METODO PARA SECUENCIAR DN POLI UCLEOTIDO Campo de la Invención Esta invención se relaciona a un método para determinar la secuencia de un polinucleótido. Antecedentes de la Invención La habilidad para determinar la secuencia de un polinucleótido es de gran importancia científica, como es mostrado por el Proyecto del Genoma Humano en el mapeo de los tres billones de bases de DNA codificadas en el genoma humano . El método de origen en uso general para la. secuenciación de DNA a gran escala es el método de terminación de cadena. Este método primero fue desarrollado por Sanger y Coulson (Sanger y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1977; 74:5463-5467), y depende del uso de derivados de didesoxi de los cuatro trifosfatos de nucleósido que son incorporados en la cadena de polinucleótido naciente en una reacción de polimerasa . En la incorporación, los derivados de didesoxi terminan la reacción de polimerasa y los productos luego son separados mediante la electroforesis de gel y analizados para revelar la posición en la cual el derivado de didesoxi partxcular se incorporó en la cadena. Aunque este método es ampliamente utilizado y produce resultados confiables, se reconoce que es lento, de trabajo intensivo y costoso.
Las marcas o etiquetas fluorescentes se han utilizado para identificar la incorporación de nucleótido sobre una molécula de DNA naciente en crecimiento, utilizando la reacción de polimerasa (ver WO 91/06678) . Sin embargo, estas técnicas tienen la desventaja de incrementar la interferencia de fondo de los fluoróforos. Conforme la molécula de DNA crece, el "ruido" de fondo se incrementa y el tiempo requerido para detectar cada incorporación de nucleótido necesita ser incrementado. Esto restringe severamente el uso del método para secuenciar polinucleótidos grandes . La limitación más seria de la construcción de sistemas para secuenciar un polinucleótido alrededor de tintes fluorescentes, sin embargo, es el problema del fotoblanqueo . El fotoblanqueo es un fenómeno bien documentado en los sistemas de tinte fluorescente y resulta de la exposición del tinte a las longitudes de onda de excitación. Todos los sistemas de tinte tienen una habilidad para absorber un número limitado de fotones antes de que ocurra el fotoblanqueo. Una vez que el fotoblanqueo ha ocurrido, el tinte fluorescente no es visible por más tiempo al observador y por consiguiente, si es conjugado a una molécula, este no será detectable Por lo tanto, existe una necesidad por un método mejorado para determinar la secuencia de un polinucleótido, que incremente significativamente la proporción y el tamaño del fragmento del polinucleótido que es secuenciado y que de preferencia no dependa de los nucleótidos fluorescentemente marcados para la detección. Además, el método debe ser capaz de ser llevado a cabo por un proceso automatizado, reduciendo la complejidad y el costo asociados con los métodos existentes. Breve Descripción de la Invención La presente invención está basada en la comprensión de que un cambio de distribución conformacional y/o de masa y/o de energía en una enzima que procesa un polinucleótido, . que ocurre cuando una enzima se asocia con, se mueve a lo largo de un polinucleótido objetivo, puede ser detectado utilizando la formación de imagen óptica no lineal, incluyéndose aquella basada en la generación de la segunda o tercera armónica. De acuerdo con la presente invención, un método para secuenciar un polinucleótido comprende los pasos de: (i) poner en contacto una enzima que procesa un polinucleótido, inmovilizada en una posición fija, con un polinucleótido objetivo bajo condiciones suficientes para la actividad de la enzima y (ii) detectar un efecto consecuente sobre la interacción de la enzima y el polinucleótido, en donde el efecto es detectado por la medición de una señal óptica no lineal o una señal lineal acoplada a una señal no lineal. Numerosas ventajas son obtenidas con la presente invención. La secuenciación puede ser llevada a cabo con cantidades pequeñas de polinucleótido, con la capacidad de secuenciar moléculas de polinucleótido individuales, eliminando de esta manera la necesidad por amplificación antes de la iniciación de la secuenciación. Las