JPWO2006082866A1 - p53の機能異常の検出方法、癌の分子診断方法及び癌治療に有効な化合物の評価方法 - Google Patents

p53の機能異常の検出方法、癌の分子診断方法及び癌治療に有効な化合物の評価方法 Download PDF

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Abstract

被検組織又は被検細胞に於ける、CARS、MOCOS、TNFRSF9、LOC56901及びGEF−H1からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子又は該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現量を測定する工程と、該遺伝子の発現量と正常組織又は正常細胞における対応遺伝子の発現量とを比較する工程と、比較した結果、被検組織又は被検細胞における遺伝子の発現量が正常組織又は正常細胞における遺伝子の発現量より有意に多いか否かを判断する工程と、を含む方法により、p53の機能異常の検出や癌の分子診断を行う。本発明の分子診断方法により、p53の変異の有無にかかわらず、また、p53の変異を直接検出することなくp53の機能異常を検出することや、かかる機能異常に起因する癌の診断を行うことが可能となる。

Description

本発明は、所定の遺伝子の発現等を測定することにより癌抑制遺伝子p53の機能異常の検出や癌の診断を行う方法に関する。また、所定の遺伝子の発現量等に基づいて化合物の評価を行う方法に関する。
近年、ヒトゲノム計画の進展により、薬物感受性の個人差を遺伝子レベルで理解し、医薬の開発に応用する薬理ゲノミクス(Pharmacogenomics)が急速に進展している。薬物感受性の個人差を遺伝子レベルで判断できるようになれば、副作用の強い医薬を真に薬効の期待できる患者だけに投与することや、試行錯誤的な投薬を実施することなく、治療の初期から適切な投薬を実施する、いわゆるオーダーメイド医療が可能となる。その結果、患者に無用の肉体的負担を負わせることもなくなり、また、近年高騰する傾向にある医療費の削減にも寄与することとなる。中でも、抗癌剤は非常に強い副作用を有する場合が多く、オーダーメイド医療が強く望まれている。
また、個々人の疾患関連遺伝子の分子レベルでの解析が可能となることによって、同じ疾患であっても原因となるメカニズムが異なる場合に、そのメカニズムに応じた治療や予防を行うことが可能となる。
一方、癌抑制遺伝子として知られるp53は、当初、腫瘍ウイルスであるSV40のT抗原と複合体を形成する分子として発見された(J.Virol.、第31巻、463頁、1979年:非特許文献1)。その後、p53遺伝子が多くの癌で欠失が見られる17番染色体の短腕(17p13)に存在し、対立遺伝子の双方が欠失と変異により不活性化されている癌抑制遺伝子であることが明らかとなった(N.Engl.J.Med.、第319巻、525頁、1988年:非特許文献2)。また、その遺伝子産物は393アミノ酸からなる転写制御因子で、4量体を形成して機能することが明らかとなっている。さらに、細胞周期に関与するp21、14−3−3、アポトーシスに関与するbax、PIG3、GADD45等、非常に多くの遺伝子がp53の標的遺伝子として同定されており、p53に異常が生じることにより標的遺伝子の転写制御に異常を来たすと考えられる。
実際、p53遺伝子の変異は、肺癌では70%、胃癌では45%、乳癌では30%、大腸癌では65%、膀胱癌では61%、膵臓癌では70%にのぼることが明らかとなっており(実験医学、第19巻、135頁、2001年:非特許文献3)、他の癌抑制遺伝子と比較しても顕著に高い。すなわち、p53遺伝子の変異による機能異常が癌の発症に大きな影響を及ぼしているといえる。
このような状況の下、p53遺伝子の変異や機能異常と疾患との関連に関する研究が盛んになされている。例えば、Soussiらは15000例以上にのぼるp53の変異をデータベース化しており(http://p53.curie.fr/:Nucleic Acids Res.、第22巻、3551頁、1994年:非特許文献4)、p53のDNA結合ドメイン領域内に位置するコドン175、245、248、273等には変異が頻発することを示している。また、ある種の肝細胞癌では、DNA結合ドメイン内のコドン249にはArgからSerへの変異が認められることが明らかにされている(Nature、第350巻、427頁、1991年:非特許文献5)。また、紫外線によって生じる皮膚癌においてもp53遺伝子中のCCがチミンダイマー化していることが報告されている(PNAS、第88巻、10124頁、1991年:非特許文献6)。
J.Virol.、第31巻、463頁、1979年 N.Engl.J.Med.、第319巻、525頁、1988年 実験医学、第19巻、135頁、2001年 Nucleic Acids Res.,第22巻、3551頁、1994年 Nature、第350巻、427頁、1991年 PNAS、第88巻、10124頁、1991年 Mol.Carcinogenesis、第19巻、243頁、1997年
しかしながら、p53の変異が必ずしも機能異常や疾患の原因となるわけではなく、変異が生じていてもp53の機能には何ら影響を及ぼさない場合もある。例えば、Li−QunJiaらは、酵母を用いた実験で、リンパ腫由来のA3/KAW細胞にはp53のコドン213及び234にミスセンス変異がありながら、転写活性には異常が認められなかったことを明らかにしている(Mol.Carcinogenesis、第19巻、243頁、1997年:非特許文献7)。このような場合には、p53の変異を検出しても機能異常や疾患との関連を推測することができないという問題があった。
