CN111902397A - 改进了细胞内动力学的阳离子脂质 - Google Patents

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Abstract

提供一种改进了细胞内动力学的阳离子脂质、包含其的脂质膜结构体及它们的用途。一种式(1)表示的阳离子脂质(式(1)中，R1a及R1b各自独立地表示碳原子数为1～6的亚烷基；Xa及Xb各自独立地表示：碳原子数为1～6、且叔胺基的数量为1的非环状烷基叔胺基，或碳原子数为2～5、且叔胺基的数量为1～2的环状亚烷基叔胺基；R2a及R2b各自独立地表示碳原子数为8以下的亚烷基或氧二亚烷基；Ya及Yb各自独立地表示酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键或脲键；Za及Zb各自独立地表示碳原子数为3～16、具有至少一个的芳香环且可具有杂原子的芳香族化合物衍生的2价基团；R3a及R3b各自独立地表示源自具有羟基的脂溶性维生素与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基，或源自具有羟基的甾醇衍生物与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基，或碳原子数为12～22的脂肪族烃基，

Description

改进了细胞内动力学的阳离子脂质
技术领域
本发明涉及改进了细胞内动力学的阳离子脂质，含有所述阳离子脂质的脂质膜结构体及其用途。
背景技术
对于核酸治疗的实施，要求有效且安全的核酸递送载体。尽管病毒载体是具有良好表达效率的核酸递送载体，但从安全性的方面来看具有实用上的问题。因此，可以更安全地使用的非病毒核酸递送载体的开发正在进行中。其中，使用阳离子脂质的载体是目前最通常使用的非病毒核酸递送载体。
阳离子脂质主要由胺部分和脂质部分构成，其中显示阳离子性的胺部分和聚阴离子核酸发生静电相互作用以形成带正电的脂质体或脂质膜结构，其促进摄取到细胞内，并将核酸递送到细胞内。
作为通常并广泛使用的已知阳离子脂质，可以列举DOTAP和DODAP。这些已知的阳离子脂质当与磷脂组合时形成带正电的脂质体或脂质膜结构体，其与核酸发生静电相互作用，使得能够将核酸递送至靶细胞(非专利文件1)。
在另一方面，对于使用有阳离子脂质的脂质膜结构体，为了在生物体内作为核酸递送载体发挥实际的效果，需要满足良好的体内动力学特性，具体而言为，血液中较高的稳定性，如在肿瘤靶标中高度聚集。鉴于该问题，已知：将脂质膜结构体表面的pKa调节至约中性左右，导入有PEG脂质的脂质膜结构体于静脉内注射后在血液中显示长寿命，并在肿瘤部位中聚集。
如上所述正在开发改进了体内动力学的阳离子脂质，但通常鉴于这样的将外来物质导入细胞内的核酸递送载体的性质，期望以较少的摄入量发挥较大的效果。即，当脂质膜结构体被用作表达载体到细胞内的递送载体时，期望提高细胞内摄入的单位脂质膜结构体对应的表达水平，以提高细胞内表达效率。为了提高细胞内表达效率，除了体内动力学，需要改进细胞的摄取、从内体逃逸、核膜渗透性等细胞内动力学。此外，已知对于促进细胞内转录，需要提高核酸从载体解离、且与转录因子的结合能力(非专利文件2)。
如上所述，作为核酸递送载体，不仅需要改进体内动力学，还需要改进细胞内动力学，特别是，促进细胞的摄取、内体逃逸、从核酸的载体的解离变得重要。这些细胞内动力学的改善例存在以下报告。
专利文献1中记载了增加细胞的摄取量的例子。该文献中记载了，出于增加细胞的摄取量的目的，含有较多氨基的阳离子脂质。含有该阳离子脂质的脂质膜结构体可以增加细胞的摄取量，但另一方面，由于具有较多的与核酸发生相互作用的氨基，在细胞内，核酸从脂质膜结构体的解离受到抑制，无法期待改善核酸递送效率。
接着，有改进了内体逃逸效率的例子(非专利文献3及非专利文献4)。这些文献中，改变阳离子脂质的氨基周边结构，将脂质膜结构体的表面的pKa调整为对内体逃逸优选的值。记载了：其结果，可促进脂质膜结构体的内体逃逸，能够效率良好地将核酸递送至细胞质内。但是，并非全部的具有适当的pKa的脂质膜结构体均显示较高的核酸递送效率，另外，对于这些文献的阳离子脂质，没有记载可以调整脂质膜结构体的pKa以外的効果。
另外，作为改进内体逃逸效率的方法，提高脂质膜结构体的膜融合能力也是一个手段(非专利文献5)。该文献中，作为一个内体逃逸能力的指标，对膜融合能力(溶血活性)进行了评价。记载了对构成脂质膜结构体的阳离子脂质的结构进行改变，膜融合能力发生变化，内体环境中膜融合能力对核酸递送效率产生影响。但是，没有记载具体怎样的结构能改进膜融合能力。
并且，还有在细胞内促进核酸从脂质膜结构体解离的实例(专利文献2及专利文献3)。这些文献中，记载了具有下述结构的阳离子脂质：包含1个或2个胺部分与1个脂质部分的化合物彼此通过显示可生物分解的二硫键连接的结构。根据这些参考文献，该阳离子脂质可以改善血液稳定性及肿瘤靶向性等体内动力学，并且可以通过改变胺位点周围的结构来改进作为脂质膜结构的pKa，将其调节至有利于内体逃逸的值，并且，利用二硫键在细胞中裂解，显示出具有将核酸从脂质膜结构解离的效果。实际上已知，与公知的阳离子脂质DOTAP和DODAP相比，显示出更高的核酸递送效率，因此阳离子脂质可以改进核酸向细胞质的递送效率提高等细胞内动力学。
如上所述，有多个关于摄取到细胞、内体逃逸以及促进核酸从载体上解离等改进核酸递送载体的细胞内动力学的报告。但是，无论这些本领域的技术的进展如何，通过使用了这些阳离子脂质的脂质膜结构体实现的向细胞的核酸递送效率尚未得到充分满足，需要进一步的改进。
背景技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2011-121966号公报
专利文献2：US2014/0335157A1
专利文献3：国际公开第2016/121942号
非专利文献
非专利文献1：Biomaterials 29(24-25):3477-96，2008
非专利文献2：Molecular Therapy 13(4):786-794，2006
非专利文献3：Molecular Therapy 24(4):788-795，2016
非专利文献4：Angewante Chemie International Edition 51:8529-8533，2012
非专利文献5：Proceedings of the National Academy of Science 110(32):12881-12886，2013
发明内容
发明所要解决的问题
本发明要解决的技术问题是实现现有技术无法实现的细胞内动力学的进一步改进，并且提供一种可以用作核酸递送载体的阳离子脂质、使用该阳离子脂质的脂质膜结构及使用有该阳离子脂质的核酸导入剂。
另外，本发明的主题是提供一种通过使用含有阳离子脂质的核酸导入剂来实现核酸导入的方法。
解决问题的技术方案
鉴于上述问题，本发明的发明人进行了深入研究的结果，本发明人发现了能够对影响内体逃逸效率的脂质膜结构的pKa进行调整，并且具有较高膜融合能力的阳离子脂质。具体而言，是具有如下结构的阳离子脂质：在脂质部位的附近导入芳香环，将它们与胺部分结合而得到的化合物通过二硫键连接。由于具有二硫键，因此还具有在细胞中切断二硫键，使核酸从脂质膜结构解离的效果。
发现含有这种新的阳离子脂质的脂质膜结构在核内体环境中具有较高的膜融合能力和较高的内体逃逸效率，因此可以有效地将核酸递送到细胞质中。
即，本发明包含以下的内容。
[1]一种阳离子脂质，其以式(1)表示，
[化学式1]
Figure BDA0002699986920000041
(式(1)中，
R1a及R1b各自独立地表示碳原子数为1～6的亚烷基，
Xa及Xb各自独立地表示：碳原子数为1～6、且叔胺基的数量为1的非环状烷基叔胺基，或碳原子数为2～5、且叔胺基的数量为1～2的环状亚烷基叔胺基，
R2a及R2b各自独立地表示碳原子数为8以下的亚烷基或氧二亚烷基，
Ya及Yb各自独立地表示酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键或脲键，
Za及Zb各自独立地表示碳原子数为3～16的芳香族化合物衍生的2价基团，所述芳香族化合物具有至少一个的芳香环，且可具有杂原子，
R3a及R3b各自独立地表示源自具有羟基的脂溶性维生素与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基，或源自具有羟基的甾醇衍生物与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基，或碳原子数为12～22的脂肪族烃基)(本说明书中，有时简称为“阳离子脂质(1)”)。
[2]根据[1]所述的阳离子脂质，其中，Za及Zb各自独立地为Z1：
[化学式2]
Figure BDA0002699986920000051
(式中，
s表示0～3的整数，
t表示0～3的整数，
u表示0～4的整数，
u个R4各自独立地表示取代基)。
[3]根据[2]所述的阳离子脂质，其中，s为0。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的阳离子脂质，其中，Xa及Xb各自独立地为环状亚烷基叔胺基，所述环状亚烷基叔胺基的碳原子数为2～5，且叔胺基的数量为1～2。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的阳离子脂质，其中，R3a及R3b各自独立地为：
源自具有羟基的脂溶性维生素与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基，或
碳原子数为12～22的脂肪族烃基。
[6]根据[5]所述的阳离子脂质，其中，R3a及R3b各自独立地为源自具有羟基的脂溶性维生素与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基。
[7]根据[5]所述的阳离子脂质，其中，R3a及R3b各自独立地为碳原子数12～22的脂肪族烃基。
[8]一种脂质膜结构体，其包含[1]～[7]中任一项所述的阳离子脂质作为膜的构成脂质。
[9]一种核酸导入剂，其含有[1]～[7]中任一项所述的阳离子脂质、或[8]所述的脂质膜结构体。
[10]一种将核酸导入细胞内的方法，其包括：在生物体外，使封装有所述核酸的[9]中所述的核酸导入剂与所述细胞接触。
[11]一种将核酸导入细胞内的方法，其包括：将封装有所述核酸的[9]中所述的核酸导入剂给药于活生物体，以使其向靶细胞递送。
发明的效果
本发明涉及一种含有具有叔氨基和芳香环的酯、脂质部分和作为可生物分解基团的二硫键的阳离子脂质以及具有其的脂质膜结构。本发明的阳离子脂质可以形成脂质膜结构，还可以制成包含该阳离子脂质的核酸导入剂。本发明的阳离子脂质可以调整影响阳离子脂质体内体逃逸效率的脂质膜结构体的pKa，并且在内体逃逸环境中的膜融合能力高，可以促进内体逃逸。并且，本发明的阳离子脂质中包含的二硫键在细胞内的还原环境中被切断，因此促进内包物(核酸)释放。因此，使用有本发明的阳离子脂质的核酸导入剂可以实现向细胞质内的高的核酸递送效率。
当使用本发明的阳离子脂质或包含其的脂质膜结构体进行核酸导入时，由于血清成分引起的核酸的分解受到抑制，因此，对于血清存在下的核酸导入，及在生物体内的核酸导入是有利的。
附图说明
图1是显示了由本发明的阳离子脂质(O-Ph-P4C2)制备的LNP的pH在7.4和5.5下的溶血活性(膜融合能力)的图。
图2是表示由本发明的阳离子脂质(O-Ph-P4C2及O-Bn-P4C2)与比较例1制备的各种LNP在pH5.5下的各种脂质浓度的溶血活性的图。
图3是表示由本发明的阳离子脂质(O-Ph-P4C1、O-Ph-P4C2)及比较例1制备的各种LNP在体外的基因表达活性的图。
图4是表示由本发明的阳离子脂质(O-Ph-P4C2及O-Bn-P4C2)及比较例1制备的各种LNP在体外的基因表达活性的图。
图5是表示由本发明的阳离子脂质(O-Ph-P4C2及O-Bn-P4C2)及比较例1制备的各种LNP及市售的基因导入试剂TransIT(注册商标)在体外的基因表达活性的图。
图6是表示由本发明的阳离子脂质(O-Ph-P4C2、O-Bn-P4C2)及比较例1制备的各种LNP在体外的FVII基因的敲低(knock-down)活性的图。
图7是表示由本发明的阳离子脂质(O-Ph-P4C2、E-Ph-P4C2、HD-Ph-P4C2、O-Ph-酰胺-P4C2)及比较例1制备的各种LNP在pH7.4及pH5.5下的溶血活性(膜融合能力)的图。
图8是表示由本发明的阳离子脂质(O-Ph-P4C2、L-Ph-P4C2、HD-Ph-P4C2、O-Ph-酰胺-P4C2)及比较例1制备的各种LNP在体外的基因表达活性的图。
