JPH08510562A - 核酸増幅生成物のリアルタイム検出装置 - Google Patents

核酸増幅生成物のリアルタイム検出装置

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Abstract

(57)【要約】 核酸増幅生成物のリアルタイム蛍光ベース測定を行なう装置を提供する。本発明の好ましい実施例では、励起ビームが反応混合物の表面を通って反応混合物中に合焦され、反応混合物は、（ｉ）第１蛍光信号を発生できる第１蛍光指標を含有し、第１蛍光信号の強度は、励起ビームにより照射される反応混合物の体積中の増幅生成物の量に強度が比例し、（ii）励起ビームにより照射される反応混合物の体積に比例する第２蛍光信号を発生できる反応混合物の全体に亘って均質に分散される第２蛍光指標を含有する。励起ビームは、反応混合物を含有する閉鎖反応チャンバの壁の部分を通ってレンズにより反応混合物中に合焦されるのが好ましい。励起ビームに応答して、それぞれ第１及び第２蛍光指標により発生される第１及び第２蛍光信号を収集するのに同じレンズが使用される。第１及び第２蛍光信号の蛍光強度の比は、増幅反応中に合成される増幅生成物の量の安定した量的指標を与える。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸増幅生成物のリアルタイム検出装置 本発明は、広くは、核酸増幅（nucleic acid amplification）の分野に関し、 より詳しくは、ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction；ＰＣＲ） のような核酸増幅法からポリヌクレオチド生成物をリアルタイムに測定する装置 に関する。 背景 核酸連続分析は、多くの研究分野、医療分野及び産業分野において重要性が増 している。例えば、Caskeyの「サイエンス（Science）２３６」（1987年）第122 3〜1228頁；Landegren等の「サイエンス（Science）２４２」（1988年、第２２ ９〜２３７頁）；及びArnheim等の「年刊評論誌生化学（Ann．Rev．Biochem.）6 1」（1992年、第１３１〜１５６頁）を参照されたい。幾つかの核酸増幅体系の 発展は、この傾向に重要な役割を演じてきた。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ ＰＣＲ）については、Innis等の「ＰＣＲプロトコル（PCR Protocols）」（Acad emic Press社、ニューヨーク、1991年）；McPherson等の「ＰＣＲ：実際的適用 （PCR:A Practical Approach）」（IRL Press社、オックスフォード、1991年） を、連結反応ベース増幅技術については、Baranyの「ＰＣＲ法及びその適用（PC R Meth-od and Applications）１」（1991年、第５〜１６頁）等を参照されたい 。 特に、ＰＣＲは、クローン化、遺伝子表現の分析、ＤＮＡ塩基配列決定、遺伝 子地図、薬剤発見等への適用において非常に重要な研究手段となっている。例え ば、Arnheim等の上記文献；Gilliland等の「Proc．Natl．Acad．Sci.，８７」（ 1990年、2725〜2729頁）；Bevan等の「ＰＣＲ法及びその適用１」（1992年、２ ２２〜２２８頁）；Green等の「ＰＣＲ法及びその適用１」（1991年、７７〜９ ０頁）；及びBlackwell等の「サイエンス２５０」（1990年、1104〜1110頁）を 参照されたい。 核酸増幅、特にＰＣＲを実施するための非常に多くの器具が開発されている。 例えば、Johnson等の米国特許第5,038,852号（「コンピュータ制御形熱サイクラ ー（computer-controlled thermal cycler）」）；Wittwer等の「核酸研究（Nu- cleic Acids Reserch）１７」（1989年、4353〜4357頁）（キャピラリチューブ ＰＣＲ）；Hallsbyの米国特許第5,187,084号（「空気ベース温度制御（air-base d temperature control）」）；Garner等の「バイオ技術（Biotechniques）１４ 」（1993年、第１１２〜１１５頁）（８６４枚のウェル板における高スループッ トＰＣＲ）；Wilding等の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ93/04039号（「微細加工構造 におけるＰＣＲ（PCR in micro-machined structure）」）；Schnipelsky等の欧 州特許第90301061.1（公開番号第0381501 A2号）（「使い捨て形単一使用ＰＣＲ 装置（disposable，single use PCR device）」）等を参照されたい。ＰＣＲ器 具開発に重要な設計目的の基礎として、微細温度制御、多試料熱サイクリングに おける試料−試料変異性（sample-to-sample variability）の最小化、前／後Ｐ ＣＲ処理段階の自動化、高速サイクリング、試料体積の最小化、増幅生成物のリ アルタイム測定、相互汚染又は試料排出の最小化等がある。より詳しくは、ＰＣ Ｒを閉鎖反応チャンバ内で行ない且つリアルタイムにモニタリングできる器具の 設計が強く望まれている。閉反応チャンバは相互汚染を防止する上で好ましい。 例えば、Higuchi等の「バイオテクノロジー（Biotechnology）１０」（1992年、 第４１３〜４１７頁）及び「バイオテクノロジー１１」（1993年、1026〜1030頁 ）；及びHolland等の「Proc．Natl．Acad．Sci.８８」（1991年、第7276〜7280 頁）を参照されたい。このような設計目的の成功裏の実現は、高頻度の偽陽性及 び偽陰性によってＰＣＲベース処置の価値を極めて低下させる虞れのある診断試 料の分析に特に望まれることは明らかである。