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、p53の変異の有無にかかわらず、また、p53の変異を直接検出することなくp53の機能異常を検出することや、かかる機能異常に起因する癌の診断を行う方法等を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、特定の遺伝子群の発現量がp53の機能異常とリンクして増減することを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明のp53の機能異常の検出方法は、被検組織又は被検細胞に於ける、CARS、MOCOS、TNFRSF9、LOC56901及びGEF−H1からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子又は当該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現量を測定する工程と、当該遺伝子の発現量と正常組織又は正常細胞における対応遺伝子の発現量とを比較する工程と、比較した結果、被検組織又は被検細胞における遺伝子の発現量が正常組織又は正常細胞における遺伝子の発現量より有意に多いか否かを判断する工程と、を含むことを特徴とする。
ここで、前記遺伝子がCARS又はGEF−H1であることが好ましい。かかる遺伝子を用いることにより、より精度高くp53の機能異常を検出することが可能となる。
また、本発明の癌の分子診断方法(癌の評価又は判定方法)は、被検組織又は被検細胞における、CARS、MOCOS、TNFRSF9、LOC56901及びGEF−H1からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子又は該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現量を測定する工程と、当該遺伝子の発現量と正常組織又は正常細胞における対応遺伝子の発現量とを比較する工程と、比較した結果、被検組織又は被検細胞における遺伝子の発現量が正常組織又は正常細胞における遺伝子の発現量より有意に多いか否かを判断することによりp53の機能異常を予測する工程と、を含むことを特徴とする。
ここで、前記遺伝子がCARS又はGEF−H1であることが好ましい。かかる遺伝子を用いることにより、より精度高く癌の分子診断を行うことが可能となる。
また、本発明の薬剤感受性の判定方法は、被検組織又は被検細胞における、CARS、MOCOS、TNFRSF9、LOC56901及びGEF−H1からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子又は当該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現量を測定する工程と、当該遺伝子の発現量と正常組織又は正常細胞における対応遺伝子の発現量とを比較する工程と、比較した結果、被検組織又は被検細胞における遺伝子の発現量が正常組織又は正常細胞における遺伝子の発現量より有意に多いか否かを判断することによりp53の機能異常を予測する工程と、を含むことを特徴とする。
ここで、前記遺伝子がCARS又はGEF−H1であることが好ましい。かかる遺伝子を用いることにより、より精度高く薬剤感受性の判定をすることが可能となる。
さらに、本発明は、上記薬剤感受性の判定方法によって得られた結果に基づき投与する抗癌剤を選択する抗癌剤の投与方法(抗癌剤の選択方法)をも包含する。
また、本発明の癌診断キット(検出キット、p53の機能異常の検出キット)は、CARS、MOCOS、TNFRSF9、LOC56901及びGEF−H1からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現を測定する発現測定手段と、当該遺伝子の発現を検出する検出手段と、を含むことを特徴とする。
ここで、前記発現測定手段が、マイクロアレイ、PCR用プライマーからなる群より選択されるいずれか一つであることが好ましい。
また、本発明の癌治療に有効な化合物の評価方法は、被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる工程と、当該被検動物又は被検細胞中における、CARS、MOCOS、TNFRSF9、LOC56901及びGEF−H1からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子又は当該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現量を測定する工程と、当該発現量を被検化合物の投与又は接触前と比較する工程と比較した結果、被検化合物の投与又は接触によって当該遺伝子の発現量が有意に変化したことを確認する工程と、を含むことを特徴とする。
ここで、前記遺伝子がGEF−H1であることが好ましい。かかる遺伝子を使用することにより、より精度高く化合物の評価を行うことが可能となる。
さらに、本発明の癌治療に有効な化合物の評価方法は、被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる工程と、当該被検化合物が、CARS、MOCOS、TNFRSF9、LOC56901及びGEF−H1からなる群より選択される少なくとも一つのタンパク質又は当該タンパク質と機能的に等価なタンパク質の活性を測定する工程と、当該活性の値を被検化合物の投与又は接触前と比較する工程と、比較した結果、投与又は接触前後で当該タンパク質の活性が有意に変化しているか否かを確認する工程と、を含むことを特徴とする。
ここで、前記タンパク質がGEF−H1であることが好ましい。かかる遺伝子を使用することにより、より精度高く化合物の評価を行うことが可能となる。
本発明によれば、p53の変異を直接検出することなく、また、被験者に負担をかけることなくp53の機能異常を検出することや、かかる機能異常に起因する癌の診断を行うことが可能となる。さらに、本発明によれば、p53が関与する癌の治療に有効な化合物の評価が可能となる。
