JP2002526450A - Ｃｈｋ１キナーゼ阻害物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ｃｈｋ１キナーゼ受容体アンタゴニストを使用する方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、チェックポイントキナーゼ（「ｃｈｋ１キナーゼ」）阻害物質、こ
れらの化合物を含む医薬組成物および種々の形態の癌および高増殖性障害を治療
するのにこれらの化合物を使用する方法に関する。

【０００２】 （発明の背景） 真核細胞周期の進行は、ＤＮＡの完全な複製およびフィデリティーを包含する
事象の適当な順序およびタイミングをモニターして確実にする一連の細胞周期関
連チェックポイントにより制御される。有糸分裂への移行は、ｃｄｃ２プロテイ
ンキナーゼおよびサイクリンＢを含有する複合体であるＭ期促進因子（ＭＰＦ）
により開始される。ＭＰＦの適当な調節により、確実に、細胞周期の初期が完了
した後にだけ有糸分裂が生じることになる。Ｔｙｒ−１５およびＴｈｒ−１４で
のｃｄｃ２のリン酸化は、間期（Ｇ１、Ｓ、およびＧ２）の間、この活性を抑制
する。Ｇ２−Ｍ過渡期に、ｃｄｃ２は、Ｔｙｒ−１５およびＴｈｒ−１４で脱リ
ン酸化し、ＭＰＦにその有糸分裂基質をリン酸化させる。これは、通常、二重特
異性ホスファターゼｃｄｃ２５Ｃにより行われる。しかしながら、ＤＮＡ損傷に
応答して、細胞周期は、Ｇ２期で休止し、ｃｄｃ２キナーゼの阻害性リン酸化は
、無傷のままである。

【０００３】 最近、Sanchez et al.（Science, 1997. 277:1497-1501）は、ＤＮＡ損傷チェ
ックポイントに必須である、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyce
s pombe）チェックポイントキナーゼの相同体であるヒトチェックポイントキナ
ーゼ（Ｃｈｋ１）のクローニングおよび特徴付けを開示した。ヒトＣｈｋ１は、
Ｓｅｒ２１６上でｃｄｃ２５Ｃに結合してそれをリン酸化し、その結果、１４−
３−３タンパク（細胞周期および細胞死制御因子、癌遺伝子および情報伝達分子
に関連することが知られているタンパクの一ファミリー）のｃｄｃ２５への結合
およびｃｄｃ２５ホスファターゼ活性の阻害を引き起こすことが立証されている
（Sanchez et al. Science 1997. 277:1497-1501; Peng et al. Science. 277:1
501-1505）。これは、ｃｄｃ２キナーゼを不活性状態に維持し、有糸分裂への移
行を妨げる。Ｃｈｋ１によりリン酸化することができないＳ２１６Ａ ｃｄｃ２
５Ｃ変異体の過剰発現により、Ｇ２チェックポイントの破壊が引き起こされ、Ｄ
ＮＡ損傷細胞がＧ２期で休止および修復できないようになる。したがって、Ｃｈ
ｋ１阻害物質をＤＮＡ損傷剤と一緒に投与することは、腫瘍細胞死を相乗的に増
加させるという仮説をたてることができる。

【０００４】 Ｃｈｋ１キナーゼは、特に、Ｇ２／Ｍ期で、重要な細胞周期制御因子である。
したがって、阻害物質は、癌の治療に魅力的である。手術、放射線および化学療
法を包含する現行の癌治療法は、しばしば、該疾患の治癒が不成功に終わる。患
者人口は大きい。例えば、大腸癌だけでも、米国では毎年１６０,０００件の新
しいケースがあり、６０,０００人が死亡している。世界中では、毎年６００,０
００件の新しい大腸癌のケースがある。肺癌の数は、大腸癌の２倍である。大部
分の充実性腫瘍に対する化学療法の欠点は、ほとんどの患者が応答しないという
ことである。これは、細胞周期制御、およびその結果としての最も有効な化学療
法剤の標的であるＤＮＡまたは有糸分裂装置に対する損傷の修復によるものであ
る。Ｃｈｋ１キナーゼは、腫瘍細胞に抵抗性を生じさせるこれらのメカニズムか
ら上流にインターベンションポイントを提供する。Ｃｈｋ１の阻害は、慣用の化
学療法と併用して薬物抵抗性を抑えることができる。

