ES2309319T3

ES2309319T3 - Metodo para la deteccion automatica de celulas mediante la compartimentacion de marcadores moleculares asociados a enfermedades.

Info

Publication number: ES2309319T3
Application number: ES03728698T
Authority: ES
Inventors: Chee-Wui Chu; Alan C. Nelson; Robert W. Webster
Original assignee: VisionGate Inc
Current assignee: VisionGate Inc
Priority date: 2002-05-14
Filing date: 2003-05-03
Publication date: 2008-12-16
Anticipated expiration: 2023-05-03
Also published as: EP1504405A1; CA2485675C; US6636623B2; EP1504405B1; CN1653480A; AU2003234471A1; ATE389873T1; AU2003234471B2; DE60319816T2; CN1308885C; US20030031352A1; CA2485675A1; EP1504405A4; HK1073713A1; WO2003098539A1; JP4767539B2; DE60319816D1; JP2005525581A

Abstract

Un método para la detección de células con una compartimentación de marcadores moleculares asociada a la malignidad y/o la enfermedad, incluyendo un cáncer, el método comprende las etapas: a) obtener una muestra celular que posea una pluralidad de células (1) y suspender (100) la pluralidad de células en una solución; c) marcar (103) al menos un marcador molecular en la pluralidad de células con sondas moleculares marcadas o tintes; d) iluminar (104) al menos una célula (1) de la pluralidad de células con al menos una fuente puntual de luz (21a, 21b, 21c); e) obtener (105) al menos una imagen de proyección a través de al menos una célula (1) con un arreglo de detectores (23a, 23b, 23c), donde la al menos una imagen de proyección se obtiene usando (104) la al menos una fuente puntual de luz (21a, 21b, 21c) de conjunto con un arreglo opuesto de detectores, donde se genera un conjunto de rayos de proyección (31), cuyos rayos de proyección se definen como líneas rectas que pasan a través de la célula y conectan la al menos una fuente puntual de luz (21) con un elemento sensor individual (33) de dicho arreglo opuesto de detectores (23a, 23b, 23c), permitiendo de ese modo la adquisición de proyecciones de la luz trasmitida a través de la al menos una célula (1); f) compensar (106) la al menos una imagen de proyección para corregir variaciones en la iluminación; g) analizar (107) la al menos una imagen de proyección para detectar al menos un marcador molecular marcado que posea características densitométricas y de localización; h) analizar (108) la localización de al menos un marcador molecular dentro de la al menos una célula (1); i) medir (109) la compartimentación del al menos un marcador molecular por medio del uso de características densitométricas y de localización; y j) analizar (110) la compartimentación del al menos un marcador molecular con al menos un clasificador para detectar la compartimentación de marcadores asociada a la malignidad y/o la enfermedad.

Description

Método para la detección automática de células mediante la compartimentación de marcadores moleculares asociados a enfermedades.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con sistemas de proyección de imágenes en general y clasificación de células, y con mayor particularidad, con sistemas automatizados de alto flujo que usan proyección de imágenes, tales como tomografía óptica de flujo (FOT por sus siglas en inglés), para la detección del cáncer en individuos de alto riesgo sobre la base de medidas altamente cuantitativas de la compartimentación de marcadores moleculares nucleares o citoplasmáticos, asociados a las afecciones y enfermedades.

Contexto de la invención

El método más común para el diagnóstico del cáncer en pacientes es mediante la obtención de una muestra del tejido sospechoso y su examen bajo el microscopio en busca de la presencia de células obviamente cancerígenas. Aunque este proceso es relativamente simple cuando se conoce la localización anatómica del tejido sospechoso y pueden tomarse muestras del mismo de manera exhaustiva (p.e., el cuello del útero), no resulta tan simple cuando no existe un tumor o lesión fácilmente identificable y el área de la que debe tomarse la muestra es muy amplia. Por ejemplo, con referencia a la detección del cáncer de pulmón, no resulta posible raspar toda la vía de entrada de aire de los pulmones. Debe emplearse una muestra como el esputo, ya que contiene células exfoliadas al paso del aire por los pulmones. Esto crea un problema de dilución, dado que un cáncer de pulmón temprano es muy pequeño en comparación con la superficie interna completa de los pulmones y, como resultado, el número de células desprendidas del tumor es también muy pequeño en comparación con el de las células normales. El problema resulta una mezcla compuesta, debido a que sólo se examina una pequeña porción de la muestra de esputo. Por tanto, la detección del cáncer de pulmón con la citología tradicional del esputo requiere que una o más de las relativamente infrecuentes células cancerosas estén presentes en la parte de la muestra que se examina. Por tanto, si la muestra no refleja de manera perceptible y exacta las condiciones del pulmón, no se puede diagnosticar de manera adecuada a los pacientes con cáncer de pulmón.

Un ejemplo de un sistema y un método basados en la microscopía para la detección de células a ser diagnosticadas y de células que poseen cambios asociados a la malignización se muestra en Palcic et al., Patente US 6.026.174. El sistema de Palcic et al. incluye un clasificador automático que posee un microscopio convencional, una cámara, un digitalizador de imágenes, un sistema informático para control e interfaz de estos componentes, un clasificador primario para la clasificación inicial de las células, y un clasificador secundario para la clasificación siguiente de las células. El método utiliza el clasificador automático para detectar de manera automática las células a diagnosticar y las células que poseen cambios asociados a la malignización. Este método mejora la citología tradicional mediante la detección de células que poseen cambios asociados a la malignización, que son más comunes que las células cancerosas. Sin embargo, la calidad del resultado del diagnóstico está limitada por el uso de un microscopio convencional, que no permite una medición precisa de las densidades de tinción. Además, el método de Palcic et al. no se dirige al uso de sondas moleculares específicas ni a la compartimentación de los marcadores moleculares.

Con la aparición de sondas moleculares específicas, tales como los anticuerpos, y las sondas de ácidos nucleicos, se puede dar respuesta a nuevas preguntas relacionadas con las enfermedades, por medio del marcaje de estas sondas moleculares y la posterior medición de su localización y concentración dentro de las células y tejidos biológicos. El uso de sondas moleculares específicas marcadas permite la cuantificación indirecta y la compartimentación de marcadores moleculares, tales como pRb, p53/proteína 1 de unión a p53 (53BP1), Sam68, PTEN, E2F y 5-metilcitosin-guanina (metil CpG) que pueden brindar información acerca de procesos de enfermedades como el cáncer (Véanse, por ejemplo, Pasquale, D., "Retinoblastoma Protein Tethered to Promoter DNA Represses TBP-Mediated Transcription", Journal of Cellular Biochemistry, 70:281-287, 1998, Rappold I, "Tumor Suppressor p53 Binding Protein 1 (53BP1) Is Involved in DNA Damage-signaling Pathways", The Journal of Cell Biology, 153 (3):613-620. 2001, Chen, T., "A Role for the GSG Domain in Localizing Sam68 to Novel Nuclear Structures in Cancer Cell Lines", Molecular Biology of the Cell 10:3015-3033, 1999, Perren, A., "Mutation and Expression Analyses Reveal Differential Subcellular Compartmentalization of PTEN in Endocrine Pancreatic Tumors Compared to Normal Islet Cells", American Journal of Pathology, 157 (4):1097-1103, 2000, Gil, R., "Subcellular Compartmentalization of E2F Family Members Is Required for Maintenance of the Postmitotic State in Terminally Differentiated Muscle", The Journal of Cell Biology, 148(6):1187-1201, 2000, Rountree, M., "DNA methylation, chromatin inheritance, and cancer", Oncogene, 20:3156-3165, 2001). A medida que aparece la necesidad de localizar y cuantificar de manera más precisa estas sondas, existe una necesidad concomitante de mejores técnicas para medir las densidades de las sondas con resolución de submicrones en dos dimensiones (2D) y tres dimensiones (3D). El microscopio convencional de luz, que emplea las células montadas sobre placas de vidrio solo puede aproximar mediciones de 2D debido a las limitaciones en la profundidad del plano focal, los ángulos de muestreo, y problemas con las preparaciones celulares que provocan por lo regular que las células se sobrelapen en el plano de la imagen. Otra limitación de la microscopía de luz es la limitación inherente de la visión a través de una lente objetivo, en la que solo el área dentro del plano focal estrecho proporciona datos exactos para el análisis.

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Los métodos de citometría de flujo por lo regular resuelven el problema de la superposición de las células haciendo que las células fluyan una a una en una corriente de fluido. Desafortunadamente, los sistemas de citometría de flujo no generan imágenes de células de la misma calidad que la microscopía de luz tradicional y, en cualquier caso, las imágenes no son tridimensionales. Para una revisión, los expertos en la técnica deben dirigirse a Shapiro, HM, Practical Flow Cytometry, 3ª ed., Wiley-Liss, 1995.

La microscopía confocal ofrece imágenes de 3D de muestras, mediante la superposición de las imágenes sucesivas de capas finas de la muestra para crear un apilamiento de imágenes 2D, que pueden visualizarse en 3D. La imagen se logra por medio del barrido de un punto fino de luz que pasa a través de la muestra situada en una placa de vidrio. La luz fluorescente o reflejada se enfoca sobre un detector a través de un pequeño agujero, que bloquea la irradiación de la luz que está fuera de foco sobre el detector. Por tanto, el tamaño del agujero determina la resolución en la dirección vertical y el tamaño del punto determina la resolución en la dirección horizontal. Desafortunadamente, la microscopía confocal es un procedimiento muy lento porque la imagen se construye mediante el barrido de un pequeño punto de luz en una trama a través de la muestra y la muestra debe ser barrida nuevamente para producir cada capa adicional. Otra limitación es que las células depositadas sobre las placas son alisadas, provocando un desproporcionamiento de las estructuras celulares.