濃い濃度の相対値は、ＰＣＲ中に 相対濃度値のヒストリーを考慮に入れることにより求められるため、ＰＣＲのリ アルタイムモニタリングにより、多ターゲット増幅（multi-target amplificati on）における出発ターゲットＤＮＡ濃度の一層正確な定量化が可能になる。また 、リアルタイムモニタリングは、ＰＣＲインヒビターが試料中に存在するか否か を示すＰＣＲの効率を評価することを可能にする。 上記Holland等の「Proc．Natl．Acad．Sci.８８」及び他の文献には、ＰＣＲ 中に増幅生成物のリアルタイム測定を行なう蛍光ベースアプローチが提案されて いる。このようなアプローチとして、（臭化エチジウムのような）挿入染料（i- ntercalating dyes）を用いて、存在する二重鎖ＤＮＡの量を表示するもの、又 は、蛍光生成物（その濃度は存在する二重鎖ＤＮＡの量に比例する）を放出させ るため増幅中に切断される蛍光発光−消光対を含むプローブを用いるもの（いわ ゆる「タック−マン（Tac-Man）」アプローチ）がある。 残念なことに、要求される蛍光測定は非常に高い蛍光バックグラウンドに対し て行なわなくてはならないので、これらのアプローチの成功裏の実施は妨げられ ている。かくして、加熱サイクル及び冷却サイクル中のチャンバ内の凝縮の形成 、光路内での気泡、溶液中の粒子又は屑片の形成、試料体積の差異（従って、信 号の発生及び吸収の差異）等の小さな器具雑音源であっても、蛍光信号の信頼性 のある測定を妨げている。 以上から、利用できる任意の核酸増幅体系から得られる増幅生成物の蛍光指標 （fluorescent indicators）の安定し且つ信頼性のあるリアルタイム測定が可能 な装置を提供することが望まれている。 発明の要約 本発明は、核酸増幅生成物のリアルタイム蛍光ベース測定を行なう装置に関す る。本発明の好ましい実施例では、励起ビームは反応混合物中に合焦され、該反 応混合物は、（ｉ）第１蛍光信号を発生できる第１蛍光指標を含有し、第１蛍光 信号の強度は、励起ビームにより照射される反応混合物の体積中の増幅生成物の 量に強度が比例し、（ii）励起ビームにより照射される反応混合物の体積に比例 する第２蛍光信号を発生できる反応混合物の全体に亘って均質に分散される第２ 蛍光指標を含有する。蛍光強度の比例性は、有機染料の蛍光発光に独立的に影響 を与える温度、ｐＨ、塩濃度等のパラメータの一定の組に対して定まる。 好ましくは、励起ビームは、反応混合物を収容する閉鎖反応チャンバの壁の部 分を通って、レンズにより反応混合物中に合焦される。更に好ましくは、励起ビ ームに応答してそれぞれ第１及び第２蛍光指標により発生される第１及び第２蛍 光信号を収集するのに、同じレンズが使用される。かくして、励起光学部品と収 集光学部品との不整合による収集信号の変異性が防止される。この実施例では、 レンズが、励起ビームを、反応混合物とは接触していない閉鎖反応チャンバの壁 の部分を通るように向ける。壁の前記部分は、レンズにより収集される蛍光信号 の光路内に反応混合物からの凝縮が形成されないように加熱され、これにより、 収集される信号中の別の変異性の原因が除去される。 最も好ましい実施例では、反応チャンバは、閉鎖端部（ここではチューブの底 部と呼ぶ）と、開放端部（ここではチューブの頂部と呼ぶ。漏洩防止シールが形 成されるようにキャップで閉鎖できる）とを有する。換言すれば、ひとたび反応 混合物をチューブ内に入れてキャップを取り付ければ、閉鎖反応チャンバが形成 される。この最も好ましい実施例では、（１）反応混合物がチューブの一部（一 般には、チューブの底部）を充填し、チューブのキャップと反応混合物の頂面と の間に空所が残されるようにし、（２）チューブの壁はつや消しにし（すなわち 、光を伝達し且つ散乱する材料でチューブの壁を作り）、（３）レンズは、キャ ップに接触することなく、キャップを通る励起ビームを、反応混合物の頂面を通 して反応混合物中に合焦させ且つ第１及び第２蛍光指標により発生される蛍光を 収集する。上記のように、励起ビームが通るチューブの部分（この実施例ではキ ャップ）は、収集される蛍光信号の測定における変異性の付加原因ともなる凝縮 の形成を防止すべく加熱される。第１及び第２蛍光信号の連続的分析から生じる ことがある潜在的変異性は、例えば荷電結合素子（ＣＣＤ）配列上に信号を回折 して、信号光をフォト検出器の配列上にスペクトル的に分離し、信号を同時に分 析することにより無くすことができる。 後でより完全に述べるように、単一光源（例えばレーザ）により発生される励 起ビームは、光ファイバにより、複数の閉鎖反応チャンバに便利に分散される。 同様に、複数の反応チャンバからの蛍光信号を同じ光ファイバで収集し、単一の 検出／分析装置により分析することもできる。 装置には核酸のＰＣＲ増幅を用いるのが好ましい。 本発明の装置は、増幅生成物の量に比例し且つ反応混合物の体積の変化とは無 関係に安定した蛍光信号を発生する装置及び蛍光試薬を設けることにより、核酸 増幅反応の正確なリアルタイムモニタリングを可能にする。増幅反応の進行を示 すデータが入手できると、目標核酸の相対出発濃度のより正確な見積り及び増幅 反応の効率の迅速な評価が可能になり、且つ少量の試薬の使用及びフィードバッ ク反応制御の可能性が開かれる。 図面の簡単な説明 第１図は、本発明の装置の試料インターフェース部品の好ましい実施例を示す 概略図である。 第２図は、光ファイバマルチプレクサを介して連続的識別反応により複数の増 幅反応を同時モニタリングする好ましい実施例を示す概略図である。 第３図は、テトラメチルローダミン蛍光指標、フルオレセイン蛍光指標、及び 後述の好ましい実施例のＣＣＤ配列により自記される機器バックグラウンドに関 するスペクトル的に分離された蛍光強度データを示す図面である。 