JP2002506654A - ヌクレオチド配列を検出するための方法と装置 - Google Patents

ヌクレオチド配列を検出するための方法と装置

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JP2002506654A JP2000536883A JP2000536883A JP2002506654A JP 2002506654 A JP2002506654 A JP 2002506654A JP 2000536883 A JP2000536883 A JP 2000536883A JP 2000536883 A JP2000536883 A JP 2000536883A JP 2002506654 A JP2002506654 A JP 2002506654A
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primer
microtiter plate
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JP2000536883A
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ベルトリング，ボルフ
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ノーベンバー・アクチェンゲゼルシャフト・ゲゼルシャフト・フュール・モレクラーレ・メディツィーン
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Publication date
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer

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Abstract

(57)【要約】 本発明は蛍光を使ってヌクレオチド配列を検出する方法に関する。本発明方法によれば、検出しようとするヌクレオチド配列（Ｎ）の存在下で、第１の分子（Ｆ１）と第２の分子（Ｆ２）の間に、直接的エネルギー移動によってまたは放射を伴わずに可能になった相互作用が起こる。それらの分子（Ｆ１、Ｆ２）の少なくとも一方は、汚染を避け、本方法の感度を向上させるために、固相（Ｍ）の表面に結合される。

Description

【発明の詳細な説明】
（技術分野) 本発明は請求項１の前文に記載の方法に関する。また、その方法を実施するた
めのマイクロタイタープレートとキットに関する。 （背景技術） US 4,996,143とDE 195 81 489 T1には、第１および第２のプライマーが、検出
しようとするヌクレオチド配列に、２〜７ヌクレオチド離して結合される方法が
開示されている。第１および第２のプライマーにはそれぞれ蛍光分子が与えられ
る。結合した状態では、フェルスター効果により、一方の蛍光分子から他方の蛍
光分子への無放射エネルギー移動が観察される。これは特有の蛍光を生じる。こ
の既知の方法は特に高感度なわけではない。
【０００１】 US 5,607,834には、ヘアピンループを持つプライマーをヌクレオチド配列の検
出に使用することが開示されている。この場合、蛍光分子と消光体は、そのヘア
ピンループのループ部分に互いに相対して与えられる。この蛍光分子と消光体の
間の距離は、蛍光を消光する無放射エネルギー移動を可能にする。しかし、プラ
イマーが相補鎖とハイブリダイズすると、そのヘアピンが開かれる。蛍光を消光
する蛍光分子と消光体の間の空間的関係が変化する。こうして蛍光が観察できる
。
【０００２】 WO 93/09250には、第１のプライマーが第１の相に結合される増幅法が開示さ れている。第２のプライマーは蛍光色素で標識される。検出しようとするヌクレ
オチド配列が存在する場合、標識された第２のプライマーが固相に蓄積する。十
分に識別性のあるシグナルを固相上で認識するには、ＰＣＲ後に洗浄段階を行な
う必要がある。この段階には余分な労力が要求される。その上、この段階を行な