图9是表示由本发明的阳离子脂质(O-Ph-P4C2)制备的LNP及基因导入试剂(Lipofectamine MessengerMAX)在体外的基因表达的总量的图。
图10是表示由本发明的阳离子脂质(O-Ph-P4C2)制备的LNP及基因导入试剂在体外的细胞基因表达的均匀性的图。
图11是表示由本发明的阳离子脂质(E-Ph-P4C2)及比较例2制备的各种LNP在体外(皮下)的基因表达活性的图。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明，但本发明并不限定于这些实施方式。
本发明提供由式(1)表示的阳离子脂质。
R1a及R1b各自独立地表示碳原子数为1～6的亚烷基，其可以为直链状，也可以具有支链，但优选为直链状。该亚烷基的碳原子数优选1～4，更优选1～2。作为碳原子数1～6的亚烷基，具体可列举：亚甲基、亚乙基、三亚甲基、亚异丙基、四亚甲基、亚异丁基、五亚甲基、新戊烯基等。R1a及R1b优选各自独立地为亚甲基、亚乙基、三亚甲基、亚异丙基或四亚甲基，最优选各自为亚乙基。
R1a与R1b可以相同也可以不同，优选R1a与R1b为相同的基。
Xa及Xb各自独立地表示碳原子数为1～6、且叔胺基的数量为1的非环状烷基叔胺基，或者碳原子数为2～5、且叔胺基的数量为1～2的环状亚烷基叔胺基，优选各自独立地表示碳原子数为2～5、且叔胺基的数量为1～2的环状亚烷基叔胺基。
碳原子数为1～6、且叔胺基的数量为1的非环状烷基叔胺基中的碳原子数1～6的烷基可以为直链状，也可以为支链状，还可以为环状。该烷基的碳原子数优选为1～3。作为碳原子数1～6的烷基，具体而言可列举：甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、1,2-二甲基丙基、2-甲基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、环己基，优选甲基、乙基、丙基或异丙基，最优选甲基。
碳原子数为1～6、且叔胺基的数量为1的非环状烷基叔胺基的优选具体的结构由X1表示。
[化学式3]
Figure BDA0002699986920000081
X1的R5表示碳原子数1～6的烷基，其可以是直链、支链或环状。该烷基的碳原子数优选为1～3。作为碳原子数1～6的烷基，具体可列举：甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、1,2-二甲基丙基、2-甲基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、环己基等，优选甲基、乙基、丙基或异丙基，最优选甲基。
碳原子数为2～5、且叔胺基的数量为1～2的环状亚烷基叔胺基中的碳原子数优选为4～5。作为碳原子数为2～5、且叔胺基的数量为1～2的环状亚烷基叔胺基，具体为亚氮丙啶基、亚氮杂环丁烷基、亚吡咯烷基、亚哌啶基、亚咪唑烷基、亚哌嗪基，优选亚吡咯烷基、亚哌啶基、亚哌嗪基，最优选亚哌啶基。
碳原子数为2～5、且叔胺基的数量为1的环状亚烷基叔胺基优选的具体的结构以X2表示。
[化学式4]
Figure BDA0002699986920000091
X2的p为1或2。p为1时X2为亚吡咯烷基，p为2时，X2为亚哌啶基。
碳原子数为2～5、且叔胺基的数量为2的环状亚烷基叔胺基的优选的具体的结构以X3表示。
[化学式5]
Figure BDA0002699986920000101
X3中w为1或2。w为1时X3为亚咪唑烷基，w为2时X3为亚哌嗪基。
Xa与Xb可以相同，也可以不同，优选Xa与Xb为相同的基团。
R2a及R2b各自独立地表示碳原子数为8以下的亚烷基或氧二亚烷基，优选各自独立地为碳原子数8以下的亚烷基。
碳原子数为8以下的亚烷基可以为直链状，也可以具有支链，优选直链状。该亚烷基中包含的碳原子数优选6以下，最优选4以下。作为碳原子数8以下的亚烷基，具体可列举：亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚异丙基、四亚甲基、亚异丁基、五亚甲基、六亚甲基、七亚甲基、八亚甲基等，优选亚甲基、亚乙基、亚丙基、四亚甲基、最优选亚乙基。
碳原子数为8以下的氧二亚烷基表示醚键介在的亚烷基(亚烷基-O-亚烷基)，2个存在的亚烷基的碳原子数的合计为8以下。在此，2个存在的亚烷基可以相同也可以不同，优选为相同。作为碳原子数8以下的氧二亚烷基，具体可列举：氧二亚甲基、氧二亚乙基、氧二亚丙基、氧二亚丁基等。优选氧二亚甲基、氧二亚乙基、氧二亚丙基，最优选氧二亚乙基。
R2a与R2b可以相同也可以不同，优选R2a与R2b为相同的基团。
Ya及Yb各自独立地为酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键或脲键，优选各自独立地为酯键、酰胺键或氨基甲酸酯键，更优选各自独立地为酯键或酰胺键，最优选各自为酯键。Ya及Yb的键的方向没有限制，在Ya及Yb为酯键的情况下，优选呈现-Za-CO-O-R2a-及-Zb-CO-O-R2b-的结构。
Ya与Yb可以相同也可以不同，优选Ya与Yb为相同的基团。
Za及Zb各自独立地表示碳原子数为3～16的芳香族化合物衍生的2价基团，所述芳香族化合物具有至少一个的芳香环，且可以具有杂原子。该芳香族化合物中包含的碳原子数优选为6～12，最优选为6～7。另外、该芳香族化合物中包含的芳香环优选为1个。
作为碳原子数3～16的芳香族化合物中包含的芳香环的种类，关于芳香族烃环可列举苯环、萘环、蒽环，关于芳香族杂环可列举：咪唑环、吡唑环、噁唑环、异噁唑环、噻唑环、异噻唑环、三嗪环、吡咯环、呋喃噻吩环、嘧啶环、哒嗪环、吡嗪环、吡啶环、嘌呤环、哌啶环、苯并咪唑环、吲哚环、苯并呋喃环、喹唑啉环，酞嗪环、喹啉环、异喹啉环、香豆素环、色酮环、苯并二氮杂环、苯噁嗪环、吩噻嗪环、吖啶环等，优选苯环，萘环，蒽环，最优选为苯环。
芳香环可以具有取代基，作为该取代基可列举：碳原子数2～4的酰基、碳原子数2～4的烷氧羰基、碳原子数2～4的氨基甲酰基、碳原子数2～4的酰氧基、碳原子数2～4的酰基氨基、碳原子数2～4的烷氧羰基氨基、氟原子、氯原子、溴原子、碘原子、碳原子数1～4的烷基硫基、碳原子数1～4的烷基磺酰基、碳原子数6～10的芳基磺酰基、硝基、三氟甲基、氰基、碳原子数1～4的烷基、碳原子数1～4的脲基、碳原子数1～4的烷氧基、碳6～10的芳基、碳原子数6～10的芳氧基等，作为优选例可列举：乙酰基、甲氧羰基、甲基氨基甲酰基、乙酰氧基、乙酰胺基、甲氧羰氨基、氟原子、氯原子、溴原子、碘原子、甲硫基、苯磺酰基、硝基、三氟甲基、氰基、甲基、乙基、丙基、异丙基、叔丁基、脲基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、叔丁氧基、苯基及苯氧基等。
作为Za及Zb的优选的具体结构可列举Z1。
[化学式6]
Figure BDA0002699986920000121
式中，s表示0～3的整数，t表示0～3的整数，u表示0～4的整数，u个R4各自独立地表示取代基。
Z1中s优选为0～1的整数，更优选为0。
Z1中t优选为0～2的整数，更优选为1。
Z1中u优选为0～2的整数，更优选为0～1的整数。
Z1中R4是不会抑制该阳离子脂质的合成过程中的反应，且碳原子数3～16的芳香族化合物中包含的芳香环(苯环)的取代基。作为该取代基，可列举：碳原子数2～4的酰基、碳原子数2～4的烷氧羰基、碳原子数2～4的氨基甲酰基、碳原子数2～4的酰氧基、碳原子数2～4的酰基氨基、碳原子数2～4的烷氧羰基氨基、氟原子、氯原子、溴原子、碘原子、碳原子数1～4的烷基硫基、碳原子数1～4的烷基磺酰基、碳原子数6～10的芳基磺酰基、硝基、三氟甲基、氰基、碳原子数1～4的烷基、碳原子数1～4的脲基、碳原子数1～4的烷氧基、碳6～10的芳基、碳原子数6～10的芳基氧基等，作为优选例可列举：乙酰基、甲氧羰基、甲基氨基甲酰基、乙酰氧基、乙酰胺基、甲氧羰氨基、氟原子、氯原子、溴原子、碘原子、甲基硫基、苯磺酰基、硝基、三氟甲基、氰基、甲基、乙基、丙基、异丙基、叔丁基、脲基、甲氧羰基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、叔丁氧、苯基及苯氧基等。存在多个R4的情况下，各R4可以相同，也可以不同。
Za与Zb可以相同，也可以不同，优选Za与Zb为相同的基团。
R3a及R3b各自独立地表示源自具有羟基的脂溶性维生素与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基，或表示源自具有羟基的甾醇衍生物与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基，或表示碳原子数为12～22的脂肪族烃基，优选各自独立地为源自具有羟基的脂溶性维生素与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基，或碳原子数12～22的脂肪族烃基，最优选各自独立地为碳原子数12～22的脂肪族烃基。
作为具有羟基的脂溶性维生素，可列举，例如：视黄醇、麦角甾醇、7-脱氢胆固醇、钙化醇、胆钙化醇、二氢麦角钙化醇、二氢速甾醇、生育酚、生育三烯酚等。具有羟基的脂溶性维生素优选为生育酚。
作为具有羟基的甾醇衍生物，可列举，例如：胆甾醇、胆甾烷醇、豆甾醇、β-谷甾醇、羊毛甾醇及麦角甾醇等，优选为胆甾醇、或胆甾烷醇。优选为胆甾醇或胆甾烷醇。
碳原子数12～22的脂肪族烃基可以为直链状，也可以具有支链。该脂肪族烃基可以为饱和的，也可以为不饱和的。在为不饱和脂肪族烃基的情况下，该脂肪族烃基中包含的不饱和键的数量通常为1～6个，优选为1～3个，更优选为1～2个。不饱和键包含碳-碳双键及碳-碳三键，但优选碳-碳双键。该脂肪族烃基中包含的碳原子数优选为13～19，最优选为13～17。脂肪族烃基中包含烷基、烯基、炔基等，优选包含烷基或烯基。作为碳原子数为12～22的脂肪族烃基，具体而言可列举：十二烷基，十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基、十二碳烯基、十三碳烯基、十四碳烯基、十五碳烯基、十六碳烯基、十七碳烯基、十八碳烯基、十九碳烯基、二十碳烯基、二十一碳烯基、二十二碳烯基、十二碳二烯基、十三碳二烯基、十四碳二烯基、十五碳二烯基、十六碳二烯基、十七碳二烯基、十八碳二烯基、十九碳二烯基、二十碳二烯基、二十一碳二烯基、二十二碳二烯基、十八碳三烯基、二十碳三烯基、二十碳四烯基、二十碳五烯基、二十二碳六烯基、异硬脂基、1-己基庚基、1-己基壬基、1-辛基壬基、1-辛基十一烷基、1-癸基十一烷基等。碳原子数12～22的脂肪族烃基优选为十三烷基、十五烷基、十七烷基、十九烷基、十七碳烯基、十七碳二烯基、1-己基壬基，特别优选为十三烷基、十七烷基、十七碳烯基、十七碳二烯基。
本发明的一个实施方式中，以R3a及R3b表示的碳原子数12～22的脂肪族烃基源自脂肪酸。该情况下，源自脂肪酸的羧基碳包含在式(1)的-CO-O-中。作为脂肪族烃基的具体例，在使用亚油酸作为脂肪酸的情况下，为十七碳二烯基，在使用油酸作为脂肪酸的情况下，为十七碳烯基。
R3a与R3b可以相同，也可以不同，优选R3a与R3b为相同的基团。
本发明的一个实施方式中，R1a与R1b相同，Xa与Xb相同，R2a与R2b相同，Ya与Yb相同，Za与Zb相同，R3a与R3b相同。
作为本发明中以式(1)表示的阳离子脂质的适当的例子，可列举以下的阳离子脂质。
[阳离子脂质(1-1)]
阳离子脂质(1)中，
R1a及R1b各自独立地为碳原子数1～6的亚烷基(例如，亚甲基、亚乙基)；
Xa及Xb各自独立地为碳原子数1～6、且叔胺基的数量为1的非环状烷基叔胺基(例如，-N(CH3)-)，或碳原子数为2～5、且叔胺基的数量为1～2的环状亚烷基叔胺基(例如，亚哌啶基)；
R2a及R2b各自独立地为碳原子数8为以下的亚烷基(例、亚甲基、亚乙基、亚丙基)；
Ya及Yb各自独立地为酯键或酰胺键；
Za及Zb各自独立地为碳原子数为3～16的芳香族化合物衍生的2价基团，所述芳香族化合物具有至少一个的芳香环，且可以具有杂原子(例如，-C6H4-CH2-、-CH2-C6H4-CH2-)；
R3a及R3b各自独立地为源自具有羟基的脂溶性维生素(例、生育酚)与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基，或碳原子数12～22的脂肪族烃基(例、十七碳烯基、十七碳烯二基、1-己基壬基)。
[阳离子脂质(1-2)]
阳离子脂质(1)中，
R1a及R1b各自独立地是碳原子数为1～4的亚烷基(例如，亚甲基、亚乙基)；