第４図は、増幅生成物（第１蛍光指標）に比例するフルオレセイン染料及び一 般的なＰＣＲ中に第２蛍光指標として用いられるテトラメチルローダミン染料か らの蛍光信号の時間依存を示す図面である。 第５図は、フルオレセインの強度と、同じＰＣＲからのテトラメチルローダミ ン染料（その時間依存データが第３図に示されている）の強度との比のサイクル 依存を示す図面である。 第６図は、同じ目標核酸の異なる出発濃度をもつ別々のＰＣＲのサイクル数に 対する増幅生成物の量に関するデータを示す図面である。 定義 本願明細書で蛍光信号に関して使用する用語「安定（stable）」は、雑音（ノ イズ）による平方２乗偏差の平方根（root means square（ＲＭＳ）deviation） が平均信号の大きさの２％以下であることを意味する。より好ましくは、「安定 」は、雑音による信号のＲＭＳ偏差が平均信号の大きさの１％以下であることを 意味する。 発明の詳細な説明 本発明は、核酸増幅反応の進行をリアルタイムにモニタリングする蛍光ベース 装置である。本発明の装置に使用する増幅体系の形式は厳格でないが、一般に、 装置は、エキソヌクレアーゼ活性をもつ核酸ポリメラーゼ、又はモニタリングす る反応中に増加する二重鎖ＤＮＡの集団の使用を必要とする。本発明の装置に使 用できる増幅体系の例として、Walker等の「核酸研究２０」（1992年、第1691〜 1696頁）に記載されているように、ＰＣＲ、リガーゼ鎖反応（ligase chain re- action（ＬＣＲ））のようなリガーゼベース増幅体系、Ｑβレプリカーゼベース 増幅体系、鎖置換増幅（ＳＤＡ）等がある。核酸増幅体系についての分かりやす い説明が、Keller及びManakの「ＤＮＡプローブ（DNA Probes）」（第２版、Sto -ckton Press社、1993年、ニューヨーク）になされている。本発明の装置に必須 なことは、第１蛍光指標の蛍光強度と、ここで第２第２蛍光指標と呼ぶ内部基準 との比を測定することである。第１蛍光指標及び第２蛍光指標は、スペクトル的 に分解できなくてはならない。すなわち、これらのそれぞれの発光スペクトルが オーバーラップせず、結合スペクトル中に別々の発光ピークが充分観察されるも のでなくてはならない。一般に、装置には、例えば、複数の蛍光強度比をモニタ リングして、単一反応における幾つかの目標核酸の同時増幅をモニタリングでき るように、複数の第１蛍光指標を与えることができる。Fung等の米国特許第4,85 5,225号、Menchen等の米国特許第5,188,934号、Bergot等の国際出願ＰＣＴ／Ｕ Ｓ90/05565等には、このような実施例での使用に適したスペクトル的に分解可能 な幾つかの染料が開示されている。 本発明の装置は試料インターフェース（すなわち、閉鎖反応チャンバと関連作 動する光学部品）を有し、該試料インターフェースは、反応混合物中に励起ビー ムを合焦させ且つこの結果生じる蛍光を収集するためのレンズと、光源からレン ズに向かう励起ビーム及びレンズから検出／分析手段に向かう蛍光信号の両方を 伝達するための光ファイバとを有している。試料の相互汚染（いわゆる「キャリ ーオーバ」）を防止するため、反応混合物は閉鎖反応チャンバ内に収容するのが 好ましい。従って、レンズは、励起ビームを合焦させ且つ閉鎖反応チャンバの壁 の一部を通して蛍光を収集する。上記のように、好ましい反応チャンバは、例え ば慣用的なエッペンドルフチューブ（Eppendorf tube）の幾何学的形状及び体積 をもつチューブである。チューブは、該チューブの開放端にキャップを取り付け ることにより反応混合物を添加した後に閉じられる。ＰＣＲ用試料インターフェ ースの好ましい実施例では、レンズが、第１図に示すように、チューブのキャッ プを通して励起ビームを向け且つ蛍光を収集する。例示の構造では、光ファイバ ２の第１端部は、フェルール４、ハウジング６及びレンズ８と同心状のプレート １０内に保持されている。光ファイバの第２端部（図示せず）は、後で詳述する ように、光源及び検出／分析手段と関連作動する。光ファイバ２の端面とレンズ ８との間の距離は、光ファイバの開口数、チューブ１８の幾何学的形状、レンズ ８の焦点距離、レンズ８の直径等を含む幾つかのファクタにより決定される。任 意の特定実施例におけるこのような変数の値を選択するガイダンスは、光学設計 に関する標準テキスト（例えば、「光学ガイド（Optics Guide）５」（Mellers ，Griot，Irvine等。ＣＡ、1990年）等）において容易に見出される。例示の実 施例では、レンズ８は８mmの直径を有し且つEdmund Scientific社（ニュージャ ージ州、Barrington）から市販されている材料ＢＫ７で作られている。光ファイ バ２は、０.２の開口数を有する。この設計は、反応混合物２２への励起ビーム ２８の伝達が最大になるようにするのが好ましい。例えば、レンズ８、光ファイ バ２の開口数、及び光ファイバ２とレンズ８との間の距離は、レンズ８の直径が 励起ビーム２８の直径（励起ビーム２８が第１図に示すようにレンズに衝突する ところの直径）に等しいか大きくなるように選択される。励起ビーム２８は、キ ャップ１６、空所２４、反応混合物２２の頂面２６を通って、光ファイバの直径 の約１〜３倍の領域（例えば、表面２６から１〜３mm下の領域）に合焦される。 この合焦の度合いはこの実施例の厳格な特徴ではなく、重要なことは商業的に入 手できる熱サイクラーの試料ホルダの幾何学的形状及び寸法に試料インターフェ ースを適合させることである。他の実施例では、反応混合物中により鋭く合焦さ せる幾何学的形状及び寸法にすることができる。 本発明のレンズは、特定実施例に従って種々の形状にすることができる。例え ば、レンズは、例えばHlousekの米国特許第5,037,199号、Hoppe等の米国特許第4 ,747,87号、Morning等の米国特許第5,239,360号、Hirschfieldの米国特許第4,57 7,109号等に開示されているように、球形、截頭球形、円筒形、截頭円筒形、偏 球形、截頭偏球形等の形状にし且つ任意の透明屈折材料で作ることができ る。 