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Die Erfindung betrifft ein Referenzpräparat für eine Untersuchungsmethode unter Verwendung eines bildgebenden Erfassungs- und Auswertungsverfahrens. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Referenzpräparats sowie dessen Verwendung.
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In der wissenschaftlichen, klinischen wie auch toxikologisch regulatorischen Untersuchung biologischer Effekte und Veränderungen stellt die Auswertung von Präparaten mittels bildgebender Erfassungs- und Auswertungsverfahren mittlerweile eine Standard-Methode dar.
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Unter bildgebenden Erfassungs- und Auswertungsverfahren werden hierbei alle apparativen Verfahren verstanden, mit denen diese biologischen Effekte und Veränderungen visualisiert werden.
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Der Begriff Präparat bezeichnet eine entnommene biologische Probe, die für die Bilderfassung und -auswertung vorbereitet worden ist. Typischerweise wird eine biologische Probe durch Färben der Probe präpariert.
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Bildgebende Erfassungs- und Auswertungsverfahren finden beispielsweise Anwendung bei klinisch-diagnostischen Verfahren, histologischen Verfahren, im High Content Screening, auch als High Content Analyse bezeichnet, Toxizitätsuntersuchungen, Immuno- oder Genotoxizitätsassays. Bei den letztgenannten sind insbesondere der COMET-Assay, die Mikrokern-Untersuchung, auch als Mikrokerntest bezeichnet, und die Untersuchung von Chromosomenaberrationen, auch als Chromosomenaberrationstest bezeichnet, von Bedeutung. Im Zuge von Zulassungsverfahren insbesondere von Chemikalien kommen üblicherweise diese dem Fachmann bekannten Tests zur Charakterisierung der genotoxikologischen Eigenschaften zum Einsatz.
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In der klinischen Diagnostik, beispielsweise der Hämatologie, werden Bildanalyse-Verfahren eingesetzt, die eine Auswertung von nativen Blutausstrichen zur Darstellung des Differentialblutbildes gestatten. Hierbei werden die Blutzellen in dem Präparat lokalisiert und aufgrund ihrer unterschiedlichen morphologischen Eigenschaften oder Anfärbbarkeiten in die klinisch relevanten Unterklassen klassifiziert.
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Das High Content Screening ist eine hoch leistungsfähige Methode der pharmazeutischen Produktentwicklung und der Toxikologie, mit der unter Einsatz mikroskopischer Techniken und Bildanalyse-Verfahren mit optimiertem Automatisierungsgrad eine hohe Informationsdichte über die Wirkung von Substanzen erzeugt werden kann.
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Gemeinsam ist den vorgenannten Methoden, dass auf verschiedenste Art und Weise Präparate erzeugt werden, die im weiteren Verlauf der Untersuchung bildlich, vorzugsweise mittels eines Mikroskops, erfasst und durch eine Bildauswertung beurteilt werden. Diese Bildauswertung kann im einfachsten Fall durch direkte visuelle Beurteilung des Bildes durch einen Bearbeiter geschehen oder durch ein mehr oder weniger automatisiertes Verfahren, insbesondere unter Einsatz von computergestützten Systemen.
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In jedem Fall wird das Vorhandensein von verschieden Farben, Farbintensitäten, geometrischen Formen und deren Größe, die räumliche Nähe verschiedener Strukturen oder dergleichen in Abhängigkeit von der spezifischen Methode herangezogen, um eine qualitative, semi-quantitative oder quantitative Auswertung des Präparates zu erhalten.
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Als Referenzpräparat für die Auswertung in bildgebenden Erfassungs- und Auswertungsverfahren werden zumeist Positiv- und Negativproben in der jeweiligen aktuellen Untersuchung mitgeführt. Üblich ist auch die Verwendung von computergestützt gespeicherten Bildern bestimmter Präparate, um die Integrität der individuell durchgeführten Untersuchung zu sichern.
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Nachteilig daran ist, dass für jede Einzeluntersuchung ein neues Referenzpräparat hergestellt werden muss. Da die Eigenschaften des zu erwartenden Referenzpräparats stark von den biologischen Eigenschaften der entnommenen biologischen Probe abhängen und daher erheblichen Variationen ausgesetzt sind, ist das Referenzpräparat nachteilig nicht reproduzierbar herstellbar.
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Insbesondere ist so eine Vergleichbarkeit als Maß der Übereinstimmung zwischen Ergebnissen von Auswertungen derselben Probe mit unterschiedlichen Apparaten, durch unterschiedliche Personen, an unterschiedlichen Orten und zu unterschiedlichen Zeitpunkten nicht zwingend gegeben.
