JP2006075031A - 核酸配列の増幅法および検出法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】(1)(a)標的核酸配列を含有すると推定される試料、
(b)標的核酸配列の3′末端領域にアニールする相補的配列、RNAポリメラーゼ認識プロモーター配列および親和性分子ペアの一方を含有する標的核酸配列捕捉プローブ、および
(c)親和性分子ペアの他方を微小粒子に固定してなる担体
を接触させ、前記標的核酸配列が存在する場合に該標的核酸配列、標的核酸配列捕捉プローブおよび担体からなる複合体を形成させる工程、ならびに
(2)RNアーゼH活性を有する逆転写酵素およびRNAポリメラーゼの存在下で、または逆転写酵素、RNアーゼHおよびRNAポリメラーゼの存在下で、前記標的核酸配列が存在する場合に該標的核酸配列を鋳型とする核酸配列増幅反応を実施する工程
を含む核酸配列増幅法。
Description
(1)(a)標的核酸配列を含有すると推定される試料、
(b)標的核酸配列の3′末端領域にアニールする相補的配列、RNAポリメラーゼ認識プロモーター配列および親和性分子ペアの一方を含有する標的核酸配列捕捉プローブ、および
(c)親和性分子ペアの他方を微小粒子に固定してなる担体
を接触させ、前記標的核酸配列が存在する場合に該標的核酸配列、標的核酸配列捕捉プローブおよび担体からなる複合体を形成させる工程、ならびに
(2)RNアーゼH活性を有する逆転写酵素およびRNAポリメラーゼの存在下で、または逆転写酵素、RNアーゼHおよびRNAポリメラーゼの存在下で、前記標的核酸配列が存在する場合に該標的核酸配列を鋳型とする核酸配列増幅反応を実施する工程
を含む核酸配列増幅法に関する。
(1′)複合体を試料から分離する工程
が実施されることが好ましい。
(d)アビジンとビオチンとのペア、および/または
(e)抗原と抗体とのペア
であることが好ましい。
(1)(a)標的核酸配列を含有すると推定される試料、
(b)標的核酸配列の3′末端領域にアニールする相補的配列、RNAポリメラーゼ認識プロモーター配列および親和性分子ペアの一方を含有する標的核酸配列捕捉プローブ、および
(c)親和性分子ペアの他方を微小粒子に固定してなる担体
を接触させ、前記標的核酸配列が存在する場合に該標的核酸配列、標的核酸配列捕捉プローブおよび担体からなる複合体を形成させる工程、
(2)RNアーゼH活性を有する逆転写酵素およびRNAポリメラーゼの存在下で、または逆転写酵素、RNアーゼHおよびRNAポリメラーゼの存在下で、前記標的核酸配列が存在する場合に該標的核酸配列を鋳型とする核酸配列増幅反応を実施する工程、ならびに
(3)工程(2)において増幅された核酸配列を検出する工程
を含む核酸配列検出法に関する。
(1′)複合体を試料から分離する工程
が実施されることが好ましい。
(d)アビジンとビオチンとのペア、および/または
(e)抗原と抗体とのペア
であることが好ましい。
(i)試料調製工程
本発明における試料の調製に関しては、TMA法(たとえば、特許第3241717号明細書参照)またはNASBA法(たとえば、特開平9−327298号公報)などの従来法に基づき、当業者は適宜実施することができるが、たとえば、以下のようにして行うことができる。
(ii)核酸配列の増幅工程
本発明における核酸配列の増幅は、標的核酸配列捕捉プローブを予め担体に固定する工程を含むことなく、標的核酸配列を含有する試料、標的核酸配列捕捉プローブおよび担体を接触させる点を特徴とする。本発明における核酸配列の増幅工程は、従来のTMA法またはNASBA法などに基づき実施することができ、たとえば、以下のように実施することができる。
(iii)標的核酸配列の検出工程
標的核酸配列の検出については、従来法(たとえば、ハイブリダイゼーションプロテクションアッセイ。特許第3190348号明細書参照)に基づき当業者が適宜実施することができるものである。たとえば、ハイブリダイゼーションプロテクションアッセイにより標的核酸配列の検出を行う場合は、たとえば、以下ようにして実施することができる。
本実施例では、標的核酸配列捕捉プローブおよび担体を用いて標的核酸配列を増幅し、ハイブリダイゼーションプロテクションアッセイにより標的核酸配列の検出を実施した。
標的配列含有溶液1を希釈液(50mM Tris-Cl、2mM EDTA、10mM N-アセチル-L-システイン (pH=8.0))で10倍または100倍希釈したものについて、アビジン粒子の非存在下での鋳型RNA配列(標的核酸配列)の増幅操作を以下のように実施した。
本実施例において、担体としては、実施例1に記載のアビジン粒子を使用した。
マイコバクテリウム アビウムのリボソームRNAについて、アビジン粒子の非存在下でのRNA配列(標的核酸配列)の増幅操作を以下のように実施した。
本実施例では、捕捉プローブ1に含有される核酸配列と同一の配列からなるが、ビオチンが結合されていないプライマー(「リバースプライマー1」とする)をさらに用いた。
本実施例において、担体としては、実施例1に記載のアビジン粒子を使用した。
