CN110506035B - 生物降解性化合物、脂质粒子、含有脂质粒子的组合物、和试剂盒 - Google Patents

生物降解性化合物、脂质粒子、含有脂质粒子的组合物、和试剂盒 Download PDF

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Abstract

[课题]本发明提供具有可在细胞内分解的结构的生物降解性化合物、含有其的脂质粒子、以及含有该脂质粒子的药物组合物。[解决手段]实施方式的化合物的特征在于，由下述式(1)表示，P‑[X‑R‑Y‑R’‑Q]2(1)(式中，P为含有醚键的亚烷氧基，X为含有叔胺结构的2价连接基，R为2价连接基，R’为单键或C1～C6亚烷基，Q为脂溶性维生素残基、甾醇残基、或C12～C22脂族烃基。)而且结构中含有至少1个生物降解性基团。该化合物可以与其他脂质、可减少聚集的脂质组合来制作脂质粒子。进而，该脂质粒子可应用于向细胞递送活性剂的药物组合物。

Description

生物降解性化合物、脂质粒子、含有脂质粒子的组合物、和试 剂盒
技术领域
本发明涉及具有可在细胞内分解的结构的生物降解性化合物、和含有该生物降解性化合物的脂质粒子。另外，本发明还涉及含有该脂质粒子的、用于递送核酸这样的活性剂的组合物和试剂盒。
背景技术
人们正在研究以治疗各种疾病为目的的脂质体。脂质体是由脂质构成的具有纳米级粒径的微囊，其内部可包封各种化合物等，并且生物相容性等也优异，因此是用于将治疗药或活性剂选择性地递送至生物体内的靶部位的理想的材料。为了这样的目的，一般使用平均粒径为100nm以上的巨大型单层膜脂质体(LUV)，关于构成该膜的材料，开发了各种材料。
这样的脂质体可由单个脂质构成。在这种情况下，例如，脂质使用具有头部和与之连接的疏水部的磷脂，该脂质结合而形成膜，构成可包封活性剂等的微囊。但是，为了赋予脂质体优异的特性，一般使用脂质混合物来构成脂质体。接着，该脂质混合物包括生物降解性优异的脂质、抑制所形成的脂质体聚集的脂质、具有抑制包封物渗漏的效果的脂质、具有膜融合效果的脂质等的组合。
另外，为了进一步改善脂质体的特性，研究了每种脂质。例如，对于专门用于基因转移的医用脂质体来说，优选满足高的生物降解性、高的生物相容性、高的活性剂引入性、和低的细胞毒性，期望能够构成这样的脂质体的脂质。
作为这样的脂质，开发了各种化合物，但所要应用的生物体的状态和待治疗的疾病有各种各样。期望基于它们的条件来增加可选择的脂质的种类。进而，正在寻求可构成具有超越以往脂质体的特性的脂质体的脂质。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第6093710号
发明内容
发明要解决的课题
针对上述课题，作为可构成脂质体的脂质，本实施方式提供的新化合物、使用其的脂质粒子、以及组合物和试剂盒。
解决课题的手段
本实施方式的化合物的特征在于，由下述式(1)表示：
P-[X-R-Y-R’-Q]2 (1)
式中，
P为主链含有1个以上醚键的亚烷氧基，
X各自独立地为含有叔胺结构的2价连接基，
R各自独立地为C1～C6亚烷基，
Y各自独立地为选自单键、醚键、羧酸酯键、硫代羧酸酯键、硫酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、和脲键中的2价连接基，
R’各自独立地为单键或C1～C6亚烷基，
Q各自独立地为脂溶性维生素残基、甾醇残基、或C12～C22脂族烃基)，
其结构中含有至少1个选自羧酸酯键、硫代羧酸酯键、二硫代羧酸键、酰胺键、氨基甲酸酯键、羧二氧键、和脲键中的生物降解性基团。
另外，实施方式的脂质粒子的特征在于，含有上述化合物。
另外，实施方式的组合物的特征在于，含有上述脂质粒子和载体。
另外，实施方式的试剂盒包含组合物，所述组合物含有上述脂质粒子、和向细胞引入上述脂质粒子的引入剂。
具体实施方式
[定义]
本实施方式中，在使用“～”表示数值范围时，只要没有特殊限定，包括两个端点，单位是相同的。例如，10～25摩尔％是指10摩尔％以上25摩尔％以下。
本实施方式中，“Cx～Cy”和“Cx”等记载是指分子或取代基中的碳数。例如，C1～C6烷基是指具有1个以上6个以下的碳的烷基。另外，本实施方式中，卤代烷基是指烷基中的1个以上的氢被氟等卤素取代，例如，氟芳基是指芳基中的1个以上的氢被氟取代。
本实施方式中，只要没有特殊限定，烷基是指从链烷烃的任意的碳上除去了1个氢的一价基团。术语“烷基”包括直链状或支链状烷基。进而，环烷基是指包括环状结构的烷基。将环状结构被直链状或支链状烷基取代的那些也称为环烷基。