longitudes de lectura de secuencia larga pueden ser obtenidas y minimizadas las consideraciones de estructura secundaria. La obtención de longitudes de lectura larga elimina la necesidad para el reensamble de fragmento extensivo utilizando computación. -Además, como la invención no es dependiente de la necesidad por nucleótidos fluorescentemente marcados o cualquier medición de fluorescencia, la limitación de la longitud de lectura al nivel de molécula individual como una función del fotoblanqueo u otros efectos de fluorescencia impredecibles , es evitada. La presente invención también permite que fragmentos de polinucleótido largos sean leidos secuencialmente por el mismo sistema de enzima. Esto tiene el beneficio de permitir que un sistema de enzima individual sea utilizado, el cual puede ser regenerado y reutilizado permitiendo que muchos patrones de polinucleótidos diferentes sean secuenciados . Finalmente, la utilización de la Generación de la Segunda o Tercera Armónica ofrece ventajas debido a la carencia de fotodaño y fotoblanqueo . Esto es debido al hecho de que no ocurre fotoquímica, aun en el plano focal debido a que la señal, estimulada por la radiación no resonante, no involucra un estado excitado con una duración de vida finita. De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, un material de soporte sólido comprende por lo menos una polimerasa y por lo menos una molécula dipolar posicionada sobre, o próxima a la polimerasa. De acuerdo con un tercer aspecto de la invención, una estructura de sistema de formación de imagen para detectar una señal óptica no lineal, comprende - un soporte sólido que tiene inmovilizado sobre el mismo una enzima que interactúa como un polinucleótido y una molécula dipolar posicionada sobre, o próxima a la enzima . Descripción _de los Dibujos La invención es descrita con referencia a las figuras acompañantes, en donde: La Figura 1 es una ilustración esquemática de un sistema de formación de imagen que utiliza generación de segunda armónica y La Figura 2 muestra la señal de segunda armónica generada por una polimerasa en la incorporación de un polinucleótido especifico.
Descripción Detallada de la Invención La presente invención hace uso de mediciones óptimas no lineales convencionales para identificar un cambio de distribución conformacional y/o de masa y/o de energía que ocurre conforme un enzima que procesa un polinucleótido interactúa con las bases individuales sobre un polinucleótido objetivo o incorpora nucleótidos sobre una molécula de polinucleótido naciente. El uso de métodos ópticos no lineales para la formación de imagen de moléculas es conocido. Lo que no se ha apreciado es que estos métodos se pueden aplicar a la secuencíación de un polinucleótido, haciendo uso de una enzima inmovilizada o fija. En una modalidad separada, se genera una señal lineal además de una señal no lineal y se detecta la señal lineal. Las dos señales se dice que son acopladas, dando por resultado la detección mejorada. El término "polinucleótido" como se utiliza en la presente se va a interpretar ampliamente, e incluye DNA y RNA incluyéndose DNA y RNA modificados, híbridos de DNA/RNA, así como otras moléculas similares al ácido nucleico hibridantes, por ejemplo ácido nucleico de péptido (PNA) . El término "enzima que procesa un polinucleótido" como se utiliza en la presente, se va a interpretar ampliamente y se refiere a cualquier enzima que interactúa con un polinucleótido y se mueve continuamente a lo largo del polinucleótido . La enzima es de preferencia una enzima de polimerasa/ y puede ser de cualquier tipo conocido. Por ejemplo, la polimerasa puede ser cualquier polimerasa de DNA dependiente de DNA. Si el polinucleótido objetivo es una molécula de RNA, entonces la polimerasa puede ser una polimerasa de DNA dependiente de RNA, es decir, transcriptasa inversa, o una polimerasa de RNA dependiente de RNA, es decir replicasa de RNA. En una modalidad preferida de la invención, la polimerasa es polimerasa T4. En modalidades preferidas adicionales de la invención, la polimerasa es ya sea holoenzima de polimerasa III de E. colí (McHenry, Ann. " Rev. Biochem., 1988; 57:519); polimerasa T7 (Schwager y colaboradores, Methods in Molecular and