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Die zu erwartenden Varianzen in der Durchführung der individuellen Untersuchung, in der das jeweilige Referenzpräparat hergestellt wird, wirken sich ebenfalls nachteilig aus und resultieren darin, dass ein derartiges Referenzpräparat nicht in wünschenswerter Weise reproduzierbar herstellbar ist.
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Die Langlebigkeit derartiger Referenzpräparate ist zudem stark von der verwendeten Methode abhängig. So zeigen insbesondere fluoreszierende Referenzpräparate aufgrund des typischen Ausbleichverhaltens der enthaltenen Fluoreszenzfarbstoffe keine Langlebigkeit. Die Wiederholbarkeit der Auswertung ist somit nur sehr eingeschränkt gegeben.
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In den behördlichen GxP-Richtlinien (Good x Practice mit x = Laborstory, Clinical, Manufacturing, also GLP, GCP, GMP) wird weiterhin gefordert, dass auch die Methoden unter Verwendung bildgebender Erfassungs- und Auswertungsverfahren unter Einbeziehung aller methodischen Verfahrenskomponenten zu validieren und die hierbei verwendeten Apparate zu qualifizieren sind.
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Daher löst auch die Verwendung computertechnisch abgespeicherter Bilder bestimmter Präparate dieses Problem nicht, da hier zwar die Forderungen nach der Langlebigkeit und Wiederholbarkeit der Bildauswertung erfüllt sind, die Verfahrenskomponente der Bilderfassung aber nicht berücksichtigt wird.
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DE 24 34 246 B2 offenbart ein Verfahren zur Erkennung und Deutung von Objekten, bei welchem ein mikroskopisch erzeugtes Objektbild einer realen Probe mit einem Vergleichsbild, nämlich einem künstlichen Bild, verglichen wird. Das in
DE 24 34 246 B2 offenbarte Vergleichsbild ist hierbei eine Mikro-Photographie.
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US 3 580 682 A befasst sich mit einem Vergleichsbild zur Bestimmung der Rauhigkeit von metallischen Schnittflächen. Diese Vergleichsbilder liegen als Diapositive in einem Rahmen vor.
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US 2006/0115429 A1 betrifft eine biologische Systemanalyse, bei der eine Vielzahl biochemischer Daten aus Blut und Urin erfasst und bestimmten biologischen Zuständen, z. B. Krankheiten, zugeordnet werden. Die gesammelten und einen bestimmten biologischen Zustand, z. B. eine bestimmte Krankheit, kennzeichnenden Daten können in Form eines informativen Musters visualisiert werden und bilden dann eine Art Vergleichsbild, das zur Bestimmung eines unbekannten biologischen Zustands und dessen Visualisierung aus entsprechend gesammelten Daten, so genannte molekulare System-Bilder, herangezogen werden kann.
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Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Referenzpräparat für eine Untersuchungsmethode unter Verwendung eines bildgebenden Erfassungs- und Auswertungsverfahrens bereitzustellen, welches langlebig ist, eine unbegrenzt wiederholbare Auswertbarkeit und Herstellbarkeit in identischer und in vorgegebener Weise ermöglicht sowie eindeutig interpretierbar ist.
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Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Referenzpräparat gelöst, welches einen Träger umfasst, auf dem das Bild eines biologischen Präparats aufgebracht ist.
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Auf dem Träger ist erfindungsgemäß also nicht das reale biologische Präparat, sondern nur das Bild eines biologischen Präparats, quasi ein künstliches Präparat aufgebracht.
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Eines solches Bild eines biologischen Präparats zeichnet sich gegenüber einem realen biologischen Präparat durch
- – Langlebigkeit
- – unbegrenzt wiederholbare Auswertbarkeit
- – unbegrenzt wiederholbare Herstellbarkeit
aus.
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Da es sich bei dem auf dem Träger aufgebrachten Bild eines biologischen Präparats erfindungsgemäß um ein Referenzpräparat handelt, ist das abgebildete biologische Präparat eindeutig definiert und eindeutig interpretierbar.
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Ein Referenz-Präparat repräsentiert im Rahmen der Erfindung vorzugsweise einen Vergleichswert, der die Kalibrierung der Ergebnisse einer quantitativen oder semi-quantitativen Methode zulässt.
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Erfindungsgemäß werden also Referenzpräparate bereitgestellt, die eine vollständige Validierung von bildgebenden Auswertungsverfahren unter Einschluss der Bilderfassung erlauben und damit eine langfristige und wiederholbare Abstimmung auch unterschiedlicher Geräte-Systeme zur Bilderfassung und -auswertung möglich machen.
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Gerade im Hinblick auf die Entwicklung harmonisierter Methoden und Referenzpräparate zur Gestaltung und Umsetzung international verbindlicher Guidelines und Vorschriften beispielsweise in den Bereichen der in-vitro-Toxikologie, der klinischen Diagnostik und Pharmaforschung, auch angesichts der europäischen Chemikalienpolitik, insbesondere im Hinblick auf die europäische REACH(Registration, Evaluation and Authorisation of Chemicals)-Verordnung, ist die Bereitstellung erfindungsgemäßer Referenzpräparate ein erheblicher Fortschritt.
