DE60224524T2

DE60224524T2 - Verfahren zur Sequenzierung von Polynukleotiden

Info

Publication number: DE60224524T2
Application number: DE60224524T
Authority: DE
Inventors: Daniel Henry Nr-Totnes DENSHAM
Original assignee: Medical Biosystems Ltd
Current assignee: Medical Biosystems Ltd
Priority date: 2001-05-18
Filing date: 2002-05-20
Publication date: 2009-01-08
Anticipated expiration: 2022-05-21
Also published as: US20040241678A1; KR20030094412A; CN1537172B; RU2291197C2; CA2447222A1; JP4907498B2; IL158743A0; PT1389241E; JP4094961B2; WO2002095070A2; US20170022556A1; GB0112238D0; NZ529349A; AU2002257933B2; JP2004535800A; ATE383442T1; CN1537172A; EP1389241B1; US20090029383A1; CA2447222C

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Sequenz eines Polynukleotids.
Hintergrund der Erfindung
Die Fähigkeit, die Sequenz eines Polynukleotids zu bestimmen, ist von großer wissenschaftlicher Bedeutung, wie durch das Humangenomprojekt bei der Kartierung der drei Milliarden DNA-Basen, die im menschlichen Genoms enthalten sind, gezeigt wurde.
Das allgemein angewandte Hauptverfahren zur großtechnischen DNA-Sequenzierung ist das Kettenabbruchverfahren. Dieses Verfahren wurde zuerst von Sanger und Coulson (Sanger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1977; 74: 5463–5467) entwickelt und beruht auf der Verwendung von Didesoxyderivaten der vier Nukleosidtriphosphate, die in einer Polymerasereaktion in die entstehende Polynukleotidkette eingebaut werden. Nach Einbau beenden die Didesoxyderivate die Polymerasereaktion, und anschließend werden die Produkte durch Gelelektrophorese aufgetrennt und analysiert, um die Position anzuzeigen, an der das jeweilige Didesoxyderivat in die Kette eingebaut wurde.
Obwohl dieses Verfahren verbreitet eingesetzt wird und zuverlässige Ergebnisse produziert, ist bekannt, dass es langsam, arbeitsaufwändig und teuer ist.
Es sind Fluoreszenzmarkierungen verwendet worden, um den Einbau eines Nukleotids in ein wachsendes, entstehendes DNA-Molekül unter Verwendung der Polymerasereaktion zu identifizieren (siehe WO91/06678 ). Diese Techniken weisen jedoch den Nachteil einer zunehmenden Hintergrundinterferenz von den Fluorophoren auf. Mit dem Wachsen des DNA-Moleküls nimmt das Hintergrund-„Rauschen" zu, und die Zeit, die erforderlich ist, um jeden Nukleotideinbau zu detektieren, muss heraufgesetzt werden. Dies schränkt die Verwendung des Verfahrens zur Sequenzierung langer Polynukleotide stark ein. Die stärkste Einschränkung von Polynukleotid-Sequenzierungssystemen, die auf Fluoreszenzfarbstoffen aufgebaut sind, ist jedoch das Problem des Photobleachings.
Das Photobleaching ist ein gut belegtes Phänomen in Fluoreszenzfarbstoff-Systemen und rührt her aus der Belichtung des Farbstoffs mit Anregungswellenlängen. Sämtliche Farbstoffsysteme sind in der Lage, eine begrenzte Anzahl von Photonen zu absorbieren, bevor das Photobleaching auftritt. Sobald Photobleaching aufgetreten ist, ist der Fluoreszenzfarbstoff für den Beobachter nicht mehr sichtbar, und folglich ist, wenn er an ein Molekül gebunden ist, dieses nicht mehr nachweisbar.
Es bedarf demnach eines verbesserten Verfahrens zur Bestimmung der Sequenz eines Polynukleotids, das die Geschwindigkeit und die Fragmentgröße des Polynukleotids, das sequenziert wird, heraufsetzt, und das bevorzugt nicht auf fluoreszenzmarkierte Nukleotide zur Detektion angewiesen ist. Des Weiteren sollte das Verfahren in der Lage sein, durch einen automatisierten Prozess durchgeführt zu werden, was den Aufwand und die Kosten, die mit bestehenden Verfahren verbunden sind, herabsetzt.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass eine Änderung der Konformation und/oder Masse und/oder Energieverteilung in einem Polynukleotid-prozessierenden Enzym, die auftritt, wenn ein Enzym an ein Zielpolynukleotid bindet und sich daran entlang bewegt, unter Verwendung nichtlinearer optischer Bildgebung detektiert werden kann, einschließlich derer, die auf der Erzeugung von ersten und zweiten Oberwellen bzw. Oberwellen zweiter und dritter Ordnung beruht.
Gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst ein Verfahren zur Sequenzierung eines Polynukleotids die Schritte:

(i) Inkontaktbringen eines Polynukleotid-prozessierenden Enzyms, dass in einer festgelegten Position immobilisiert ist, mit einem Zielpolynukleotid unter Bedingungen, die zur Enzymaktivität hinreichend sind; und
(ii) Detektieren eines aus der Wechselwirkung zwischen dem Enzym und dem Polynukleotid hervorgehenden Effekts, wobei der Effekt durch Messung eines nichtlinearen optischen Signals oder eines mit einem nichtlinearen Signal gekoppelten linearen Signals detektiert wird.