図1は、各種組換えp53変異体の発現をタンパク質レベルで確認した図である。 図2は、各種組換えp53変異体の発現をmRNAレベルで確認した図である。 図3は、各種組換えp53変異体とp21の発現との関係を示す図である。 図4は、各種p53変異体の発現とGEF−H1の発現量との関係を示す図である。 図5は、p53変異体の発現誘導によって活性化されるGEF−H1と、GEF−H1の発現によって活性化されるRhoAとの関係を示す図である。 図6は、種々の癌細胞におけるGEF−H1の発現量を示す図である。図中、□は変異型p53を発現する癌細胞を示し、△は野生型p53を発現する癌細胞を示す。 図7は、野生型p53を発現するHCT116細胞についてGEF−H1の発現を抑制した場合の3日後の生細胞率を示す図である。□は対照(Scramble)を示し、◇はGEF−H1siRNAを導入した場合の生細胞率を示す。 図8は、野生型p53を発現するA427細胞についてGEF−H1の発現を抑制した場合の3日後の生細胞率を示す図である。□は対照(Scramble)を示し、◇はGEF−H1siRNAを導入した場合の生細胞率を示す。 図9は、野生型p53を発現するRT4細胞についてGEF−H1の発現を抑制した場合の3日後の生細胞率を示す図である。□は対照(Scramble)を示し、◇はGEF−H1siRNAを導入した場合の生細胞率を示す。 図10は、変異型p53を発現するUMCU3細胞についてGEF−H1の発現を抑制した場合の3日後の生細胞率を示す図である。□は対照(Scramble)を示し、◇はGEF−H1siRNAを導入した場合の生細胞率を示す。 図11は、変異型p53を発現するSK−OV3細胞についてGEF−H1の発現を抑制した場合の3日後の生細胞率を示す図である。□は対照(Scramble)を示し、◇はGEF−H1siRNAを導入した場合の生細胞率を示す。 図12は、変異型p53を発現するES−2細胞についてGEF−H1の発現を抑制した場合の3日後の生細胞率を示す図である。□は対照(Scramble)を示し、◇はGEF−H1siRNAを導入した場合の生細胞率を示す。
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
先ず、本発明にかかる用語について説明する。
本発明における「被検組織」とは、癌の検査対象となる生体から抽出可能な組織であり、p53の関与を検討する必要のある癌組織や、癌診断の必要があると認められる組織であればその種類は特に限定されない。かかる組織の例としては、例えば、神経芽腫、網膜芽細胞腫、脳腫瘍、頭頸部癌、下垂体腺腫、神経膠腫、聴神経鞘腫、口腔が癌、咽頭癌、喉頭癌、甲状腺癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、肝臓癌、膵臓癌、膵内分泌腫瘍、胆道癌、陰茎癌、外陰癌、腎盂尿管癌、腎臓癌、精巣癌、前立腺癌、膀胱癌、子宮癌、絨毛性疾患、膣癌、卵巣癌、卵管癌、卵巣胚細胞腫瘍、皮膚癌、菌状息肉症、悪性黒色腫、軟部肉腫、骨腫瘍、悪性リンパ腫、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、リンパ浮腫由来の組織が挙げられる。
また、本発明における「被検細胞」も同様に、癌の検査対象となる生体から抽出可能な組織であり、p53の関与を検討する必要のある癌組織由来の細胞や、癌診断の必要があると認められる組織由来の細胞であればその種類は特に限定されない。かかる細胞の例としては、例えば、神経芽腫、網膜芽細胞腫、脳腫瘍、頭頸部癌、下垂体腺腫、神経膠腫、聴神経鞘腫、口腔が癌、咽頭癌、喉頭癌、甲状腺癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、肝臓癌、膵臓癌、膵内分泌腫瘍、胆道癌、陰茎癌、外陰癌、腎盂尿管癌、腎臓癌、精巣癌、前立腺癌、膀胱癌、子宮癌、絨毛性疾患、膣癌、卵巣癌、卵管癌、卵巣胚細胞腫瘍、皮膚癌、菌状息肉症、悪性黒色腫、軟部肉腫、骨腫瘍、悪性リンパ腫、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、リンパ浮腫由来の細胞が挙げられる。
次に、本発明において被検対象となる遺伝子、CARS遺伝子、MOCOS遺伝子、TNFRSF9遺伝子、LOC56901遺伝子及びGEF−H1遺伝子について説明する。
CARS遺伝子(cysteinyl−tRNA synthetase:NM_001751:配列番号1)によりコードされるタンパク質は、細胞質に存在する酵素であり、tRNAのアミノアシル化を触媒する。また、CARS遺伝子は、癌抑制遺伝子の存在部位として知られる染色体の11p15.5に存在することが明らかにされている(Genomics、第15巻、692頁、1993年)。
MOCOS遺伝子(molybdenum cofactor sulfurase:NM_017947:配列番号2)は、キサンチン尿症の原因遺伝子として同定された(Biochem.Biophys.Res.Commun.、第282巻、1194頁、2001)。MOCOSは、コード領域2667塩基、888アミノ酸からなる分子である。
TNFRSF9遺伝子(tumor necrosis factor receptor superfamily, member 9:NM_001561:配列番号3)によりコードされるタンパク質は、Tumor necrosis factor(TNF)受容体ファミリーに属し、T細胞の増殖を阻害し、アポトーシスを誘導することが知られている(Eur J.Immunol.、第9巻、2219頁、1994年)。
GEF−H1遺伝子(Rho guanine exchange nucleotide factor−H1:NM_004723:配列番号4)によりコードされるタンパク質は、癌遺伝子と知られるRhoに結合し、不活性型のRho−GDPから活性型のRhoに変換する酵素として知られている(J. Biol Chem.、第273巻、34954頁、1998年)。
LOC56901遺伝子(NM_020142:配列番号5)によりコードされるタンパク質は、電子をNADHから電子伝達系に輸送する酸化還元酵素NDUFA4のホモログとして知られる(Proc Natl Acad Sci USA.、第99巻、16899頁、2002年)。
