EP2059906A2 - Verfahren zur quantitativen bestimmung der kolokalisation von molekülmarkern in gewebeschnitten - Google Patents

Verfahren zur quantitativen bestimmung der kolokalisation von molekülmarkern in gewebeschnitten

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Publication number
EP2059906A2
EP2059906A2 EP07788341A EP07788341A EP2059906A2 EP 2059906 A2 EP2059906 A2 EP 2059906A2 EP 07788341 A EP07788341 A EP 07788341A EP 07788341 A EP07788341 A EP 07788341A EP 2059906 A2 EP2059906 A2 EP 2059906A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
molecular markers
tissue
tissue section
molecular
colocalization
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP07788341A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ansgar Pommer
Bernd Bonnekoh
Raik BÖCKELMANN
Harald Gollnik
Lars Phillipsen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tpa Biotech GmbH
Original Assignee
Skinsystec GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Skinsystec GmbH filed Critical Skinsystec GmbH
Publication of EP2059906A2 publication Critical patent/EP2059906A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T7/00—Image analysis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism

Definitions

  • the invention relates to a method for the quantitative determination of the colocalization of at least two molecular markers in tissue sections, in particular in skin and mucosal tissue sections.
  • tissue section to be examined is mixed with a solution containing a specific reagent, eg. As a dye or an antibody contains.
  • a specific reagent eg. As a dye or an antibody contains.
  • the tissue section containing the molecular groups marked in this way is replaced by different, mostly optical Investigated methods, wherein a signal distribution pattern reflecting the arrangement and distribution of the molecular group of interest is recorded.
  • Fluorescence microscopy in which the fluorescence of with a fluorophore, for example, fluorescein iso-thiocyanate or phycoerythrin, labeled molecules is measured.
  • a fluorophore for example, fluorescein iso-thiocyanate or phycoerythrin
  • Fluorescence signal distribution pattern recorded which reflects the distribution and arrangement of the labeled molecule in the microscope object.
  • the procedure described above must be repeated frequently using different fluorophores.
  • the fluorescence signal distribution patterns obtained in each case for the different molecular species are subsequently to be evaluated together to determine the correlative distribution of the molecular species studied.
  • a method for automating repeated fluorescence labeling for the purpose of determining the colocalization of molecular species in a cell or tissue sample is described in DE 197 09 348 C2.
  • This automated method termed “automatic multi-epitope ligand mapping method” (MELK)
  • MELK uses a device that includes a pipetting system, a 3D handling system, and an optical measuring system.
  • the automatic pipetting system the cell or tissue sample to be examined will gradually with different incubation solutions, each one or more Fluorophore-conjugated reagents, with a fluorescence distribution pattern being recorded by a fluorescence microscope image acquisition device, such as a CCD camera, for each incubation cycle.
  • the invention is therefore based on the object of specifying a method which also allows reliable quantitative statements on the colocalization of molecular markers in tissue sections, in particular in skin and mucosal tissue sections.
  • Tissue section for each of the at least two molecular markers to represent the respective molecular marker - superimposition of the digitized images into a summation image
  • each pixel is assigned a vector whose components are the quantized molecular marker signals of the at least two molecular markers.
  • an image which represents the signal distribution pattern of the respective molecular marker is first recorded and digitized for each of the at least two molecular markers.
  • the images can be generated by different analysis methods. Fluorescence microscopy has proved to be particularly suitable as an analytical method which has been used successfully for many years in biology and medicine. In this case, fluorophores are used as molecular markers whose fluorescence signals are displayed in a fluorescence image.
  • other methods of analysis may be used to generate the digitized images of the tissue section, such as autoradiography, in which the digitized images are read by reading a radiation detector which registers the radioactive radiation emitted by isotope-labeled molecules, or by digitizing one by the radiation blackened photographic film are generated.
  • the digitized images are then superimposed according to the invention to form a summation image, wherein it depends particularly on a preparation point or pixel-precise overlay to obtain exact information about the relative positions of the individual molecule markers to each other.
  • a preparation point or pixel-precise overlay to obtain exact information about the relative positions of the individual molecule markers to each other.
  • the signals for each of the at least two molecular markers in the summation image are quantized pixel by pixel after the image has been overlaid. This can be done by different types of coding, for example by a Trinär-Codtechnik (Basis 3) or in general by an encoding to the base of a number n.
  • a matrix is finally generated, wherein each pixel of the summation image is assigned a vector whose components correspond to the quantized molecular marker signals of the at least two molecular markers.
  • the standardized orientation may be such that the basal membrane zone (BMZ) of the skin tissue in each of the digitized images is disposed substantially horizontally.
  • the digitized images can be aligned anatomically standardized, so that an alignment of the tissue section itself is not required.
  • each of the images is checked for non-informative contents, in particular with regard to possible artifacts, image areas occupied with non-informative contents are marked and these image areas are removed from all images.
  • image areas occupied with non-informative contents are marked and these image areas are removed from all images.
  • the vectors associated with each pixel are normalized to a defined horizontal width of a Hautgewebesammlungs. This can be done by vectorial addition of the signal vectors of the pixels arranged side by side on the defined horizontal width of the Hautgewebeitess. This takes into account the biological situation that the skin is a nonhomogeneous, stratified epithelial tissue that is permanently differentiating perpendicular to the BMZ line, so that normalization only follows along the BMZ line, ie in the horizontal direction, and not perpendicular to it makes sense.
  • the defined horizontal width of the Hautgewebeites may be for example 100 microns.
  • the analysis of the quantized molecular marker signals represented as a vector for each pixel may relate to the entire tissue section, but it is also possible that colocalization of certain molecular markers, e.g. B. certain T-cell subpopulations, toposelective in certain microcompartments, such as the epidermis, in the blood or lymph vessel system or in the dermis to determine quantitatively.
  • the quantitative determination of the colocalization of the molecular marker can be carried out in at least one focal field of the tissue section.