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Eine Weiterbildung der Vorrichtung sieht vor, dass das Bild vor dem Aufbringen auf den Träger bearbeitet worden ist. Vorzugsweise ist das Bild digital bearbeitet worden.
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Bei der digitalen Bildbearbeitung handelt es sich um die computergestützte Bearbeitung von digitalen Bildern. Bei den zu bearbeitenden Bildern handelt es sich vorzugsweise um solche, die mittels eines bildgebenden Verfahrens von realen biologischen Präparaten erfasst worden sind. Vorzugsweise handelt es sich um digitale Fotos. Somit kann von Bildern ausgegangen werden, die aus der Untersuchung realer biologischer Proben stammen.
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Diese Bilder werden nachträglich verändert, um sie zu optimieren, zu modifizieren oder zu manipulieren, mit dem Ziel, ein gewünschtes Ergebnis zu erreichen.
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Das gewünschte Ergebnis ist das Bild eines biologischen Präparats, welches eindeutig interpretierbar und auswertbar ist, und, aufgebracht auf einen Träger, das Referenzpräparat bildet. Die Bearbeitung des Bildes kann mithin beispielsweise auch darauf zielen, die Anzahl der darauf abgebildeten einzelnen Objekte, insbesondere der einzelnen Zellen, deren untersuchte Merkmale individuell stärker oder weniger stark ausgeprägt sind, in ihrer Zusammensetzung so zu verändern, dass bei der Auswertung mittels bildanalytischer Methoden ein eindeutiges Ergebnis ermittelt werden kann. Dieses eindeutige Ergebnis kann im biologischen Ausgangspräparat durch die normale statistische Variationsbreite der Zellen üblicherweise nicht erreicht werden, wodurch dort eine exakte und vollständige Validierung und erst recht eine quantitative Kalibrierung der gesamten Methode ausgeschlossen wird.
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Durch die digitale Bildbearbeitung können so verschiedenste Präparat-Situationen, also verschiedenste Präparat-Zustände, bildlich dargestellt werden.
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Jedes so erzeugte und gegebenenfalls bearbeitete Bild eines biologischen Präparats bildet quasi eine Vorlage, die reproduzierbar, also in identischer Form, auf einen Träger aufgebracht werden kann.
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Somit sind erstmalig alle in der Praxis denkbaren Präparat-Situationen unter Einschluss aller methodischen Verfahrenskomponenten, beispielsweise Bildakquisition, Bildspeicherung und -verarbeitung, Auswertung, Generierung der Ergebnisse, simulier- und testbar, und es können erfindungsgemäß Referenzpräparate für alle denkbaren Präparat-Situationen hergestellt werden.
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Eine Weiterbildung des Referenzpräparats sieht vor, dass das Bild farbig ist.
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Vorzugsweise besteht das Bild aus Pigmenten, wobei die Pigmente derart gewählt sind, dass das auf dem Träger aufgebrachte Bild hinsichtlich seiner Färbung einem realen biologischen Präparat, welches aus einer entnommenen biologischen Probe gemäß einer vorgegebenen Probenvorbereitung erhalten wird, entspricht.
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Eine vorteilhafte Ausgestaltung sieht vor, dass die Farbpigmente Quantendots und/oder Fluoreszenzfarbstoffe umfassen.
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Geeignete Quantendots sind vorzugsweise solche aus Halbleitermaterialien, insbesondere aus Cadmium-Selen (CdSe) oder Zink-Schwefel (ZnS), in verschiedenen Größen, die vorzugsweise an die gewünschten Fluoreszenzeigenschaften anpassbar sind.
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Geeignete organische Fluoreszenz-Farbstoffe mit biologischer Relevanz sind vorzugsweise Alexa-Fluor-, BCECF-, BODIPY-, Calcein-, SNARF-, Cy2-, Cy5-, DCF-, Fluorescein-, FURA-, SYBR-Farbstoffe.
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Referenzpräparate, die Quantendots als Farbpigmente aufweisen, sind hinsichtlich ihrer fluoreszierenden Eigenschaften äußerst langlebig.
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Dies ist bei fluoreszenzbasierten bildgebenden Erfassungs- und Auswertungsverfahren, insbesondere mittels eines Fluoreszenzmikroskops, von Bedeutung.
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Vorzugsweise ist das Bild des biologischen Präparats drucktechnisch auf dem Träger aufgebracht. Druckverfahren eignen sich besonders gut, um das Bild des biologischen Präparats, also die Vorlage, weitestgehend identisch und reproduzierbar auf den Träger zu übertragen.
