DexPhos)。24小时和48小时后，给药类似的载有DexPal的LNP、和DexPhos，并计算最终给药24小时后的肿瘤体积。移植后1周的肿瘤体积为100%时的最终给药起24小时后的肿瘤体积的比例示于图13。

[实施例5] 含4-甲基伞形酮胆固醇半琥珀酸酯(4MU-CHEMS)、地塞米松胆固醇半琥珀酸酯(Dex-CHEMS)的O/W型乳液的制造

1.含4MU-CHEMS的O/W型乳液的制造

向B-2:DOPC:Chol=3:4:3，添加9摩尔%DSG-PEG2000、和30摩尔%4MU-CHEMS，并且进一步添加1摩尔%荧光色素DiD从而给出类似于实施例1的乳液。

2.含Dex-CHEMS的O/W型乳液的制造

通过类似于实施例1中的方法，制造具有脂质组成：B-2/DOPC/Chol=3/4/3、10摩尔% Dex-CHEMS、10摩尔% DMG-PEG2000和3摩尔% DSG-PEG2000的乳液。

以与实施例1中相同的方法测量所制造的颗粒的平均粒径，并且结果示于表7。

[表7]

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[实验实施例5] 血中滞留性测试：4-甲基伞形酮棕榈酸酯(4MU-Pal)和4-甲基伞形酮胆固醇半琥珀酸酯(4MU-CHEMS)的对比

向B-2:DOPC:Chol=3:4:3的脂质混合物，添加DSG-PEG2000(9摩尔%)、和30摩尔%4MU-Pal，并且进一步添加1摩尔%荧光色素DiD，从而通过类似于实施例1中的方法给出乳液。

向B-2:DOPC:Chol:4MU-CHEMS=3:4:1.5:1.5的脂质混合物，添加DSG-PEG2000(15摩尔%)，并且进一步添加荧光色素DiD(1摩尔%)，并且通过类似于实施例1中的方法制备乳液。

将颗粒悬浮液的浓度设为以脂质浓度(B-2+DOPC+Chol)计4mM。向ICR小鼠♂4周龄，从尾静脉给药所述悬浮液(250μL)。在各时点，回收血液(25μL)，并与pH 10.4硼酸盐缓冲液(275μL)、乙醇(150μL)、10% SDS(50μL)混合。通过在60℃下培育30分钟，从而水解4MU-Pal或4MU-CHEMS。分别通过读板仪测量所生成的4-甲基伞形酮、和被颗粒修饰的DiD的荧光，并且由分析曲线检验血中残留量。结果示于图15。4MU-CHEMS与4MU-Pal相比，更长地滞留在血中。

[实验实施例6] 血中滞留性测试：4MU-CHEMS的肿瘤和血中浓度的对比

向B-2:DOPC:4MU-CHEMS=3:4:3的脂质混合物，添加DSG-PEG2000(20摩尔%)，并且制备颗粒。将颗粒悬浮液的浓度设为以脂质浓度计8mM。向用4T1细胞进行了皮下移植的Balb/c小鼠(♀4周龄，移植7天)，从尾静脉给药200μL。血中滞留性类似于实验实施例5地进行检验。对于肿瘤内浓度，在各时点回收肿瘤，将所回收的肿瘤切碎，然后量取25mg。添加硼酸盐缓冲液(pH 10.4，300μL)、乙醇(150μL)、和10% SDS(50μL)，并将混合物均化。将均化物在60℃下培育30分钟，并在14000g下离心5分钟。检验上清液的荧光强度，并由分析曲线推测存在量。

作为对比对象，使用由4-甲基伞形酮和DSG-PEG2000组成的胶束。在含有2%DMSO的PBS中制备胶束以含有1.6mM DSG-PEG2000和2.4mM 4MU。给药和定量以与颗粒中相同的方式实施。结果示于图16中。由B-2和4MU-CHEMS组成的乳液与由4-甲基伞形酮和DSG-PEG2000组成的胶束相比，更长地滞留在血中，并且在肿瘤中累积。