En el área de la tomografía asistida por ordenadores, la Patente US 5.402.460, concedida el 28 de marzo de 1955 a Jonson et al., con el título "Three-dimensional Microtomographic Analysis System" presenta un sistema microtomográfico para la generación de imágenes de alta resolución, tridimensionales de un espécimen, empleando un generador de rayos X y un detector de rayos X que mide la atenuación del flujo de rayos X al pasar a través del espécimen. Dos proyecciones, cada una empleando un flujo de rayos X de diferente energía, de cada vista del espécimen, se llevan a cabo con el sistema microtomográfico de Jonson et al. Luego de realizar dos proyecciones de una vista del espécimen, el mismo se rota sobre el asegurador del espécimen y se lleva a cabo otro conjunto de proyecciones. Las proyecciones de cada vista del espécimen se analizan de conjunto para proporcionar una indicación cuantitativa de la fracción de fase del material que contiene al espécimen. Las proyecciones de las diferentes vistas se combinan para proporcionar una imagen tridimensional del espécimen. Aunque la tecnología de rayos X tal como se enseña en la Patente US 5.402.460 resulta útil para algunas aplicaciones, la misma no proporciona una solución óptica útil par ala citometría de flujo, mediante la cual se pueda medir la distribución 3D de la densidad molecular dentro de una célula biológica.

El documento WO-A-0 235 474 describe un método para llevar a cabo un ensayo de translocación en el cual la emisión de dos o más especies marcadas con fluorescencia se detecta de manera simultánea, mediante la excitación por medio de una o más longitudes de onda de iluminación. La translocación de interés es de una o más especies, que pueden ser proteínas, lípidos u otros complejos moleculares o estructuras subcelulares, tales como vesículas, desde una región bien definida de una célula a otra: los ejemplos son, factores de transcripción (NF-KB, NFAT, AP-1). En una rutina de análisis para procesar los datos de imágenes de translocación, la localización marcada es el núcleo de la célula, siendo la marca un fluorósforo específico para el ADN, tal como Hoechst 33342. La segunda especie es un factor de transcripción, cuya migración desde el citoplasma hacia el núcleo es el sujeto del ensayo. Esta proteína puede marcarse mediante uno de varios métodos, incluyendo su expresión como una proteína de fusión con GFP, y la puesta en contacto de la muestra con un anticuerpo marcado de manera fluorescente, que reconozca de manera específica la proteína que actúa como factor de transcripción. La rutina determina la cantidad de una primera especie marcada con fluorescencia que se distribuye de manera correlacionada o anticorrelacionada con respecto a una segunda especie marcada con fluorescencia. En una realización se emplea el análisis para ensayar la actividad de un compuesto químico y se emplea un aparato de barrido de etapa XY. El método lleva a cabo el diagnóstico de los estados patológicos de las muestras de células tales como neuroblastoma, células neuronales, células sanguíneas, p. e., en la investigación sobre el cáncer: las especies marcadas mediante fluorescencia se localizan en dos o tres dimensiones.

Para resolver las limitaciones anteriores y otras que se encuentran en tales sistemas, es una motivación de la presente invención, la combinación de la presentación de una célula a la vez por la citometría de flujo, con la tomografía óptica informático a partir de las proyecciones de fuentes de múltiples puntos para la reconstrucción de la información sobre la densidad dentro de una célula, a partir de una pluralidad de proyecciones. La información de densidad reconstruida permite la cuantificación precisa de los marcadores marcados de manera específica y la compartimentación de dichos marcadores.

La información de densidad a la que se hace referencia en el presente documento es única de los sistemas de imágenes basados en proyección, que no requieren del uso de lentes y planos focales con su inherente artefacto de borrosidad indeseado, debido a las estructuras desenfocadas que se encuentran fuera del estrecho plano focal. Dado que los sistemas de imágenes de proyección no requieren lentes ni planos focales, sino que producen mapas de sombras en los cuales todas las estructuras se encuentran en foco claro al mismo tiempo, las mediciones de las características de densidad resultan más cuantitativas y precisas que en los sistemas de microscopio convencionales. Además, la reconstrucción 3D a partir de las imágenes de proyección permite la separación de características que pueden superponerse en cualquier visión 2D. Estas características de densidad están directamente relacionadas con las localizaciones y cantidades de las sondas moleculares empleadas para la tinción de las células.

La presente invención resuelve las deficiencias de la técnica precedente, en la que la medición de la compartimentación subcelular o subnuclear de los marcadores moleculares no se empleaba para el diagnóstico porque, hasta ahora, no existía ningún método eficiente para llevar a cabo estas mediciones.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un método para la detección de células como se define en las reivindicaciones anexas 1-21.

Para determinar la compartimentación de un marcador molecular, se obtiene una muestra de células y se las tiñe en suspensión, y luego se obtienen sus imágenes mediante FOT. La tinción o sonda marcada es específica para los marcadores moleculares de interés, que incluyen, pero no se limitan a, pRb, p53/p53BP1, E2F, PTEN, SAM68 y metilCpG. La sonda molecular puede marcarse con cromóforos, fluorocromos o enzimas que pueden generar cromóforos o fluorocromos. El sistema informático analiza a continuación las imágenes de proyección, de manera directa y/o calcula la reconstrucción 3D que también se analiza. Las imágenes se corrigen para eliminar la iluminación no uniforme y otras imperfecciones del sistema de adquisición de imágenes. Luego de que todas las imágenes han sido corregidas, se calculan los bordes, superficies y volúmenes, y densidades de los objetos de interés, o sea, la frontera que determina que píxeles o vóxeles pertenecen a cada objeto o estructura de interés y cuáles pertenecen al fondo. Estos objetos incluyen agregados de las sondas marcadas y estructuras celulares teñidas.

El sistema informático calcula a continuación un conjunto de valores de características 1D, 2D y 3D para cada objeto o estructura. Para los cálculos de algunas características, se corrige la frontera a lo largo del valor de mayor gradiente, ya sea mediante dilatación o erosión de borde (o superficie) por uno o más píxeles (o vóxeles). Esto se lleva a cabo de manera tal que cada característica alcanza un poder de discriminación mayor entre clases de objetos y por tanto, es objeto específico. Los valores de estas características se analizan a continuación por medio de un clasificador que emplea los valores de las características para determinar si el objeto es un artefacto o un objeto o estructura de interés dentro de una célula o núcleo que ha sido marcado o teñido de manera específica. Si el objeto aparente ser un objeto o estructura de interés, entonces los valores de las características se analizan con más detenimiento por medio del clasificador, para determinar si el objeto es del tipo y se encuentra en un compartimento celular o nuclear que indiquen una enfermedad. Una vez que se ha identificado un objeto o estructura de interés, la densidad de la sonda molecular asociada se asigna a dicho objeto particular, lo que permite la compartimentación de la sonda. Sobre la base de la cantidad de células encontradas en la muestra que aparenten tener cambios significativos relacionados con enfermedades en la compartimentación de los marcadores, se puede llevar a cabo una determinación estadística de si el paciente del cual se obtuvo la muestra de células está sano o porta un crecimiento maligno.

En otras realizaciones, la presente invención proporciona un método para detectar células epiteliales en una muestra de células y un método para detectar células con compartimentación molecular que se correlacione con la enfermedad entre las células epiteliales. En otra realización, se proporciona un método para predecir si un paciente desarrollará cáncer.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 muestra de manera esquemática un ejemplo de un sistema de citometría de flujo que puede emplearse en el método de la presente invención.

La Fig. 2 muestra de manera esquemática un ejemplo de un proceso de flujo para una sola célula que puede emplearse en el método de la presente invención.

Las Fig. 3A y 3B muestran de manera esquemática un ejemplo de una célula y una sección en cruce de la reconstrucción, como se pretende para su empleo en una realización del método de la presente invención.

La Fig. 4 muestra de manera esquemática un ejemplo de un cilindro de reconstrucción, como se pretende para el uso en una realización del método de la presente invención.

La Fig. 5 muestra de manera esquemática un ejemplo de un sistema de tomografía óptica de flujo (FOT) como se pretende para el uso en una realización del método de la presente invención.

La Fig. 6 muestra de manera esquemática un ejemplo de rayos de proyección dentro de un cilindro de reconstrucción como se pretende para el uso en una realización del método de la presente invención.

La Fig. 7 muestra de manera esquemática un ejemplo de una vista superior de un cilindro de reconstrucción como se pretende para el uso en una realización del método de la presente invención.

La Fig. 8 muestra de manera esquemática un ejemplo de la geometría de una configuración de arreglo fuente/lineal empleada en la reconstrucción celular como se pretende para el uso en una realización del método de la presente invención.

La Fig. 9 muestra de manera esquemática un ejemplo de un método de clasificación empleado en el análisis de la cuantificación y compartimentación de marcadores a partir de imágenes de proyección y la reconstrucción tomográfica como se pretende para el uso en una realización del método de la presente invención.

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La Fig. 10 muestra de manera esquemática un ejemplo del proceso de compartimentación de una sonda molecular como se pretende para el uso en una realización del método de la presente invención.

La Fig. 11 muestra de manera esquemática ejemplos de compartimentos en el interior de una célula.

La Fig. 12 muestra de manera esquemática un diagrama de bloque de un método para la detección de células con compartimentación de marcadores moleculares asociada a la malignidad y/o la enfermedad, incluyendo el cáncer.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

La invención se describe en el presente documento en relación con ejemplos específicos relacionados con células biológicas: sin embargo, debe entenderse que estos ejemplos sirven sólo a propósitos de ilustración de los principios de la invención y que la invención no se encuentra limitada a ellos. En un ejemplo, la construcción de una distribución tridimensional de densidades puntuales e intensidades de emisión dentro de un volumen microscópico permite la medición de la densidad y la fluorescencia en cualquier localización dentro del volumen subcelular y determina la localización de estructuras o marcadores moleculares que se han marcado con sondas moleculares. Mediante el uso de sondas moleculares marcadas, se puede medir la cantidad de sondas que se unen a estructuras específicas o marcadores moleculares en el objeto microscópico, produciendo una medida de la compartimentación del marcador asociado a la estructura. Con propósitos ilustrativos, un objeto como una célula biológica puede marcarse con al menos una sonda molecular tal como anticuerpos, proteínas de unión específica, lectinas o sondas de ácidos nucleicos, y la compartimentación medida de estas sondas puede reportar información importante acerca del estado de enfermedad de la célula, incluyendo, aunque no limitado a, varios cánceres, tales como cánceres de pulmón, de mamas, de próstata, cervicales, de vejiga y de ovarios. La sonda molecular puede ser un anticuerpo contra pRb, p53, p53BP1, Sam68, PTEN, E2F, o metil CpG.