励起ビーム２８により発生される蛍光は、励起ビーム２８により形成される光 路とほぼ同じ光路に沿ってレンズ８により収集され且つ光ファイバ２の端部上に 合焦されて、装置の光分離／分析部品に伝達される。 励起ビーム及び反応混合物成分の凝縮からの信号の散乱及び／又は吸収による 変異性を低減させるには、光伝達に使用される反応チャンバの壁の部分を加熱す る手段を試料インターフェースに設けることが好ましい。第１図の実施例では、 光伝達に使用される反応チャンバ（チューブ１８）の壁の部分はキャップ１６で ある。従って、キャップ１６を加熱するのに、加熱要素１２及び熱伝導プラテン １４が使用されている。加熱要素１２は、抵抗加熱要素と、キャップ１６の温度 のプログラム制御を可能にする温度センサで構成するのが好ましい。キャップ１ ６は、反応混合物の成分の凝縮点より高い温度に維持される。一般に、キャップ １６は９４〜１１０℃の範囲の温度に維持される。通常、反応混合物中の主要溶 媒は水であるので、キャップ１６は約１０２〜１０５℃の範囲の温度に維持され る。より好ましくは、キャップ１６は１０３℃に維持される。熱サイクリングを 用いる実施例では、上記キャップ加熱部品は、反応混合物２２の温度を周期的に 制御するのに使用される熱伝導部品２０から断熱しておくのが好ましい。 上記のように、チューブ１８の壁はつや消しにし、熱伝導部品２０の壁からの あらゆる偽反射を拡散又は散乱させて、このような反射によって信号が集合する 傾向を低減させるのが好ましい。 通常、エッチング又は粗面化加工により、半透明又は透明なチューブの壁が便 利につや消しされる。 上記部品に適した材料の選択は通常の機械技術者の良く知るところである。材 料選択の基準例として、（ｉ）特に熱サイクリングを用いた増幅体系に対する熱 膨張の度合い及び光学部品の整合に及ぼすその影響、（ii）励起波長及び使用す る蛍光物質の発光波長の光伝達特性、（iii）反応混合物の成分に対する反応チ ャンバの化学的不活性度合い、（iv）例えばポリメラーゼ、目標核酸等の重要な 反応成分がチャンバ壁上に吸着される度合い、（ｖ）光路内での蛍光材料の最小 化等がある。一般に、増幅反応混合物を収容するチューブは、ポリプロピレン等 の 材料で作られる。 第１図に示す試料インターフェースは個々に使用するか、第２図に概略的に示 すような単一器具における複数の同一インターフェースのうちの１つとして使用 することができる。図示の実施例では、ホルダ３０（該ホルダ３０は、例えば、 Mossa等の欧州特許出願第91311090.4号（公開番号第0488769 A2号）に記載され た熱サイクラー３２に関連する加熱ブロックで構成できる）に配列された個々の 試料インターフェース３１は、光ファイバ３４により光ファイバマルチプレクサ ３６に連結され、該光ファイバマルチプレクサは、例えばプログラムされたマイ クロプロセッサによる制御の下で、個々の光ファイバとポート３５との間で選択 的に伝達できるようにする。好ましい構造では、光源５２及びコントローラ５４ により発生された励起ビーム４１は、ビームスプリッタ４０を通り且つレンズ３ ８によりポート３５上に合焦される。ここで、励起ビーム４１は、光ファイバマ ルチプレクサ３６により、所定組（又は副組）の光ファイバ３４の各々に向けら れる。逆に、反応チャンバ内で発生された蛍光信号は、レンズ８により収集され 且つ光ファイバ上に合焦される。次に、光ファイバは、蛍光信号を、可能ならば 光ファイバマルチプレクサを介して、検出／分析手段に伝達する。第２図に戻っ て説明すると、試料インターフェースにより収集された蛍光信号は、光ファイバ マルチプレクサ３６に向けられ、ポート３５を通って光ファイバマルチプレクサ ３６から出て、レンズ３８により収集され且つ光軸に対して平行にされる。レン ズ３８は、蛍光信号をビームスプリッタ４０に向かわせ、該ビームスプリッタ４ ０は蛍光信号を選択的にカットオフフィルタ４２に向かわせる。カットオフフィ ルタ４２は、励起ビームからの光が信号検出部品に到達することを防止する。ビ ームスプリッタ４０は、慣用的なダイクロイックミラー又は励起ビームが通る孔 を備えた完全反射ミラー（例えば、米国特許第4,577,109号に開示されているよ うなミラー）等で構成できる。カットオフフィルタ４２を通過後、蛍光信号はレ ンズ４４によりスペクトル分析器に導かれる。スペクトル分析器は、蛍光信号を スペクトル的に分離し且つ信号の複数のスペクトル成分の強度を測定する。一般 に、スペクトル分析器は、蛍光信号をそのスペクトル成分に分離するためのプリ ズムのようなスペクトル部品及び回折格子等と、ダイオード配列、荷電結合素 子（ＣＣＤ）装置、バンドパスフィルタの配列及び光電子増倍管等のフォト検出 器の配列とからなる。第２図の好ましい実施例では、スペクトル分析器は、回折 格子４６（例えば、ニュージャージ州、Jobin-Yvon社のモデルCP-140）及びＣＣ Ｄコントローラ５０にリンクされたＣＣＤ配列４８（例えば、ニュージャージ州 、Princeton Instruments社のモデルS2135）からなる。 フルオレセイン及びテトラメチルローダミンからの蛍光信号を分析するのに適 した一例としてのＣＣＤ配列は、スペクトルの５００〜６５０nm領域に跨がる２ １個の収集ビンに区分される。各ビンは、８.５nm窓を超える光を収集する。他 の多くの構成を使用できることも明らかである。スペクトル分析のためのＣＣＤ 配列の適用例が、Karger等の「核酸研究１９」（1991年、第4955〜4962頁）に記 載されている。 蛍光信号の分析は、スペクトル分析器により収集されたデータに基づいて行う のが好ましい。なぜならば、１つ以上の第１及び第２蛍光指標（これらの指標か ら強度比が計算される）を、例えば多ビームスプリッタ、フィルタ及び光電子増 倍管の不整合により生じることがある波長特定装置の変異性を導入することなく 、同時に分析できるからである。