っている間に汚染物質が混入する可能性もある。
【０００３】 本発明の目的は先行技術の短所を取り除くことである。具体的には、本発明は
、向上した感度を持ち、汚染の可能性が低く、簡単かつ安価に実施できる方法を
提供しようとするものである。さらにまた、検出しようとするヌクレオチド配列
の濃度は、可能な限り効率のよい方法で決定されるべきである。
【０００４】 この目的は請求項１と１９の特徴によって達成される。請求項２〜１８および
請求項２０〜３４の特徴から適当な態様が得られる。
【０００５】 本発明では少なくとも一つの蛍光分子が固相の表面に結合される。この方法で
は、検出しようとするヌクレオチド配列を定性的または定量的に測定することが
できる。少なくとも一つの蛍光分子が固相に結合されるという事実から、簡単な
蛍光測定（具体的にはオンライン検出）が可能である。この方法は、汚染の危険
を増加させる洗浄段階を省くことができるので、簡単かつ安価に行なうことがで
きる。
【０００６】 具体的一態様では、第１のプライマーが固相に結合される。第１のプライマー
を介して第１の蛍光分子を固相に結合することができる。この場合、第１のプラ
イマーはヘアピンループを持つことが好ましく、第１の蛍光分子は一方のループ
部分に結合され、第２の蛍光分子は相互作用が起こりうる距離で、他方のループ
部分に向かい合って結合される。その相互作用は、第１のプライマーに相補的な
相補鎖とのハイブリダイゼーションによって、あるいは第１のプライマー上で起
こる合成によって都合よく排除される。上述の方法はさらに汚染の可能性も減少
させる。
【０００７】 本発明のもう一つの態様として、第２の蛍光分子を第２のプライマーに結合さ
せてもよい。しかし、第２の蛍光分子を備えたヌクレオチドまたはもう一つの核
酸配列を合成鎖に組み込むこともできる。第２のプライマーは溶解状態にある。
増幅と変性の後、相互作用が生じるような形で、第１のプライマーと第２のプラ
イマーが都合よくハイブリダイズされる。ハイブリダイズさせた状態での第１の
蛍光分子と第２の蛍光分子の間の距離は、好ましくは２〜１２ヌクレオチドであ
る。本法の上記の変法はとりわけ高感度である。
【０００８】 固相は例えばポリカーボネート、ポリカルベン、トリメチルチオフェン（trim
ethylthiopene）および／またはトリアミノベンゼンおよび／または炭素繊維な どのポリマー（好ましくは導電性のもの）からなりうる。固相はマイクロタイタ
ープレートであることが特に好都合なことがわかっている。
【０００９】 ある態様のさらにもう一つの特徴として、第１の分子は受容基であり、第２の
蛍光分子は供与基である。その受容基は６-カルボキシテトラメチルローダミン 、供与基は６-カルボキシフルオレセインでありうる。他の好適な供与体／受容 体対は、次の表からわかる。
【００１０】
【表１】
【００１１】 当然、第１の蛍光分子と第２の蛍光分子は交換できる。ある態様のさらにもう
一つの特徴として、第１または第２の蛍光分子を消光体（好ましくは４-［４'- ジメチルアミノフェニルアゾ］安息香酸によって形成される消光体）で置き換え
ることができる。
【００１２】 好適な消光体／蛍光体対は、次の表からわかる。
【００１３】
【表２】
【００１４】 検出しようとするヌクレオチド配列の濃度を決定するために、データ処理シス
テムに接続したフルオロメーターを使って蛍光を記録し、検出しようとするヌク
レオチド配列の濃度を経時的な蛍光強度の変化から決定できる。使用する基準点
は、実施した増幅サイクル数に対する蛍光強度の二次導関数であることが好まし
い。
【００１５】 本装置に関する解決策によれば、多数のウェル形のくぼみを持ち第１の分子が
結合される上面を持つマイクロタイタープレートが、本発明の方法を実施するた
めに提供される。その上面には第１のプライマーを結合させることができ、第１
の分子は第１のプライマーを介してその表面に結合させると好都合である。さら
にもう一つの態様では、第１のプライマーがヘアピンループを持ち、第１の分子
は一つのループ部分に結合され、第２の蛍光分子は相互作用が起こりうる距離で
、もう一つのループ部分に向かい合って結合される。
