JPH104984A - 鳥型結核菌複合種の増幅および検出 - Google Patents
鳥型結核菌複合種の増幅および検出Info
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- JPH104984A JPH104984A JP9058834A JP5883497A JPH104984A JP H104984 A JPH104984 A JP H104984A JP 9058834 A JP9058834 A JP 9058834A JP 5883497 A JP5883497 A JP 5883497A JP H104984 A JPH104984 A JP H104984A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 鳥型結核菌複合種の増幅および検出。
【解決手段】 ミコバクテリアのＢＣＧ８５−Ｂ遺伝子
に由来するオリゴヌクレオチドプライマーおよび鳥型結
核菌（Mycobacterium avium）複合体（ＭＡＣ）の種に
おけるＢＣＧ８５−Ｂ遺伝子のフラグメントの複合体特
異的増幅方法を提供する。更に、ＭＡＣ種のＢＣＧ８５
−Ｂ遺伝子の増幅生成物を検出するのに有用なオリゴヌ
クレオチド検出用プローブおよび多種増幅反応のための
プライマーの適応を開示する。
に由来するオリゴヌクレオチドプライマーおよび鳥型結
核菌（Mycobacterium avium）複合体（ＭＡＣ）の種に
おけるＢＣＧ８５−Ｂ遺伝子のフラグメントの複合体特
異的増幅方法を提供する。更に、ＭＡＣ種のＢＣＧ８５
−Ｂ遺伝子の増幅生成物を検出するのに有用なオリゴヌ
クレオチド検出用プローブおよび多種増幅反応のための
プライマーの適応を開示する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、標的核酸配列の増
幅および検出に関する。特に、本発明は、ミコバクテリ
アの標的核酸配列の増幅および検出に関する。
幅および検出に関する。特に、本発明は、ミコバクテリ
アの標的核酸配列の増幅および検出に関する。
【０００２】
【従来の技術】ミコバクテリアは、抗酸性、非自動性、
グラム陽性の桿状体である細菌の属である。該属は、限
定されるものではないが、ミコバクテリウム・アフリカ
ヌム（Mycobacterium africanum)、鳥型結核菌（M.aviu
m)、ウシ型結核菌（M.bovis)、ウシ型結核菌−ＢＣＧ、
Ｍ．ケロネエ（chelonae）、Ｍ．フォルツイツム（fort
uitum)、Ｍ．ゴルドネエ（gordonae）、Ｍ．イントラセ
ルレア（intracellulare)、Ｍ．カンサシイ（Kansasi
i）、Ｍ．ミクロティ（Microti)、Ｍ．スクロフラセウ
ム（scrofulaceum）、パラ結核菌（M.paratuberculosi
s）およびヒト型結核菌（M.tuberculosis）を含むいく
つかの種を含む。これらの微生物のいくつかは疾患の原
因物質である。最初の１９５３年以来、ミコバクテリア
感染の症例は米国において増加している。結核が特に問
題であるが、他のミコバクテリア感染もまた、免疫無防
備患者数の増加の結果として増加している。多数のこれ
ら新規の症例はエイズ流行に関係しており、それは、ミ
コバクテリアによる感染に対して特に感受性である免疫
無防備集団を与えている。鳥型結核菌、ミコバクテリウ
ム・カンサシイおよび他の非結核ミコバクテリアは、Ｈ
ＩＶ感染および他の免疫無防備患者において日和見性病
原体として見出される。
グラム陽性の桿状体である細菌の属である。該属は、限
定されるものではないが、ミコバクテリウム・アフリカ
ヌム（Mycobacterium africanum)、鳥型結核菌（M.aviu
m)、ウシ型結核菌（M.bovis)、ウシ型結核菌−ＢＣＧ、
Ｍ．ケロネエ（chelonae）、Ｍ．フォルツイツム（fort
uitum)、Ｍ．ゴルドネエ（gordonae）、Ｍ．イントラセ
ルレア（intracellulare)、Ｍ．カンサシイ（Kansasi
i）、Ｍ．ミクロティ（Microti)、Ｍ．スクロフラセウ
ム（scrofulaceum）、パラ結核菌（M.paratuberculosi
s）およびヒト型結核菌（M.tuberculosis）を含むいく
つかの種を含む。これらの微生物のいくつかは疾患の原
因物質である。最初の１９５３年以来、ミコバクテリア
感染の症例は米国において増加している。結核が特に問
題であるが、他のミコバクテリア感染もまた、免疫無防
備患者数の増加の結果として増加している。多数のこれ
