JP2001511357A

JP2001511357A - ハイブリダイゼーションプローブとしての２’−ｏ−メチルｒｎａの使用

Info

Publication number: JP2001511357A
Application number: JP2000504281A
Authority: JP
Inventors: キャラハン，ケイ; シアカー，ジェーン
Original assignee: ゼネカ・リミテッド
Priority date: 1997-07-24
Filing date: 1998-07-21
Publication date: 2001-08-14
Also published as: WO1999005314A1; EP0998584A1; GB9715522D0

Abstract

(57)【要約】核酸ハイブリダイゼーションアッセイのための2'−O−メチルRNAを含む消化耐性プローブ。その調製および用法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、分子ビーコン（Molecular Beacon）として知られる核酸プローブの
改善に関する。具体的には、こうしたプローブを合成するための修飾核酸の使用
は、in situハイブリダイゼーションおよび均質（homogeneous）リアルタイムPC Rアッセイを含む、いくつかの適用において、核酸標的の検出に利点を有する。

【０００２】分子ビーコンとしては、最近、ハイブリダイゼーションの際に蛍光を放つ核酸
プローブが記載されている（TyagiおよびKramer, Nature Biotechnology 14: 30 3-308: 1996）。該プローブの二次構造は重要であり、そしてその配列に依存する。各プローブは、約15またはそれ以上のヌクレオチドの標的相補的部分（ルー
プ）および各末端に付随する互いに相補的な、さらなる配列を有する。最後に、
該プローブは1つの末端に蛍光リポーター分子を、そしてもう1つの末端に蛍光消
光剤（quencher）を有する。自己相補的末端配列は、塩基対形成によりステムを
形成し、したがって、発蛍光団（fluorophore）および消光剤を極めて近接させ、そして蛍光シグナルを除去することが可能である。しかし、（ループ）相補標
的の存在下では、ループおよび標的が塩基対を形成し、そしてこれがプローブ鎖
を「伸長させ（stretches out）」、したがって消光剤から発蛍光団を移動させ、適切に照射されたとき、リポーターが蛍光を放つのを可能にする。このように
、蛍光はハイブリダイゼーションに依存する。

【０００３】分子ビーコンは、多くの利点を提供する。該ビーコンは、均質アッセイとして
実行することが可能である。シグナルの「スイッチ・オン（switching on）」は
、標的の存在下でのみ起こるため、過剰の非結合プローブを洗い流す必要がない
。これにより、分子ビーコンはin situハイブリダイゼーションおよびリアルタイムPCRなどの適用に理想的となる。分子ビーコンは、低バックグラウンドシグナルを生じる。標的の非存在下および適切な温度で、プローブは自己アニーリン
グし、そして蛍光を消光させる。単位複製物（amplicon）が集積すると、プロー
ブのいくらかは結合し、そしてほどけ、それにより蛍光を生成する。このように
、均質（洗浄なし、閉じた試験管）蛍光を産生し、そして標的の非存在下での低
シグナルは、ノイズに対するシグナルの高い比率を生じる。これにより、設計柔
軟性が提供される。標準ステムの使用により、迅速でそして信頼性のあるプロー
ブ設計が可能になる。さらに、ステムの正確な設計および最適化により、PCRに適した温度でのバックグラウンドを最小にすることが可能である。

【０００４】均質解析には、熱力学的に、分子ビーコンのループ要素がステム部分より補助
（favoured）されなければならないが、ステムはアッセイ温度で容易に形成され
なければならない。これらの重要な必要条件により、長いループおよびステムが
必要となる可能性が高く、これには合成収量および分子ビーコンの純度が重要と
なる。さらに、長いループは、発蛍光団および消光剤との間を十分に分離するが
、長いループは、広い温度領域にわたり融解し、高いバックグラウンドシグナル
およびこれらのシグナルにおける、より大きいノイズを導く。

