ES2316764T3

ES2316764T3 - Sistema de imaginologia por proyeccion optica y metodo para la deteccion automatica de celulas.

Info

Publication number: ES2316764T3
Application number: ES03732015T
Authority: ES
Inventors: Alan C. Nelson
Original assignee: VisionGate Inc
Current assignee: VisionGate Inc
Priority date: 2002-01-22
Filing date: 2003-01-21
Publication date: 2009-04-16
Anticipated expiration: 2023-01-21
Also published as: DE60323605D1; AU2003210590B2; JP2005539209A; WO2003061454A2; US20020150285A1; EP1474033A2; CA2473678A1; JP4718777B2; CN1623163A; CN1294520C; US6519355B2; HK1072492A1; CA2473678C; EP1474033B1; EP1474033A4; WO2003061454A3; ATE408868T1

Abstract

Un método para detectar células de interés (1) en una muestra de célula, que comprende los pasos de: obtener una muestra de célula y suspender las células (1) en la solución (17); preparar las células (1) de la muestra de célula en la solución; marcar las células (1) para generar densidades ópticas dentro de cada célula de la muestra; iluminar la muestra con al menos una fuente de puntos de luz (21), en donde las células son presentadas una a una para la iluminación; obtener al menos dos imágenes de proyección a través de la muestra con un detector (23) de colección digital; compensar las al menos dos imágenes de proyección para variaciones en la iluminación de fondo; analizar las al menos dos imágenes de proyección para detectar al menos un objeto de interés; calcular un conjunto de valores característicos (94) para el al menos un objeto de interés, incluyendo valores característicos unidimensionales (1D) y valores característicos bidimensionales (2D), donde los valores 1D y 2D son calculados usando densidades ópticas generadas en el al menos un objeto de interés; proporcionar el conjunto de valores característicos (94) para al menos un clasificador (90); usar el conjunto de valores característicos (94) y el al menos un clasificador (90) para identificar el al menos un objeto de interés desde la muestra de célula; Y combinar las al menos dos imágenes de proyección usando métodos para la reconstrucción de imagen computarizada para generar imágenes tomográficas multidimensionales, en donde los métodos de reconstrucción de imagen computarizada incluyen métodos seleccionados del grupo consistente en geometrías de proyección de haz en abanico y geometrías de proyección de haz en cono.

Description

Sistema de imaginología por proyección óptica y método para la detección automática de células.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a sistemas de imaginología por proyección en general y a la clasificación de células, y más en particular, a sistemas automatizados de flujo de alto rendimiento basados en la utilización de la imaginología por proyección, como por tomografía óptica de flujo (TOF), para detectar células anormales y cancerosas y para detectar células raras basados en mediciones altamente cuantitativas de características densitométricas nucleares y citoplásmicas (CDNs y CDCs) asociadas con la enfermedad.

Antecedentes de la invención

El método más común de diagnosticar cáncer en pacientes es obteniendo una muestra del tejido sospechoso y examinándola en un microscopio en busca de la presencia de células obviamente cancerosas. Mientras este proceso es relativamente fácil cuando es conocida la posición anatómica del tejido sospechoso, no es tan fácil cuando no hay tumor o lesión precancerosa fácilmente identificable. Por ejemplo, detectar la presencia de cáncer pulmonar a partir de una muestra de esputo requiere que estén presentes en la muestra una o más células de cáncer relativamente raras. Por consiguiente, los pacientes que tienen cáncer pulmonar no pueden ser diagnosticados correctamente si la muestra no refleja perceptiva y exactamente las condiciones del pulmón.

Un ejemplo de un método y sistema basado en microscopio para detectar células de diagnóstico y células que tienen alteraciones asociadas a malignidad es revelado en Palcic et al., Patente de Estados Unidos 6 026 174. El sistema Palcic et al. incluye un clasificador automatizado que tiene un microscopio convencional, cámara, digitalizador de imagen, un sistema de ordenador para controlar e interconectar estos componentes, un clasificador primario para la clasificación inicial de la célula, y un clasificador secundario para la subsiguiente clasificación de la célula. El método utiliza el clasificador automatizado para detectar automáticamente células de diagnóstico y células que tienen alteraciones asociadas a malignidad. Sin embargo, la calidad del resultado del diagnóstico está limitada por el uso de un microscopio convencional, lo cual no permite mediciones precisas de densidades de la tintura. El método de Palcic et al. no se dirige al uso de sondas moleculares.

Con el advenimiento de sondas moleculares, tales como sondas de anticuerpos y sondas de hibridación de ácido nucleico, pueden ser tratadas nuevas cuestiones relacionadas con las enfermedades etiquetando estas sondas moleculares y luego midiendo su localización y concentración dentro de células y tejidos biológicos. Como está emergiendo la necesidad de localizar y cuantificar con más precisión a estas sondas, hay una necesidad concomitante para técnicas mejoradas de medir microscópicamente densidades de la sonda en dos dimensiones (2D) y tres dimensiones (3D). La microscopía de luz visible convencional, la cual utiliza células montadas sobre láminas de vidrio, sólo puede aproximar mediciones 2D y 3D debido a limitaciones en la profundidad del plano focal, ángulos de muestreo, y problemas con las preparaciones de las células que típicamente causan que las células se solapamienton en el plano de la imagen. Otro inconveniente de la microscopía de luz visible es la limitación inherente de mirar a través de un lente objetivo donde sólo el área dentro del estrecho plano focal proporciona datos precisos para el análisis.

Los métodos de citometría de flujo generalmente vencen el problema del solapamiento de células haciendo fluir las células una a una en una corriente fluida. Desafortunadamente, los sistemas de citometría de flujo no generan imágenes de células de la misma calidad que la microscopía de luz visible tradicional, y, en cualquier caso, las imágenes no son tridimensionales. Para más información, los expertos en la técnica pueden consultar Shapiro, HM, Practical Flow Cytometry, 3ra ed., Wiley-Liss, 1995.

En el área de la tomografía asistida por ordenador, la Patente de Estados Unidos No. 5 402 460, publicada el 28 de marzo de 1995, de Johnson et al., titulada "Three-dimensional Microtomographic Analysis System" revela un sistema microtomográfico para generar imágenes tridimensionales de alta resolución de un espécimen usando un generador de rayos X y un detector de rayos X que mide la atenuación del haz de rayos X a lo largo del espécimen. Con el sistema microtomográfico de Johnson et al., son hechas dos proyecciones de cada vista del espécimen, cada una usando un haz de rayos X de diferente energía. Después que son hechas las dos proyecciones de una vista del espécimen, el espécimen es rotado sobre la agarradera del espécimen y se hace otro conjunto de proyecciones. Las proyecciones de cada vista del espécimen son analizadas juntas para proporcionar una indicación cuantitativa de la fracción de la fase del material que contiene al espécimen. Las proyecciones de las vistas diferentes son combinadas para proporcionar una imagen tridimensional del espécimen. La Patente de Estados Unidos No. 5 402 460 es incorporada en la presente solicitud como referencia. Aunque la tecnología de rayos X como es mostrada por la Patente de Estados Unidos No. 5 402 460 es útil para algunas aplicaciones, no proporciona una solución óptica útil para la citometría de flujo, por medio de la cual uno podría medir la distribución 3D de densidad molecular dentro de una célula
biológica.

Es una motivación de esta invención, para superar las limitaciones mencionadas anteriormente y otras encontradas en tales sistemas, combinar la presentación de las células una a una de la citometría de flujo con la tomografía óptica computacional desde múltiples proyecciones de fuente de puntos para reconstruir la información de densidad dentro de una célula a partir de una pluralidad de proyecciones. La información de densidad 3D reconstruida permite la medición precisa de características densitométricas nucleares (CDNs) y características densitométricas citoplásmicas (CDCs).

Las CDNs y CDCs referidas en la presente solicitud son únicas para los sistemas de imaginología por proyección que no requieren el uso de lentes y planos focales con su artefacto de aspecto borroso inherente no deseado debido a estructuras desenfocadas fuera del estrecho plano focal. Debido a que los sistemas de imaginología por proyección no requieren lentes y planos focales, sino más bien, producen sombragramas en donde todas las estructuras están enfocadas límpidamente al mismo tiempo, la medición de características de densidad será más cuantitativa y precisa que en sistemas de microscopía convencionales. Por consiguiente, los términos "CDN" y "CDC" se refieren a mediciones de características de densidad de sombragramas y a reconstrucciones tomográficas usando sombragramas. Las CDNs y CDCs son alteraciones sutiles que se conoce que tienen lugar en células asociadas con el tejido de cáncer. Estas alteraciones son indicativas de desviación de normalidad y reflejan alteraciones moleculares asociadas con el proceso de enfermedad.

Sin embargo, las CDNs y CDCs aún no han logrado aceptación amplia para determinar explorando si un paciente tiene o desarrollará cáncer, porque los métodos de medición no han provisto exactitud y/o rendimiento adecuados. Tradicionalmente, las CDNs y CDCs han sido detectadas seleccionando cuidadosamente una muestra de células de una posición cercana a un tumor o lesión precancerosa y observando las células bajo un microscopio usando amplificación relativamente alta. Sin embargo, se cree que las alteraciones de CDN y CDC que tienen lugar en las células pueden ser demasiado sutiles para ser detectadas fiablemente por un patólogo humano que trabaja con equipamiento convencional de microscopía, especialmente debido a que el patólogo típicamente no está haciendo mediciones cuantitativas. Por ejemplo, una alteración de CDN puede ser indicada por la distribución y la densidad de ADN dentro del núcleo acoplado con variaciones leves en la forma del núcleo. Debido a que los observadores humanos no pueden cuantificar fácilmente tales alteraciones sutiles de la célula, es difícil de determinar cuáles células exhiben alteraciones de CDN.