ら新規の症例はエイズ流行に関係しており、それは、ミ
コバクテリアによる感染に対して特に感受性である免疫
無防備集団を与えている。鳥型結核菌、ミコバクテリウ
ム・カンサシイおよび他の非結核ミコバクテリアは、Ｈ
ＩＶ感染および他の免疫無防備患者において日和見性病
原体として見出される。
【０００３】鳥型結核菌およびＭ．イントラセルレア
は、鳥型結核菌複合体（ＭＡＣ）のメンバーである。パ
ラ結核菌は鳥型結核菌の亜種であり、そしてまた、概し
て、ＭＡＣに包含されている。これらの種は、エイズ患
者における播種性ＭＡＣ感染の高罹患率のために、近年
重要になってきた。播種性ＭＡＣ感染は、ＨＩＶを有す
る患者での全身性細菌感染の大部分の原因として引合い
に出されており、大部分のエイズ患者は、彼等が重症の
免疫無防備状態になるまで充分に長く生存し続けた場
合、このような感染を発症するであろうということが示
唆された。鳥型結核菌複合体は、それらの生化学的およ
び血清凝集特性に基いて区別しうる２８種類の血液型亜
型から成る（インダーリード（Inderlied）ら、1993
年、Clin.Microbiol.Rev.6,266-310 による論及を参照
されたい）。分類の方法に応じて、２８血液型亜型の内
１０〜１２種類は鳥型結核菌種に属し、そして１０〜１
２種類はミコバクテリウム・イントラセルレア種に属す
ると分類される。ＭＡＣ血液型亜型の内６種類はまだ明
確に分類されていない。ＭＡＣ感染は、現在、ミコバク
テリア学研究室で同定された病原性単離物の約５０％を
占め且つエイズおよび他の免疫無防備患者の中で最も一
般的である。ＭＡＣ感染の初期診断および治療は、感染
した個体の生存状態を改善し且つ延長することができ
る。
は、鳥型結核菌複合体（ＭＡＣ）のメンバーである。パ
ラ結核菌は鳥型結核菌の亜種であり、そしてまた、概し
て、ＭＡＣに包含されている。これらの種は、エイズ患
者における播種性ＭＡＣ感染の高罹患率のために、近年
重要になってきた。播種性ＭＡＣ感染は、ＨＩＶを有す
る患者での全身性細菌感染の大部分の原因として引合い
に出されており、大部分のエイズ患者は、彼等が重症の
免疫無防備状態になるまで充分に長く生存し続けた場
合、このような感染を発症するであろうということが示
唆された。鳥型結核菌複合体は、それらの生化学的およ
び血清凝集特性に基いて区別しうる２８種類の血液型亜
型から成る（インダーリード（Inderlied）ら、1993
年、Clin.Microbiol.Rev.6,266-310 による論及を参照
されたい）。分類の方法に応じて、２８血液型亜型の内
１０〜１２種類は鳥型結核菌種に属し、そして１０〜１
２種類はミコバクテリウム・イントラセルレア種に属す
ると分類される。ＭＡＣ血液型亜型の内６種類はまだ明
確に分類されていない。ＭＡＣ感染は、現在、ミコバク
テリア学研究室で同定された病原性単離物の約５０％を
占め且つエイズおよび他の免疫無防備患者の中で最も一
般的である。ＭＡＣ感染の初期診断および治療は、感染
した個体の生存状態を改善し且つ延長することができ
る。
【０００４】ミコバクテリア感染の診断は、伝統的に、
抗酸性染色および微生物の培養に続く生化学的検定にた
よってきた。これらの方法は時間がかかり、慣用的な培
養法を用いる典型的な診断は６週間程度かかることがあ
る。BACTECTMシステム（ベクトン・ディキンソン・ミク
ロバイオロジー・システムズ（Becton Dickinson Micro
biology Systems)，スパークス，ＭＤ）のような自動培
養システムは、診断のための時間を１週間または２週間
まで減らすことができる。しかしながら、ミコバクテリ
ア感染を診断するのに必要な時間を１週間未満に、好ま
しくは、１日またはそれ未満に短縮することがなお要求
されている。核酸増幅は、特異的な標的配列の速やかな
検出を可能にする有力な技術である。したがって、それ
は、ミコバクテリアの速やかな検出および同定に有望な
技術である。当該技術分野において知られている核酸増
幅技術の例は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：米国特
許第4,683,195号；第4,683,202号；第4,800,159号；第
4,965,188号明細書）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）（Ｇ．ウ
ォーカー（Walker）ら、1992年，Proc.Nat.Acad.Sci. US
A 89,392-396；Ｇ．ウォーカーら、1992年，Nucl.Acids
Res.20,1691-1696；米国特許第5,270,184号明細書；米