【０００５】 上記に基づいて、種々の上記適応症の治療について強力なｃｈｋ１キナーゼ阻
害物質の同定が必要とされている。

【０００６】 （発明の概要） 本発明は、下記式（Ｉ）で示される化合物、かかる化合物を含む医薬組成物、
およびｃｈｋ１キナーゼを阻害する方法、ならびにｃｈｋ１キナーゼ活性の阻害
を検出する特異的アッセイに関する。

【０００７】 （発明の詳細な記載） 本発明は、下記式（Ｉ）：

【化２】 ［式中、 Ｘは、Ｎ、ＳまたはＯＨであり； Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４は、独立して、Ｃ_１−６アルキル、ＯＨまたはＳ
ＨまたはＨを表す］ で示される化合物を提供する。

【０００８】 好ましくは、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４は、独立して、Ｃ_１−３アルキルま
たはＨを表す。 最も好ましくは、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４は、Ｈを表す。 本発明において有用な特に好ましい化合物は、以下の化合物である： ９,１０,１１,１２−テトラヒドロ−９,１２−エポキシ−１Ｈ−ジインドロ[
１,２,３−ｆｇ:３',２',１'−ｋｌ]ピロロ[３,４−ｉ][１,６]ベンゾジアゾシ
ン−１,３(２Ｈ)−ジオン。

【０００９】 本明細書で用いる場合、「アルキル」は、炭素−炭素単結合により一緒に結合
される置換されていてもよい炭化水素基を表す。アルキル炭化水素基は、直鎖で
あっても、分枝鎖であってもまたは環状であってもよく、飽和であってもまたは
不飽和であってもよい。好ましくは、この基は、飽和した直鎖または環状のもの
である。

【００１０】 本発明の化合物は、１個以上の不斉炭素原子を含有していてもよく、ラセミ体
および光学活性形態で存在してもよい。これらの化合物およびジアステレオマー
の全ては、本発明の範囲内であると考えられる。

【００１１】 本発明の化合物は、また、医薬上許容される塩およびその複合体として製剤化
することができる。医薬上許容される塩は、それらが投与される量および濃度で
は非毒性の塩である。

【００１２】 医薬上許容される塩としては、硫酸塩、塩酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、
リン酸塩、スルファミン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、メタン
スルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスル
ホン酸塩、シクロヘキシルスルファミン酸塩およびキナ酸塩を含む酸付加塩など
の酸付加塩が挙げられる。医薬上許容される酸は、塩酸、マレイン酸、硫酸、リ
ン酸、スルファミン酸、酢酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、マロン酸、メタンスル
ホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シ
クロヘキシルスルファミン酸、フマル酸、およびキナ酸などの酸から得ることが
できる。

【００１３】 医薬上許容される塩としては、また、カルボン酸またはフェノールのような酸
性官能基が存在する場合には、ベンザチン、クロロプロカイン、コリン、ジエタ
ノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン、プロカイン、アルミニウム、カ
ルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、アンモニウム、ア
ルキルアミン、および亜鉛を含む塩基付加塩などの塩基付加塩が挙げられる。

【００１４】 本発明の化合物は、下記実施例Ｉにより例示される方法により製造することが
できる。

【００１５】 （実施例） 実施例Ｉ ＳＢ−２１８０７８［９,１０,１１,１２−テトラヒドロ−９,１２−エポキシ
−１Ｈ−ジインドロ[１,２,３−ｆｇ:３',２',１'−ｋｌ]ピロロ[３,４−ｉ][１
,６]ベンゾジアゾシン−１,３(２Ｈ)−ジオン］の合成