El documento EP 0539022A2 describe un analizador de partículas el cual dirige un haz de luz en un flujo líquido del espécimen para interactuar con partículas en el flujo líquido del espécimen y usa un sensor de imagen unidimensional extendiéndose transversalmente de la dirección del flujo de partículas para recoger información morfológica de las partículas.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un método para detectar células de interés en una muestra de célula según la reivindicación 1. Se describe aquí un método que comprende los pasos de obtener una muestra de célula y suspender las células en la solución; si se requiere, acondicionar las células de la muestra de célula en la solución; entintar y/o etiquetar las células para generar densidades ópticas asociadas con moléculas nucleares u otras estructuras dentro de cada célula de la muestra; Iluminar la muestra con un "punto" emisor de luz y obtener una o más imágenes de proyección (por ejemplo sombragramas) a través de la muestra con un detector de colección digital; compensar las imágenes de proyección para variaciones en la iluminación de fondo; analizar las imágenes de proyección para detectar objetos de interés; calcular un conjunto de valores característicos unidimensionales (1D) y bidimensionales (2D) para cada objeto de interés; y proporcionar el conjunto de valores característicos al menos a un clasificador (90) que identifica y caracteriza células de interés en la muestra de célula.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un sistema para detectar automáticamente las CDNs y CDCs en muestras de célula. El sistema preferente incluye un instrumento de tomografía óptica de flujo (TOF) que es controlado por e interconectado con un sistema de ordenador. Las imágenes de proyección captadas por el TOF son almacenadas en un pizarrón de procesamiento de imagen y son manipuladas por el sistema de ordenador para detectar la presencia de las CDNs y CDCs unidimensionales y bidimensionales. Múltiples imágenes de proyección pueden ser reconstruidas por el ordenador para generar imágenes tridimensionales (3D) y de dimensión superior (3D +) con sus CDCs y CDNs asociadas.

Para medir las CDNs y CDCs, es obtenida una muestra de célula y entintada en suspensión, y luego mostrada por la TOF. La tintura es estequiométrica y/o proporcional al ADN y/o sus proteínas asociadas o a otras moléculas de interés dentro de la célula incluyendo el citoplasma. El sistema de ordenador analiza luego las imágenes de proyección directamente y/o computa la reconstrucción 3D que es también analizada. Las imágenes se corrigen de la iluminación dispareja y otras imperfecciones del sistema de adquisición de imagen. Después de que todas las imágenes son corregidas, se calculan los bordes, superficies y volúmenes y densidades de los objetos de interés, o sea, el límite que determina qué píxeles o vóxeles pertenecen al objeto o estructura de interés y cuáles pertenecen al fondo.

El sistema de ordenador calcula luego un conjunto de 1D, 2D, 3D y 3D + valores característicos para cada objeto o estructura. Para algunos cálculos de características el límite cercano al valor más alto del gradiente se corrige dilatando o erosionando el borde (o la superficie) en uno o más píxeles (o vóxeles). Esto se hace de manera que cada característica logra un mayor poder de discriminar entre clases de objetos y es de este modo objeto específica. Estos valores característicos son luego analizados por un clasificador que usa los valores característicos para determinar si el objeto es un artefacto o es un núcleo de célula o estructura de interés. Si el objeto parece ser un núcleo de célula o estructura de interés, entonces los valores característicos son analizados además por el clasificador para determinar si el objeto exhibe indicativos de CDNs y CDCs de enfermedad. Puede hacerse una determinación estadística de si es saludable el paciente de quien la muestra de célula fue obtenida o de si alberga un crecimiento maligno, basada en el número de objetos encontrados en la muestra que parecen tener alteraciones significativas de CDN y CDC relacionadas a la enfermedad.

En otras realizaciones, la presente invención proporciona un método para detectar células epiteliales en una muestra de célula y un método para detectar células teniendo CDNs y CDCs que están correlacionadas con enfermedades entre las células epiteliales. En otra realización, se provee un método para predecir si un paciente desarrollará cáncer.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra esquemáticamente una ilustración de un ejemplo de un sistema del citometría de flujo como es contemplado por una realización de la presente invención.

La Fig. 2 muestra esquemáticamente una ilustración de ejemplo de un proceso de flujo para una sola célula como es contemplado por una realización de la presente invención.

La Fig. 3A y la Fig. 3B muestran esquemáticamente un ejemplo de una célula y una sección transversal de reconstrucción como es contemplada por una realización de la presente invención.

La Fig. 4 muestra esquemáticamente un ejemplo de un cilindro de reconstrucción como es contemplado por una realización de la presente invención.

La Fig. 5 muestra esquemáticamente un ejemplo de un sistema de tomografía óptica de flujo (TOF) como es contemplado por una realización de la presente invención.

La Fig. 6 muestra esquemáticamente un ejemplo de rayos de proyección dentro de un cilindro de reconstrucción como es contemplado por una realización de la presente invención.

La Fig. 7 muestra esquemáticamente un ejemplo de una vista superior de un cilindro de reconstrucción como es contemplado por una realización de la presente invención.

La Fig. 8 muestra esquemáticamente un ejemplo de la geometría de una configuración de conjunto de fuente/lineal usada en la reconstrucción de la célula como es contemplado por una realización de la presente invención.

La Fig. 9 muestra esquemáticamente un ejemplo de un método de clasificación usado en el análisis de CDNs y CDCs de imágenes de proyección y la reconstrucción tomográfica como es contemplado por una realización de la presente invención.

Descripción detallada de las realizaciones preferentes

La invención es descrita en la presente solicitud con relación a ejemplos específicos referentes a células biológicas, sin embargo, se tendrá por entendido que estos ejemplos son para el propósito de ilustrar los principios de la invención, y que la invención no está de tal modo limitada. En un ejemplo, construir una distribución tridimensional de densidades de puntos e intensidades de emisión dentro de un volumen microscópico permite la medición de densidad y fluorescencia en cualquier posición dentro del volumen microscópico y determina la posición de estructuras, moléculas o sondas moleculares de interés. Usando las sondas moleculares etiquetadas, puede ser medida la cantidad de sondas que corresponden a estructuras específicas en el objeto microscópico. Para propósitos ilustrativos, un objeto tal como una célula biológica puede estar etiquetado con al menos una sonda molecular etiquetada, y la cantidad y posición medida de esta sonda pueden producir información importante acerca del estado de enfermedad de la célula, incluyendo, pero no limitado a, cánceres diversos como cáncer pulmonar, de mama, de próstata, de cervical y de ovarios.

A las células biológicas que han sido preparadas para citometría de flujo y entintadas o etiquetadas con sondas moleculares etiquetadas para el diagnóstico de enfermedades específicas, se les hace fluir a través de un dispositivo que tiene prevista la colección de imágenes de proyección y permite la reconstrucción de información de densidad 2D y 3D desde caminos del rayo de proyección óptica aproximadamente perpendiculares al vector de flujo de la célula. Controlando la velocidad de la célula que fluye a lo largo de un eje, los planos perpendiculares 2D de reconstrucción pueden ser posicionados correctamente (o apilados) a lo largo del eje de la célula para crear una imagen 3D de la célula entera, o puede ser computada una imagen 3D de la célula directamente desde proyecciones de emisión o transmisión óptica 2D.

La citometría de flujo es altamente apropiada para la reconstrucción de imagen debido a las siguientes características:

\bullet: las células fluyen en fila única a través del tubo capilar de manera que el solapamiento de células y la obscuración son minimizados,

\bullet: la velocidad de las células fluyendo a través del tubo capilar puede ser directamente medida y es constante,

\bullet: las células tienden a seguir el eje central del tubo capilar y volverse simétricas estructural y radialmente, y

\bullet: dependiendo de la preparación de suspensión y fijación de la célula, las células pueden retener plasticidad y asumir una forma alargada a lo largo del eje z en respuesta al gradiente de velocidad en el tubo capilar.

La presente invención aprovecha dichas características para proporcionar un sistema de imaginología por proyección de fuente de puntos y reconstrucción de imagen tomográfica.

Refiriéndose ahora a la Fig. 1, allí se muestra esquemáticamente una ilustración de ejemplo de un sistema de citometría de flujo como es contemplado por una realización de la presente invención. El sistema está orientado con referencia a un sistema de coordenadas 11 que tiene coordenadas en las direcciones X, Y, y Z. En operación, las células 1 son inyectadas dentro del tubo de inyección 3 usando un dispositivo de inyección conocido 4. El tubo capilar es más ancho en el extremo de inyección 5 e incluye una cápsula de presión 6. Un fluido de cubierta 7 es introducido en el tubo 8 para crear flujo laminar dentro del tubo capilar 2. Es característico de la citometría de flujo tradicional que las células 1, preparadas y suspendidas en la solución, puedan ser impulsadas a través de un tubo capilar 2 de manera que se elonguen con el eje de flujo y se muevan aproximadamente hacia abajo del eje central del tubo capilar 2, como es representado por la línea discontinua 9. A las células ventajosamente puede obligárseles a fluir con simetría axial y con velocidad constante 10 en fila india a lo largo del eje central de un tubo capilar cilíndrico.