捕捉プローブ1を予めアビジン粒子に結合させたものを用いて、鋳型RNA配列(標的核酸配列)の増幅操作を以下のように実施した。
本実施例では、洗浄工程を省略して標的核酸の増幅を行い、ついで標的核酸配列の検出を行った。
Claims (14)
- (1)(a)標的核酸配列を含有すると推定される試料、
(b)標的核酸配列の3′末端領域にアニールする相補的配列、RNAポリメラーゼ認識プロモーター配列および親和性分子ペアの一方を含有する標的核酸配列捕捉プローブ、および
(c)親和性分子ペアの他方を微小粒子に固定してなる担体
を接触させ、前記標的核酸配列が存在する場合に該標的核酸配列、標的核酸配列捕捉プローブおよび担体からなる複合体を形成させる工程、ならびに
(2)RNアーゼH活性を有する逆転写酵素およびRNAポリメラーゼの存在下で、または逆転写酵素、RNアーゼHおよびRNAポリメラーゼの存在下で、前記標的核酸配列が存在する場合に該標的核酸配列を鋳型とする核酸配列増幅反応を実施する工程
を含む核酸配列増幅法。 - 前記工程(1)および工程(2)の間に
(1′)複合体を試料から分離する工程
を含む請求項1記載の方法。 - 親和性分子ペアが、
(d)アビジンとビオチンとのペア、および/または
(e)抗原と抗体とのペア
であることを特徴とする請求項1または2記載の方法。 - 抗原と抗体とのペアが、フェニトインと抗フェニトイン抗体とのペアである請求項3記載の方法。
- 抗原と抗体とのペアが、ジゴキシゲニンと抗ジゴキシゲニン抗体とのペアである請求項3記載の方法。
- (1)(a)標的核酸配列を含有すると推定される試料、
(b)標的核酸配列の3′末端領域にアニールする相補的配列、RNAポリメラーゼ認識プロモーター配列および親和性分子ペアの一方を含有する標的核酸配列捕捉プローブ、および
(c)親和性分子ペアの他方を微小粒子に固定してなる担体
を接触させ、前記標的核酸配列が存在する場合に該標的核酸配列、標的核酸配列捕捉プローブおよび担体からなる複合体を形成させる工程、
(2)RNアーゼH活性を有する逆転写酵素およびRNAポリメラーゼの存在下で、または逆転写酵素、RNアーゼHおよびRNAポリメラーゼの存在下で、前記標的核酸配列が存在する場合に該標的核酸配列を鋳型とする核酸配列増幅反応を実施する工程、ならびに
(3)工程(2)において増幅された核酸配列を検出する工程
を含む核酸配列検出法。 - 前記工程(1)および工程(2)の間に
(1′)複合体を試料から分離する工程
を含む請求項6記載の方法。 - 親和性分子ペアが、
(d)アビジンとビオチンとのペア、および/または
(e)抗原と抗体とのペア
であることを特徴とする請求項6または7記載の方法。 - 抗原と抗体とのペアが、フェニトインと抗フェニトイン抗体とのペアである請求項8記載の方法。
- 抗原と抗体とのペアが、ジゴキシゲニンと抗ジゴキシゲニン抗体とのペアである請求項8記載の方法。
- 前記核酸配列がハイブリダイゼーションプロテクションアッセイにより検出される請求項6、7、8、9または10記載の方法。
- 標的核酸配列が、結核菌群または抗酸菌群由来の核酸配列である請求項6、7、8、9、10または11記載の方法。
- 結核菌群が、少なくともマイコバクテリウム ツベルクローシス、マイコバクテリウム ボビス、マイコバクテリウム ボビス ビーシージー、マイコバクテリウム アフリカナムまたはマイコバクテリウム マイクロティを含む請求項12記載の方法。
- 抗酸菌群が、少なくともマイコバクテリウム アビウムまたはマイコバクテリウム イントラセルラレを含む請求項12記載の方法。
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---|---|---|---|---|
JPH04501959A (ja) * | 1988-11-21 | 1992-04-09 | ダイナル・エイ・エス | 核酸プローブ |
JP2002506654A (ja) * | 1998-03-18 | 2002-03-05 | ノーベンバー・アクチェンゲゼルシャフト・ゲゼルシャフト・フュール・モレクラーレ・メディツィーン | ヌクレオチド配列を検出するための方法と装置 |
JP2003219881A (ja) * | 2002-01-29 | 2003-08-05 | Jsr Corp | 核酸捕獲用および核酸増幅用粒子ならびにこれを用いた目的遺伝子の検出方法 |
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2004
- 2004-09-08 JP JP2004260419A patent/JP4710283B2/ja active Active
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JPH04501959A (ja) * | 1988-11-21 | 1992-04-09 | ダイナル・エイ・エス | 核酸プローブ |
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