  • a focus field any, for example, a rectangular, circular or any polygonal area to be determined in the tissue section to be examined. Due to the high automation potential of the method according to the invention, it makes sense to perform this while executing a computer program on a data processing system.
  • the invention is further based on the object of providing a device for the quantitative determination of the colocalization of at least two molecular markers in tissue sections, in particular in skin and mucosal tissue sections, which is composed of commercially available standard components and thus can be realized comparatively inexpensively.
  • the unit for generating digitized images is designed as a fluorescence microscope and comprises a CCD camera.
  • Fig. 1 shows a skin tissue section with a reference line along the basal membrane zone (BMZ)
  • Fig. 2 shows a number of fluorescence images of
  • FIG. 9 is a graphical representation of a bivariate analysis for the quantitative determination of the colocalization of a key molecule marker with each one of the remaining molecular marker and
  • Fig. 1 the microscopic image of a skin tissue section is shown. Visible is the upper layer of the horny layer 1 (stratum corneum) and below the epidermis 2 (epidermis). Also recognizable are the basal membrane zone 3 (BMZ), the dermis 4 (dermis) and the subcutis 5 (subcutis). In the area of the basal membrane zone 3 and the dermis 4 different blood and lymph vessels 6 are shown in cross section.
  • BMZ basal membrane zone 3
  • dermis 4 dermis
  • subcutis 5 subcutis
  • the microscopic image of the skin tissue section is first aligned anatomically standardized in a suitable manner. This is preferably done in such a way that the basement membrane zone 3 runs substantially horizontally in the reference coordinate system of the image acquisition apparatus.
  • the mean course of the basement membrane zone 3 is designated in FIG. 1 as BMZ line.
  • FIG. 2 now shows a total of four digitized images of the skin tissue section from FIG. 1, this being different in the context of a test series with n Molecular markers was added. All images were taken by fluorescence microscopy and show the fluorescence signals of the molecular marker shown in each case as a hatched area. In Fig. 2, these carry the reference numeral 7. Further, in Fig. 2, a phase contrast image of the Hautgewebe4.000s is shown. The inclusion of a phase contrast image facilitates the preparation point exact superposition of the fluorescence images in the context of the method according to the invention. As can also be seen from FIG. 2, all fluorescence images as well as the phase contrast image are already anatomically standardized by the horizontal arrangement of the basal membrane zone.
  • a uniform image area (general information field) is defined for all fluorescence images (the fluorescence signals are not shown in FIG. 3 for the sake of clarity) and the phase contrast image.
  • all the fluorescence images are checked for non-informative contents, in particular artifacts.
  • a technical artifact 8 uniquely detectable by an unnatural fluorescence signal value or a particle is identified in the first fluorescence image.
  • the image area occupied by the artifact 8 is marked and removed from the line through the upper edge of the skin tissue section and a line drawn parallel to it in the area of the subcutaneous tissue and laterally delimited by vertical lines in all fluorescence images.
  • FIG. 5 simultaneously represents the summation image from the individual fluorescence images.
  • the colocalization of the individual molecule markers in the tissue section can already be determined on a qualitative level.
  • FIG. 4 now shows a further essential step of the method according to the invention.
  • the signals of all molecular markers in the summation image are quantized pixel by pixel.
  • they are trinely coded, i. H. into the three categories "not available” (value 0), "weakly available” (value 1) and “strongly present” (value 2).
  • a vector whose dimension corresponds to the number of examined molecular markers and thus to the number of different fluorescence images is formed and arranged in a matrix corresponding to the pixel grid of the digitized images.
  • the components of the vectors formed for each pixel of the pixel grid correspond to the quantized ones
  • Molecular marker signals of the n analyzed molecular markers can also be referred to as Molecular Phenotype (MOLP).
  • MOLP Molecular Phenotype
  • FIG. 4 a 4 ⁇ 4 pixel block and specifically the pixel P 32 (3rd row, 2nd column) is considered concretely. This provides no signal for the molecular marker 1, since the fluorescent signal X recognizably does not protrude sufficiently far into the 4 ⁇ 4 pixel block. The situation is different with the molecular marker 2.
  • the weak signal Y becomes represented by the value 1 in the context of quantization.
  • the signal Z (molecular marker 3) is a strong signal. Accordingly, this is quantized with the value 2.
  • no signal is registered for the molecular marker n (ie quantized value 0).
  • the normalization is preferably carried out by vectorial addition of the signal vectors of juxtaposed pixels on the defined horizontal width of Hautgewebeites, which in the present case is suitably set to 100 microns.
  • the standardization takes into account the biological situation that the skin is a permanently differentiating epithelial tissue perpendicular to the BMZ line, so that a standardization only along the BMZ line, ie. H. makes sense in the horizontal direction.
  • This normalization is also referred to as "normalized number of pixels (NORP) with respect to a defined horizontal skin width".
  • the analysis of the quantized molecular marker signals may relate to the entire tissue section, but it is also possible for a toposelective colocalization of certain molecular markers in certain microcompartments of the skin tissue section. As shown by way of example in FIG. 5, these may be the epidermis 2, blood or lymphatic vessels 6 or also the dermis 4.
  • the colocalization of the analyzed molecular markers can also be determined by analyzing individual focal fields of the tissue section make. These can be of any geometrical shape, for example as a square (FIG. 6a), as circles (FIG. 6b) or else as any surface (FIG. 6d).
  • Fig. 7 shows the examination of the immediate pixel neighborhood to a central pixel.
  • this search strategy referred to as "pixel neighborhood search”
  • the eight neighboring pixels laterally or diagonally adjacent to the central pixel are examined in order to recognize the distribution patterns of the molecular markers.
  • Fig. 8 shows a higher order examination of adjacent pixels for the purpose of detecting molecular marker distribution patterns.
  • the pixels adjacent to the central pixel in the first, second, third or nth order are also analyzed, this being the case in the entire general information field (see FIG Microcompartments (see Fig. 5) or focus fields (see Fig. 6) can take place.