Cellular Biology, 1989/90; 1(4): 155-159) o polimerasa de gen 5 de bacteriófago T7 formada en complejo con Tioredoxina de E. colí (Tabor y colaboradores, J. Biol. Chem. , 1987; 262; 1612-1623) . Cada una de estas enzimas de polimerasa se enlaza a un polinucleótido efectivo con alta procesabilidad (y fidelidad) y por lo tanto mantiene un complejo de polimerasa-polinucleótido, aun cuando la polimerización no está activamente tomando lugar . Las enzimas alternativas que interactúan con un polinucleótido incluyen las enzimas helicasa, primasa, holoenzima, topoisomerasa o girasa. Tales enzimas ofrecen ventajas adicionales. Por ejemplo, la utilización de una helicasa reduce el problema de estructuras secundarias que existen dentro de las moléculas de polinucleótido, ya que las helicasas encuentran y extienden estas estructuras dentro de su medio ambiente natural. En segundo lugar, las helicasas permiten que las reacciones necesarias sean llevadas a cabo en el DNA de doble hebra a temperatura ambiente. Conforme la enzima interactúa con bases sucesivas sobre el polinucleótido, su conformación cambiará dependiendo de que base (o nucleótido) sobre el objetivo es llevado en contacto. Asi, el orden temporal de las adiciones de pares, bases durante la reacción es medida en una molécula individual de ácido nucleico, es decir, la actividad del sistema de enzima sobre el polinucleótido patrón a ser secuenciado puede ser seguida en tiempo real. La secuencia es deducida al identificar que base (nucleótido) esta siendo incorporado en la hebra complementaria en crecimiento del polinucleótido objetivo vía la actividad catalítica de la en2ima. Un aspecto importante de la presente invención es la inmovilización de la enzima en una posición fija con relación al sistema de formación de imagen. Esto de preferencia es llevado a cabo al inmovilizar la enzima a un soporte sólido, con la enzima que retiene su actividad biológica. Los métodos para la inmovilización de enzimas adecuadas a un soporte sólido son conocidos. Por ejemplo, WO-A-99/05315 describe la inmovilización de una enzima de polimerasa a un soporte sólido. Los métodos generales para inmovilizar proteínas a soportes son adecuados . Los métodos de detección ópticos utilizados en la presente invención se proponen para formar en imagen al nivel de molécula individual, es decir, generar una imagen/señal distinta para una enzima. Una pluralidad de enzimas pueden ser inmovilizadas sobre un soporte sólido a una densidad que permite la resolución de enzima individual. Por lo tanto, en una modalidad, existen múltiples enzimas inmovilizadas en un soporte sólido, y el método de la invención puede ser llevada a cabo en éstas simultáneamente. Esto permite que diferentes moléculas de polinucleótido sean secuenciadas conjuntamente. Será evidente para la persona experta llevar a cabo el método de formación de imagen bajo condiciones adecuadas para promover la actividad enzimica. Por ejemplo, con respecto a una enzima de polimerasa, será evidente que se requieren los otros componentes necesarios para que proceda la reacción de polimerasa. En esta modalidad, una molécula cebadora de polinucleótido y cada uno de los trifosfatos de nucleósido dATP, dTTP, dCTP y dGTP, serán requeridos. Los trifosfatos de nucleósido pueden ser adicionados secuencialmente, con la remoción de los nucleótidos no enlazados antes de la introducción del siguiente trifosfato de nucleósido. Alternativamente, todos los trifosfatos pueden están presentes al mismo tiempo. Puede ser preferible utilizar trifosfatos que tienen uno o más grupos de bloqueo que pueden ser removidos selectivamente mediante la luz monocromática pulsada, para prevenir de esta manera la incorporación no controlada. Los trifosfatos bloqueados adecuados son descritos en WO-A-99/05315. Los sistemas de formación de imagen ópticos no lineales de alta resolución son conocidos en la técnica. En general, la polarización no lineal de un material puede ser expresada como: P = Xtl,E1 + XÍ2)E2 + X(3)E3 + donde P es la polarización inducida, Xtrj> es el nav orden de susceptibilidad no lineal y E es el vector de campo eléctrico. El primer término describe la absorción normal y la reflexión de la luz; el segundo describe