AT504849B1 - Visualisierung von elektrophoresegelen - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Visualisieren mindestens einer Bande und mindestens eines Spots von Molekülen auf einem Elektrophorese-Gel, umfassend die Schritte:- Vorsehen eines Elektrophorese-Gels, das die mindestens eine Bande und/oder den mindestens einen Spot aufweist,- Visualisieren der mindestens einen Bande und/oder des min¬destens einen Spots unter Verwendung einer dreidimensionalen Bildgebungstechnik.

Description

österreichisches Patentamt AT 504 849 B1 2011-03-15

Beschreibung [0001] Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Visualisieren von Elektrophorese-Gelen.

[0002] Die Gel-Elektrophorese wird häufig in der Molekularbiologie, Genetik, Mikrobiologie und Biochemie zum Trennen von Nukleinsäuren, Proteinen, Glykoproteinen, Kohlehydraten usw. verwendet. Die Ergebnisse können durch Visualisieren der Bande und Spots am Gel quantitativ analysiert werden. Wenn die Bande und Spots am Gel quantitativ oder halb-quantitativ analysiert werden, wird ein Bild mit einer geeigneten Computer-betriebenen Bildgebungseinrichtung (z.B. Scanner, Kamera usw.) aufgezeichnet, und die Intensität der interessierenden Bande oder Spots wird gemessen und mit Standards oder Markern, die auf dasselbe Gel geladen sind, verglichen.

[0003] Eine spezifische Form der Gel-Elektrophorese, die üblicherweise zur Analyse von Proteinen verwendet wird, ist die zweidimensionale Gel-Elektrophorese (2-DE oder 2-D Elektrophorese). Die 2-DE macht sich die Tatsache zunutze, dass sich Proteine nicht nur hinsichtlich der Größe unterscheiden, sondern auch unabhängig von der Größe hinsichtlich des isoelektrischen Punkts. Bei der eindimensionalen Elektrophorese (1-DE oder 1-D-Elektrophorese) werden Moleküle, wie Proteine, in einer Dimension getrennt, so dass alle Moleküle, voneinander durch irgendeine Eigenschaft (z.B. Größe) getrennt, entlang einer Linie liegen. Die 2-DE beginnt mit einer eindimensionalen Gel-Elektrophorese, trennt danach aber die Moleküle gemäß einer zweiten Eigenschaft in einer Richtung 90° von der ersten. Das Ergebnis ist, dass die Moleküle über 2-D-Oberflächen ausgebreitet sind anstatt entlang einer Linie. Weil es weniger wahrscheinlich ist, dass zwei Moleküle in beiden Eigenschaften gleich sein werden, als dass sie in nur einer Eigenschaft gleich sind, werden Moleküle in 2-DE wirksamer getrennt als in der eindimensionalen Elektrophorese. Proteine können z.B. mit dieser Technik gemäß isoelektrischem Punkt und Molekularmasse getrennt werden (auch andere Trennungsparameter sind möglich).

[0004] Um Proteine aufgrund des isoelektrischen Punkts zu trennen, wird ein pH-Gradient an das Gel angelegt, und eine elektrische Spannung wird quer über das Gel angelegt, wobei ein Ende positiver gemacht wird als das andere. Bei allen anderen pH-Werten als ihrem isoelektrischen Punkt werden die Proteine geladen. Wenn sie positiv geladen werden, werden sie zum negativeren Ende des Gels hin gezogen, und wenn sie negativ geladen werden, werden sie zum positiveren Ende des Gels hin gezogen. Die in der ersten Dimension aufgetragenen Proteine bewegen sich das Gel entlang und sammeln sich an ihrem isoelektrischen Punkt.

[0005] Vor dem Trennen der Proteine gemäß der Masse können sie mit Detergentien wie Natri-umdodecylsulfat (SDS) behandelt werden. Dadurch werden die Proteine denaturiert, und eine Anzahl von SDS-Molekülen, die in etwa der Proteinlänge entspricht, wird befestigt. Weil die Länge eines Proteins (wenn es ungefaltet ist) in etwa seiner Masse entspricht, ist dies das gleiche, wie wenn man sagt, dass eine Anzahl von SDS-Molekülen in etwa proportional zur Proteinmasse befestigt wird. Da die SDS-Moleküle negativ geladen sind, ist das Ergebnis, dass alle Proteine etwa dasselbe Masse-zu-Ladungs-Verhältnis haben werden. Außerdem werden die Proteine nicht wandern, wenn sie keine Ladung haben (ein Ergebnis des isoelektrischen Fokussier-Schritts), und daher gestattet die Beschichtung des Proteins in SDS das Wandern der Proteine in der zweiten Dimension. In der zweiten Dimension wird wiederum eine elektrische Spannung angelegt, jedoch in einem 90 Grad-Winkel vom ersten Feld. Die Proteine werden proportional zu ihrem Masse-zu-Ladungs-Verhältnis von der positiveren Seite des Gels angezogen. Wie zuvor erklärt, wird dieses Verhältnis für alle Proteine nahezu gleich sein. Die Bewegung der Proteine wird durch Reibungskräfte verlangsamt. Das Gel wirkt daher wie ein Molekularsieb, wenn die Spannung angelegt ist, und trennt die Proteine auf Basis ihres Molekulargewichts, wobei größere Proteine stärker im Gel zurückgehalten werden und kleinere Proteine das Sieb schneller passieren können.