  • the molecular neighborhood of T-cell subpopulations in a tissue context can be mapped and analyzed.
  • the signal vectors for each pixel that have been quantitatively evaluated with different search strategies in different subareas of the examined tissue section can now be used for the most diverse biomathematical Evaluation methods are subjected. For example, a monovariate analysis of the signal vectors can be performed. Due to the practically unlimited number of analysable molecular markers when using the method according to the invention, a previously unachievable gain in information, for example in the immunodermahistological diagnosis of cutaneous lymphoma, is possible with the methods known from the prior art.
  • Figure 9 shows the bivariate analysis of the signal vectors for the purpose of quantifying the colocalization of a key molecular marker with each one of the remaining molecular markers analyzed. This makes possible the analysis of the dual-radial relationship of a key molecular marker, a so-called stroke marker, to the remaining molecular markers of a network. It goes without saying that in addition to monovariate and bivariate analysis of the signal vectors, a multivariate analysis can also be carried out as the most complex form of data evaluation. So can be z. For example, the frequency of a particular lymphocyte subpopulation characterized by the positive appearance of two or more molecular markers within the microcompartment of the dermis can be accurately detected.
  • the analysis of the cytoplasmic environment of the nucleus 9 begins in its center by analysis of the pixels adjacent to a central pixel in the first-order first order (see Fig. 7) and then successively in a higher order (see Fig. 8). This is done e.g. until the molecular marker signal corresponding to the cytoplasm 10 breaks off in the signal vectors associated with the individual pixels.
  • the method according to the invention thus allows the analysis of the absolute and relative spatial position of selected cells in relation to one another or to the extracellular matrix.

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Kolokalisation von wenigstens zwei Molekülmarkern in Gewebeschnitten, insbesondere in Haut- und Schleimhautgewebeschnitten. Das erfindungsgemäße Verfahren ist durch folgende Verfahrensschritte gekennzeichnet: Erzeugung eines digitalisierten Bildes des Gewebeschnittes für jeden der wenigstens zwei Molekülmarker zur Darstellung des jeweiligen Molekülmarkers, Überlagerung der digitalisierten Bilder zu einem Summenbild, bildpunktweise Quantisierung des Molekülmarkersignals für jeden der wenigstens zwei Molekülmarker in dem Summenbild, Erzeugung einer Matrix, wobei jedem Bildpunkt ein Vektor zugeordnet wird, dessen Komponenten die quantisierten Molekülmarkersignale der wenigstens zwei Molekülmarker sind und gewebespezifische standardisierte Ausrichtung der Matrix. Ferner betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung der Kolokalisation von wenigstens zwei Molekülmarkern in Gewebeschnitten, insbesondere in Haut- und Schleimhautgewebeschnitten sowie eine Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Description

Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Kolokalisation von Molekülmarkern in Gewebeschnitten
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Kolokalisation von wenigstens zwei Molekülmarkern in Gewebeschnitten, insbesondere in Haut- und Schleimhautgewebeschnitten.
Zur Untersuchung der korrelativen Verteilung und Anordnung verschiedener Molekülspezies in Gewebeschnitten, werden derzeit verschiedene Techniken und Verfahren im Bereich der Biologie, der Biochemie und der Medizin angewandt. Zielsetzung bei der Anwendung solcher Verfahren ist es, aus den so gewonnenen Kenntnissen zur Molekülanordnung und Verteilung diagnostische Daten zu bestimmten Krankheitsbildern zu erhalten oder Erkenntnisse über die Organisation von Zellen oder Zellsystemen auf molekularer Ebene zu gewinnen .
Die aus dem Stand der Technik bekannten und in der Biologie, Biochemie und Medizin standardmäßig eingesetzten Verfahren basieren weitgehend auf manuellen Methoden. Bei diesen wird der zu untersuchende Gewebeschnitt mit einer Lösung versetzt, die ein spezifisches Reagenz, z. B. einen Farbstoff oder einen Antikörper, enthält. Dieses markiert eine zu untersuchende Molekülgruppe dadurch, dass es sich an diese anlagert oder mit ihr beispielsweise unter Bildung eines spezifischen Komplexes reagiert. Im Anschluss wird der die so markierten Molekülgruppen enthaltene Gewebeschnitt durch verschiedene, zumeist optische Methoden untersucht, wobei ein die zu ermittelnde Anordnung und Verteilung der interessierenden Molekülgruppe wiedergebendes Signalverteilungsmuster aufgenommen wird.
Eine bewährte Methode stellt hierbei die
Fluoreszenzmikroskopie dar, bei der die Fluoreszenz von mit einem Fluorophor, beispielsweise Fluorescein-Iso- Thiocyanat oder Phycoerythrin, markierten Molekülen gemessen wird. Dabei wird ein
Fluoreszenzsignalverteilungsmuster aufgenommen, welches die Verteilung und Anordnung des markierten Moleküls in dem mikroskopierten Objekt wiedergibt. Zur Bestimmung der Kolokalisation mehrerer markierter Molekülspezies ist das vorstehend beschriebene Verfahren unter dem Einsatz jeweils unterschiedlicher Fluorophore entsprechend oft zu wiederholen. Die für die unterschiedlichen Molekülspezies jeweils erhaltenen Fluoreszenzsignalverteilungsmuster sind anschließend zur Bestimmung der korrelativen Verteilung der untersuchten Molekülspezies gemeinsam auszuwerten .