国特許第5,455,166号明細書；公開された欧州特許出願
第0684315号明細書）、核酸配列に基く増幅（ＮＡＳＢ
Ａ：カンジーン（Cangene）による米国特許第5,130,238
号明細書）、転写に基く増幅（Ｄ．クウォー（Kwoh）
ら、1989年，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86,1173-1177）、
自己持続配列複製（３ＳＲ：Ｊ．グァテリ（Guatelli）
ら、1990年，Proc.Nat.Acad.Sci.US A 87,1874-1878）お
よびＱβレプリカー ゼシステム（Ｐ．リザルディ（Liz
ardi）ら、1988年，BioTechnology 6,1197-1202）であ
る。
抗酸性染色および微生物の培養に続く生化学的検定にた
よってきた。これらの方法は時間がかかり、慣用的な培
養法を用いる典型的な診断は６週間程度かかることがあ
る。BACTECTMシステム（ベクトン・ディキンソン・ミク
ロバイオロジー・システムズ（Becton Dickinson Micro
biology Systems)，スパークス，ＭＤ）のような自動培
養システムは、診断のための時間を１週間または２週間
まで減らすことができる。しかしながら、ミコバクテリ
ア感染を診断するのに必要な時間を１週間未満に、好ま
しくは、１日またはそれ未満に短縮することがなお要求
されている。核酸増幅は、特異的な標的配列の速やかな
検出を可能にする有力な技術である。したがって、それ
は、ミコバクテリアの速やかな検出および同定に有望な
技術である。当該技術分野において知られている核酸増
幅技術の例は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：米国特
許第4,683,195号；第4,683,202号；第4,800,159号；第
4,965,188号明細書）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）（Ｇ．ウ
ォーカー（Walker）ら、1992年，Proc.Nat.Acad.Sci. US
A 89,392-396；Ｇ．ウォーカーら、1992年，Nucl.Acids
Res.20,1691-1696；米国特許第5,270,184号明細書；米
国特許第5,455,166号明細書；公開された欧州特許出願
第0684315号明細書）、核酸配列に基く増幅（ＮＡＳＢ
Ａ：カンジーン（Cangene）による米国特許第5,130,238
号明細書）、転写に基く増幅（Ｄ．クウォー（Kwoh）
ら、1989年，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86,1173-1177）、
自己持続配列複製（３ＳＲ：Ｊ．グァテリ（Guatelli）
ら、1990年，Proc.Nat.Acad.Sci.US A 87,1874-1878）お
よびＱβレプリカー ゼシステム（Ｐ．リザルディ（Liz
ardi）ら、1988年，BioTechnology 6,1197-1202）であ
る。
【０００５】ＳＤＡおよび３ＳＲのような等温増幅法
は、それらがＰＣＲのような方法に特有の高／低温循環
を必要としないので、診断において特に有益である。し
たがって、それらはより簡単なプロトコールであり且つ
実施するのに特別な装置をあまり必要としない。しかし
ながら、ＳＤＡのような等温増幅法は、概して、ＰＣＲ
によって増幅可能なものほど大きい標的を増幅すること
ができない。適当な増幅プライマー結合部位付近が因子
になり且つ増幅生成物中には検定プローブ設計に利用可
能な配列がほとんどないので、小さい標的配列は、ある
与えられた標的の検出に望ましい特異性を有するプライ
マーおよびプローブを設計する能力を厳しく制限する。
は、それらがＰＣＲのような方法に特有の高／低温循環
を必要としないので、診断において特に有益である。し
たがって、それらはより簡単なプロトコールであり且つ
実施するのに特別な装置をあまり必要としない。しかし
ながら、ＳＤＡのような等温増幅法は、概して、ＰＣＲ
によって増幅可能なものほど大きい標的を増幅すること
ができない。適当な増幅プライマー結合部位付近が因子
になり且つ増幅生成物中には検定プローブ設計に利用可
能な配列がほとんどないので、小さい標的配列は、ある
与えられた標的の検出に望ましい特異性を有するプライ
マーおよびプローブを設計する能力を厳しく制限する。
【０００６】最初、ＳＤＡは、約３５℃〜４５℃の温度
で使用するために開発された（「従来のＳＤＡ」）。最
