JP4718777B2 - 光投影画像システム、および核を有する細胞および疾病に関与する細胞質密度の特徴を自動的に検出する方法 - Google Patents
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Description
・細胞の重なり合いおよび不鮮明さが最小限になるように、細胞は導管を一列で流れる。
・導管を流れる細胞の速度は直接検出することができ、一定である。
・細胞は導管の中心軸を辿り、構造的に放射対称性になる傾向がある。
・細胞の固定および懸濁の調整に応じて、細胞は柔軟性を保持することができ、導管内の速度勾配に反応してz軸に沿って細長い形をとる。
本発明は上記の特徴を利用して、点光源投影画像化および断層画像再構成のためのシステムを提供することにある。
t=d+V (式1)
1.細胞17の外側の流動体(すなわち、シース液および細胞懸濁培地)
2.細胞質18、および
3.細胞核19
フロー・サイトメータ
図5を参照すると、本発明の一実施形態として熟考されるように、フロー・オプティカル断層撮影システム(FOT)の一例が概略的に示されている。このフロー・オプティカル断層撮影システムは、フロー・サイトメータを備えており、再構成円筒20が導管2の周囲に設けられている。光子25の源および光子センサ26は、波高分析器27と共に働いてトリガ装置として動作する。波高分析器27は、細胞の開始に対して第1のトリガ地点28を、細胞の終わりに対して第2のトリガ地点29を提供するために、知られている原理に従って動作する。波高分析器27は、各細胞の開始および終わりに対応するトリガ信号30を出力するが、このトリガ信号は再構成円筒20によって受け取られる。
ここで図6を参照すると、本発明の一実施形態によって熟考されるように、再構成円筒20内に扇状ビームの投射光線の一例が概略的に示されている。再構成円筒の目的は、小さな円周に沿って円筒形の導管に向けて、複数の固定された点光源21a〜21cから光を投射する手段を提供することである。点光源から放出された光子は、扇状または円錐状などの知られている投影形状であり、センシング要素23a、23bまたは23cの列によって検出されことになっており、場合によっては対応する点光源に対向するより大きな円周に沿って設置されるべき導管を通過する。扇状のビーム透過照明に適した曲線状の線形(1D)センサ・アレイを説明のために示しているが、円錐状のビーム照明に適した直線状の線形(1D)センサ・アレイまたは平面(2D)センサ・アレイが同様に採用されてよいことが理解されるべきである。この方法で、投影光線のセットが生成され得るが、投影光線は点光源と個々のセンシング要素とを接続する直線として示すことができる。光線31などの特定の投影光線に沿って点光源を去る光子の数と、特定のセンシング要素にて受け取られる光子の数との間の差は、細胞および投影光線路に沿った流管の他の内容との相互作用によって失われる、あるいは減衰される光子の数と関連している。
各光源は同じ一般的な特性を有してよく、好適には以下の通りである。
・光源は小さな円形の点光源に近いものであってよい。
・光源は、知られているスペクトル容量を用いて明るいものであってよい。
・光源から放出される光子は、円錐ビームまたは扇状ビームなどの知られている形状であってよい。
各光源は1つの投影角についてのデータを作成する。軸が流管の中心軸であるらせんに沿って配置された複数の光源は、細胞がモジュールを流れるときに、それぞれ連続する平面(または再構成断面)を通る複数の投影角からデータを作成する。センサ形状に応じて、センサにおいて投影が重なり合わないように、いくつかの点光源が同じ円周上に共線形的に配置されてよい。小さい角度範囲が、いくつかの場合には堪えることができるが、180°のらせんに沿って等距離で光源を設置することによって、良いサンプリング形状を得ることができ、信号対雑音比を改善するために、360°を使用してよい。所望の点光源の数は、各平面再構成(x−y平面)または容積再構成内の必要な解像度の関数である。らせん状の構成が照明のために用いられるが、種々の幾何学的パターンが点光源構成に使用されてよいことが理解されるべきである。さらに、点光源の波長は、種々のダイオードまたは他のレーザを、あるいは白色のまたは他の広帯域の源、例えば、水銀灯またはキセノン・アーク灯である帯域通過フィルタいずれかを用いることによって選択可能である。
・レーザまたは他の高強度の光子源の前のピンホール。
・断面が小さな光ファイバ。
・光子源の前の短焦点レンズ。
・リン光面体上に光点を照射する電子ビーム(CRTの形態)。