Ein Verfahren zur Automatisierung wiederholter Fluoreszenzmarkierung zum Zwecke der Ermittlung der Kolokalisation von Molekülspezies in einer Zell- oder Gewebeprobe ist in der DE 197 09 348 C2 beschrieben. Bei diesem als "automatisches Multi-Epitop-Ligand- Kartierungsverfahren" (MELK) bezeichneten automatisierten Verfahren wird eine Vorrichtung verwendet, die ein Pipettiersystem, ein 3D-Handhabungssystem sowie ein optisches Messsystem umfasst. Durch das automatische Pipettiersystem wird die zu untersuchende Zell- oder Gewebeprobe nach und nach mit unterschiedlichen Inkubationslösungen, die jeweils ein oder mehrere Fluorophor-konjugierte Reagenzien enthalten, versetzt, wobei bei jedem Inkubationszyklus ein Fluoreszenzverteilungsmuster durch ein an ein Fluoreszenzmikroskop angeschlossenes Bildaufnahmegerät, beispielsweise eine CCD-Kamera, aufgenommen wird. Die so erhaltenen Fluoreszenzbilder, deren Anzahl der Anzahl der unterschiedlichen Inkubationslösungen entspricht, können nun computerunterstützt überlagert werden, so dass aus den verschiedenen Einzelmustern ein resultierendes komplexes Kombinationsmuster zur gemeinsamen Darstellung der Verteilung und Anordnung der unterschiedlichen markierten Molekülspezies entsteht. Mit diesem Verfahren ist es folglich möglich, mit vergleichsweise geringem manuell-präparativem Aufwand Aufschluss über die molekulare Anordnung bzw. Verteilung einzelner Molekülspezies in einer Zell- oder Gewebeprobe zu erhalten. Allerdings ist das Verfahren auf rein qualitative Aussagen zur Kolokalisation unterschiedlicher Molekülspezies beschränkt.
Davon ausgehend liegt somit der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren anzugeben, welches auch verlässliche quantitative Aussagen zur Kolokalisation von Molekülmarkern in Gewebeschnitten, insbesondere in Haut- und Schleimhautgewebeschnitten, ermöglicht.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß mit einem Verfahren gelöst, welches durch folgende Verfahrensschritte gekennzeichnet ist:
- Erzeugung eines digitalisierten Bildes des
Gewebeschnittes für jeden der wenigstens zwei Molekülmarker zur Darstellung des jeweiligen Molekülmarkers, — Überlagerung der digitalisierten Bilder zu einem Summenbild,
— bildpunktweise Quantisierung des Molekülmarkersignals für jeden der wenigstens zwei Molekülmarker in dem Summenbild und
— Erzeugung einer Matrix, wobei jedem Bildpunkt ein Vektor zugeordnet wird, dessen Komponenten die quantisierten Molekülmarkersignale der wenigstens zwei Molekülmarker sind.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird zunächst für jeden der wenigstens zwei Molekülmarker ein Bild, welches das Signalverteilungsmuster des jeweiligen Molekülmarkers darstellt, aufgenommen und digitalisiert. Die Bilder können durch unterschiedliche Analyseverfahren erzeugt werden. Als besonders geeignet erweist sich dabei die Fluoreszenzmikroskopie als ein in Biologie und Medizin seit Jahren bewährtes Analyseverfahren. Hierbei werden entsprechend Fluorophore als Molekülmarker eingesetzt, deren Fluoreszenzsignale in einem Fluoreszenzbild dargestellt werden. Zur Erzeugung der digitalisierten Bilder des Gewebeschnittes können jedoch auch andere Analyseverfahren eingesetzt werden, so beispielsweise die Autoradiographie, bei der die digitalisierten Bilder durch Auslesen eines Strahlungsdetektors, welcher die von Isotopen-markierten Molekülen ausgesendete radioaktive Strahlung registriert, oder durch Digitalisierung eines durch die Strahlung entsprechend geschwärzten fotographischen Filmes erzeugt werden. Die digitalisierten Bilder werden sodann erfindungsgemäß zu einem Summenbild überlagert, wobei es besonders auf eine präparatepunkt- bzw. bildpunktgenaue Überlagerung ankommt, um exakte Aussagen über die relativen Positionen der einzelnen Molekülmarker zueinander zu erhalten. Hierzu ist es von Vorteil, neben den einzelnen Bildern zur Darstellung der jeweiligen Molekülmarker in an sich bekannter Weise auch ein Phasenkontrastbild aufzunehmen.
Erfindungsgemäß werden nach erfolgter Bildüberlagerung die Signale für jeden der wenigstens zwei Molekülmarker in dem Summenbild bildpunktweise quantisiert. Dies kann durch unterschiedliche Arten der Codierung erfolgen, beispielsweise durch eine Trinär-Codierung (Basis 3) oder allgemein durch eine Codierung zur Basis einer Zahl n.
Gemäß der Lehre der Erfindung wird abschließend eine Matrix erzeugt, wobei jedem Bildpunkt des Summenbildes ein Vektor zugeordnet wird, dessen Komponenten den quantisierten Molekülmarkersignalen der wenigstens zwei Molekülmarker entsprechen. Hierdurch ist es nunmehr möglich, die in den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren gewonnenen qualitativen Messdaten zur Kolokalisation von Molekülmarkern auch quantitativ präzise auszuwerten. Dies ermöglicht unter anderem eine valide Vergleichbarkeit von Messergebnissen, die beispielsweise an unterschiedlichen Proben gewonnen wurden . Nach einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass der Gewebeschnitt vor der Erzeugung der digitalisierten Bilder anatomisch standardisiert ausgerichtet wird. Im Falle eines Hautgewebeschnittes kann die standardisierte Ausrichtung beispielsweise derart erfolgen, dass die Basalmembranzone (BMZ) des Hautgewebes in jedem der digitalisierten Bilder im wesentlichen horizontal angeordnet ist. Alternativ können auch die digitalisierten Bilder anatomisch standardisiert ausgerichtet werden, so dass eine Ausrichtung des Gewebeschnittes selbst nicht erforderlich ist.