【００１６】

【化３】

【００１７】 インドロ[２,３−ａ]カルバゾール（ＳＢ−２５４２７３）（３.００ｇ）、２
,５−ジメトキシテトラヒドロフラン（２.４１ｇ）およびｄ−１０−カンフルス
ルホン酸（０.６０ｇ）の乾燥塩化メチレン（２００ｍＬ）中混合物を室温で撹
拌した。一夜撹拌した後、該混合物を蒸発させ、溶離液として塩化メチレンを用
いてシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーカラムにて精製した。得られた無
色粉末（ＩＩ）（２.７６ｇ、融点２８２−６℃）を次工程にて用いた。

【００１８】 １１,１２−(テトラヒドロフラン−２,５−イル)−インドロ[２,３−ａ]カル
バゾール（ＩＩ）の撹拌懸濁液（ＤＭＦ １０ｍＬ中に０.８１ｇ）にＮ−ブロモ
スクシンイミドの溶液（ＤＭＦ ５ｍＬ中に０.９ｇ）を滴下した。該混合物を６
５℃で２時間撹拌し、次いで、室温に冷却し、一夜撹拌した。水（２０ｍＬ）を
添加し、数分間撹拌した後、該混合物を濾過した。沈澱物を水で洗浄し、真空乾
燥して化合物ＩＩＩ（１.２ｇ）を得、これを次工程にて用いた。

【００１９】 化合物ＩＩＩ（１.２ｇ）、シアン化銅(Ｉ)（０.９０ｇ）およびヨウ化ナトリ
ウム（０.７５ｇ）の乾燥ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）中混合物を窒素下で
１６５℃に加熱した。２４時間後、該混合物を室温に冷却し、沈澱した黄色残渣
を水で洗浄し、真空乾燥させた（０.８２ｇ）。この生成物の質量スペクトルは
、多少の痕跡量のモノ−シアノアナログを含むが、主として、所望の生成物（Ｉ
Ｖ、ジシアノ化合物、ＳＢ−２５４２７３）であることを示した。

【００２０】 ジシアノ化合物（ＩＶ、０.３８ｇ）をＤＭＳＯ（１８ｍＬ）、水（１ｍＬ）
およびＫＯＨ（０.５７ｇ）中で１.５時間、１５０℃に加熱した。室温に冷却し
た後、トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）を滴下した。得られた溶液を室温で一夜撹拌
した。水（４０ｍＬ）を添加し、沈澱した黄色残渣を回収し、水で洗浄し、真空
乾燥させて化合物Ｖ（０.３７ｇ、融点＞３００℃）を得た。粗製生成物をＤＭ
Ｆ／水（５ｍＬ；１０：１）から再結晶して黄色結晶性物質（０.１０ｇ、融点
＞３００℃）を得た。

【００２１】 McCombie, Stuart W.; Bishop, Robert W.; Carr, Donna; Dobek, Emily; Kir
kup, Michael P.; Kirschmeier, Paul; Lin, Sue Ing; Petrin, Joanne; Rosins
ki, Karen; et al. Indolocarbazoles. 1. Total synthesis and protein kinas
e inhibiting characteristics of compounds related to K-252c. Bioorg. Med
. Chem. Lett. (1993), 3(8), 1537-42（出典明示により本明細書の一部とする
）も参照のこと。

【００２２】 式（Ｉ）で示される残りの化合物の合成は、化学的官能基の適当な操作および
保護を用いて、上記の方法と類似の方法により行う。

【００２３】 式（Ｉ）で示される化合物またはその医薬上許容される塩をヒトおよび他の哺
乳動物の治療に使用するためには、通常、標準的な製薬方法に従って医薬組成物
として製剤化される。

【００２４】 本発明のリガンドは、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、経口、局所、経皮、ま
たは経粘膜投与を包含する種々の経路により投与することができる。全身投与に
ついては、経口投与が好ましい。経口投与については、例えば、該化合物は、カ
プセル剤、錠剤、ならびにシロップ剤、エリキシル剤および濃縮滴剤の如き液体
製剤などの慣用の経口投与剤形に製剤化することができる。