la generación de segunda armónica (SHG) , la suma y la diferencia de la generación de frecuencia; y el tercero describe la dispersión de luz, los procesos de Raman estimulados, la generación de tercera armónica (TGH) , y la absorción tanto de dos fotones como de tres fotones. Un sistema de formación de imagen preferido de la presente invención depende de la detección de la señal que surge de la generación de la segunda o tercera armónica. La resolución de una molécula individual utilizando la generación de la segunda . o tercera armónica (posteriormente referido como SHG) es conocida en la técnica (Peleg y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1999; 95:6700-6704 y Peleg y colaboradores, Bioimaging, 1996; 4:215-224) . La estructura general del sistema de formación de imagen puede ser como es descrito en Peleg y colaboradores, 1996, supra, y como es mostrado en la Figura 1. Con referencia a la Figura 1, un láser (1) es utilizado como la fuente de iluminación, para generar un haz de láser que luego es pasado, a través de un polarizador (2) . Parte del haz de, láser puede ser dirigido a través de un cristal no lineal (3) para producir un haz verde para ayudar en la alineación del haz de láser. Un fotodiodo (4) está colocado en estrecha proximidad a la ruta óptica para proporcionar un medio para inspeccionar la intensidad del infrarrojo cercano (NIR) generada. Un filtro (5) está posicxonado enfrente del puerto de entrada de un microscopio para prevenir que cualquier segunda armónica entre al microscopio. El haz de láser es enfocado sobre el soporte sólido que comprende la enzima inmovilizada, y la señal no lineal es recolectada por las lentes (7) y detectada utilizando un monocromador (8). La intensidad fundamental es bloqueada utilizando un filtro IR. La señal del fotomultiplicador es amplificada, promediada e integrada utilizando un promediador de caja e integrador de canal (9) . Las señales generadas luego son transferidas a una computadora (10) para generar las imágenes. Para generar la segunda o tercera armónica, es necesario posicionar una marca apropiada sobre, o en estrecha proximidad a la enzima inmovilizada. Las moléculas altamente dipolares son adecuadas para este propósito. (Lewis y colaboradores, Chem. Phys . , 1999; 245; 133-144 ) . Un ejemplo de moléculas adecuadas son los tintes, particularmente tintes de estirilo (tal como el tinte de membrana JP 1259 - provisto por Molecular Probes) . La Proteína Fluorescente Verde (GFP) es otro ejemplo de un "tinte" o "marca" que puede ser utilizado para formar en imagen vía SHG. Como se utiliza en la presente, la GFP se refiere a tanto la proteína de tipo silvestre y los mutantes espectralmente desplazados de la misma (Tsien, Ann. Rev. Biochem., 1998;67:509 y. US 5,777,079 y US 5,625,048) . Otros tintes adecuados incluyen di-4-ANEPPS, di-8-ANEPPS y JP 2080 (Molecular Probes) . Las moléculas dipolares puede ser localizadas sobre las bases individuales del polinucleótido (o su complemento si las moléculas dipolares son unidas a los trifosfatos de nucleósido y utilizadas en una reacción de polimerasa) . En una modalidad preferida de la invención, la enzima, por ejemplo, una polimerasa, es preparada como una fusión recombinante con la GFP. La GFP puede ser localizada en el N- o C- terminal de la enzima (el C-terminal puede ser deseable si una polimerasa va a ser utilizada en conjunción con una ^abrazadera corrediza' ) . Alternativamente, la molécula de GFP puede ser localizada dondequiera dentro de la enzima, siempre y cuando se retenga la actividad enzimica. En una modalidad separada de la presente invención, el sistema de formación de imagen óptico no lineal es la espectroscopia de Raman o la espectroscopia de Raman mejorada en la superficie (SERS) . Una revisión de la espectroscopia de Raman está contenida en cGilp, Progresa in Surface Science, 1995; 49 (1) : 1-106. La radiación óptica utilizada para excitar el sistema de Raman, es, de preferencia, la Radiación Infrarroja cercana (NIR). La excitación NIR tiene la ventaja de disminuir la fluorescencia en . la señal de Raman del medio circundante o solvente. En una modalidad separada de la invención, la señal no lineal puede ser mejorada mediante el