Xa及Xb各自独立地是碳原子数为1～3、且叔胺基的数量为1的非环状烷基叔胺基(例、-N(CH3)-)，或碳原子数为2～5、且叔胺基的数量为1的环状亚烷基叔胺基(例、亚哌啶基)；
R2a及R2b各自独立地是碳原子数6以下的亚烷基(例如，亚甲基、亚乙基、亚丙基)；
Ya及Yb各自独立地是酯键或酰胺键；
Za及Zb各自独立地是碳原子数为6～12、的芳香族化合物衍生的2价基团，所述芳香族化合物具有至少一个的芳香环，且可以具有杂原(例如，-C6H4-CH2-、-CH2-C6H4-CH2-)；
R3a及R3b各自独立地是源自具有羟基的脂溶性维生素(例、生育酚)与琥珀酸酐的反应物的残基，或碳原子数为13～19的脂肪族烃基(例、十七碳烯基、十七碳烯二基、1-己基壬基)。
[阳离子脂质(1-3)]
阳离子脂质(1)中，
R1a及R1b各自独立地是碳原子数为1～2的亚烷基(例如，亚甲基、亚乙基)；
Xa及Xb各自独立地为X1：
[化学式7]
Figure BDA0002699986920000151
(式中，R5是碳原子数1～3的烷基(例、甲基))，或X2：
[化学式8]
Figure BDA0002699986920000152
(式中，p为1或2)；
R2a及R2b各自独立地是碳原子数为4以下的亚烷基(例、亚甲基、亚乙基、亚丙基)；
Ya及Yb各自独立地为酯键或酰胺键；
Za及Zb各自独立地为Z1：
[化学式9]
Figure BDA0002699986920000161
(式中，s为0～1的整数、t为0～2的整数、u为0～2的整数(优选0)，u个R4各自独立地表示取代基)；
R3a及R3b各自独立地是源自具有羟基的脂溶性维生素(例、生育酚)与琥珀酸酐的反应物的残基，或碳原子数为13～17的脂肪族烃基(例、十七碳烯基、十七碳烯二基、1-己基壬基)。
作为本发明的阳离子脂质(1)的具体例，可列举下述的O-Ph-P3C1、O-Ph-P4C1、O-Ph-P4C2、O-Bn-P4C2、E-Ph-P4C2、L-Ph-P4C2、HD-Ph-P4C2、O-Ph-酰胺-P4C2、O-Ph-C3M。
[表1-1]
Figure BDA0002699986920000162
Figure BDA0002699986920000171
[表1-2]
Figure BDA0002699986920000172
接着，对本发明的阳离子脂质(1)的制备方法进行说明。
本发明的阳离子脂质(1)具有-S-S-(二硫)键。因此，作为制备方法，可列举：制备具有R3a-CO-O-Za-Ya-R2a-Xa-R1a-的SH(硫醇)化合物、及具有R3b-CO-O-Zb-Yb-R2b-Xb-R1b-的SH(硫醇)化合物，然后，将这些化合物氧化(偶联)而得到包含-S-S-键的本发明的阳离子脂质(1)的方法，由包含-S-S-键的化合物出发，依次合成必要的部分并最终获得本发明的化合物的方法等。优选为后一种方法。
将后一种方法的具体例列举如下，但制造方法并不限定于此。
作为起始化合物，可列举：包含-S-S-键的两末端羧酸、两末端胺、两末端异氰酸酯、两末端醇、具有甲磺酰基等离去基团的两末端醇、具有对硝基苯基碳酸酯基等离去基团的两末端碳酸酯等。
例如，制备阳离子脂质(1)的情况下，其中，R1a及R1b为相同的R1，Xa及Xb为相同的X，R2a及R2b为相同的R2，Ya及Yb为相同的Y，Za及Zb为相同的Z，且R3a及R3b为相同的R3，按照以下示出的合成路径能够得到作为目标的式(1’)的阳离子脂质物。
[化学式10]
Figure BDA0002699986920000181
使含有-S-S-键的化合物(I)中的两末端官能团(FG1)，与具有仲胺并在末端具有1个官能团(FG2)的化合物(II)中的仲胺发生反应，合成化合物(III)。使具有R3的化合物(IV)，与含有具有羟基并具有反应性官能团(FG3)的Z的化合物(V)中的羟基发生反应，合成化合物(VI)，最后，通过使化合物(VI)的反应性官能团(FG3)与化合物(III)的反应性官能团(FG2)发生反应，可以得到含有-S-S-键、R1、X、R2、Y、Z及R3的式(1’)的阳离子脂质。
上述的制备方法中，化合物(III)可以通过专利文献2或专利文献3中记载的方法制备。
化合物(IV)与化合物(V)的反应中，作为催化剂，可使用碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钾、三乙胺、4-二甲基氨基吡啶(以下称为“DMAP”)等碱催化剂，或者，可以在对甲苯磺酸或甲磺酸等酸催化剂的存在下进行，也可以在无催化剂下进行。
另外，使用二环己基碳二亚胺(以下称为“DCC”)、二异丙基碳二亚胺(以下称为“DIC”)，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(以下称为“EDC”)等缩合剂，使化合物(IV)与化合物(V)直接反应，或者，可以使用缩合剂将化合物(IV)转化酸酐等后再使其与化合物(V)进行反应。
化合物(IV)的投料量相对于化合物(V)通常为1～50mol当量，优选为1～10mol当量。
在化合物(IV)与化合物(V)的反应中使用的催化剂可根据待反应的化合物种类进行适当选择。
催化剂量相对于化合物(V)通常为0.05～100mol当量，优选为0.1～20mol当量，更优选为0.1～5mol当量。
作为在化合物(IV)与化合物(V)的反应中使用的溶剂，只要是不会抑制反应的溶剂即可，可以没有特别限制地使用。可列举，例如，水、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲苯等。这些中，优选氯仿、甲苯。
反应温度通常为0～150℃，优选0～80℃，更优选10～50℃。反应时间通常为1～48小时，优选为1～24小时。
通过上述反应得到的反应物(VI)可通过萃取纯化、重结晶、吸附纯化、再沉淀、柱色谱法、离子交换色谱法等常规的纯化法进行适当纯化。
使化合物(III)与化合物(VI)反应的情况下，如化合物(IV)与化合物(V)的反应那样，作为催化剂，可以使用碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钾、三乙基胺、4-二甲基氨基吡啶等碱催化剂，也可以在对甲苯磺酸、甲磺酸等酸催化剂、或无催化剂下进行。
另外，可以使用DCC、DIC、EDC等作为缩合剂，使化合物(III)与化合物(VI)直接反应，或者，可以使用缩合剂将化合物(VI)转化为酸酐等后再与化合物(III)进行反应。
化合物(VI)的投料量相对于化合物(III)，通常为1～50mol当量，优选为1～10mol当量。
在化合物(III)与化合物(VI)的反应中使用的催化剂，可以根据进行反应的化合物种类适当选择。
相对于化合物(III)，催化剂量通常为0.05～100mol当量，优选为0.1～20mol当量，更优选为0.1～5mol当量。
作为化合物(III)与化合物(VI)的反应中使用的溶剂，只要是不抑制反应的溶剂即可，可以没有特别制限地使用。可列举，例如，水、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲苯等。它们中，优选为氯仿、甲苯。
反应温度通常为0～150℃，优选为0～80℃，更优选为10～50℃。反应时间通常为1～48小时，优选1～24小时。
根据上述反应得到的本发明的阳离子脂质(1)可通过萃取纯化、重结晶、吸附纯化、再沉淀、柱色谱法、离子交换色谱法等的常规的纯化法进行适当纯化。
具体的实施例后述(实施例1～9)。本领域技术人员可适当地选择原料，根据本发明的说明书中实施例的方法进行反应，由此制备期望的阳离子脂质(1)。
接着，对本发明的脂质膜结构体进行说明。
本发明的脂质膜结构体是指含有本发明的阳离子脂质，即以上述通式(1)表示的阳离子脂质作为膜的构成物质的物质。这里，本发明的所述“脂质膜结构体”是指，具有两亲性脂质的亲水基团朝着界面的水相侧排列的膜结构的粒子。“两亲性脂质”是指具有显示亲水性的亲水性基团及显示疏水性的疏水性基团这两者的脂质。作为两亲性脂质，可列举例如：阳离子脂质、磷脂等。
本发明的脂质膜结构体的形态没有特别限定，但作为例如在水性溶剂中分散有本发明的阳离子脂质的形态，可列举脂质体(例如单层脂质体、多层脂质体等)、O/W型乳液、W/O型乳液、球状胶束、蠕虫状胶束、脂质纳米粒子(Lipid Nano Particle、以下称为“LNP”)、或不特定的层状结构体等。本发明的脂质膜结构体优选为脂质体。本发明的另一实施方式中优选为LNP。
本发明的脂质膜结构体除了本发明的阳离子脂质以外，还可以进一步含有其以外的其它构成成分。作为该其它构成成分，可列举例如：脂质(磷脂(磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱等)、糖脂、肽脂、胆甾醇、本发明的阳离子脂质以外的阳离子脂质、PEG脂质等)、表面活性剂(例如，3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]丙烷磺酸酯、胆酸钠盐、辛基葡糖苷、N-D-葡糖-N-甲基烷酰胺类等)、聚乙二醇、蛋白质等。本发明的脂质膜结构体中的该其它构成成分的含量通常为5～95mol％，优选为10～90mol％，更优选为30～80mol％。
本发明的脂质膜结构体中包含的本发明的阳离子脂质的含量没有特别限定，但通常，在将脂质膜结构体用作后述的核酸导入剂的情况下，可包含用于导入核酸的充分量的本发明的阳离子脂质。例如为总脂质的5～100mol％，优选为10～90mol％，更优选为20～70mol％。
本发明的脂质膜结构体可通过使本发明的阳离子脂质及其它构成成分(脂质等)分散在适当的溶剂或分散介质、例如水性溶剂、醇性溶剂中，并根据需要进行导向组装化的操作来制备。
作为“导向组装化的操作”，可列举例如：使用微流路或涡旋振荡的乙醇稀释法、单纯水合法、超声波处理、加热、涡旋振荡、醚注入法、法式压滤法、胆酸法、Ca2+融合法、冻融法、反相蒸发法等自身公知的方法，但并不限定于这些方法。
可以通过使核酸包封在包含本发明阳离子脂质的脂质膜结构体中，并使其与细胞接触，从而在生物体内和/或生物体外将该核酸导入该细胞内。因此，本发明提供包含上述本发明的阳离子脂质或脂质膜结构体的核酸导入剂。
本发明的核酸导入剂可以将任意的核酸导入细胞内。作为核酸的种类，可列举DNA、RNA、RNA的嵌合核酸、DNA/RNA的杂合体等，但并不限定于这些。另外，核酸可以使用1～3根链的任意核酸，但优选为单链或双链。核酸也可以是作为嘌呤或嘧啶碱基的N-葡糖苷的其它类型的核苷酸、或具有非核苷酸骨架的其它低聚物(例如，市售的肽核酸(PNA)等)、或具有特殊键的其它低聚物(需要说明的是，该低聚物含有存在于DNA、RNA中那样的碱基配对、具有容许碱基附着的构型的核苷酸)等。此外，该核酸还可以是例如：施加了公知的修饰的核酸、具有本领域已知的标记的核酸、带有帽的核酸、经过了甲基化的核酸、将1个以上天然核苷酸用类似物取代而成的核酸、经过了分子内核苷酸修饰的核酸、具有无电荷键(例如，甲基磺酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)的核酸、具有含电荷的键或含硫键(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的核酸、具有例如蛋白质(例如，核酸酶、核酸酶抑制剂、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)、糖(例如，单糖等)等侧链基团的核酸、具有插入性化合物(例如，吖啶、补骨脂等)的核酸、含有螯合化合物(例如，金属、具有放射活性的金属、硼、氧化性金属等)的核酸、含有烷基化剂的核酸、具有经过了修饰的键的核酸(例如，α-异构型核酸等)等。
能够在本发明中使用的DNA的种类没有特别限制，可根据使用目的而适当选择。可列举例如质粒DNA、cDNA、反义DNA、染色体DNA、PAC、BAC、CpG寡聚核苷酸等，优选为质粒DNA、cDNA、反义DNA，更优选为质粒DNA。质粒DNA等环状DNA可通过限制性内切酶等被消化，也可以用作线性DNA。
能够在本发明中使用的RNA的种类没有特别限制，可根据使用目的而适当选择。可列举例如：siRNA、miRNA、shRNA、反义RNA、信使RNA(mRNA)、单链RNA基因组、双链RNA基因组、RNA复制子、转运RNA、核糖体RNA等，优选为siRNA、miRNA、shRNA、mRNA、反义RNA、RNA复制子。
对于本发明中使用的核酸，优选利用本领域技术人员通常使用的方法进行纯化。