【００２５】 別法として、筋肉注射、静脈注射、腹腔内注射および皮下注射などの注射（非
経口投与）を用いることができる。注射については、本発明の化合物は、溶液、
好ましくは、生理学上適合するバッファーまたは溶液、例えば、生理食塩水、ハ
ンクス溶液、リンゲル溶液にて製剤化される。さらに、当該化合物は、固体形態
で製剤化でき、使用直前に再度溶解または懸濁させることができる。凍結乾燥形
を調製することもできる。

【００２６】 全身投与は、また、経粘膜または経皮手段によることができる。経粘膜または
経皮投与については、浸透されるべき障壁に対して適当な浸透剤が製剤化に用い
られる。かかる浸透剤は、一般に、当該技術分野で知られており、例えば、経粘
膜投与については、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が挙げられる。さらに、界
面活性剤を用いて浸透を容易にすることができる。経粘膜投与は、例えば、鼻ス
プレー剤、直腸用坐剤、または膣用坐剤によることができる。

【００２７】 局所投与については、本発明の化合物は、当該技術分野で一般に知られている
ように、軟膏剤（ointments）、軟膏剤（salves）、ゲル剤、またはクリーム剤
に製剤化することができる。

【００２８】 種々の化合物の投与量は、化合物ＩＣ_５０、ＥＣ_５０、化合物の生物学的半減
期、患者の年齢、大きさおよび体重、ならびに患者に関連している疾患または障
害などの因子を考慮して標準的な方法により決定することができる。

【００２９】 投与量は、また、投与経路および経口生物学的利用能の程度にも左右される。
例えば、低い経口生物学的利用能を有する化合物については、相対的に高い投与
量を投与するべきであろう。

【００３０】 好ましくは、当該組成物は、単位投与剤形である。経口投与については、例え
ば、錠剤またはカプセル剤を投与することができ、鼻投与については、定量型エ
アゾール剤を投与することができ、経皮投与については、局所製剤またはパッチ
剤を投与することができ、経粘膜デリバリーについては、バッカルパッチ剤を投
与することができる。各々の場合、投薬は、患者が一回投与量を投与できるよう
なものである。

【００３１】 経口投与についての各投与単位は、適当には、式（Ｉ）で示される化合物また
はその医薬上許容される塩を遊離塩基として換算して０.０１〜５００ｍｇ／ｋ
ｇ、好ましくは、０.１〜５０ｍｇ／ｋｇ含有する。非経口、鼻、口吸入、経粘
膜または経皮経路についての日用量は、適当には、式（Ｉ）で示される化合物０
.０１ｍｇ〜１００ｍｇ／ｋｇを含有する。局所製剤は、適当には、式（Ｉ）で
示される化合物を０.０１〜５.０％含有する。有効成分は、当業者に容易に明ら
かであるように、所望の活性を示すのに十分なように、１日１〜６回、好ましく
は、１回投与される。

【００３２】 本明細書で用いる場合、疾患の「治療」としては、疾患の防御（prevention）
、遅延および予防（prophylaxis）が挙げられるが、これらに限定されるもので
はない。本明細書で用いる場合、本発明化合物を用いて治療可能な「疾患」とし
ては、白血病、充実性腫瘍性癌および癌転移、リンパ腫、軟部組織癌、脳癌、食
道癌、胃癌、膵癌、肝癌、肺癌、膀胱癌、骨癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、
子宮体癌、精巣癌、腎臓癌、頭部癌および頚部癌、慢性炎症性増殖性疾患、例え
ば、乾癬および慢性関節リウマチ；増殖性心血管疾患、例えば、再狭窄；増殖性
眼障害、例えば、糖尿病性網膜症；ならびに良性高増殖性疾患、例えば、血管腫
が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【００３３】 経口投与した場合に活性である式（Ｉ）で示される化合物およびそれらの医薬
上許容される塩は、シロップ剤、錠剤、カプセル剤およびロゼンジ剤として製剤
化することができる。シロップ製剤は、一般に、フレーバーまたは着色料を含む
液体担体、例えば、エタノール、落花生油、オリーブ油、グリセリンまたは水に
おける当該化合物または塩の懸濁液または溶液からなる。組成物が錠剤の剤形で
ある場合、固体製剤の調製に慣用的に用いられる医薬担体を用いることができる
。かかる担体の例としては、ステアリン酸マグネシウム、白土、タルク、ゼラチ
ン、アラビアガム、ステアリン酸、デンプン、ラクトースおよびスクロースが挙
げられる。組成物がカプセル剤の剤形である場合、例えば、ハードゼラチンカプ
セルシェル中に上記担体を用いるような慣用のカプセル化が適当である。組成物
がソフトゼラチンシェルカプセル剤の剤形である場合、例えば、水性ガム、セル
ロース、シリケートまたは油などの分散剤または懸濁剤の調製に慣用的に用いら
れる医薬担体が考えられ、ソフトゼラチンカプセルシェルに取り込まれる。