Mit der vorliegenden Erfindung werden zahlreiche Vorteile erlangt. Die Sequenzierung kann mit kleinen Mengen an Polynukleotid durchgeführt werden, mit der Fähigkeit zur Sequenzierung einzelner Polynukleotidmoleküle, wodurch die Notwendigkeit zur Amplifikation vor Beginn der Sequenzierung eliminiert wird. Es können große Sequenz-Leselängen erreicht werden und die Berücksichtigung von Sekundärstrukturen minimiert werden. Das Erreichen großer Leselängen eliminiert die Notwendigkeit für ein umfangreiches Zusammensetzen von Fragmenten unter Verwendung von Berechnungen. Des Weiteren wird, da die Erfindung nicht auf die Notwendigkeit für fluoreszenzmarkierte Nukleotide oder irgendeine Fluoreszenzmessung angewiesen ist, die Beschränkung der Leselänge auf der Einzelmolekülebene als eine Funktion des Photobleachings, oder anderer unvorhersehbarer Fluoreszenzeffekte, umgangen. Die vorliegende Erfindung erlaubt auch, dass lange Polynukleotidfragmente der Reihe nach von demselben Enzymsystem gelesen werden. Das hat den Vorteil, dass ein einziges Enzymsystem verwendet werden kann, das regeneriert und wiederverwendet werden kann, was es erlaubt, dass viele verschiedene Polynukleotid-Templates sequenziert werden können. Schließlich bietet die Ausnutzung der Erzeugung von Oberwellen erster und zweiter Ordnung Vorteile aufgrund des Ausbleibens von Photoschäden und Photobleaching. Dies beruht auf der Tatsache, dass selbst in der Fokusebene keine photochemische Reaktion stattfindet, da das Signal, das durch Nichtresonanzstrahlung ausgelöst wird, nicht einen angeregten Zustand mit einer endlichen Lebensdauer umfasst.
Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung umfasst ein festes Trägermaterial mindestens eine Polymerase und mindestens ein dipolares Molekül, das auf oder nahe der Polymerase positioniert ist, wobei das dipolare Molekül eine Markierung ist, das die Oberwelle erster oder zweiter Ordnung sowie ein daraus entstehendes Signal erzeugt, zur Detektion unter Verwendung nichtlinearer optische Verfahren.
Gemäß einem dritten Aspekt der Erfindung umfasst ein Bildgebungssystem, das zur Detektion eines nichtlinearen optischen Signals aufgebaut ist, einen festen Träger, auf dem ein Enzym immobilisiert ist, das mit einem Polynukleotid interagiert, und ein dipolares Molekül, das auf oder nahe dem Enzym positioniert ist.
Beschreibung der Zeichnungen
Die Erfindung wird im Bezug zu den beiliegenden Figuren beschrieben, wobei:
1 eine schematische Darstellung eines Bildgebungssystems ist, das die Erzeugung von Oberwellen erster Ordnung ausnutzt; und
2 das Signal der ersten Oberwelle zeigt, das durch eine Polymerase bei Einbau eines spezifischen Polynukleotids erzeugt wird.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung nutzt herkömmliche nichtlineare optische Messungen aus, um eine Änderung der Konformation und/oder Masse und/oder Energieverteilung zu identifizieren, die auftritt, wenn ein Polynukleotid-prozessierendes Enzym mit den einzelnen Basen auf einem Zielpolynukleotid interagiert oder Nukleotide in ein entstehendes Polynukleotidmolekül einbaut.
Die Verwendung von nichtlinearen optischen Verfahren zur Bildgebung von Molekülen ist bekannt. Es wurde bisher nicht erkannt, dass diese Verfahren unter Ausnutzung eines immobilisierten oder fixierten Enzyms bei der Sequenzierung eines Polynukleotids angewendet werden können.
In einer getrennten Ausführungsform wird zusätzlich zu einem nichtlinearen Signal ein lineares Signal erzeugt, und das lineare Signal wird detektiert. Die beiden Signale gelten als gekoppelt, was zu einer verbesserten Detektion führt.
Der Begriff „Polynukleotid", wie hier verwendet, soll breit interpretiert werden und umfasst DNA und RNA, einschließlich modifizierter DNA und RNA, DNA/RNA-Hybriden, sowie anderer hybridisierender nukleinsäureartiger Moleküle, z. B. Peptidnukleinsäure (PNA).
Der Begriff „Polynukleotid-prozessierendes Enzym", wie hier verwendet, soll breit interpretiert werden und bezeichnet ein beliebiges Enzym, das mit einem Polynukleotid interagiert und sich kontinuierlich am Polynukleotid entlang bewegt. Das Enzym ist bevorzugt ein Polymerase-Enzym und kann von einem beliebigen bekannten Typ sein.