包封有核酸的本发明的核酸导入剂可以例如将疾病的预防和/或治疗作为目标进行生物体内(in vivo)给药。因此，本发明中使用的核酸优选为相对于某些指定的疾病具有预防和/或治疗活性(预防/治疗用核酸)的核酸。作为如上所述的核酸，可列举，例如，所谓的基因治疗中使用的核酸等。
为了使用本发明的核酸导入剂将核酸导入细胞内，在形成本发明的脂质膜结构体时，通过使目标的核酸共存而形成包封有该核酸的本发明的脂质膜结构体。例如，在利用乙醇稀释法形成脂质体的情况下，在将核酸的水溶液和本发明的脂质膜结构体的构成成分(脂质等)的乙醇溶液通过涡旋振荡或微流路等剧烈地进行混合之后，利用适当的缓冲液对混合物进行稀释。在利用单纯水合法形成脂质体的情况下，将本发明的脂质膜结构体的构成成分(脂质等)溶解在适当的有机溶剂中，并将该溶液加入玻璃容器，通过进行减压干燥而将溶剂蒸馏除去，从而得到脂质薄膜。在向其中加入核酸的水溶液并使其发生水合之后，利用Sonicator进行超声波处理。本发明还提供这样的包封有核酸的上述脂质膜结构体。
作为包封有核酸的脂质体的实施方式之一，可列举通过形成核酸与阳离子脂质之间的静电复合体而进行了核酸封入的LNP。该LNP可作为用于将核酸等选择性地递送到特定的细胞内的药物递送系统使用，可用于例如基于向树突细胞的抗原基因转染的DNA疫苗、肿瘤的基因治疗剂及利用RNA干涉的抑制目标基因的表达的核酸医药品等。
包封有核酸的本发明的脂质膜结构体的粒径优选为10nm～500nm、更优选为30nm～300nm。粒径的测定可使用Zetasizer Nano(Malvern公司)进行。脂质膜结构体的粒径可通过脂质膜结构体的制备方法而适当调整。
包封有核酸的本发明的脂质膜结构体的表面电位(Zeta电位)优选为-15～+15mV、进一步优选为-10～+10mV。在以往的基因转染中，主要使用的是带正的表面电位的粒子。这作为用于促进具有负电荷的细胞表面与硫酸肝素之间的静电相互作用、从而促进向细胞的摄取的方法是有用的，但正的表面电荷存在会在细胞内与递送核酸之间的相互作用而抑制核酸从载体的释放、或因mRNA与递送核酸之间的相互作用而抑制蛋白质合成的可能性。通过将表面电荷调整至上述范围内，可以解决该问题。表面电荷的测定可使用ZetasizerNano等Zeta电位测定装置进行。脂质膜结构体的表面电荷可根据包含本发明的阳离子脂质的脂质膜结构体的构成成分的组成而进行调整。
本发明的脂质膜结构体的脂质膜表面pKa(以下称为Liposomal pKa)，没有特别制限，优选pKa为5.5～7.2，进一步优选pKa为6.0～6.8。Liposomal pKa被作为显示通过内吞作用而摄入的脂质膜结构体在内体的弱酸性环境下，脂质膜结构体容易受到质子化的指标。如非专利文献3及非专利文献4的记载，从内体逃逸并将核酸递送到细胞质内，将Liposomal pKa设为对于内体逃逸而言为优选值是重要的，通过调整为上述的范围，可以有效地进行核酸向细胞质内的递送。Liposomal pKa可以根据含有本发明的阳离子脂质的脂质膜结构体的构成成分的组成进行调整。
本发明的脂质膜结构体的溶血活性(膜融合能力)没有特别限定，优选在生理pH(pH7.4)下不具有溶血活性(小于5％)，在内体的弱酸性环境下(pH5.5)具有活性。如非专利文献5中记载的那样，溶血是用于使通过内吞作用摄入的脂质膜结构体从内体逃逸的手段之一。溶血活性较高的可以有效地将核酸递送至细胞质内，但在生理pH中具有溶血活性的情况下，在血中滞留期间会将核酸递送到非意向细胞中，导致目标指向性的降低及毒性。因此，如上所述，优选仅在内体环境中具有溶血活性。溶血活性可以通过含有本发明的阳离子脂质的脂质膜结构体的构成成分的组成进行调整。
通过使包封有核酸的本发明的脂质膜结构体与细胞接触，可以将包封的核酸导入细胞内。该“细胞”的种类没有特别限定，可使用原核生物及真核生物的细胞，但优选为真核生物。真核生物的种类没有特别限定，可列举例如：包括人类的哺乳类(例如，人、猴、小鼠、大鼠、仓鼠、牛等)、鸟类(例如，鸡、鸵鸟等)、两栖类(例如，蛙等)、鱼类(例如，斑马鱼、青鳉鱼等)等脊椎动物、昆虫(蚕、蛾、果蝇等)等无脊椎动物、植物、微生物(例如，酵母等)等。在本发明中成为对象的细胞更优选为动物或植物细胞、进一步优选为哺乳动物细胞。该细胞可以是包含癌细胞的培养细胞系，也可以是从个体、组织中分离出的细胞、或组织或组织片的细胞。另外，细胞可以是贴壁细胞，也可以是非贴壁细胞。
以下，对使包封有核酸的本发明的脂质膜结构体与细胞在生物体外(in vitro)接触的工序进行具体说明。
对于细胞，可以在使其与该脂质膜结构体接触的数日前悬浮在适当的培养基中，并在适当的条件下进行培养。在与脂质膜结构体接触时，细胞可以是在增殖期，也可以不是在增殖期。
该接触时的培养液可以是含血清的培养基也可以是不含血清的培养基，但培养基中的血清浓度优选为30重量％以下、更优选为20重量％以下。培养基中包含过量的血清等蛋白质时，存在抑制该脂质膜结构体与细胞的接触的可能性。
该接触时的细胞密度没有特殊限定，可考虑细胞的种类等而适当设定，但通常在1×104～1×107细胞/mL的范围。
在这样制备的细胞中，添加例如上述包封有核酸的本发明的脂质膜结构体的悬浮液。该悬浮液的添加量没有特殊限定，可考虑到细胞数等而适当设定。就与细胞接触时的脂质膜结构体的浓度而言，只要能够实现目标核酸向细胞内的导入则没有特殊限定，但以脂质浓度计，通常为1～100nmol/mL、优选为10～50nmol/mL，作为核酸的浓度，通常为0.01～100μg/mL、优选为0.1～10μg/mL。
将上述悬浮液添加至细胞后，对该细胞进行培养。培养时的温度、湿度、CO2浓度等可考虑到细胞的种类而适当设定。细胞为源自哺乳动物的细胞的情况下，通常，温度约为37℃、湿度约为95％、CO2浓度约为5％。另外，培养时间也可以考虑到所使用的细胞的种类等条件而适当设定，但通常为0.1～76小时的范围、优选为0.2～24小时的范围、更优选为0.5～12小时的范围。上述培养小时如果过短，则可能导致核酸无法充分导入细胞内，培养小时如果过长，则可能导致细胞变弱。
通过上述培养，核酸被导入细胞内，但优选将培养基交换为新鲜的培养基、或向培养基中添加新鲜的培养基而进一步继续培养。细胞为源自哺乳动物的细胞的情况下，新鲜的培养基优选包含血清或营养因子。
另外，通过如上所述地使用本发明的脂质膜结构体，不仅在生物体外(in vitro)、在生物体内(in vivo)也能够将核酸导入细胞内。即，通过将包封有核酸的本发明的脂质膜结构体向对象给药，可使该脂质膜结构体到达并接触靶细胞，从而在生物体内将包封在该脂质膜结构体中的核酸导入细胞内。作为能够给药该脂质膜结构体的对象，没有特殊限定，可列举例如：哺乳类(例如，人、猴、小鼠、大鼠、仓鼠、牛等)、鸟类(例如，鸡、鸵鸟等)、两栖类(例如，蛙等)、鱼类(例如，斑马鱼、青鳉鱼(rice-fish)等)等脊椎动物、昆虫(例如，蚕、蛾、果蝇等)等无脊椎动物、植物等。作为本发明的脂质膜结构体的给药对象，优选为人或其它哺乳动物。
靶细胞的种类没有特殊限定，通过使用本发明的脂质膜结构体，可以向各种组织(例如，肝脏、肾脏、胰脏、肺、脾脏、心脏、血液、肌肉、骨、脑、胃、小肠、大肠、皮肤、脂肪组织、淋巴结、肿瘤等)中的细胞导入核酸。
向导入有核酸和/或核酸以外的化合物的质膜结构体的对象(例如、脊椎动物、无脊椎动物等)的给药方法，只要是能够使该脂质膜结构体到达并接触靶细胞，从而将导入至该脂质膜结构体的化合物导入细胞内的方法即可，没有特殊限定，可考虑导入化合物的种类、靶细胞的种类、部位等而适当选择本身公知的给药方法(例如，口服给药、非口服给药(例如，静脉内给药、肌内给药、局部给药、经皮给药、皮下给药、腹腔内给药、喷雾等)等)。该脂质膜结构体的给药量只要在能够实现化合物向细胞内的导入的范围即可，没有特殊限定，可考虑到给药对象的种类、给药方法、导入化合物的种类、靶细胞的种类、部位等而适当选择。
将本发明的阳离子脂质或脂质膜结构体作为核酸导入剂使用的情况下，可以按照常规方法进行制药。
提供该核酸导入剂作为研究用试剂的情况下，就该本发明的核酸导入剂而言，可以直接提供本发明的脂质膜结构体，或使用与例如水或除水以外的生理学上可接受的液体(例如，水溶性溶剂(例如，苹果酸缓冲液等)、有机溶剂(例如，乙醇、甲醇、DMSO、叔丁醇等)或水溶性溶剂与有机溶剂的混合液等)形成的无菌性溶液或悬浮液而提供本发明的脂质膜结构体。本发明的核酸导入剂可适当地包含本身公知的生理学上可接受的添加剂(例如，赋形剂、媒介物(vehicle)、防腐剂、稳定剂、结合剂等)。
另外，将该核酸导入剂作为药物提供的情况下，该本发明的核酸导入剂可以直接使用本发明的脂质膜结构体，或通过将本发明的脂质膜结构体与药学上可接受的公知添加剂(例如，担载体、香味剂、赋形剂、媒介物、防腐剂、稳定剂、结合剂等)一起使用并将它们以常规认可的制药实施所要求的单位用量形式进行混和而以口服剂(例如，片剂、胶囊剂等)或非口服剂(例如注射剂、喷雾剂等)的形式制造，优选以非口服剂(更优选为注射剂)的形式制造。
本发明的核酸导入剂除了可用于成人以外，还可以作为儿科用制剂。
本发明的核酸导入剂也可以以试剂盒的形式提供。该试剂盒中除了本发明的阳离子脂质或脂质膜结构体以外，还可以包含在导入核酸时使用的试剂。在一个实施方式中，本发明的核酸导入剂(或试剂盒)进一步包含聚阳离子(例如，鱼精蛋白)。通过使用该实施方式的本发明的核酸导入剂(或试剂盒)，可以容易地将核酸与聚阳离子(例如，鱼精蛋白)间的静电复合体封入本发明的脂质膜结构体，从而用于将核酸供给至细胞内。
实施例
以下，针对本发明的实施例进行更为详细的说明，但本发明完全不受到该实施例的限定。
在实施例的说明中使用的简称的含义分别如下所述。
siRNA：小干扰RNA
mRNA：信使RNA
Chol：胆甾醇
DMG-PEG2k：1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇(PEG MW 2000)
DSG-PEG5k：1,2二硬脂酰基-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇(PEG MW 5000)
DOPE：1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺
DOPC：1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱
PBS：磷酸缓冲生理盐水
MES：2-吗啉乙磺酸
TNS：6-(对甲苯基)-2-萘磺酸钠
表1中示出了在下述实施例及比较例中制造的阳离子脂质的名称和结构。比较例1及2分别是基于专利文献2的制备方法而制造的。
[表2-1]
Figure BDA0002699986920000281
Figure BDA0002699986920000291
[表2-2]
Figure BDA0002699986920000292
[实施例1]O-Ph-P3C1的合成
O-Ph-P3C1通过式(2)的方法而制备，制备并不限定于该方法。
式(2)
[化学式11]
Figure BDA0002699986920000301
<油酸的酸酐化>
将油酸(日油公司制造)70.0g(248mmol)在室温下以氯仿560g溶解，进行冷却直到10-15℃。这里，将DCC(大阪合成有机化学研究所制造)25.1g(121mmol)以氯仿140g溶解并得到悬浊液，通过滴加加入得到的悬浊液，在10-25℃下反应2小时。过滤反应溶液后，通过蒸发器对滤液进行浓缩。将得到的浓缩物再溶解在己烷210g中，将不溶物通过过滤而除去。将得到的滤液通过蒸发器浓缩，得到油酸酐64.2g。
油酸酐的1H-NMR谱(600MHz、CDCl3)
δ0.86-0.90ppm(t、6H)、δ1.25-1.40ppm(m、40H)、δ1.61-1.68(m、4H)、δ1.94-2.05(m、8H)、δ2.39-2.46(t、4H)、δ5.30-5.38(m、4H)
<4-油酰氧苯乙酸的合成>
将油酸酐43.1g(78.9mmol)及4-羟基苯乙酸(东京化成工业公司制造)6.00g(39.4mmol)溶解在氯仿647g中。然后加入DMAP(广荣化学公司制造)1.93g(15.8mmol)，在室温下反应9小时反应。将反应溶液用10％乙酸水溶液216g清洗2次，用离子交换水216g清洗2次，然后向有机层加入硫酸镁(关东化学公司制造)12.9g，搅拌30分钟。过滤硫酸镁后，通过蒸发器对滤液进行浓缩。将浓缩物通过己烷284g进行再溶解，过滤不溶物后，进行6次使用乙腈168g的萃取。回收乙腈层，通过蒸发器进行浓缩，由此得到18.1g的粗体。对得到的粗体14.5g进行柱纯化，由此得到4-油酰氧苯乙酸3.66g。
4-油酰氧苯乙酸的1H-NMR谱(600MHz、CDCl3)