本発明において使用されるCARS、MOCOS、TNFRSF9、LOC56901又はGEF−H1は、これらの遺伝子と機能的に等価な遺伝子であってもよい。
ここで、「CARS、MOCOS、TNFRSF9、LOC56901及びGEF−H1からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子と機能的に等価な遺伝子」とは、当該遺伝子と塩基配列は異なるものの、比較的高い相同性を示し、それぞれのタンパク質と同じ又は類似の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を示す。ここで、前記相同性は、機能的に等価であれば特に制限はないが、塩基配列の相同性が70〜100%であることが好ましく、80〜100%であることがより好ましく、90〜100%であることが特に好ましい。相同性が前記下限より低い場合には対応する遺伝子と同じ又は類似の機能を示さない可能性が高い傾向にある。しかしながら、相同性が前記下限未満であっても、対応する遺伝子に特有の機能を有するドメインと、当該ドメインに対応する塩基配列との相同性が高い場合には同じ又は類似の機能を有する場合がある。このような遺伝子は、塩基配列の相同性が前記範囲外であっても好適に使用可能である。また、比較的相同性の高い遺伝子とは、CARS、MOCOS、TNFRSF9、LOC56901又はGEF−H1における1又は2以上の塩基が自然若しくは人為的に置換、欠失、付加及び/又は挿入した遺伝子であってもよい。
次に、本発明のp53の機能異常の検出方法について説明する。
本発明のp53の機能異常の検出方法は、被検組織における、CARS、MOCOS、TNFRSF9、LOC56901及びGEF−H1からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現量を測定する工程と、当該遺伝子の発現量と正常組織における対応遺伝子の発現量とを比較する工程と、比較した結果、被検組織における遺伝子の発現量が正常組織における遺伝子の発現量より有意に多いか否かを判断する工程とを含むことを特徴とする。
本発明において、先ず、被検組織における、CARS、MOCOS、TNFRSF9、LOC56901及びGEF−H1からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現量を測定する。遺伝子の発現量の測定の方法としては特に制限はないが、例えば、被検組織から抽出したゲノミックDNAを鋳型としてRT−PCRを行う方法、前記遺伝子がプロットされたマイクロアレイを用いる方法、ノーザンブロットが挙げられる。ここで、遺伝子の「発現量」とは、遺伝子転写産物の絶対量又は相対量をいい、相対量の場合は、後述する正常組織における発現量との相対的な比較において当該遺伝子の発現量を決定すればよい。
また、本工程において、発現量を測定する遺伝子は一種である必要はなく、二種以上の遺伝子の発現を測定した結果よりp53の機能異常を総合的に判断してもよい。
次に、上記の方法により測定した遺伝子の発現量と正常組織における対応遺伝子の発現量とを比較する。
ここで、「正常組織又は正常細胞」とは、被検組織又は被検細胞と比較の対象となる組織又は細胞であればその由来は特に限定されず、健常人由来であっても癌患者由来であってもよい。また、癌組織の近辺に存在する正常組織又は正常細胞であってもよい。
本工程においては、被検組織又は細胞に発現するCARS、MOCOS、TNFRSF9、LOC56901又はGEF−H1遺伝子と正常組織又は細胞に発現するこれらの遺伝子(対応遺伝子)の発現量を比較するが、発現量の絶対量を比較してもよく、また、比較による相対値を算出してもよい。
次に、比較した結果、被検組織又は被検細胞における遺伝子の発現量が正常組織又は正常細胞における遺伝子の発現量より有意に多いか否かを判断する。
前記の有意差の判断手法としては特に制限はないが、当業者に公知の統計学的手法を用いて検定すればよい。
被検組織又は被検細胞と、正常組織又は正常細胞における前記遺伝子の発現量の比較の結果、有意差をもって被検組織又は被検細胞において発現が高いと認められた場合には当該被検組織又は被検細胞におけるp53に機能異常が認められると判断できる。この場合のp53の機能異常としては、p53遺伝子における塩基の欠失(例えばナンセンス変異)、置換(例えば、ミスセンス変異、ポイントミューテーション)、挿入、フレームシフト等が考えられるが、本発明の対象としては、機能異常の原因は特に限定されず、これらのいずれが原因となった機能異常も含まれる。
また、p53の機能異常の具体例としては、p53タンパク質の転写活性が低下又は活性化する場合や、転写が全く起こらない場合が挙げられるが、活性には異常を認めないがコードされる遺伝子には変異を生じている場合も含まれる。
次に、本発明の癌の分子診断方法(癌の評価又は判定方法)について説明する。
本発明の癌の分子診断方法は、被検組織又は被検細胞における、CARS、MOCOS、TNFRSF9、LOC56901及びGEF−H1からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現量を測定する工程と、当該遺伝子の発現量と正常組織又は正常細胞における対応遺伝子の発現量とを比較する工程と、比較した結果、被検組織又は被検細胞における遺伝子の発現量が正常組織又は正常細胞における遺伝子の発現量より有意に多いか否かを判断することによりp53の機能異常を予測する工程と、を含む。