・上記を種々組み合わせたもの。
各点光源は、再構成の円を通過する光子線を受け取るために、CCDなどの対応するセンシング要素のアレイを、点光源の反対側でいくつかの直線状または曲線状構成で有していなければならない。典型的には、線形アレイは、そのセンシング要素のアレイの中心は、点光源と流れの中心軸との間の線上にあってよく、またその流れの軸に対して垂直に並んでいてよい。2Dアレイ内の要素の各ラインのサブセットのみが、再構成の入力のために読み出される2Dアレイを使用することが可能である。ある2Dアレイでは、点光源のらせん構成に沿った異なる点光源の各々と適切に一直線になるように、要素の連続するサブセットの各々は、適切な数の要素によって交互に置かれてよい。
フィルタ処理背投影方法として知られている最も一般的で簡単に実施される再構成アルゴリズムは、円錐状のビーム形状または扇状のビーム形状を用いるコンピュータX線断層撮影(CT)における同様のパラダイムから導かれる。(例えば、次の参照文献を参照すること。1988年、ニューヨークのIEEEプレス発行の、Kak,ACとSlaney,Mの「コンピュータ断層撮影の原理(Principles of Computerized Tomographic Imaging)」および1980年、ニューヨークのアカデミックプレス社発行の、Herman,Gの「投影からの画像再構成:コンピュータ断層撮影の基本(Image Reconstruction from Projections:The Fundamentals of Computerized Tomography)」。)これらの方法は、点光源および/または検出器構成の特定の幾何学的形状および照射ビーム内の光路を反映する変形例と共に、ラドン変換の定理に基づいたものである。しかし、臨床用のX線CTの場合、slice−by−sliceの取得のために、所定のスライス内の複数の投影角からデータを収集するために、X線源および検出器アレイが患者の周りの弧に沿って移動するかもしれない間に、通常ヒト被験者は動かないように保持される。次に、ヒト被験者はz軸に沿って再度位置決めされ、別のスライスのデータなどが収集される。択一的には、より現代的な臨床らせんCTにおいては、らせん状の投影データを収集するために点光源−検出器のアセンブリが連続的に回転する間、患者は連続的にz軸方向に動かされてよく、続いて、このデータは患者のz軸と直交する投影画像を提供するために補間される。フロー・オプティカル断層撮影では、被験体(細胞)は、固定された点光源および検出器アレイに対して等速で移動され、複数の点光源および/または検出器システムは、所定のスライスまたは容積内で複数の投影角のデータを生成するような方法で、細胞の速度ベクトルに沿って特定のゲート時間の地点と同期してデータを取得する。slice−by−sliceで走査する場合、再構成アルゴリズムは、動きの軸に垂直な平面の2D画像を計算し、複数のスライスの連続的な重なり合いが、被検体の3D画像を生成するが、この3D画像は、コントラストがX線減衰係数またはそれぞれCTあるいはフロー・オプティカル断層撮影のための、被検体内の光学密度の変化の関数である。容積を円錐状に走査する場合、再構成アルゴリズムは、細胞または他の物体内の容積の3D画像を平面的な透過型または放出型の光学的投影から直接的に計算するが、この場合コントラストはそれぞれ、画像化された物体内の光学密度および/または標識プローブ密度の分布の関数である。
多染性の点光源を用いる場合(例えば、白色光)、所定の細胞内の多数の分子プローブと構造上の特徴とを識別するために、異なる染色液(例えば、chromaphor)を用いてよい。ここで、点光源あるいはセンシング・アレイ(またはその両方)にある一連の帯域通過フィルタは、波長データを分離し、個々に染色された分子の再構成および空間的位置決めを可能にする。複数のプローブを画像化することによりロバストな方法は、センサ・アレイ内に強力な白色灯源、および複数のろ波された帯域幅を同時に収集する工程を含み、これによって、画像再構成アルゴリズムは、各chromaphorに対して空間的な画像スライスを算出することができる。これらはカラー画像として表示されてよい。