Nach einer weiteren vorteilhaften Lehre der Erfindung werden unmittelbar vor der Überlagerung der Bilder zu einem Summenbild jedes der Bilder hinsichtlich nichtinformativer Inhalte, insbesondere hinsichtlich etwaiger Artefakte, überprüft, mit nichtinformativen Inhalten belegte Bildareale markiert und diese Bildareale aus allen Bildern entfernt. Hierdurch ist gewährleistet, dass die zu einem Summenbild überlagerten digitalisierten Bilder keine die quantitative Analyse der Molekülmarkerkolokalisation verfälschenden Bildinhalte mehr enthalten. Das Entfernen der bei zumindest einem Bild mit nichtinformativen Inhalten belegten Bildareale aus allen digitalisierten Bildern ermöglicht, dass das im Anschluss daran durch Überlagerung erzeugte Summenbild in jedem Bildpunkt verwertbare Informationen zu allen Molekülmarkern enthält. Als Prüfkriterien kommen z.B. die Intaktheit des Gewebeschnitts oder die Kontamination des Gewebeschnitts durch Partikel in Frage. Auch offensichtlich unnatürlich hohe Signalwerte rechtfertigen einen Ausschluss des betreffenden Bildareals. Nach einer weiteren vorteilhaften Lehre der Erfindung werden die jedem Bildpunkt zugeordneten Vektoren auf eine definierte horizontale Breite eines Hautgewebeschnitts normiert. Dies kann durch vektorielle Addition der Signalvektoren der auf der definierten horizontalen Breite des Hautgewebeschnitts nebeneinander angeordneten Bildpunkte erfolgen. Dies trägt der biologischen Situation Rechnung, dass es sich bei der Haut um ein nicht-homogenes, stratifiziertes, sich senkrecht zur BMZ- Linie permanent ausdifferenzierendes epitheliales Gewebe handelt, so dass eine Normierung folglich nur entlang der BMZ-Linie, d. h. in horizontaler Richtung, und nicht senkrecht dazu sinnvoll ist. Die definierte horizontale Breite des Hautgewebeschnitts kann beispielsweise 100 μm betragen .
Die Analytik der für jeden Bildpunkt als Vektor dargestellten quantisierten Molekülmarkersignale kann sich auf den gesamten Gewebeschnitt beziehen, möglich ist jedoch auch, die Kolokalisation bestimmter Molekülmarker, z. B. bestimmter T-Zell-Subpopulationen, toposelektiv in bestimmten Mikrokompartimenten, wie der Epidermis, im Blut- oder Lymphgefäßsystem oder in der Dermis, quantitativ zu bestimmen. Ebenso können die quantitative Bestimmung der Kolokalisation der Molekülmarker in wenigstens einem Fokusfeld des Gewebeschnitts erfolgen. Als Fokusfeld kann ein beliebiges, beispielsweise ein rechteckiges, kreisförmiges oder beliebig mehreckiges Areal, in dem zu untersuchenden Gewebeschnitt festgelegt werden . Aufgrund des hohen Automatisierungspotentials des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es sinnvoll, dieses unter Ausführung eines Computerprogramms auf einer Datenverarbeitungsanlage durchzuführen .
Der Erfindung liegt ferner die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung der Kolokalisation von wenigstens zwei Molekülmarkern in Gewebeschnitten, insbesondere in Haut- und Schleimhautgewebeschnitten, zu schaffen, welche sich aus kommerziell verfügbaren Standardkomponenten zusammensetzt und damit vergleichsweise kostengünstig zu realisieren ist .
Die Aufgabe wird mit einer Vorrichtung gemäß Patentanspruch 15 gelöst.
Vorteilhafterweise ist die Einheit zur Erzeugung digitalisierter Bilder als Fluoreszenzmikroskop ausgebildet und umfasst eine CCD-Kamera.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand einer Ausführungsbeispiele darstellenden Zeichnung näher erläutert, wobei weitere Vorteile der Erfindung deutlich werden. Es zeigen
Fig. 1 einen Hautgewebeschnitt mit eingezeichneter Bezugslinie entlang der Basalmembranzone (BMZ), Fig. 2 eine Anzahl von Fluoreszenzbildern des
Hautgewebeschnitts aus Fig. 1 sowie ein Phasenkontrastbild mit horizontal ausgerichteter BMZ-Linie,
Fig. 3 die Bestimmung eines für alle
Fluoreszenzbilder gültigen Bildareals unter Ausschluss nichtinformativer Bildinhalte,
Fig. 4 die bildpunktweise Quantisierung der
Signalwerte für jeden der verwendeten Molekülmarker,
Fig. 5 die quantitative Analytik in
Mikrokompartimenten des Bildareals aus Fig. 3 in einem aus den Fluoreszenzbildern der Fig. 2 gebildeten Summenbild,
Fig. 6a - d die quantitative Analytik in einzelnen
Fokusfeldern des Bildareals der Fig. 3,
Fig. 7 die Analytik der unmittelbaren
Bildpunktnachbarschaft eines ausgewählten Bildpunktes,
Fig. 8 die Analytik der
Bildpunktnachbarschaft zu einem ausgewählten Bildpunkt in höherer Ordnung, Fig. 9 die graphische Darstellung einer bivariaten Analyse zur quantitativen Bestimmung der Kolokalisation eines Key-Molekülmarkers mit jedem einzelnen der übrigen Molekülmarker und
Fig. 10 der Einsatz des erfindungsgemäßen
Verfahrens zur Zellerkennung und -Charakterisierung .
In Fig. 1 ist das mikroskopische Bild eines Hautgewebeschnittes dargestellt. Erkennbar ist als oberste Schicht die Hornschicht 1 (Stratum corneum) und darunter die Oberhaut 2 (Epidermis) . Ferner erkennbar sind die Basalmembranzone 3 (BMZ), die Lederhaut 4 (Dermis) sowie die Unterhaut 5 (Subcutis) . Im Bereich der Basalmembranzone 3 und der Lederhaut 4 sind verschiedene Blut- und Lymphgefäße 6 im Querschnitt dargestellt.