Refiriéndose ahora a la Fig. 2, allí se muestra esquemáticamente una ilustración de un ejemplo de un proceso de flujo para una sola célula como es contemplado por una realización de la presente invención. Una célula 1 se mueve con una velocidad constante (V) indicada por el vector de velocidad 10 a través de un tubo capilar 2. La célula 1 comprende una pared del citoplasma de la célula 12 y una pared del núcleo de la célula 13. Durante el curso de fluir a través del tubo capilar 2, la célula 1 atraviesa una pluralidad de planos de reconstrucción representados para propósitos ilustrativos como el primer, segundo y tercer planos de reconstrucción 14a, 14b y 14c respectivamente. Un primer corte planar 15a a través de la pared del citoplasma de la célula yace dentro del plano de reconstrucción 14a. De modo similar, un segundo corte planar 15b a través de las paredes del citoplasma de la célula y del núcleo de la célula, yace dentro del segundo plano de reconstrucción 14b, y un tercer corte planar 15c yace dentro del tercer plano de reconstrucción 14c. Una característica central de la presente invención es que son dispuestas alrededor de y concéntricas con el tubo capilar un número de fuentes de puntos ópticas de longitud de onda elegible. Las fuentes de puntos ópticas operan en conjunción con colecciones de sensores ópticos en oposición que son sensitivos a las porciones elegibles del espectro de luz, permitiendo de este modo la adquisición de proyecciones de la luz transmitida a través de la célula. Las imágenes de proyección adquiridas pueden ser analizadas directamente o procesadas usando algoritmos de reconstrucción de imágenes tomográficas para proporcionar imágenes o mapas espaciales de la distribución de densidades y/o intensidades de emisión dentro de la célula. Se tendrá por entendido que en la práctica el número de planos de reconstrucción puede diferir desde varios hasta varios centenares o más, dependiendo de la resolución de imagen necesitada del objeto siendo presentado al sistema. El grupo de imágenes reconstruidas de cortes planares paralelos puede ser combinado o apilado en software para producir una imagen tridimensional (3D) de las densidades e intensidades de emisión dentro de la célula. Además, pueden ser adquiridas simultáneamente proyecciones de una pluralidad de cortes planares contiguos a través de las células fluyentes, empleando colecciones planares (2D) de sensores de luz en lugar de lineales (1D), y un cono en lugar de un patrón de rayos de iluminación en abanico. Como consecuencia, pueden ser computadas imágenes tridimensionales (3D) de la distribución de densidades e intensidades de emisión dentro del volumen de la célula directamente desde las proyecciones bidimensionales (2D), usando algoritmos de reconstrucción de haz en cono. Alternativamente, pueden ser analizadas directamente las imágenes de proyección de fuente de puntos 2D, las cuales poseen infinita profundidad de campo.

En el caso de una célula biológica, una distancia (d) entre planos de reconstrucción puede ser de algunos micrones o menos. Un punto dentro de la célula 1 coincidirá con cada plano de reconstrucción en los intervalos de tiempo, donde los intervalos de tiempo (t) pueden ser descritos según la relación:

(Ecuación 1)t = d \div V

Refiriéndose ahora conjuntamente a la Fig. 3A y la Fig. 3B, allí es mostrado esquemáticamente un ejemplo de una sección transversal 16 de reconstrucción como es contemplado por una realización de la presente invención. La reconstrucción de densidades de puntos dentro de una célula desde proyecciones ópticas a través de esta se beneficia de la centralidad y simetría axial de la célula fluyente. Adicionalmente, el espacio siendo muestreado por las proyecciones puede ser modelado como consistente en tres compartimientos discretos:

1. el fluido fuera de la célula 17 (o sea, el fluido de cubierta o el medio de suspensión de la célula),

2. el citoplasma de la célula 18, y

3. el núcleo de célula 19.

Es suficiente conocer cuantitativamente la distribución de densidad óptica o sondas moleculares en estos tres compartimientos para enfrentar muchos problemas importantes en la biología de la célula y el diagnóstico de enfermedades. Adicionalmente, esto puede ser útil para computar superficies de dos límites incluyendo a la pared de célula o citoplásmica 12 y a la pared nuclear 13 si ciertas sondas moleculares se vinculan preferentemente a estas superficies. Por otra parte, puede ser suficiente caracterizar a estas paredes como las superficies de transición entre los tres compartimientos diferentes.

Combinando los cortes reconstruidos de la célula, o reconstruyendo en una manera helicoidal, volumétrica, pueden ser generadas la morfología 3D y la información de volumen, pero los volúmenes absolutos (a distinción de los relativos) dependen de información precisa de la posición de la célula. La posición de la célula es una función de la velocidad de flujo. Sin embargo, en varias instancias, las concentraciones relativas de densidad o las sondas moleculares son suficientes para enfrentar la interrogante del diagnóstico: ¿Cuánta sonda está en el citoplasma relativo al núcleo vs. la sonda no vinculado en el fluido de fondo? O, ¿está ubicada la sonda primariamente en la membrana de la célula o en la superficie de la membrana nuclear?.

Mientras las células que pasan a través del tubo capilar pueden volverse simétricas radial y estructuralmente, la distribución dentro de los compartimientos nucleares y citoplásmicos de al menos una sonda molecular vinculada no puede poseer tal simetría axial. Es por lo tanto deseable para el sistema de imagen y el algoritmo de reconstrucción (particularmente la emisión) proporcionar suficiente resolución espacial para localizar volúmenes de sonda molecular vinculada fluorescente, en una escala más fina que la requerida para proporcionar el análisis de tres compartimientos descrito anteriormente. Es deseable además que el sistema provea información cuantitativa acerca de la concentración de sonda distribuida asimétricamente dentro de los dos compartimientos intracelulares. La asociación de la sonda con compartimientos subcelulares específicos, estructuras u organelos dentro del citoplasma o el núcleo es facilitada por la resolución espacial submicrónica.

Un ejemplo más específico corresponde a la detección temprana de cáncer en pacientes en riesgo. En tales casos, ciertos genes pueden expresar de más o de menos su función cuando la célula experimenta transformación. Es importante desde el punto de vista del diagnóstico medir la expresión relativa de más o de menos del producto del gene (frecuentemente una proteína) en el citoplasma relativo al núcleo, mientras que se normaliza para sondas no vinculadas en el fluido suspensión del fondo. Si el producto del gene es una proteína, entonces una sonda de anticuerpo etiquetada puede ser usada para evaluar el estado de la enfermedad de la célula localizando y/o cuantificando la proteína producto del gene. Por lo tanto, el análisis de tres compartimientos puede ser suficiente para hacer la determinación del estado de la enfermedad.

Refiriéndose ahora a la Fig. 4, es mostrado esquemáticamente un ejemplo de un cilindro de reconstrucción, rodeando el tubo de flujo 2 que contiene células fluyentes 1, como es contemplado por una realización de la presente invención. Un cilindro de reconstrucción 20 incluye, por ejemplo, una hélice 24 de fuentes de puntos 21 dispuesta en una inclinación helicoidal predeterminada, con ángulo de inclinación \theta. Cada fuente de puntos 21 genera un haz de fotones 22, donde el haz de fotones 22 es típicamente en forma de cono o abanico. Mientras que la disposición de las fuentes descritas en el ejemplo de la Fig. 4 es helicoidal, el conjunto de fuentes de puntos puede tomar una variedad amplia de patrones geométricos, dependiendo en parte de la velocidad de la electrónica, la velocidad de la célula y la geometría que logran las señales de proyección sin solapamiento en el sensor (detector). Elementos sensores 23 son dispuestos para recibir luz desde las fuentes de puntos.

Las fuentes de puntos ópticas fijas 21, en conjunción con detectores opuestos 23 montados alrededor de una circunferencia del tubo pueden muestrear múltiples ángulos de proyección a través de la célula entera 1 a medida que estas fluyen pasando las fuentes. Midiendo el tiempo de emisión o lectura, o ambos, de la fuente de luz y la luz emitida y/o diseminada y/o transmitida atenuada, cada señal detectada coincidirá con una posición específica, conocida a lo largo del eje en la dirección de la z de la célula fluyente. De esta manera, una célula 1 fluyendo con velocidad conocida a lo largo de un eje conocido perpendicular a una fuente de luz que es inducida a emitir o a ser detectada en un modo sincronizado, puede ser seccionada de manera óptica con proyecciones a través de la célula que puede ser reconstruida para formar un corte 2D en el plano X-Y. Apilando o combinando matemáticamente cortes secuenciales, emergerá una imagen 3D de la célula. Es posible también combinar el movimiento de la célula con el posicionamiento de la fuente de luz (o las fuentes) alrededor del eje de flujo para generar datos que pueden ser reconstruidos, por ejemplo, en una manera helicoidal para crear una imagen 3D de la célula. La reconstrucción puede ser hecha ya sea apilando imágenes planares contiguas reconstruidas desde proyecciones lineales (1D) usando algoritmos de reconstrucción de haz en abanico, o a partir de proyecciones planares (2D) usando directamente algoritmos de reconstrucción de haz en cono. La imagen 3D de la célula puede producir mediciones cuantitativas de estructuras subcelulares y la posición y cantidad de sondas moleculares etiquetadas que proporcionan información de diagnóstico.