[0006] Dies führt zu einem Gel, in dessen Volumen Proteine ausgebreitet sind. Diese Proteine können dann durch vielerlei Mittel, insbesondere unter Verwendung von Farben, wie Silber, 1/21 österreichisches Patentamt AT 504 849 B1 2011-03-15

Coomassie, fluoreszierende Farben, Radioaktivität oder andere Marker, die mit einem entsprechenden Bildgebungsverfahren nachweisbar sind, visualisiert werden. Die Intensität der Färbung kann als quantitativer Indikator verwendet werden.

[0007] Die Analyse solcher 2-DE-Gele erfolgt üblicherweise mit 2-DE-Gel-Analyse-Software unter Verwendung von Abbildungen, die mit herkömmlichen Scannern oder Kameras erhalten wurden. Diese Werkzeuge sind für die Quantifizierung und Analyse gut definierter, gut getrennter Molekül-Spots und -Bande gut geeignet (z.B. Protein-Spots auf 2-DE-Gelen). Sie liefern jedoch falsche, nicht reproduzierbare und nicht auswertbare Ergebnisse mit weniger definierten, weniger getrennten Spots und Banden. Dieses Problem kann jedoch auch bei eindimensionalen Elektrophorese-Gelen auftreten.

[0008] US 5,091,652 betrifft einen Gel-Scanner und dessen Verwendung in einem Verfahren zur Detektion von DNA-Molekülen in Agarose-Gelen. Zur Detektion der Nukleinsäuren im Gel wird Fluoreszensspektroskopie verwendet, wobei mittels eines konfokalen Mikroskops die Nukleinsäuren im Gel detektiert werden.

[0009] US 6,134,002 betrifft ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop, mit dessen Hilfe unter anderem Elektrophorese-Gele untersucht werden können.

[0010] Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Verfahren vorzusehen, die die Analyse von unvollständig getrennten (überlappenden) Spots und Banden (weniger definiert und/oder getrennt), schwachen Spots und Banden („Rauschen"; z.B. „Geister-Spots") ermöglichen.

[0011] Dieses Ziel wird mit der vorliegenden Erfindung erreicht, die ein Verahren vorsieht, welches das Visualisieren von dreidimensionalen Banden und Spots auf einem Elektrophorese-Gel unter Verwendung einer dreidimensionalen Bildgebungstechnik ermöglicht.

[0012] Daher betrifft die vorliegende Erfindung ein Verahren zum Visualisieren von mindestens einer Bande und mindestens einem Spot von Molekülen auf einem Elektrophorese-Gel, welches die Schritte umfasst: [0013] - Vorsehen eines Elektrophorese-Gels, das die mindestens eine Bande und/oder den mindestens einen Spot aufweist, [0014] - Visualisieren der mindestens einen Bande und/oder des mindestens einen Spots unter Verwendung einer dreidimensionalen Bildgebungstechnik.

[0015] Herkömmliche Verfahren zum Visualisieren von Banden und Spots auf Elektrophorese-Gelen benützen einfache Abbildungen, die von Scannern und Kameras erhalten werden. Diese Art von Bildgebung ermöglicht nur ein zweidimensionales Visualisieren von Banden und Spots auf Elektrophorese-Gelen. Moderne Software-Packages und Bildgebungs-Werkzeuge inkludieren jedoch fortgeschrittenere Merkmale, welche ein dreidimensionales Bild eines Elektrophorese-Gels simulieren, ohne das Gel in seiner dritten Dimension physisch zu scannen. Diese „dreidimensionalen" Abbildungen werden aus zweidimensionalen Bildern erhalten, wobei die dritte Dimension die Intensität der Bande und Spots auf dem Elektrophorese-Gel wiedergibt. Die Intensität der Banden und Spots auf dem Elektrophorese-Gel korreliert mit der Menge der in diesen Banden und Spots vorhandenen Moleküle. Daher können diese Bilder nicht als dreidimensionale Bilder des Elektrophorese-Gels angesehen werden, und sie ermöglichen kein Nachweisen und Unterscheiden von beispielsweise überlappenden Spots oder Banden.