δ0.77-0.89(t、3H)、δ1.27-1.42(m、20H)、δ1.71-1.77(m、2H)、δ1.99-2.03(m、4H)、δ2.52-2.56(m、2H)、δ3.64(s、2H)、δ5.32-5.38(m、2H)、δ7.03-7.06(m、2H)、δ7.28-7.31(m、2H)
<O-Ph-P3C1的合成>
将通过专利文献2中记载的方法合成的双{2-[3-(羟基甲基)吡啶]乙基}二硫化物(di-3PM体)0.340g(0.975mmol)、4-油酰氧苯乙酸0.813g(1.95mmol)及DMAP 0.0477g(0.390mmol)在室温下溶解于氯仿10.2g。然后加入EDC(东京化成工业公司制造)0.561g(2.93mmol)，并在30-35℃下反应3小时。将反应溶液用20％食盐水6.80g清洗2次后，使用硫酸镁0.340g进行脱水。对硫酸镁进行过滤過后，通过蒸发器对滤液进行浓缩，得到0.870g的粗体。对得到的粗体进行柱纯化，由此得到0.584g的O-Ph-P3C1。
O-Ph-P3C1的1H-NMR谱(600MHz、CDCl3)
δ0.86-0.90(t、6H)、δ0.92-1.05(m、2H)、δ1.20-1.42(m、40H)、δ1.50-1.60(m、2H)、δ1.62-1.80(m、10H)、δ1.90-2.04(m、12H)、δ2.52-2.56(m、4H)、δ2.61-2.65(m、4H)、δ2.78-2.82(m、8H)、δ3.61(s、4H)、δ3.89-4.02(m、4H)、δ5.34-5.37(m、4H)、δ7.02-7.05(m、4H)、δ7.26-7.30(m、4H)
[实施例2]O-Ph-P4C1的合成
O-Ph-P4C1通过与实施例1同样的合成路径合成。
将通过专利文献2中记载的方法合成的双{2-[4-(羟基甲基)吡啶]乙基}二硫化物(di-4PM体)0.340g(0.975mmol)、4-油酰氧苯乙酸0.853g(2.05mmol)及DMAP 0.0477g(0.390mmol)在室温下溶解于氯仿10.2g。然后添加EDC 0.561g(2.93mmol)，在30-35℃反应3小时反应。通过6.80g的20％食盐水对反应溶液进行2次清洗后，使用硫酸镁0.340g进行脱水。对硫酸镁进行过滤后，通过蒸发器对滤液进行浓缩得到0.900g的粗体。对得到的粗体进行柱纯化，由此得到0.629g的O-Ph-P4C1。
O-Ph-P4C1的1H-NMR谱(600MHz、CDCl3)
δ0.86-0.90(t、6H)、δ1.27-1.42(m、44H)、δ1.62-1.76(m、10H)、δ1.96-2.00(m、12H)、δ2.52-2.56(m、4H)、δ2.64-2.67(m、4H)、δ2.81-2.93(m、8H)、δ3.60(s、4H)、δ3.93-3.95(d、4H)、δ5.34-5.37(m、4H)、δ7.02-7.05(m、4H)、δ7.26-7.30(m、4H)
[实施例3]O-Ph-P4C2的合成
O-Ph-P4C2通过与实施例1同样的合成路径合成。
将通过专利文献2中记载的方法合成得到的双{2-[4-(2-羟基乙基)吡啶]乙基}二硫化物(di-4PE体)0.350g(0.929mmol)、4-油酰氧苯乙酸0.813g(1.95mmol)及DMAP 0.0454g(0.372mmol)在室温下溶解在氯仿10.5g中。然后加入EDC 0.534g(2.79mmol)，在30-35℃下反应4小时。通过7.00g的20％食盐水对反应溶液进行2次清洗后，使用硫酸镁0.350g进行脱水。对硫酸镁进行过滤后，通过蒸发器对滤液进行浓缩，得到1.10g的粗体。对得到的粗体进行柱纯化，由此得到0.722g O-Ph-P4C2。
O-Ph-P4C2的1H-NMR谱(600MHz、CDCl3)
δ0.86-0.90(t、6H)、δ1.22-1.42(m、46H)、δ1.54-1.76(m、12H)、δ1.94-2.03(m、12H)、δ2.52-2.56(m、4H)、δ2.62-2.66(m、4H)、δ2.80-2.89(m、8H)、δ3.59(s、4H)、δ4.11-4.14(t、4H)、δ5.34-5.37(m、4H)、δ7.02-7.05(m、4H)、δ7.26-7.30(m、4H)
[实施例4]O-Bn-P4C2
O-Bn-P4C2通过与实施例1同样的合成路径合成。
<4-(油酰氧甲基)苯乙酸的合成>
将油酸酐13.2g(24.1mmol)及4-(羟基甲基)苯乙酸(东京化成工业公司制造)2.01g(12.1mmol)溶剂在氯仿198g中。然后加入DMAP 0.590g(4.83mmol)，在室温下进行7小时的反应。通过10％乙酸水溶液66g对反应溶液进行2次清洗，通过离子交换水66g进行2次清洗，然后，将硫酸镁(关东化学公司制造)4.00g加入至有机层，搅拌30分钟。对硫酸镁进行过滤后，通过蒸发器对滤液进行浓缩。使用己烷87.0g对浓缩物进行再溶解，对不溶物进行过滤后，使用乙腈51.5g进行6次萃取。回收乙腈层，通过蒸发器进行浓缩，得到7.47g的粗体。对得到的粗体5.98g进行柱纯化，由此得到1.03g的4-(油酰氧甲基)苯乙酸。
4-(油酰氧甲基)苯乙酸的1H-NMR谱(600MHz、CDCl3)
δ0.86-0.89(t、3H)、δ1.15-1.37(m、20H)、δ1.60-1.66(m、2H)、δ1.98-2.04(m、4H)、δ2.32-2.36(m、2H)、δ3.66(s、2H)、δ5.09(s、2H)、δ5.31-5.38(m、2H)、δ7.25-7.29(m、2H)、δ7.31-7.44(m、2H)
<O-Bn-P4C2的合成>
将di-4PE体0.250g(0.664mmol)、4-(油酰氧甲基)苯乙酸0.600g(1.39mmol)及DMAP0.0324g(0.266mmol)在室温下溶解在氯仿7.5g中。然后加入EDC 0.382g(1.99mmol)，在30-35℃下进行4小时反应。通过20％食盐水5.00g对反应溶液进行2次清洗后，使用硫酸镁0.250g进行脱水。对硫酸镁进行过滤后，通过蒸发器对滤液进行浓缩，得到0.823g的粗体。对得到的粗体进行柱纯化，由此得到0.463g的O-Bn-P4C2。
O-Bn-P4C2的1H-NMR谱(600MHz、CDCl3)
δ0.86-0.89(t、6H)、δ1.20-1.30(m、46H)、δ1.50-1.65(m、12H)、δ1.92-2.03(m、12H)、δ2.32-2.36(t、4H)、δ2.62-2.65(m、4H)、δ2.80-2.90(m、8H)、δ3.61(s、4H)、δ4.11-4.14(t、4H)、δ5.09(s、4H)、δ5.31-5.38(m、4H)、δ7.26-7.28(m、4H)、δ7.30-7.32(m、4H)
[实施例5]E-Ph-P4C2
E-Ph-P4C2通过与实施例1同样的合成路径合成。
<琥珀酸D-α-生育酚的酸酐化>
将琥珀酸D-α-生育酚(SIGMA-ALDRICH制造)70.0g(132mmol)在室温下溶解在氯仿560g中，冷却至10-15℃。这里，将DCC(大阪合成有机化学研究所公司制造)13.7g(66mmol)溶解在氯仿140g而得到悬浊液，并通过滴加而添加，在10-25℃下进行2小时的反应。对反应溶液进行过滤后，通过蒸发器对滤液进行浓缩。将得到的浓缩物再溶解于己烷210g中，通过过滤除去不溶物。通过蒸发器对滤液进行浓缩，得到64.2g的无水琥珀酸D-α-生育酚。
无水琥珀酸D-α-生育酚的1H-NMR谱(600MHz、CDCl3)
δ0.84-0.87ppm(m、24H)、δ1.02-1.85ppm(m、52H)、δ1.96(s、6H)、δ2.01(s、6H)、δ2.08(s、6H)、δ2.56-2.59(t、4H)、δ2.90-2.95(m、8H)
<4-(D-α-生育酚半琥珀酰基)苯乙酸的合成>
将D-α-琥珀酸酐生育酚43.1g(41.3mmol)及4-羟基苯乙酸(东京化成工业公司制造)3.13g(20.6mmol)溶解在氯仿647g中。然后添加DMAP(广荣化学公司制造)1.01g(8.26mmol)，在室温下进行9小时的反应。将反应溶液通过10％乙酸水溶液216g进行2次清洗，通过离子交换水216g进行2次清洗，然后，将硫酸镁(关东化学公司制造)12.9g加入至有机层，搅拌30分钟。对硫酸镁进行过滤后，通过蒸发器对滤液进行浓缩。浓缩物通过己烷284g进行再溶解，对不溶物进行过滤后，使用乙腈168g进行萃取6次。回收乙腈层，通过蒸发器进行浓缩，得到17.0g的粗体。对得到的粗体13.6g进行柱纯化，由此得到3.44g的4-(D-α-生育酚半琥珀酰基)苯乙酸。
4-(D-α-生育酚半琥珀酰基)苯乙酸的1H-NMR谱(600MHz、CDCl3)
δ0.83-0.87ppm(m、12H)、δ1.02-1.85ppm(m、26H)、δ1.96ppm(s、3H)、δ2.01ppm(s、3H)、δ2.08ppm(s、3H)、δ2.56-2.59ppm(t、2H)、δ2.71-2.76ppm(m、2H)、δ2.92-2.96ppm(m、2H)、δ3.66ppm(s、2H)、δ7.05-7.08ppm(m、2H)、δ7.27-7.31ppm(m、2H)
<E-Ph-P4C2的合成>
将di-4PE体0.350g(0.929mmol)、4-(D-α-生育酚半琥珀酰基)苯乙酸1.04g(1.95mmol)及DMAP 0.0454g(0.372mmol)在室温下溶解在氯仿10.5g中。然后加入EDC 0.534g(2.79mmol)，在30-35℃下进行4小时反应。通过20％食盐水7.00g对反应溶液进行2次清洗后，使用硫酸镁0.350进行脱水。对硫酸镁进行过滤后，通过蒸发器对滤液进行浓缩，得到1.31g的粗体。对得到的粗体进行柱纯化，由此得到0.860g的E-Ph-P4C2。
E-Ph-P4C2的1H-NMR谱(600MHz、CDCl3)
δ0.83-0.87ppm(m、24H)、δ1.02-1.85ppm(m、66H)、δ1.94-1.98ppm(m、10H)、δ2.00ppm(s、6H)、δ2.08ppm(s、6H)、δ2.53-2.66ppm(m、8H)、δ2.71-2.85ppm(m、8H)、δ2.85-2.95ppm(m、8H)、δ3.65ppm(s、4H)、δ4.11-4.14ppm(t、4H)、δ7.05-7.08ppm(m、2H)、δ7.27-7.31ppm(m、2H)
[实施例6]L-Ph-P4C2
L-Ph-P4C2通过与实施例1同样的合成路径合成。
<亚油酸的酸酐化>
将亚油酸(日油公司制造)69.6g(248mmol)在室温下溶解在氯仿560g中，冷却至10-15℃。然后，将DCC25.1g(121mmol)溶解在氯仿140g中得到悬浊液，并通过滴加而添加，在10-25℃下进行2小时反应。反应溶液过滤后，通过蒸发器对滤液进行浓缩。将得到的浓缩物再溶解于己烷210g，通过过滤除去不溶物。通过蒸发器对滤液进行浓缩，得到63.8g的亚油酸酐。
亚油酸酐的1H-NMR谱(600MHz、CDCl3)
δ0.86-0.90ppm(t、6H)、δ1.25-1.40ppm(m、32H)、δ1.61-1.68(m、4H)、δ1.94-2.05(m、8H)、δ2.39-2.46(t、4H)、δ5.30-5.38(m、8H)
<4-亚油酰氧苯乙酸的合成>
将亚油酸酐42.8g(78.9mmol)及4-羟基苯乙酸6.00g(39.4mmol)溶解在氯仿647g中。然后添加DMAP 1.93g(15.8mmol)，在15-20℃下进行9小时的反应。将反应溶液通过10％乙酸水溶液216g清洗2次，通过离子交换水216g清洗2次，然后将硫酸镁12.9g添加至有机层，搅拌30分钟。对硫酸镁进行过滤后，通过蒸发器对滤液进行浓缩。将浓缩物通过己烷284g进行再溶解，对不溶物进行过滤后，使用乙腈168g进行6次萃取。回收乙腈层，通过蒸发器进行浓缩，得到18.1g的粗体。对得到的粗体14.5g进行柱纯化，由此得到3.66g的4-亚油酰氧苯乙酸。
4-亚油酰氧苯乙酸的1H-NMR谱(600MHz、CDCl3)
δ0.77-0.89(t、3H)、δ1.27-1.42(m、4H)、δ1.71-1.77(m、2H)、δ1.99-2.03(m、4H)、δ2.52-2.56(m、2H)、δ3.64(s、2H)、δ5.34-5.39(m、4H)、δ7.03-7.06(m、2H)、δ7.28-7.31(m、2H)
<L-Ph-P4C2的合成>
将di-4PE体0.350g(0.929mmol)、4-亚麻酰氧苯乙酸0.808g(1.95mmol)及DMAP0.0454g(0.372mmol)在室温下溶解在氯仿10.5g中。然后加入EDC 0.534g(2.79mmol)，在30-35℃下进行4小时的反应。通过20％食盐水7.00g将反应溶液清洗2次后，使用硫酸镁0.350g进行脱水。对硫酸镁进行过滤后，通过蒸发器对滤液进行浓缩，得到1.02g的粗体。对得到的粗体进行柱纯化，由此得到0.668g的L-Ph-P4C2。