Como se mencionó, es requerida más de una proyección a través de una sección de célula para reconstruir la estructura de densidad 2D o 3D en la sección o el volumen. En la tomografía computada de rayos X medicinal de corte a corte tradicional, las proyecciones múltiples son hechas manteniendo inmóvil al paciente humano mientras la fuente de rayos X y los detectores opuestos se mueven a lo largo de una circunferencia para generar múltiples ángulos de proyección a través del paciente. Análogamente, el sistema de tomografía óptica de flujo de esta invención mueve la célula a una velocidad (V) predeterminada pasando por múltiples fuentes posicionadas en ángulos diferentes a lo largo de la circunferencia del tubo capilar para generar proyecciones múltiples a través de la célula a medida que esta fluye pasando las fuentes de punto. Estas fuentes de puntos emiten fotones que atraviesan la célula y son detectados por un conjunto de sensores opuestos a la fuente. Las fuentes de puntos pueden ser dispuestas a lo largo de una hélice 24, o en otros patrones geométricos apropiados, en la circunferencia del tubo capilar de manera que cada punto en la célula es muestreado desde una multitud de ángulos a medida que atraviesan el conjunto de fuentes de punto. Para una buena geometría de muestreo, estas fuentes de puntos pueden cubrir al menos 180 grados de circunferencia. Menos cobertura angular (o sea, ángulos siendo muestreados) puede ser factible en algunas instancias, mientras que la cobertura radial adicional mejorará la precisión y la proporción señal-ruido de la reconstrucción computada. Dependiendo de la geometría, puede ser ventajoso aplicar algoritmos analíticos, iterativos o estadísticos tradicionales para la reconstrucción de imagen de haz en cono o de haz en abanico. (Ver, por ejemplo, Gilbert, P, "Iterative Methods for the Three-dimensional Reconstruction of an Object from Projections", Journal of Theoretical Biology 36:105-17, 1972, Oppenheim, BE, "More Accurate Algorithms for Iterative 3 dimensional Reconstruction", IEEE Transactions on Nuclear Science NS-21:72-7, 1974, Singer, JR, Grunbaum, FA, Kohn, P, y Zubelli, JP, "Image Reconstruction of the Interior of Bodies that Diffuse Radiation", Science 248(4958):990-3, 1990. Mueller, K y Yage, R, "Rapid 3-D Cone-beam Reconstruction with the Simultaneous Algebraic Reconstruction Technique (SART) Using 2-D Texture Mapping Hardware", IEEE Transactions on Medical imaging 19 (12):1227-37, 2001.) Los métodos relacionados incluyen, pero no son limitados a TRA (técnica de reconstrucción algebraica, como es planteada en Bellman, SH, Bender, R, Gordon, R, y Rowe, JE, "ART is Science being A Defense of Algebraic Reconstruction Techniques for Three-dimensional Electron Microscopy", Journal of Theoretical Biology 32:205-16, 1971), TRIS (técnica de reconstrucción iterativa simultánea, como es planteada, por ejemplo por Gilbert, id. #1493), ME-VM (maximización de la esperanza de vida máxima, como es planteada, por ejemplo, por Manglos, SH, Jaszcak, RJ, y Floyd, CE, "Maximum Likelihood Reconstruction for Cone Beam SPECT: Development and Initial Tests", Physics in Medicine and Biology 34(12):1947-57,1989, #1382), y MESO (maximización de la esperanza de subconjuntos ordenados, como es planteada, por ejemplo, en Manglos, SH, Gagne, GM, Krol A, Thomas, FD, y Narayanaswamy, R, "Transmission Maximum-likelihood Reconstruction with Ordered Subsets for Cone Beam CT", Physics in Medicine and Biology 40(7):1225-41, 1995, #4389).

Métodos Citómetro de Flujo

Refiriéndose ahora a la Fig. 5, allí es mostrado esquemáticamente un ejemplo de un sistema de tomografía óptica de flujo (TOF) como es contemplado por una realización de la presente invención. El sistema de tomografía óptica de flujo incluye un citómetro de flujo, con un cilindro de reconstrucción 20 situado alrededor del tubo capilar 2. Una fuente de fotones 25 y un sensor de fotón 26 trabajan conjuntamente con el analizador de elevación del pulso 27 para operar como un dispositivo detonante. El analizador de elevación del pulso 27 opera de acuerdo con los principios conocidos para proporcionar un primer punto detonador 28 para el comienzo de una célula, y un segundo punto detonador 29 para el final de la célula. El analizador de elevación del pulso 27 devuelve una señal del detonador 30 correspondiente al comienzo y al final de cada célula, donde la señal del detonador es recibida por el cilindro de reconstrucción 20.

Un ordenador 40 es acoplado para transmitir datos, señales de control y señales de cronometraje hacia las fuentes de puntos 21, elementos sensores 23 y al analizador de elevación del pulso 27 por las líneas de señal 41-43. El ordenador puede comprender un ordenador conocido o una pluralidad de ordenadores y procesadores de conjunto adecuados para la adquisición de imagen y el procesamiento de reconstrucción de imagen.

Los citómetros de flujo comerciales vienen con tres configuraciones de flujo básicas: a saber, el tubo cilíndrico de flujo, el tubo rectangular de flujo y el flujo en el sistema de aire. (Véanse Shapiro, HM, Practical Flow Cytometry, ed. 3, Wiley-Liss, 1995). La configuración preferente es el tubo cilíndrico de flujo, debido a que es importante preservar la geometría cilíndrica óptima para el algoritmo de reconstrucción para minimizar cualquier dependencia radial, debido a la maquinaria de flujo (véase la Fig. 1). Además, el tubo cilíndrico de flujo puede tener paredes uniformemente delgadas relativas al área de sección transversal del tubo capilar.

Adicionalmente, el dispositivo detonante puede ser ubicado contracorriente desde el módulo de reconstrucción para proporcionar una señal de cronometraje para iniciar y terminar la colección de datos a medida que la célula entra y emerge óptimamente del cilindro de reconstrucción. El dispositivo detonante puede comprender ventajosamente un diodo de láser, CCD, PMT, una combinación de fotodetector, un fotodetector de estado sólido y combinaciones de los elementos anteriores. El dispositivo detonante tiene una configuración de umbral que percibe la presencia de una célula fluyente, generando de este modo una señal detonadora que, en conjunción con una velocidad de célula conocida, puede usarse para calcular cuándo el cilindro de reconstrucción corriente abajo puede empezar la colección de datos para esa célula de interés en particular. Además, el intervalo de tiempo entre el primer y el segundo punto de detonación que corresponde a la entrada y la salida de la célula dentro y fuera del cilindro de reconstrucción, puede estar dividido en incrementos iguales o desiguales durante cada uno de los cuales pueden ser adquiridos datos de proyección adicionales emitiendo luz estroboscópica desde la(s) fuente(s) de luz 21 y leyendo el(los) conjunto(s) de sensores 23.

La velocidad de flujo necesita ser controlada y medida con precisión. Esta capacidad es provista para sistemas comerciales en alto-fin que usan velocidades en el rango de 1 metro/seg a 10 metros/seg. La mejor velocidad de la célula será determinada por la velocidad de colección de datos y consideraciones de señal-ruido como será discutido posteriormente.

Módulo de reconstrucción

Refiriéndose ahora a la Fig. 6, es mostrado esquemáticamente un ejemplo de rayos de proyección de haz en abanico dentro de un cilindro de reconstrucción 20 como es contemplado por una realización de la presente invención. El propósito del cilindro de reconstrucción es proporcionar una manera de proyectar luz de una pluralidad de fuentes de puntos fijo 21a - 21c, a lo largo de una circunferencia pequeña, en el tubo capilar cilíndrico. Los fotones emitidos desde las fuentes de puntos tienen una geometría de proyección conocida, tal como una forma de abanico o de cono, y atraviesan el tubo capilar para ser detectados por un conjunto de elementos sensores 23a, 23b ó 23c, según sea el caso, ubicados a lo largo de una circunferencia mayor opuesta a una fuente de puntos correspondiente. Mientras son descritos para propósitos de ilustración conjuntos de sensores lineales curvados (1D) adecuados para la transiluminación de haz en abanico, debe tenerse por entendido que conjuntos de sensores lineales rectos (1D) o conjuntos de sensores planares (2D) adecuados para la iluminación de haz en cono pueden ser empleados de modo similar. De esta manera, puede ser generado un conjunto de rayos de proyección donde los rayos de proyección pueden ser descritos como la línea recta conectando la fuente de puntos a un elemento sensor individual. La diferencia entre el número de fotones que parten de la fuente de puntos a lo largo de un rayos de proyección particular, como el rayo 31, y el número de fotones recibidos en el elemento sensor particular está relacionada con el número de fotones perdidos o atenuados debido a interacciones con la célula y otros contenidos del tubo de flujo a lo largo del camino del rayo de proyección.

Sin embargo, pueden originarse complicaciones a partir de la dispersión de la luz, alteraciones de energía del fotón, geometría imperfecta y colimación escasa, y fotones de fuentes diferentes pueden llegar a un elemento sensor particular cuando son energizadas simultáneamente múltiples fuentes de punto. La contaminación del fotón debido a estos asuntos puede ser minimizada, pero no eliminada, con la construcción cuidadosa del cilindro de reconstrucción, por ejemplo mediante la elección juiciosa de la geometría para el patrón de fuentes de puntos y sus detectores opuestos como es descrito en la presente solicitud, y midiendo o multiplicando apropiadamente el tiempo de activación de las múltiples fuentes de puntos y lectura de los conjuntos del sensor.

La contaminación del fotón puede ser tenida en cuenta por la calibración del sistema, por ejemplo, sin células presentes. Es decir, cada fuente de luz puede ser iluminada a su vez y pueden medirse sus efectos en cada uno de los sensores, suministrando por consiguiente datos del desplazamiento para ser usados en la normalización del sistema. Un paso de calibración adicional puede conllevar, por ejemplo, la visualización de cuentas de polímero de látex u otras microesferas o esferoides achatados cuyas propiedades ópticas son conocidas y extienden el rango de densidad de interés para la visualización celular. Fotones emitidos por sondas fluorescentes pueden ser diferenciados de aquellos que se originan en las fuentes de puntos por el uso de filtros de paso de banda espectrales en el detector como será discutido posteriormente.

Fuente de luz

Cada fuente puede tener las mismas características generales, preferentemente:

\bullet: puede aproximar una fuente de puntos circular pequeña,

\bullet: puede ser brillante con contenido espectral conocido,

\bullet: los fotones emitidos por la fuente pueden tener una geometría conocida tal como una de haz en cono o una de haz en abanico.

Cada fuente crea datos para un ángulo de proyección. Una pluralidad de fuentes ordenadas a lo largo de una hélice cuyo eje es el eje central del tubo de flujo crea datos de múltiples ángulos de proyección a través de cada plano sucesivo (o corte de reconstrucción) a medida que la célula fluye a través del módulo. Dependiendo de la geometría del sensor, varias fuentes de puntos podrían ser ordenadas colinealmente en la misma circunferencia de manera que las proyecciones no se solapen en el sensor. Una buena geometría de muestreo puede ser lograda colocando fuentes equidistantes a lo largo de una hélice de 180 grados, sin embargo puede ser tolerable en algunas instancias menos cobertura angular, y pueden ser utilizados 360 grados para mejorar la proporción señal-ruido. El número deseado de fuentes es una función de la resolución necesitada dentro de cada reconstrucción planar (el plano X-Y) o reconstrucción volumétrica. Mientras se usa para ilustración una colocación helicoidal de fuentes de punto, debe tenerse por entendido que pueden ser empleados por el conjunto de fuentes de puntos una variedad de patrones geométricos. Además, la longitud de onda de las fuentes es seleccionable ya sea por el uso de diversos diodos u otros láseres o por filtrado por paso de banda de una fuente blanca u otra de banda ancha, por ejemplo un una lámpara de arco de mercurio o xenón.