[0016] Verfahren und Systeme (Vorrichtungen) zum Erhalt dreidimensionaler Abbildungen von im Wesentlichen transparenten dreidimensionalen Objekten sind dem Fachmann bekannt und sind z.B. in der US 5,804,813, T. Furukawa (Hrsg.): Biological Imaging and Sensing. Springer; 2006, ISBN-13, 978-3540438984; P. Michael Conn (Hrsg.): Imaging in Biological Research, Teil A, Band 385 (Methods in Enzymology); Academic Press, 2004, ISBN-13; 978-0121827908, geoffenbart.

[0017] Wie hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck „Gel" eine zum Trennen von Molekülen verwendete Matrix. Das Gel kann ein vernetztes Polymer sein, dessen Zusammensetzung und Porosität gewählt wird auf Basis des Gewichts und der Zusammensetzung des Analyse-Ziels. 2/21 österreichisches Patentamt AT 504 849 B1 2011-03-15

Beim Trennen von Proteinen, Peptiden oder kleinen Nukleinsäuren (DNA, RNA, oder Oligo-nukleotide) kann das Gel mit verschiedenen Konzentrationen an Acrylamid und einem Vernetzungsmittel hergestellt werden, wobei verschieden große Polyacrylamid-Maschen-Netzwerke erzeugt werden. Beim Trennen größerer Nukleinsäuren (größer als ein paar hundert Basen) kann die bevorzugte Matrix eine gereinigte Agarose (ein Bestandteil von Agar, das ein roter Seetang-Extrakt ist) sein. In beiden Fällen bildet das Gel eine feste, aber poröse Matrix.

[0018] Der Ausdruck „Elektrophorese", wie hierin verwendet, bezieht sich auf die elektromotorische Kraft („electromotive force", EMF), die verwendet wird, um Moleküle durch eine Matrix, vorzugsweise durch eine Gel-Matrix, zu schieben oder zu ziehen. Die Moleküle, die vorzugsweise in einer Probe vorhanden sind, werden in Vertiefungen am Gel gegeben, wonach, wenn ein elektrischer Strom angelegt wird, die Moleküle in die Gel-Matrix eindringen werden und sich mit verschiedenen Geschwindigkeiten durch die Matrix zu der Anode hin bewegen werden, wenn sie negativ geladen sind, oder zur Kathode hin, wenn sie positiv geladen sind.

[0019] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung basiert die dreidimensionale bildgebende Technik auf konfokaler Mikroskopie, Tomographie oder Mikrotomographie.

[0020] Es zeigte sich, dass besonders die konfokale Mikroskopie verwendet werden kann, um Bande und Spots auf Elektrophorese-Gelen dreidimensional sichtbar zu machen. Der optische Flauptunterschied zwischen einem herkömmlichen Mikroskop und einem konfokalen Mikroskop ist das Vorhandensein konfokaler Lochblenden, die nur Licht aus der Ebene des Fokus den Detektor erreichen lassen. Dies bildet das Prinzip eines konfokalen Mikroskops, wo Licht, das „nicht im Brennpunkt" ist, vom Bild durch die Verwendung einer geeignet positionierten Lochblende entfernt wird. Dies erzeugt Bilder, die das Sammeln optischer Schnitte des Zieles zur Verwendung bei der Erzeugung einer dreidimensionalen Abbildung der Probe gestatten. Wenn die Ebene des Fokus verändert oder das Ziel bewegt wird, kann durch die Dicke des Objekts eine Reihe von Bildern an verschiedenen Positionen erzeugt werden, d.h. eine Reihe von X-Y Bildern an verschiedenen Z-Positionen. Eine solche Serie von Bildern ist eine dreidimensionale Darstellung des Zieles (z.B. eines Elektrophorese-Gels), das durch optische (im Gegensatz zur physischen) Zerteilung erzeugt wird.

[0021] Konfokale Mikroskope haben mehrere Vorteile gegenüber der herkömmlichen Mikroskopie. Erstens erzeugt die konfokale Mikroskopie Bilder mit verbesserter Auflösung, indem nicht im Fokus befindliches Licht („out-of-focus light") eliminiert wird. Konfokale Mikroskope haben auch eine höhere Empfindlichkeit im Vergleich zu herkömmlichen Mikroskopen aufgrund hoch empfindlicher Lichtdetektoren und der Fähigkeit, Bilder, die über die Zeit aufgenommen wurden, zu sammeln. Ein weiterer wesentlicher Vorteil der konfokalen Mikroskopie ist die Fähigkeit, dreidimensionale Bilder von Proben zu machen, wie oben erwähnt. Die konfokale Mikroskopie ist auch eine weniger invasive Form der Bildgebung. Dies ist auf die Verwendung von beispielsweise leistungsstarker Laser-Beleuchtung und die Reduktion lichtstreuender Artefakten zurückzuführen, was die nicht-invasive Bildgebung von sogar dicken Schnitten gestattet, vorausgesetzt, dass diese Schnitte im Wesentlichen halbdurchsichtige Ziele sind.