また、スペクトル分析器は、「バーチャルフィ ルタ」の使用、すなわちフォト検出器の配列から得られるデータのプログラム操 作（該操作では、関連するマイクロプロセッサを介してのプログラム制御下で、 物理的バンドパスフィルタと同様に複数の別々の波長範囲がサンプリングされる ）が可能になる。この能力により、第１及び第２蛍光指標としての染料の選択に 高度のフレキシビリティが得られる。 一般に、検出／分析手段は、第１及び第２蛍光指標により発生される信号の強 度比を反映する読取り値が得られる任意の検出装置で構成できる。このような装 置は、米国特許第4,577,109号及び第4,786,886号及び「光技術の設計及び適用ハ ンドブック（The Photonics Design & Applications Handbook）第３９版）」（ 1993年、Laurin Publishing社、マサチューセッツ州、Pittsfield）に例示され ているように、当該技術分野で良く知られている。 本発明の装置はＰＣＲのモニタリングに使用するのが好ましいけれども、ＬＣ Ｒのような他の種々の増幅体系にも使用できる。ＰＣＲを行なうための説明及び ガイダンスは、例えば上記Innis等及びMcPherson等の文献を含む広範囲の文献に おいてなされている。簡単にいえば、ＰＣＲでは、ＤＮＡポリメラーゼを触媒と する一連の合成反応のプライマーとして、２つのオリゴヌクレオチドが使用され る。一般に、これらのオリゴヌクレオチドは異なるシーケンスを有し、且つ、（ ｉ）テンプレートすなわち目標ＤＮＡの対向鎖上にあり、（ii）増幅すべきＤＮ Ａのセグメントをフランキングするシーケンスを補完する。目標ＤＮＡは、１モ ルを大きく超える量の２つのオリゴヌクレオチド及び４つのデオキシヌクレオシ ド三リン酸（ｄＮＴＰ）の各々の存在下で加熱することにより、最初に変性が引 き起こされる。次に、反応混合物は、オリゴヌクレオチドプライマーをこれらの 目標シーケンスにアニーリングできる温度に冷却され、この後に、アニーリング されたプライマーがＤＮＡポリメラーゼと共に拡張（extend）される。次に、変 性、アニーリング及び拡張が多数回（一般に２５〜３５回）反復される。１回目 の増幅の生成物は次回の目標核酸として機能するので、各連続サイクルが、目標 ＤＮＡの量すなわち増幅生成物の量を本質的に倍化する。 前述のように、本発明の重要な特徴は、第１及び第２蛍光指標として使用され る蛍光染料にある。指標の蛍光強度の比を試験することにより、強度の点のみに おいて明らかな系統的な変異性の大部分の源の作用を無くすことができる。一般 に、本発明によれば、第１蛍光指標は錯体形成染料、又は信号を発生させる重合 化ステップ中に分解されるオリゴヌクレオチドプローブに共有結合された染料で 構成できる。この後者の実施例は、Holland等の「Proc．Natl．Acad．Sci.８８ 」（1991年、第7276〜7280頁）に記載されたいわゆる「Tacman」アプローチに関 する。染料に関連して本願で使用する用語「錯体形成（complex-forming」は、 染料が、二重鎖又は三重鎖核酸構造（通常、ＤＮＡ）をもつ安定した非共有結合 錯体を形成できること、及び染料の蛍光特性が、非錯体状態（すなわち、通常、 自由溶液（free-solution）状態）と比べて、錯体状態にある点で実質的に異な っていることを意味する。好ましくは、錯体形成染料の蛍光の量子効率は、自由 溶液状態と比べ、錯体状態において高められ、これにより錯体形成時に強い蛍光 が得られる。錯体形成染料の例として、Hoechst 33258及びHoechst 33342のよう な臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム（propidium iodide）、チアゾールオレ ン ジ、ダウノマイシン、メパクリン、４′，６′−ジアミニジノ−２−フェニリン ドール（ＤＡＰＩ）、オキサゾールオレンジ、ビスベンジミダグゾール（bisbe- nzimidaxole）染料、及びエチジウム、アクリジン、チアゾリウム及びオキサゾ リウム染料（これらの頭字語ＰＯＰＲＯ、ＢＯＰＲＯ、ＹＯＰＲＯ及びＴＯＰＲ Ｏとして知られている）のような種々の挿入染料がある。これらは、次の文献、 すなわち「蛍光プローブ及び調査薬品ハンドブック（Handbook of Fluorescent Pr-obes and Reserch Chemicals）」第５版（1992年、Molecular Probes，Inc. 社、Eugene、第２２１〜２２９頁、Haugland）；Srinivasan等の「電気泳動の理 論及び応用（Applied and Theoretical Electrophoresis）３」（1993年、第２ ３５〜２３９頁）；Kapuscinski等の「年刊生化学３」（1977年、第２５２〜２ ５７頁）；Hillの「年刊生化学７０」（1976年、第６３５〜６３８頁）；Setaro 等の「年刊生化学７１」（1976年、第３１３〜３１７頁）；Latt等の「J．Histo chem．Cyt-ochem.２４」（1976年、第２４〜３３頁）；及びRye等の「核酸研究 ２０」（1992年、第2803〜2812頁）に記載されている。第１蛍光指標として錯体 形成染料を用いる場合には、このような染料は、チアゾールオレンジ、臭化エチ ジウム及びＴＯＰＲＯからなる群から選択するのが好ましい。 第２蛍光指標として用いられる染料は、核酸特に二重鎖ＤＮＡの存在すなわち 二重鎖ＤＮＡとの関連により蛍光特性が実質的に影響を受けない蛍光染料である 。このような染料として、この基準を満たし且つ使用されるあらゆる第１蛍光指 標からスペクトル的に分解できる事実上全ての蛍光染料がある。好ましい第２蛍 光指標としてローダミン染料がある。