【０００５】我々は、分子ビーコンとして使用すると、多くの有益な特性を有する修飾RNA プローブを考案し、そしてここに提供する。

【０００６】したがって、本発明の第一の側面において、我々は、結合している供与および
消光種を両方有する2'−O−置換RNAプローブを用いる分子ビーコンアッセイ法を
提供する。2'−O−置換基は、都合よくは、メチル、プロピル、ブチルまたはアリル基である。該置換基は、好ましくは2−メチル基である。

【０００７】分子ビーコンアッセイ法は、WO-95/13399（ニューヨーク公衆衛生研究施設（P ublic Health Research Institute of New York））に開示される。これは本質的に、あらかじめ選択された核酸配列を含むと考えられる試料とビーコンプロー
ブを、あらかじめ選択された配列が該試料に存在するならばプローブからのビー
コンシグナルの検出可能な変化があるようなハイブリダイゼーション条件下で、
接触させることによる、前記のあらかじめ選択された核酸配列の検出を含む。

【０００８】ビーコンプローブは、一本鎖標的相補配列、該標的相補配列に対し5'および3' のヌクレオチド配列からなり、そして標的相補配列／標的配列融解温度より低い
融解温度を有するステム二重鎖、および少なくとも1つのラベル（label）対であ
って、各対がプローブの5'末端またはその近傍に結合している第一のラベルとプ
ローブの3'末端またはその近傍に結合している第二のラベルとを含むラベル対を
含む、一体（unitary）プローブである。アッセイ条件下で、標的相補配列の標的配列へのハイブリダイゼーションは、ラベル対からのビーコンシグナルの変化
を導く。

【０００９】供与および受容種は、いかなる都合のよい方法で分子ビーコンプローブに結合
していてもよい。制限されない例の方法によれば、どちらの種も調節孔ガラス（
CPG）に基づく合成を介し、プローブの3'末端に結合しても、または5'−ホスホロアミダイト化学反応を介し、5'末端に結合してもよい。供与および消光剤種は
、例えばプローブの末端またはその近傍など、プローブのいかなる都合のよい部
位にも結合し、好ましくはプローブの末端に結合する。都合のよい供与種の例は
、当業の科学者に明白であろうし、そしてFAM、TET、JOE、HEX、ROX、BODIPYおよびEDANSが含まれる。都合のよい受容種の例には、TAMRA、ピレンブチレート、
およびDABCYLが含まれる。さらなる都合のよい詳細は、例えばLivakら"PCR meth ods and applications, 1995, 4, 357-362；WO-95/13399（ニューヨーク公衆衛生研究施設）に見られる。

【００１０】 2'−O−置換プローブの利点には、「標準」DNAプローブと比較すると、DNA標的にアニールする際の、より高いTmが含まれる；これは、同様の温度で機能する
、より短いプローブを設計することが可能であること、そしてしたがってより高
いレベルの特異性が可能であることを意味する。短いオリゴヌクレオチド内の単
一のミスマッチは、同一のミスマッチがより長いハイブリダイズしている領域に
あるより、より不安定にする効果を有する。

【００１１】第二に「伝統的な」分子ビーコンは、所望により、3.5 mMまたはそれ以上の濃
度のマグネシウム中で行う。新規2'−O−置換分子ビーコンを用いると、有意に低いマグネシウム濃度を利用することが可能である。これは、PCRおよび特にARM S反応の特異性にかなりの利点を有する。（ARMS技術は、例えばNewtonら, 1989, Nucleic Acids Research (17) 2503-2516に記載されている）。

【００１２】また、2'−O−置換RNAの、相補的な2'−O−置換RNA標的へのアニーリングは、
DNA標的よりもさらにより好ましい；これにより、より短いステム領域を用いることが可能であり、これは効果的なビーコンプローブの設計に特に利点を有する
。これは、分子ビーコンを、特にリアルタイムPCR系において用いるのに、3つの
機能的利点を有する。