[0022] Bei der konfokalen Mikroskopie ist es wie bei der herkömmlichen Mikroskopie nötig, dass die interessierenden Gewebeproben irgendeine Form eines optischen Kontraste zwischen verschiedenen Bereichen der Probe für das Visualisieren zeigen. Dies erfordert üblicherweise das Färben des Ziels unter Verwendung einer Markierung, die das Licht entweder absorbiert oder reflektiert, oder die fluoresziert.

[0023] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die mindestens eine Bande und/oder der mindestens eine Spot mit mindestens einem Fluorophor, Chromophor, chemilumineszierendem Mittel und/oder einer Radiomarkierung markiert.

[0024] Um die Spots und Banden auf einem Elektrophorese-Gel sichtbar zu machen, werden die Moleküle vor oder nach der Trennung auf dem Gel durch ein Chromophor, Fluorophor, einen radioaktiven Marker oder irgendeinen geeigneten Marker, der der verwendeten bildge- 3/21 österreichisches Patentamt AT 504 849 B1 2011-03-15 benden Methode entspricht, markiert (z.B. Coomassie, Sypro Ruby, Cy-Farbstoffe, 35S usw.).

[0025] Die mindestens eine Bande und/oder der mindestens eine Spot wird vorzugsweise mit einem Fluorophor markiert, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Acridin-Orange, Cy3, Cy5, 4', 6-Diamidino-2-phenylindol, Ethidiumbromid, Fluorescein, Hilyte-Fluor, Rhodamin, SYBR Green I, SYBR Green II, SYBR Gold, Oxazol-Gelb, Thiazol-Orange, Pico-Green, Texas-Red, Cy2, Sypro Ruby, Sypro Orange, Deep Purple und Kombinationen davon.

[0026] Die im Gel sichtbar zu machenden Moleküle können mit einem oder mehreren Fluorophoren markiert sein. Das Markieren der Bande und/oder Spots mit mindestens zwei Fluorophoren ermöglicht das Unterscheiden zwischen mindestens zwei Proben, die vor der elektrophoretischen Trennung markiert wurden (Differentialanalyse). Daher können die Proben vor ihrer elektrophoretischen Trennung einzeln oder mehrfach markiert werden.

[0027] Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Elektrophorese-Gel ein Polyacrylamid-Gel oder ein Agarose-Gel.

[0028] Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann mit jedem Polymer, das zur Herstellung eines Elektrophorese-Gels verwendet wird, durchgeführt werden, wobei es besonders bevorzugt ist, Polymere zu verwenden, die zur Analyse von Nukleinsäuren (z.B. DNA, RNA) und Proteinen, einschließlich Polypeptiden, Peptiden und Modifikationen davon (z.B. Glykoprotei-nen) verwendet werden.

[0029] Die Gel-Elektrophorese von großer DNA oder RNA erfolgt gewöhnlich mittels Agarose-Gel-Elektrophorese. Es ist jedoch natürlich auch möglich, Polyacrylamid-Gele für eine elektrophoretische Trennung von Nukleinsäuremolekülen zu verwenden.

[0030] Proteine (einschließlich Polypeptide, Peptide und Modifikationen davon) werden üblicherweise mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE), mittels nativer Gel-Elektrophorese, mittels quantitativer präparativer nativer kontinuierlicher Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (QPNC-PAGE), isoelektrischer Fokussierung (in Polyacrylamid oder Agarose-Gelen; Träger auf Ampholyt-Basis, auf immobilisierter pH-Gradienten-Basis) oder mittels 2-D-Elektrophorese analysiert.

[0031] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das konfoka-le Mikroskop ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop oder ein konfokales Zwei-Photonen-Mikroskop.

[0032] Es ist besonders vorteilhaft, das konfokale Prinzip mit einem Scanning-System zu kombinieren, vorzugsweise unter Verwendung einer Laser-Lichtquelle. Dies baut eine Abbildung auf, indem ein Laserlicht-Punkt über die Probe in X- und Y-Richtung gescannt wird. Im Fall eines Laser-Scanning-Systems ist der Detektor des von der Probe reflektierten Lichts im Allgemeinen ein Photomultiplier Tube. Das Signal vom Photomultiplier Tube wird in digitale Form umgewandelt, welche Informationen über die Position des Lasers im Bild und die Menge an Licht, die von der Probe kommt, enthält. Gewöhnlich wird ein Computer verwendet, um den Intensitätswert jedes Punktes vom Detektor zu speichern und präsentiert diese in der richtigen Reihenfolge auf einem hochauflösenden Video-Monitor, um die Abbildung zu zeigen. Um eine Reihe von Abbildungen zu erhalten, verschiebt der Computer dann den Fokus um eine feststehende Menge, und der Gegenstand wird wiederum gescannt, um das nächste Bild in einer anderen Z-Position zu erzeugen. Dieses Bild wird gespeichert, und der Prozess wird wiederholt, um den dreidimensionalen Daten-Satz aufzubauen.