Zum Beispiel kann die Polymerase eine beliebige DNA-abhängige DNA-Polymerase sein. Wenn das Zielpolynukleotid ein RNA-Molekül ist, kann die Polymerase eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, d. h. Reverse Transkriptase, sein oder eine RNA-abhängige RNA-Polymerase, d. h. RNA-Replikase, sein. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Polymerase T4-Polymerase. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist die Polymerase entweder Polymerase-II-Holoenzym aus E. coli (McHenry, Ann. Rev. Biochem., 1988; 57: 519); T7-Polymerase (Schwager et al., Methods in Molecular and Celllular Biology, 1989/90; 1(4): 155–159) oder Gen-5-Polymerase aus dem Bakteriophagen T7, komplexiert mit E. coli- Thioredoxin (Tabor et al., J. Biol. Chem., 1987; 262: 1612–1623). Jedes dieser Polymerase-Enzyme bindet an eine Zielpolynukleotidsequenz mit hoher Prozessivität (und Genauigkeit) und erhält daher einen Polymerase-Polynukleotid-Komplex aufrecht, selbst wenn keine aktive Polymerisation stattfindet.
Alternative Enzyme, die mit einem Polynukleotid Wechselwirken, umfassen Helikase, Primase-, Holoenzym-, Topoisomerase- oder Gyrase-Enzyme. Solche Enzyme bieten weitere Vorteile. Beispielsweise vermindert die Verwendung einer Helikase das Problem von Sekundärstrukturen, die innerhalb von Polynukleotidmolekülen vorliegen, da Helikasen innerhalb ihrer natürlichen Umgebung auf diese Strukturen treffen und sie überwinden. Zweitens lassen Helikasen zu, dass die notwendigen Reaktionen an doppelsträngiger DNA bei Raumtemperatur durchgeführt werden.
Wenn das Enzym mit aufeinander folgenden Basen auf dem Polynukleotid interagiert, wird sich seine Konformation ändern, abhängig davon, mit welcher Base (oder Nukleotid) auf dem Ziel es in Kontakt gebracht wird. Somit wird die zeitliche Abfolge von Basenpaaradditionen im Verlauf der Reaktion an einem einzigen Nukleinsäuremolekül gemessen; d. h. die Aktivität des Enzymsystems an dem zu sequenzierenden Template-Polynukleotid kann in Echtzeit verfolgt werden. Die Sequenz wird abgeleitet, indem bestimmt wird, welche Base (welches Nukleotid) in den wachsenden komplementären Strang des Zielnukleotids durch die katalytische Aktivität des Enzyms eingebaut wird.
Ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Immobilisierung des Enzyms an einer festgelegten Position relativ zum Bildgebungssystem. Dies wird bevorzugt durchgeführt durch Immobilisieren des Enzyms auf einem festen Träger, wobei das Enzym seine biologische Aktivität behält. Verfahren zur Immobilisierung geeigneter Enzyme auf einem festen Träger sind bekannt. Zum Beispiel beschreibt WO-A-99/05315 die Immobilisierung eines Polymerase-Enzyms auf einem festen Träger. Allgemeine Verfahren zum Immobilisieren von Proteinen auf Trägern sind geeignet.
Die optischen Detektionsverfahren, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sollen der Bildgebung auf der Einzelmolekülebene dienen, d. h. ein distinktes Bild/Signal für ein Enzym erzeugen. Eine Vielzahl von Enzymen kann auf einem festen Träger immobilisiert werden, in einer Dichte, die Einzelmolekülauflösung zulässt. Daher sind, bei einer Ausführungsform, mehrere Enzyme auf einem festen Träger immobilisiert, und das Verfahren der Erfindung kann an diesen gleichzeitig durchgeführt werden. Das lässt es zu, dass verschiedene Polynukleotidmoleküle zusammen sequenziert werden.
Es ist für den Fachmann offenkundig, dass das Bildgebungsverfahren unter Bedingungen durchzuführen ist, die geeignet sind, Enzymaktivität zu fördern. Es ist beispielsweise im Hinblick auf das Polymerase-Enzym offenkundig, dass die anderen Bestandteile, die notwendig für das Ablaufen der Polymerasereaktion notwendig sind, erforderlich sind. Bei dieser Ausführungsform sind ein Polynukleotidprimermolekül und jedes der Nukleosidtriphosphate, dATP, dTTP, dCTP und dGTP, erforderlich. Die Nukleosidtriphosphate können nacheinander, unter Entfernung nichtgebundender Nukleotide vor der Einführung des nächsten Nukleosidtriphosphats zugegeben werden.
Alternativ können sämtliche Triphosphate zur selben Zeit anwesend sein. Es kann vorteilhaft sein, Triphosphate einzusetzen, die eine oder mehrere Blockierungsgruppen aufweisen, die selektiv durch Pulse von monochromatischem Licht entfernt werden können, wodurch ein unkontrollierter Einbau verhindert wird. Geeignete blockierte Triphosphate werden in WO-A-99/05315 offenbart.
Hochauflösende nichtlineare optische Bildgebungssysteme sind im Fachgebiet bekannt.
Im Allgemeinen kann die nichtlineare Polarisation für ein Material ausgedrückt werden als: P = X(1)E1 + X(2)E2 + X(3)E3 + ... wobei P die induzierte Polarisation ist, X⁽ⁿ⁾ die nichtlineare Suszeptibilität der n-ten Ordnung ist, und E der elektrische Feldvektor ist. Der erste Term beschreibt die normale Absorption und Reflexion von Licht; der Zweite beschreibt die Erzeugung von Oberwellen erster Ordnung (SHG), Summen- und Differenzfrequenzerzeugung; und der Dritte beschreibt die Lichtstreuung, die stimulierten Raman-Prozesse, die Erzeugung von Oberwellen zweiter Ordnung (TGH) und sowohl die Zwei- als auch die Drei-Photonen-Absorption.