[实验实施例7] 含4MU-CHEMS的乳液的脏器分布

向B-2:DOPC:4MU-CHEMS=3:4:3，添加20摩尔%DSG-PEG2000，添加1摩尔%荧光色素DiD，并且以与实施例1中相同的方式制备乳液。将颗粒悬浮液调整至以脂质浓度计8mM，并且用4T1细胞进行了皮下移植的Balb/c小鼠(♀4周龄)从尾静脉给药200μL。用肝素/PBS使肝出血，移除肝、肺、心脏、肾、脾、肿瘤，并通过IVIS获得DiD的荧光。此外，计算与各脏器相关的平均像素强度。将各肿瘤切碎，并量取25mg。用Triton/PBS均化后，将均化物离心，并通过读板仪获得上清液中含有的DiD的荧光。结果示于图17。由B-2和4MU-CHEMS组成的乳液在肿瘤中累积，并且累积量随时间增大。

[实验实施例8] 血中滞留性评价

1.由地塞米松胆固醇半琥珀酸酯(Dex-CHEMS)和B-2组成的乳液的制备

脂质组成是3mM B-2/DOPC/Chol=3/4/3+10摩尔%Dex-CHEMS+10摩尔%DMG-PEG2000+10摩尔%DSG-PEG2000 (1000 μL)时，如下在测试管内混合脂质溶液。

[表8]

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将溶剂暂时蒸去，并将残留物在100 μL的CHCl₃中再溶解。通入N₂气体，从而在测试管壁上形成脂质薄膜。通过干燥器进行数小时真空处理后，添加20mM 苹果酸缓冲液(30mMNaCl，pH 3.0，1000μL)，并将混合物在室温下培育10分钟。用浴型超声仪超声30秒后，将混合物通过探针型超声仪超声5分钟(输出功率：30%)。在4℃、15000g下离心5分钟后，回收上清液。通过添加等量的36mM NaOH/PBS，从而实施中和。

2.Dex-CHEMS的定量

将各颗粒(100μL)转移至1.5mL管，并通过浓缩器(加热：高)干燥30分钟。将颗粒溶解于0.1%TFA/己烷:0.1%TFA/EtOH=9:1(100μL)中，并通过HPLC且使用Dex-CHEMS的峰面积计算回收率(HPLC条件…流动相：0.1%TFA/己烷:0.1%TFA/EtOH=9:1，柱：COSMOSIL SL-II，流速：1mL/分钟，分析时间：10分钟，柱温度：40℃，检测波长：240nm，Dex-CHEMS的峰：3.90分钟)。此外，作为Dex-CHEMS的分析曲线，使用在0.1%TFA/己烷:0.1%TFA/EtOH:CHCl₃=8:1:1中的0.5、0.25、0.125、0.0625mM的Dex-CHEMS。

3.给药、血液回收

将由Dex-CHEMS和B-2组成的乳液向ICR小鼠(4w♂)以25μg Dex-CHEMS/小鼠给药。使用26G注射针，在给药后1分钟、1小时、6小时、24小时，从尾静脉采集40μL的血液，快速加入含有1μL的5000U/mL肝素钠的PCR管中，通过轻敲共混，并在冰上保存。

4.Dex-CHEMS的测量

将在4℃、1000g下离心10分钟的血浆(16.5μL)转移至另一个1.5mL管。添加DDW至50μL，添加CHCl₃(62.5μL)、和MeOH中的0.04mM 4-甲基伞形酮棕榈酸酯(4MU-Pal)(将4MU-Pal用作标准物质)(125μL)，并将混合物涡旋混合30秒。添加CHCl₃(62.5μL)和DDW(62.5μL)，将混合物涡旋混合30秒，并且在4℃、15000g下离心5分钟。将下层的CHCl₃(100μL)在另一个管中回收，蒸去溶剂，并且将残留物溶解于0.1%TFA/己烷:0.1%TFA/EtOH=9:1(100μL)中。使用HPLC，计算Dex-CHEMS的峰面积、和4MU-Pal的峰面积。通过类似的方法，使用HPLC计算0.5、0.25、0.125、0.0625nmol的Dex-CHEMS的峰面积，并用作分析曲线。

(HPLC条件：流动相：0.1%TFA/己烷:0.1%TFA/EtOH=9:1，柱：COSMOSIL SL-II，流速：1mL/分钟，分析时间：10分钟，柱温度：40℃，检测波长：240nm(Dex-CHEMS)或280nm(4MU-Pal)，Dex-CHEMS：3.90分钟，4MU-Pal的峰：3.27分钟)。

以给药1分钟后作为100%，计算1小时后的血中残留率。结果示于图18。类似于上述，制备由B-2和地塞米松棕榈酸酯(Dex-Pal)组成的乳液，并类似地进行评价。其结果是，Dex-Pal在1小时后从血中消失，而Dex-CHEMS持续残留。