[0033] Bei einem typischen Ansatz für ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop wird eine Lochblende vor der Lichtquelle platziert, um einen eindeutigen und räumlich begrenzten Beleuchtungspunkt zu erzeugen. Das durch diese Lochblende passierende Licht wird auf die Probe fokussiert, während eine zweite Lochblende vor dem Licht-Detektor platziert wird. Wenn der optische Abstand von der Detektor-Lochblende zum Brennpunkt genau gleich ist wie jener zwischen dem Brennpunkt und der Beleuchtungs-Lochblende, erreicht nur das am Brennpunkt erzeugte Licht den Detektor, weil die Lochblende das nicht im Fokus befindliche Licht blockiert. Das Signal vom Detektor wird dann digitalisiert und vorzugsweise an einen Computer geleitet. 4/21 österreichisches Patentamt AT 504 849 B1 2011-03-15

Das Bild der Probe wird digital aufgebaut durch Scannen der Probe in X- und Y-Richtung, und danach wird eine spezielle Software verwendet, um ein digitales Bild zu rekonstruieren.

[0034] Die Zwei-Photonen-(oder Multi-Photonen)-Mikroskopie ist praktisch dieselbe wie die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie, außer dass die Notwendigkeit für Lochblenden eliminiert wird. Optisches Zerschneiden der Probe wird stattdessen durch die bevorzugte Verwendung eines modengekoppelten Ti:Saphir-Lasers erreicht, welcher im Infrarot-nahen Bereich arbeitet. Der Laser erzeugt eine hohe Photonendichte, die auf eine Wellenlänge abgestimmt wird, die etwa doppelt so groß ist wie die der beabsichtigten Absorptions-Wellenlänge der Probe. Dies bedeutet, dass zwei oder mehr Photonen an einem einzigen Punkt notwendig sind, um ein optisches Signal (z.B. eine Anregung) zu erzeugen, die detektiert werden kann. Die Wahrscheinlichkeit, dass ein solches Zwei-Photonen-Ereignis auftritt, ist auf den Brennpunkt beschränkt, wo es eine extrem hohe Photonen-Dichte gibt. Infolgedessen kommt es bei der 2-Photonen-Bildgebung zu einer Anregung nur in der Ebene des Fokus.

[0035] Die Verwendung der konfokalen Zwei-Photonen-Mikroskopie anstatt der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie verringerte das Fokus-Bleichen (den Verlust der optischen Signal-Erzeugung infolge einer Proben-Beschädigung durch den Laser). Die Zwei-Photonen-Mikroskopie erhöht auch die Proben-Penetration wegen der verringerten Absorption der Infrarot-nahen Strahlung, die anderseits der Probe wenig Schaden zufügt. Außerdem kann die Zwei-Photonen-Mikroskopie die Empfindlichkeit erhöhen weil die Eliminierung der Lochblende es möglich macht, dass das gesamte Signal den Detektor des Mikroskops erreicht.

[0036] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die zu analysierenden Moleküle ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, Glykoprotei-nen, Peptiden, Polypeptiden, Kohlehydraten und Nukleinsäuren, vorzugsweise DNA und RNA. Insbesondere bevorzugt sind Proteine, Peptide, Polypeptide einschließlich posttranslationeil modifizierte Peptide, Proteine, Polypeptide (z.B. Glykopeptide, Glykopolypeptide, Glykoprotei-ne).

[0037] Die auf einem Elektrophorese-Gel Spots und Banden bildenden Moleküle können, wenn sie mit einem Fluorophor oder Chromophor (falls nötig) markiert sind, von jeder beliebigen Art sein. Es ist jedoch besonders bevorzugt Proteine, Glykoproteine, Peptide, Polypeptide und Kohlehydrate, die auf Elektrophorese-Gelen getrennt sind, sichtbarzu machen.

[0038] In einigen Fällen ist es vorteilhaft, einzelne Spots und Banden, die auf einem Elektrophorese-Gel vorhanden sind, zu quantifizieren. Daher wird die Menge des mindestens einen Spots und/oderder mindestens einen Bande quantifiziert.