【００３４】 典型的な非経口組成物は、非経口上許容される油、例えば、ポリエチレングリ
コール、ポリビニルピロリドン、レシチン、落花生油またはゴマ油を含有してい
てもよい無菌水性もしくは非水性担体における化合物または塩の溶液または懸濁
液からなる。

【００３５】 典型的な吸入用組成物は、乾燥粉末として、またはジクロロジフルオロメタン
もしくはトリクロロフルオロメタンなどの慣用の噴霧剤を用いるエアゾール形態
で投与できる液剤、懸濁剤または乳剤の剤形である。

【００３６】 典型的な坐剤製剤は、このようにして投与した場合に活性である式（Ｉ）で示
される化合物またはその医薬上許容される塩を、結合剤および／または滑沢剤、
例えば、高分子グリコール、ゼラチン、カカオ脂または他の低融点植物性ワック
スまたは脂肪またはそれらの合成アナログと一緒に含む。

【００３７】 典型的な皮膚用および経皮製剤は、慣用的な水性または非水性ビヒクルを含ん
でおり、例えば、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤もしくはパスタ剤であるか
、または、薬用硬膏剤、パッチ剤または膜剤の剤形である。

【００３８】 好ましくは、組成物は、患者が一回投与量を投与できるような、一回投与型剤
形のもの、例えば、錠剤、カプセル剤または定量型エアゾール剤である。

【００３９】 本発明の化合物を本発明に従って投与する場合、許容されない毒物学的作用は
考えられない。

【００４０】 式（Ｉ）で示される化合物の生物学的活性は、以下に示す試験により証明され
る。

【００４１】 Ｃｈｋ１法： ｍｙｔ１キナーゼ阻害能を有する化合物は、以下に記載するとおり、インビト
ロアッセイおよび細胞アッセイを用いて同定することができる。これらのアッセ
イの変形例は、当業者に明白であろう。

【００４２】 ＧＳＴ−Ｃｈｋ１の発現： トロンビン切断部位を含有するリンカーを介してＣｈｋ１キナーゼのアミノ末
端に融合したグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子を有するＧＳＴ−Ｃ
ｈｋ１発現構築物を構築した。この構築物をバキュロウイルス発現ベクターｐＦ
ＡＳＴＢＡＣ中にクローン化し、これを用いて、次なる感染のためのウイルスス
トックを調製した。スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細
胞（Ｓｆ９）をＧＳＴ−Ｃｈｋ１発現ウイルスに感染させ、該細胞を３日間増殖
させ、次いで、収穫し、凍結させた。