本発明の癌の分子診断方法の手順としては、p53の機能異常を検出するまでは上述したp53の機能異常の検出方法と同様に行う。当該方法によってp53の機能異常が検出された場合、被検組織又は被検細胞がp53の異常によって生じる癌由来の組織又は細胞であると判断できる。すなわち、被検組織又は被検細胞が由来する組織においてp53の異常により生じることが知られている癌種を特定することができる。具体的には、例えば、p53との関与が示唆されているLi−Fraumeni Syndrome(Science、第250巻、1233頁、1990年)、肝細胞癌(Nature、第350巻、377頁、1991年)、骨原性肉腫(Proc Natl Acad Sci USA,第84巻、7716頁、1987年)、横紋筋肉種(Proc Natl Acad Sci USA、第87巻、5863頁、1990年)、結腸癌(Science、第244巻、217頁、1989年)、肺癌(Science、第246年、491頁、1989年)、グリア芽細胞腫(Am. J. Hum. Genet.、第47巻(suppl.)、A4、1990年)、食道癌(Proc Natl Acad Sci USA、第87巻、9958頁、1990年)、膀胱癌(Science、第252巻、706頁、1991年)、扁平上皮癌(Proc Natl Acad Sci US、第88巻、10124頁、1991年)、子宮頚癌(Lancet、第339巻、1070頁、1992年)、肺癌(Proc Natl Acad Sci USA、第89巻、7262頁、1992年)、白血病・リンパ腫(J Clin Invest.、第90巻、653頁、1992年)等と、被検組織又は被検細胞との関係を診断することが可能となる。
次に、本発明の薬剤感受性の判定方法について説明する。
本発明の薬剤感受性の判定方法は、被検組織又は被検細胞における、CARS、MOCOS、TNFRSF9、LOC56901及びGEF−H1からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現量を測定する工程と、当該遺伝子の発現量と正常組織又は正常細胞における対応遺伝子の発現量とを比較する工程と、比較した結果、被検組織又は被検細胞における遺伝子の発現量が正常組織又は正常細胞における遺伝子の発現量より有意に多いか否かを判断することによりp53の機能異常を予測する工程と、を含む。
本発明の癌の分子診断方法の手順としては、p53の機能異常を検出するまでは上述したp53の機能異常の検出方法と同様に行う。当該方法によってp53の機能異常が検出された場合、被検組織又は被検細胞がp53の異常によって生じる癌由来の組織又は細胞であると判断できる。すなわち、p53と薬効との関係が知られている薬剤について、その薬剤を投与した場合にどの程度の薬効が期待できるか、あるいは、どのような副作用が生じるかといった薬剤感受性を予測することができる。その結果、副作用が予想される薬剤の投与は避け、有効であると予想される薬剤を選択的に投与することが可能となる。このようなp53と薬効との関係が知られている薬剤としては、例えば、ドキソルビシンやアントラサイクリン系の抗癌剤が挙げられ、p53のDNA結合領域に遺伝子変異が存在することにより生じる肺癌とこれらの抗癌剤の応答性に一定の関係があることが示唆されている(Nat Med、第2巻、811頁、1996年)。しかしながら、本発明の薬剤感受性の判定方法において対象となる薬剤は前記抗癌剤に限定されず、あらゆる抗癌剤についてp53との関連を検討あるいは調査したうえで、薬剤感受性の判断をおこなえばよい。
すなわち、本発明の薬剤感受性の判定方法により、被検組織又は被検細胞がp53の関与する癌細胞を含むことが明らかとなった場合に、被検体にこれらの抗癌剤の投与が有効かどうか判断できることとなり、投与すべきかどうかの判定が可能となる。また、当該判定によって適切な薬剤を選択し、投与することにより、副作用を抑え、治療効果の高い投薬を行うことが可能となる。
また、本発明は、CARS、MOCOS、TNFRSF9、LOC56901及びGEF−H1からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現を測定する発現測定手段と、当該遺伝子の発現を検出する検出手段と、を含む癌診断キットをも提供する。
CARS、MOCOS、TNFRSF9、LOC56901及びGEF−H1からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現を測定する発現測定手段としては特に制限はないが、例えば、当該遺伝子を増幅するためのプライマー、当該遺伝子がプロットされたマイクロアレイ、ノーザンブロット用のプローブが挙げられる。また、当該遺伝子の発現を検出する検出手段としても特に制限はないが、例えば、ノーザンブロット用のプローブを可視化するための蛍光標識試薬やラジオアイソトープ標識試薬が挙げられる。
このような癌診断キットを使用することにより、被検組織や被検細胞からゲノムDNAを抽出して塩基配列を確認することによりp53の変異を検出するという工程を経ることなく、簡易・迅速にp53が関与する癌の診断をすることが可能となる。
次に、本発明の化合物の評価方法について説明する。
本発明の第一の化合物の評価方法は、被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる工程と、当該被検動物又は被検細胞中における、CARS、MOCOS、TNFRSF9、LOC56901及びGEF−H1からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現量を測定する工程と、当該遺伝子の発現量と、正常動物又は正常細胞における対応遺伝子の発現量とを比較する工程と、比較した結果、該被検動物又は被検組織における遺伝子の発現量が該正常動物又は正常組織における遺伝子の発現量と有意に差が認められるか否かを確認する工程と、を含むことを特徴とする。
具体的には、以下の手順で化合物の評価を行う。
先ず、被検化合物を被検動物又は被検細胞に投与又は接触させる。ここで、被検化合物としては、癌に治療、予防又は診断を目的とする薬剤候補の化合物であれば、その構造や性質は問わず、化合物種も限定されない。
また、被検化合物を被検動物に投与する方法としては特に制限はなく、その都度好適な投与方法を選択すればよいが、例えば、経口投与、非経口投与(例えば、経皮投与、筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射)が挙げられる。また、被検化合物を被検細胞に接触させる方法としても特に制限はなく、例えば、細胞と被検化合物を培養液や緩衝液(例えば、リン酸緩衝液)等の溶液中で混合し、両者を接触させる方法が挙げられる。