[0039] Die Verwendung dreidimensionaler Bildgebungstechniken, insbesondere der konfokalen Mikroskopie, beim Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht es nicht nur, die Banden und Spots auf einem Elektrophorese-Gel qualitativ zu analysieren, sondern auch die Menge der in einem einzelnen Spot oder einer einzelnen Bande vorhandenen Moleküle quantitativ zu bestimmen. Infolge der Möglichkeit, Moleküle zu trennen und sie in einem Spot oder einer Bande mit elektrophoretischen Methoden zu konzentrieren und somit Spots und Banden zu erhalten, die idealerweise nur eine Art von Molekülen enthalten, ist es möglich, diese Spots und Banden quantitativ zu bestimmen.

[0040] Um die Menge von Molekülen (z.B. Proteinen), die in einem Spot abgelagert sind, quantitativ zu bestimmen, muss eine weitere Probe mit einer bekannten Menge an Molekülen dem identischen Elektrophorese-Prozess unterzogen werden, vorzugsweise innerhalb desselben Gels. Die Quantifizierung beruht auf dem Vergleich der abgelagerten Menge in einem bekannten Standard-Spot mit der in einem in Frage stehenden Spot abgelagerten Menge. Bei diesem Verfahren wird die Menge als das vom Spot eingenommene Volumen definiert. Das Volumen ist wiederum als die Anzahl von Voxel (elementare Volumseinheiten in einer 3D-Bildgebungs-methode) definiert, die den bestimmten Spot darstellen, so dass der charakteristische Wert (Intensität) des Voxel über irgendeinem festgelegten Schwellenwert liegt. Die Schwellen-Intensität stellt die Unterscheidungsgrenze zwischen Spot und Hintergrund dar, wobei die In- 5/21 österreichisches Patentamt AT 504 849 B1 2011-03-15 tensität der Spot-Voxel typischerweise größer ist als die Intensität der Hintergrund-Voxel. Da die Schwellen-Intensität für alle Objekte (Spots) über das Gel einheitlich ist, ist ein volumetrischer Vergleich zwischen verschiedenen Objekten (Spots) möglich.

[0041] Um das Volumen eines Spots zu berechnen, spezifiziert man zuerst den Ort des Spots, typischerweise durch Identifizieren eines Kern-Voxels, das sich in der Mitte der Spot-Masse befindet. Man nimmt an, dass die Intensität dieses Voxels über dem Schwellenwert liegt, und daher wird erklärt, dass es zum Spot gehört. Danach identifiziert man alle Voxel, die räumliche Nachbarn des Kern-Voxels sind und deren Intensitäten über dem Schwellenwert liegen. Es wird erklärt, dass alle diese Voxel zum Spot gehören. Auf ähnliche Weise werden dann dem Spot Voxel weiter hinzugefügt, wenn sie räumliche Nachbarn jener Voxel sind, die bereits als zum Spot gehörig erklärt wurden und wenn ihre Intensität über dem Schwellenwert liegt. Das Verfahren wird fortgesetzt, bis es keine anderen Voxel mehr gibt, die potentiell hinzugefügt werden könnten. Die Gesamtmenge der Voxel, die als zum Spot gehörig erklärt wurden, stellt auf diese Weise das Volumen des in Frage stehenden Spots dar.

[0042] Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines konfokalen Mikroskops für das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung.

[0043] Mit einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine dreidimensionale Darstellung eines Elektrophorose-Gels erhältlich.

[0044] Die Ergebnisse des Verfahrens können typischerweise in Form perspektivischer Zeich-nungen/Bilder präsentiert werden, die die räumliche Tiefe der einzelnen Spots wiedergeben. Eine Präsentation unter Verwendung von Software-Werkzeugen für dreidimensionale Präsentation (welche eine interaktive Manipulation der visualisierten Objekte, wie räumliche Drehung, Zoomen usw. ermöglicht) ist ebenfalls möglich. Für den Zweck des Quantifizierens müssen diese Zeichnungen von numerischen Daten begleitet sein, die die Volumina der einzelnen Spots darstellen. Für die in dieser Beschreibung dargelegten Versuche wurde eine universelle mathematische Standard-Software verwendet, die eine Berechnung und ein Visualisieren der dreidimensionalen numerischen Daten ermöglicht.

[0045] Ein Set auf Basis dieses Verfahrens kann ein Instrument sein, das die relevanten Teile einer dreidimensionalen Scan-Einrichtung (vorzugsweise eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops) und eines Computers mit einer zugehörigen Software kombiniert. Diese Software benützt Standard-Algorithmen, wird jedoch hinsichtlich der erforderlichen Daten-Formate und Präsentationsweisen an die Kundenwünsche angepasst und ermöglicht eine einfache Benutzer-Interaktion. Typischerweise platziert der Benutzer das Elektrophorese-Gel auf eine Probenhalterplatte und startet die Software; dem Benutzer wird ein Vorschau-Bild des gesamten Gels präsentiert; der Benutzer wählt interaktiv den interessierenden Bereich auf dem Gel; das System führt das dreidimensionale Scannen des Bereichs durch; das System präsentiert eine perspektivische Ansicht des interessierenden Bereichs, wobei die Spots automatisch identifiziert und ihre Volumina berechnet werden. Dieses Instrument ist daher eine Alternative zu den derzeit erhältlichen zweidimensionalen Gel-Dokumentationssystemen.