Refiriéndose ahora a la Fig. 7, es mostrado esquemáticamente un ejemplo de una vista superior de un cilindro de reconstrucción, como se muestra en la Fig. 6, como es contemplado por una realización de la presente invención. Una primera fuente de puntos 21a y un conjunto sensor 23a son mostrados con una célula con núcleo 19 fluyendo perpendicular a la página en una proyección de la trayectoria de la fuente que, en dos dimensiones, constituye un círculo de reconstrucción 32, en el cual todas las proyecciones, si bien son adquiridas de una manera temporalmente escalonada, son bosquejadas como solapamiento, y en el cual está contenida la célula entera. Una segunda fuente de puntos 21b y un segundo conjunto sensor 23b están ubicados aproximadamente 30º alrededor de la hélice. Una tercera fuente de puntos 21c y un tercer conjunto sensor 23c están ubicados aproximadamente 90º alrededor de la hélice.

La colección de datos es regulada en sincronía con la velocidad de la célula dentro de una sección transversal axial planar "gruesa" de la célula. El espesor deseado del plano está en función de la resolución necesitada en la dirección Z. Típicamente, la resolución en la dirección axial (dirección Z) será menor que en la dirección transaxial planar. También, el mejor círculo de reconstrucción puede estar definido por la intersección solapada de los abanicos de proyección teniendo las fuentes de puntos en sus cimas y la anchura de los conjuntos sensores en sus bases. Es deseable que la geometría del cilindro de reconstrucción asegure que la sección transversal de la célula fluyente esté contenida enteramente dentro del círculo de reconstrucción.

Hay varias opciones que pueden ser empleadas para crear fuentes de puntos ópticas, tales como:

\bullet: un agujero pequeño delante de un láser u otra fuente de fotón de alta intensidad,

\bullet: una fibra óptica con una sección transversal pequeña,

\bullet: un lente de corta longitud focal delante de una fuente de fotón,

\bullet: un haz electrónico que irradia un punto en una superficie de fósforo (una forma de CRT), y

\bullet: combinaciones diversas de lo antedicho.

La geometría es tal que mientras es más cercana la fuente de puntos al objeto de interés (la célula) es mayor la magnificación debido al ángulo geométrico más ancho que es subtendido por un objeto más cercano a la fuente. Inversamente, si la resolución requerida es conocida con anterioridad al diseño del sistema, entonces la geometría puede ser optimizada para esa resolución particular. Para información, los expertos en la técnica son dirigidos a Blass, M, editor en jefe, Handbook of Optics: Fiber Optics and Nonlinear Optics, 2da edición, Vol. IV, Mcgraw-Hill, 2001.

Refiriéndose ahora a la Fig. 8, la Fig. 8 muestra esquemáticamente un ejemplo de un conjunto lineal convencional 23 usado en la reconstrucción de la célula como es contemplado por una realización de la presente invención. Por ejemplo, dada una sección transversal de la célula 12 y núcleo 19 contenido dentro de un círculo de reconstrucción de diámetro de 30 micrones y una resolución deseada de 0.5 micrones, entonces el muestreo Nyquist (o sea sobremuestreando por un factor de 2) dicta que al menos 120 elementos sensores 33 son requeridos para cada fuente de puntos 21. La fuente de puntos 21 en la cima y la longitud de conjunto lineal 34 en la base forman un triángulo 35, tal que la célula ejemplo de diámetro de 30 micrones se ajusta dentro del triángulo 35 tan cercanamente como sea posible a la fuente de puntos 21. En este ejemplo, si cada elemento del conjunto (por ejemplo CCD) tiene 20 micrones de ancho y la longitud del conjunto es 2400 micrones, entonces el centro de la célula puede estar ubicado aproximadamente a 100 micrones (la mitad del diámetro del tubo capilar) de la fuente de puntos cuando la distancia entre la fuente de puntos y el conjunto lineal es 8 milímetros, proporcionando una magnificación de 80 veces.

Como un segundo ejemplo, considérese un círculo de reconstrucción de diámetro de 30 micrones y un conjunto sensor semiconductor de óxido de metal complementario (SOMC) en el cual el tamaño del elemento de píxel es 4 micrones. En este caso el conjunto puede contener 120 elementos para una anchura de 480 micrones, y puede ser situado a 1.6 mm de la fuente de puntos cuando la distancia entre la fuente de puntos y la célula es 100 micrones, proporcionando una magnificación de 16 veces.

Elementos Sensores

Cada fuente de puntos tendrá un conjunto correspondiente de elementos sensores tales como CCDs en algún acomodamiento geométrico recto o curvado y al frente de la fuente de puntos para recibir rayos de fotón transmitidos a través del círculo de reconstrucción. Típicamente, el conjunto lineal puede tener su conjunto de elementos sensores centrados en la línea entre la fuente de puntos y el eje central de flujo, y puede alinearse perpendicularmente al eje de flujo. Es posible usar conjuntos 2D donde sólo un subconjunto de cada línea de elementos dentro del conjunto 2D sea leído para la entrada de reconstrucción. En un conjunto 2D, cada subconjunto sucesivo de elementos puede ser escalonado por el número apropiado de elementos para ponerse correctamente al lado de cada fuente de puntos a lo largo del acomodamiento helicoidal de fuentes de punto.

Para la reconstrucción de haz en abanico corte a corte usando el ejemplo del círculo de reconstrucción de 30 micrones con 120 elementos sensores por abanico para obtener una resolución de 0.5 micrones, es suficiente un conjunto 2D con 2000x2000 elementos de 20 micrones para el sensor 136, fuentes de puntos colocadas en incrementos de 1 grado radial, donde el promedio de desplazamiento entre las vistas sucesivas es 300 micrones, donde ello es equivalente a 15 elementos sensores. (En el centro del conjunto, el desplazamiento puede ser de 140 micrones, ó 7 elementos, mientras en los extremos del conjunto, un barrido de 1 grado radial entre vistas puede conllevar un desplazamiento considerablemente mayor.) Si fuesen promediados grupos de 15 filas del conjunto sensor para proporcionar los datos de proyección para un corte, la resolución z dentro de la imagen de la célula puede ser 3,75 micrones, mientras que si fuesen promediadas 2 filas para cada proyección, la resolución axial en el espacio del objeto puede ser 0,5 micrones, equivalente a la resolución transaxial.

En una realización preferente de la invención, el conjunto 2D está curvado a lo largo de una circunferencia cilíndrica que puede ser concéntrica con el cilindro de reconstrucción, de modo que los caminos del rayo sean todos de igual longitud. Para el caso de un círculo de reconstrucción de 30 micrones, un conjunto 2D, curvado, que poseyó sólo los elementos requeridos para oponerse a un lugar geométrico helicoidal de fuentes de puntos puede ser una tira helicoidal de 120 elementos de ancho por algún múltiplo de 136 elementos de alto (longitud) para el ejemplo descrito anteriormente.

Aunque la iluminación de abanico planar o "grueso" está descrita para propósitos de la ilustración de antes, debe tenerse por entendido que puede ser utilizada la iluminación no-colimada de haz en cono auténtica en conjunción con detectores planares 2D, provistos para la reconstrucción 3D usando algoritmos de haz en cono. Las imágenes de proyección 2D pueden ser analizadas directamente para obtener, por ejemplo, información acerca del estatus de la enfermedad o el estado de transformación de la célula. Para la reconstrucción de haz en cono volumétrica directa, la iluminación desde una pluralidad de fuentes de puntos es multiplexada de una manera tal que, dado el acomodamiento geométrico de las fuentes de puntos y los detectores, los conos de iluminación de diferentes fuentes de puntos no se solapan en la colección de sensores.

Además, si la célula fluyese con una velocidad de 1 metro/seg (ó 1 000 000 micrones/seg) y cada elemento en el conjunto 2D tuviera 20 micrones de ancho, entonces una línea leída cada 20 microsegundos fácilmente puede captar datos dentro de un corte de 0.25 micrones de la célula. Para el caso de cuando 15 filas del sensor son promediadas para proporcionar los datos para un corte de 3.75 micrones, las lecturas tendrían que ocurrir cada 300 microsegundos. Se logra una mejora significativa en la calidad de la imagen de reconstrucción usando un mayor conjunto 2D.

Una realización de la presente invención especialmente apropiada para la imagen multiespectral de un número de bandas de longitud de onda transmitidas o emitidas puede incluir ventajosamente dos o más módulos de reconstrucción dispuestos en serie. Tales múltiples cilindros de reconstrucción pueden ser separados por secciones interventoras de tubo capilar, y cada módulo proporciona datos de proyección adecuados para producir una imagen reconstruida completa de los objetos fluyendo a través de él. Las fuentes de puntos y/o las colecciones de sensores para cada uno de los distintos módulos de reconstrucción pueden ser optimizadas para una banda espectral particular. Por ejemplo, un primer módulo de reconstrucción puede utilizar iluminación de luz visible blanca intensa y la detección no filtrada para proporcionar un conjunto de datos de proyección completo para reconstruir un mapa de coeficientes de dispersión, absorción o densidad óptica de objeto, mientras un segundo módulo de reconstrucción puede utilizar iluminación, tal como un láser de ión argón (488 nm), en una banda espectral estrecha centrada alrededor de 495 nm para excitar las proteínas de etiquetado de sonda fluorescente para un estudio de inmunofluorescencia en conjunción con colecciones de sensores filtrados sensibles a la emisión de 520-nm para proporcionar un segundo conjunto de datos de proyección completo suficiente como para trazar un mapa de la distribución de concentración de las proteínas etiquetadas usando algoritmos de reconstrucción de la emisión, como será descrito posteriormente. Pero un tercer módulo de reconstrucción puede usar iluminación de banda estrecha centrada alrededor de 535 y/o 342 nm para excitar al yoduro de propidio vinculado estequiométricamente al ADN y a las colecciones de sensores filtrados para detectar óptimamente las emisiones rojas (617-nm) para estudios de ploidía. Se tendrá por entendido que los ejemplos mencionados son para propósitos ilustrativos, y que el método se aplica generalmente a cualesquiera combinaciones de longitud de onda para la iluminación y detección.