【００１６】 本装置に関するもう一つの態様として、本発明のマイクロタイタープレートと
、第２の分子を備えたプライマーとを含むキットが提供される。
【００１７】 以下、図面を参照して、本発明の方法をより詳細に説明する。 図１では、第１のプライマーＰ１がポリカーボネートまたはポリプロピレン製
のマイクロタイタープレートＭのくぼみ内で上面に結合されている。マイクロタ
イタープレートＭは制御された抵抗加熱機構を含みうる。それが抵抗過熱機構自
体の一部であってもよい。第１の蛍光分子Ｆ１は第１のプライマーＰ１に結合さ
れる。
【００１８】 標的ＤＮＡ中に存在する検出すべき核酸配列Ｎと、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を行なうのに必要な他の成分と、その
くぼみにピペットで入れる。後者には、具体的には第２のプライマーＰ２と、そ
れに結合した第２の蛍光分子Ｆ２が含まれる。標的ＤＮＡを変性させる（すなわ
ち鎖Ｓと相補鎖Ｃに分離させる）。
【００１９】 次に温度を５０℃〜６０°に下げる。鎖Ｓは第１のプライマーＰ１の相補配列
セグメントと結合する。相補鎖Ｇは液中に存在する第２のプライマーＰ２に結合
する。次に、それぞれに欠けている配列セグメントがＴａｑ ＤＮＡポリメラー
ゼを使って合成される。次に、蛍光分子Ｆ１、Ｆ２を含む合成鎖が一本鎖として
（すなわち合成鎖ＳＳ１および合成相補鎖ＳＣ１として）液中に存在するように
、温度が９４℃に上げられる。第２の蛍光分子Ｆ２は、第２のプライマーＰ２を
介してではなく、ヌクレオチドまたは別の核酸配列に結合された形で合成鎖ＳＳ
１に組み込まれてもよい。温度を５０〜６０°に下げる。合成鎖ＳＳ１と合成相
補鎖ＳＣ１は、第１の蛍光分子Ｆ１と第２の蛍光分子Ｆ２とが６〜１２ヌクレオ
チドの距離に存在するように、ハイブリダイズする。これを図２に図示する。
【００２０】 供与体として設計された第１の蛍光分子Ｆ１を励起すると、受容体として作用
する第２の蛍光分子Ｆ２への無放射エネルギー移動が起こる。その結果、増加し
た蛍光が第２の蛍光分子Ｆ２で観察される。蛍光は蛍光計を使って検出される。
測定値はデータ処理システムに送信される。
【００２１】 第１のプライマーＰ１はヘアピンループを示してもよく、第１の蛍光分子Ｆ１
は第１のループ部分に結合され、消光体は相互作用が起こりうる距離で、向かい
合ったループ部分に結合される。ヘアピンループが閉じられると、相互作用が蛍
光の消光を引き起こす。第１のプライマーＰ１に相補的な相補鎖Ｃとのハイブリ
ダイゼーションの結果として、または第１のプライマーＰ１上で起こる合成によ
り、ヘアピンループが開かれる。蛍光分子と消光体の間の相互作用が解消される
。蛍光分子の励起が蛍光をもたらす。
【００２２】 次いで、温度を上昇させることによって次のＰＣＲサイクルが開始される。合
成鎖ＳＳ１と合成相補鎖ＳＣ１がさらに増幅され、その結果、蛍光強度が増す。
【００２３】 ＰＣＲまたはＬＣＲサイクル数に対する蛍光強度の変化は標的ＤＮＡの初期濃
度の尺度であり、試料がより多くの標的ＤＮＡを含有するほど、蛍光強度はより
迅速に増加する。
【００２４】 上述の方法を実施するために、ポリカーボネート製またはポリプロピレン製の
マイクロタイタープレートＭが使用される。第１のプライマーＰ１はウェル領域
にてその５'末端でマイクロタイタープレートの上面に、好ましくは６ＣＨ2基か
らなるリンカーを介してポリプロピレン表面に結合される。第１のプライマーＰ
１はWeiler-J.とHoheisel-JD.の方法（Anal.-Biochem.,1996；243(2)：218-27）
によってポリプロピレン表面に結合される。
【００２５】 図４は本方法のもう一つの変法を示している。この変法では、第１の蛍光分子
Ｆ１が固相（すなわちマイクロタイタープレートＭの上面）に直接結合される。
第１のプライマーＰ１は第１の蛍光分子Ｆ１に近接して固相に結合される。合成
鎖ＳＳ１または合成相補鎖ＳＣ１のハイブリダイゼーション後、励起は第１の蛍
光分子Ｆ１（供与体）から第２の蛍光分子Ｆ２（受容体）への無放射エネルギー