【００４３】 ＧＳＴ−Ｃｈｋ１の精製： ＧＳＴ−Ｃｈｋ１タンパクを以下のとおり精製した：ＧＳＴ−Ｃｈｋ１を発現
するＳｆ９細胞ペレットを氷上で溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃl、p
Ｈ ７.５、２５０ｍＭ ＮaＣl_２、１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、０.１
％Ｂｒｉｊ、５％（ｖ／ｖ）プロテアーゼ阻害剤カクテル、１ｍＭオルトバナジ
ウム酸ナトリウム）に再懸濁させ、音波処理により細胞を溶解し、１００,００
０×ｇで３０分間遠心分離した。上清を、洗浄バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−Ｃl、pＨ ７.０、１０ｍＭ ＭgＣl_２、１００ｍＭ ＮaＣl_２、１ｍＭ ＤＴＴ
、０.５％（ｖ／ｖ）プロテアーゼ阻害剤カクテル、１ｍＭオルトバナジウム酸
ナトリウム）中で平衡化させたビーズであるＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ ４Ｂに添加した。該混合物を３０分間揺動した。ＧＳＴ−Ｃｈｋ１
を結合した樹脂を５００×ｇで５分間回転させ、洗浄バッファー１４ｍｌで洗浄
した。ビーズを上記のとおり回転させ、洗浄バッファー１４ｍｌに再懸濁させた
。懸濁液をカラムに移し、充填し、次いで、洗浄バッファーを重力により流通さ
せた。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃl（pＨ８.０）中の１０ｍＭグルタチオンを用いて
該カラムからＧＳＴ−Ｃｈｋ１をフラクション５００ｕｌずつにて溶離させた。
ビオ−ラド（Bio-Rad）のタンパクアッセイキットを説明書に従って用いてフラ
クションのタンパク濃度を測定した。ＧＳＴ−Ｃｈｋ１を含有するフラクション
をプールし、〜０.５ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈し、透析バッファー（２０ｍＭ Ｈ
ＥＰＥＳ、pＨ ７.０、１ｍＭ 酢酸マンガン、１００ｍＭ ＮaＣl_２、０.０５％
Ｂｒｉｊ−３５、１０％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ、０.２％（ｖ／ｖ）プロ
テアーゼ阻害剤カクテル、１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム）にて４℃で４
時間透析した。該タンパクのアリコートを取り、−８０℃で貯蔵した。

【００４４】 細胞周期実験： 細胞作用を考える薬物実験を、Ｈｅｌａ Ｓ３付着細胞系にて行った。細胞を
十分に低い濃度で平板培養して２４時間後に集密度１０〜２０％となった（典型
的には、細胞２×１０^５個／１５ｃｍ ｅ３）。次いで、反復チミジンブロック
により細胞をＳ期に同調させた。すなわち、細胞を２ｍＭチミジンで１８時間処
理し、３回の洗浄により８時間離脱させ、次いで、再度、チミジンで処理した。
２回目のチミジンからの離脱を行った後、細胞の９５％がＳ期であった。次いで
、同調させた細胞を、５０ｎＭトポテカン（アポトーシスを誘発させずに初期Ｇ
２期に細胞を休止させるのに十分であることを本発明者らが見出した用量）のよ
うなＤＮＡ損傷薬を単独でおよび試験化合物と組み合わせて含有する完全培地に
１８時間まで戻した。次いで、細胞周期プロフィールを、核のプロピジニウム・
ヨージド染色法を用いてサイトメトリーにより行った。（Vindelov et al, Cyto
metry Vol. 3, No. 5, 1983, 323-327）。ＣＨＫ１阻害物質は、ＤＮＡ損傷薬に
より引き起こされるＧ２休止を逆転させると考えられる。かかる活性についての
典型的な濃度範囲は、０.００１〜１０ｕＭである。