Las células biológicas que se han preparado en suspensión y se han teñido o marcado con sondas moleculares marcadas para el diagnóstico de enfermedades específicas, se hacen circular o trasladarse a través de un dispositivo que proporciona la toma de imágenes de proyección, y permite la reconstrucción de información 2D y 3D a partir de caminos de rayos de proyección óptica que son aproximadamente perpendiculares a los vectores de movimiento de la célula. Por medio del control de la velocidad del movimiento de la célula a lo largo de un eje, se pueden localizar (o apilar) correctamente los planos 2D de reconstrucción a lo largo del eje de la célula para crear una imagen 3D de la célula completa, o se puede calcular una imagen 3D de la célula directamente a partir de trasmisiones ópticas o proyecciones de emisión 2D.

La citometría de flujo es sumamente adecuada para la reconstrucción de imágenes, dado que posee las siguientes características:

\bullet: las células fluyen en una fila única a través de un tubo capilar, de manera que se minimizan la superposición y el oscurecimiento de las células,

\bullet: la velocidad del flujo de las células a través del tubo capilar puede medirse de manera directa y es constante,

\bullet: las células tienden a seguir el eje central del tubo capilar,

\bullet: el análisis de las células en suspensión minimiza las distorsiones estructurales.

La presente invención se aprovecha de las características anteriormente mencionadas, pero no se limita a estas características, para proporcionar un sistema para la producción de imágenes de proyección de fuente puntual y la reconstrucción de imágenes tomográficas.

En referencia ahora a la Fig. 1, en la misma se muestra un ejemplo de un sistema de citometría de flujo, como se pretende para el empleo en una realización del método de la presente invención. El sistema se orienta con referencia a un sistema de coordenadas 11 que posee coordenadas en las direcciones x, y, y z. Durante la operación, se inyectan células 1 en el tubo de inyección 3, empleando un dispositivo de inyección 4 conocido. El tubo capilar es más amplio en el extremo de inyección 5, e incluye una caperuza de presión 6. Un fluido de envoltura 7 se introduce en el tubo 8 para crear un flujo laminar dentro del tubo capilar 2. Es característico de la citometría de flujo tradicional que las células 1, preparadas y suspendidas en solución, puedan moverse a través del tubo capilar 2, de manera que se elonguen ligeramente en la dirección del eje del flujo y se muevan aproximadamente a lo largo del eje central del tubo capilar 2, como se representa por medio de la línea discontinua 9. Se puede lograr, de manera ventajosa, que las células fluyan con simetría axial y con velocidad constante 10 en una única fila a lo largo del eje central de un tubo capilar cilíndrico.

En referencia ahora a la Fig. 2, en la misma se muestra de manera esquemática un ejemplo de un proceso de flujo para una única célula como se pretende para el empleo en una realización del método de la presente invención. Una célula 1 se mueve a velocidad constante (V) como indica el vector de velocidad 10 a través del tubo capilar 2. La célula 1, contiene una membrana citoplasmática 12 y una membrana nuclear 13. Durante el curso del flujo a través de tubo capilar 2, la célula 1 pasa a través de una pluralidad de planos de reconstrucción, representados, para propósitos ilustrativos como los planos primero, segundo y tercero de reconstrucción 14a, 14b y 14c, respectivamente. Una primera capa planar 15a, a través del citoplasma cae sobre el plano de reconstrucción 14a. De manera similar, una segunda capa planar 15b, a través del citoplasma y el núcleo, cae sobre el segundo plano de reconstrucción 14b y una tercera capa planar 15c cae dentro del tercer plano de reconstrucción 14c. Una característica central de una de las realizaciones de la presente invención es que se dispone una cantidad de fuentes de punto óptico con longitud de onda ajustable alrededor y de manera concéntrica con respecto al tubo capilar. Las fuentes de punto óptico operan en conjunción con conjuntos de sensores ópticos opuestos a ellas que son sensibles a porciones ajustables del espectro luminoso, lo que permite la adquisición de proyecciones de la luz trasmitida a través de la célula. Las imágenes de proyección adquiridas pueden analizarse directamente o procesarse empleando algoritmos de reconstrucción de imágenes tomográficas para proporcionar mapas o imágenes espaciales de la distribución de densidades y/o intensidades de emisión dentro de la célula. Debe comprenderse que, en la práctica, el número de planos de reconstrucción puede variar desde varios hasta varios cientos o más, en dependencia de la resolución de las imágenes de que se precise del objeto que se presenta al sistema. El grupo de imágenes de capas planas paralelas reconstruidas puede combinarse o apilarse mediante un sistema informático para producir una imagen tridimensional (3D) de las densidades y las intensidades de emisión dentro de la célula. Además, por medio del empleo de conjuntos de sensores de luz planares (2D), en lugar de lineales (1D), y de un cono en lugar de patrón de iluminación en forma de abanico, se pueden adquirir de manera simultánea proyecciones o una pluralidad de capas planas contiguas a través de las células que fluyen. Como resultado, se pueden calcular imágenes tridimensionales (3D) de la distribución de densidades y de intensidades de emisión dentro del volumen celular, de manera directa, a partir de proyecciones bidimensionales (2D) empleando algoritmos de reconstrucción de rayo cónico. De manera alternativa, las imágenes de proyección de fuente puntual 2D, que poseen densidad de campo infinita, pueden analizarse de manera directa.

En el caso de una célula biológica, la distancia (d) entre los planos de reconstrucción puede ser de unas pocas micrómetros o menos. Un punto dentro de la célula 1 coincidirá con cada plano de reconstrucción a intervalos de tiempo, donde los intervalos de tiempo (t) pueden describirse de acuerdo con la relación:

(Ecuación 1)t = d \div V

En referencia conjunta, ahora, a la Fig. 3A y la Fig. 3B, en las mismas se muestra de manera esquemática, un ejemplo de una sección transversal 16 de la reconstrucción, como se pretende emplearla en una realización del método de la presente invención. La reconstrucción de las densidades puntuales dentro de una célula a partir de proyecciones ópticas que atraviesan las mismas, se aprovecha de la simetría axial y la centralidad de la célula que fluye. De manera adicional, el espacio muestreado por medio de las proyecciones puede modelarse como un arreglo que consta de tres compartimentos principales:

1. el fluido externo a la célula 17 (i.e. el fluido de envoltura o el medio de suspensión de las células),

2. el citoplasma celular 18, y

3. el núcleo celular 19.

El conocimiento cuantitativo de la distribución de la densidad óptica o las sondas moleculares en estos tres compartimentos puede resultar suficiente para resolver muchos problemas importantes en la biología celular y en el diagnóstico de enfermedades. Además, puede resultar útil para calcular dos superficies de frontera, incluyendo la membrana citoplasmática 12 y la membrana nuclear 13 si determinadas sondas moleculares se unen de manera preferencial a esas superficies. Si no, puede resultar suficiente caracterizar estas membranas como las superficies de transición entre los tres compartimentos diferentes.

En otros ejemplos, puede resultar ventajoso reconstruir y definir compartimentos dentro del citoplasma y el núcleo, tales como el aparato de Golgi y el nucléolo, respectivamente, y localizar marcadores moleculares específicos para estos compartimentos.

Combinando las capas reconstruidas de la célula, o recostruyendo en forma helicoidal, volumétrica, se pueden generar la morfología 3D y la información de volumen, pero los volúmenes absolutos (a diferencia de los relativos) dependen de la información exacta de la localización celular. La localización celular es una función de la velocidad de flujo. Sin embargo, en algunos casos las concentraciones o las densidades relativas de tinción o las sondas moleculares son suficientes para resolver la pregunta del diagnóstico: ¿cuánta sonda hay en un determinado compartimento subcelular o subnuclear en comparación con otros compartimentos? La compartimentación inadecuada de algunos marcadores moleculares medida por las densidades ópticas relativas de las sondas específicas en los diferentes compartimentos puede ser suficiente para diagnosticar una determinada enfermedad. La asociación de las sondas marcadas con compartimentos subcelulares específicos, estructuras u organelos dentro del citoplasma o el núcleo se facilita por medio de la resolución espacial en el intervalo inferior a los micrómetros.

Con referencia, ahora, a la Fig. 4, en la misma se muestra de manera esquemática un ejemplo de un cilindro de reconstrucción, que rodea al tubo 2, que contiene células en flujo 1, como se pretende para su empleo en una realización del método de la presente invención. Un cilindro de reconstrucción 20 incluye, por ejemplo, una hélice 24 de fuentes puntuales 21, dispuestas en un paso helicoidal predeterminado, con ángulo de separación \theta. Cada fuente puntual 21, genera un rayo de fotones 22, cuyo rayo de fotones 22 posee por lo regular una forma cónica o de abanico. En tanto la disposición de las fuentes que se muestra en el ejemplo de la Fig. 4 es helicoidal, el arreglo de fuentes puntuales puede tomar una gran variedad de patrones geométricos, en dependencia en parte de la velocidad de los electrones, la velocidad de la célula y la geometría que logran en el sensor (detector) señales de proyección no sobrelapadas. Los elementos sensores 23, se disponen para recibir la luz de las fuentes puntuales.

Las fuentes puntuales ópticas fijas 21, junto con los detectores que se les oponen 23, montados alrededor de una circunferencia del tubo pueden muestrear múltiples ángulos de proyección a través de la célula completa 1, a medida que la misma fluye a través de las fuentes. Cronometrando la emisión o la lectura, o ambas, de la fuente de luz y de la luz atenuada trasmitida y/o dispersada y/o emitida, cada señal detectada coincidirá con una posición específica, conocida a lo largo del eje en la dirección z del flujo de células. De esta manera, una célula 1 que fluya con velocidad conocida a los largo de un eje conocido, perpendicular a una fuente de luz que fluye para emitir o ser detectada de manera sincronizada, puede seccionarse óptimamente con proyecciones a través de la célula que pueden reconstruirse para formar una capa 2D en el plano x-y. Al apilar o combinar matemáticamente capas consecutivas, emergerá una imagen 3D de la célula. También se puede combinar el movimiento de la célula con la posición de la fuente (o fuentes) de luz alrededor del eje del flujo, para generar datos que pueden ser reconstruidos, por ejemplo, de manera helicoidal para crear una imagen 3D de la célula. La reconstrucción puede hacerse mediante el apilamiento de imágenes planares contiguas reconstruidas a partir de proyecciones lineales (1D) empleando algoritmos de reconstrucción abanico-rayo, o a partir de proyecciones planares (2D) empleando directamente algoritmos de reconstrucción cono-rayo. La imagen 3D de la célula puede producir medidas cuantitativas de estructuras subcelulares y la compartimentación o localización y cantidad de sondas moleculares marcadas que proporcionen información para el diagnóstico.