移動をもたらし、そこで蛍光が生じる（図５）。
【００２６】 図６は３'-蛍光体が取り付けられているプライマーを使ったＰＣＲのＰＣＲ産
物の蛍光を示している。ＰＣＲ産物の蛍光は４９６ｎｍの励起波長と５７６ｎｍ
の発光波長で相対蛍光単位（ＲＦＵ）として測定された。「ＰＣＲ（テンプレー
ト無）」という試料はＨＧＨテンプレートＤＮＡ無しで２５サイクル後のＰＣＲ
調製物である。「ＰＣＲ（テンプレート有）」という試料はＨＧＨテンプレート
ＤＮＡを含む２５サイクル後のＰＣＲ混合物である。右側のカラムはテンプレー
トＤＮＡを含むが温度サイクルを行なわなかったＰＣＲ混合物を示す。
【００２７】 図６から、このテンプレートが本発明の方法を使って容易に、特に洗浄段階を
必要としないで、検出できることが明らかにわかる。
【００２８】
【実施例】
実施例１：３'-蛍光体が取り付けられているプライマーのＰＣＲ産物における
蛍光エネルギー移動 ３'-末端区域が蛍光基で標識された２つのプライマーを合成した。
【００２９】 長さが２３塩基の第１のプライマーは次の配列を持つ： ５'-ACCAGGAGTTTGTAAGCTCTTGG-３'。
【００３０】 ３'-末端から４番目のチミジン（上の配列で太字の部分）は６-カルボキシフ ルオレセイン（６-ＦＡＭ）で標識される。ＦＡＭ基はオリゴヌクレオチド合成 中に組み込まれるｄＴ-Ｃ２-ＮＨ２のアミノ基を介して結合される。
【００３１】 長さが１９塩基の第２のプライマーは次の配列を持つ： ５'-ビオチン-CCTGATGCGCACCCATTCC-３'。
【００３２】 3'末端から3番目のチミジン（上の配列で太字の部分）はカルボキシメチルロ ーダミン（ＴＡＭＲＡ）で標識される。ＴＡＭＲＡ基はオリゴヌクレオチド合成
中に組み込まれるｄＴ-Ｃ２-ＮＨ２のアミノ基を介して結合される。第２のプラ
イマーは５'-末端がビオチン基で標識される。
【００３３】 合成は0.2μmol規模で行なわれる。それらのプライマーはＨＰＬＣで精製され
る。これらのプライマーの配列はヒト成長ホルモン遺伝子（ＨＧＨ遺伝子）の配
列セグメントのすぐ近くにある。 第１のプライマー： ５'-ACCAGGAGTTTGTAAGCTCTTGG-３' ＨＧＣ： ５'-ACCAGGAGTTTGTAAGCTCTTGG- GGAATGGGTGCGCATCAGG-３' ３'-TGGTCCTCAAACATTCGAGAACC- CCTTACCCACGCGTAGTCC-５' 第２のプライマー： ３'-CCTTACCCACGCGTAGTCC-ビオチン-５' 第１と第２のプライマーを、ＨＧＨ遺伝子の配列セグメントをカバーするテン
プレートＤＮＡを用いたＰＣＲで反応させる。このＰＣＲはそれぞれ、適切なＰ
ＣＲ緩衝液中、０.５μＭのプライマー、２単位のＴａｑ-ＤＮＡポリメラーゼお
よび１μｌのＨＧＨ遺伝子（１０ｎｇ）を使って５０μlの総液量で行なわれる （全ての溶液と酵素はBoehringer Mannheim社から入手）。６６℃のアニーリン グ温度（４５秒）、７２℃の伸長温度（４５秒）および９４℃の変性温度（３０
秒）で２５サイクル行なう。
【００３４】 陰性対照として、同じＰＣＲをテンプレートＤＮＡを使用しないで行なう。さ
らにもう一つの対照として、ＰＣＲ混合物を４℃に放置する。
【００３５】 このＰＣＲは、第１のプライマーと第２のプライマーの蛍光体が数塩基の距離
で反対の向きを持つ鎖に配されたＰＣＲ産物の形成をもたらす。
【００３６】 FAM ５'-ACCAGGAGTTTGTAAGCTCTTGG-GGAATGGGTGCGCATCAGG-３' ３'-TGGTCCTCAAACATTCGAGAACC-CCTTACCCACGCGTAGTCC-ビオチン-５' TAMRA ４９６ｎｍでの５-ＦＡＭ基の適当な励起は、相補鎖上にあって５７６ｎｍの 発光極大を持つＴＡＭＲＡ基への蛍光エネルギー移動をもたらす。
【００３７】 ＰＣＲ産物の形成と蛍光エネルギー移動を検出するために、蛍光分光計にて、
４９６（±１０ｎｍ）の励起波長と５７６ｎｍ（±１０ｎｍ）の発光波長で蛍光
を測定する。ＰＣＲにより、ＴＡＭＲＡ基の蛍光が増加する（図６）。この蛍光