另外，烯基是指从烯烃的任意的碳上除去了1个氢的一价基团。
另外，烃基是指1价或2价以上的、含有碳和氢的、如果需要可含有氧或氮的基团。脂族基团是指不含芳环的烃基，可采取链状、支链状或环状的任一种结构，也可以是它们的组合。另外，只要没有特殊限定，脂族基团可以含有不饱和键。进而，只要没有特殊限定，脂族基团可以含有氮、氧、硫、硒、氟、氯、溴等杂原子。另外，脂族基团可以为一价基团，也可以为多价基团。另外，芳族烃基是指含有芳环，如果需要具有脂族烃基作为取代基。
[生物降解性脂质化合物]
本实施方式的化合物是可适宜作为构成脂质体的脂质的化合物。其疏水部具有生物降解性基团，起可生物降解的脂质化合物的作用。进而，在应用于生物体时，具有抑制细胞内的蛋白质结合、毒性低的特征。另外，当脂质体由该脂质化合物构成时，由于脂质体的表面成为非阳离子性，从而减少了对细胞的损害，提高了核酸等活性剂的引入率。
这样的脂质化合物由下述通式(1)表示。
P-[X-R-Y-R’-Q]2 (1)
(式中，
P为主链含有1个以上醚键的亚烷氧基，
X各自独立地为选自甲基亚氨基、1,2-吡咯烷二基、和1,3-吡咯烷二基中的2价连接基，
R各自独立地为C1～C6亚烷基，
Y各自独立地为选自单键、醚键、羧酸酯键、硫代羧酸酯键、硫酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、和脲键中的2价连接基，
R’各自独立地为单键或C1～C6亚烷基，
Q各自独立地为脂溶性维生素残基、甾醇残基、或C12～C22脂族烃基。)
而且，在其结构中含有至少1个选自羧酸酯键、硫代羧酸酯键、硫酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、羧二氧键、和脲键中的生物降解性基团。
本实施方式的化合物的一个特征是，式(1)中的P包含醚键。即，P包含至少1个氧，该氧与2个碳键合。P包含的氧的数没有特殊限定，优选含有1～2个氧。另外，P含有的碳的数也没有特殊限定，P中含有的烃链的碳数优选为1～3，P中含有的碳的总数优选为3～8个。作为优选的P，可举出如下。
-(CH2)2-O-(CH2)2-
-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-
-(CH2)2-O-O-(CH2)2-
-(CH2)3-O-(CH2)2-O-(CH2)3-
-(CH2)2-O-CH2-O-(CH2)2-
通过具有这样的结构，立体结构的自由度增高。在将这样的化合物用于构成脂质体时，醚键中含有的氧与所组合的核酸等形成氢键，因此核酸等的包封量增多。
另外，X为含有叔胺结构的2价连接基，优选选自甲基亚氨基、1,2-吡咯烷二基、和1,3-吡咯烷二基。在将这样的化合物用于构成脂质体时，通过叔胺结构，发挥高的细胞膜透过性。
式(1)中，-R-Y-R’-Q构成疏水部。该疏水部中含有生物降解性基团。在此，生物降解性基团选自羧酸酯键(-C(＝O)-O-)、硫代羧酸酯键(-C(＝O)-S-)、二硫代羧酸酯键(-C(＝S)-S-)、酰胺键(-C(＝O)-NH-)、氨基甲酸酯键(-NH-C(＝O)-O-)、羧二氧键(-O-C(＝O)-O-)、和脲键(-NH-C(＝O)-NH-)。
该生物降解性基团除了在结构中作为Y存在以外，还可以包含在Q中。即，Q是源自脂溶性维生素或甾醇的基团，其结构中可以含有羧酸酯基等。另外，生物降解性基团不但可以包含在Q和Y两者中，而且Q和Y的任一方均可以含有2个以上的生物降解性基团。
Y和R’是连接R和Q的2价基团。
Y是选自单键、醚键、羧酸酯键、硫代羧酸酯键、硫酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、和脲键中的2价连接基。另外，R’是单键或C1～C6亚烷基。
它们可以是不含元素的单键。另一方面，在Q不含有生物降解性基团的情况下，Y含有生物降解性基团。
Q为脂溶性维生素残基、甾醇残基、或C12～C22脂族烃基。其中，优选为脂溶性维生素残基或甾醇残基，更优选为脂溶性维生素残基。
脂溶性维生素残基是由脂溶性维生素衍生的基团。作为脂溶性维生素，例如可举出视黄醇、视黄醛、麦角甾醇、7-去氢胆甾醇、麦角钙化醇(维生素D2)、胆钙化醇(维生素D3)、二氢麦角钙化醇(维生素D4)、二氢速甾醇、生育酚、和生育三烯酚。这些脂溶性维生素在末端具有羟基。脂溶性维生素残基的一例为从它们的羟基脱除了氢的基团。另外，可以使用来自脂溶性维生素衍生物的基团。该脂溶性维生素衍生物是指脂溶性维生素中含有的羟基可被硫代羟基、羧基、硫代羧基、或二硫代羧基置换的化合物。这些脂溶性维生素残基在末端具有-S-、-C(＝O)-O-、-C(＝O)-S-、或-C(＝S)-S-。在脂溶性维生素残基中，特别优选的是来自视黄醇(维生素A)、生育酚(维生素E)或者这些羧酸衍生物的基团。