【００１３】第一に、分子ビーコンを高温（94℃）から低温（20℃）に冷却する際、蛍光が
、高いもの（ビーコンがランダムコイルである）から低いもの（ビーコンがステ
ム／ループ形成に適合している）へ変化する。図1を参照されたい。「ランダムコイル」からステムループ構造への推移の温度範囲は、ステム配列の長さに依存
し；より長い配列は、おそらく一連の小さな段階で、より広い温度領域にわたり
融解すると期待され、一方、より短いステムは、単一の迅速なステム推移を経る
可能性がより高い。これは、バックグラウンドが可能な限り低くなくてはならな
い、効果的なリアルタイムアッセイの設計に重要であり、；ステム／ループ構造
は、蛍光が測定される温度で完全に形成されていなくてはならず、そしてプロー
ブ／標的相互作用もまた、この温度で促進されなければならない。

【００１４】第二に、短いステムは、柔軟性が低く、そしてそれゆえ発蛍光団消光を与える
能力が減少しているため、これらが陽性ハイブリダイゼーションにおいてより低
いノイズを示すというさらなる利点を有する。

【００１５】第三に、より低い温度では、ループおよび標的がアニーリングしている場合で
も、結合していないステム配列は互いを「見つける」ことが可能である。ハイブ
リダイズした二重鎖は、ぐるりと屈曲することが可能であり、そしてしたがって
、蛍光シグナルの消光が起こる可能性がある。この特徴の結果、また、このハイ
ブリッド屈曲を最小にするため、より短いループ部分の分子ビーコンの設計が好
ましく、これはより短い二重鎖が物理的により束縛され、そしてこの制限された
構造内でそれほど容易に屈曲することは不可能であるためである。

【００１６】さらなる利点は、PCR産物が真に定量化されることが必要であるとき、二重にラベルされているプローブが切断されないことが望ましく、これはこうした反応
において観察される蛍光が、以前のサイクルすべてにわたる切断反応の集積を反
映し、したがって、それまでに実際に集積した単位複製物の真のレベルをある程
度不明瞭にするためである。PCRに通常用いられる酵素の多くは、内因性5'ヌクレアーゼ活性を有し、そしてプローブを切断する可能性がある。

【００１７】したがって、本発明のさらなる側面において、我々は、結合している供与およ
び消光種を両方有する2'−O−置換RNAプローブを提供する。2'−O−置換基は、都合よくは、メチル、プロピル、ブチルまたはアリル基である。該置換基は、好
ましくは2−O−メチル基である。これらの修飾核酸は、ヌクレアーゼ耐性であり
；これはin situハイブリダイゼーションまたはリアルタイムPCRアッセイなどの
ヌクレアーゼが存在している可能性があるアッセイにおいて重要である。

【００１８】本発明は、さらに、1つまたはそれより多い本発明のビーコンプローブを、適切な緩衝剤および他の試薬、および使用のための指示と共に含む、診断キットに
関する。

【００１９】本発明はここに例示されるであろうが、以下の実施例および図への言及により
限定されない。

【００２０】

【実施例】実施例1 試薬：プライマーおよびプローブ R351：CGC TGA TGA ATG TGA AAA ATC TAA R352：AGA AGT TCC AGA TAT TGC CTG CTT 0007M（2−メチルRNA分子ビーコン）：（FAM）−GCG AGC AAA AGA CCU AUU AGA CAC AGA GAA GCU CGC−（消光剤）：下線部分は、自己相補的ステムを示す。 R297：CTT TTG TTC TCT GTG TCT AAT AGG TCT TTT TCT GAA；ビーコン0007Mの合
成標的、下線領域は相補的部分である。他の試薬： 10 x ARMS（35）緩衝液： 100 mM Tris-HCl（25℃でpH 8.3）、500 mM KCl 、3.5 mM MgCl₂、0.1％ゼラチン 1 mM dNTP： 10 mMストック（Pharmacia）から希釈した各1 mM dNTP Amplitaq Gold（5 U/μl）： Perkin-Elmerより ROX標準： ROX結合オリゴヌクレオチド、600 nM保存溶液融解特性：反応混合物 1 x ARMS（3.5）緩衝液（10倍のストック（10 x ARMS）から希釈したもの）中
の400 nM分子ビーコン0007Mに加え、最終100 mMのdNTP、60 nMのROX標準および多様な濃度の標的。標的は1μMの合成オリゴ標的（R297）、またはプライマーR3 51およびR352を用いたPCRにより産生され、そして連続的に希釈された二本鎖単位複製物のいずれかである。