[0046] Die vorliegende Erfindung ist durch die folgenden Figuren und Beispiele weiter veranschaulicht, ohne jedoch auf diese eingeschränkt zu sein.

[0047] Fig. 1a zeigt eine Seitenansicht (Z- und X-Achse) von zwei Spots auf einem 2-DE-Gel; [0048] Fig. 1b zeigt eine Draufsicht (Y- und X-Achse) auf dieselben Spots wie in Fig. 1a. Der hierin verwendete Schwellenwert ist die Unterscheidungsgrenze zwischen Spot und Hintergrund. Voxel mit Intensitäten, die unter dem Schwellenwert liegen, gehören zum Hintergrund. Voxel mit Intensitäten, die über dem Schwellenwert liegen, sind räumlich gruppiert und bilden die Objekte/Spots. Typischerweise gilt, je höher dieser Schwellenwert, desto höher die Spezifität des Verfahrens, aber desto geringer seine Empfindlichkeit.

[0049] Fig. 2a zeigt eine weitere Seitenansicht (Z- und Y-Achse) der Spots der Fig. 1; 6/21

österreichisches Patentamt AT 504 849 B1 2011-03-15 [0050] Fig. 2b zeigt eine dreidimensionale Ansicht (X-, Y- und Z-Achse) der Spots der Fig. 1.

[0051] Fig. 3a zeigt eine Seitenansicht (Z- und X-Achse) einiger Spots auf einem 2-DE-Gel; [0052] Fig. 3b zeigt eine Draufsicht (Y- und X-Achse) derselben Spots wie in Fig. 3a.

[0053] Fig. 4a zeigt eine weitere Seitenansicht (Z- und X-Achse) der Spots der Fig. 3; [0054] Fig. 4b zeigt eine dreidimensionale Ansicht (X-, Y- und Z-Achse) der Spots der Fig. 3.

[0055] Fig. 5a zeigt eine Seitenansicht (Z- und X-Achse) einiger Spots auf einem 2-DE-Gel; [0056] Fig. 5b zeigt eine Draufsicht (Y- und X-Achse) auf dieselben Spots wie in Fig. 5a.

[0057] Fig. 6a zeigt eine weitere Seitenansicht (Z- und Y-Achse) der Spots der Fig. 5; [0058] Fig. 6b zeigt eine dreidimensionale Ansicht (X-, Y- und Z-Achse) der Spots der Fig. 5.

[0059] Fig. 7a zeigt ein 2-DE-Gel eines mit Sypro Ruby gefärbten E.coli-Lysats. Die Gel-Dicke beträgt etwa 1mm.

[0060] Fig. 7b zeigt ein vergrößertes Detail des in Fig. 7a gezeigten Gels.

[0061] Fig. 8a zeigt ein zweidimensionales Bild des in Fig. 7b gezeigten Details, mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommen.

[0062] Fig. 8b zeigt ein dreidimensionales Bild des in Fig. 8a gezeigten Details.

[0063] Fig. 9a bis 9c zeigen dreidimensionale Bilder des Spot A, wie in den Fig. 7b bis 8b an gemerkt, wobei die Konzentration des Lysats von 50 bis 200 pg variiert wurde.

[0064] Fig. 10a bis 10c zeigen die Quantifizierung des Spot A, wenn verschiedene Mengen an E.coli-Lysat auf die Elektrophorese-Gele aufgetragen wurden (50 bis 200 pg). BEISPIELE: [0065] Das Verfahren wird in den folgenden Schritten implementiert: [0066] 1. Ein Gel wird nach Elektrophorese und Markieren auf einem Tisch platziert und nötigenfalls mit einer geeigneten Lichtquelle (typischerweise UV) beleuchtet, um die Spots für den Menschen, der den Versuch durchführt, sichtbarzu machen.

[0067] 2. Der relevante Teil des Gels, einschließlich der zu analysierenden Spots, wird aus dem Gel herausgeschnitten (typischerweise ein Stück mit ca. 6 x 10 mm, je nach der Größe des Probenhalters) und auf einem Probenhalter platziert. Typischerweise ist der Probenhalter ein Mikroskop-Objektträger mit einer Kammer für flüssigen Puffer. Flüssiger Puffer wird zugegeben, um ein Austrocknen des Gels zu verhindern.