甾醇残基是由甾醇衍生的基团。作为甾醇，例如可举出胆固醇、豆甾醇、β-谷甾醇、羊毛甾醇、和麦角甾醇。甾醇残基的一例是从这些甾醇的羟基中脱除了氢的基团。另外，甾醇残基可以具有与来自上述脂溶性维生素衍生物的基团同样的末端基。特别优选的甾醇残基是来自甾醇、胆固醇或它们的羧酸衍生物的基团。
C12～C22脂族烃基可以为直链状、支链状的任一种，也可以具有环状结构。另外，脂族烃基可以含有不饱和键，在含有的情况下，一般含有6个以下、优选3个以下的不饱和键。脂族烃基的碳数优选为12～18，更优选为13～17。
在这些Q中，优选含有吸收紫外线的结构的那些。具体地，优选含有环己烯结构。这样，通过含有吸收紫外线的结构，可以减轻由于含有该化合物作为成分的脂质粒子的光带来的劣化，另外，在需要分析脂质粒子的行为时，可容易地对其进行解析。
予以说明，式(1)的化合物含有2个[X-R-Y-R’-Q]，这些X、R、Y、R’、Q彼此独立，可以相同或不同，优选相同，且化合物的结构为对象。
本实施方式的化合物的各部位具有如上所述的结构，本实施方式的化合物优选具有下述式(1-01)～(1-12)表示的结构。
[化1-1]
Figure BDA0002199848830000071
[化1-2]
Figure BDA0002199848830000081
[化1-3]
Figure BDA0002199848830000091
。
其中，特别优选(1-01)～(1-04)，因为在用于脂质体时能够发挥优异的特性。
[化合物的制造方法]
这样的化合物例如可根据下述的工序图来制造。
[化2]
Figure BDA0002199848830000101
这样的化合物的合成方法与以往已知的脂质化合物的合成工艺相比，工序数少、能够以更高的效率制造。
[脂质粒子]
根据实施方式，提供脂质粒子。该脂质粒子的代表例为脂质体，但不限定于此，也包括与核酸等复合的脂质复合物等。另外，脂质体可以为单层膜脂质体(单室脂质体)、多层膜脂质体(多室脂质体)的任一种。
实施方式的脂质粒子含有上述式(1)表示的化合物。另外，期望还含有形成膜的脂质和可减少聚集的脂质。上述式(1)表示的化合物也可以起形成膜的脂质的作用，在实施方式中，“形成膜的脂质”不包含上述式(1)的化合物。
形成膜的脂质只要是通常可用于脂质体的脂质，即可任意使用。该脂质优选为生物降解性优异的脂质。
这样的形成膜的脂质的具体例为二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、二氢鞘磷脂、脑磷脂、和脑苷脂等。在实施方式中，用于脂质粒子的形成膜的脂质考虑目标脂质体的尺寸和生物体中的脂质体的稳定性等来适当地选择。其中，优选为二酰基磷脂酰胆碱、和二酰基磷脂酰乙醇胺。其中，脂质中含有的酰基的烃链的长度优选为10～20。该烃链可以为饱和烃基，也可以为不饱和烃基。
这样的形成膜的脂质已知有各种各样，作为优选的脂质，例如可举出：
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DOPE)、
1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DSPE)、
1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DPPC)、
1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(POPC)、
1,2-二-O-十八烷基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)、
1,2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷(DODAP)、
1,2-二肉豆蔻酰基-3-二甲基铵丙烷(14：0DAP)、
1,2-二棕榈酰基-3-二甲基铵丙烷(16：0DAP)、
1,2-二硬脂酰基-3-二甲基铵丙烷(18：0DAP)、
N-(4-羧基苄基)-N,N-二甲基-2,3-双(油酰氧基)丙烷(DOBAQ)、