【００４５】 増殖／アポトーシス実験： 増殖実験は、Ｈｅｌａ Ｓ３、ＨＴ２９、およびＪｕｒｋａｔを包含する種々
の付着細胞系および非付着細胞系にて行った。増殖アッセイは、代謝活性細胞に
よるテトラゾリウム試薬ＸＴＴのホルマザン生成物への還元により引き起こされ
る比色変化を用いた（Scudiero et al. Cancer Research, 48, 1981, 4827-4833
）。細胞を１００ｕｌにて９６ウェルプレートにほぼ１０％の集密度に播き（細
胞濃度は細胞系により変わる）、２４時間増殖させた。次いで、十分なビヒクル
を含有する培地を用いるかまたは用いずに化合物を添加して、０.２％ＤＭＳＯ
中、化学試薬を含有する最終容量２００ｕｌに細胞を増量させた。細胞に、３７
℃、５％ＣＯ_２で、複数の濃度のＤＮＡ損傷性抗増殖薬（例えば、トポテカン）
、試験化合物、およびコンビネーション処理を与えた。７２時間後、各ウェルに
ＸＴＴ／フェナジン・メトスルフェート混合物５０ｕｌを添加し、細胞を９０分
間インキュベートした。プレートを４５０ｎｍで測定し、抗増殖作用をビヒクル
処理細胞と比較した。ＣＨＫ１阻害物質は、ＤＮＡ損傷性化学療法薬の細胞毒性
を増強すると考えられる。かかる活性についての典型的な濃度範囲は、０.００
１〜１０ｕＭである。細胞増殖または細胞毒性についての他のアッセイもまた試
験化合物と一緒に用いることができ、これらのアッセイは、当業者に知られてい
る。

【００４６】 Ｃｈｋ１キナーゼアッセイ： ９６ウェルＦｌａｓｈｐｌａｔｅ（バージニア州アーリントン・ハイツのアマ
シャム（Amersham））の各ウェルを、ＰＢＳで希釈したＧＳＴ−ｃｄｃ２５Ｃ融
合タンパク１ｕｇでコーティングした。プレートを４℃で一夜インキュベートし
、ＰＢＳで２回洗浄し、３７℃で５〜３０分間乾燥させた。ＤＭＳＯビヒクルま
たは化合物を２ｕｌ／ウェルとして添加した後、０.１ｕＣi／ウェルの[^３３Ｐ]
−γＡＴＰおよび１０ｕＭの冷ＡＴＰ、ならびに２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（pＨ ７.
４）、５０ｍＭ ＫＣl、１０ｍＭ ＭgＣl_２、１ｍＭ ＥＧＴＡ、０.５ｍＭ ＤＴ
Ｔを含有するキナーゼ反応バッファーを添加した。該反応をＧＳＴ−ＣＨＫ１（
０.５ｕｇ／ウェル）の添加により開始し、時間対リン酸化プロットが直線にな
るように予め決定した時間、該反応を行った。同量（５０ｕＬ）の５０ｍＭ Ｅ
ＤＴＡを添加して反応を停止した。プレートをＰＢＳで４回洗浄し、３０℃で３
０分間乾燥させ、液体シンチレーションカウンターに付すことにより定量化した
。試験化合物がＣＨＫ１活性を阻害すると予想される典型的な濃度範囲は、０.
００１〜１０ｕＭである。

【００４７】 本発明の化合物を配合する医薬用途用の製剤は、種々の剤形で、多種多様の賦
形剤を用いて調製することができる。かかる製剤の冷としては、以下のものが挙
げられる。

【００４８】 実施例２ 吸入製剤： 式（Ｉ）で示される化合物（１ｍｇ〜１００ｍｇ）を定量型吸入器からエアゾ
ール化して、使用当たり所望量の薬物をデリバリーする。

【００４９】 実施例３ 錠剤製剤： 錠剤／成分 錠剤当たり １． 有効成分 ４０ｍｇ （式（Ｉ）で示される化合物） ２． コーンスターチ ２０ｍｇ ３． アルギン酸 ２０ｍｇ ４． アルギン酸ナトリウム ２０ｍｇ ５． ステアリン酸マグネシウム １.３ｍｇ

【００５０】 錠剤製剤の調製方法： 成分１、２、３および４を適当なミキサー／ブレンダーでブレンドする。該ブ
レンドに充分量の水を、添加ごとに注意深く混合しながら、塊を湿顆粒に変える
ことができるようなコンシステンシーを有するまで滴下する。湿塊を、Ｎo.８メ
ッシュ（２.３８ｍｍ）スクリーンを用いて振動造粒器に通して顆粒に変える。
次いで、湿顆粒を１４０°Ｆ（６０℃）のオーブン中で乾燥するまで乾燥させる
。乾燥顆粒をＮo.５の成分で滑沢処理し、滑沢処理した顆粒を適当な打錠器で圧
縮する。