L-Ph-P4C2的1H-NMR谱(600MHz、CDCl3)
δ0.87-0.90(t、6H)、δ1.24-1.41(m、38H)、δ1.55-1.76(m、12H)、δ1.93-2.07(m、12H)、δ2.53-2.56(m、4H)、δ2.63-2.65(m、4H)、δ2.77-2.89(m、8H)、δ3.59(s、4H)、δ4.11-4.13(t、4H)、δ5.34-5.39(m、8H)、δ7.02-7.05(m、4H)、δ7.26-7.30(m、4H)
[实施例7]HD-Ph-P4C2
HD-Ph-P4C2通过与实施例1同样的合成路径合成。
<2-己基癸酸的酸酐化>
将2-己基癸酸(东京化成工业公司制造)6.36g(24.8mmol)在室温下溶解在氯仿56g中，冷却至10-15℃。然后，将DCC 2.51g(12.1mmol)溶解在氯仿14g中得到悬浊液，并通过滴加而添加，在10-25℃下进行2小时的反应。反应溶液过滤后，通过蒸发器对滤液进行浓缩。使得到的浓缩物再溶解于己烷21g中，不溶物通过过滤除去。通过蒸发器对得到的滤液进行浓缩，得到5.83g的2-己基癸酸酐。
2-己基癸酸酐的1H-NMR谱(600MHz、CDCl3)
δ0.86-0.90ppm(m、12H)、δ1.25-1.40ppm(m、40H)、δ1.61-1.68(m、8H)、δ2.39-2.46(m、2H)
<2-己基癸酰氧苯乙酸的合成>
将2-己基癸酸酐3.90g(7.89mmol)及4-羟基苯乙酸0.600g(3.94mmol)溶解在氯仿65g中。然后，加入DMAP 0.193g(1.58mmol)，在室温下进行9小时反应。将反应溶液通过10％乙酸水溶液22g清洗2次，通过离子交换水22g清洗2次后，将硫酸镁1.5g加入至有机层，搅拌30分钟。对硫酸镁进行过滤后，通过蒸发器对滤液进行浓缩。通过己烷28g对浓缩物进行再溶解，对不溶物进行过滤后，使用乙腈17g进行6次萃取。回收乙腈层，通过蒸发器进行浓缩，得到1.64g的粗体。对得到的粗体1.32g进行柱纯化，得到0.333g的2-己基癸酰氧苯乙酸。
2-己基癸酰氧苯乙酸的1H-NMR谱(600MHz、CDCl3)
δ0.77-0.89(t、6H)、δ1.27-1.42(m、20H)、δ1.71-1.77(m、4H)、δ2.52-2.56(m、2H)、δ3.64(s、2H)、δ7.03-7.06(m、2H)、δ7.28-7.31(m、2H)
<HD-Ph-P4C2的合成>
将di-4PE体0.117g(0.310mmol)、2-己基癸酰氧苯乙酸0.254g(0.650mmol)及DMAP0.0151g(0.124mmol)在室温下溶解在氯仿3.5g中。然后加入EDC 0.178g(0.930mmol)，在30-35℃下进行4小时的反应。将反应溶液通过20％食盐水3g清洗2次清洗后，使用硫酸镁0.3g进行脱水。对硫酸镁进行过滤后，通过蒸发器对滤液进行浓缩，得到0.320g的粗体。对得到的粗体进行柱纯化，由此得到0.210g的HD-Ph-P4C2。
HD-Ph-P4C2的1H-NMR谱(600MHz、CDCl3)
δ0.87-0.90(t、12H)、δ1.23-1.41(m、40H)、δ1.54-1.76(m、20H)、δ1.93-1.97(m、4H)、δ2.54-2.57(m、2H)、δ2.63-2.65(m、4H)、δ2.81-2.89(m、8H)、δ3.59(s、4H)、δ4.11-4.13(t、4H)、δ7.00-7.02(m、4H)、δ7.26-7.29(m、4H)
[实施例8]O-Ph-酰胺-P4C2
<di-4PE体羟基的氨基化>
将di-4PE体0.815g(2.16mmol)、邻苯二甲酰亚胺(关东化学公司制造)0.892g(6.06mmol)及三苯基膦(关东化学公司制造)1.59g(6.06mmol)在室温下溶解在二氯甲烷5g中。然后加入偶氮二羧酸二异丙酯(ACROS ORGANICS制造)1.05g(5.20mmol)，在室温下进行4小时的反应。在反应溶液加入甲醇10g，通过蒸发器进行浓缩后，通过甲醇4g对浓缩物进行再溶解，加入乙二胺一水合物(关东化学公司制造)5.08g(65.0mmol)，在35-45℃下进行了3小时的反应。通过蒸发器对反应溶液进行了浓缩后，通过5％磷酸二氢钠水溶液10g对浓缩物进行再溶解，通过乙酸乙酯10g进行3次清洗。其后，使用氢氧化钠水溶液将水层调整为pH12，通过二氯甲烷10g进行2次萃取，使用硫酸钠(关东化学公司制造)1g进行脱水。对硫酸钠进行过滤后，通过蒸发器对滤液进行浓缩，由此得到0.572g的di-4PE-胺体。
di-4PE-胺体的1H-NMR谱(400MHz、CDCl3)
δ1.20-1.55ppm(m、10H)、δ1.51-1.54ppm(m、4H)、δ1.95-2.05ppm(m、4H)、δ2.58-2.66ppm(m、4H)、δ2.72ppm(t、4H)、δ2.78-2.83ppm(m、4H)、δ2.89-2.92ppm(m、4H)
<O-Ph-酰胺-P4C2的合成>
将di-4PE-胺体0.348g(0.929mmol)、4-油酰氧苯乙酸0.813g(1.95mmol)及DMAP0.0454g(0.372mmol)在室温下溶解在氯仿10.5g中。然后加入EDC 0.534g(2.79mmol)，在30-35℃下进行4小时的反应。将反应溶液通过20％食盐水7.00g清洗2次后，使用硫酸镁0.350g进行脱水。对硫酸镁进行过滤后，通过蒸发器对滤液进行浓缩，得到1.10g的粗体。对得到的粗体进行柱纯化，由此得到0.629g的O-Ph-酰胺-P4C2。
O-Ph-酰胺-P4C2的1H-NMR谱(600MHz、CDCl3)
δ0.86-0.90(t、6H)、δ1.22-1.42(m、46H)、δ1.61-1.77(m、12H)、δ1.92-2.03(m、12H)、δ2.52-2.56(m、4H)、δ2.62-2.66(m、4H)、δ2.80-2.89(m、8H)、δ3.22-3.25(m、4H)、δ3.54(s、4H)、δ5.32-5.37(m、6H)、δ7.05-7.05(m、4H)、δ7.25-7.26(m、4H)
[实施例9]O-Ph-C3M
<O-Ph-C3M的合成>
将通过专利文献2中记载的方法合成得到的双[{N-甲基-N-(3-羟基丙基)氨基}乙基]二硫化物(di-MAP体)0.275g(0.929mmol)、4-油酰氧苯乙酸0.813g(1.95mmol)及DMAP0.0454g(0.372mmol)在室温下溶解在氯仿10.5g中。然后加入EDC 0.534g(2.79mmol)，在30-35℃下进行4小时的反应。将反应溶液通过20％食盐水7.00g进行2次清洗后，使用硫酸镁0.350g进行脱水。对硫酸镁进行过滤后，通过蒸发器对滤液进行浓缩，得到0.871g的粗体。对得到的粗体进行柱纯化，由此得到0.498g的O-Ph-C3M。
O-Ph-C3M的1H-NMR谱(600MHz、CDCl3)
δ0.86-0.90(t、6H)、δ1.22-1.42(m、44H)、δ1.77-1.82(m、8H)、δ1.99-2.03(m、8H)、δ2.26(s、6H)、δ2.28-2.30(t、4H)、δ2.52-2.56(m、4H)、δ2.67-2.69(m、4H)、δ2.79-2.81(m、4H)、δ3.54(s、4H)、δ4.10-4.13(t、4H)、δ5.32-5.37(m、4H)、δ7.05-7.05(m、4H)、δ7.25-7.26(m、4H)
[比较例1]O-P4C2的合成
通过专利文献2中记载的合成路径合成。
O-P4C2的1H-NMR谱(600MHz、CDCl3)
δ0.86-0.90(t、6H)、δ1.20-1.35(m、40H)、δ1.58-1.70(m、4H)、δ1.75-1.83(m、4H)、δ1.95-2.05(m、8H)、δ2.24-2.32(m、10H)、δ2.66-2.70(m、4H)、δ2.78-2.82(m、4H)、δ4.10-4.13(t、4H)、δ5.13-5.38(m、4H)
[比较例2]E-P4C2的合成
通过专利文献2中记载的合成路径合成。
E-P4C2的1H-NMR谱(400MHz、CDCl3)
δ0.83-0.88(m、24H)、δ1.00-1.81(m、66H)、δ1.95-2.10(m、22H)、δ2.55-2.60(t、4H)、δ2.62-2.66(m、4H)、δ2.73-2.77(t、4H)、δ2.80-2.84(m、4H)、δ2.86-2.95(m、8H)、δ4.12-4.17(t、4H)
实验例1包封mRNA的粒子的制备及物性评价
1.根据乙醇稀释法进行的包封mRNA的LNP的制备
(1)脂质的乙醇溶液的制备
脂质的乙醇溶液如下制备：在5mL小管中，以目标比例混合5mM的阳离子脂质、5mM磷脂、5mM胆甾醇，使总脂质量为131.5nmol，进一步以总脂质量的3％相当量添加DMG-PEG2k(1mM乙醇溶液)，添加乙醇并使总量为30μL。
(2)核酸的酸性缓冲溶液的制备
核酸的酸性缓冲溶液的制备如下：在微量离心管(Eppendorf tube)中取核酸的酸性缓冲溶液，并使mRNA溶液(浓度根据体外翻译的效率而不同，但大概为0.6-0.8μg/μL)为3μg，加入酸性苹果酸缓冲(20mM，pH3.0，含有30mM NaCl)，使总量为45μL。
(3)根据乙醇稀释法的LNP制备
将核酸的酸性缓冲溶液45μ一边进行涡旋混合一边加入到脂质的乙醇溶液30μL中。接着在混合液中加入MES缓冲液(pH5.5)925μL。将LNP溶液的总量转移到事前加入有MES缓冲液1mL的Amicon Ultra 4(Millipore公司)。向加入有LNP溶液的5mL小管中添加1mL的MES缓冲液进行洗涤。进行第二次洗涤。以离心条件(25℃，1000g，3min)进行超滤浓缩至约100μL后，使用PBS定容到4mL，再次以离心条件(25℃，1000g，10min)进行浓缩。最后，使用PBS进行定容并成为目标脂质浓度。
2.各种mRNA封入LNP的粒径及表面电位的测定
对于粒径及表面电位，使用动态光散射法(Zetasizer Nano；Malvern公司)进行了测定。上述1.中制备的各种LNP的粒径、表面电位如表3～9所示。
[表3]
Figure BDA0002699986920000401
[表4]
Figure BDA0002699986920000402
[表5]
Figure BDA0002699986920000403
Figure BDA0002699986920000411
[表6]
Figure BDA0002699986920000412
[表7]
Figure BDA0002699986920000413
[表8]
Figure BDA0002699986920000414
[表9]
Figure BDA0002699986920000415
3.结果
任一LNP均为优选方式的粒径30～300nm，生理性pH下的电荷(Zeta电位)也为优选方式的-15～+15mV。
实验例2包封siRNA的粒子的制备及物性评价
1.基于微流路法的包封siRNA的LNP的制备
(1)脂质的乙醇溶液的制备
脂质的乙醇溶液按如下而制备：在微量离心管(Eppendorf tube)中以目标比例混合5mM的阳离子脂质、5mM胆甾醇，并使总脂质量为900nmol，进一步以总脂质量的1.5％相当量添加DMG-PEG2k(2mM乙醇溶液)，添加乙醇使总量为100μL。
(2)核酸的酸性缓冲溶液的制备
核酸的酸性缓冲溶液如下制备：在5mL小管中称取4mg/mL的siRNA溶液并使其为4.5μg，加入酸性苹果酸缓冲(20mM，pH3.0)并使总量为900μL。
(3)使用微流路制备LNP
将核酸的酸性缓冲溶液和脂质的乙醇溶液分别量取置于注射器中。使用超高速纳米药物制备装置NanoAssemblr(由Precision Nano Systems制造)，在18mL/min的核酸溶液，2mL/min的脂质溶液和30℃的注射器支架温度的条件下制备LNP，并在15mL管中回收。将3000μL的PBS添加到15mL试管中后，将其转移至Amicon Ultra 4中，并在离心条件下(30℃，1000g，6分钟)超滤浓缩约100μL。然后，用PBS定容至4mL，并在离心条件下(30℃，1000g，6min)再次进行浓缩。最后，使用PBS进行定容，使得达到目标脂质脂质浓度。
2.各种包封siRNA的LNP的粒径及表面电位的测定