[实验实施例9] PEG脂质的浓度的影响

以与实施例1中相同的方式制备具有B-2/DOPC/Chol=3/4/3+10摩尔% DMG-PEG2000+3~9摩尔% DSG-PEG2000+10摩尔% Dex-CHEMS的组成的乳液。将具有各PEG量的乳液从小鼠尾静脉给药，1分钟、1小时、6小时、和24小时后回收血浆，用有机溶剂萃取，并通过HPLC计算Dex-CHEMS浓度。结果示于图19。随着DSG-PEG2000方面的增加，血中滞留性提高，从而对于DSG-PEG2000 6摩尔%和9摩尔%变为几乎相等。

[实验实施例10] mRNA表达评价

1.乳液的制造

以与实施例1中相同的方式，制备具有B-2/DOPC/Chol=3/4/3+10摩尔% DMG-PEG2000+6摩尔% DSG-PEG2000+10摩尔% Dex-CHEMS的组成的乳液。

2.肿瘤mRNA提取

将荷瘤小鼠通过颈椎脱臼进行安乐死，用解剖用剪刀分离肿瘤，在冰上的培养皿上去除皮肤并切碎。将约50mg的肿瘤置于含有氧化锆珠的自立型2mL管中，并用液氮急速冻结。分离全部样品，从液氮中取出，添加500μL的TRIzol，并经受使用Microsmash的破碎处理(4800rpm、30秒、2次)。添加100μL的氯仿，并将混合物涡旋混合1分钟，并静置5分钟。将管在4℃、12000g下离心15分钟，将上清液(200μL)转移至1.5mL管，并添加250μL的异丙醇。涡旋混合1分钟后，并将混合物静置5分钟，并在4℃、12000g下离心15分钟，并去除上清液。添加500μL的冰冷70%乙醇，使小片浮起并在4℃、12000g下离心10分钟，并去除上清液。再次实施该操作，并将小片完全溶解于100μL的不含核糖核酸酶的水(RNase free water)中。添加250μL的乙醇和5μL的5M NaCl，并将混合物涡旋混合1分钟，静置5分钟，并在4℃、12000g下离心15分钟，并去除上清液。添加500μL的冰冷70%乙醇，使小片浮起并在4℃、12000g下离心10分钟，并去除上清液。将小片完全溶解于500μL的不含核糖核酸酶(RNase)的水中，并且由吸光度测量浓度。

3.逆转录反应

用下述组成实施反应。

[表9]

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打开热循环仪，开始实验流程，并实施盖的预培育(105℃)。将总RNA以0.25μg/6μL置于PCR管中，在65℃、5分钟→4℃、∞的条件下进行修饰。

添加4×DN Master Mix(具有gDNA去除剂，2μL)，并将混合物轻微搅拌，并在37℃、5分钟→4℃、∞的条件反应。

添加5×RT Master Mix II(2μL)，并将混合物轻微搅拌，并在37℃、15分钟→50℃、5分钟→98℃、5分钟→4℃、∞的条件下反应。

将混合物在另一个PCR管内稀释10倍，并且在24小时内使用时，保存于4℃，并且在除此之外的情况中保存于-20℃。

4.定量实时PCR

定量实时PCR使用THUNDERBIRD(注册商标) SYBR(注册商标) qPCR Mix(TOYOBO)、和Light Cycler 480(Roche Diagnostics)和384孔板来实施。每1个孔以实现下述组成的方式混合试剂。

[表10]

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测量全部一式两份地实施。反应条件如下所述。通过ddCt法实施分析。

[表11]

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给药由B-2和Dex-CHEMS组成的乳液、作为对比的PBS、作为水溶性地塞米松制剂的地塞米松磷酸钠(DexPhos)、和通过从由B-2和Dex-CHEMS组成的乳液中去除Dex-CHEMS而得到的乳液，并以PBS中的值作为1进行对比。结果示于图20。在所有指标中，由B-2和Dex-CHEMS组成的乳液均显示出最低值。

[实验实施例11] 抗肿瘤效果

1.肿瘤移植

回收在2天前以5.0×10⁵细胞/皿接种的EG7-OVA，并用10 mL的PBS洗涤2次。对细胞计数，并以8.0×10⁵细胞/40μL悬浮于PBS中。向C57BL/6J(6~8周龄，♀)的右腋，以8.0×10⁵细胞/40μL给药所述悬浮液。