より詳しくは、第２蛍光指標として、テト ラメチルローダミン又は２′，４′，５′，７′−テトラクロロ−４，７，−ジ クロロフルオレセインがあり、後者はMenchen等の米国特許第5,188,934号に開示 されている。 好ましい実施例では、Lee等の「核酸研究２１」（1993年、第3761〜3766頁） に記載されているように、第１及び第２蛍光指標は、両方共、オリゴヌクレオチ ドプローブに共有結合される。より詳しくは、第１蛍光指標としてフルオレセイ ンを使用し且つ第２蛍光指標としてテトラメチルローダミンを使用して、テトラ メチルローダミンの部分（moiety）が、フルオレセインの部分によるあらゆる蛍 光の発光を実質的に消光（クエンチング）するようにする。かくして、両染料が 同じオリゴヌクレオチドに付着すると、テトラメチルローダミンのみが蛍光信号 を発生することができる。オリゴヌクレオチドが、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ の５′−＞３′エキソヌクレアーゼ活性を介して切断され、２つの染料を分離す ると、フルオレセインは蛍光信号を発生できるようになる。この実施例では、励 起ビームは、アルゴンイオンレーザの４８８nm発光ラインから発生させるのが好 ましい。本発明によれば、ＰＣＲでは、この実施例における「自由」フルオレセ インの生成は、使用されるＤＮＡポリメラーゼを触媒とするＤＮＡ合成の量（従 って、増幅生成物の量）に比例する。この実施例では、第１蛍光指標はフルオレ セイン（例えば、Foster CityのApplied Biosystems社から市販されている６− ＦＡＭ）、第２蛍光指標はテトラメチルローダミン又は２′，４′，５′，７′ −テトラクロロ−４，７，−ジクロロフルオレセインとするのが好ましい。 本発明のこのようなオリゴヌクレオチドプローブは、多数のアプローチにより 合成できる。例えば、Ozaki等の「核酸研究２０」（1992年、第5205〜5214頁） ；Agrawal等の「核酸研究１８」（1990年、第5419〜5423頁）等を参照されたい 。オリゴヌクレオチドプローブは、ホスホルアミダイト化学（例えば、Applied Biosystems，Inc.社のモデル３９２又は３９４ＤＮＡ合成装置（カリフォルニア 州、Foster City））を用いた自動化された固相ＤＮＡ合成装置で合成される。 第１及び第２蛍光指標は、反応基を含むヌクレオシドホスホルアミダイトモノマ ーを用いることにより、オリゴヌクレオチドの所定のヌクレオチドに共有結合で きる。例えば、このような反応基は、リン酸基又はリン酸基類似基にあるもの（ 例えばAgrawal等の上記文献参照）、５′末端ヌクレオチドに付着する場合には ５′ヒドロキシルにあるもの（例えばFung等の米国特許第4,757,141号又はHobbs Jr．の米国特許第4,997,928号参照）、及び塩基部分にあるものでよい（例えば Ruthの米国特許第4,948,882号；Haralambidis等の「核酸研究１５（1987年、第4 857〜4876頁）；Urdea等の米国特許第5,093,232号；Cruic-kshankの米国特許第5 ,091,519号；Hobbs Jr．等の米国特許第5,151,507号等を参照）。ピリミジン部 分をもつヌクレオチドを誘導するのが最も好ましい。更に好ましくは、オリゴヌ クレオチドプローブの３′末端ヌクレオチドは、核酸ポリメラーゼによりブロ ックすなわち伸長できないようにされる。このようなブロッキングは、例えばHo rn及びUrdeaの「Tetrahedron Lett．２７％（1986年、第4705頁）に記載されて おり且つ５′リン酸−ＯＮ（商標）としてClontech Laboratories社（カリフォ ルニア州、Palo Alto）から市販されている試薬を用いて、リン酸基の付着によ り行なうのが便利である。好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブの長さは、 １５〜６０ヌクレオチドの範囲内にあるのが好ましい。より好ましくは、オリゴ ヌクレオチドプローブの長さは、１８〜３０ヌクレオチドの範囲内にある。 オリゴヌクレオチドプローブ内の第１及び第２蛍光指標の分離は、第１及び第 ２蛍光指標の性質、該蛍光指標が付着する態様、発光源等に基づいて変化できる 。所与の実施例についての適当な距離の選択に関するガイダンスを、蛍光分子と 消光分子（それぞれ、「ドナー分子」及び「アクセプタ」分子と呼ぶことがある ）との間の共鳴エネルギ伝播に関する多数の参考文献に見出すことができ、例え ば、Stryer及びHauglandの「Proc．Natl．Acad．Sci．５８」（1967年、第７１ ９〜７２６頁）；Cleggの「Meth．Enzymol ２１１」（1992年、第３５３〜388 頁）；Cardullo等の「Proc．Natl．Acad．Sci.８５」（1988年、第8790〜8794頁 ）；Ozaki等の上記文献；Hauglandの上記文献； Heller等の「Fed．Proc．４６ 」（1987年、第1968頁）等を参照されたい。第１及び第２蛍光指標は、第１蛍光 指標からの蛍光の実質的に全て（例えば９０％）が消光されるように、充分近い 関係にある必要がある。一般に、エネルギ伝播ベース消光については、第１蛍光 指標と第２蛍光指標との間の距離は１０〜１００オングストロームの範囲内にあ る必要がある。一実施例では、第１及び第２蛍光指標は、ヘアピン等のような介 在２次構造が存在しないという条件で、約４〜１０ヌクレオチドの間、より好ま しくは４〜６ヌクレオチドの間で分離される。好ましくは、第１蛍光指標又は第 ２蛍光指標のいずれかが、オリゴヌクレオチドプローブの５′に付着される。 他の実施例では、オリゴヌクレオチドプローブには、両端部に付着された第１ 及び第２蛍光指標が設けられる。この構成は、自由溶液中で、エネルギ伝播範囲 内で第１及び第２蛍光指標をもたらすランダムコイルを形成するより便利に合成 されるプローブを可能にする。