【００２１】サイクルパラメーター ABI PRISMシステム7700を用いた、94℃2分；その後94℃から11℃へ減少する15 秒の84段階、蛍光読み取りは、各温度でモニターする。

【００２２】結果図1は、標的の存在下（黒いひし形）または非存在下（黒い四角）で0007Mで得
られた結果を示す。上昇した温度での高い蛍光は、ステムが形成されておらず、
そしてプローブが本質的にランダムコイルとなっていることを示す。温度が減少
するにつれ、蛍光は「標的なし」反応で減少したが、一方過剰な標的の存在下で
は蛍光の増加が観察され、ピークは56℃近辺である。この蛍光の続く減少は、ス
テムが互いに高親和性であること、そしてより低い温度では、プローブ標的二重
鎖は屈曲することが可能であり、ステムが形成され、そして蛍光がスイッチ・オ
フされることが可能になることを反映する。

【００２３】図2は、異なる量の二本鎖単位増幅物での同様の一連の曲線を示し；「未希釈のもの」から1/16までの2倍連続希釈および陰性対照のものである。データは、試験管間の直接比較を可能にするために、88℃および74℃間（各線が平坦である
場所）の蛍光に関し等しくされている。陽性および陰性試料間には明白な相違が
あり、そして標的希釈数は、特により低い温度での相対蛍光に明白に反映されて
いる。このデータから引き出される2つのさらなる観察がある。 1．より大きい単位複製物標的は、オリゴヌクレオチド標的より、引き続く屈曲および閉鎖の傾向が低く； 2．標的は一度だけ熱変性され、そして「もう一方の」鎖が、その結合部位からプローブを追い出すことが期待される可能性があった。蛍光が実質的に冷却の間
中残っていたため、これはあてはまらなかった。増幅反応：反応混合物 100μM dNTP、500 nMの各プライマー（R351、R352）、60 nMのROX標準、400 n Mビーコン0007M、2単位のAmplitaq Gold（50μl反応当たり）、5μl（50 ng）ヒ
トゲノムDNAに添加された1 x ARMS（3.5）緩衝液。

【００２４】サイクル条件以下の条件を用い、反応を反復しそして蛍光を読み取った。Amplitaq Goldを活性化するため、94℃で20分。その後94℃41秒、60℃42秒、72℃52秒を40サイク
ル。蛍光データは60℃アニーリング段階で集め、そして解析した。

【００２５】結果上記のような増幅反応からの結果は、図3に示している。この系を用いると、陽性および陰性試料間には明白な相違がある。我々は、プローブ設計および反応
条件をさらに最適化して、増加した蛍光を生じる一方、シグナルノイズを最小に
し、そして該技術の感度を高めることが可能であると期待している。実施例2 本実施例において、我々はさらに改善された分子ビーコンを開示する。本実施
例において、プローブのループ部分を広くし、標的に対する強い結合および発蛍
光団の消光剤からの十分な物理的分離を確実にした。さらに、ステムの大きさを
小さくしてCGCG四量体とした。これは、結合した二重鎖が折り返されるのを最小
にする短い長さ、その特定の配列組成による高いTm、プローブ0007Mに示されるような、Gによる消光の可能性を排除する発蛍光団に隣接する5'末端Cという、多
数の利点を有する。