の増加は予想されるＰＣＲ産物の形成を示す。
【００３８】 実施例２：３'-標識された固定化プライマーを用いるＰＣＲ 実施例１に記載のプライマーを、３'-標識された固定化プライマーを用いるＰ
ＣＲにも使用した。５'-ビオチン化された実施例１の第２プライマーを、直径約
２.８μｍのサイズを持つストレプトアビジン被覆超常磁性粒子（Ｍ-280 Dynabe
ads、Dynal社、ハンブルク）に、ＰＣＲによって結合させる。この目的を達する
ために、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７.４）に懸濁した粒子（１０μg/ μl、６.７×１０8粒子／ｍｌ）をＢ／Ｗ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、２Ｍ ＮａＣｌ）（ｐｈ７.５）で洗浄し、濃度をＢ／Ｗ緩衝液中、５
μｇ／μｌにする。この懸濁液のうち２０μｌを、蒸留水中のプライマー２の５
０μＭ溶液等量で処理する。その懸濁液を室温で穏やかに振とうしながら１時間
インキュベートする。粒子をまず１００μｌのＢ／Ｗ緩衝液で２回洗浄し、次に
１０ｍＭトリス塩酸、０.２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）（ＴＥ）で洗浄することに
よって、未結合のプライマーを除去する。それらの粒子を１０μｇ／μｌの懸濁
液として、ＴＥ中に４℃で保存する。
【００３９】 超常磁性粒子に結合した第２のプライマーを用いるＰＣＲを実施例１と同様に
行なう。実施例１とは異なり、粒子結合型プライマー２の懸濁液１μｌを、遊離
型第２プライマーの代わりに使用した。ＰＣＲ後、粒子をＴＥで繰り返し洗浄し
、蛍光顕微鏡で分析した。調べたのは、６-ＦＡＭ標識された第１プライマーの それら粒子への付着である。図７Ａは終了後の粒子の蛍光を示す。図７Ｂに示す
ＰＣＲ混合物は、ＦＡＭ標識された第１プライマーの粒子への付着によって起こ
る粒子の蛍光を示している。この蛍光はテンプレートＤＮＡ無しの対照には存在
しない（図７Ｄ）。
【００４０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 標的ＤＮＡの鎖および相補鎖の第１および第２のプライマーとの
対形成を示す図。
【図２】 合成されたプライマーのハイブリダイゼーション。
【図３】 蛍光分子の励起。
【図４】 本方法のもう一つの変法における標的ＤＮＡの鎖と相補鎖の対形
成。
【図５】 図４の変法による蛍光分子の励起。
【図６】 ヌクレオチド標識を持つおよび持たない検出用ヌクレオチドの蛍
光。
【図７】 ａ：暗視野像で見た、テンプレートＤＮＡを用いたＰＣＲ後に第
２のプライマーに結合した粒子。ｂ：蛍光顕微鏡写真で見た、図７ａの粒子。ｃ
：暗視野像で見た、テンプレートＤＮＡなしのＰＣＲ後に第２のプライマーに結
合した粒子。ｄ：蛍光顕微鏡写真で見た、図７ｃの粒子。
【符号の説明】
Ｓ 鎖 Ｃ 相補鎖 Ｐ１ 第１のプライマー Ｐ２ 第２のプライマー Ｆ１ 第１の蛍光分子 Ｆ２ 第２の蛍光分子 ＳＳ１ 合成鎖 ＳＣ１ 合成相補鎖 Ｍ マイクロタイタープレート Ｎ ヌクレオチド配列
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年６月７日（２０００．６．７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA01 CA20 HA08 HA11 HA14 4B029 AA07 BB20 FA15 4B063 QA01 QA13 QQ41 QQ42 QR08 QR42 QR62 QR63 QR66 QR84 QS02 QS25 QS34 QX02

Claims (34)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 検出しようとするヌクレオチド配列（Ｎ）が存在する場合は
    、第１の蛍光分子（Ｆ１）と第２の蛍光分子（Ｆ２）の間の無放射または直接エ
    ネルギー移動を可能にする相互作用が生成または排除される、蛍光を使ってヌク