Zur Vorbereitung der erfindungsgemäß vorgesehenen Erzeugung digitalisierter Bilder des Gewebeschnitts zur Darstellung der jeweils eingesetzten Molekülmarker wird zunächst das mikroskopische Bild des Hautgewebeschnittes in geeigneter Weise anatomisch standardisiert ausgerichtet. Vorzugsweise erfolgt dies derart, dass die Basalmembranzone 3 im Bezugskoordinatensystem des Bildaufnahmegerätes im Wesentlichen horizontal verläuft. Der mittlere Verlauf der Basalmembranzone 3 ist in Fig. 1 als BMZ-Linie bezeichnet.
In Fig. 2 sind nun insgesamt vier digitalisierte Bilder des Hautgewebeschnittes aus Fig. 1 dargestellt, wobei dieser im Rahmen einer Versuchsreihe mit n verschiedenen Molekülmarkern versetzt wurde. Sämtliche Bilder wurden durch Fluoreszenzmikroskopie aufgenommen und zeigen die jeweils als schraffierte Fläche dargestellten Fluoreszenzsignale des jeweils dargestellten Molekülmarkers . In Fig. 2 tragen diese das Bezugszeichen 7. Ferner ist in Fig. 2 ein Phasenkontrastbild des Hautgewebeschnitts dargestellt. Die Aufnahme eines Phasenkontrastbildes erleichtert die präparatepunktgenaue Überlagerung der Fluoreszenzbilder im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens. Wie der Fig. 2 ferner zu entnehmen ist, sind bereits sämtliche Fluoreszenzbilder sowie das Phasenkontrastbild durch horizontale Anordnung der Basalmembranzone anatomisch standardisiert ausgerichtet .
Wie in Fig. 3 dargestellt ist, wird für alle Fluoreszenzbilder (die Fluoreszenzsignale sind der Übersichtlichkeit halber in Fig. 3 nicht dargestellt) sowie das Phasenkontrastbild ein einheitliches Bildareal (generelles Informativfeld) festgelegt. Dazu werden gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens unmittelbar vor der Überlagerung der Fluoreszenzbilder zu einem Summenbild sämtliche Fluoreszenzbilder hinsichtlich nichtinformativer Inhalte, insbesondere Artefakte, überprüft. Im vorliegenden Beispiel ist in dem ersten Fluoreszenzbild ein durch einen unnatürlichen Fluoreszenzsignalwert oder einen Partikel eindeutig feststellbares technisches Artefakt 8 identifiziert. Das mit dem Artefakt 8 belegte Bildareal wird markiert und aus dem durch den oberen Rand des Hautgewebeschnittes und eine im Bereich der Unterhaut dazu parallel gezogene Linie horizontal und durch vertikale Linien seitlich begrenzten Bildareal bei allen Fluoreszenzbildern entfernt. Im Ergebnis wird bei allen Fluoreszenzbildern nur noch das in Fig. 5 dargestellte als generelles Informativfeld bezeichnete Bildareal des Hautgewebeschnittes betrachtet. Fig. 5 stellt gleichzeitig das Summenbild aus den einzelnen Fluoreszenzbildern dar. Hierbei kann bereits auf qualitativer Ebene die Kolokalisation der einzelnen Molekülmarker in dem Gewebeschnitt ermittelt werden.
In Fig. 4 ist nun ein weiterer wesentlicher Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens dargestellt. Nach erfolgter Präparate- bzw. bildpunktweiser Überlagerung der digitalen Fluoreszenzbilder zu einem Summenbild werden die Signale sämtlicher Molekülmarker in dem Summenbild bildpunktweise quantisiert. Im vorliegenden Fall werden sie trinär codiert, d. h. in die drei Kategorien "nicht vorhanden" (Wert 0), "schwach vorhanden" (Wert 1) sowie "stark vorhanden" (Wert 2) eingeteilt. Somit wird erfindungsgemäß für jeden Bildpunkt des Summenbildes ein Vektor, dessen Dimension der Anzahl der untersuchten Molekülmarker und damit der Anzahl der verschiedenen Fluoreszenzbilder entspricht, gebildet und in einer dem Pixelraster der digitalisierten Bilder entsprechenden Matrix angeordnet. Anders ausgedrückt: Die Komponenten der für jeden Bildpunkt des Pixelrasters gebildeten Vektoren entsprechen den quantisierten
Molekülmarkersignalen der n analysierten Molekülmarker. Diese einzelnen Vektoren können auch als molekularer Phänotyp (MOLP) bezeichnet werden. In Fig. 4 wird nun konkret ein 4 x 4-Pixelblock und davon speziell der Bildpunkt P32 (3. Zeile, 2. Spalte) betrachtet. Dieser liefert für den Molekülmarker 1 kein Signal, da das Fluoreszenzsignal X erkennbar nicht hinreichend weit in den 4 x 4-Pixelblock hineinragt. Anders verhält es sich bei dem Molekülmarker 2. Hier wird das schwache Signal Y im Rahmen der Quantisierung durch den Wert 1 repräsentiert. Bei dem Signal Z (Molekülmarker 3) handelt es sich um ein starkes Signal. Entsprechend wird dies mit dem Wert 2 quantisiert. Für den Molekülmarker n wird, wie aus dem entsprechenden Fluoreszenzbild hervorgeht, kein Signal registriert (d.h. quantisierter Wert 0).
Es erweist sich als zweckmäßig, die für jeden Bildpunkt erhaltenen Signalvektoren auf eine definierte horizontale Breite des Hautgewebeschnitts zu normieren. Die Normierung erfolgt bevorzugt durch vektorielle Addition der Signalvektoren nebeneinander angeordneter Bildpunkte auf der definierten horizontalen Breite des Hautgewebeschnitts, die vorliegend zweckmäßigerweise auf 100 μm festgelegt wird. Die Normierung berücksichtigt die biologische Situation, dass es sich bei der Haut um ein sich senkrecht zur BMZ-Linie permanent ausdifferenzierendes epitheliales Gewebe handelt, so dass eine Normierung nur entlang der BMZ-Linie, d. h. in horizontaler Richtung sinnvoll ist. Diese Normierung wird auch als "normalized number of pixels (NORP) with respect to a defined horizontal skin width" bezeichnet.