【００２６】改善されたビーコンは0009M：（FAM）−CGC GGA AAA ASA CCU AUU AGA CAC AG A GAA CAC GCG−（消光剤）である。下線部分はステムである。すべての塩基は2 '−O−メチルRNAである。実施例3 2'−O−メチルRNA分子ビーコンを用いた遺伝性ヘモクロマトーシス突然変異の検
出 1）C282Y ARMS試験材料および方法 2つの混合物を作成し、第一（N）は正常（野生型）対立遺伝子を検出するため
であり、そして第二（M）は突然変異対立遺伝子を検出するためであった。混合物は、ARMSプライマーの3'塩基のみが異なる。混合物構成要素の最終濃度を以下
に示す：

【００２７】

【表１】

【００２８】 1 xビーコン緩衝液の組成： 50 mM KCl 10 mM Tris（pH 8.3） 3.5 mM MgCl₂ 0.01%（w/v）ゼラチンプライマー／ビーコン配列（5'→3'）： R279-97 AAGTGCCTCCTTTGGTGAAGCTGACACA R280-97 TGATCCAGGCCTGGGTGCTCCACCTGAC R281-97 TGATCCAGGCCTGGGTGCTCCACCTGAT 0037M （FAM）−CGCGAGUUCGAACCUAAAGACGUAUUGCCCAACGCG−（消光剤）混合物を光学試験管（optical tube）に20μlアリコットに分配した。ゲノムD NA（血液からアルカリ溶解により調製し、そして水で1/5に希釈したもの）5μl を、両混合物の各2つのアリコットに添加した。野生型、ヘテロ接合突然変異体およびホモ接合突然変異体試料の例を用いた。

【００２９】試験管を熱サイクル装置（Applied Biosystems 7700）中に置き、そして以下のPCRプログラムを実行した： 94℃20分に続き 20サイクルの 94℃45秒 60℃45秒その後25サイクルの 94℃45秒 40℃45秒。

【００３０】結果を図5および図6に示す。上記の結果は、N混合物は野生型対立遺伝子を含むゲノムDNA（黒いひし形およ
び白三角）のみを増幅し、そしてM混合物は突然変異対立遺伝子を含むゲノムDNA （白三角および黒丸）のみを増幅することを示す。増幅は、ゲノムDNAを欠く混合物ではどちらでも起こらない（X）。2）H63D ARMS試験材料および方法 2つの混合物を作成し、第一（N）は正常（野生型）対立遺伝子を検出するため
であり、そして第二（M）は突然変異対立遺伝子を検出するためであった。混合物は、ARMSプライマーの3'塩基のみが異なる。H63D試験におけるすべてのプライ
マーは、その5'端に同一の26量体の非相同テール配列を有する。混合物構成要素
の最終濃度を以下に示す：

【００３１】

【表２】

【００３２】 1 xビーコン緩衝液の組成： 50 mM KCl 10 mM Tris（pH 8.3） 3.5 mM MgCl₂ 0.01%（w/v）ゼラチンプライマー／ビーコン配列（5'→3'）： R369-98 GCGTACTAGCGTACCACGTGTCGACTTCCTACTACACATGGTTAAGGCCTG R370-98 GCGTACTAGCGTACCACGTGTCGACTGGGCTCCACACGGCGACTCTCAAG R371-98 GCGTACTAGCGTACCACGTGTCGACTGGGCTCCACACGGCGACTCTCAAC MB026-98 （FAM）−CGCGGGAUGACCAGCUGUUCGUGUUCUACGCG−（消光剤）混合物を光学試験管に20μlアリコットに分配した。ゲノムDNA（血液からGent ra PureGeneキットを用いて調製し、そして水で10 ng/μlに希釈したもの）5μl を、両混合物の各2つのアリコットに添加した。野生型、ヘテロ接合突然変異体およびホモ接合突然変異体試料の例を用いた。

【００３３】試験管を熱サイクル装置（Applied Biosystems 7700）中に置き、そして以下のPCRプログラムを実行した： 94℃20分に続き 20サイクルの 94℃45秒 60℃45秒その後25サイクルの 94℃45秒 40℃45秒。