特別な場合のフロー・オプティカル断層撮影システムとして、ある分子プローブに、光子の一次源によって刺激を受けたときに、波長(より長い)の異なる光を放出する「レポーター」という標識を付けることができる。一次源の光子と二次的な放出光子とを分離するために、レポーターからの二次放出は、標準的な光フィルタを用いてろ波され得る。しかし、二次的な光子は点光源からの直接的な光路に必ずしも出現するというわけではないため、二次的な放出光子の画像再構成アルゴリズムは、さらに複雑なものである。二次的な光子が二次的な点光源から均一な球形パターンで放射すると仮定した場合、いずれかのセンシング要素に到達する二次的な光子の強度は、センシング要素との距離の関数になろう。点光源に対する、再構成スライス内の二次的な光子の空間的分布のモデルを提供することによって、二次的な点光源からの光子の非球形分布がさらに改善されよう。いずれかの方法は、再構成スライスまたは容積内の二次的な点光源の位置を算出する手段を提供するであろう。画像化された物体と検出器アレイとの間の照準は、画像再構成を向上するであろう。
Claims (29)
- 細胞標本内の対象となる細胞(1)を検出する方法であって、
(a)採取された細胞標本の該細胞(1)を溶液(17)で懸濁する工程と、
(b)前記細胞標本の前記細胞(1)を溶液中で固定する工程と、
(c)前記標本の各細胞(1)内で光学密度を発生させるために、前記細胞をマーキングする工程と、
(d)少なくとも1つの点光源(21)を用いて、前記細胞(1)に照明を当てる工程と、
(e)デジタル・アレイ検出器(23)を用いて、前記標本を介して少なくとも1つの投影画像を取得する工程と、
(f)背景の照明の変動に対して、前記少なくとも1つの投影画像を補正する工程と、
(g)前記少なくとも1つの投影画像を分析して、少なくとも1つの対象となる物体を検出する工程と、
(h)少なくとも1つの対象となる物体に関する一次元(1D)の特徴値および二次元の特徴値(2D)を有する、特徴値(94)のセットを算出する工程であって、前記特徴値のセットが1D及び2Dの核密度の特徴(NDF)と細胞質密度の特徴(CDF)のグループから選択される、工程、
(i)前記特徴値(94)のセットを少なくとも1つの分類器(90)に提供する工程と、
(j)前記細胞標本から前記少なくとも1つの対象となる物体を識別するために、前記特徴値(94)のセットおよび前記少なくとも1つの分類器(90)を用いる工程とから成る細胞標本内の対象となる細胞(1)を検出する方法。 - 前記標本内の前記少なくとも1つの対象となる物体を分類するために用いられる前記特徴値(94)のセットは、さらに、細胞標本の細胞の面積及び平均半径、細胞標本の細胞の光学密度(OD)の変動、細胞標本の細胞のODの歪み、細胞標本の細胞のOD範囲、細胞標本の細胞のOD平均値、細胞標本の細胞のOD最大値、細胞標本の細胞のDNA領域、細胞標本の細胞のDNA量、エントロピ、フラクタル寸法、DNA指標、斑点性から成るグループから選択される請求項1に記載の方法。
- 前記細胞標本は、ヒト肺の検体を含む請求項1に記載の方法。
- 前記細胞標本は、ヒト子宮頚部の検体を含む請求項1に記載の方法。
- 前記細胞標本は、ヒト血液の検体を含む請求項1に記載の方法。
- 前記細胞標本は、稀な細胞を含む請求項1に記載の方法。
- 前記標本にマーキングする工程は、DNA染色液およびRNA染色液のいずれかの染色液を用いて染色する工程を含む請求項1に記載の方法。
- 前記標本にマーキングする工程は、Feulgen染色液、Romanowski染色液、May−Grunwald−Giemsa染色液、Methyl Green、およびチオニンから成るグループから選択された染色液を用いて染色する工程を含む請求項1に記載の方法。
- 前記標本をマーキングする工程は、抗体マーカを用いて染色する工程を含む請求項1に記載の方法。
- 前記標本をマーキングする工程は、核酸シーケンス・マーカを用いて染色する工程を含む請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの対象とする物体が前浸潤癌細胞である請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの対象とする物体が浸潤癌細胞である請求項1に記載の方法。
- 前記前浸潤癌細胞は、上皮癌から採取される請求項11に記載の方法。
- 前記上皮癌は、肺癌、咽喉癌、子宮頚癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、皮膚癌、および胃腸管の癌からなるグループから選択される請求項13に記載の方法。
- 前記浸潤癌細胞は、上皮癌から採取される請求項12に記載の方法。
- 前記上皮癌は、肺癌、咽喉癌、子宮頚癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、皮膚癌、胃腸管の癌、およびリンパ腺癌からなるグループから選択される請求項15に記載の方法。