1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DOPC)、
1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DLPC)、
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰-L-丝氨酸(DOPS)、和
胆固醇等。
它们除了可以发挥脂质体等的形成膜的功能，还可以发挥膜的融合效果。
实施方式中使用的可减少聚集的脂质在脂质粒子的调合中发挥包括粒子之间的聚集的功能。作为这样的脂质，已知有各种脂质，实施方式的脂质粒子可以选用任意的脂质粒子。作为这样的脂质的例子，可举出聚乙二醇(PEG)修饰的脂质、由ω-氨基(低聚乙二醇)链烷酸单体衍生的聚酰胺低聚物(美国专利第6320017号)、单唾液酰神经节苷脂等。更具体地，可以使用美国专利第6320017号中列举的ATTA8-DPSE等ATTA脂质、美国专利第5820873号、美国专利第5534499号、和美国专利第5885613号中所述的聚乙二醇脂质共轭物。
在形成脂质粒子时，PEG修饰的脂质可在脂质粒子的表面上形成锚定的脂质部分。作为这样的PEG修饰的脂质的例子，可举出PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG-神经酰胺共轭物(例如日本专利第3920330号说明书中所述的C14 PEG-Cer或C20 PEG-Cer)、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的1,2-二酰氧基丙烷-3-胺、PEG修饰的二酰基甘油(例如1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-甲氧基聚乙二醇；PEG-DMG)和PEG修饰的二烷基甘油。其中，特别优选PEG修饰的二酰基甘油和PEG修饰的二烷基甘油。
当使PEG等体积大的修饰基团结合在脂质表面时，修饰基团与脂质粒子的结合影响脂质粒子乃至脂质体的稳定性。例如在美国专利第5820873号中公开了PEG修饰的脂质中的酰基链的长度、酰基链的饱和度、和空间位阻头部基团的尺寸等特性影响脂质粒子的稳定性。因此，通过调节这些特性，可以获得根据目的的脂质粒子。例如，通过缩短PEG修饰的脂质中的修饰基团，会更快地脱除脂质粒子，或者通过延长修饰基团，可以增加脂质粒子在血浆中的滞留时间等。其结果，有时可以改善脂质粒子向靶组织的递送。
脂质粒子还可以含有其他脂质。这样的其他脂质可以从通常用于脂质粒子的那些中任意选用。例如，为了调节毒性，可以组合毒性相对较低的脂质。另外，为了引入用于将配体结合到脂质粒子的官能团，可以组合具有特定结构的脂质。
进而，在使用脂质粒子作为脂质体的情况下，作为用于抑制该包封物渗漏的脂质，可以含有甾醇、例如胆固醇。进而，可以使靶作用物质与脂质粒子偶联。此时的偶联方法可以采用以往已知的任意方法。
脂质粒子通过组合这些脂质来构成，构成该脂质粒子的各脂质的配比根据目的来调整，没有限定。其中，以用于脂质粒子的脂质的总摩尔数为基准，一般而言，配合：
式(1)表示的脂质化合物10～75摩尔％、
形成膜的脂质25～80摩尔％、
可减少聚集的脂质1～10摩尔％，
优选为：
式(1)表示的脂质化合物10～50摩尔％、
形成膜的脂质47.5～80摩尔％、
可减少聚集的脂质1～10摩尔％、例如2.5摩尔％。
在此，式(1)的化合物与形成膜的脂质的平衡非常重要，即使仅存在它们中的一方，活性剂的引入率也不足够高。因此，式(1)的化合物与形成膜的脂质的配比以摩尔数为基准，优选为1：0.5～1：9，更优选为1：1～1：2。
实施方式的脂质粒子还可以含有活性剂。在实施方式中，活性剂是指可以对细胞、组织、器官、或受试者赋予特定效果的物质。特定效果可以是生物学的、生理学的、或美容的效果的任一种。通过使用实施方式的脂质粒子，可以向生物体内的目标部位递送各种活性剂。该活性剂既可以包封在脂质粒子的内部，也可以结合到外侧或内侧的脂质表面，还可以配置在脂质层的内部。
活性剂的典型的例子为核酸，例如可举出选自质粒、寡核苷酸、多核苷酸、低分子干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、DNA、适体、和核酶中的核酸。另外，也可以使用反义寡核苷酸、Antago-mir、aDNA、质粒、核糖体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)、核内低分子RNA(snRNA)、mRNA等。