次に、被検動物又は被検細胞中における、CARS、MOCOS、TNFRSF9、LOC56901及びGEF−H1からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子又は該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現量を測定する。これらの遺伝子の発現量の測定方法としては、特に制限はなく、投与又は接触前を対照として、当該遺伝子の発現量の変化をRT−PCRのような遺伝子増幅法、マイクロアレイを用いる方法、ノーザンブロット等によって検出し、比較すればよい。また、発現量の測定には、前記遺伝子の発現調節領域とレポーター遺伝子との融合遺伝子を人為的に導入した動物又は細胞を用いてもよい。この場合、レポーター遺伝子としては、例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子又はグリーンフルオレッセンスプロテイン遺伝子が挙げられる。
ここで、「CARS、MOCOS、TNFRSF9、LOC56901及びGEF−H1からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子と機能的に等価な遺伝子」とは、当該遺伝子と塩基配列は異なるものの、比較的高い相同性を示し、それぞれのタンパク質と同じ又は類似の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を示す。ここで、前記相同性は、機能的に等価であれば特に制限はないが、塩基配列の相同性が70〜100%であることが好ましく、80〜100%であることがより好ましく、90〜100%であることが特に好ましい。相同性が前記下限より低い場合には対応する遺伝子と同じ又は類似の機能を示さない可能性が高い傾向にある。しかしながら、相同性が前記下限未満であっても、対応する遺伝子に特有の機能を有するドメインと、当該ドメインに対応する塩基配列との相同性が高い場合には同じ又は類似の機能を有する場合がある。このような遺伝子は、塩基配列の相同性が前記範囲外であっても好適に使用可能である。また、比較的相同性の高い遺伝子とは、CARS、MOCOS、TNFRSF9、LOC56901又はGEF−H1における1又は2以上の塩基が自然若しくは人為的に置換、欠失、付加及び/又は挿入した遺伝子であってもよい。
次に、前工程で測定した当該遺伝子の発現量を、被検化合物の投与又は接触前と比較する。すなわち、本工程では、測定対象の遺伝子の発現量が被検化合物の投与又は接触前後でどのように変化したかを確認する。比較の結果、発現量の差に有意差が認められるか否かを検討し、被検化合物の投与又は接触後でCARS、MOCOS、TNFRSF9、LOC56901又はGEF−H1の発現が優位に高い場合には化合物の効果が低いと判断し、低い場合には有効と判断する。
次に、本発明の第二の化合物の評価方法について説明する。
本発明の第二の化合物の評価方法は、被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる工程と、当該被検化合物が、CARS、MOCOS、TNFRSF9、LOC56901及びGEF−H1からなる群より選択される少なくとも一つのタンパク質又は該タンパク質と機能的に等価なタンパク質の活性を測定する工程と、当該活性の値を被検化合物の投与又は接触前と比較する工程と、比較した結果、投与又は接触前後で該タンパク質の活性が有意に変化しているか否かを確認する工程と、を含むことを特徴とする。
具体的には、以下の手順で化合物の評価を行う。
先ず、被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる。ここで、被検化合物としては、癌に治療、予防又は診断を目的とする薬剤候補の化合物であれば、その構造や性質は問わず、化合物種も限定されない。
また、被検化合物を被検動物に投与する方法としては特に制限はなく、その都度好適な投与方法を選択すればよいが、例えば、経口投与、非経口投与(例えば、経皮投与、筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射)が挙げられる。また、被検化合物を被検細胞に接触させる方法としても特に制限はなく、例えば、細胞と被検化合物を培養液や緩衝液(例えば、リン酸緩衝液)等の溶液中で混合し、両者を接触させる方法が挙げられる。
次に、被検動物又は被検細胞中における、CARS、MOCOS、TNFRSF9、LOC56901及びGEF−H1からなる群より選択される少なくとも一つのタンパク質又は該タンパク質と機能的に等価なタンパク質の活性を測定する。これらのタンパク質の活性の測定方法としては、特に制限はなく、投与又は接触前を対照として、例えば、CARSであればtRNAのアミノアシル化活性を測定すればよい。
ここで、「CARS、MOCOS、TNFRSF9、LOC56901及びGEF−H1からなる群より選択される少なくとも一つのタンパク質と機能的に等価なタンパク質」とは、当該タンパク質とアミノ酸配列は異なるものの、比較的高い相同性を示し、それぞれのタンパク質と同じ又は類似の活性を有するタンパク質を示す。ここで、前記相同性は、機能的に等価であれば特に制限はないが、アミノ酸配列の相同性が50〜100%であることが好ましく、60〜100%であることがより好ましく、70〜100%であることが特に好ましい。相同性が前記下限より低い場合には対応するタンパク質と同じ又は類似の活性を示さない可能性が高い傾向にある。しかしながら、相同性が前記下限未満であっても、対応するタンパク質に特有の機能を有するドメインと、当該ドメインに対応するアミノ酸配列との相同性が高い場合には同じ又は類似の活性を有する場合がある。このようなタンパク質は、アミノ酸配列の相同性が前記範囲外であっても好適に使用可能である。また、比較的相同性の高いタンパク質とは、CARS、MOCOS、TNFRSF9、LOC56901又はGEF−H1における1又は2以上のアミノ酸が自然若しくは人為的に置換、欠失、付加及び/又は挿入したタンパク質であってもよい。