Reconstrucción de la Imagen

Los algoritmos de reconstrucción más comunes y fácilmente implementados, conocidos como métodos de proyección hacia atrás filtrada, se derivan de un paradigma similar en tomografía computarizada de rayos x (TC) usando la geometría de haz en cono y haz en abanico. (Véanse las siguientes referencias, por ejemplo, Kak, AC y Slaney, M, Principles of Computerized Tomographic Imaging, IEEE Press, New York, 1988, y Herman, G, Image Reconstruction from Projections: The Fundamentals of Computerized Tomography, Academic Press, New York, 1980). Estos métodos están basados en teoremas para las transformadas de Radon con modificaciones que reflejan la geometría particular de la configuración fuente/detector y los caminos del rayo en el haz que irradia. Sin embargo, en el caso de TC de rayos x clínico, para la adquisición corte a corte, el individuo se mantiene usualmente inmóvil mientras las colecciones de detectores y fuentes de rayos x pueden moverse a lo largo de un arco alrededor del paciente para colectar datos desde múltiples ángulos de proyección dentro de un corte dado. Luego el individuo es reposicionado a lo largo del eje z y se colecciona otro corte de datos, etc. Alternativamente, en la TC helicoidal clínica más moderna, el paciente puede ser continuamente volcado en la dirección z mientras el ensamblado del detector de la fuente rota continuamente para proporcionar datos de proyección helicoidales, lo cual es entonces interpolado para proporcionar proyecciones ortogonales al eje z del paciente. En la tomografía óptica de flujo, el sujeto (una célula) es movido con velocidad constante relativa a las colecciones de detector y fuentes estacionarias en donde la pluralidad de sistemas de fuente/detector adquieren datos en sincronía con puntos de tiempo regulado específicos a lo largo del vector de velocidad de la célula de una manera que genera datos de múltiples ángulos de proyección dentro de un volumen o corte dado. Para la tomografía corte a corte, el algoritmo de reconstrucción computará una imagen 2D de un plano perpendicular al eje de movimiento, y el apilamiento serial de múltiples cortes generará la descripción 3D del individuo donde el contraste es una función de las variaciones en el coeficiente de atenuación o la densidad óptica de los rayos x dentro del individuo para la TC o la tomografía óptica de flujo, respectivamente. Para la tomografía de haz en cono volumétrica, el algoritmo de reconstrucción computa una imagen 3D de un volumen dentro de la célula u otro objeto directamente a partir de proyecciones ópticas de emisión o transmisión planar, donde el contraste es una función de la densidad óptica y/o la distribución de densidad de la sonda etiquetada, respectivamente, dentro del objeto mostrado.

Puede ser deseable emplear algoritmos de reconstrucción de imagen aparte de la proyección hacia atrás filtrada ya sea para que los datos de transmisión produzcan la reconstrucción de densidad de la célula o para que los datos de emisión reconstruyan la distribución etiquetada de la sonda, o ambos. La clase general conocida como algoritmos de reconstrucción iterativos es más eficaz en algunas instancias, especialmente para la tomografía de emisión o cuando es posible, como en la instancia de la invención actual donde son conocidas la simetría axial y la naturaleza de tres compartimentos del objeto, incorporar una información a priori en el algoritmo de reconstrucción para mejorar la calidad de la reconstrucción (Ver, por ejemplo, Gilbert, P, "Iterative Methods for the Three-dimensional Reconstruction of an Object from Projections", Journal of Theoretical Biology 36: 105-17, 1972, y otras referencias citadas anteriormente).

De modo similar, un método puede usar ventajosamente algoritmos estadísticos de reconstrucción con modelación basada en elementos finitos (MEF). Los algoritmos MEF son derivados de la teoría del transporte lineal en la cual la ecuación de difusión/migración del fotón es resuelta en todos los límites de los elementos para producir un mapa bidimensional o tridimensional de alguna combinación de los índices refractivos, de absorción, dispersión y las propiedades del factor de anisotropía del objeto mostrado. Ejemplos de tales métodos son enseñados en Paulsen, KD y Jiang, H, "Spatially Varying Optical Property Reconstruction Using a Finite Element Diffusion Equation Approximation", Medical Physics 22(691-701) 1995, Hampel, U y Freyer, R, "Fast Image Reconstruction for Optical Absorption Tomography in Media with Radially Symmetric Boundaries", Medical Physics 25 (1): 92-101, 1998, y Jiang, H, Paulsen, KD, y Osterberg, UL, "Frequency-domain Near-infrared Photo Diffusion Imaging: Initial Evaluation in Multitarget Tissuelike Phantoms", Medical Physics 25 (2): 183-93,1998.

Separación Cromática

Si es usada una fuente de puntos policromática (por ejemplo, luz blanca) entonces pueden ser utilizadas diferentes tinturas cromáticas (por ejemplo cromóforos) para distinguir un número de sondas moleculares y características estructurales dentro de una célula dada. Aquí, filtros de paso de banda seriales en la fuente o el conjunto sensor (o ambos) separan los datos de longitud de onda y permiten la reconstrucción y la localización espacial de las moléculas entintadas individualmente. Un método más robusto para mostrar sondas múltiples requiere una fuente de luz blanca intensa y la colección simultánea de múltiples anchos de banda filtrados en los conjuntos sensores permitiendo de este modo a los algoritmos de reconstrucción de imagen computar cortes de imágenes espaciales para cada cromóforo. Estos pueden ser exhibidos como imágenes coloreadas.

Fluorescencia, fosforescencia, quimioluminiscencia y emisión de nanopartículas

Como un caso especial del sistema de tomografía óptico de flujo, ciertas sondas moleculares pueden ser etiquetadas con un "reportero" que emite luz de una longitud de onda diferente (más larga) cuando es estimulado por la fuente primaria de fotones. La emisión secundaria del reportero puede ser filtrada con filtros ópticos estándares para separar los fotones de la fuente primaria de los fotones de la emisión secundaria. Sin embargo, el algoritmo de reconstrucción de imagen del fotón de la emisión secundaria es por otro lado complicado, debido a que los fotones secundarios no necesariamente ascienden en un camino de rayos directo desde la fuente de punto. Si se asume que los fotones secundarios radian desde la fuente de puntos secundaria en un patrón esférico uniforme, entonces la intensidad de los fotones secundarios que alcanzan cualquier elemento sensor será una función simple de distancia al elemento sensor. Una refinación adicional puede tenerse en cuenta para la distribución no esférica de los fotones de la fuente secundaria proporcionando un modelo de la distribución espacial de los fotones secundarios relativo a la fuente de puntos y dentro del corte de reconstrucción. Cualquier método proporcionará una manera para calcular la posición de la fuente secundaria en el volumen o corte de reconstrucción. La colimación entre el objeto mostrado y el(los) conjunto(s) detector(es) mejorará la reconstrucción de la imagen.

Si las intensidades del fotón primario y las intensidades del fotón secundario son medidas simultáneamente por filtración óptica, la reconstrucción de densidad de alta resolución de las intensidades del fotón primario puede ser superpuesta o fusionada con la reconstrucción de la fuente secundaria de modo que la morfología de la imagen junto con la concentración de la sonda localizada esté disponible en una sola imagen reconstruida. Puede ser ventajoso utilizar múltiples fuentes secundarias cada una correspondiendo a una sonda molecular etiquetada de modo diferente, dependiendo de la intensidad, la señal-ruido y de la habilidad para filtrar o producir anchos de banda estrechos de fotones en la fuente y/o los sensores.

La Patente de Estados Unidos No. 6 201 628 titulada "High Throughput Optical Scanner", publicada el 13 de marzo de 2001, a nombre de Basiji et al., revela un aparato escaneador provisto para obtener tomografías automatizadas, rápidas y sensitivas de fluorescencia del substrato, densidad óptica o fosforescencia. El escáner usa un tren óptico de longitud de camino constante, lo cual habilita la combinación de un haz en movimiento para escanear a alta velocidad con la detección fase-sensitiva para la reducción de ruido, comprendiendo una fuente de luz, un espejo escaneador para recibir luz de la fuente de luz y pasarla a través de un espejo director, un espejo director para recibir luz del espejo escaneador y reflejarla hacia el substrato, por lo cual es pasada a través del substrato a lo largo de un arco de tomografía, y un fotodetector para recibir luz emitida o diseminada desde el substrato, en donde la longitud del camino óptico desde la fuente de luz hasta el fotodetector es sustancialmente constante a todo lo largo del paso a través del substrato. El tren óptico puede incluir además un guía de onda o espejo para coleccionar la luz emitida o diseminada desde el substrato y dirigirla hacia el fotodetector. Para la detección fase-sensitiva la fuente de luz es modulada en intensidad y el detector es conectado a la electrónica de la detección fase-sensitiva. También es provisto un escáner que usa un traductor del substrato. Para la visualización bidimensional el substrato es volcado en una dimensión mientras el espejo escaneador escanea el haz en una segunda dimensión. Para un escáner de rendimiento alto, son cargados conjuntos de substratos sobre una banda transportadora de un alimentador de bandeja. La Patente de Estados Unidos No. 6 201 628 es incorporada en la presente solicitud como referencia. Sin embargo, ninguna de estas patentes permite la generación de imágenes de proyección óptica, y consecuentemente, la reconstrucción tomográfica no es posible sin tales imágenes.

Como fue descrito anteriormente, la presente invención es un sistema para detectar automáticamente CDNs en los núcleos y CDCs en los citoplasmas a partir de proyecciones ópticas y reconstrucciones tomográficas de células obtenidas de un paciente. A partir de la presencia o la ausencia de CDNs y CDCs relacionadas con enfermedad, puede ser hecha una determinación de si el paciente tiene un cáncer maligno.