    レオチド配列（Ｎ）を検出する方法であって、その蛍光分子（Ｆ１、Ｆ２）の少
    なくとも一つが固相（Ｍ）に結合されることを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】 第１のプライマー（Ｐ１）が固相（Ｍ）に結合される請求項
    １に記載の方法。
  3. 【請求項３】 第１の蛍光分子（Ｆ１）が第１のプライマー（Ｐ１）を介し
    て固相（Ｍ）に結合される上記請求項の一項に記載の方法。
  4. 【請求項４】 第１のプライマー（Ｐ１）がヘアピンループを持ち、第１の
    蛍光分子（Ｆ１）が一つのループ部分に結合され、第２の分子は相互作用が起こ
    りうる距離で、もう一つのループ部分に向かい合って結合される請求項３に記載
    の方法。
  5. 【請求項５】 上記の相互作用が第１のプライマー（Ｐ１）に相補的な相補
    鎖（Ｃ）とのハイブリダイゼーションによってまたは第１のプライマー（Ｐ１）
    上で起こる合成によって排除される請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 第２の蛍光分子（Ｆ２）がもう一つのプライマー（Ｐ２）に
    結合される上記請求項の一項に記載の方法。
  7. 【請求項７】 第２の蛍光分子（Ｆ２）を備えたヌクレオチドまたはもう一
    つの核酸配列が合成鎖（ＳＳ１）に組み込まれる上記請求項の一項に記載の方法
    。
  8. 【請求項８】 増幅と変性の後、相互作用が生成するような形で第１のプラ
    イマー（Ｐ１）と第２のプライマー（Ｐ２）がハイブリダイズされる上記請求項
    の一項に記載の方法。
  9. 【請求項９】 ハイブリダイズさせた状態での第１の蛍光分子（Ｆ１）と第
    ２の蛍光分子（Ｆ２）の間の距離が２〜１２ヌクレオチドである上記請求項の一
    項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 固相（Ｍ）がポリマー（好ましくは導電性ポリマー）から
    なる上記請求項の一項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 ポリマーがポリカーボネート、トリメチルチオフェン、ト
    リアミノベンゼンおよび/またはポリカルベンおよび/または炭素繊維からなる請
    求項１０に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 固相がマイクロタイタープレート（Ｍ）である上記請求項
    の一項に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 第１の蛍光分子（Ｆ１）または第２の蛍光分子（Ｆ２）が
    消光体（好ましくは４-［４'-ジメチルアミノフェニルアゾ］安息香酸によって 形成される消光体）で置き換えられる上記請求項の一項に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 第１の蛍光分子（Ｆ１）が供与基であり、第２の蛍光分子
    （Ｆ２）が対応する受容基である上記請求項の一項に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 受容基が６-カルボキシテトラメチルローダミン、テトラ メチルローダミン、フルオレセイン、ＤＡＢＣＹＬまたはＢｏｄｉｐｙ Ｆｌで ある上記請求項の一項に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 供与基が６-カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン 、ＩＡＤＥＡＮＳ、ＥＤＡＮＳまたはＢｏｄｉｐｙ Ｆｌである上記請求項の一 項に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 蛍光がデータ処理システムに接続された蛍光計を使って記