Ein bevorzugtes Bildgebungssystem der vorliegenden Erfindung beruht auf der Detektion des Signals, das aus Erzeugung von Oberwellen der ersten oder zweiten Ordnung entsteht.
Die Einzelmolekülauflösung unter Verwendung der Erzeugung von Oberwellen der ersten oder zweiten Ordnung (im Folgenden als SHG bezeichnet) ist im Fachgebiet bekannt (Peleg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999; 95: 6700–6704 und Peleg et al., Bioimaging, 1996; 4: 215–224).
Der allgemeine Aufbau des Bildgebungssystems kann wie in Peleg et al., 1996, wie oben, und wie in 1 gezeigt sein. Im Bezug auf 1, wird ein Laser (1) als Beleuchtungsquelle verwendet, um einen Laserstrahl zu erzeugen, der dann durch einen Polarisator (2) geleitet wird. Ein Teil des Laserstrahls kann durch einen nichtlinearen Kristall (3) gelenkt werden, um einen grünen Strahl zu erzeugen, der beim Ausrichten des Laserstrahls behilflich ist. Eine Photodiode (4) wird in unmittelbare Nähe zum optischen Strahlengang platziert, um eine Möglichkeit bereitzustellen, die erzeugte Nahinfrarot(NIR)-Intensität zu überwachen. Ein Filter (5) wird vor dem Eingangsport eines Mikroskops positioniert, um zu verhindern, dass Oberwellen erster Ordnung in das Mikroskop einfallen. Der Laserstrahl wird auf den festen Träger, der das immobilisierte Enzym umfasst, fokussiert, und das nichtlineare Signal wird durch Linsen (7) gesammelt und unter Verwendung eines Monochromators (8) detektiert. Die Intensität der Grundschwingung wird unter Verwendung eines IR-Filters blockiert. Das Signal aus dem Photomultiplier wird verstärkt, gemittelt und integriert unter Verwendung eines Boxcar-Averagers und -Integrators (9). Die erzeugten Signale werden dann auf einen Computer (10) übertragen, um die Bilder zu erzeugen.
Um die erste oder zweite Oberwelle zu erzeugen, ist es notwendig, eine geeignete Markierung an oder in unmittelbarer Nähe zu dem immobilisierten Enzym zu positionieren. Starke dipolare Moleküle sind zu diesem Zweck geeignet. (Lewis et al. Chem. Phys., 1999; 245: 133–144). Ein Beispiel für geeignete Moleküle sind Farbstoffe, insbesondere Styrylfarbstoffe (wie der Membranfarbstoff JPW 1259 – erhältlich von Molecular Probes). Das Grün Fluoreszierende Protein (GFP) ist ein weiteres Beispiel für einen „Farbstoff" oder eine „Markierung", die zur Bildgebung mittels SHG verwendet werden kann. Wie hier verwendet, bezeichnet GFP sowohl das Wildtyp-Protein, als auch spektral verschobne Mutanten davon (Tsien, Ann. Rev. Biochem., 1998; 67: 509 und US 5 777 079 sowie US 5 625 048 ). Andere geeignete Farbstoffe umfassen Di-4-ANEPPS, Di-8-ANEPPS und JPW 2080 (Molecular Probes).
Die dipolaren Moleküle können an den einzelnen Basen des Polynukleotids lokalisiert sein (oder seinem Komplement, wenn die dipolaren Moleküle an die Nukleosidtriphosphate gebunden sind und in einer Polymerasereaktion eingesetzt werden).
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Enzym, z. B. eine Polymerase als ein rekombinantes Fusionsprotein mit GFP hergestellt. Das GFP kann am N- oder C-Terminus des Enzyms lokalisiert sein (der C-Terminus kann erwünscht sein, wenn eine Polymerase in Verbindung mit einer "Ringklemme" verwendet werden soll). Alternativ kann das GFP-Molekül an beliebiger Stelle innerhalb des Enzyms lokalisiert sein, mit der Maßgabe, dass die Enzymaktivität beibehalten wird.
Bei einer getrennten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das nichtlineare optische Bildgebungssystem die Raman-Spektroskopie oder oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie (SERS). Eine Übersicht über die Raman-Spektroskopie ist in McGilp, Progress in Surface Science, 1995; 49(1): 1–106 enthalten.
Die optische Strahlung, die verwendet wird, um das Raman-System anzuregen ist, bevorzugt, Nahinfrarot-Strahlung (NIR). NIR-Anregung hat den Vorteil, dass es die Fluoreszenz und das Raman-Signal des Umgebungsmediums- oder Lösungsmittels vermindert.
Bei einer getrennten Ausführungsform der Erfindung kann das nichtlineares Signal verstärkt werden durch die Verwendung eines Metallnanopartikels und/oder einer aufgerauten Metalloberfläche (Boyed et al., Phys. Rev., 984; B. 30: 519–526, Chen et al., Phys. Rev. Lett., 1981; 46: 1010–1012 und Peleg et al., wie oben). Ein signalverstärkendes Metallnanopartikel kann mit dem Enzym verbunden sein (z. B. mittels eines nanopartikelkonjugierten Antikörpers, Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999; 96: 6700–6704) in der Nähe des immobilisierten/lokalisierten Enzyms immobilisiert sein oder in unmittelbare Nähe des SHG-Farbstoffs/Enzyms gebracht werden.