Como se ha mencionado, se requiere más de una proyección a través de una sección de la célula para reconstruir una densidad de estructura 2D o 3D en la sección o volumen. En la tomografía médica computarizada tradicional capa a capa, de rayos X, se llevan a cabo múltiples proyecciones sosteniendo inmóvil al paciente mientras la fuente de rayos X, y los detectores opuestos a la misma se mueven a lo largo de una circunferencia para generar múltiples ángulos de proyección a través del paciente. Por analogía, el sistema de tomografía óptica de flujo empleado en una realización del método de la invención, mueve la célula a una velocidad predeterminada (V) a través de múltiples fuentes colocadas a diferentes ángulos a lo largo de la circunferencia del tubo capilar, para generar múltiples proyecciones a través de la célula a medida que fluye a través de las fuentes puntuales. Estas fuentes puntuales emiten fotones que pasan a través de la célula y son detectados por medio de un conjunto de sensores opuestos a la fuente. Las fuentes puntuales pueden colocarse ventajosamente a lo largo de una hélice 24, o en otro patrón geométrico apropiado, en la circunferencia del tubo capilar, de manera que cada punto en la célula sea muestreado a partir de una multitud de ángulos a medida que pasa a través de un conjunto de fuentes puntuales. Para una geometría correcta de muestreo, estas fuentes puntuales pueden cubrir al menos 180 grados de la circunferencia. Una cobertura angular inferior (i.e., muestreo subangular) puede llevarse a cabo en algunos casos, en tanto una cobertura radial adicional mejorará la exactitud y la relación señal a ruido de la reconstrucción calculada. Dependiendo de la geometría, puede ser ventajoso aplicar algoritmos tradicionales analíticos, iterativos o estadísticos para la reconstrucción cono-rayo o abanico-rayo (véanse, por ejemplo, Gilbert, P., "Iterative Methods for the Three-dimensional Reconstruction of an Object from Projections", Journal of Theoretical Biology 36:105-17, 1972, Oppenheim, B.E., "More Accurate Algorithms for Iterative 3 dimensional Reconstruction", IEEE Transactions on Nuclear Science NS-21:72-7, 1974, Singer, J.R, Grunbaum, F.A., Kohn, P., y Zubelli, J.P., "Image Reconstruction of the Interior of Bodies that Diffuse Radiation", Science 248(4958):990-3, 1990. Mueller, K. y Yage, R., "Rapid 3-D Cone-beam Reconstruction with the Simultaneous Algebraic Reconstruction Technique (SART) Using 2-D Texture Mapping Hardware", IEEE Transactions on Medical imaging 19#(12):1227-37, 2001). Métodos relacionados incluyen, pero no se limitan a ART (técnica de reconstrucción algebraica, como se discute en Bellman, S.H., Bender, R., Gordon, R., y Rowe, J.E., "ART is Science being A Defence of Algebraic Reconstruction Techniques for Three-dimensional Electron Microscopy", Journal of Theoretical Biology 32:205-16, 1971), SIRT (técnica de reconstrucción iterativa simultánea, como se discute, por ejemplo en Gilbert, id. #1493), ML-EM (expectación-maximización de máxima verosimilitud, como se discute, por ejemplo, en Manglos, S.H., Jaszcak, R.J., y Floyd, C.E., "Maximum Likelihood Reconstruction for Cone Beam SPECT: Development and Initial Tests", Physics in Medicine and Biology 34(12): 1947-57,1989, #1382), y OSEM (expectación-maximización usando subconjuntos ordenados, como se discute, por ejemplo, en Manglos, S.H., Gagne, G.M., Krol A, Thomas, F.D., y Narayanaswamy, R, "Transmission Maximum-likelihood Reconstruction with Ordered Subsets for Cone Beam CT", Physics in Medicine and Biology 40(7):1225-41, 1995, #4389).

Métodos Citometría de flujo

En referencia ahora a la Fig. 5, en la misma se muestra de manera esquemática un ejemplo de un sistema de tomografía óptica de flujo (FOT) como se pretende para su empleo en una realización del método de la presente invención. El sistema de tomografía óptica de flujo incluye un citómetro de flujo, con un cilindro de reconstrucción 20 posicionado alrededor del tubo capilar 2. Una fuente de fotones 25 y un sensor de fotones 26 funcionan junto con un analizador de altura de pulso 27 para operar como dispositivo de disparo. El analizador de altura de pulso 27 opera de acuerdo con principios conocidos para proporcionar un primer punto de disparo 28 para el comienzo de una célula, y un segundo punto de disparo 29 para el fin de la célula. El analizador de altura de pulso 27 desencadena una señal de disparo 30 correspondiente al inicio y el final de cada célula, cuya señal de disparo es recibida por el cilindro de reconstrucción 20.

\newpage

Un ordenador 40 está acoplado para trasmitir datos, controlar las señales y cronometrar las señales a las fuentes puntuales 21, los elementos sensores 23 y el analizador de altura de pulso 27 por las líneas de señal 41-43. El ordenador puede consistir en un ordenador conocido o una variedad de ordenadores y un conjunto de procesadores adecuados para la adquisición de imágenes y el procesamiento de la reconstrucción de imágenes.

Los citómetros de flujo comerciales vienen con tres configuraciones de flujo básicas: a saber, el tubo de flujo cilíndrico, el tubo de flujo rectangular y el tubo de flujo en sistema de aire (véase Shapiro, H.M., Practical Flow Cytometry, 3ª ed., Wiley-Liss, 1995). La configuración preferida es la del tubo de flujo cilíndrico, dado que es importante preservar la geometría cilíndrica óptima para que el algoritmo de reconstrucción minimice cualquier dependencia radial debida al hardware de flujo (véase Fig. 1). Además, el tubo de flujo cilíndrico puede poseer paredes uniformemente finas en relación con el área transversal del tubo capilar.

Adicionalmente, el dispositivo de disparo puede localizarse corriente arriba con respecto al módulo de reconstrucción para proporcionar una señal de cronometrado para iniciar y luego terminar la recogida de datos, a medida que la célula entra de manera óptima y luego emerge a partir del cilindro de reconstrucción. El dispositivo de disparo puede contener ventajosamente un diodo láser, CCD, PMT, una combinación fotodectora, un fotodetector de estado sólido y combinaciones de los elementos anteriores. El dispositivo de disparo posee una configuración umbral que sensa la presencia de la célula en el flujo y genera de ese modo una señal de disparo que, junto a una velocidad conocida de la célula puede emplearse para calcular en qué momento el cilindro de reconstrucción que se encuentra corriente abajo puede comenzar la recogida de datos para la célula particular de interés. Además, el intervalo de tiempo entre el primer y el segundo punto de disparo correspondientes a la entrada y salida de la célula a y del cilindro de reconstrucción, puede dividirse en incrementos iguales o desiguales durante cada uno de los cuales se pueden adquirir datos de proyección adicionales cambiando las fuentes de luz 21 y leyendo a partir del conjunto de sensores
23.

La velocidad de flujo debe ser controlada y medida con precisión. Esta capacidad se proporciona en sistemas comerciales de alto desempeño que emplean velocidades en el intervalo de 1 metro/seg a 10 metros/seg. La mejor velocidad de las células se determinará por medio de la velocidad de la adquisición de datos y las consideraciones señal a ruido, como se discute a continuación.

Módulo de reconstrucción

En referencia, ahora, a la Fig. 6, en la misma se muestra de manera esquemática un ejemplo de rayos de proyección de tipo abanico-rayo dentro de un cilindro de reconstrucción 20 como se pretende para el uso en una realización del método de la presente invención. El fin del cilindro de reconstrucción es proporcionar un medio de proyectar la luz a partir de una pluralidad de fuentes puntuales fijas 21a-21c, a lo largo de una pequeña circunferencia, hacia el interior del tubo capilar cilíndrico. Los fotones emitidos a partir de las fuentes puntuales poseen una geometría de proyección conocida, tal como una forma de abanico o de cono, y pasan a través del tubo capilar para ser detectados por un conjunto de elementos sensibles 23a, 23b o 23c, como puede ser el caso, localizados a lo largo de una circunferencia más amplia, opuesta a la fuente puntual correspondiente. Aunque los conjuntos de sensores de línea curva (1D) adecuados para la transiluminación de abanico-rayo se muestran con propósitos ilustrativos, debe entenderse que los conjuntos de sensores de línea recta (1D) o los conjuntos de sensores planares (2D) adecuados para la iluminación cono-rayo pueden emplearse de manera similar. De esta manera, puede generarse un conjunto de rayos de proyección en el que los rayos de proyección pueden describirse como la línea recta que conecta la fuente puntual con un elemento sensor individual. La diferencia entre el número de fotones que parte de la fuente puntual a lo largo de un rayo de proyección particular, tal como el rayo 31, y el número de fotones recibidos en el elemento sensor particular se relaciona con el número de fotones perdidos o atenuados debido a las interacciones con la célula y las sondas moleculares marcadas asociadas y otros contenidos del tubo de flujo a lo largo del camino del rayo de proyección.

Sin embargo pueden surgir complicaciones por la dispersión de la luz, cambios de energía de los fotones, geometría imperfecta y colimación defectuosa, y pueden llegar fotones provenientes de diferentes fuentes a un elemento sensor determinado cuando múltiples fuentes puntuales se activan simultáneamente. Con una construcción cuidadosa del cilindro de reconstrucción, por ejemplo, seleccionando de manera juiciosa la geometría del patrón de fuetes puntuales y sus detectores opuestos como se describe aquí, y cronometrando o asegurando de manera adecuada la activación de las múltiples fuentes puntuales y la lectura de los conjuntos de sensores, la contaminación fotónica producida por estas causas puede minimizarse, aunque no eliminarse.