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Eine Weiterbildung des Referenzpräparats sieht vor, dass der aus optisch durchlässigem Material hergestellte Träger, vorzugsweise aus Glas, besonders bevorzugt aus Quarzglas, oder aus Kunststoff, besonders bevorzugt aus PMMA und/oder aus Polycarbonat, besteht. Es handelt sich um einen Träger, der dem standardmäßigen Träger in der Durchführung der Untersuchung mit Probenmaterial entspricht. Dies kann im Falle der Anwendung in der Histologie beispielsweise ein üblicher Objektträger sein, im Falle von High Content Screening eine Multiwell-Platte, vorzugsweise mit 96, 384 oder mehr Vertiefungen, oder auch ein in Form und Funktion speziell für die Methode entwickelter und hergestellter Träger.
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Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Referenzpräparats für eine Methode unter Verwendung eines bildgebenden Erfassungs- und Auswertungsverfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Bild eines biologischen Präparats reproduzierbar auf einen Träger aufgebracht wird.
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Vorzugsweise wird das Bild eines biologischen Präparats vor dem Aufbringen auf den Träger mittels eines bildgebenden Erfassungs- und Auswertungsverfahrens erfasst. Das Bild wird erfindungsgemäß also von einem realen biologischen Präparat aufgenommen.
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Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens wird das Bild dann durch drucktechnische Verfahren, vorzugsweise durch Spotten, durch Offsetdruck und/oder durch Walzen oder durch moderne Druckverfahren wie z. B. der Ink-Jet Technologie, Functional Printing, Photolithographie-, Nanolithographie- oder Soft Lithographie-Verfahren, durch Micro Contact Printing (μCP) oder andere Belichtungstechniken oder durch die Mascless Mesoscale Material Deposition (M3D) Technik, und/oder unter Umständen unter Einschluss einer Behandlung oder Nachbehandlung unter Nutzung der Laser-Technologie auf dem Träger aufgebracht wird.
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Eine vorteilhafte Ausgestaltung des Verfahrens sieht vor, dass das Bild der biologischen Probe durch Abtrag oder durch strukturelle Veränderung der Oberfläche des Trägers, vorzugsweise durch Fräsen oder Ätzen, auf dem Träger entsteht.
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Eine Weiterbildung des Verfahrens sieht vor, dass das Bild vor dem Aufbringen auf den Träger, wie oben bereits ausgeführt, digital bearbeitet wird.
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Die Erfindung betrifft schließlich noch die Verwendung eines Referenzpräparats nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Entwicklung, Validierung und/oder Harmonisierung von Methoden zur Auswertung mikroskopischer Präparate unter Nutzung eines bildgebenden Erfassungs- und Auswertungsverfahrens.
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Die erfindungsgemäßen Referenzpräparate stehen hierbei für ein eindeutig benennbares Ergebnis, das durch das bildgebende Erfassungs- und Auswertungsverfahren eines Assays erhalten wird.
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Durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Referenzpräparate können Definitionen und Regeln gefunden und überprüft werden, nach denen die methodische Auswertung solcher Präparate mittels bildgebender Erfassungs- und Auswertungsverfahren durchgeführt werden kann.
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Dies gilt sowohl für die automatisierte als auch für die manuelle visuelle Auswertung.
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Wie bereits ausgeführt, sind die erfindungsgemäßen Referenzpräparate reproduzierbar herstellbar und erlauben so eine vollständige Validierung von bildgebenden Auswertungsverfahren unter Einschluss der Bilderfassung.
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Dadurch wird eine langfristige und wiederholbare Abstimmung auch unterschiedlicher Apparate-Systeme zur Bilderfassung und -auswertung möglich gemacht.
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Die erfindungsgemäße Verwendung ermöglicht somit
- • die Entwicklung von Methoden zur Bildauswertung und die Weiterentwicklung von spezifischen Assays, insbesondere auch die Entwicklung automatisierter Methoden, beispielsweise mittels digitaler Bilderfassung und computergestützter Auswertung
- • die Optimierung von Methoden
- • die Validierung von Methoden, insbesondere im Rahmen der eingangs genannten GxP-Richtlinien,
- • die Qualitätssicherung, auch ohne Zugrundelegung von GxP-Richtlinien
- • die Harmonisierung von Methoden, insbesondere in Form von Ringstudien unter Beteiligung mehrerer Forschungseinrichtungen
- • die Definition von Richtlinien für die Durchführung derartiger Methoden
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Nachfolgend wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Referenzpräparats und dessen erfindungsgemäße Verwendung anhand eines Ausführungsbeispiels demonstriert, das in der Zeichnung dargestellt ist. In dieser zeigt die einzige 1 ein entsprechendes Ablaufschema für die Herstellung eines Referenzpräparats.