对于粒径及表面电位，使用动态光散射法进行了测定。通过实验例5的1中记载的方法制备得到的各种LNP的粒径、表面电位的1例示于表10～12中。
[表10]
Figure BDA0002699986920000421
Figure BDA0002699986920000431
[表11]
Figure BDA0002699986920000432
[表12]
Figure BDA0002699986920000433
3.结果
任一LNP均为优选方式的粒径30～300nm，生理的pH下的电荷(Zeta电位)均为优选方式的-10～+10mV。
实验例3Liposomal pKa的测定
1.各种LNP的制备
Liposomal pKa的评价中使用了未包封核酸的空的LNP。空的LNP(阳离子脂质:DOPC:Chol:DMP-PEG2k＝60:10:30:3)如下制备：在实验例1中记载的方法中不使用核酸进行粒子制备。
2.Liposomal pKa的测定
准备好符合pH3.0～10.0的范围的各种pH的、含有最终浓度为150mM的NaCl的20mM的枸橼酸缓冲液、磷酸钠缓冲液及Tris-HCl缓冲液。将实验例3中通过1.制得的LNP用PBS进行稀释，并使LNP作为脂质浓度为0.5mM。TNS(Sigma公司制造)用超纯水进行稀释并使其为0.6mM。在黑色96孔板中加入2μL的TNS溶液、各种LNP溶液12μL及调整为各种pH的缓冲液186μL。对板进行遮光，以400rpm振荡10分钟。使用板读取器(TECAN公司制造)，测定荧光强度(激发：321nm/发光：447nm)。各LNP中的荧光强度的最大值设为100％，最小值设为0％，以百分率算出相对荧光强度。另外，将相对荧光强度为50％的pH设为Liposomal pKa。各种LNP的Liposomal pKa的评价结果示于表13中。
[表13]
阳离子脂质_LNP Liposomal pKa
实施例1的脂质(O-Ph-P3C1) 5.5
实施例2的脂质(O-Ph-P4C1) 6.1
实施例3的脂质(O-Ph-P4C2) 6.1
比较例1的脂质(O-P4C2) 5.9
3.结果
任一的LNP的Liposomal pKa均在对于内体逃逸而言优选的pKa(5.5～7.2)的范围内。另外，对阳离子脂质的氨基周边结构进行改变，由此，可以调整LNP的Liposomal pKa。
实验例4pH7.4及5.5下的溶血活性(膜融合能力)的评价
1.各种LNP的调整
溶血活性的评价中使用未包封核酸的空的LNP。空的LNP如下而制备：在实验例2的1中记载的方法中不使用核酸进行粒子制备。
2.小鼠红血球的取得
使6-7周龄的雄性ICR小鼠安乐死，从下大静脉采血约1000μL。将刚取得的血液立刻与0.5μL的肝素溶液(5000U/5mL)混合。血液中加入PBS约9mL并使总量为10mL，翻转混合之后进行离心分离(4℃、400g、10min)。将含有血浆成分的上清通过巴斯德移液管(PasteurPipette)除去。向血球成分加入PBS约9mL并使总量为10mL，再次进行离心分离。重复4次同样地洗浄操作，得到小鼠红血球。
3.溶血活性的评价
称取小鼠红血球2、4、6、8、10μL，通过PBS对含有1％(w/v)的Triton-X100进行稀释。将总量转移至透明96孔板，使用板读取器测定545nm中的吸光度。使用本稀释系列制作标准曲线，将吸光度为1的点确定为溶血分析中使用的血球量。将空的LNP溶液在微量离心管(Eppendorf tube)中称取，通过苹果酸-PBS缓冲液(pH5.5，pH6.5，pH7.4)进行稀释，并且加入小鼠红血球。使脂质的最终浓度为100μM，溶液的最终体积为250μL。以1900rpm将各小管振荡30分钟。将各样品以离心条件(4℃、400g、5min)进行离心分离，将上清200μL转移至透明96孔板，测定545nm下的吸光度。作为负调控，使用未处理的红血球。作为正调控，使用1％(w/v)的Triton-X。各样品的吸光度通过负调控及正调控进行标准化。
4.结果
将结果示于图1中。值越高，意指膜融合能力(溶血活性)越高。本发明的使用阳离子脂质的LNP(O-Ph-P4C2_LNP)在生理pH(7.4)下不具有溶血活性。另一方面，在内体环境pH(5.5)中显示80％以上的较高的溶血活性。
实验例5各种LNP在pH5.5下的溶血活性的评价
1.各种LNP的调整
空的LNP如下制备：通过实验例2的1中记载的方法中不使用核酸进行粒子制备。
2.小鼠红血球的取得
小鼠红血球的取得按照“实验例4”中记载的方法进行。
3.溶血活性的评价
将小鼠红血球称取2、4、6、8、10μL，通过含有1％(w/v)的Triton-X100的PBS进行稀释。将总量转移至透明96孔板，使用板读取器测定545nm中的吸光度。使用本稀释系列制作标准曲线，将吸光度为成为1的点确定为溶血分析中使用的血球量。将空的LNP溶液在微量离心管(Eppendorf tube)中称取，通过苹果酸-PBS缓冲液(pH5.5)进行稀释，并加入小鼠红血球。使脂质的最终浓度为1.56、6.25、25、100、400μM，溶液的最终体积为250μL。将各小管以1900rpm振荡30分钟。将各样品通过离心条件(4℃、400g、5min)进行离心分离，将上清200μL转移到透明96孔板中测定545nm中的吸光度。作为负调控，使用未处理红血球，作为正调控使用添加有1％(w/v)的Triton-X100的物质。各样品的吸光度通过负调控及正调控进行标准化。
4.结果
将结果示于图2中。值越高，意指膜融合能力(溶血活性)越高。与比较例1的LNP相比，使用了本发明阳离子脂质的LNP(O-Ph-P4C2_LNP和O-Bn-P4C2_LNP)在各脂质浓度中均显示出高的溶血活性。O-Ph-P4C2_LNP及O-Bn-P4C2_LNP的溶血活性没有差别。pH5.5中溶血活性较高意指：内体环境中与内体膜之间的相互作用较高，即，从内体的逃逸效率较高。可知使用了本发明阳离子脂质的LNP(O-Ph-P4C2_LNP和O-Bn-P4C2_LNP)由于溶血活性较高，因此在内体逃逸方面优异。
[实验例6]体外基因表达的评价1
1.各种LNP的制备
通过实验例1中的1中记载的方法制备包封有表达荧光素酶的mRNA的LNP(阳离子脂质:DOPC:Chol＝60:10:30)。
2.体外基因表达的经时评价
在转染24小时前，将人肾癌细胞OSRC2播种至3.5cm皿中，并使其成为1.0×104cells/2mL/Dish。24小时后，将培养基转换为含有0.1mM的D-荧光素酶(D-luciferin)的培养基(RPMI1640)。制得的包封mRNA的LNP以PBS进行稀释，使mRNA的浓度为6μg/mL。将稀释得到的包封mRNA的LNP溶液33μL(mRNA0.2μg)加入到3.5cm皿中，并安装于培养箱型发光计KronosDio(由ATTO制造)。每隔1小时测量荧光素酶的发光强度2分钟。根据获得的表达时间变化，计算24小时的累积发光强度。
4.结果
结果如图3所示。该值越高，意指即总萤光素酶活性越高，基因表达越高。使用了本发明阳离子脂质的LNP(O-Ph-P4C1_LNP和O-Ph-P4C2_LNP)与使用了比较例1的阳离子脂质的LNP(O-P4C2_LNP)相比，显示出更高的基因表达。
[实验例7]体外基因表达的评价2
1.各种LNP的制备
通过实验例1中的1中记载的方法制备包封有表达荧光素酶的mRNA的LNP(阳离子脂质:DOPC:Chol＝52.5:7.5:40)。
2.体外基因表达的经时评价
转染24小时前，播种小鼠大肠癌细胞CT26至3.5cm皿中，并使其成为8.0×104/2mL/Dish。24小时后，将培养基变换为包含0.1mM的荧光素酶(D-luciferin)的培养基。制得的包封有mRNA的LNP以PBS进行稀释，使mRNA的浓度为6μg/mL。将稀释得到的包封有mRNA的LNP溶液67μL(mRNA0.4μg)添加到3.5cm皿中，并安装于培养箱型发光计KronosDio(由ATTO制造)。每隔1小时测量荧光素酶的发光强度2分钟。根据获得的表达时间变化，计算24小时的累积发光强度。
3.结果
结果如图4所示。该值越高，意指即总萤光素酶活性越高，基因表达越高。使用了本发明阳离子脂质的LNP(O-Ph-P4C2_LNP和O-Bn-P4C2_LNP)与比较例1的LNP相比，显示出更高的基因表达活性。特别地，O-Ph-P4C2_LNP显示出比比较例1的LNP高约10倍的基因表达活性，并且具有优异的体外mRNA递送能力。
[实验例8]体外基因表达的经时评价
1.各种LNP的制备
通过实施例1中记载的方法，制备了包封表达促红细胞生成素的mRNA的LNP(阳离子脂质:DOPC:Chol＝52.5:7.5:40)。
2.体外基因表达的经时评价
用PBS稀释制备的包封mRNA的LNP，以使mRNA的浓度为5μg/mL。将经过稀释的包封mRNA的LNP以每1g体重为10μL的量向6周龄的雌性Balb/c小鼠进行尾静脉内给药(作为mRNA的给药量为0.05mg/kg)。在给药后0.5、1、2、3、6、9、24小时从小鼠的尾静脉采集15μL的血液。将刚收集的血液立即与0.3μL肝素溶液(5000U/5mL)混合。在离心条件下(25℃，2000g，20min)对各血液样品进行离心分离并回收上清液。使用小鼠促红细胞生成素Quantikine ELISAKit(R&D Systems制造)，通过试剂盒方案中描述的方法，对上清液中的促红细胞生成素浓度进行测定。
3.使用了市售的基因导入试剂TransIT(注册商标)的mRNA-TransIT复合体的制备
该复合物的制备参考文献进行(Thess A et al.Molecular Therapy.2017)。在微量离心管(Eppendorf tube)中称量mRNA溶液，使得mRNA的量为5μg。mRNA溶液用Dulbecco改良的Eagle培养基(高葡萄糖，High-Glucose)稀释至491μL。通过向其中添加5.5μL的TransIT-mRNA试剂和3.5μL的mRNA Boost试剂，并培养2分钟，由此制备mRNA-TransIT复合体。
4.体外mRNA-TransIT复合体的基因表达的经时评价
参照文献进行该基因表达活性评价(Thess A et al.Molecular Therapy.2017)。将制备的mRNA-TransIT复合物以每1g体重为5μL的量向6周龄的雌性Balb/c小鼠进行腹腔内给药(作为mRNA的给药量为0.05mg/kg)。在各个时间点从小鼠的尾静脉采集血液，并通过实施例7中的2中描述的方法对促红细胞生成素浓度进行定量。
5.结果
结果示于图5。值越高，即促红细胞生成素活性越高，意指基因表达越高。使用本发明阳离子脂质的LNP(O-Ph-P4C2_LNP和O-Bn-P4C2_LNP)与市售的基因导入试剂TransIT(注册商标)相比，显示出更高的基因表达活性。特别地，O-Ph-P4C2_LNP显示出比市售基因导入试剂高约10倍的基因表达活性，并且可以看出其具有优异的体内mRNA递送能力。
[实验例9]体外基因敲低活性的评价(向肝脏的siRNA的递送)
1.各种LNP的制备
通过[实验例2]的1中记载的方法，制备了包封针对肝脏特异性蛋白质凝血因子第VII因子(FVII)的siRNA的LNP。
2.在体外肝脏中的基因敲低活性的评价
以PBS稀释制得的包封siRNA的LNP，并使siRNA的浓度为2μg/mL。将稀释的包封siRNA的LNP以每1g体重为10μL的量向4周龄的雄性ICR小鼠进行尾静脉内给药(作为siRNA的给药量为0.02mg/kg)。在24小时后，将小鼠安乐死，从下大静脉采集血液约500μL。将刚采集的血液立即与0.5μL的肝素溶液(5000U/5mL)混合，在冰上保存直到进行分析。使用Biophen VIIassay kit(Aniara社)，按照试剂盒的方案中记载的方法，对血中的FVII浓度进行测定。各样品给药后24小时后的FVII的血中浓度通过未处理的小鼠的血中FVII浓度进行标准化。
3.结果
将结果示于图6。值越低，即FVII蛋白质的表达活性越低，意指基因敲低活性越高。使用了本发明阳离子脂质的LNP(O-Ph-P4C2_LNP和O-Bn-P4C2_LNP)与使用了比较例1的LNP相比，均显示出更高的基因敲低活性。特别地，可知O-Ph-P4C2_LNP在体外具有优异的siRNA的递送能力。
[实验例10]包封mRNA粒子的制备和物性评价
1.基于微流路法的包封mRNA的LNP的制备
(1)脂质的乙醇溶液的制备
脂质的乙醇溶液如下制备：以目标比例在5mL小管中将5mM的阳离子脂质、5mM磷脂、5mM胆甾醇混合，并使总脂质量为2550nmol，进一步以总脂质量的1.5％相当量添加DMG-PEG2k(1mM乙醇溶液)，加入乙醇使总量为510μL。