Se puede dar cuenta de la contaminación fotónica por medio de la calibración del sistema, por ejemplo, cuando no hay células presentes. O sea, cada fuente luminosa puede iluminarse a su vez y se pueden medir sus efectos sobre cada uno de los sensores, proporcionando de ese modo datos de partida para su empleo en la normalización del sistema. Un paso de calibración adicional puede conllevar, por ejemplo, la realización de imágenes de cuentas de polímeros de látex u otras microesferas u esferoides de tipo oblea, con propiedades ópticas conocidas y que se encuentren dentro del intervalo de densidades de interés para la obtención de imágenes de las células. Los fotones emitidos por sondas fluorescentes pueden diferenciarse de los que se originan en las fuentes puntuales por medio del uso de filtros de banda espectral en los detectores, como se discute a continuación.

Fuente de luz

Cada fuente de luz puede poseer las mismas características generales, de preferencia:

-: puede aproximarse a una fuente puntual circular pequeña,

-: puede ser brillante con contenido espectral conocido,

-: los fotones emitidos por la fuente pueden poseer una geometría conocida, tal como un cono-rayo o un abanico-rayo.

Cada fuente crea datos para un ángulo de proyección. Una pluralidad de fuentes colocadas a lo largo de una hélice cuyo eje es el eje central del tubo de flujo crea datos a partir de múltiples ángulos de proyección a través de cada plano sucesivo (o capa de reconstrucción) a medida que la célula fluye a través del módulo. En dependencia de la geometría del sensor, se pueden colocar varias fuentes puntuales de manera colineal en la misma circunferencia, de manera que las proyecciones no se solapen en el sensor. Una buena geometría de muestreo puede lograrse situando fuentes equidistantes a lo largo de una hélice de 180 grados, aunque se puede tolerar una cobertura angular inferior en algunos casos, y se puede emplear 360 grados para mejorar la relación señal a ruido. El número deseado de fuentes es una función de la resolución que se necesita dentro de cada reconstrucción planar (el plano x-y) o reconstrucción volumétrica. Si bien se emplea un arreglo helicoidal de fuentes puntuales a modo de ilustración, debe comprenderse que puede emplearse una variedad de patrones geométricos para el arreglo de fuentes puntuales. Además, se puede seleccionar la longitud de onda de las fuentes, ya sea mediante el uso de varios diodos u otros láseres o por medio del filtrado de banda de una fuente blanca u otra fuente de banda amplia, por ejemplo, una lámpara de mercurio o una lámpara de arco de xenón.

En referencia, ahora a la Fig. 7, en la misma se muestra de manera esquemática un ejemplo de una vista superior de un cilindro de reconstrucción como se muestra en la Fig. 6, según se pretende para el uso en una realización del método de la presente invención. Una primera fuente puntual 21a y un arreglo de sensores 23a se muestran con un núcleo celular 19 que fluye de manera perpendicular a la página en una proyección de la trayectoria de la fuente que, en dos dimensiones, constituye un círculo de reconstrucción 32, en el que todas las proyecciones, incluso las que se adquieren de manera distante en el tiempo, se muestran superpuestas, y en el que se encuentra contenida la célula entera. Una segunda fuente puntual, 21b y un segundo arreglo de sensores 23b se localizan alrededor de 30º alrededor de la hélice. Una tercera fuente puntual 21c y un tercer arreglo de sensores 23c se localizan alrededor de 90º alrededor de la hélice.

La toma de datos se abre en sincronía con la velocidad de la célula, dentro de una sección transversal axial "gruesa" de la célula. El grosor deseado del plano es una función de la resolución deseada en la dirección z. Por lo regular, la resolución en la dirección axial (dirección z) será menor que en la dirección transaxial del plano. Además, el mejor círculo de reconstrucción puede definirse por medio de la intersección sobrelapada de los abanicos de proyección que poseen las fuentes puntuales en sus ápices y el ancho de los arreglos sensores en sus bases. Es deseable que la geometría del cilindro de reconstrucción asegure que la sección transversal de la célula que fluye esté contenida por completo dentro del círculo de reconstrucción.

Hay varias opciones que pueden emplearse para crear fuentes puntuales ópticas, tales como:

\bullet un agujero pequeño frente a un láser o a otra fuente de protones de alta intensidad,

\bullet una fibra óptica con una pequeña sección transversal,

\bullet una lente de reducida distancia focal colocada frente a una fuente de fotones,

\bullet un rayo de electrones que irradie un punto en una superficie de fósforo (una forma de CRT), y

\bullet varias combinaciones de las anteriores.

La geometría es tal que mientras más cerca se halle la fuente puntual al objeto de interés (la célula) mayor será la magnificación debido al ángulo geométrico más amplio que está sustentado por un objeto más cercano a la fuente. A la inversa, si la resolución requerida se conoce de antemano al diseño del sistema, entonces puede optimizarse la geometría para dicha resolución particular. A modo de contexto, los expertos en la técnica pueden dirigirse a Blass, M., editor-in-chief, Handbook of Optics: Fiber Optics and Nonlinear Optics, 2nd ed., Vol. IV, Mcgraw-Hill, 2001.

En referencia, ahora, a la Fig. 8, la misma muestra, de forma esquemática un ejemplo de un arreglo en línea recta 23 usado en la reconstrucción celular como se pretende para el uso en una realización del método de la presente invención. Por ejemplo, dada una sección transversal de una célula 12 y de un núcleo 19 contenida en un círculo de reconstrucción de 30 micrómetros de diámetro y una resolución deseada de 0,5 micrómetros, luego el muestreo de Nyquist (o sea, sobremuestreo por un factor de dos) dicta que se requieren al menos 120 elementos de detección 33 para cada fuente puntual 21. La fuente puntual 21 en el ápice y la longitud del arreglo lineal 34 en la base forman un triángulo 35, de manera que la célula ejemplo de 30 micrómetros de diámetro cabe dentro del triángulo 35, tan cerca como resulta posible de la fuente puntual 21. En este ejemplo, si cada elemento del arreglo (p.ej. CCD) tiene un ancho de 20 micrómetros y la longitud del arreglo es 2400 micrómetros, entonces el centro de la célula puede estar localizado alrededor de 100 micrómetros (la mitad del diámetro del tubo capilar) contando a partir de la fuente puntual cuando la distancia entre la fuente puntual y el arreglo lineal es 8 milímetros, proporcionando una ampliación de 80 veces.

Como segundo ejemplo, considérese un círculo de reconstrucción de 30 micrómetros y un arreglo de sensores de semiconductor complementario de óxido metálico (CMOS), en el cual el tamaño del elemento píxel es 4 micrómetros. En este caso, el arreglo puede contener 120 elementos para un ancho de 480 micrómetros, y puede estar posicionado a 1,6 mm de la fuente puntual cuando la distancia entre la fuente puntual y la célula es 100 micrómetros, proporcionando una ampliación de 16 veces.

Elementos sensores

Cada fuente puntual tendrá un arreglo correspondiente de elementos sensores, tales como CCDs en algún arreglo geométrico recto o curvo, opuesto a la fuente puntual para recibir los rayos fotónicos transmitidos a través del círculo de reconstrucción. Por lo regular, el arreglo lineal puede tener su arreglo de elementos sensores centrado en la línea entre la fuente puntual y el eje de flujo central, y puede alinearse perpendicularmente al eje del flujo. Es posible usar arreglos 2D en los que sólo un subconjunto de cada línea de elementos dentro del arreglo 2D se lee para la entrada de la reconstrucción. En un arreglo 2D, cada subconjunto sucesivo de elementos puede relacionarse con el número adecuado de elementos para alinearlo correctamente con cada fuente puntual distinta a lo largo del arreglo helicoidal de fuentes puntuales.

Para la reconstrucción capa a capa por abanico-rayo empleando el ejemplo del círculo de reconstrucción de 30 micrómetros con 120 elementos sensores por abanico, para obtener una resolución de 0,5 micrómetros, es suficiente un arreglo con 2000x2000 elementos de 20 micrómetros para detectar 136 fuentes puntuales colocadas a incrementos de un grado radial, donde el promedio de separación entre vistas sucesivas es 300 micrómetros, donde ello es equivalente a 15 elementos sensores (en el centro del arreglo la separación puede ser de 140 micrómetros, o 7 elementos, mientras que en los bordes del arreglo, una separación de un grado radial entre vistas puede acarrear una diferencia considerablemente mayor). Si se promediaran grupos de 15 filas del arreglo sensor para proporcionar los datos de proyección para una capa, la resolución z dentro de la imagen de la célula puede ser de 3,75 micrómetros, en tanto si se promedian 2 filas para cada proyección, la resolución axial en el espacio objeto puede ser de 0,5 micrómetros, que equivalen a la resolución transaxial.

En una realización preferida para el uso en el método de la invención, el arreglo 2D se curva siguiendo una circunferencia cilíndrica que puede ser concéntrica con el cilindro de la reconstrucción, de manera que los caminos de los rayos son todos iguales en longitud. Para el caso de un círculo de reconstrucción de 30 micrómetros, un arreglo 2D que posea solo los elementos requeridos para oponerse a un locus helicoidal de fuentes puntuales puede ser una tira de 120 elementos de ancho por algún múltiplo de 136 elementos en altura (longitud) para el ejemplo descrito con anterioridad.

Aunque se describe la iluminación planar o "gruesa" en abanico con propósitos de la ilustración anterior, debe comprenderse que la iluminación verdadera, no colimada de cono-rayo puede emplearse de conjunto con detectores planares 2D, que proporcionan una reconstrucción 3D empleando algoritmos de cono-rayo. Las imágenes de proyección 2D pueden analizarse directamente para obtener, por ejemplo, información acerca del estado de la enfermedad o el estado de transformación de la célula. Para una reconstrucción directa, volumétrica, de cono-rayo, la iluminación a partir de una pluralidad de fuentes puntuales se multiplica de tal manera que, dado el arreglo geométrico de de las fuentes puntuales y los detectores, los conos de iluminación a partir de diferentes fuentes puntuales no se sobrelapan en el arreglo de sensores.