作为miRNA，可以使用17～25个核苷酸单元连接而成的miRNA。在一个更优选的实施方式中，核酸是15～50个或20～30个核苷酸单元连接而成的寡核苷酸。siRNA例如含有16～30个核苷酸单元，可具有双链区。在其他实施方式中，核酸是免疫刺激性寡核苷酸、诱饵寡核苷酸、超级mir、miRNA模拟物、或miRNA抑制剂。超级mir是指RNA或脱氧核糖核酸DNA或这两者或者它们的改性体的单链、双链、或部分双链的低聚物或聚合物，具有与miRNA基本相同的核苷酸序列，并且是与其靶标反义的低聚物或聚合物。miRNA模拟物表示可用于模拟1种以上miRNA的基因沉默能力的分子组。因此，术语“miRNA模拟物”是指可以进入RNAi途径并调节基因表达的合成非编码RNA(即，miRNA不能从内源性miRNA的供给源精制来获得)。
在脂质粒子中组合核酸时，核酸的形态没有特殊限定。该核酸例如可以为单链DNA或RNA、双链DNA或RNA、或者DNA-RNA杂合体。作为双链RNA的例子，可举出siRNA。作为单链核酸，例如可举出反义寡核苷酸、核酶、miRNA、和形成三链的寡核苷酸。
实施方式的脂质粒子含有核酸时，还可以含有与核酸结合的化合物。作为这样的化合物，可举出碱性蛋白质、或碱性肽，优选可举出鱼精蛋白、组蛋白、和它们的盐。例如，组蛋白及其盐具有与核酸结合，折叠核酸分子的性质。另外，鱼精蛋白具有与核酸结合，并且卷入该核酸的性质。因此，这些化合物对于将核酸封入脂质粒子都是有效的。
另外，实施方式的脂质粒子还可以含有调节细胞内的核酸表达的化合物。通过调节细胞内的核酸的表达，可以使被递送了脂质体的细胞获得可视化和细胞死亡的效果，因此是优选的。作为这样的化合物，可举出视黄酸、环腺苷酸(cAMP)、抗坏血酸等。
另外，实施方式的脂质粒子可以含有脂蛋白、载脂蛋白等。
作为活性剂，可以使用其他治疗剂。作为可使用的治疗剂的具体例，可举出肽、多肽、细胞因子、生长因子、致凋亡因子、分化诱导因子、细胞表面受体及其配体、激素等。更具体地，治疗剂可举出抗炎化合物、抗抑郁药、兴奋剂、镇痛药、抗生素、避孕药、退热药、血管扩张剂、血管生成抑制剂、细胞血管作用药(cytovascular agents)、信号转导抑制剂、心血管药、抗肿瘤药、激素、和类固醇。
当在脂质粒子中组合活性剂时，优选将活性剂以更高的引入率引入脂质粒子。另外，还优选由取决于脂质特性的细胞毒性引起的细胞死亡率低。在使用以往已知的脂质粒子引入核酸时，通常，引入率低，并且细胞毒性引起的细胞死亡率高。与此相比，在使用本实施方式的脂质粒子的情况下，可以提高核酸的引入率，并且降低细胞死亡率。具体地，在以往的脂质粒子中，引入率为约10％，电穿孔导致的细胞死亡率为60～70％，与此相比，在使用实施方式的脂质粒子的情况下，引入率为约70％以上，电穿孔导致的细胞死亡率降低至30％以下。
实施方式的脂质粒子可以根据目的，形成任意的尺寸。但是，在将实施方式的脂质粒子用于医药用途的情况下，通常，将脂质粒子制成纳米级尺寸的粒子。具体地，实施方式的脂质粒子的平均粒径一般为50nm～300nm，优选为50nm～200nm。脂质粒子的尺寸可以采用任意方法调节。例如，可以通过超声波处理来缩小脂质粒子。另外，也可以通过透过聚碳酸酯膜和陶瓷膜，将脂质粒子进行分级来调节尺寸。予以说明，在实施方式中，脂质粒子的平均粒径例如可以通过使用动态光散射法的激光粒度仪(Zetasizer)来测定。
另外，实施方式的脂质粒子的体内半衰期(t1/2)一般小于3小时，优选小于2小时，特别优选小于1小时。在此，体内半衰期是指例如肝脏中、脾脏中或血浆中的半衰期。在实施方式中，由于构成脂质的式(1)化合物具有生物降解性基团，因此与由不含生物降解性基团的脂质构成的脂质粒子相比，半衰期例如少10％。
[脂质粒子的制造方法]
实施方式的脂质粒子可以通过以往已知的任意方法制造。作为制造脂质粒子和脂质体的方法，已知有バンガム(Bangham)法、有机溶剂提取法、表面活性剂除去法、冻融法等，可以采用这些方法。另外，例如，通过向醇等有机溶剂中引入式(1)表示的化合物、以及形成膜的脂质、可减少聚集的脂质，再添加水性缓冲液，由此可自发地形成脂质粒子。通过在该水性缓冲液中预先组合活性剂，可以向脂质粒子中引入活性剂。
本实施方式的脂质粒子可用于向细胞递送活性剂。特别是将核酸等活性剂向细胞的递送用于基因工程、重组蛋白的生产、和基因治疗以及作为细胞诊断已知的医疗技术等所有的领域。
[组合物]
本实施方式的脂质粒子可用作组合物。例如，提供含有本实施方式的脂质粒子和载体的组合物。这样的组合物可用于医药用途。