次に、前工程で測定した当該タンパク質の活性を、被検化合物の投与又は接触前と比較する。すなわち、本工程では、測定対象の遺伝子の活性が被検化合物の投与又は接触前後でどのように変化したかを確認する。比較の結果、活性の差に有意差が認められるか否かを検討し、被検化合物の投与又は接触後でCARS、MOCOS、TNFRSF9、LOC56901又はGEF−H1の活性が優位に高い場合には効果が低いと判断し、低い場合には有効と判断する。
以上説明したような本発明の化合物の評価方法によれば、癌治療や予防に有用な化合物のスクリーニングや、これら薬剤の有効性又は安全性の評価が可能となる。
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
まず、変異型p53発現ベクタープラスミドを構築した。
野生型及びV157F、R175H、R248Qの各変異を持つp53遺伝子をドキソサイクリン誘導型ベクターpTRE−hygへクローニングした。次に、これらのp53発現ベクターを癌細胞であるU2OSへ導入し、誘導性のp53変異体発現細胞株を樹立した。
次に、野生型及び各変異型p53遺伝子を有する細胞株のp53の発現を確認した。タンパク質レベルでの発現をウエスタンブロット法にて(図1)、mRNAレベルでの発現をリアルタイムRT−PCR法にて測定した(図2)。RT−PCRに用いたプライマー及びプローブの配列は下記のとおりである。
フォワードプライマー:5’-TCCCCGGACGATATTGAACA-3’(配列番号6)
リバースプライマー:5’-GCATTCTGGGAGCTTCATCTG-3’(配列番号7)
TaqManプローブ:5’-TGGTTCACTGAAGACCCA-3’(配列番号8)。
その結果、誘導後は10倍以上の野生型及び変異体p53の発現誘導があった。
次に、これらの細胞株において導入した変異型p53により内在性のp53の機能が喪失していることを確かめた。
まず、p53の転写活性化能をp21の遺伝子発現誘導を測定することにより調べた。リアルタイムRT−PCR法に用いたプライマー及びプローブの配列は下記のとおりである。
フォワードプライマー:5’-TGGAGACTCTCAGGGTCGAAA-3’(配列番号9)
リバースプライマー:5’-GGCGTTTGGAGTGGTAGAAATC-3’(配列番号10)
TaqManプローブ:5’-CGGCGGCAGACCAGCATGAC-3’(配列番号11)。
調製した細胞株にドキソサイクリンを添加し、野生型及び変異型p53を誘導したところ、誘導後10時間において野生型p53発現細胞ではp21が10倍以上転写活性化されているのに対して、3種の変異型細胞では、全くp21の転写活性化が見られなかった(図3)。このことにより、変異型p53では、転写活性化能は失われていることが確認できた。
次に、変異型p53によって発現が誘導される遺伝子を探索するために、野生型、変異型p53発現細胞株及びコントロールのU2OS細胞株の網羅的遺伝子発現をマイクロアレイを用いて測定した。変異型p53発現誘導後0、12、15時間の各細胞からmRNAを抽出し、逆転写反応によってcDNAに変換後、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ(Affymetrix社製)でハイブリダイゼーションし、解析を行った。3種類全ての変異型p53発現細胞株で遺伝子発現が上昇している遺伝子群を次のように抽出した。すなわち、変異型p53誘導前と誘導15時間後を比較して、少なくとも一つの変異体細胞で1.5倍以上の発現上昇があり、全ての変異体で有意に発現上昇を示す遺伝子群を抽出した。また、野生型p53の発現誘導によっては、遺伝子発現は変化をしないことを条件とした。この条件下で以下の12遺伝子が抽出された。
Gene symbol: C9orf48, CCNB1IP1, MRPL46, ZNF24, CARS, MOCOS, TNFRSF9, CARS, LOC56901, GEF−H1, SFPQ, CCNL1
これらの遺伝子群の発現亢進の有無は、癌細胞においてp53の状態が野生型か変異型かを判別することに有用と考えられる。さらに、遺伝子抽出の基準値を全ての変異型p53により1.5倍以上の発現上昇を示す遺伝子群を抽出したところ、GEF−H1(Rho guanine nucleotide exchange factor H1)とCARS(cysteinyl−tRNA synthetase)の二つであった。
次にGEF−H1に注目し、変異型p53によるGEF−H1の誘導をリアルタイムRT−PCR法により確認した。用いたプライマー及びプローブの配列は下記のとおりである。
フォワードプライマー:5’-TGAGATGTACGAGGTGCACACA-3’(配列番号12)
リバースプライマー:5’-CGCACGCTCTGCTGAATG-3’(配列番号13)
TaqManプローブ:5’-CCGGGATGACCGGAGCACCTG-3’(配列番号14)。
ドキシサイクリンによるp53発現誘導後のGEF−H1発現の経時変化を調べたところ、24〜48時間後には全ての変異p53細胞株において発現量が5倍以上上昇していた(図4)。さらに、GEF−H1は癌遺伝子のRhoAを活性化することが知られているので変異型p53発現誘導後のRhoAの活性化状態を測定した。変異型及び野生型p53の発現誘導時間が24、48時間の各細胞株から、細胞抽出液を作成し全体のRhoAの発現量と活性型RhoAの量をキット(Rho activation assay kit, cytoskeleton, Inc.)を用いて次のように測定した。GST−Rhotekin−RBD (Rho Binding Domain) は活性型Rhoに結合するのでGST−Rhotekin−RBDを用いてプルダウンした。プルダウンされた活性型GTPaseはRhoA特異抗体を用いたウェスタンブロッティングで検出した。結果として、変異型p53を発現しGEF−H1が誘導されている細胞株では、RhoAの活性が5倍以上上昇していることが判明した(図5)。