uso de una nanoparticula de metal y/o una superficie de metal áspera (Boyed y colaboradores, Phys Rev., 1984; B. 30:519-526, Chen y colaboradores, Phys. Rev. Lett., 1981; 46:1010-1012 y Peleg y colaboradores, 1996, supra) . Una nanoparticula de metal que mejora la señal puede ser conjugada con la enzima (por ejemplo, con un anticuerpo conjugado con una partícula, Lewis y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1999; 96:6700-6704), inmovilizada cerca de la enzima inmovilizada/localizada o llevada en estrecha proximidad al tinte SHG/enzima. Una nanoparticula de metal mejora la formación de imágen espectroscópica asociada con, en particular, SHG de regiones nanométricas , permitiendo de esta manera la formación de imagen mejorada al nivel de molécula individual. La formación de imagen espectroscópica basada en la dispersión de Raman también puede ser mejorada utilizando una nanoparticula de metal. Las nanoparticulas de metal adecuadas son conocidas, e incluyen nanoparticulas de oro y de plata. Las nanoparticulas son generalmente de un diámetro de 5 nm a 100 nm, de preferencia de 10 nm 60 nm. La nanoparticulas pueden ser unidas al polinucleótido (o su complemento si las nanoparticulas son unidas a los trifosfatos de nucleósido y utilizadas en una reacción de polimerasa) . Una superficie de metal áspera tambié se ha mostrado que mejora la sensibilidad del proceso de SHG (Chen y colaboradores, 1981, supra y Peleg y colaboradores, 1996, supra) y también es un requerimiento para SERS. La superficie de metal es usualmente plata u otro metal noble. Una modificación selectiva inicial de la superficie de metal a una resolución espacial de sub-longitud de onda puede ser llevada a cabo utilizando varias técnicas, incluyéndose el uso de la microscopía de fuerza atómica (A M) . Una punta de AFM recubierta con platino puede ser utilizada para catalizar la hidrogenación de las azidas terminales de grupos amino que están disponibles para la derivación adicional (Muller y colaboradores, Science, 1995; 268:272-273). Las enzimas luego pueden ser colocadas en "puntos factibles" donde existen altos campos locales en regiones donde están localizados modos ópticos (Shalaev y colaboradores. Phys . Rep., 1996; 272:61) . En una modalidad separada de la invención, una nanoparticula puede ser llevada en estrecha proximidad con la enzima utilizando una punta/sonda voladiza de AFM, para mejorar de esta manera la señal no lineal. La AFM se ha mostrado recientemente que es capaz "de tener una resolución de tiempo y sensibilidad aplicable a la formación de imagen dinámica de los cambios conformacionales de proteina (Rousso y colaboradores, J. Struc. Biol., 1997; 119:158-164). Esto es utilizado en una modalidad preferida de la invención, donde una sonda/punta de AFM es posicionada sobre la enzima y, en combinación con la información óptica no lineal (por ejemplo, SHG) , utilizada para detectar los cambios conformacionales de una proteina debido a la interacción entre la enzima y la secuencia de nucleótidos conforme la enzima se mueve a lo largo del polinucleótido objetivo. La información puede ser recolectada en el campo lejano utilizando óptica confocal convencional o en modo de reflexión si es utilizada en conjunción con la reflexión interna total. En una modalidad adicional, la señal no lineal (por ejemplo SHG) es inspeccionada en el campo cercano utilizando la Microscopía Optica de Exploración de Campo Cercano (NSOM) . La NSOM es una forma de microscopía de sonda de exploración, que hace uso de la interacción óptica entre una punta nanoscópica (como es utilizada en AEM) y una muestra para obtener información óptica espacialmente resuelta. La microscopía de campo cercano en combinación con SGH es estudiada extensivamente y se ha -mostrado que es sensible a la superficie sobre una escala atómica (McGilp, 1995, supra) . La ventaja principal de utilizar la NSOM como parte del sistema de formación de imagen es que permite un gran incremento en resolución a las dimensiones de sub-longitud de onda. Como la presente invención se refiere a la inspección conformacional de una enzima individual, por ejemplo una enzima de polimerasa, ya que interactúa como un polinucleótido, la resolución espacial