作为载体，可以从往已知的载体中任选使用，例如可举出水、生理盐水这样的盐水、甘氨酸水溶液、缓冲液等。除了这些载体以外，为了改善稳定性等，可以组合白蛋白、脂蛋白、载脂蛋白、球蛋白等糖蛋白。
实施方式的组合物可以通过标准的方法制备。作为载体，一般使用生理盐水。在包含盐水或其他含盐载体的组合物中，载体优选在脂质粒子形成后加入。因此，在组合脂质粒子和核酸等活性剂后，通常，将该组合物用生理盐水这样的药学可接受的载体稀释。
实施方式的组合物可根据需要含有佐剂。例如，在医药用途的情况下，通过含有药学可接受的佐剂，例如pH调节剂、缓冲剂、张度调节剂等作为佐剂，可以使药物组合物更接近生理状态。作为起这种作用的佐剂，可举出醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙等。另外，实施方式的组合物可以含有用于改善贮存稳定性的脂质保护剂。作为这样的保护剂，可举出抑制自由基引起的损伤的α-生育酚这样的亲脂性自由基淬灭剂、抑制脂质过氧化损伤的铁草胺这样的水溶性螯合剂。
除此以外，可以将上述的活性剂等添加到组合物中。该活性剂可以与组合在脂质粒子中的活性剂相同或不同。另外，还可以向组合物中添加与核酸结合的化合物和调节核酸表达的化合物。
实施方式的组合物中含有的脂质粒子的浓度没有特殊限定，组合物中含有的脂质粒子的含有率一般为0.01～30质量％、优选为0.05～10质量％。脂质粒子的浓度可根据目的适当选择。
实施方式的组合物可以通过以往周知的方法灭菌。灭菌的组合物可以作为可直接给药的制剂进行包装，也可以干燥后包装。干燥的组合物可以通过在临给药前与灭菌水溶液组合来制成可给药的制剂。
实施方式的组合物可以是试剂盒形态。实施方式的试剂盒含有上述脂质粒子和用于向细胞引入上述脂质粒子的引入剂，但其形态是任意的。例如可举出：将不含活性剂的脂质粒子分散在载体中的分散物和活性剂分别装纳在不同的容器中的试剂盒，以及将干燥的脂质粒子、活性剂和载体分别装纳在不同的容器中的试剂盒等。进而，可以将干燥的脂质粒子或脂质粒子分散物与活性剂分别制成独立的产品，从而可以使使用者根据目的来选用每种产品
该试剂盒中可以组合有用于引入核酸的试剂。
[药物组合物的利用方法]
在将实施方式的脂质粒子用于医药用途时，组合物可用于治疗人或动物的各种疾病。通过采用治疗剂作为活性剂而与脂质粒子组合，可以将治疗剂递送至靶细胞来治疗疾病。
例如，可以将各种核酸递送给细胞而与细胞接触来进行疾病的预防或治疗。作为这样的核酸，可举出寡核苷酸、siRNA、质粒、反义核酸、或核酶。另外，核酸的递送在体外或体内进行均可。
作为体内给药的方法，药物组合物优选采用非口服给药，即，关节内给药、静脉内给药、腹膜内给药、皮下给药、或肌肉内给药。药物组合物的静脉内给药或腹膜内给药可以通过团注法来进行。
另外，向靶组织直接涂布实施方式的药物制剂，也可以使药物组合物与靶组织接触。另外，也可以通过滴注向脑膜等给药、使用内窥镜器具给药。
在特定的实施方式中，用药物组合物的处理(预防和治疗)一般在生理温度(约37℃)下进行1～24小时、优选为2～8小时的时间。在体外的应用中，作为对象的细胞没有特殊限定。例如可以为脊椎动物细胞、非脊椎动物细胞或植物细胞。但是，在优选的实施方式中，细胞为动物细胞，更优选为哺乳动物细胞，最优选为人细胞。
实施例
[合成例1]化合物(1-01)的合成
根据上述制造工艺，进行化合物(1-01)的合成。具体地，进行如下所述的操作。
在氩气氛下，向200mL烧瓶中引入三甘醇5.00g(33mmol)、三乙胺14.39mL(112mmol)、和乙腈(50mL)。在0℃下滴入甲磺酰氯7.97mL(103mmol)后，在室温下搅拌1小时。接着，滴入乙醇10mL，处理未反应的甲磺酰氯后，过滤。将过滤后的反应液用50mL二氯甲烷洗涤4次，用Na2SO4干燥。将干燥后的反应液过滤后，浓缩，得到橙色油状的中间产物18.21g(收率81％)。
接着，向100mL烧瓶中引入中间产物1 842mg(2.75mmol)、K2CO3 950mg(6.87mmol)和乙腈15mL。在室温下搅拌15分钟后，滴入3-(甲氨基)-1-丙醇735mg(8.258mmol)。在保持在70℃的温度的同时搅拌过夜。将反应液放冷后，通过过滤除去不溶物。将滤液进行浓缩，得到粗制物720mg。将该粗制物通过柱色谱(NH硅胶15g，展开液50％己烷/氯仿)精制，得到微黄色透明油状的中间产物2 348mg(收率43％)。