かくして、非ハイブリッド形成状態では、励起さ れた蛍光部分が消光される。ハイブリッド形成状態では、エネルギ伝播が無視さ れて、励起された蛍光部分が蛍光を発することができるように、蛍光部分及び消 光剤が引き離される。 指標分子をオリゴヌクレオチドの５′又は３′末端に付着させるための多くの 連鎖部分及び方法があり、下記の参考文献、すなわちEckstein編「オリゴヌクレ オチド及び類似物：実際のアプローチ（Oligonucleotides and Analogues：A Pr -actical Approach）」（1991年、IRL Press社、Oxford）；Zu-ckerman等の「核 酸研究１５」（1987年、第5305〜5321頁）（オリゴヌクレオチドの３′チオール 基）；Sharma等の「核酸研究１９」（1991年、第3019頁）（３′スルフヒドリル ）；Giusti等の「ＰＣＲ法及び適用（PCR Methods and Applications２」（1993 年、第２２３〜２２７頁）；Fung等の米国特許第4,757,141号（カリフォルニア 州、Foster CityのApplied Biosystems社から市販されているAminolink（商標） による５′ホスホアミノ基）；Stabinskyの米国特許第4,739,044号（３′アミノ アルキルホスホリル基）；Agrawal等の「四面体文字（Tetrahedron Letters）３ １」（1990年、第1543〜1546頁）（ホスホルアミデート連鎖による付着）；Spro at等の「核酸研究１５」（1987年、第4837頁）（５′メルカプト基）；及びNels on等の「核酸研究１７」（1989年、第7187〜7194頁）（５′アミノ基）に例示さ れている。 合成中にオリゴヌクレオチドに付着できる市販の連鎖部分（例えば、Clontech Laboratories社（カリフォルニア州、Palo Alto）から市販されている）を使用 するのが好ましい。 例えばWoo等の米国特許第5,231,191号及びHobbs，Jr.の米国特許第4,997,928 号に記載されているように、ローダミン及びフルオレセイン染料は、ホスホルア ミデート部分で誘導される染料により、固相合成の終時にオリゴヌクレオチドの ５′ヒドロキシルに便利に付着される。 上記実施例に関連する実施例であって、第１蛍光指標が、第２蛍光指標ではな く他の非蛍光消光分子によりオリゴヌクレオチドプローブに付着される構成の実 施例を使用できることも明らかである。このような実施例では、第２蛍光指標は 、増幅生成物と相互作用しないスペクトル的に分解可能な事実上全ての蛍光染料 で形成できる。 実験 目標ＤＮＡの種々の出発濃度からＤＮＡコード化するβ−アクチンのＰＣＲ増 幅のリアルタイムモニタリング 目標ＤＮＡをコード化する人のβ−アクチンの２９６塩基対セグメントを、目 標ＤＮＡの５×１０3〜１×１０6コピーの範囲内の種々の出発量からＰＣＲによ り増幅した。次のプライマー及びプローブを使用した。 ここで、「ＦＡＭ」は、Fung等の米国特許第5,212,304号に従って、フルオレセ インの６炭素に付着したＮＨＳエステル基と、オリゴヌクレオチドの５′−末端 デオキシアデノシンに付着した５′−アミノリン酸とを反応させることにより、 オリゴヌクレオチドに結合されたフルオレセイン分子を示し、また、「ＴＭＲ」 は、Urdea等の米国特許第5,093,232号に開示されたアミノ連鎖剤により隣接チミ ジンの塩基部分に結合されたテトラメチルローダミン分子を示す。 ＰＣＲは、下記の成分を用いて、0.2mL MicroAmpチューブ（Perkin-Elmer社、 コネチカット州、Norwalk）内で行なった。使用した成分は、１０ｍＭ Tris-HCl 、ｐＨ８.３、５０ｍＭ ＫＣｌ、３.５ｍＭ ＭｇＣｌ2、２００μＭ、各ヌク レオシドトリホスフェート（相互汚染を防止すべく、米国特許第5,035,996号に 従って、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを用いる）、３００ｎＭ、各正プライマー 及び逆プライマー、AmpliTaq（Perkin-Elmer社、コネチカット州、Norwalk）で ある。この混合物には、１０ｎｇ／μＬで５μＬのRajiＤＮＡ（Applied Biosys tems社、コネチカット州、Foster City）、２μＬで５μＬのプローブ、及び１ 単位／μＬで１μＬのウラシルＮ−グリコシラーゼを添加し、反応体積を５１μ Ｌにした。加熱サイクル及び冷却サイクルは、本発明の試料インターフェース成 分を収容する試料ホルダカバーが設けられたモデル9600 Thermal Cycler（Perki n-Elmer社、コネチカット州、Norwalk）内で行なわれた。次の温度分布を使用し た。すなわち、 ５００℃で２分間保持し、９５℃で１０分間保持し、且つ次の温度（９２℃で、 １５秒間、５４℃で１５秒間、７２℃で１分間）を通じて４０回反復し、次に７ ２℃で保持した。 第３図は、上記指標として用いたフルオレセイン及びテトラメチルローダミン 染料及び装置の部外光源による蛍光の発光スペクトルのデータを示す。 第４図は、サイクル数の関数としてのフルオレセイン蛍光強度（fluorescein fluorescent intensity）及びテトラメチルローダミン蛍光強度のデータを示す 。強度における高周波数の振動は、２つの染料の蛍光発光の温度依存性を反映し ている。１０サイクルと２８サイクルとの間での両染料についてのベースライン 蛍光の増大は、装置ベースの変化である。同じデータからのテトラメチルローダ ミン蛍光強度に対するフルオレセイン蛍光強度の比を示す第５図において、装置 ベースの変化は無くなり、読取り信号の変動のＲＭＳ（すなわち蛍光強度の比） は、測定した比の平均大きさの１％より小さい。 第６図は、図示のように5000目標分子から１０6目標分子の範囲の両から出発 するβアクチンＤＮＡのＰＣＲからのデータを示す。