Además, si la célula fluye a velocidad de 1 metro/seg. (o 1.000.000 micrómetros/seg.) y cada elemento en el arreglo 2D posee 20 micrómetros de ancho, entonces una lectura tomada cada 20 microsegundos puede fácilmente capturar datos dentro de capas de la célula de 0,25 micrómetros. Para el caso en que se promedian 15 filas de sensores para proporcionar los datos para una capa de 3,75 micrómetros, las lecturas tendrían que tomarse cada 300 microsegundos. Una mejora significativa en la reconstrucción de la calidad de la imagen se logra por medio del uso de un arreglo 2D mayor.

Una realización para el uso en el método de la presente invención especialmente adecuada para la toma de imágenes multiespectrales de un número de bandas de longitud de onda transmitida o emitida puede incluir de manera ventajosa dos o más módulos de reconstrucción dispuestos en serie. Tales cilindros de reconstrucción múltiples pueden separarse por medio de secciones intercaladas de tubo capilar, y cada módulo proporciona datos de proyección adecuados para producir una imagen reconstruida completa de los objetos que fluyen a través de él. Las fuentes puntuales y/o arreglos de sensores para cada uno de los varios módulos de reconstrucción pueden optimizarse para una banda espectral particular. Por ejemplo, un primer módulo de reconstrucción puede emplear una iluminación de luz blanca intensa y una detección no filtrada para proporcionar un conjunto completo de datos de proyección para reconstruir un mapa de la densidad óptica del objeto, los coeficientes de absorción o dispersión, mientras que un segundo módulo de reconstrucción puede emplear iluminación, tal como un láser de argón iónico (488 nm), en una banda espectral estrecha, centrada alrededor de 495 nm, para excitar proteínas marcadas con sondas fluorescentes para un estudio de inmunofluorescencia, de conjunto con arreglos de sensores filtrados, sensibles a la emisión a 520 nm, para proporcionar un segundo conjunto completo de datos de proyección, suficiente para delinear mapas der la distribución de concentración de las proteínas marcadas por medio del uso de algoritmos de reconstrucción de la emisión, como se describe a continuación. Un tercer módulo de reconstrucción más puede usar iluminación de banda estrecha centrada alrededor de 535 y/o 342 nm para excitar al yoduro de propidio unido estequiométricamente al ADN y arreglos de sensores filtrados para detectar de manera óptima las emisiones rojas (617 nm) para estudios de ploidía. Debe comprenderse que los ejemplos anteriormente mencionados tienen propósitos ilustrativos, y que el método se aplica, de modo general, a cualquier combinación de longitudes de onda para iluminar y detectar.

Reconstrucción de la imagen

Los algoritmos más comunes y fáciles de implementar de reconstrucción, conocidos como métodos de proyección reversa filtrada, se derivan a partir de un paradigma similar en la tomografía computarizada de rayos X (CT) usando geometría de cono-rayo y de abanico-rayo (véanse las siguientes referencias, por ejemplo, Kak, A.C. y Slaney, M., Principles of Computerized Tomographic Imaging, IEEE Press, New York, 1988, y Herman, G., Image Reconstruction from Projections: The Fundamentals of Computerized Tomography, Academic Press, New York, 1980). Estos métodos se basan en los teoremas para las transformaciones de Radón con modificaciones que reflejan la geometría particular de la configuración fuente/detector y los caminos de los rayos en la fuente de irradiación. Sin embargo, en el caso de la CT clínica de rayos X, para la adquisición capa a capa, el sujeto humano por lo general se mantiene inmóvil mientras la fuente de rayos X y los arreglos de detectores pueden moverse a lo largo de un arco alrededor del paciente para tomar datos a partir de múltiples ángulos de proyección dentro de una capa dada. Luego, el sujeto humano se reposiciona a lo largo del eje z y se toman los datos de otra capa, etc. De manera alternativa, en la más moderna CT clínica helicoidal, el paciente puede trasladarse de manera continua en la dirección z mientras el conjunto fuente-detector rota de manera continua para proporcionar datos de proyección helicoidal, lo cual se interpola luego para proporcionar proyecciones ortogonales al eje z del paciente. En la tomografía óptica de flujo, el sujeto (una célula) se mueve a velocidad constante en relación con las fuentes estacionarias y los arreglos de detectores, en los cuales, la pluralidad de los sistemas fuente/detector adquieren datos en sincronía con puntos de tiempo específicos desencadenados a lo largo del vector velocidad de la célula de manera que se generan datos de múltiples ángulos de proyección dentro de una capa o volumen dado. Para el barrido capa a capa, el algoritmo de reconstrucción calculará una imagen 2D de un plano perpendicular al eje del movimiento, y el apilamiento en serie de múltiples capas generará la imagen 3D del sujeto en la que el contraste es una función de las variaciones en el coeficiente de atenuación de los rayos X o la densidad óptica dentro del sujeto para la CT o la tomografía óptica de flujo, respectivamente. Para el barrido volumétrico de cono-rayo, el algoritmo de reconstrucción calcula una imagen 3D de un volumen dentro de la célula u otro objeto directamente a partir de la transmisión planar o las proyecciones ópticas de emisión, donde el contraste es una función de la densidad óptica y/o la distribución de densidad de la sonda marcada mediante fluorescencia, respectivamente, dentro del objeto cuya imagen se obtiene.

Puede resultar deseable sea para cualquiera de los datos de transmisión producir la reconstrucción de la densidad celular o para los datos de emisión, reconstruir la distribución de la sonda marcada mediante fluorescencia, o ambos, para emplear algoritmos de reconstrucción de imágenes diferentes a la retroproyección filtrada. La clase general conocida como algoritmos de reconstrucción iterativos es más eficaz en algunos casos, especialmente para la tomografía de emisión o, cuando resulta posible, como una instancia del método de la presente invención, en especial para la tomografía de emisión, o cuando resulta posible, como un caso del método de la presente invención, donde la simetría axial y la naturaleza de tricompartimentación del objeto resultan conocidas, para incorporar información a priori al algoritmo de reconstrucción, para mejorar la calidad de la reconstrucción (véase, por ejemplo, Gilbert, P., "Iterative Methods for the Three-dimensional Reconstruction of an Object from Projections", Journal of Theoretical Biology 36:105-17, 1972, y otras referencias ya mencionadas con anterioridad).

De manera similar, un método puede emplear de forma ventajosa los algoritmos de reconstrucción estadística de modelación basada en elemento finito (FEM). Los algoritmos FEM se derivan a partir de la teoría de transporte lineal, en la que la ecuación de difusión/migración del fotón se resuelve en todas las fronteras de los elementos para producir un mapa bidimensional o tridimensional de alguna combinación de las propiedades de absorción, dispersión, índice refractivo y factor anisotrópico del objeto cuya imagen se obtiene. Ejemplos de estos métodos se muestran en Paulsen, K.D. y Jiang, H., "Spatially Varying Optical Property Reconstruction Using a Finite Element Diffusion Equation Approximation", Medical Physics 22 (691-701) 1995, Hampel, U. and Freyer, R., "Fast Image Reconstruction for Optical Absorption Tomography in Media with Radially Symmetric Boundaries", Medical Physics 25 (1): 92-101, 1998, y Jiang, H., Paulsen, K.D., y Osterberg, U.L., "Frequency-domain Near-infrared Photo Difusión Imaging: Initial Evaluation in Multitarget Tissuelike Phantoms", Medical Physics 25(2): 183-93,1998.

Separación cromática

Si se usa una fuente puntual policromática (p. ej., luz blanca) se pueden utilizar diferentes tinciones cromáticas (p. ej., cromóforos) para distinguir un número de sondas moleculares y características estructurales dentro de una célula determinada. Aquí, filtros de banda en serie en la fuente o en los arreglos de sensores (o en ambos) separan los datos de la longitud de onda y permiten la reconstrucción y localización espacial de las moléculas individuales teñidas. Un método más robusto para obtener imágenes a partir de múltiples sondas involucra una fuente de luz blanca intensa y la toma inmediata de múltiples longitudes de onda filtradas en los arreglos de sensores, lo que permite a los algoritmos de reconstrucción de imágenes calcular las capas espaciales para cada cromóforo. Los mismos pueden mostrarse como imágenes coloreadas.

Fluorescencia, fosforescencia, quimiluminiscencia y emisión de nanopartículas

Como un caso especial del sistema de tomografía óptica de flujo, ciertas sondas moleculares pueden marcarse con un "reportero" que emita luz a una longitud de onda diferente (mayor) cuando se le estimula por medio de la fuente primaria de fotones. La emisión secundaria del reportero puede filtrarse con filtros ópticos estándar para separar los fotones de la fuente primaria de los fotones de emisión secundaria. Sin embargo, el algoritmo de reconstrucción de imagen obtenida mediante emisión secundaria de fotones es más complicado, porque los fotones secundarios no necesariamente aparecen en un rayo de camino directo a partir de la fuente puntual. Se asume que los fotones secundarios irradian a partir de la fuente puntual secundaria en un patrón esférico uniforme, por tanto, la intensidad de los fotones secundarios que alcanzan cualquier elemento sensible será una función simple de la distancia al elemento de detección. Un refinamiento superior puede alcanzarse por medio de la distribución no esférica de fotones a partir de la fuente secundaria proporcionando un modelo de la distribución espacial de los fotones secundarios, en relación con la fuente puntual y dentro de la capa de reconstrucción. Cada método proporcionará una forma de calcular la localización de la fuente secundaria en la capa o el volumen de reconstrucción. La colimación entre el objeto del que se obtienen las imágenes y los arreglos de sensores mejorarán la reconstrucción de la imagen.

Si la intensidad de los fotones primarios y la intensidad de los fotones secundarios se miden de manera simultánea por medio de filtración óptica, la reconstrucción de densidad de alta resolución a partir de las intensidades de los fotones primarios pueden superponerse sobre o fundirse con la reconstrucción de la fuente secundaria, de manera que la morfología de la imagen, de conjunto con la concentración de la sonda localizada estén disponibles en una única imagen reconstruida. En dependencia de la intensidad, la relación señal a ruido y la capacidad de filtrar o producir anchos de banda estrechos de fotones en la fuente y/o los sensores, puede resultar ventajoso usar múltiples fuentes secundarias, cada una de las cuales corresponda a una sonda molecular marcada de forma diferente.