[0068] 3. Der Probenhalter wird in den Scan-Bereich des konfokalen Mikroskops gegeben.

[0069] 4. Geeignete Scan-Parameter werden festgesetzt, wie die Wahl des Objektivs, die Wahl der Lochblenden-Größe, geeignete Fokussierung, Rahmen- und Zeilen-Durchschnittsbestim-mung usw. Die folgenden Parameter (nur die relevantesten aufgezählt) wurden von den Autoren in den Versuchen festgesetzt: [0070] a. Objektiv-Vergrößerung: 2,5x [0071] b. Lochblenden-Größe: 2,19 dünn [0072] c. Reale Volumengröße: 6,00 x 6,00 x 1,88 mm3 [0073] d. Daten-Volumen: 512 x 512 x 43 Voxel [0074] e. Voxel-Größe: 11,72 x 11,72 x 44,76 mm3 [0075] f. Zeilen-Durchschnittsbestimmung: 4 x [0076] g. Rahmen-Durchschnittsbestimmung: 4 x 7/21

Claims (9)

1. österreichisches Patentamt AT 504 849 B1 2011-03-15 [0077] 5. Der Vorschau-Modus wird gewählt, um die richtigen Einstellungen zu überprüfen. Die Einstellungen werden nötigenfalls adaptiert. [0078] 6. Der Scanning-Prozess wird gestartet. Dies kann je nach den Parametern bis zu einer Stunde für die Fertigstellung dauern. [0079] 7. Mit dem konfokalen Mikroskop auf dem PC gespeicherte Bilddaten werden durch ein mathematisches Software-Package für dreidimensionale Datenverarbeitung eingelesen. Datenformat-Umwandlungen werden nötigenfalls durchgeführt. [0080] 8. Geeignete dreidimensionale perspektivische Visualisierungs-Modi werden eingestellt, und die dreidimensionalen Daten werden auf dem Bildschirm als Vorschau graphisch dargestellt. [0081] 9. Basierend auf der Vorschau werden ein geeigneter dreidimensionaler Unterbereich und ein Schwellenwert ausgewählt. [0082] 10. Die räumliche Position der relevanten Spots wird auf der Vorschau identifiziert. [0083] 11. Der Unterbereich wird in einer perspektivischen Ansicht visualisiert, wobei die relevanten Spots als feste Objekte mit Oberflächen, die durch den Schwellenwert definiert sind, gezeigt werden. Die Anzahl der Voxels, die zu den jeweiligen Spots gehören, ist gezeigt. [0084] 12. Wenn ein Standard-Spot am selben Gel mit einer bekannten Menge zur Verfügung steht, wird dasselbe Verfahren für diesen Spot durchgeführt. Das Verhältnis der Anzahl der Voxel für den in Frage stehenden Spot und den Standard-Spot kann verwendet werden, um die Menge der Moleküle des in Frage stehenden Spots zu spezifizieren. Patentansprüche 1. Verfahren zum Visualisieren mindestens einer Bande und mindestens eines Spots von Molekülen auf einem Elektrophorese-Gel, umfassend die Schritte: - Vorsehen eines Elektrophorese-Gels, das die mindestens eine Bande und/oder den mindestens einen Spot aufweist, - Visualisieren der mindestens einen Bande und/oder des mindestens einen Spots unter Verwendung einer dreidimensionalen Bildgebungstechnik.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die dreidimensionale Bildgebungstechnik konfokale Mikroskopie, Tomographie oder Mikrotomographie ist.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Bande und/oder der mindestens eine Spot mit mindestens einem Fluorophor, Chromophor, chemilumineszenten Mittel und/oder einer Radiomarkierung markiert ist.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Fluorophor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Acridin-Orange, Cy3, Cy5, 4',6-Diamino-2-phenylindol, Ethidiumbromid, Fluorescein, Hilyte-Fluor, Rhodamin, SYBR Green I, SYBR Green II, SYBR Gold, Oxazol-Gelb, Thiazol-Orange, Pico Green, Texas Red, Cy2, Sypro Ruby, Sypro Orange, Deep Purple und Kombinationen davon.
5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Elektrophorese-Gel ein Polyacrylamid-Gel oder ein Agarose-Gel ist.
6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das konfokale Mikroskop ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop ist.
7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Moleküle ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, Glykoproteinen, Peptiden, Polypeptiden, Kohlehydraten und Nukleinsäuren, vorzugsweise DNA und RNA. 8/21 österreichisches Patentamt AT 504 849 B1 2011-03-15
8. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Spot und/oder die mindestens eine Bande quantifiziert wird.
9. 9. Verwendung eines konfokalen Mikroskops für das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8. Hierzu 12 Blatt Zeichnungen 9/21