Ein Metallnanopartikel verstärkt die spektroskopische Bildgebung, die, insbesondere, mit SHG aus Nanometerbereichen verbunden ist, und erlaubt so eine verbesserte Bildgebung auf Einzelmolekülebene. Spektroskopische Bildgebung, die auf Raman-Streuung beruht, kann auch durch Verwendung eines Metallnanopartikels verbessert werden. Die Nanopartikel haben im Allgemeinen einen Durchmesser von 5 nm bis 100 nm, bevorzugt von 10 nm bis 60 nm. Die Nanopartikel können an das Polynukleotid angebunden sein (oder sein Komplement, wenn die Nanopartikel an die Nukleosidtriphosphate gebunden sind und in einer Polymerasereaktion eingesetzt werden).
Es wurde gezeigt, dass auch eine aufgeraute Metalloberfläche die Empfindlichkeit des SHG-Prozesses verbessert (Chen et al., 1981, wie oben und Peleg et al., 1996, wie oben) und eine solche ist auch eine Voraussetzung für SERS. Die Metalloberfläche besteht gewöhnlich aus Silber oder einem anderen Edelmetall. Eine anfängliche selektive Modifikation der Metalloberfläche bei räumlicher Auflösung im Subwellenlängenbereich kann unter Verwendung verschiedener Techniken durchgeführt werden, einschließlich der Verwendung von Rasterkraftmikroskopie (AFM). Eine platinbeschichtete AFM-Spitze kann verwendet werden, um die Hydrierung endständiger Azide zu Aminogruppen zu katalysieren, die zugänglich für eine weitere Derivatisierung sind (Muller et al., Science, 1995; 268: 272–273). Die Enzyme können dann an "Hot Spots" platziert werden, an denen starke lokale Feldstärken in Regionen existieren, in denen optische Moden lokalisiert sind (Shalaev et al., Phys. Rep., 1996; 272: 61).
Bei einer getrennten Ausführungsform der Erfindung kann ein Nanopartikel unter Verwendung einer AFM-Cantileverspitze/-sonde in unmittelbare Nähe des Enzyms gebracht werden, um dadurch das nichtlineare Signal zu verstärken.
Es wurde kürzlich gezeigt, dass AFM in der Lage ist, eine zeitliche Auflösung und Empfindlichkeit zu haben, die zur dynamischen Bildgebung von Protein-Konformationsänderungen anwendbar ist (Rousso et al., J. Struc. Biol., 1997; 119: 158–164). Das wird ausgenutzt bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, wobei eine AFM-Sonde/-Spitze über dem Enzym positioniert wird und, in Kombination mit nichtlinearer optische Information (z. B. SHG), verwendet wird, um Konformationsänderungen eines Proteins aufgrund der Wechselwirkung zwischen dem Enzym und der Nukleotidsequenz zu detektieren, während das Enzym sich am Zielnukleotid entlang bewegt. Die Information kann im Fernfeld erfasst werden, unter Verwendung herkömmlicher konfokaler Optik, oder im Reflektionsmodus, bei Verwendung in Verbindung mit totaler interner Reflektion.
Bei einer weiteren Ausführungsform wird das nichtlineare Signal (z. B. SHG) unter Verwendung von optischer Nahfeldmikroskopie (NSOM) im Nahfeld überwacht. NSOM ist eine Form der Rastersondenmikroskopie, welche die optische Wechselwirkung zwischen einer nanoskopischen Spitze (wie bei der AFM verwendet) und einer Probe ausnutzt, um räumlich aufgelöste optische Informationen zu erhalten.
Nahfeldmikroskopie in Kombination mit SHG ist ausführlich untersucht wurden, und es wurde gezeigt, dass sie im atomaren Bereich oberflächenempfindlich ist (McGilp, 1995, wie oben). Der Hauptvorteil der Verwendung von NSOM als Teil des Bildgebungssystems besteht darin, dass sie eine große Zunahme der Auflösung zu Größenordnungen im Subwellenlängenbereich erlaubt. Da die vorliegende Erfindung die Überwachung der Konformation eines einzelnen Moleküls, z. B. eines Polymerase-Enzyms, betrifft, wenn es mit einem Polynukleotid interagiert, ist eine räumliche Auflösung im Subwellenlängenbereich äußerst wünschenswert. Im Zusammenhang dieses Aspekts der Erfindung ist es bevorzugt, wenn eine AFM-Cantileverspitze als ein aperturloses Nahfeldmikroskop (Sangohdar et al., J. Opt. A: Pure Apl. Opt., 199; 523–530) verwendet wird. Das ist analog zu der Verwendung metallischer Nanopartikel als eine Quelle lokaler Feldverstärkung. Es ist bevorzugt, dass die Spitze aus einem Edelmetall besteht oder damit beschichtet ist, oder einem beliebigen Material, dass eine Verstärkung des lokalen elektromagnetischen Felds bewirkt. Alternativ kann ein Metallnanopartikel direkt mit der Cantileverspitze verbunden werden. Es wurde bereits gezeigt, das dies bei der Überwachung von Konformationsänderungen auf Einzelmolekülebene anwendbar ist (Rousso et al., wie oben).