Refiriéndose ahora a la Fig. 9, es mostrado esquemáticamente un ejemplo de un método de clasificación con información de reconstrucción de la célula como es contemplado por una realización de la presente invención. El sistema puede incluir varios clasificadores que pueden trabajar juntos para determinar si una muestra de célula particular contiene células de interés y células de diagnóstico que tienen CDNs y CDCs asociadas con enfermedad. Un clasificador es un programa de ordenador que analiza un objeto basado en ciertos valores característicos 94. El sistema clasificador automatizado de la presente invención puede incluir, por ejemplo, un clasificador primario 90, el cual realiza una función básica de exploración, y selecciona objetos de interés. Un clasificador secundario 92 clasifica objetos celulares como anormales morfológicamente o normales morfológicamente y que tienen CDNs y CDCs asociadas con enfermedad, o normales y que no exhiben CDCs y CDNs relacionadas con enfermedad. Un reporte 93 puede ser provisto detallando los resultados de la clasificación de cualesquiera o todos los clasificadores. Se tendrá por entendido que muchos y varios clasificadores pueden ser empleados. Dependiendo de la aplicación.

Como fue anotado anteriormente, mientras el sistema automatizado de la presente invención puede incluir un clasificador primario y uno secundario, un solo clasificador puede ser usado para obtener secuencialmente las clasificaciones obtenidas por la presente invención. Los paquetes de software usados para generar funciones de clasificación basadas en métodos estadísticos están generalmente disponibles comercialmente.

El clasificador automatizado de esta invención preferentemente incluye clasificadores que utilizan decisiones binarias borrosas o decisiones estadísticas Bayesianas basadas en CDNs y CDCs calculadas directamente en ejecución de su función de clasificación. El clasificador puede ser construido para incluir un gran número de valores característicos, por ejemplo, incluir las características morfológicas, características fotométricas, características de textura discreta, características de textura Markoviana, características de textura no Markoviana, características de textura fractal y características de textura de codificación por grupos de longitud variable.

El clasificador primario típicamente puede funcionar para subcategorizar objetos de interés en tres clases: (1) células epiteliales incluyendo células de diagnóstico y células que pueden contener CDNs y CDCs asociadas con enfermedad; (2) células inflamatorias; y (3) artefactos. El clasificador primario puede incidir en la clasificación célula a célula a través de un árbol binario de decisión incorporando una selección de valores característicos.

Como fue indicado anteriormente, la habilidad del sistema de la presente invención para distinguir núcleos de célula de artefactos, células epiteliales de otros tipos de célula, y células que tienen CDNs y CDCs asociadas con enfermedad de otras células epiteliales normales depende de la habilidad del clasificador para hacer distinciones basadas en los valores de las características computados. Por ejemplo, para distinguir células epiteliales normales de células epiteliales anormales (o sea, células de diagnóstico), la presente invención puede aplicar varias funciones discriminantes diferentes, cada una de las cuales es entrenada para identificar tipos particulares de objetos y alteraciones particulares en las CDNs y CDCs.

El clasificador secundario clasifica las células epiteliales en la muestra de célula seleccionada por el clasificador primario y también usa un árbol binario de decisión y valores característicos en la ejecución de su función de clasificación. El clasificador secundario, que puede ser considerado como un clasificador muestra a muestra, analiza las células epiteliales clasificadas por el clasificador primario y clasifica esas células como CDN o CDC-negativa normales y de enfermedad o CDN o CDC-positiva normales y de enfermedad. Al igual que el clasificador primario, el clasificador secundario se construye para distinguir células basado en un conjunto preferente característicos CDN y CDC.

Los conjuntos característicos usados por cada clasificador son desarrollados a partir de funciones discriminantes analizando las características cuantitativas de densidad de núcleos y/o citoplasmas de célula y, preferentemente, incluye un número mínimo de características. Idealmente, la selección de un número mínimo de características nucleares óptimas resulta en un clasificador eficiente y robusto. Es decir, un clasificador que es preferentemente eficiente en clasificar con precisión una célula o un tipo de célula, y también robusto en clasificar fidedignamente una variedad de preparaciones de células y de muestras.

El clasificador puede incluir al menos una función discriminante, en donde la función discriminante usa características de los gráficos de sombras para clasificar células de interés en la muestra incluyendo, pero no limitado a, características densitométricas nucleares (CDNs) 1D y 2D y características densitométricas citoplásmicas (CDCs) y características seleccionadas del grupo consistente en área, radio medio, varianza de la densidad óptica (DO), asimetría de DO, rango de DO, promedio de DO, máximo de DO, densidad de manchas de luz, área de ADN bajo, área de ADN alto, cantidad de ADN bajo, cantidad de ADN alto, distancia promedio alta, distancia promedio medio/alta, correlación, homogeneidad, entropía, dimensión fractal, índice de ADN, textura, puntuación, componentes conectados y los diversos armónicos en el espacio de frecuencias de densidad espacial.

La muestra de célula puede ser un espécimen de pulmón humano, un espécimen cervical humano, un espécimen de sangre, o puede contener células raras. En un ejemplo, la tinción de una muestra para identificar CDNs y CDCs comprende tintar con una tintura de ADN y ARN estequiométrica o proporcional. La tintura de ADN puede ser seleccionada del grupo consistente en tintura de Feulgen, tintura de Romanowski, tintura de May-Grunwald-Giemsa, Verde de Metilo y tionina 9. En otro ejemplo, la muestra puede ser tintada con un marcador de anticuerpo para identificar CDNs y CDCs. En otro ejemplo, un marcador de secuencia de ácido nucleico puede ser usado ventajosamente para tintar la muestra.

El sistema de la invención es útil para analizar varios tipos de células biológicas. En un ejemplo, la célula de interés puede ser seleccionada para ser diagnóstico de cáncer, y/o, la célula de interés puede ser ventajosamente una célula de cáncer preinvasivo. La célula de interés puede comprender una célula de cáncer invasivo donde las células de interés son utilizadas para explorar a un paciente por cáncer. Las células de interés también pueden ser utilizadas para determinar si un paciente desarrollará cáncer invasivo. La célula de cáncer invasivo puede ser derivada de un cáncer epitelial. Alternativamente, o además, la célula de cáncer preinvasivo puede ser derivada de un cáncer epitelial. El cáncer epitelial puede ser seleccionado ventajosamente del grupo consistente en cáncer de pulmón y de garganta, cáncer cervical y ovárico, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de piel y cáncer del tracto gastrointes-
tinal.

En una realización usada para analizar imágenes multidimensionales, tales como, por ejemplo, imágenes 3D e imágenes de mayor dimensión (3D+), las características usadas para clasificar células de interés en la muestra pueden comprender, pero no están limitadas a, características densitométricas nucleares (CDNs) 1D, 2D, 3D, 3D+ y características densitométricas citoplásmicas (CDCs) y características seleccionadas del grupo consistente en área, radio medio, volumen, volumen medio, varianza de densidad óptica (DO), asimetría de DO, rango de DO, promedio de DO, máximo de DO, densidad de manchas de luz, volumen de ADN bajo, volumen de ADN alto, cantidad de ADN bajo, cantidad de ADN alto, distancia promedio alta, distancia promedio medio/alta, correlación, homogeneidad, entropía, dimensión fractal, índice de ADN, textura, puntuación, componentes conectados y los diversos armónicos en el espacio de frecuencia de densidad espacial. El volumen de ADN alto, por ejemplo, puede ser de tal manera que esté por encima de una línea base como es medido en una población de células normales.

La invención ha sido descrita en la presente solicitud en considerable detalle para cumplir con los Estatutos de Patente y proporcionar a los expertos en la técnica de la información necesaria para aplicar los principios nuevos de la presente invención, y construir y usar tantos componentes ejemplares y especializados como son requeridos. Sin embargo, debe tenerse por entendido que la invención puede ser ejecutada por equipamiento y dispositivos y algoritmos de reconstrucción específicamente diferentes, y que varias modificaciones, tanto para los detalles del equipamiento como para los procedimientos operativos, pueden ser realizadas sin salirse del alcance de la presente invención como se define en las reivindicaciones anexas.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es sólo para la conveniencia del lector. No forma parte del Documento Europeo de Patente. Aun cuando se ha tenido un gran cuidado en la compilación de las referencias, los errores o las omisiones no pueden ser excluidas y la EPO desconoce todo adeudo a este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

- US 6026174 A, Palcic: - EP 0539022 A2

- US 5402460 A, Johnson: - US 6201628 B

Literatura no patente citada en la descripción

\bulletSHAPIRO, HM. Practical Flow Cytometry. Wiley-Liss, 1995

\bulletGILBERT, P. Iterative Methods for the Three-dimensional Reconstruction of an Object from Projections. Journal of Theoretical Biology, 1972, vol. 36, 105-17

\bulletOPPENHEIM, BE. More Accurate Algorithms for Iterative 3 dimensional Reconstruction. IEEE Transactions on Nuclear Science NS, 1974, vol. 21, 72-7

\bulletSINGER, JR; GRUNBAUM, FA; KOHN, P; ZUBELLI, JP. Image Reconstruction of the Interior of Bodies that Diffuse Radiation. Science, 1990, vol. 248 (4958), 990-3

\bulletMUELLER, K; YAGE, R. Rapid 3-D Cone-beam Reconstruction with the Simultaneous Algebraic Reconstruction Technique (SART) Using 2-D Texture Mapping Hardware. IEEE Transactions on Medical imaging, 2001, vol. 19 (12), 1227-37

\bulletBELLMAN, SH; BENDER, R; GORDON, R; ROWE, JE. ART is Science being A Defense of Algebraic Reconstruction Techniques for Three-dimensional Electron Microscopy. Journal of Theoretical Biology, 1971, vol. 32, 205-16

\bulletMANGLOS, SH; JASZCAK, RJ; FLOYD, CE. Maximum Likelihood Reconstruction for Cone Beam SPECT: Development and Initial Tests. Physics in Medicine and Biology, 1989, vol. 34 (12), 1947-57