Como se describió con anterioridad, la presente invención es un método para la detección automática y la compartimentación de marcadores moleculares teñidos o marcados de manera específica con sondas moleculares a partir de proyecciones ópticas y la reconstrucción tomográfica de células obtenidas a partir de un paciente como se define en las reivindicaciones 1-21 que se anexan. Se puede llevar a cabo una determinación de si el paciente tiene un cáncer maligno por medio de la presencia o ausencia de la expresión y la compartimentación de marcadores moleculares inadecuados.

En referencia, ahora a la Fig. 9, en la misma se muestra de manera esquemática un ejemplo de un método de clasificación con los datos de la reconstrucción celular como se pretende en la realización de la presente invención. El sistema puede incluir varios clasificadores que pueden trabajar de manera conjunta para determinar si una muestra particular de células contiene células de interés y si dichas células muestran una expresión y/o compartimentación inadecuada de marcadores moleculares, que estén asociadas a enfermedades. Un clasificador es un programa informático que analiza un objeto sobre la base de los valores de determinadas características 91. El sistema de clasificación automática para el uso en la presente invención puede incluir, por ejemplo, un clasificador primario, 90, que lleva a cabo una función básica de pesquisaje, y selecciona objetos de interés. Un clasificador secundario, 92, clasifica los objetos como morfológicamente anormales o morfológicamente normales y como que poseen una expresión y/o compartimentación inadecuada del marcador molecular, asociada con una enfermedad, o como normal y que no exhibe una expresión y/o compartimentación inadecuada del marcador molecular relacionadas con una enfermedad. Un informe, 93 puede proporcionarse, que detalle los resultados de la clasificación de cualquiera o todos los clasificadores. Debe comprenderse que muchos y variados clasificadores pueden emplearse. Esto depende de la aplicación.

Como se apuntó con anterioridad, en tanto el sistema automático para el uso en el método de la presente invención puede incluir un clasificador primario y otro secundario, se puede usar un único clasificador para obtener de manera secuencial las clasificaciones alcanzadas por el método de la presente invención. Los paquetes de software empleados para generar las funciones de clasificación basadas en métodos estadísticos por lo general están disponibles comercialmente.

El clasificador automático usado en el método de la presente invención incluye de manera preferencial clasificadores que utilizan decisiones binarias difusas o decisiones de estadística tipo Bayesian basadas en características de marcadores moleculares en el desempeño de su función de clasificación. El clasificador puede construirse de manera que incluya un gran número de valores de características, por ejemplo, incluyendo características de compartimentación de los marcadores moleculares, características morfológicas, características fotométricas, características de textura discreta, características de textura tipo Markovian, características de textura no del tipo Markovian, características de textura fractal y características de textura de largo de corrida.

El clasificador primario puede funcionar, por lo regular, para subdividir objetos de interés en tres clases: (1) células que contienen información de diagnóstico incluyendo marcadores moleculares y su compartimentación que están asociados con la enfermedad; (2) células inflamatorias; y (3) artefactos. El clasificador primario puede afectar la clasificación célula a célula por medio de un árbol de decisión que incorpore una selección de valores de características.

Como se indicó con anterioridad, la capacidad del sistema usado en el método de la presente invención para distinguir células y núcleos celulares de artefactos, y células que poseen una compartimentación de marcadores moleculares asociada a una enfermedad de otras células normales depende de la capacidad del clasificador de hacer distinciones basadas en los valores de las características calculadas. Por ejemplo, para distinguir las células normales de células anormales (o sea, células que sirven para el diagnóstico), el método de la presente invención puede aplicar varias funciones de discriminación distintas, cada una de las cuales se entrena para identificar tipos particulares de objetos y cambios particulares en la expresión y/o compartimentación de marcadores moleculares.

El clasificador secundario clasifica las células en la muestra de células seleccionadas por el clasificador primario y también usa un árbol de decisión y valores de características en el desempeño de su función de clasificación. El clasificador secundario, que puede ser considerado como un clasificador muestra a muestra, analiza las células clasificadas por el clasificador primario y clasifica las muestras en las que poseen características asociadas con el cáncer y las que no poseen características asociadas al cáncer. Del mismo modo que con el clasificador primario, el clasificador secundario se construye para distinguir las células sobre la base de un conjunto de compartimentaciones de marcadores moleculares preferidos.

El clasificador puede incluir al menos una función de discriminación, cuya función de discriminación emplea características de los mapas de sombras para clasificar células de interés en la muestra, incluyendo, pero sin limitarse a, la expresión y compartimentación de marcadores moleculares y características seleccionadas del grupo compuesto por el área, el radio medio, la varianza de la densidad óptica (OD), la estrechez del perfil de la OD, el intervalo de la OD, la OD media, la OD máxima, la densidad de las manchas (spots) luminosos, la distancia promedio superior, la distancia promedio media/superior, la correlación, la homogeneidad, la entropía, la dimensión fractal, la textura, el patrón de puntos, los componentes conectados, el análisis de primeros vecinos, y los diferentes harmónicos en el espacio de frecuencia de densidad espacial.

En referencia, ahora a la Fig. 10, en la misma se muestra esquemáticamente un proceso que ejemplifica la determinación de la compartimentación de una sonda molecular. En un primer paso, 94 se extraen las características a partir de las imágenes de proyección o las imágenes 3D reconstruidas. En el paso 95 se identifican los bordes, fronteras, límites, áreas, superficies y volúmenes dentro del objeto de interés empleando técnicas conocidas para la localización de bordes, por ejemplo. Luego de la extracción de las características a partir de las imágenes de proyección o las imágenes 3D reconstruidas, se emplean dichas características para encontrar objetos de interés en el paso 96, lo que puede lograrse por medio del sistema de clasificación descrito en la Fig. 9, con anterioridad. En el paso 97, luego de la identificación de determinados objetos de interés, se delinean mapas de las densidades de la sonda molecular asociadas al objeto de interés con respecto al objeto correspondiente, como medida de la compartimentación de la sonda(s) en el paso 98. Por ejemplo, la concentración de una sonda A asociada a un objeto de interés X será una medida de la concentración de las moléculas blanco asociadas con dicho objeto y, como tal, es la compartimentación del blanco dentro de la célula.

En referencia, ahora, a la Fig. 11, en la misma se muestra de manera esquemática, ejemplos de compartimentos que pueden ser de interés. En el caso más simple, una célula 1 puede dividirse en dos compartimentos, el compartimento citoplasmático 18 y el compartimento nuclear 19. Los marcadores moleculares pueden compartimentarse dentro de los compartimentos citoplasmático o nuclear de una célula. En otro ejemplo, el compartimento citoplasmático puede subdividirse a su vez en otros compartimentos, tales como las mitocondrias, el retículo endoplasmático y los lisosomas. En otro ejemplo diferente, los organelos tales como los nucléolos pueden definirse como compartimentos dentro del compartimento nuclear. En otro ejemplo diferente, se pueden definir como compartimentos estructuras transientes, tales como los cromosomas condensados 36. Una persona con conocimiento de la técnica reconocerá que cualquier estructura molecular que pueda localizarse en el espacio intracelular puede ser definida como compartimento.

En referencia, ahora, a la Fig. 12, se muestra de manera esquemática un diagrama de bloque de un método para la detección de células con la compartimentación de marcadores moleculares asociados a la malignidad y/o la enfermedad, incluyendo un cáncer. El método incluye:

: la obtención de una muestra celular que posee una pluralidad de células y la suspensión de dicha pluralidad de células en una solución en el paso 100;

: si se requiere, la fijación de la pluralidad de células de la muestra celular en el paso 102;

: el marcaje de al menos un marcador molecular en la pluralidad de células con sondas moleculares marcadas o teñidas en el paso 103;

: la iluminación de al menos una célula de la pluralidad de células con al menos una fuente puntual de luz en el paso 104;

: la obtención de al menos dos imágenes de proyección diferentes a través de al menos una célula con un detector de composición digital en el paso 105;

: la compensación de al menos dos imágenes de proyección para eliminar las variaciones de la iluminación en el paso 106;

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: el análisis de al menos dos imágenes de proyección para detectar al menos un marcador molecular marcado que posea características densitométricas y de localización en el paso 107;

: el análisis de la localización de al menos un marcador molecular dentro de al menos una célula, en el paso 108;

: la medición de la compartimentación de al menos un marcador molecular marcado por medio del uso de las características densitométricas y de localización en el paso 109; y

: el análisis de la compartimentación de al menos un marcador molecular marcado con al menos un clasificador para la detección de malignidades y/o compartimentación del marcador asociada a enfermedad en el paso 110.

En un ejemplo de realización, el paso 106 de la compensación de al menos dos imágenes de proyección para eliminar variaciones en la iluminación puede lograrse por medio del uso de técnicas de procesamiento de imágenes y técnicas ópticas convencionales. El análisis de al menos dos imágenes de proyección para detectar al menos un marcador molecular marcado que posea características densitométricas y de localización en el paso 107, puede llevarse a cabo empleando las técnicas descritas en la Patente US 6.519.355 concedida a Alan C. Nelson, el 11 de febrero de 2003, titulada "OPTICAL PROJECTION IMAGING SYSTEM AND METHOD FOR AUTOMATICALLY DETECTING CELLS HAVING NUCLEAR AND CYTOPLASMIC DENSITOMETRIC FEATURES ASSOCIATED WITH DISEASE".

El paso 108, que analiza la localización de al menos un marcador molecular dentro de al menos una célula, puede llevarse a cabo empleando las técnicas descritas en la solicitud pendiente US, número 10/147.154, de Alan C. Nelson, enviada el 13 de mayo de 2002, titulada, "METHOD AND APPARATUS FOR EMISSION COMPUTED TOMOGRAPHY USING TEMPORAL SIGNATURES".

El paso 109, la medición de la compartimentación puede incluir de manera ventajosa el análisis de la textura de las características de densidad formadas por al menos un marcador molecular marcado, localizado dentro de las superficies de unión coincidentes localizadas dentro de al menos dos imágenes de proyección. Además, el paso de la medición de la compartimentación puede incluir, de manera ventajosa, la comparación de las superficies frontera dentro de al menos dos de las imágenes de proyección, para determinar un conjunto de superficies de frontera coincidentes entre las al menos dos imágenes de proyección. El paso de la medición de la compartimentación puede incluir además, de manera ventajosa, la determinación de la colocalización de al menos dos marcadores moleculares marcados en el espacio 3D. El paso de la medición de la compartimentación puede incluir además, de manera ventajosa, la determinación de la colocalización de al menos dos marcadores marcados en el espacio 2D. El paso de la medición de la compartimentación puede incluir también, de manera ventajosa, el análisis de la textura de las características de densidad de al menos dos marcadores moleculares en relación mutua, por ejemplo, mediante el empleo de técnicas de la solicitud US mencionada con anterioridad de Nelson, número 10/147.154.