2.DC疫苗

将通过下述方法诱导为1.0×10⁶细胞/500μL/孔的骨髓源性树状细胞(BMDC)接种于未处理的有底12孔板中。

在测试管中，以DOPE:磷脂酸=7:2(摩尔比)混合DOPE和磷脂酸，并蒸去溶剂。在涡旋混合器中混合等量的0.12mg/mL的精蛋白溶液和0.8mg/mL的质粒DNA溶液，并制备质粒DNA/精蛋白颗粒悬浮液(使用10mM HEPES缓冲液作为溶剂)。在测试管内添加质粒DNA/精蛋白颗粒悬浮液，以使得脂质浓度为0.55mM，并将混合物在室温下培育10分钟。将其通过浴型超声仪超声，并以总脂质量的10摩尔%混合STR-KALA，从而给出含有KALA修饰质粒DNA的纳米颗粒。

添加含有KALA修饰质粒DNA的纳米颗粒，从而实现适当的浓度(血清(-)，GM-CSF(+))。2小时后，添加培养基(血清(+))。4小时后，从各孔回收BMDC，用PBS洗涤2次，对细胞计数，并用PBS稀释，从而实现适当的细胞浓度。将C57BL/6J(6w,♀)用二乙基醚麻醉。并从双足的足底皮下给药40μL的BMDC悬浮液。

3.由Dex-CHEMS和B-2组成的乳液的给药

将实验实施例1中制备且由Dex-CHEMS和B-2组成的乳液以基于地塞米松对应于0.5mg/kg的量(200μL)从尾静脉给药。

肿瘤体积根据下述式计算。

肿瘤体积(mm³)=(长轴(mm))×(短轴(mm))²×0.52。

4.小鼠骨髄源性树状细胞(BMDC)的诱导

在灭菌培养皿中，以每1只小鼠10mL分别添加RPMI-1640培养基和PBS，从经受颈椎脱臼的C57BL/6J、或者Balb/c小鼠(6~10周龄)中分离股骨和颈椎骨，用70%乙醇轻微消毒，并浸于PBS中。切断骨的两端，并且在1mL注射器(26G针)中用培养基挤出骨髄细胞。使细胞悬浮液通过40μm的细胞筛，并转移至50mL的锥形管。离心(450g，4℃，5分钟)后，去除上清液，添加ACK裂解缓冲液(1mL)，并且将混合物混合并在室温下静置5分钟。添加培养基(9mL)，将混合物离心并去除上清液。进一步将残留物用培养基(10mL)洗涤2次。然后，将细胞悬浮于培养基(10mL)中，并将悬浮液添加至10cm细胞培养皿，并在37℃、5%、CO₂的条件下培养不小于4小时。通过轻微吸取，将仅漂浮的细胞回收在50mL锥形管中，并进行离心。去除上清液，并将细胞在培养基(10mL)中悬浮并计数。细胞以1×10⁶细胞/mL悬浮于培养基中，添加GM-CSF(终浓度10ng/mL)，以1mL接种于24孔板，并在37℃、5%、CO₂的条件下培养2天。2天后和4天后去除漂浮的细胞，残留细胞的凝集体。添加新鲜的含GM-CSF的RPMI-1640培养基(1mL)。将在GM-CSF的存在下开始培养起第6天的漂浮和弱附着细胞作为未成熟树状细胞用于实验。

未处理(non-treat)、仅免疫组(immunization，免疫化)、未免疫但给药实验实施例1中制备的由Dex-CHEMS和B-2组成的乳液的组(Dex-CHEMS)、以及免疫且给药实验实施例1中制备的由Dex-CHEMS和B-2组成的乳液的组(免疫化+Dex-CHEMS)的对比示于图21。免疫且给药实验实施例1中制备的由Dex-CHEMS和B-2组成的乳液的组(免疫化+Dex-CHEMS)示出最高的抗肿瘤效果。