次に様々なガン細胞(29種類)においてp53の変異とGEF−H1遺伝子発現量の相関を調べた。図6に示すようにGEF−H1の遺伝子発現は変異細胞株群において有意に上昇していることが判った(P<0.01)。
次に、変異型p53によるGEF−H1の発現が癌化の進行を促進しているかどうかを調べるため、野生型及び変異型p53細胞株においてGEF−H1の発現をsiRNAにて抑制し、細胞増殖能を調べた。すなわち、GEF−H1のsiRNA(Dharmacon社)をOligofectamineを用いて癌細胞へトランスフェクションし、3日後にMTT法にて生細胞率を測定した。
図7〜9(野生型p53を発現する癌細胞株)及び図10〜12(変異型p53を発現する癌細胞株)に示すように、野生型p53を発現する細胞群に比して変異型p53を発現する細胞群ではGEF−H1の発現抑制により、有意に細胞増殖能が低下していることが明らかとなった。
本発明によれば、p53の変異を直接検出することなく、また、被験者に負担をかけることなくp53の機能異常を検出することや、かかる機能異常に起因する癌の診断を行うことが可能となる。さらに、本発明によれば、p53が関与する癌の治療に有効な化合物の評価が可能となる。

Claims (13)

  1. 被検組織又は被検細胞における、CARS、MOCOS、TNFRSF9、LOC56901及びGEF−H1からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子又は該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現量(E)を測定する工程と、
    発現量(E)と、正常組織又は正常細胞における対応遺伝子の発現量(E)とを比較する工程と、
    比較した結果、発現量(E)が発現量(E)より有意に多いか否かを判断する工程と、を含むp53の機能異常の検出方法。
  2. 前記遺伝子がCARS又はGEF−H1である請求項1に記載のp53の機能異常の検出方法。
  3. 被検組織又は被検細胞における、CARS、MOCOS、TNFRSF9、LOC56901及びGEF−H1からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子又は該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現量(E)を測定する工程と、
    発現量(E)と、正常組織又は正常細胞における対応遺伝子の発現量(E)とを比較する工程と、
    比較した結果、発現量(E)が発現量(E)より有意に多いか否かを判断することによりp53の機能異常を予測する工程と、を含む癌の分子診断方法。
  4. 前記遺伝子がCARS又はGEF−H1である請求項3に記載の癌の分子診断方法。
  5. 被検組織又は被検細胞における、CARS、MOCOS、TNFRSF9、LOC56901及びGEF−H1からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子又は該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現量(E)を測定する工程と、
    発現量(E)と、正常組織又は正常細胞における対応遺伝子の発現量(E)とを比較する工程と、
    比較した結果、発現量(E)が発現量(E)より有意に多いか否かを判断することによりp53の機能異常を予測する工程と、を含む薬剤感受性の判定方法。
  6. 前記遺伝子がCARS又はGEF−H1である請求項5に記載の薬剤感受性の判定方法。
  7. 請求項5又は6に記載の薬剤感受性の判定方法によって得られた結果に基づき投与する抗癌剤を選択する抗癌剤の選択方法。
  8. CARS、MOCOS、TNFRSF9、LOC56901及びGEF−H1からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現を測定する発現測定手段と、
    該遺伝子の発現を検出する検出手段と、を含む癌診断キット。
  9. 前記発現測定手段が、マイクロアレイ及びPCR用プライマーからなる群より選択されるいずれか一つである請求項8に記載の癌診断キット。
  10. 被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる工程と、
    該被検動物又は被検細胞中における、CARS、MOCOS、TNFRSF9、LOC56901及びGEF−H1からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子又は該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現量を測定する工程と、
    該発現量を被検化合物の投与又は接触前と比較する工程と
    比較した結果、被検化合物の投与又は接触によって該遺伝子の発現量が有意に変化したことを確認する工程と、を含む癌治療に有効な化合物の評価方法。
  11. 前記遺伝子がGEF−H1である請求項10に記載の評価方法。
  12. 被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる工程と、
    該被検化合物が、CARS、MOCOS、TNFRSF9、LOC56901及びGEF−H1からなる群より選択される少なくとも一つのタンパク質又は該タンパク質と機能的に等価なタンパク質の活性を測定する工程と、
    該活性の値を被検化合物の投与又は接触前と比較する工程と、
    比較した結果、投与又は接触前後で該タンパク質の活性が有意に変化しているか否かを確認する工程と、を含む癌治療に有効な化合物の評価方法。
  13. 前記タンパク質がGEF−H1である請求項12に記載の評価方法。
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