En una realización preferida, un compartimento puede ser cualquier espacio tridimensional que posea fronteras dentro de una célula, según pueda discernirse mediante FOT. La muestra celular puede ser un espécimen de pulmón humano, un espécimen de cerviz humana, un espécimen sanguíneo, o puede contener células raras. En un ejemplo, la tinción de una muestra para identificar la compartimentación de marcadores moleculares incluye hacer reaccionar las células con anticuerpo anti-pRb. En otro ejemplo, una proteína de unión específica a metil CpG puede emplearse para teñir el ADN metilado.

El sistema empleado en el método de la invención resulta útil para el análisis de varios tipos de células biológicas. En un ejemplo, la célula de interés puede seleccionarse para realizar un diagnóstico de cáncer, y/o la célula de interés puede ser, de manera ventajosa, una célula de cáncer preinvasivo. La célula de interés puede contener una célula de cáncer invasivo, cuyas células de interés se emplean para el pesquisaje de un paciente en busca de cáncer. Las células de interés pueden utilizarse también para determinar si un paciente desarrollará cáncer. La célula cancerosa puede obtenerse a partir de un cáncer epitelial. De manera alternativa. o además, la célula de cáncer preinvasivo puede ser de origen epitelial. El cáncer epitelial puede seleccionarse, de manera ventajosa, a partir del grupo que incluye al cáncer de pulmón y garganta, el cáncer de ovario y cuello del útero, el cáncer de mamas, el cáncer de próstata, el cáncer de vejiga, el cáncer de piel, y el cáncer del tracto gastrointestinal.

En otra realización, la compartimentación del marcador molecular asociada a enfermedad se determina por medio de la medición de la compartimentación de marcadores que incluyen, pero no se limitan a, pRb, p53/p53BP1, SAM68, PTEN, E2F y c-myc en un número significativo de muestras de esputo tomadas a partir de individuos con cáncer de pulmón y la comparación de la compartimentación de estos marcadores moleculares en individuos normales y la determinación de cuáles marcadores moleculares poseen una compartimentación que sea distinguible entre los dos grupos. Otros marcadores moleculares también pueden muestrearse en busca de compartimentación asociada a enfermedades, de la misma manera.

La invención se ha descrito en el presente documento con considerable detalle, con el objetivo de cumplir con los Estatutos de Patentes y para proveer a los expertos en la técnica de la información necesaria para aplicar los novedosos principios de la presente invención, y para construir y usar los componentes ejemplificados y especializados como se les requiera. Sin embargo, debe comprenderse que la invención puede llevarse a vías de hecho por medio de un equipamiento y dispositivos y algoritmos de reconstrucción específicamente diferentes, y que las distintas modificaciones, tanto en los detalles del equipamiento y los procedimientos operativos, pueden lograrse sin separarse del alcance de la presente invención.

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Referencias citadas en la descripción

Este listado de referencias citadas por el solicitante tiene como único fin la conveniencia del lector. No forma parte del documento de la Patente Europea. Aunque se ha puesto gran cuidado en la compilación de las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la OEP rechaza cualquier responsabilidad en este sentido.

Documentos de patentes citados en la descripción

\bullet US 6026174 A: \bullet US 5402460 A, Johnson

\bullet WO 0235474 A: \bullet US 6519355 B

\bullet US 147154 A

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Claims

1. Un método para la detección de células con una compartimentación de marcadores moleculares asociada a la malignidad y/o la enfermedad, incluyendo un cáncer, el método comprende las etapas:

a): obtener una muestra celular que posea una pluralidad de células (1) y suspender (100) la pluralidad de células en una solución;

c): marcar (103) al menos un marcador molecular en la pluralidad de células con sondas moleculares marcadas o tintes;

d): iluminar (104) al menos una célula (1) de la pluralidad de células con al menos una fuente puntual de luz (21a, 21b, 21c);

e): obtener (105) al menos una imagen de proyección a través de al menos una célula (1) con un arreglo de detectores (23a, 23b, 23c), donde la al menos una imagen de proyección se obtiene usando (104) la al menos una fuente puntual de luz (21a, 21b, 21c) de conjunto con un arreglo opuesto de detectores, donde se genera un conjunto de rayos de proyección (31), cuyos rayos de proyección se definen como líneas rectas que pasan a través de la célula y conectan la al menos una fuente puntual de luz (21) con un elemento sensor individual (33) de dicho arreglo opuesto de detectores (23a, 23b, 23c), permitiendo de ese modo la adquisición de proyecciones de la luz trasmitida a través de la al menos una célula (1);

f): compensar (106) la al menos una imagen de proyección para corregir variaciones en la iluminación;

g): analizar (107) la al menos una imagen de proyección para detectar al menos un marcador molecular marcado que posea características densitométricas y de localización;

h): analizar (108) la localización de al menos un marcador molecular dentro de la al menos una célula (1);

i): medir (109) la compartimentación del al menos un marcador molecular por medio del uso de características densitométricas y de localización; y

j): analizar (110) la compartimentación del al menos un marcador molecular con al menos un clasificador para detectar la compartimentación de marcadores asociada a la malignidad y/o la enfermedad.

2. El método de la reivindicación 1 que comprende, entre los pasos a) y c) el paso de:

b): fijar (102) la pluralidad de células de la muestra celular.

3. El método de las reivindicación 1 o la reivindicación 2, en los que la al menos una imagen de proyección comprende al menos dos imágenes de proyección diferentes.

4. El método de la reivindicación 1, en el que el paso h) comprende el análisis de la localización de al menos un marcador molecular en el espacio bidimensional dentro de la mencionada al menos una célula (1, 108).

5. El método de la reivindicación 3, en el que el paso de obtener al menos dos imágenes de proyección diferentes (105) comprende además, el emplear un sistema de tomografía óptica para obtener las al menos dos imágenes de proyección.

6. El método de la reivindicación 5, en el que el sistema de tomografía óptica comprende un sistema de tomografía óptica de flujo.

7. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 3, en el que la muestra celular comprende al menos un espécimen aislado, seleccionado a partir del grupo que consta de esputo, lavado bronquio-alveolar, raspado bucal, orina, raspados y rastros cervicales, aspirados de pezones, lavados de pezones, heces, aspirados con aguja fina de órganos blanco y sangre.

8. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 3, que comprende, además, el paso de desnudar el citoplasma (18) de la pluralidad de células (1).

9. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 3, en el que el cáncer se selecciona a partir del grupo que consta de cáncer de pulmón, vejiga, cuello uterino, mamas, colon, recto, próstata, células de ovario y sanguíneas.

10. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 3, en el que las sondas moleculares se seleccionan a partir del grupo que consta de anticuerpos, proteínas de unión específica, lectinas, sondas de ácidos nucleicos marcadas con cromóforos, fluorósforos, enzimas que pueden generar cromóforos y enzimas que pueden generar fluoróforos.

11. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 3, en el que al menos un marcador molecular marcado se selecciona a partir del grupo que consta de pRb, p53/p53BP1, E2F, PTEN, SAM68, BRCA1, c-myc y metil CpG.

12. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 3, en el que al menos un marcador molecular marcado muestra una compartimentación diferente entre las células (1) o los núcleos celulares (19) tomados a partir de individuos con cáncer y células (1) o núcleos celulares (19) tomados a partir de individuos sin cáncer.

13. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 3 que consta además del paso de emplear el análisis de imágenes para la reconstrucción de las superficies de fronteras (12,13) de al menos un compartimento celular (18, 19, 36) dentro del cual se encuentra al menos un marcador molecular marcado.

14. El método de la reivindicación 3, en el que el paso de medir la compartimentación consta además del paso de analizar la textura de las características de densidad formadas por el al menos un marcador molecular localizado dentro de superficies de frontera coincidentes (12, 13) localizadas dentro de al menos dos imágenes de proyección.

15. El método de la reivindicación 14, que comprende además el paso de comparar las superficies de frontera (12, 13) dentro de las al menos dos imágenes de proyección para determinar un conjunto de superficies de frontera coincidentes (12, 13) entre las al menos dos imágenes de proyección.

16. El método de la reivindicación 3, en el que el paso de medir la compartimentación (109) comprende además el paso de determinar la colocalización de al menos dos marcadores marcados en el espacio 3D reconstruido.

17. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 3, en el que el paso de medir la compartimentación (109) consta además del paso de determinar la colocalización de al menos dos marcadores marcados en el espacio 2D.

18. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 3, en el que el paso de medir la compartimentación (109) consta además del paso de analizar la textura de las características de densidad de al menos dos marcadores marcados en relación mutua.

19. El método de la reivindicación 14, en el que la textura de las características de densidad se selecciona a partir del grupo que consta de la varianza de densidad óptica (OD), estrechez de la distribución de OD, intervalo de OD, OD promedio, OD máxima, densidad de los manchas (spots) luminosos, distancia promedio superior, distancia media/superior promedio, correlación, homogeneidad, entropía, dimensión fractal, patrón de puntos, análisis de primeros vecinos, componentes conectados, análisis de primeros vecinos y harmónicos en el espacio de frecuencia de densidad espacial.

20. El método de la reivindicación 16, en el que el paso de medir la compartimentación (109) consta además del paso de detectar las islas CpG metiladas en las regiones promotoras de genes supresores de tumores por medio de la colocalización de metil CpG y las secuencias de ADN específicas para las regiones promotoras de los genes blanco que son marcados con las proteínas de unión a metil CpG y las sondas de ácidos nucleicos.

21. El método de la reivindicación 17, en el que el paso de medir la compartimentación (109) consta además del paso de detectar las islas de CpG metiladas en las regiones promotoras de genes supresores de tumores mediante la colocalización de metil CpG y las secuencias de ADN específicas para las regiones promotoras de los genes blanco que son marcados con las proteínas de unión a metil CpG y las sondas de ácidos nucleicos.