[参考例1]TS-PZ4C2的合成

＜甲磺酰化＞

向双(2-羟基乙基)二硫化物(15g，Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.制造)(97mmol)，添加乙腈(143mL)，并将混合物在20~25℃下溶解。添加三乙基胺(33.3g，KANTOCHEMICAL CO., INC.制造)(328mmol)，并将混合物在搅拌下冷却至10℃。耗费1小时滴加甲磺酰氯(34.5g，KANTO CHEMICAL CO., INC.制造)(300mmol)，从而将温度设定为20℃或更低。滴加结束后，将混合物在20~25℃下反应3小时。通过TLC分析(洗脱剂：氯仿，碘显色)，确认到双(2-羟基乙基)二硫化物的点消失，并且结束反应。向反应溶液，添加乙醇(29mL)从而终止反应，并将不溶解的材料通过过滤去除。向滤液添加10%碳酸氢钠水(150g)，并且将混合物搅拌5分钟并静置10分钟。去除水层，并将残留物通过用碳酸氢钠水萃取4次从而进行提纯。将所得有机层用硫酸镁(4.5g)脱水。通过过滤去除不溶解的材料，并将滤液中的溶剂通过蒸发仪蒸馏去除，从而给出褐色固体(以下称为“di-Ms型”)(29.4g)。

＜¹H-NMR谱(600MHz，CDCl₃)＞

所得化合物di-Ms型的¹H-NMR谱的分析结果示于以下。

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＜叔氨化＞

向di-Ms型(1.2g，4mmol)，添加乙腈(31mL)，并将混合物在20~25℃下溶解。添加碳酸钾(1.3g，KANTO CHEMICAL CO., INC.制造)(10mmol)，并将混合物搅拌5分钟。其后，添加4-哌嗪乙醇(5.0g，Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.制造)(39mmol)，并将混合物在25~35℃下反应13小时。通过TLC分析(洗脱剂：氯仿/甲醇/28%氨水=80/20/2(v/v/v)，碘显色)，确认到di-Ms型的点消失，并结束反应。通过过滤去除不溶解的材料，并将滤液中的溶剂通过蒸发仪蒸馏去除。将所得褐色液体溶解于氯仿(25mL)中，添加蒸馏水(25mL)，并将混合物搅拌5分钟。搅拌后，将混合物静置10分钟，并去除水层。其后，将残留物通过用蒸馏水萃取2次进行提纯。将所得有机层用硫酸镁(0.6g)脱水。通过过滤去除不溶解的材料，并将滤液中的溶剂通过蒸发仪蒸馏去除，从而给出淡黄色的液体(以下称为“di-PZ4C2型”)(1.0g)。

＜¹H-NMR谱(600MHz，CDCl₃)＞

所得化合物di-PZ4C2型的¹H-NMR谱的分析结果示于如下。

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＜乙酰化＞

将di-PZ4C2型(3.0g，8mmol)和D-α-生育酚琥珀酸酯(8.4g，SIGMA-ALDRICH制造)(16mmol)在20~25℃下溶解于氯仿(45mL)中。其后，添加4-二甲基氨基吡啶(0.4g，KOEICHEMICAL CO., LTD.制)(3mmol)和EDC(4.6g，Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.制造)(24mmol)，并将混合物在30℃下反应4小时。通过TLC分析(洗脱剂：氯仿/甲醇=9/1(v/v)，磷酸硫酸铜显色)，确认到D-α-生育酚琥珀酸酯的点消失，并结束反应。通过蒸发仪蒸馏去除反应溶剂，并添加己烷(200mL)。其后，添加乙腈(100mL)，并将混合物搅拌5分钟。静置10分钟后，回收己烷层，并将溶剂通过蒸发仪蒸馏去除，从而给出淡黄色的液体(10.7g)。将该液体(9.0g)通过硅胶柱色谱提纯(洗脱剂：氯仿/甲醇=99/1~98/2(v/v))，从而给出目标产物TS-PZ4C2(5.7g)。

＜¹H-NMR谱(600MHz，CDCl₃)＞

所得化合物TS-PZ4C2的¹H-NMR谱的分析结果示于如下。

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[参考例2] L-PZ4C2的合成

＜乙酰化＞

将di-PZ4C2型(2.5g，7mmol)和亚油酸(3.7g，NOF CORPORATION制造)(13mmol)在20~25℃下溶解于氯仿(25mL)中。其后，添加4-二甲基氨基吡啶(0.3g，3mmol)和EDC(3.8g，20mmol)，并将混合物在30℃下反应4小时。通过TLC分析(洗脱剂：氯仿/甲醇=9/1(v/v)，磷酸硫酸铜显色)，确认到亚油酸的点消失，并结束反应。通过蒸发仪蒸馏去除反应溶剂，并添加己烷(57mL)。其后，添加乙腈(24mL)，并将混合物搅拌5分钟。静置10分钟后，回收己烷层，并将溶剂通过蒸发仪蒸馏去除，从而给出淡黄色的液体(4.9g)。将该液体(4.9g)通过硅胶柱色谱提纯(洗脱剂：氯仿/甲醇=99/1~97/3(v/v))，从而给出目标产物L-PZ4C2(3.1g)。