Gemäß Fig. 5 kann sich die Analytik der quantisierten Molekülmarkersignale auf den gesamten Gewebeschnitt beziehen, möglich ist jedoch auch eine toposelektive Kolokalisation bestimmter Molekülmarker in bestimmten Mikrokompartimenten des Hautgewebeschnittes. Wie in Fig. 5 beispielhaft gezeigt, können dies die Epidermis 2, Blut- oder Lymphgefäße 6 oder auch die Dermis 4 sein.
Wie in den Fig. 6a bis 6d dargestellt, lässt sich die Kolokalisation der analysierten Molekülmarker auch durch Analyse einzelner Fokusfelder des Gewebeschnitts vornehmen. Diese können beliebig geometrisch geformt sein, beispielsweise als Quadrat (Fig. 6a), als Kreise (Fig. 6b) oder auch als beliebige Fläche (Fig. 6d) .
Wie in den Fig. 7 und 8 dargestellt, kann die Kolokalisation der untersuchten Molekülmarker durch unterschiedliche Suchstrategien näher bestimmt werden. Fig. 7 zeigt die Untersuchung der unmittelbaren Bildpunktnachbarschaft zu einem zentralen Bildpunkt (Pixel) . Bei dieser als "pixel-neighbourhood-search" bezeichneten Suchstrategie, werden die acht lateral bzw. diagonal an den zentralen Bildpunkt angrenzenden Nachbarbildpunkte zur Erkennung der Verteilungsmuster der Molekülmarker untersucht.
Fig. 8 zeigt eine in höherer Ordnung durchgeführte Untersuchung benachbarter Bildpunkte zum Zwecke der Erkennung von Molekülmarkerverteilungsmustern . Bei diesem als "closest-pixels-centrifuge" bezeichneten Prinzip werden auch die zum zentralen Bildpunkt in erster, zweiter, dritter oder n-ter Ordnung benachbarten Bildpunkte analysiert, wobei dies im gesamten untersuchten generellen Informativfeld (vgl. Fig. 5) oder in einzelnen Mikrokompartimenten (vgl. Fig. 5) oder Fokusfeldern (vgl. Fig. 6) erfolgen kann. So lässt sich beispielsweise in im Vergleich zum Stand der Technik unerreichter Qualität die molekulare Nachbarschaft von T- Zell-Subpopulationen in einem Gewebekontext abbilden und analysieren .
Die mit verschiedenen Suchstrategien in unterschiedlichen Teilarealen des untersuchten Gewebeschnitts quantitativ ausgewerteten Signalvektoren zu jedem Bildpunkt können nun den unterschiedlichsten biomathematischen Auswertemethoden unterzogen werden. Beispielsweise kann eine monovariate Analyse der Signalvektoren vorgenommen werden. Aufgrund der bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens praktisch unbegrenzten Anzahl analysierbarer Molekülmarker ist ein mit den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren bisher nicht erreichbarer Informationsgewinn, beispielsweise bei der immundermahistologischen Diagnostik kutaner Lymphone möglich .
In Fig. 9 ist die bivariate Analyse der Signalvektoren zum Zwecke der Quantifizierung der Kolokalisation eines Key-Molekülmarkers mit jedem einzelnen der übrigen analysierten Molekülmarker dargestellt. Hierdurch wird die Analyse der dual-radialen Beziehung eines Key- Molekülmarkers, eines sogenannten Hub-Markers, zu den übrigen Molekülmarkern eines Netzwerkes möglich. Es versteht sich, dass neben monovariater und bivariater Analyse der Signalvektoren auch eine multivariate Analyse als komplexeste Form der Datenauswertung durchgeführt werden kann. So lässt sich z. B. die Häufigkeit einer bestimmten Lymphozyten-Subpopulation, welche durch das positive Auftreten von zwei oder mehr Molekülmarkern charakterisiert ist, innerhalb des Mikrokompartiments der Dermis exakt erfassen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung wird abschließend im Zusammenhang mit Fig. 10 erläutert. Aufgrund des Lipidgehaltes der Zellmembranen und bestimmter Fixierschritte, die Lipide aus dem Gewebeschnitt herauslösen, ist eine Zellerkennung in Bezug auf intakte Zellmembranen im Allgemeinen nicht möglich. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren besteht jedoch die Möglichkeit, zellkernbezogen eine automatische Zellerkennung zu erreichen. Ausgangspunkt hierzu ist die Verwendung eines geeigneten Zellkernmarkers, mit dessen Hilfe in einer Eichmessung die Fläche des Zellkerns 9 definiert werden kann. Davon ausgehend ist es unter Einsatz der vorstehend erläuterten Suchstrategie unter Berücksichtigung in erster und höherer Ordnung zu einem zentralen Pixel oder Pixelblock benachbarter Pixel ("dosest pixel-centrifuge"-Prinzip) möglich, die zytoplasmatische Umgebung molekülmarkerbezogen zu analysieren .
Gemäß Fig. 10 beginnt die Analyse der zytoplasmatischen Umgebung des Zellkerns 9 in dessen Zentrum durch Analyse der zu einem zentralen Bildpunkt benachbarten Bildpunkte in zunächst erster Ordnung (vgl. Fig. 7) und dann sukzessive in höherer Ordnung (vgl. Fig. 8) . Dies erfolgt z.B. solange bis in den zu den einzelnen Bildpunkten zugehörigen Signalvektoren das dem Zytoplasma 10 entsprechende Molekülmarkersignal abbricht.
Insgesamt erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren somit die Analyse der absoluten und relativen räumlichen Lage ausgewählter Zellen im Bezug zueinander bzw. auf die extrazelluläre Matrix.