Bei einer weiteren getrennten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann ein unabhängig erzeugtes Oberflächenplasmon (oder Polariton)/evaneszentes Feld verwendet werden, um das Signal-zu-Rauschen-Verhältnis des nichtlinearen Signals zu verstärken. Diese durch evaneszente Wellen verstärkte Bildgebungstechnik hat ein größeres Signal-zu-Rauschen-Verhältnis als beispielsweise SHG-Bildgebung allein. Bei dieser Ausführungsform kann das evaneszent verstärkte SHG-Feldsignal des markierten Enzyms im Nahfeld durch eine NSOM-Faser erfasst werden, während gleichzeitig AFM-Konformationsdaten erhalten werden, und zur gleichen Zeit kann die Menge der absorbierten evaneszenten Strahlung überwacht werden, um Informationen über das Ausmaß der Kopplung zwischen dem evaneszenten Feld und dem Feld der markierten Polymerase/SHG-Feld zu erhalten.
In dieser Konfiguration (NSOM-Erfassungsmodus) arbeitet das System als ein Photonen-Rastertunnelmikroskop (PSTM) und das evaneszente oder Oberflächenplasmonfeld ist in die Sondenspitze der NSOM-Faser eingekoppelt.
Jegliche Abschwächung der Feldstärke des Signals, das die Spitze erreicht, durch die Polymerase wird über einen Detektor, der am Ende der Spitze positioniert ist, überwacht werden.
Die Oberflächenplasmonresonanz ist im Fachgebiet bekannt und beruht auf der Erzeugung einer evaneszenten Welle durch das Anwenden eines einfallenden Lichtstrahls auf ein Prisma. Ein typischer Aufbau für die Verwendung bei dieser Ausführungsform besteht aus einem Prisma, das optisch mit einem metallbeschichteten Glasobjektträger gekoppelt ist, auf dem ein Enzym immobilisiert ist. Der Objektträger ist Teil eines Mikrofluid-Durchflusszellensystems mit einem Einlass zum Einbringen von Liganden (Nukleotiden) über das immobilisierte Enzym. Das Enzym ist zudem markiert, sodass nichtlineare Effekte erzeugt werden können. Ein einfallender Lichtstrahl wird auf das Prisma angewendet, um das Oberflächenplasmonfeld zu erzeugen. Gleichzeitig wird ein nichtlineares Signal (z. B. erstes Oberwellenfeld) erzeugt, indem ein Nahinfrarot-Pulslaser durch einen Polarisator und ein λ/2-Plättchen in einen optischen Scanner zur Strahlsteuerung über einen Filter, um optisches Rauschen von Oberwellen erster Ordnung zu eliminieren, und dann in die Probe gelenkt wird. Das nichtlineare optische Signal wird mit Linsen und einem Filter gesammelt und in einen Monochromator gelenkt, zur Detektion durch eine Photomultiplier-Röhre geleitet und dann verstärkt und über ein Computersystem aufgezeichnet.
Wenn das nichtlineare optische Signal mit jenem gekoppelt ist, welches das evaneszente Feld erzeugt, kann das Signal, das detektiert wird, auch das lineare (evaneszente) Signal sein. Bei dieser Ausführungsform kann die NSOM bei der Sammlung verwendet werden, die zur Detektion des linearen Signals vorgenommen wird.
Es wird weiterhin offenbart, dass die Polynukleotidsequenzierung innerhalb einer Zelle durchgeführt werden kann.
Es ist gezeigt worden, dass eine DNA-Polymerase und ihr assoziierter Replisom-Komplex in ihrer nativen zellulären Umgebung innerhalb der Zelle an einem Ort verankert sind (oder räumlich lokalisiert sind) (Newport et al., Curr. Opin. Cell Biol., 1996; 8: 365; und Lemon et al., Science, 1998; 282; 1516–1519. Dieser native verankerte Replikationskomplex ist analog zu der Immobilisierung des Enzyms auf einem festen Träger.
Das lässt es zu, dass eine In-vivo-Überwachung von konformations- und Template-Sequenz-abhängigen Änderungen von zum Replisom gehörigen Molekülen im Verlauf der DNA-Replikation und/oder Zellteilung auf Einzelmolekülebene und in Echtzeit durchgeführt wird.
Um diesen Aspekt durchzuführen, ist es notwendig, das Enzym zu modifizieren, sodass es unter Verwendung nichtlinearer optischer Detektionstechniken abgebildet werden kann. Das kann durch genetische Fusion des Enzyms, beispielsweise mit dem Grün fluoreszierenden Protein (GFP), erreicht werden. Die Zelle sollte zudem immobilisiert sein, um das Erfolgen der Detektion zuzulassen.
Das exprimierte Fusionsprotein kann an seiner verankerten zellulären Position über die Anwendung nichtlinearer optischer Detektion (Erzeugung von Oberwellen erster Ordnung) überwacht/detektiert werden.
Das folgende Beispiel veranschaulicht die Erfindung.