de sub-longitud de onda es altamente deseable. En el contexto de este aspecto de la invención, es preferible si una punta voladiza de AFM es utilizada como un microscopio de exploración de campos cercanos sin abertura (Sangohdar y colaboradores, J. Opt. A:Pure Appl. Opt., 1999; 523-530). Esto es análogo al uso de nanopartículas metálicas como una fuente del aumento de campo local. Se prefiere que la punta sea elaborada de, o recubierta con, un metal noble o cualquier material que actúe para incrementar el campo electromagnético local. Alternativamente , una nanoparticula metálica puede ser conectada directamente a la punta voladiza. Esto ya se ha mostrado que es aplicable para la inspección de campos conformacionales al nivel de molécula individual (Rousso y colaboradores, supra) . En una modalidad separada adicional de la presente invención, un plasmón (o polaritón) de superficie/campo evanescente independientemente generado puede ser utilizado para mejorar la relación de señal a ruido de la señal no lineal. Esta técnica de formación de imagen mejorada con onda evanescente tiene más grande relación de señal a ruido que, por ejemplo, la formación de imagen con SHG sola. En esta modalidad, la señal de campo de SHG evanescentemente mejorada de la enzima marcada o etiquetada puede ser recolectada en el campo cercano por una fibra de NSOM mientras que simultáneamente se obtienen datos conformacionales de AFM, y al mismo tiempo la cantidad de radiación evanescente absorbida puede ser inspeccionada para obtener información sobre la cantidad de acoplamiento entre el campo evanescente y la polimerasa marcada/campo de SHG. En esta configuración (modo de recolección de NSOM) , el sistema actúa como un microscopio de tunelizacion de exploración fotónico (????) y el campo de plas .cn evanescente o de superficie es acoplado a la punta de sonda de fibra de NSOM. Cualquier atenuación en la intensidad de campo de la señal que alcanza la punta por la polimerasa será inspeccionada vía un detector posicionado en el extremo de la punta . La resonancia de plasmón de superficie es conocida en la técnica, y depende de la generación de una onda evanescente al aplicar un haz de luz incidente a un prisma. Una estructura típica para uso en esta modalidad consiste de un prisma que es acoplado ópticamente a una cubierta de vidrio recubíerta de metal sobre la cual una enzima es inmovilizada. La cubierta es parte" de un sistema de celda de flujo microfluídico con una entrada para introducir ligando (nucleótido) sobre la enzima inmovilizada. La enzima también es marcada para permitir que sean generados efectos no lineales. Un haz: de luz incidente es aplicado al prisma par generar el campo de plasmón de superficie. Al mismo tiempo, una señal no lineal (por ejemplo campo de segunda armónica) es generada al dirigir un láser infrarrojo cercano pulsado a través de un polarizador y la placa de onda media, a un explorador óptico para controlar el haz vía un filtro para eliminar el ruido de la segunda armónica óptica, y luego a la muestra. La señal óptica no lineal es recolectada con lentes y un filtro, y es dirigida a un monocromador, pasado a un tubo fotomultiplicador para la detección y luego amplificada y registrada via un sistema de computadora. Cuando la óptica no lineal es acoplada a aquella que genera el campo evanescente, la señal que es detectada también puede ser la señal lineal (evanescente) . En esta modalidad, la NSOM puede ser utilizada en la recolección hecha para detectar la señal lineal. En un aspecto separado de la presente invención, la secuenciación de un polinucleótido puede ser llevada a cabo dentro de una célula. Se ha demostrado que, en su medio ambiente celular nativo, una polimerasa de DNA y su complejo de replisoma asociado es fijado en el lugar (o localizado en el espacio) dentro de la célula (Newport y colaboradores, Curr. Opin. Cell Biol., 1996; 8:365; and Lemon y colaboradores, Science, 1998; 282:1516-1519) . Este complejo de replicación fijado nativo es análogo a la inmovilización de la enzima a un soporte sólido. Esto permite la inspección in vivo de los cambios relacionados con la secuencia conformacional y de patrón de moléculas relacionadas con el replisome al