向30mL茄形瓶中引入中间产物2 300mg(1.03mmol)和二氯甲烷10mL，加入视黄酸770mg(2.56mmol)、4-二甲氨基吡啶50mg(0.41mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐590mg(3.08mmol)，在室温下搅拌过夜。接着，将反应液用10mL水洗涤2次，用Na2SO4干燥。将干燥后的反应液过滤后，浓缩，得到粗制物2.1g。将该粗制物通过柱色谱(硅胶40g，展开液50％己烷/氯仿和氯仿)精制，得到浓橙色油状的化合物1-01 262mg(收率29％)。
[实施例1]
使用载体DNA溶液和DNA浓缩肽，制备由载体DNA-DNA浓缩肽构成的芯复合物。载体DNA使用掺入有巨细胞病毒早期启动子/增强子、纳米样基因、转录终止信号的质粒。DNA浓缩肽使用来自人/鱼精蛋白的寡肽。向微管(プロテオセーブSS 1.5ml，住友ベークライト公司)中分配DNA浓缩肽溶液(0.24mg/ml，10mM HEPES，pH5.4)100μl。一边将分配的肽溶液用涡旋混合器(1,500rpm)(MSV-3500，BIOSAN)搅拌，一边滴入载体DNA溶液(0.15mg/ml，10mMHEPES，pH5.4)200μL进行混合。
用乙醇注入法制备包封芯复合物的脂质体。向微管(プロテオセーブSS 1.5ml，住友ベークライト公司)中分配50μl脂质溶液(化合物1-01：DOTAP：胆固醇：DMG-PEG＝5：3：1：0.3mol)。一边将分配的脂质溶液用涡旋混合器搅拌，一边滴入芯复合物50μl进行混合。滴入后，缓慢地添加10mM HEPES(pH5.4)400μl，制备包封载体DNA的脂质体。再加入10mMHEPES(pH5.4)400μl，在温和地混合后，使用超滤旋转柱(PT-1014，AproScience)，通过离心进行缓冲液交换和浓缩，制备100μL包封芯复合物的脂质体(10mM HEPES，pH7.3)。
[实施例2]
在实施例1中，将脂质溶液变更为化合物1-01：PDME：胆固醇：DMG-PEG＝5：3：1：0.3mol，除此以外，与实施例1同样操作，制备实施例2的脂质体。
[比较例1]
在实施例1中，将脂质溶液变更为化合物R-01：DOTAP：胆固醇：DMG-PEG＝5：3：1：0.3mol，除此以外，与实施例1同样操作，制备比较例1的脂质体。
[化3]
Figure BDA0002199848830000191
[比较例2]
在实施例1中，将脂质溶液变更为化合物R-01：PDME：胆固醇：DMG-PEG＝5：3：1：0.3mol，除此以外，与实施例1同样操作，制备比较例2的脂质体。
[评价]脂质体的DNA包封量的测定
脂质体的DNA包封量的测定使用Quant-iT PicoGreen dsDNA测试盒(ThermoFisher Scientific公司)进行。向含有0.1％Triton-X100的Tris-EDTA缓冲液95μL中加入实施例1的脂质体溶液5.0μL，温和地混悬。在室温下静置30分钟后，向溶液中加入用Tris-EDTA缓冲液稀释了200倍的PicoGreen溶液100μL，充分混合。在室温下静置5分钟后，使用酶标仪：Mithras LB-940(Berthold)测定溶液的荧光强度(激发波长：485nm，荧光波长：530nm)。DNA浓度使用由已知浓度的λDNA制作的检量线来定量。从得到的数值，将脂质体包封的DNA量作为每1mL溶液的DNA量(μgDNA/mL)来计算。得到的结果如表1所示。含有化合物1-01的脂质体与含有化合物R-01的脂质体相比，包封DNA的量更高。
[评价]脂质体的载体DNA引入率的测定
脂质体向细胞的载体DNA的引入(包封量)通过在载体DNA上的Nluc基因的表达来定量化。关于NLuc的表达，将其发光量通过酶标仪：Mithras LB-940(Berthold)测定来评价。细胞使用人T细胞性白血病细胞：Jurkat(从ATCC购入)。向96孔培养板中播种100μL的1×106个细胞/mL的细胞悬浮液，然后添加实施例1制备的脂质体溶液5μL。添加后，将细胞在37℃、5％CO2的气氛的恒温箱内培养48小时后，测定NLuc的酶活性。NLuc的酶活性使用NanoGlo荧光素酶测试系统(Promega)，根据试剂盒所带的手册，用光度计测定。如表1所示可知，就通过脂质体摄入细胞内的Nluc基因表达效率而言，与含有化合物R-01的脂质体相比，含有化合物1-01的脂质体更高。
[表1]
Figure BDA0002199848830000201