In diesem Experiment wurde ein Fusionsprotein aus dem Grün fluoreszierenden Protein (GFP) und einer Polymerase erzeugt, über rekombinante Techniken, die im Fachgebiet wohl bekannt sind.
Quartzchips (14 mm im Durchmesser, 0,3 mm dick) wurden mit einer 50 nm dicken Schicht Gold rotationsbeschichtet und dann mit einer Schicht aus planarem Dextran beschichtet. Diese goldbeschichteten Quartzchips wurden dann in die Durchflusszelle eines spezialangefertigten Nahfeld-Rastermikroskops (NSOM) platziert. Die goldbeschichteten Quartzchips wurden über ein Index-Matching-Öl optisch mit einem Quartzprisma gekoppelt. Die Durchflusszelle wurde dann versiegelt, und anschließend wurde Polymerasepuffer über den Chip fließen gelassen.
Die Immobilisierung der Polymerase auf der Chipoberfläche wurde durchgeführt nach Jonsson et al., Biotechniques, 1991; 11: 620–627. Die Chipumgebung wurde mit Laufpuffer (10 mM HEPES, 10 mM MgCl₂, 150 mM NaCl, 0,05% Netzmittel P20, pH 7,4) äquilibriert. Gleiche Volumen N-Hydroxysuccinimid (0,1 M in Wasser) und N-Ethyl-N'-(dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDC) (0,1 M in Wasser) wurden miteinander vermischt und über die Chipoberfläche injiziert, um das carboxymethylierte Dextran zu aktivieren. Das Polymerase-GFP-Fusionsprotein (150 μl) wurde mit 10 mM Natriumacetat (100 μl, pH 5) gemischt und über die aktivierte Oberfläche injiziert.
Schließlich wurden zurückbleibende N-Hydroxysuccinimidester auf der Chipoberfläche mit Ethanolamin (35 μl, 1 M in Wasser, pH 8,5) umgesetzt, und ungebundene Polymerase wurde von der Oberfläche gewaschen. Die Immobilisierungsprozedur wurde bei einem kontinuierlichen Durchfluss von Laufpuffer (5 μl/min) bei einer Temperatur von 2°C ausgeführt.
50 μl Antikörperbindungspuffer (10 mM MES, pH 6,0, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA) wurden mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 5 μl/min bei 25°C über die immobilisierte Polymerase/GFP auf der Chipoberfläche fließen gelassen. Ein Primärantikörper (GFP (B-2)B, biotinkonjugiert, 200 μl/ml, Santa Cruz Biotechnology) wurde 1:3000 in Antikörperbindungspuffer verdünnt und mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 5 μl/min für 30 Minuten über die Chipoberfläche fließen gelassen. Überschüssiger Antikörper wurde dann von der Oberfläche gewaschen, indem Antikörperbindungspuffer mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 5 μl/min für 30 Minuten über den Chip fließen gelassen wurde.
Ein Sekundärantikörper (Immunogold-Konjugat EM-Ziege-Anti-Maus-IgG (H+L) 40 nm, British Biocell International) wurde 1:1000 in Antikörperbindungspuffer verdünnt und bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 5 μl/min für 30 Minuten über die Chip-Oberfläche fließen gelassen. Überschüssiger Antikörper wurde dann von der Oberfläche gewaschen, indem Antikörperbindungspuffer mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 5 μl/min für 30 Minuten über den Chip fließen gelassen wurde. Der Puffer wurde dann wieder auf Laufpuffer umgestellt, der dann mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 5 μl/min für 30 Minuten über den Chip fließen gelassen wurde, bevor die nächste Phase eingeleitet wurde.
Zwei Oligonukleotide wurden unter Verwendung von Standard-Phosphoramiditchemie synthetisiert. Das Oligonukleotid, das als SEQ ID Nr. 1 definiert ist, wurde als Zielnukleotid eingesetzt, und das Oligonukleotid, das als SEQ ID Nr. 2 definiert ist, wurde als Primer eingesetzt.
Die beiden Oligonukleotide wurden unter Hybridisierungsbedingungen zur Bildung des Ziel-Primer-Komplexes umgesetzt. Der Primer-DNA-Komplex wurde dann in Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 8 mM MgCl₂, 4% (v/v) Glycerol, 5 mM Dithiothreitol (DDT)), suspendiert, der 150 μl der β-Untereinheiten enthielt, die einen Ringklemmenkomplex um die Primer-DNA bilden. Dieser Prozess ist als Präinitiation bekannt.
Um Konformationsänderungen in der Polymerase zu detektieren, wurde ein modifiziertes NSOM im Tapping-Modus mit 100 μm langen, gezogenen Quartz-Multimodefaser-Cantilevern verwendet. Der Cantilever wurde nah an seine Resonanzfrequenz herangefahren, und es eine wurde Eingangs-Flächenabtastung über die Oberfläche des Chips durchgeführt, der immobilisierte Antikörper enthielt. Das Signal der Oberwellen erster Ordnung wurde von der immobilisierten Polymerase in der Durchflusszelle über Eingangsbeleuchtung von einer Nahinfrarot-Pulslaserquelle erzeugt. Mit der NSOM-Spitze wurde dann die Chipoberfläche in der Durchflusszelle abgetastet, um ein Bild eines 40 nm Goldpartikels in der Durchflusszelle zu erhalten, das mit der Polymerase verbunden war.