＜¹H-NMR谱(600MHz，CDCl₃)＞

所得化合物L-PZ4C2的¹H-NMR谱的分析结果示于如下。

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[实施例6] O-PZ4C2的合成

将di-PZ4C2型(0.8g，2mmol)和油酸(1.2g，NOF CORPORATION制造)(4mmol)在20~25℃下溶解于氯仿(8mL)中。其后，添加4-二甲基氨基吡啶(0.1g，1mmol)和EDC(1.2g，6mmol)，并将混合物在30℃下反应3小时。通过TLC分析(洗脱剂：氯仿/甲醇=9/1(v/v)，磷酸硫酸铜显色)，确认到油酸的点消失，并结束反应。通过蒸发仪蒸馏去除反应溶剂，并添加己烷(12mL)。其后，添加乙腈(5mL)，并将混合物搅拌5分钟。静置10分钟后，回收己烷层，并将溶剂通过蒸发仪蒸馏去除，从而给出淡黄色的液体(1.8g)。将该液体(1.7g)通过硅胶柱色谱提纯(洗脱剂：氯仿/甲醇=99/1~97/3(v/v))，从而给出目标产物O-PZ4C2(1.1g)。

＜¹H-NMR谱(600MHz，CDCl₃)＞

所得化合物O-PZ4C2的¹H-NMR谱的分析结果示于如下。

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[参考例3] 4-甲基伞形酮胆固醇半琥珀酸酯(4MU-CHEMS)的合成

反应在氩气中实施。在茄形瓶中，添加胆固醇酯半琥珀酸酯(CHEMS)(2.43g，5mmol)、4-甲基伞形酮(1.06mg，6mmol)和无水DMF (20mL)。进一步，添加N,N-二甲基-4-氨基吡啶(DMAP) (61.1mg，0.5mmol)，添加N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA)(1.22mL，7mmol)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCl)(1.15g，6mmol)，并将混合物在室温下反应过夜。通过薄层色谱(TLC)确认到原料消失，并将混合物通过硅胶柱色谱提纯。干燥后，获得目标物质4-甲基伞形酮胆固醇半琥珀酸酯。所得4-甲基伞形酮胆固醇半琥珀酸酯的¹H-NMR谱的分析结果示于图22，并且结构式示于如下。

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[参考例4] 地塞米松胆固醇半琥珀酸酯的合成

反应在氩气中实施。在茄形瓶中，添加胆固醇酯半琥珀酸酯(CHEMS)(608.4mg，1.25mmol)、地塞米松(588.7mg，1.5mmol)和无水DMF(20mL)。进一步，添加N,N-二甲基-4-氨基吡啶(DMAP) (15.2mg，0.124mmol)，添加N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA)(0.305mL，1.75mmol)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCl)(287.6mg，1.5mmol)，并将混合物在室温下反应过夜。通过薄层色谱(TLC)确认到原料消失，并将混合物通过硅胶柱色谱提纯。干燥后，获得目标物质地塞米松半琥珀酸酯。所得地塞米松胆固醇半琥珀酸酯的¹H-NMR谱的分析结果示于图23，并且结果是示于如下。

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工业实用性

根据本发明的O/W型乳液，能够稳定地在其中内封水难溶性药物。细胞摄取内封有水难溶性药物的本发明的O/W型乳液时，式(I)所示的化合物被细胞内的还原性环境分解，从而使O/W型乳液崩解，由此包含在其中的水难溶性药物在细胞内被高效地释放。因此，本发明的O/W型乳液作为用于将水难溶性药物递送至细胞内的载体是有用的。此外，由于本发明的O/W型乳液具有100nm或更低的体积中值直径，因此可以避免由脾的排出，可以展示出高的血中滞留性和在靶组织、例如肿瘤等中的高累积性，并且其对于在生物体内将水难溶性药物递送至靶组织而言是有利的。

本申请基于在日本提交的专利申请第2015-200148(申请日：2015年10月8日)，其全部内容被并入本文中。