如上所述，尽管说明了本发明的几个实施方式，但这些实施方式仅作为例子示出，并不意图限制本发明的范围。这些新的实施方式可以以各种其他形式实现，在不脱离本发明主旨的范围内，可以进行各种组合、省略、置换、变更等。这些实施方式及其变形包括在本发明的范围和主旨中，也包括在权利要求记载的发明及其同等的范围内。

Claims (17)

1.化合物，其特征在于，由下述式(1)表示，
P-[X-R-Y-R′-Q]2 (1)
式中，
P为主链含有1个以上醚键的亚烷氧基，
X各自独立地为含有叔胺结构的2价连接基，
R各自独立地为C1～C6亚烷基，
Y各自独立地为选自单键、醚键、羧酸酯键、硫代羧酸酯键、硫酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键和脲键中的2价连接基，
R′各自独立地为单键或C1～C6亚烷基，
Q各自独立地为视黄醇或视黄醛；
在结构中含有至少1个选自羧酸酯键、硫代羧酸酯键、二硫代羧酸键、酰胺键、氨基甲酸酯键、羧二氧键和脲键中的生物降解性基团。
2.权利要求1所述的化合物，其中，上述P包含3～8个碳和1～2个氧。
3.权利要求1或2所述的化合物，其中，上述P仅由碳和氧构成。
4.权利要求1或2所述的化合物，上述X各自独立地选自甲基亚胺基 、1,2-吡咯烷二基、和1,3-吡咯烷二基。
5.权利要求1或2所述的化合物，其中，上述Q含有环己烯结构。
6.权利要求1或2所述的化合物，其由下述式(1-01)～(1-12)表示，
Figure FDA0003519786490000021
Figure FDA0003519786490000031
。
7.脂质粒子，其含有权利要求1～6任一项所述的化合物。
8.权利要求7所述的脂质粒子，其还含有形成膜的脂质和可减少聚集的脂质。
9.权利要求8所述的脂质粒子，其中，上述形成膜的脂质选自：
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DOPE)、
1,2-硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DSPE)、
1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DPPC)、
1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(POPC)、
1,2-二-O-十八烷基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)、
1,2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷(DODAP)、
1,2-二肉豆蔻酰基-3-二甲基铵丙烷(14：0DAP)、
1,2-二棕榈酰基-3-二甲基铵丙烷(16：0DAP)、
1,2-二硬脂酰基-3-二甲基铵丙烷(18：0DAP)、
N-(4-羧基苄基)-N,N-二甲基-2,3-双(油酰氧基)丙烷(DOBAQ)、
1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DOPC)、
1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DLPC)、
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰-L-丝氨酸(DOPS)和
胆固醇，
上述可减少聚集的脂质为聚乙二醇(PEG)修饰的脂质。
10.权利要求7～9任一项所述的脂质粒子，其还含有活性剂。
11.权利要求10所述的脂质粒子，其中，上述活性剂为选自质粒、寡核苷酸、多核苷酸、siRNA、微小RNA、DNA、mRNA、适体和核酶中的核酸。
12.权利要求11所述的脂质粒子，其还含有与核酸结合的化合物。
13.权利要求12所述的脂质粒子，其中，上述与核酸结合的化合物为碱性蛋白质或碱性肽。
14.权利要求12或13所述的脂质粒子，其中，上述与核酸结合的化合物为鱼精蛋白或组蛋白。
15.权利要求12或13所述的脂质粒子，其还包含调节细胞内的核酸表达的化合物。
16.组合物，其特征在于，含有权利要求7～15任一项所述的脂质粒子和载体。
17.试剂盒，其包含组合物，所述组合物含有权利要求10或11所述的脂质粒子和用于向细胞引入上述脂质粒子的引入剂。
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