nivel de molécula individual que es llevado a cabo en tiempo real durante la replicación de DNA y/o la división celular. Para llevar a cabo este aspecto, es necesario modificar la enzima de modo que pueda ser formada en imagen utilizando técnicas de detección óptica no lineales. Esto se puede obtener mediante la fusión genética de la enzima con, por ejemplo, proteína fluorescente verde (GFP) . La célula también debe ser inmovilizada para permitir que ocurra la detección. La proteina de fusión expresada puede ser inspeccionada/detectada en su localización celular fijada vía la aplicación de una detección óptica no lineal (generación de segunda armónica) . El siguiente Ejemplo ilustra la invención. En este experimento, una proteína de fusión de Proteína Fluorescente Verde (GFP) y una polimerasa se creó vía las técnicas recombinantes bien conocidas en la técnica. Microplaquitas de cuarzo (14 mm de diámetro, 0.3 mm de espesor) se recubrieron con giro con una capa gruesa de 50 nm de oro y luego se recubrieron con una capa de dextrano plano. Estas microplaquitas d cuarzo recubiertas con oro luego se colocaron en la celda de fluido de un Microscopio Optico de Exploración de Campo Cercano de construcción a la medida (NSOM) . Las microplaquitas de cuarzo recubiertas con oro se acoplaron ópticamente a un prisma de cuarzo vía aceite de correspondencia de índice. La celda de fluido luego se selló y la solución reguladora de polimerasa luego se dejó fluir sobre la microplaquit . La inmovilización de la polimerasa a la superficie de la microplaquita se llevó a cabo de acuerdo con Jonsson y colaboradores, Biotechniques , 1991; 11:620-627. El medio ambiente de la microplaquita se equilibró con solución reguladora de conducción (hepes 10 mM, MgClz 10 mM, NaCl 150 mM, surfactante P20 al 0.05%, pH 7.4) . Volúmenes iguales de N-hidroxisuccinimida (0.1 M en agua) y N-etil-N'-(dimetilaminopropil) carbodimida (EDC) (0.1 M en agua) se mezclaron conj ntamente y se inyectaron a través de la superficie de la microplaquita, para activar el dextrano carboximetilado . La polimerasa-proteína de fusión GFP (150 µ?) se mezcló con acetato de sodio 10 mM (100 µ?, pH 5) y se inyectó a través de la superficie activada. Finalmente,, ésteres de N-hidroxisuccinimida residuales sobre la superficie de la microplaquita se hicieron reaccionar con etanolamina (35 µ?, 1M en agua, pH 8.5), y la polimerasa no enlazada se lavó de la superficie. El procedimiento de inmovilización se realizó con un flujo continuo de solución reguladora de conducción (5 µ?/min) a una temperatura de 25°C. 50 µ? de solución reguladora de enlace de anticuerpo (MES 10 mM pH 6.0, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM) se fluyó sobre la polimerasa inmovilizada/GFP sobre la superficie de la microplaquita a un gasto de flujo de 5 µ?/min a 25°C. Un anticuerpo primario (GFP (B-2) biotina B conjugado 200 µ? ml-1, Santa Cruz Biotechnology) se diluyó 1:3000 en solución reguladora de enlace de anticuerpo y se dejó fluir sobre la superficie de la microplaquita a un gasto de flujo de 5 µ?/min durante 30 minutos. El anticuerpo en exceso luego se quitó lavando de la superficie al fluir solución reguladora de enlace de anticuerpo sobre la microplaquita a un gasto de flujo de 5 µ?/min durante 30 minutos . Un anticuerpo secundario (IgG antirratón de Cabra EM conjugado de inmunooro (H+L) 40 nm, British Biocell International) se diluyó a 1:1000 en solución reguladora de enlace de anticuerpo y se dejó fluir sobre la superficie de la microplaquita a un gasto de flujo de 5 µ?/min durante 30 minutos. El anticuerpo en exceso luego se quitó lavando en la superficie al fluir solución reguladora de enlace de anticuerpo sobre la microplaquita a un gasto de flujo de 5 µ?/min durante 30 minutos. La solución reguladora luego se regresó a la solución reguladora de conducción que luego se dejó fluir sobre la microplaquita a un gasto de 5 µ?/min durante 30 minutos antes de la iniciación de la siguiente etapa . Dos oligonucleótidos se sintetizaron utilizando química de fosforamidita estándar- El oligonucleótido definido como SEQ ID NO:l se utilizó como el polinucleótido objetivo, y el oligonucleótido definido como SEQ ID NO : 2 se utilizó como el cebador.