\bulletMANGLOS, SH; GAGNE, GM; KROL A; THOMAS, FD; NARAYANASWAMY, R. Transmission Maximum-likelihood Reconstruction with Ordered Subsets for Cone Beam CT. Physics in Medicine and Biology, 1995, vol. 40 (7), 1225-41

\bullet Handbook of Optics: Fiber Optics and Nonlinear Optics. Mcgraw-Hill, 2001, vol. IV

\bulletKAK, AC; SLANEY, M. Principles of Computerized Tomographic Imaging. IEEE Press, 1988

\bulletHERMAN, G. Image Reconstruction from Projections: The Fundamentals of Computerized Tomography. Academic Press, 1980

\bulletPAULSEN, KD; JIANG, H. Spatially Varying Optical Property Reconstruction Using a Finite Element Diffusion Equation Approximation. Medical Physics, 1995, vol. 22, 691-701

\bulletHAMPEL, U; FREYER, R. Fast Image Reconstruction for Optical Absorption Tomography in Media with Radially Symmetric Boundaries. Medical Physics, 1998, vol. 25 (1), 92-101

\bulletJIANG, H; PAULSEN, KD; OSTERBERG, UL. Frequency-domain Near-infrared Photo Diffusion Imaging: Initial Evaluation in Multitarget Tissuelike Phantoms. Medical Physics, 1998, vol. 25 (2), 183-93

Claims

1. Un método para detectar células de interés (1) en una muestra de célula, que comprende los pasos de:

: obtener una muestra de célula y suspender las células (1) en la solución (17);

: preparar las células (1) de la muestra de célula en la solución;

: marcar las células (1) para generar densidades ópticas dentro de cada célula de la muestra;

: iluminar la muestra con al menos una fuente de puntos de luz (21), en donde las células son presentadas una a una para la iluminación;

: obtener al menos dos imágenes de proyección a través de la muestra con un detector (23) de colección digital;

: compensar las al menos dos imágenes de proyección para variaciones en la iluminación de fondo;

: analizar las al menos dos imágenes de proyección para detectar al menos un objeto de interés;

: calcular un conjunto de valores característicos (94) para el al menos un objeto de interés, incluyendo valores característicos unidimensionales (1D) y valores característicos bidimensionales (2D), donde los valores 1D y 2D son calculados usando densidades ópticas generadas en el al menos un objeto de interés;

: proporcionar el conjunto de valores característicos (94) para al menos un clasificador (90);

: usar el conjunto de valores característicos (94) y el al menos un clasificador (90) para identificar el al menos un objeto de interés desde la muestra de célula; Y combinar las al menos dos imágenes de proyección usando métodos para la reconstrucción de imagen computarizada para generar imágenes tomográficas multidimensionales, en donde los métodos de reconstrucción de imagen computarizada incluyen métodos seleccionados del grupo consistente en geometrías de proyección de haz en abanico y geometrías de proyección de haz en cono.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el conjunto de valores característicos (94) usado para clasificar el al menos un objeto de interés en la muestra es seleccionado del grupo consistente en características densitométricas nucleares (CDNs) 1D y 2D, características densitométricas citoplásmicas (CDCs), área, radio medio, varianza de la densidad óptica (DO), asimetría de DO, rango de DO, promedio de DO, máximo de DO, densidad de manchas de luz, área de ADN bajo, área de ADN alto, cantidad de ADN bajo, cantidad de ADN alto, distancia promedio alta, distancia promedio medio/alta, correlación, homogeneidad, entropía, dimensión fractal, índice de ADN, textura, puntuación, componentes conectados y armónicos en el espacio de frecuencia de densidad espacial.

3. El método de la reivindicación 1, en donde el paso de usar el al menos un clasificador (90) comprende usar un clasificador que tiene al menos una función discriminante.

4. El método de la reivindicación 3 en donde la al menos una función discriminante usa un conjunto característicos discriminantes seleccionadas del grupo consistente en características densitométricas nucleares (CDNs) 1D y 2D, características densitométricas citoplásmicas (CDCs), área, radio medio, varianza de la densidad óptica (DO), asimetría de DO, rango de DO, promedio de DO, máximo de DO, densidad de manchas de luz, área de ADN bajo, área de ADN alto, cantidad de ADN bajo, cantidad de ADN alto, distancia promedio alta, distancia promedio medio/alta, correlación, homogeneidad, entropía, dimensión fractal, índice de ADN, textura, puntuación, componentes conectados y armónicos en el espacio de frecuencia de densidad espacial.

5. El método de la reivindicación 1 en donde la muestra de célula comprende un espécimen de pulmón humano.

6. El método de la reivindicación 1 en donde la muestra de célula comprende un espécimen cervical humano.

7. El método de la reivindicación 1 en donde la muestra de célula comprende una muestra de sangre humana.

8. El método de la reivindicación 1 en donde la muestra de célula comprende células raras.

9. El método de la reivindicación 1 en donde el paso de marcar la muestra comprende entintar con una tintura seleccionada del grupo consistente en tintura de ADN estequiométrica, tintura de ARN estequiométrica, tintura de ADN proporcional, y tintura de ARN proporcional.

10. El método de la reivindicación 9 en donde el paso de marcar la muestra comprende entintar con una tintura seleccionada del grupo consistente en tintura de Feulgen, tintura de Romanowski, tintura de May-Grunwald-Grunwald-Giemsa, Verde de Metilo y tionina.

11. El método de la reivindicación 1 en donde el paso de marcar la muestra comprende entintar con un marcador de anticuerpo.

12. El método de la reivindicación 1 en donde el paso de marcar la muestra comprende entintar con un marcador de secuencia de ácido nucleico.

13. El método de la reivindicación 1 que además comprende el paso de seleccionar el al menos un objeto de interés para incluir diagnósticos de cáncer.

14. El método de la reivindicación 1 que además comprende el paso de seleccionar el al menos un objeto de interés para incluir una célula de cáncer preinvasivo.

15. El método de la reivindicación 1 que además comprende el paso de seleccionar el al menos un objeto de interés para incluir una célula de cáncer invasivo.

16. El método de la reivindicación 1 que además comprende el paso de usar el al menos un objeto de interés para explorar a un paciente para cáncer.

17. El método de la reivindicación 1 que además comprende el paso de usar el al menos un objeto de interés para determinar si un paciente desarrollará cáncer invasivo.

18. El método de la reivindicación 14 en donde la célula de cáncer preinvasivo es derivada de un cáncer epitelial.

19. El método de la reivindicación 18 en donde el cáncer epitelial es seleccionado del grupo consistente en cáncer pulmonar, cáncer de garganta, cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer de mama, cáncer de la próstata, cáncer de piel y cáncer del tracto gastrointestinal.

20. El método de la reivindicación 15 en donde la célula de cáncer invasivo es derivada de un cáncer epitelial.

21. El método de la reivindicación 20 en donde el cáncer epitelial es seleccionado del grupo consistente en cáncer pulmonar, cáncer de la garganta, cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer de mama, cáncer de la próstata, cáncer de piel, cáncer del tracto gastrointestinal, cáncer linfático y cáncer óseo.

22. El método de la reivindicación 14 en donde la célula de cáncer preinvasivo es derivada de un cáncer neuroendocrino.

23. El método de la reivindicación 22 en donde el cáncer neuroendocrino es seleccionado del grupo consistente en cáncer del pulmón y de la garganta, cáncer cervical, cáncer de mama, y el cáncer del tracto gastrointestinal, cáncer linfático y cáncer óseo.

24. El método de la reivindicación 15 en donde la célula de cáncer invasivo es derivada de un cáncer neuroendocrino.

25. El método de la reivindicación 24 en donde el cáncer neuroendocrino es seleccionado del grupo consistente en cáncer pulmonar, cáncer de la garganta, cáncer cervical, cáncer de mama, y cáncer del tracto gastrointestinal, cáncer linfático y cáncer óseo.

26. El método de la reivindicación 1 que además comprende pasos en donde las imágenes multidimensionales, son procesadas como sigue:

(a): compensar las imágenes multidimensionales por variaciones en la iluminación de fondo,

(b): analizar las imágenes multidimensionales para detectar al menos un objeto de interés;

(c): calcular una superficie que delimita cada objeto de interés;

(d): calcular un conjunto de valores característicos multidimensionales (94) para cada objeto de interés; y

(e): proporcionar un conjunto de valores característicos multidimensionales (94) para al menos un clasificador (90) que identifica y caracteriza células de interés en la muestra de célula.

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27. El método de la reivindicación 26 en donde los valores característicos multidimensionales (94) usados para clasificar células de interés en la muestra son seleccionados del grupo consistente en características densitométricas nucleares (CDNs) 1D, CDNs 2D, CDNs 3D y CDNs 3D+, características densitométricas citoplásmicas (CDCs) 1D, CDCs 2D, CDCs 3D y CDCs 3D+, área, radio medio, volumen, volumen medio, varianza de la densidad óptica (DO), asimetría de DO, rango de DO, promedio de DO, máximo de DO, densidad de manchas de luz, volumen de ADN bajo, volumen de ADN alto, cantidad de ADN baja, cantidad de ADN alta, distancia promedio alta, distancia promedio medio/alta, correlación, homogeneidad, entropía, dimensión fractal, índice de ADN, textura, puntuación, componentes conectados y armónicos en el espacio de frecuencia de densidad espacial.

28. El método de la reivindicación 26 en donde los valores característicos multidimensionales (94) incluyen características 1D, 2D, 3D y 3D+ que son utilizadas por un programa de clasificación para caracterizar células de interés con respecto al tipo, maduración, estado de enfermedad, presencia y abundancia relativa de marcadores cuantitativos.

29. El método de la reivindicación 26 en donde el clasificador detecta y caracteriza células de interés incluyendo células raras.

30. El método de la reivindicación 26 incluyendo además el paso de diagnosticar la muestra de célula basado en la caracterización de células.