【００５１】 実施例４ 非経口製剤 加熱しながら適当な量の式（Ｉ）で示される化合物をポリエチレングリコール
に溶解することにより非経口投与用医薬組成物を調製する。次いで、この溶液を
注射溶液で希釈する（１００ｍＬに）。次いで、該溶液を、０.２２ミクロン膜
フィルターで濾過滅菌し、無菌容器中に密封する。

【００５２】 本明細書にて引用した特許および特許出願を包含するがこれらに限定されない
全ての刊行物は、個々の刊行物が十分に開示されているかの如く具体的かつ個別
的に出典明示により本明細書の一部とすることが明示されているかのように出典
明示により本明細書の一部とする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 29/00 Ａ６１Ｐ 29/00 １０１ １０１ 35/00 35/00 35/02 35/02 43/00 １１１ 43/00 １１１ // Ｃ０７Ｄ 491/22 Ｃ０７Ｄ 491/22 (72)発明者 モーリーン・エル・ホー アメリカ合衆国19426ペンシルベニア州カ レッジビル、シェリー・ドライブ218番 (72)発明者 クリスティーナ・エス・インバージア アメリカ合衆国19468ペンシルベニア州ロ イヤーズフォード、アビー・ドライブ143 番 (72)発明者 エイミー・ケイ・ロシャック アメリカ合衆国19403ペンシルベニア州ノ リスタウン、グリーン・リッジ・ドライブ 3004番 (72)発明者 マリア・アンパロ・ラゴ アメリカ合衆国19403ペンシルベニア州オ ーデュボン、ポンドビュー・ドライブ701 番 Ｆターム(参考） 4C050 AA02 BB04 CC10 DD07 EE03 FF01 FF02 GG03 HH01 4C086 AA01 CB22 MA01 MA04 NA14 ZA33 ZA36 ZA96 ZB11 ZB15 ZB21 ZB26 ZB27 ZC35

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ｃｈｋ１キナーゼ活性の阻害を必要とする対象に有効量の下
   記式（Ｉ）： 【化１】 ［式中、 Ｘは、Ｎ、ＳまたはＯＨであり； Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４は、独立して、Ｃ_１−６アルキル、ＯＨまたはＳ
   ＨまたはＨを表す］ で示される化合物を投与することを含むｃｈｋ１キナーゼ活性の阻害方法。
2. 【請求項２】 Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４が独立してＣ_１−３アルキルま
   たはＨを表す請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４がＨを表す請求項２記載の方法
   。
4. 【請求項４】 化合物が９,１０,１１,１２−テトラヒドロ−９,１２−エポ
   キシ−１Ｈ−ジインドロ[１,２,３−ｆｇ:３',２',１'−ｋｌ]ピロロ[３,４−ｉ
   ][１,６]ベンゾジアゾシン−１,３(２Ｈ)−ジオンである請求項３記載の方法。
5. 【請求項５】 白血病、充実性腫瘍性癌、癌転移、リンパ腫、軟部組織癌、
   脳癌、食道癌、胃癌、膵癌、肝癌、肺癌、膀胱癌、骨癌、前立腺癌、卵巣癌、子
   宮頚癌、子宮体癌、精巣癌、腎臓癌、頭部癌および頚部癌、慢性炎症性増殖性疾
   患、増殖性心血管疾患、増殖性眼障害および良性高増殖性疾患からなる群から選
   択される疾患または障害の治療方法であって、かかる治療を必要とする対象に有
   効量の請求項１記載の化合物を投与することを含む方法。
6. 【請求項６】 疾患または障害が乾癬、慢性関節リウマチ、糖尿病性網膜症
   および血管腫からなる群から選択される請求項４記載の方法。