SEQ ID NO .1 CAAGGAGAGGACGCTGCTTGTCGAAGGTAAGGAACGGACGAGAGAAGGGAGAG
SEQ ID NO, 2 CTCTCCCTTCTCTCGTC Los dos oligonucleótidos se hicieron reaccionar bajo condiciones de hibridación para formar el complejo de ob etivo-cebador. El DNA cebado luego se suspendió en solución reguladora (Tris-HCl 20 mM, pH 7.5, MgCl2 8 mM, glicerol al 4% (v/v) , ditiotreitol (DDT) 5 mM, que contiene 150 µ? de las subunidades p que forman un complejo de abrazadera corrediza alrededor del DNA cebador. Este proceso, es conocido como preiniciación. Para detectar los cambios conformacionales en la polimerasa, una NSOM modificada se utilizó en modo de derivación con ménsulas de fibra larga de 100 um de multimodo de cuarzo jalado. La ménsula se impulsó cercana a su frecuencia resonante y una exploración de área inicial se llevó a cabo sobre la superficie de la microplaquita que contiene anticuerpos inmovilizados . La señal de segunda armónica se generó de la polimerasa inmovilizada en la celda de flujo via la iluminación inicial desde una fuente de láser infrarrojo cercana pulsada. La punta NSOM luego se exploró sobre la superficie de la microplaquita en la celda de flujo para obtener una imagen de partículas de oro de 40 nm en la celda de flujo que está asociada con la polimerasa. La punta luego es sostenida en modo estacionario sobre la polimerasa . El complejo pre-cebado, pre-iniciado luego se inyectó en la celda de flujo a un gasto de flujo de 5 µ?/min de modo que la "abrazadera" alrededor de la molécula cebadora-patrón forma un complejo con la polimerasa inmovilizada. La celda de flujo de mantuvo a 25°C por un dispositivo de enfriamiento incorporado en la celda de flujo. La solución reguladora de conducción luego se inundó continuamente a través de la celda de flujo a 500 µ?/min. Después de 10 minutos, la reacción de secuenciación se inició mediante inyección de dATP 0.4 mM (8 µ?) en la solución reguladora a un gasto de flujo de 500 µ?/min.· Después de 4 minutos, se inyectó dTTP 0.4 mM (8 µ?) en la celda de flujo. Luego después de otros 4 minutos, se inyectó dGTP 0.4 mM (8 µ?) y después de otros 4 minutos, se inyectó dCTP 0.4 mM (8 µ?) . Este ciclo luego se repitió 10 veces. Durante el periodo de tiempo completo la señal de segunda armónica transmitida via la fibra multimodal se pasó a un monocromador y luego a un fotomultiplicador . La señal del fotomultiplicador luego se amplificó y se alimentó a una computadora para el procesamiento y almacenamiento. El cambio de intensidad de la señal de segunda armónica que surge del complejo de polimerasa durante un periodo de 10 segundos desde el inicio de cada inyección luego se calculó y se gráfico contra el nucleótido inyectado en la celda de flujo. Los resultados de la reacción de secuenciación son mostrados en la Figura 2. Como se puede observar de la gráfica, cambios" de intensidad grandes (cambios de intensidad más grandes que tienen en cuenta nucleótidos adyacentes entre si) corresponden al complemento de aquél de la SEQ ID NO.l (lectura de derecha a izquierda, menos aquella parte de la cual se híbrida a la secuencia cabadora) .
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<160> 2
<170> Patentln Ver. 2.1
<21G> 1 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence
<220> <223> Description of Artificial sequence: Eynt etic oligomicleotide
<400> 1 caaggagagg acgctgcttg tcgaaggtaa ggaacggacg agagaaggga gag 53
<210> 2 <211> 17 <212> UNA <213> Artificial Seguence
<220> <223> Description of Artificial Seguence: Synt etic oligonucleotide
<400> 2 ctctcccttc tctcgtc 1*7
1