【手続補正書】 【提出日】１９９６年３月７日 【補正内容】 【図２】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 9453−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 ボードナー ケヴィン エス アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94403 サン マテオ イースト フォー ティフォース プレイス 44 アパートメ ント シー (72)発明者 コーネル チャールズ アール アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94062 レッドウッド シティー キング ストリート 167 (72)発明者 ガンツ アレン エム アメリカ合衆国 コネチカット州 06611 トランバル スターリング ロード 145 (72)発明者 マックブライド リンカーン ジェイ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94002 ベルモント アラメーダ デ ラ ス プルガス 400 (72)発明者 サヴィアーノ ポール ジー アメリカ合衆国 コネチカット州 06850 ノーウォーク ヒルクレスト プレイス １ (72)発明者 シゲウラ ジョン アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94536 フリーモント キーストーン ド ライヴ 5110 (72)発明者 トレイシー ディヴィッド エイチ アメリカ合衆国 コネチカット州 06850 ノーウォーク ベルドン ヒル ロード 581 (72)発明者 ヤング ユージーン エフ アメリカ合衆国 コネチカット州 06850 ウィルトン ランバート コモン 34 (72)発明者 リー リンダ ジー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94303 パロ アルト ステーリング ド ライヴ 3187

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニタリングする装置において、 増幅生成物を合成すべく核酸増幅反応を行なうための反応混合物と、 光ファイバにより伝達される励起ビームがレンズにより反応混合物の体積中 に合焦されるように、レンズと同心状に配置された光ファイバからなる試料イン ターフェースと、 第１蛍光信号を発生できる第１蛍光指標とを有し、第１蛍光信号の強度は励 起ビームにより照射される反応混合物の体積中の増幅生成物の量に比例し、 反応混合物の全体に亘って均質に分散され且つ励起ビームにより照射される 反応混合物の体積に比例する第２蛍光信号を発生できる第２蛍光指標を更に有し 、 試料インターフェースのレンズが、第１及び第２蛍光信号の一部を収集し且 つ該部分を光ファイバ上に合焦させ、光ファイバが前記部分を検出／分析手段に 伝達することを特徴とする装置。 ２．前記第１蛍光信号が或る強度を有し且つ前記第２蛍光信号が或る強度を有し 、前記検出／分析手段が、前記第１蛍光信号の強度と第２蛍光信号の強度との比 からなる読取りを与えることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の装置。 ３．前記第１蛍光指標が錯体形成染料であることを特徴とする請求の範囲第２項 に記載の装置。 ４．前記装置は複数の前記試料インターフェースからなり、該試料インターフェ ースの前記各光ファイバが、前記レンズと同心状に配置される第１端部及び光フ ァイバマルチプレクサに連結される第２端部を備えていることを特徴とする請求 の範囲第３項に記載の装置。 ５．前記反応混合物は閉鎖反応容器内に収容され、前記レンズは、前記励起ビー ムを閉鎖反応容器の壁の部分を通して前記反応混合物中に合焦させ、前記壁の部 分は加熱されて、該部分に前記反応混合物の成分が凝縮することを防止すること を特徴とする請求の範囲第３項に記載の装置。 ６．前記閉鎖反応容器がつや消しチューブであることを特徴とする請求の範囲第 ５項に記載の装置。 ７．前記装置が複数の前記第１蛍光指標を有し、各第１蛍光指標が異なる前記増 幅生成物に対応することを特徴とする請求の範囲第３項に記載の装置。 ８．前記増幅反応がポリメラーゼ鎖反応であることを特徴とする請求の範囲第３ 項に記載の装置。 ９．前記増幅反応がリガーゼ鎖反応であることを特徴とする請求の範囲第３項に 記載の装置。 10．前記増幅反応がポリメラーゼ鎖反応であり、前記第１及び第２蛍光指標が、 前記増幅生成物の鎖の部分を補完するヌクレオチド配列を備えたオリゴヌクレオ チドに共有結合され、前記第２蛍光指標が前記第１蛍光指標の蛍光を消光するこ とを特徴とする請求の範囲第２項に記載の装置。 11．前記装置が複数の前記試料インターフェースを有し、該試料インターフェー スの前記各光ファイバが、前記レンズと同心状に配置される第１端部及び光ファ イバマルチプレクサに連結される第２端部を備えていることを特徴とする請求の 範囲第１０項に記載の装置。 12．前記反応混合物は閉鎖反応容器内に収容され、前記レンズは、前記励起ビー ムを閉鎖反応容器の壁の部分を通して前記反応混合物中に合焦させ、前記壁の部 分は加熱されて、該部分に前記反応混合物の成分が凝縮することを防止すること を特徴とする請求の範囲第１０項に記載の装置。 13．前記閉鎖反応容器がつや消しチューブであることを特徴とする請求の範囲第 １２項に記載の装置。 14．前記装置が複数の前記第１蛍光指標を有し、各第１蛍光指標が異なる前記増 幅生成物に対応することを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の装置。
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