- 前記前浸潤癌細胞は、神経内分泌癌から採取される請求項11に記載の方法。
- 前記神経内分泌癌は、肺癌および咽喉癌、子宮頚癌、乳癌、胃腸管の癌、およびリンパ腺癌からなるグループから選択される請求項17に記載の方法。
- 前記浸潤癌細胞は、神経内分泌癌から採取される請求項12に記載の方法。
- 前記神経内分泌癌は、肺癌、咽喉癌、子宮頚癌、乳癌、および胃腸管の癌、およびリンパ腺癌からなるグループから選択される請求項19に記載の方法。
- 多次元画像を生成するために、コンピュータ化された画像再構成方法を用いて少なくとも2つの投影画像を組み合わせる工程をさらに含んだ請求項1に記載の方法。
- 前記コンピュータ化された画像再構成の方法は、扇状のビーム投影形状および円錐状のビーム投影形状から成るグループから選択される方法を含む請求項21に記載の方法。
- 前記多次元画像が次のように処理されるような、
(a)背景の照明の変動に関し、前記多次元画像を補正する工程と、
(b)前記多次元画像を分析して、少なくとも1つの対象となる物体を検出する工程と、
(c)対象となる各物体の境界になっている表面を算出する工程と、
(d)対象となる各物体に対して、多次元の特徴値(94)のセットを算出する工程と、
(e)細胞標本内の対象となる細胞を識別し、かつ特徴付ける、少なくとも1つの分類器(90)に、前記多次元の特徴値(94)のセットを提供する工程とをさらに含んだ請求項21に記載の方法。 - 前記標本内で対象とする細胞を分類するために用いられる、前記多次元の特徴値(94)は、3次元のNDF、3次元のCDF、細胞標本の細胞の面、細胞標本の細胞の平均半径、細胞標本の細胞の光学密度(OD)の変動、細胞標本の細胞のODの歪み、細胞標本の細胞のOD範囲、細胞標本の細胞のOD平均値、細胞標本の細胞のOD最大値、細胞標本の細胞のDNA容積、細胞標本の細胞のDNA量、エントロピ、フラクタル寸法、DNA指標、斑点性から成るグループから選択される請求項23に記載の方法。
- 前記多次元の特徴値(94)は、タイプ、成熟度、病態、定量的マーカの相対存在量および出現に関して、対象とする細胞を特徴付けるために、分類プログラムによって利用される1D、2D、および3Dの特徴を含む請求項23に記載の方法。
- 前記分類器は稀な細胞を含んだ対象とする細胞を検出かつ特徴付ける請求項23に記載の方法。
- 前記細胞の特徴付けに基づいて、前記細胞標本を識別する工程をさらに含む請求項23に記載の方法。
- 細胞標本から前記少なくとも1つの対象とする物体を識別する方法であって、
(a)採取された細胞標本の該細胞(1)を溶液(17)で懸濁する工程と、
(b)前記細胞標本の前記細胞(1)を溶液(17)中で固定する工程と、
(c)前記標本の各細胞(1)内で、光学密度を発生させるために、前記細胞をマーキングする工程と、
(d)少なくとも1つの点光源を用いて、前記標本に照明を当てる工程と、
(e)デジタル・アレイ検出器(23)を用いて、前記標本を介して少なくとも1つの投影画像を取得する工程と、
(f)背景の照明の変動に対して、前記少なくとも1つの投影画像を補正する工程と、
(g)前記少なくとも1つの投影画像を分析して、少なくとも1つの対象となる物体を検出する工程と、
(h)前記少なくとも1つの対象とする物体に対する一次元(1D)の特徴値および二次元(2D)の特徴値を有する特徴値(94)のセットを算出する工程であって、前記標本内で前記少なくとも1つの対象とする物体を分類するために使用される該特徴値(94)のセットは、1Dの核密度の特徴値(NDF)、2DのNDF、1Dの細胞質密度の特徴値(CDF)、2DのCDF、細胞標本の細胞の面積、細胞標本の細胞の平均半径、細胞標本の細胞の光学密度(OD)の変動、細胞標本の細胞のODの歪み、細胞標本の細胞のOD範囲、細胞標本の細胞のOD平均値、細胞標本の細胞のOD最大値、細胞標本の細胞のDNA領域、細胞標本の細胞のDNA量、エントロピ、フラクタル寸法、DNA指標、斑点性から成るグループから選択されるような工程と、
(i)前記特徴値(94)のセットを少なくとも1つの分類器(90)に提供する工程と、
(j)前記細胞標本から前記少なくとも1つの対象となる物体を識別するために、前記特徴値(94)のセットおよび前記少なくとも1つの分類器(90)を用いる工程とから成る細胞標本から前記少なくとも1つの対象とする物体を識別する方法。 - 前記少なくとも1つの投影画像は、射影を含んでいる請求項1に記載の方法。
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