    録される上記請求項の一項に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 検出しようとするヌクレオチド配列（Ｎ）の濃度が経時的
    な蛍光強度の変化から決定される上記請求項の一項に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 複数のウェル形のくぼみが装備されていて第１の蛍光分子
    （Ｆ１）が結合される上面を持つ、請求項１〜１８の一項に記載の方法を行なう
    ためのマイクロタイタープレート。
  20. 【請求項２０】 第１のプライマー（Ｐ１）が前記の上面に結合される請求
    項１９に記載のマイクロタイタープレート。
  21. 【請求項２１】 第１の蛍光分子（Ｆ１）が第１のプライマー（Ｐ１）を介
    して前記の上面に結合される請求項２０に記載のマイクロタイタープレート。
  22. 【請求項２２】 第１のプライマー（Ｐ１）がヘアピンループを持ち、第１
    の蛍光分子（Ｆ１）が一つのループ部分に結合され、第２の蛍光分子は相互作用
    が起こりうる距離で、もう一つのループ部分に向かい合って結合される、請求項
    ２１に記載のマイクロタイタープレート。
  23. 【請求項２３】 第１の蛍光分子（Ｆ１）が受容基であり、第２の蛍光分子
    （Ｆ２）が供与基である請求項１９〜２２の一項に記載のマイクロタイタープレ
    ート。
  24. 【請求項２４】 第１の蛍光分子（Ｆ１）または第２の蛍光分子（Ｆ２）が
    消光体（好ましくは４-［４'-ジメチルアミノフェニルアゾ］安息香酸によって 形成される消光体）で置き換えられる請求項１９〜２２の一項に記載のマイクロ
    タイタープレート。
  25. 【請求項２５】 受容基が６-カルボキシテトラメチルローダミン、テトラ メチルローダミン、フルオレセイン、ＤＡＢＣＹＬまたはＢｏｄｉｐｙ Ｆｌで ある請求項２３または２４に記載のマイクロタイタープレート。
  26. 【請求項２６】 供与基が６-カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン 、ＩＡＤＥＡＮＳ、ＥＤＡＮＳまたはＢｏｄｉｐｙ Ｆｌである請求項２５に記 載のマイクロタイタープレート。
  27. 【請求項２７】 マイクロタイタープレート（Ｍ）がポリマー（好ましくは
    導電性ポリマー）からなる請求項１９〜２６の一項に記載のマイクロタイタープ
    レート。
  28. 【請求項２８】 ポリマーがポリカーボネート、トリメチルチオフェン、ト
    リアミノベンゼンおよび/またはポリカルベンおよび/または炭素繊維からなる請
    求項２７に記載のマイクロタイタープレート。
  29. 【請求項２９】 請求項１９〜２８の一項に記載のマイクロタイタープレー
    トと、第２の蛍光分子（Ｆ２）を備えた第２のプライマー（Ｐ２）とを含むキッ
    ト。
  30. 【請求項３０】 第１の蛍光分子（Ｆ１）が受容基であり、第２の蛍光分子
    （Ｆ２）が供与基である請求項２９に記載のキット。
  31. 【請求項３１】 第１の蛍光分子（Ｆ１）またはおよび第２の蛍光分子（Ｆ
    ２）が消光体（好ましくは４-［４'-ジメチルアミノフェニルアゾ］安息香酸に よって形成される消光体）で置き換えられる請求項２９に記載のキット。
  32. 【請求項３２】 受容基が６-カルボキシテトラメチルローダミン、テトラ メチルローダミン、フルオレセイン、ＤＡＢＣＹＬまたはＢｏｄｉｐｙ Ｆｌで ある請求項３０または３１に記載のキット。
  33. 【請求項３３】 供与基が６-カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン 、ＩＡＤＥＡＮＳ、ＥＤＡＮＳまたはＢｏｄｉｐｙ Ｆｌである請求項３２に記 載のキット。
  34. 【請求項３４】 ＰＣＲまたはＬＣＲによる増幅に必要なデオキシヌクレオ
    チド三リン酸、緩衝液成分および酵素を含む請求項２９〜３３の一項に記載のキ
    ット。
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