Der präinitiierte Primer-DNA-Komplex wurde dann mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 5 μl/min in die Durchflusszelle injiziert, sodass die "Klemme" um das Primer-Template-Molekül einen Komplex mit der immobilisierten Polymerase bildete. Die Durchflusszelle wurde durch eine in die Durchflusszelle eingebaute Kühlvorrichtung auf 25°C gehalten.
Der Laufpuffer wurde dann kontinuierlich mit einer Geschwindigkeit von 500 μl/min durch die Durchflusszelle gespült. Nach 10 Minuten wurde die Sequenzierungsreaktion durch Injektion von 0,4 mM dATP (8 μl) in den Puffer bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 500 μl/min initiiert. Nach 4 Minuten wurde 0,4 mM dTTP (8 μl) in die Durchflusszelle injiziert. Dann wurde nach weiteren 4 Minuten 0,4 mM dGTP (8 μl) injiziert, und nach weiteren 4 Minuten wurde 0,4 mM dCTP (8 μl) injiziert. Dieser Zyklus wurde dann 10 Mal wiederholt. Während der gesamten Zeitdauer wurde das Signal der Oberwellen erster Ordnung, das über die Multimode-Faser übertragen wurde, in einen Monochromator und anschließend in einen Photomultiplier weitergeleitet. Das Signal von dem Photomultiplier wurde dann verstärkt und zur Verarbeitung und Speicherung in einen Computer eingegeben.
Die Intensitätsänderung des Signals der Oberwellen erster Ordnung, das aus dem Polymerasekomplex für eine Dauer von 10 Sekunden von Beginn jeder Injektion ab entsteht, wurde dann berechnet und gegen das in die Durchflusszelle injizierte Nukleotid aufgetragen.
Die Ergebnisse der Sequenzierungsreaktion sind in 2 gezeigt. Wie anhand des Graphen ersichtlich ist, entsprechen große Intensitätsänderungen (größere Intensitätsänderungen belegen identische, miteinander benachbarte Nukleotide) dem Komplement von SEQ ID Nr. 1 (gelesen von rechts nach links, abzüglich des Teils, der mit der Primersequenz hybridisiert). SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Bestimmung der Sequenz eines Polynukleotids, das die Schritte: (i) In Kontakt bringen eines Polynukleotid-prozessierenden Enzyms, dass in einer festgelegten Position immobilisiert ist, mit einem Zielpolynukleotid unter Bedingungen, die zur Induktion der Enzymaktivität hinreichend sind; (ii) Detektieren eines aus der Wechselwirkung zwischen dem Enzym und dem Polynukleotid hervorgehenden Effekts umfasst, wobei der Effekt durch Messung eines nicht-linearen optischen Signals oder eines mit einem nicht-linearen Signal gekoppelten linearen Signals detektiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Effekt durch Messung eines nicht-linearen Signals detektiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die nicht-lineare optische Detektion eine Bildgebung durch Erzeugung von Oberwellen zweiter oder dritter Ordnung ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die nicht-lineare optische Detektion eine Raman-Spektroskopie oder oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ein dipolares Molekül auf dem oder in der Nähe des Enzyms angeordnet wird.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Molekül ein Styrylfarbstoffmolekül ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Molekül das Grün Fluoreszierende Protein ist.
Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei das dipolare Molekül mit den einzelnen Basen des Polynukleotids verbunden ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Enzym eine Polymerase ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Enzym ein Helicase- oder Primase-Enzym ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Schritt (i) die Zugabe der Nukleosidtriphosphate dATP, dTTP, dGTP und dCTP umfasst.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Nukleosidtriphosphate eine oder mehrere Blockierungsgruppe(n) umfassen, die selektiv durch monochromatisches Licht entfernt werden können.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ein Metallnanopartikel auf dem oder in der Nähe des Enzyms angeordnet wird.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Nanopartikel ein Gold- oder Silbernanopartikel ist.
Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei das Nanopartikel in eine oder mehrere der einzelnen Basen des Polynukleotids eingebaut ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Enzym auf einem festen Träger immobilisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei eine Mehrzahl von Enzymen auf dem festen Träger immobilisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, wobei der feste Träger eine aufgeraute Oberfläche aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei der Träger aus Gold oder Silber ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Detektion in Verbindung mit mit einer Rasterkraftmikroskopie oder einer optischen Nahfeld-Abtastmikroskopie durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das außerdem die Anwendung einer örtlich begrenzten Oberflächenplasmonresonanz umfasst.
Festes Trägermaterial, das mindestens eine immobilisierte Polymerase und mindestens ein dipolares Molekül umfasst, das auf oder in der Nähe der Polymerase angeordnet ist, wobei das dipolare Molekül eine Markierung ist, die eine zweite oder dritte Oberwelle und ein darauf beruhendes Signal erzeugt, zur Detektion unter Verwendung optischer Verfahren.
Bildgebende Systemanordnung zur Detektion eines nicht-linearen optischen Signals, die einen festen Träger umfasst, der ein darauf immobilisiertes Enzym, das mit einem Polynukleotid wechselwirkt, und ein auf dem oder in der Nähe des Enzyms angeordnetes, dipolares Molekül aufweist.