(2)核酸的酸性缓冲溶液的制备
核酸的酸性缓冲溶液如下制备：在5mL小管中量取mRNA溶液(浓度根据体外翻译的效率而不同，大概为0.6-0.8μg/μL)并使其为10.8μg，加入酸性苹果酸缓冲(20mM，pH3.0，含有30mM NaCl)并使总量为1300μL。
(3)使用微流路制备LNP
核酸的酸性缓冲溶液及脂质的乙醇溶液各自以注射器量取。使用超高速纳米医药制备装置NanoAssmblr，以3mL/min核酸溶液、1mL/min脂质溶液进行LNP制备，并将1.2mL回收至15mL小管中。向15mL小管加入pH6.5、20mM的MES(以NaOH制备)3000μL，然后转移至AmiconUltra 4，重复进行离心(25℃，1000g，3min)，进行超滤浓缩直到为约300μL。然后，使用PBS定容为4mL，再次重复进行离心(25℃，1000g，3min)，进行浓缩。最后，使用PBS进行定容使得成为目标的脂质浓度。
2.各种包封mRNA的LNP的粒径及表面电位的测定
对于粒径及表面电位，使用动态光散射法进行了测定。按照上述1.中的方法制备的各种LNP的粒径、表面电位的1例如表14～21所示。
[表14]
Figure BDA0002699986920000501
[表15]
Figure BDA0002699986920000502
[表16]
Figure BDA0002699986920000503
[表17]
Figure BDA0002699986920000504
[表18]
Figure BDA0002699986920000511
[表19]
Figure BDA0002699986920000512
[表20]
Figure BDA0002699986920000513
[表21]
Figure BDA0002699986920000514
3.结果
任意的LNP均为优选方式的粒径30～300nm，在生理pH下的电荷(Zeta电位)为优选方式的-15～+15mV。
[实验例11]Liposomal pKa的测定
1.各种LNP的制备
Liposomal pKa的评价中使用未包封核酸的空的LNP。空的LNP(阳离子脂质:DOPC:Chol:DMG-PEG2k＝52.5:7.5:40:1.5)如下制备：[实验例10]中记载的方法中不使用核酸进行粒子制备。
2.Liposomal pKa的测定
通过[实验例3]中记载的方法算出Liposomal pKa。各种LNP的Liposomal pKa的值如表22所示。
[表22]
Figure BDA0002699986920000521
3.结果
任意的LNP的Liposomal pKa对于内体逃逸均在优选pKa(5.5～7.2)的范围内。通过加入O-Ph-酰胺-P4C2提高pKa。
[实验例12]pH7.4及5.5下的溶血活性(膜融合能力)的评价
1.各种LNP的调整
溶血活性的评价中使用未包封核酸的空的LNP。通过[实验例11]的1中记载的方法制备空的LNP。
2.小鼠红血球的取得
通过[实验例4]的2中记载的方法得到小鼠红血球。
3.溶血活性的评价
通过[实验例4]的3中记载的方法评价溶血活性。
4.结果
结果如图7所示。使用本发明的阳离子脂质或比较例1的阳离子脂质的LNP均在生理的pH(7.4)下不具有溶血活性。另一方面，可知在内体环境pH(5.5)下使用了本发明的阳离子脂质的LNP与使用了比较例1的阳离子脂质的LNP相比，均具有更高的溶血活性。
[实验例13]体外基因表达的评价3
1.各种LNP的制备
通过[实验例10]的1中记载的方法制备包封表达荧光素酶的mRNA的LNP(阳离子脂质:DOPC:Chol＝52.5:7.5:40)。
2.体外基因表达的经时评价
转染24小时前，将人子宫颈癌细胞HeLa细胞播种到3.5cm皿中，并使其成为5.0×104cells/2mL/Dish。24小时后，将培养基变化为含有0.1mM的荧光素酶(D-luciferin)的培养基(D-MEM)。制备得到的包封mRNA的LNP以PBS进行稀释，并使mRNA的浓度为约8μg/mL。将稀释的包封有mRNA的LNP溶液约50μL(mRNA 0.4μg)加入到3.5cm皿中，并安装于培养箱型发光计KronosDio(由ATTO制造)。每隔1小时测量荧光素酶的发光强度，测量2分钟。根据获得的表达时间变化，计算24小时的累积发光强度。
3.结果
结果如图8所示。该值越高，即总萤光素酶活性越高，意指基因表达越高。使用了本发明的阳离子脂质的LNP(O-Ph-P4C2_LNP、L-Ph-P4C2_LNP、HD-Ph-P4C2_LNP、O-Ph-P4C2+O-Ph-酰胺-P4C2_LNP，及L-Ph-P4C2_LNP)与使用了比较例1的阳离子脂质的LNP(O-P4C2_LNP)相比，显示出更高的基因表达。并且，O-Ph-P4C2_LNP及O-Ph-P4C2+O-Ph-酰胺-P4C2_LNP与市售的mRNA导入试剂相比均显示出更高的基因表达活性。
[实验例14]体外基因表达的评价4
1.LNP的制备
通过[实验例10]的1中记载的类似的方法制备包封表达荧光素酶的mRNA的LNP(O-Ph-P4C2:DOPC:Chol:DMG-PEG2k＝52.5:7.5:40:0.75)。
2.使用了基因导入试剂(Lipofectamine MssengerMAX)的Lipofectamine-mRNA复合体的制备
本复合体的制备通过厂家记载的方案进行。在微量离心管(Eppendorf tube)中加入Opti-MEM培养基125μL及Lipofectamine MessengerMAX试剂，培养10分钟。在另外的微量离心管(Eppendorf tube)中制备mRNA2.5μg/Opti-MEM培养基125μL的溶液。向其中添加进行了培养的Lipofectamine溶液125μL，通过5分钟的培养制备Lipofectamine-mRNA复合体。
3.体外基因表达的经时评价
在转染24小时前，将人白血病T细胞Jurkat细胞播种到3.5cm皿中，并使得成为2.0×105cells/1.8mL/Dish。在24小时后，在各皿中加入200μL的具有荧光素酶(D-luciferin)的培养基(RPMI1640)，并使得最终浓度为0.1mM。向其中加入调制为各浓度的包封mRNA的LNP溶液80μL(作为mRNA为0.4、0.8、1.6、3.2μg)，或Lipofectamine-mRNA复合体40、80、160、320μL(作为mRNA为0.4、0.8、1.6、3.2μg)，并将各皿安装于培养箱型发光计KronosDio(由ATTO制造)。每隔3小时测量荧光素酶的发光强度2分钟。从得到的表达的时间変化，算出48小时的累积发光强度。
4.结果
结果如图9。使用了本发明阳离子脂质的LNP(O-Ph-P4C2_LNP)在所有的mRNA量上与基因导入试剂相比，均显示出优异的基因表达活性。
[实验例15]体外基因表达的评价5
1.LNP的制备
通过[实验例10]中的1记载的类似的方法制备包封有表达EGFP的mRNA的LNP(O-Ph-P4C2:DOPC:Chol:DMG-PEG2k＝52.5:7.5:40:0.75)。
2.使用了基因导入试剂的Lipofectamine-mRNA复合体的制备
通过[实验例14]的2中记载的方法制备Lipofectamine-mRNA复合体。
3.体外基因表达的经时评价
在转染24小时前，将人白血病T细胞Jurkat细胞播种在3.5cm皿中，并使得成为2.0×105cells/2mL/Dish。在24小时后，在3.5cm皿中添加调制为各浓度的包封mRNA的LNP溶液80μL(作为mRNA为0.4、0.8、1.6、3.2μg)，或Lipofectamine-mRNA复合体40、80、160、320μL(作为mRNA为0.4、0.8、1.6、3.2μg)，在细菌培养器中培养24小时。将培养液替换为FACS缓冲(0.5％牛血清白蛋白(BSA)、0.1％NaN3含有PBS)，并用流式细胞仪(NovoCyte；ACEABiosciences制造)测定，进行导入了基因的细胞的分析。
4.结果
将结果示于图10。值越高表示基因导入的细胞越多。就基因导入试剂而言，所有的mRNA量均仅在一部分细胞中进行了基因表达，表达的均匀性较低。与此相对，使用了本发明阳离子脂质的LNP无论mRNA量如何，几乎全部的细胞均导入了基因，可知表达的均匀性非常高。
[实验例16]体外基因表达的评价(皮下给药)
1.各种LNP的制备
通过[实验例10]中记载的使用了微流路的方法制备包封有表达荧光素酶的mRNA的LNP(阳离子脂质:DOPE:Chol＝60:30:10)。
2.体外基因敲低活性的评价
将制备得到的包封mRNA的LNP以每1g体重为10μL的量向6周龄的雌性C57/BL6J小鼠颈背部进行皮下给药(作为mRNA的给药量为0.05mg/kg)。给药5小时半后，对小鼠以每1g体重为10μL的量将荧光素进行腹腔内给药(作为荧光素的给药量为1.5g/kg)。30分后，使用IVIS成像系统进行成像。从所获取的图像中以Photoms/sec计算小鼠的颈背部中的亮度平均值，并将其用作颈背部中的基因表达活性的指标。
3.结果
结果如图11所示。该值越高，即总萤光素酶活性越高，意指基因表达越高。使用了本发明阳离子脂质的LNP(E-Ph-P4C2_LNP)与比较例2相比，在小鼠皮下显示了更高的基因表达活性。
工业实用性
根据本发明，可以将核酸高效地导入细胞，可用于核酸药物、基因治疗以及生化实验。
本申请基于在日本提交的日本特愿2018-060764，其全部内容通过引用合并于此。

Claims (11)

1.一种阳离子脂质，其以式(1)表示，
Figure FDA0002699986910000011
式(1)中，
R1a及R1b各自独立地表示碳原子数为1～6的亚烷基，
Xa及Xb各自独立地表示：碳原子数为1～6、且叔胺基的数量为1的非环状烷基叔胺基，或碳原子数为2～5、且叔胺基的数量为1～2的环状亚烷基叔胺基，
R2a及R2b各自独立地表示碳原子数为8以下的亚烷基或氧二亚烷基，
Ya及Yb各自独立地表示酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键或脲键，
Za及Zb各自独立地表示碳原子数为3～16的芳香族化合物衍生的2价基团，所述芳香族化合物具有至少一个的芳香环，且可具有杂原子，
R3a及R3b各自独立地表示源自具有羟基的脂溶性维生素与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基，或源自具有羟基的甾醇衍生物与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基，或碳原子数为12～22的脂肪族烃基。
2.根据权利要求1所述的阳离子脂质，其中，Za及Zb各自独立地为Z1；
Figure FDA0002699986910000012
式中，
s表示0～3的整数，
t表示0～3的整数，
u表示0～4的整数，
u个R4各自独立地表示取代基。
3.根据权利要求2所述的阳离子脂质，其中，s为0。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的阳离子脂质，其中，Xa及Xb各自独立地为环状亚烷基叔胺基，所述环状亚烷基叔胺基的碳原子数为2～5，且叔胺基的数量为1～2。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的阳离子脂质，其中，R3a及R3b各自独立地为：
源自具有羟基的脂溶性维生素与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基，或
碳原子数为12～22的脂肪族烃基。
6.根据权利要求5所述的阳离子脂质，其中，R3a及R3b各自独立地为源自具有羟基的脂溶性维生素与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基。
7.根据权利要求5所述的阳离子脂质，其中，R3a及R3b各自独立地为碳原子数12～22的脂肪族烃基。
8.一种脂质膜结构体，其包含权利要求1～7中任一项所述的阳离子脂质作为膜的构成脂质。
9.一种核酸导入剂，其含有权利要求1～7中任一项所述的阳离子脂质、或权利要求8所述的脂质膜结构体。
10.一种将核酸导入细胞内的方法，其包括：在生物体外，使封装有核酸的权利要求9中所述的核酸导入剂与所述细胞接触。
11.一种将核酸导入细胞内的方法，其包括：将封装有核酸的权利要求9中所述的核酸导入剂给药于活生物体，以使其向靶细胞递送。
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