Claims

P A T E N T A N S P R Ü C H E
1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Kolokalisation von wenigstens zwei Molekülmarkern in Gewebeschnitten, insbesondere in Haut- und
Schleimhautgewebeschnitten, g e k e n n z e i c h n e t durch folgende Verfahrensschritte :
- Erzeugung eines digitalisierten Bildes des Gewebeschnittes für jeden der wenigstens zwei Molekülmarker zur Darstellung des jeweiligen Molekülmarkers,
— Überlagerung der digitalisierten Bilder zu einem Summenbild,
- bildpunktweise Quantisierung des Molekülmarkersignals (7, X, Y, Z) für jeden der wenigstens zwei Molekülmarker in dem Summenbild und
— Erzeugung einer Matrix, wobei jedem Bildpunkt ein Vektor zugeordnet wird, dessen Komponenten die quantisierten Molekülmarkersignale (7, X, Y, Z) der wenigstens zwei Molekülmarker sind.
2. Verfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a s s die wenigstens zwei Molekülmarker Fluorophore sind, die mittels Fluoreszenzmikroskopie jeweils in einem Fluoreszenzbild dargestellt werden.
LO/hs 061206WO
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a s s der Gewebeschnitt vor der Erzeugung der digitalisierten Bilder anatomisch standardisiert ausgerichtet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a s s die digitalisierten Bilder anatomisch standardisiert ausgerichtet werden.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a s s der Gewebeschnitt ein Hautgewebeschnitt ist und die Ausrichtung des Gewebeschnitts oder der digitalisierten Bilder derart erfolgt, dass die Basalmembranzone (3, BMZ) des Hautgewebes in jedem der Bilder im wesentlichen horizontal angeordnet ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a s s unmittelbar vor der Überlagerung der Bilder zu einem Summenbild folgende zusätzliche Verfahrensschritte ausgeführt werden:
- Prüfung jedes der Bilder hinsichtlich nichtinformativer Inhalte, insbesondere Artefakte
(8),
- Markierung der mit nichtinformativen Inhalten belegten Bildareale und
- Entfernung der Bildareale aus allen Bildern.
LO/hs 061206WO
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a s s die bildpunktweise Quantisierung des
Molekülmarkersignals (7, X, Y, Z) durch eine Trinär- Codierung oder eine Codierung zur Basis der Zahl n erfolgt .
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und Anspruch 5, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a s s die jedem Bildpunkt zugeordneten Vektoren auf eine definierte horizontale Breite des Hautgewebeschnitts normiert werden.
9. Verfahren nach Anspruch 8, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a s s die Normierung durch vektorielle Addition der Signalvektoren der auf der definierten horizontalen Breite des Hautgewebeschnitts nebeneinander angeordneten Bildpunkte erfolgt.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a s s die definierte horizontale Breite des Hautgewebeschnitts 100 μm beträgt.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a s s die quantitative Bestimmung der Kolokalisation der wenigstens zwei Molekülmarker in wenigstens einem Mikrokompartiment des Gewebeschnitts erfolgt.
LO/hs 061206WO
12. Verfahren nach Anspruch 11, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a s s der Gewebeschnitt ein Hautgewebeschnitt ist und die quantitative Bestimmung der Kolokalisation der wenigstens zwei Molekülmarker in der Epidermis (2), im Blut- oder Lymphgefäßsystem (6) oder in der Dermis (4) erfolgt.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a s s die quantitative Bestimmung der Kolokalisation der wenigstens zwei Molekülmarker in wenigstens einem Fokusfeld des Gewebeschnitts erfolgt.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a s s das Verfahren unter Ausführung eines
Computerprogramms auf einer Datenverarbeitungsanlage durchgeführt wird.
15. Computerprogramm zur quantitativen Bestimmung der Kolokalisation von wenigstens zwei Molekülmarkern in Gewebeschnitten, insbesondere in Haut- und Schleimhautgewebeschnitten, dessen Ausführung wenigstens einen Prozessor veranlasst, ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13 auszuführen.
16. Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung der Kolokalisation von wenigstens zwei Molekülmarkern in Gewebeschnitten, insbesondere in Haut- und Schleimhautgewebeschnitten, umfassend eine Einheit zur Erzeugung digitalisierter Bilder des Gewebeschnittes zur Darstellung des jeweiligen
LO/hs 061206WO Molekülmarkers und eine Datenverarbeitungsanlage, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a s s die Vorrichtung zur Ausführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 13 eingerichtet ist.
17. Vorrichtung nach Anspruch 16, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a s s die Einheit zur Erzeugung digitalisierter Bilder als Fluoreszenzmikroskop ausgebildet ist.
18. Vorrichtung nach Anspruch 17, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a s s das Fluoreszenzmikroskop eine CCD-Kamera umfasst.
19. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Zellerkennung in Gewebeschnitten, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a s s wenigstens einer der wenigstens zwei Molekülmarker ein Zellkernmarker ist.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8929625B2 (en) 2009-05-28 2015-01-06 Koninklijke Philips N.V. Method and device for side-effect prognosis and monitoring
CN104165873A (zh) * 2014-07-22 2014-11-26 中国科学院植物研究所 一种检测活体植物细胞中两种膜蛋白共定位程度的方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19709348C2 (de) * 1996-05-29 1999-07-01 Schubert Walter Dr Md Automatisches Multi-Epitop-Ligand-Kartierungsverfahren
US6294331B1 (en) * 1997-08-08 2001-09-25 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Methods for assessing genetic and phenotypic markers by simultaneous multicolor visualization of chromogenic dyes using brightfield microscopy and spectral imaging
JP2002529704A (ja) * 1998-10-29 2002-09-10 セル ワークス インコーポレイテッド 単一細胞の複数マーカー特徴付け
US6678398B2 (en) * 2000-09-18 2004-01-13 Sti Medical Systems, Inc. Dual mode real-time screening and rapid full-area, selective-spectral, remote imaging and analysis device and process
AU2002307054A1 (en) * 2001-03-30 2002-10-15 Didier Adehl Detection of abnormal cells
US7872235B2 (en) * 2005-01-13 2011-01-18 Spectrum Dynamics Llc Multi-dimensional image reconstruction and analysis for expert-system diagnosis

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO2008025662A3 *

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