【００３４】結果を図7および図8に示す。ここでも、結果は、N混合物は野生型対立遺伝子を含むゲノムDNA（黒いひし形
および白三角）のみを増幅し、そしてM混合物は突然変異対立遺伝子を含むゲノムDNA（白三角および黒丸）のみを増幅することを示す。増幅は、ゲノムDNAを欠
く混合物ではどちらでも起こらない（X）。

【００３５】増幅プロトコルは、図3に示される実行と同一であった。本増幅の結果は、図4 に示される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図1は、合成オリゴヌクレオチド標的（R297）の存在下または非存在下での、2−メチルRNA分子ビーコン0007Mに対する冷却曲線を示す。冷却範囲にわたり蛍光を読み取り、そして温度に対しプロットした。未処理蛍光強度は
、Y軸に沿っている。

【図２】図2は、希釈されていないもの（neat）から1/8希釈までの多様な
濃度のPCR単位複製物を、ビーコン0007Mの存在下で冷却した時の、同様の一連の
曲線を示す。X軸上で、温度は先のように、94℃から11℃まで減少するが、正確な試験管対試験管の比較を可能にするため、各曲線が平坦である、84℃から74℃
の温度間でベースラインにデータを等しくしている。混合物が50℃未満に冷却さ
れたとき、曲線はその最小蛍光に達し、そしてこれらを比較することが適当であ
る。この点での蛍光値は、試験管内の標的の量と共に上昇する。

【図３】図3は、すべてのPCRサイクルの同一時点（60℃アニーリング段階
）でモニターされるビーコン蛍光の増加を例示する。反応にテンプレートが含ま
れているとき、蛍光は、バックグラウンド（テンプレートなしの対照により示さ
れる）より上に増加する。この増加は〜２８サイクルで有意になる。

【図４】図4は、先の0007Mビーコンの代わりに、ビーコン0009Mを用いた同一反応を示す。蛍光は、より少ないバックグラウンドノイズで順調に増加し、
そして実質的により大きな値に達する。これは、高められた設計による、このビ
ーコンの改善された有効性を反映する。

【図５】図5は、遺伝性ヘモクロマトーシス突然変異C282YヘテロおよびC2 82Yホモと共に、野生型および対照配列の正常対立遺伝子（N混合物）の検出を示
す。

【図６】図6は、遺伝性ヘモクロマトーシス突然変異C282YヘテロおよびC2 82Yホモと共に、野生型および対照配列の突然変異対立遺伝子（M混合物）の検出
を示す。

【図７】図7は、遺伝性ヘモクロマトーシス突然変異H63Dと共に、野生型および対照配列の正常対立遺伝子（N混合物）の検出を示す。

【図８】図8は、遺伝性ヘモクロマトーシス突然変異H63Dと共に、野生型および対照配列の正常対立遺伝子（N混合物）の検出を示す。

【手続補正書】

【提出日】平成１２年１０月２７日（２０００．１０．２７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続きＦターム(参考） 4B024 AA11 CA04 CA09 CA11 HA11 4B063 QA01 QA12 QQ42 QR32 QR35 QR55 QR62 QS36 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 2'−O−置換RNAを含み、そして末端または末端近傍に結合
している供与および受容種（species）を有する、ヌクレアーゼ耐性プローブ。
【請求項２】標的相補配列に対し5'および3'のヌクレオチド配列からな
るステム二重鎖を含む、請求項1に記載のプローブ。
【請求項３】ステム二重鎖が長さ3−6塩基である、請求項2に記載のプローブ。
【請求項４】 2−O−置換基がアルキル基である、請求項1−3のいずれか
１項記載のプローブ。
【請求項５】該アルキル基がメチルである、請求項3に記載のプローブ。
【請求項６】請求項１−５のいずれか１項記載のプローブの使用を含む
、診断アッセイ。
【請求項７】リアルタイムアッセイである、請求項6に記載の診断アッセイ。
【請求項８】前記請求項のいずれか１項記載の1つまたはそれより多いプローブを、1つまたはそれより多いの適切な緩衝剤、試薬および使用のための指示と共に含む、診断キット。