近になって、それは、公開された欧州特許出願第068431
5号明細書で記載のように、好熱性ポリメラーゼおよび
制限エンドヌクレアーゼを用いてより高い温度に適応さ
れてきた（「好熱性ＳＤＡ」または「ｔＳＤＡ」）。ｔ
ＳＤＡシステムは、従来のＳＤＡと比較して増大した速
度および特異性の利点を与える。従来のＳＤＡにおいて
用いるために設計された増幅プライマーの標的結合配列
は、概して、ｔＳＤＡにおいて機能するであろうが、通
常、それらは不十分であり、したがって、増幅効率はｔ
ＳＤＡのより高温で低下することがある。更に、従来の
ＳＤＡにおけるプライマー設計の場合と同様、ｔＳＤＡ
のためのプライマーの標的結合配列中の（それを延長す
るような）見たところ僅かな修飾は、しばしば、増幅効
率に対して予想できない影響を与える。対照的に、ｔＳ
ＤＡのために設計されたプライマーの標的結合配列を含
むプライマーは、通常、従来のＳＤＡまたは他の増幅反
応に対して増幅プライマーを適応した場合に効率よく機
能する。
で使用するために開発された（「従来のＳＤＡ」）。最
近になって、それは、公開された欧州特許出願第068431
5号明細書で記載のように、好熱性ポリメラーゼおよび
制限エンドヌクレアーゼを用いてより高い温度に適応さ
れてきた（「好熱性ＳＤＡ」または「ｔＳＤＡ」）。ｔ
ＳＤＡシステムは、従来のＳＤＡと比較して増大した速
度および特異性の利点を与える。従来のＳＤＡにおいて
用いるために設計された増幅プライマーの標的結合配列
は、概して、ｔＳＤＡにおいて機能するであろうが、通
常、それらは不十分であり、したがって、増幅効率はｔ
ＳＤＡのより高温で低下することがある。更に、従来の
ＳＤＡにおけるプライマー設計の場合と同様、ｔＳＤＡ
のためのプライマーの標的結合配列中の（それを延長す
るような）見たところ僅かな修飾は、しばしば、増幅効
率に対して予想できない影響を与える。対照的に、ｔＳ
ＤＡのために設計されたプライマーの標的結合配列を含
むプライマーは、通常、従来のＳＤＡまたは他の増幅反
応に対して増幅プライマーを適応した場合に効率よく機
能する。
【０００７】ミコバクテリアのＢＣＧ８５複合体は３種
類の抗原（Ａ、ＢおよびＣ）から成り且つミコバクテリ
ア増殖の第一段階で多量に生成される。これらのタンパ
ク質は、γインターフェロン合成を誘導し、フィブロネ
クチンに対して結合し、そして細胞性および体液性免疫
を刺激するので、それらは免疫病理学において重要な役
割を果たしていると考えられる。ＢＣＧ８５−Ｂはα抗
原に対応する。ＢＣＧ８５−Ｂをコードしている遺伝子
は、最初、ウシ型結核菌（Ｋ．マツオ（Matsuo）ら、19
88年，J.Bacteriol.170:3847-3854）およびＭ．カンサ
シイ（Ｋ．マツオら、1990年，Infect.Immun.58:550-55
6）からクローン化された。その後、同様の遺伝子がら
い菌（M.leprae）で同定され（Ｌ．リマ（Lima）ら、19
91年，Nu cl.Acids Res.19:5789）、そして最近、鳥型結
核菌で報告された（Ｎ．オハラ（Ohara）ら、1993年，I
nfect.Immun.61:1173-1179）。２種類の鳥型結核菌特異
的エピトープは、一連のタンパク質欠失を構築すること
によって鳥型結核菌α抗原タンパク質中で同定された。
これらの鳥型結核菌特異的エピトープは、アミノ酸配列
中のＧｌｙ−１６９〜Ｇｌｎ−３１９およびＬｅｕ−３
１８〜Ｇｌｙ−３３０に地図で示された。
類の抗原（Ａ、ＢおよびＣ）から成り且つミコバクテリ
ア増殖の第一段階で多量に生成される。これらのタンパ
ク質は、γインターフェロン合成を誘導し、フィブロネ
クチンに対して結合し、そして細胞性および体液性免疫
を刺激するので、それらは免疫病理学において重要な役
割を果たしていると考えられる。ＢＣＧ８５−Ｂはα抗
原に対応する。ＢＣＧ８５−Ｂをコードしている遺伝子
は、最初、ウシ型結核菌（Ｋ．マツオ（Matsuo）ら、19
88年，J.Bacteriol.170:3847-3854）およびＭ．カンサ
シイ（Ｋ．マツオら、1990年，Infect.Immun.58:550-55
6）からクローン化された。その後、同様の遺伝子がら
い菌（M.leprae）で同定され（Ｌ．リマ（Lima）ら、19
91年，Nu cl.Acids Res.19:5789）、そして最近、鳥型結
核菌で報告された（Ｎ．オハラ（Ohara）ら、1993年，I
nfect.Immun.61:1173-1179）。２種類の鳥型結核菌特異
的エピトープは、一連のタンパク質欠失を構築すること
によって鳥型結核菌α抗原タンパク質中で同定された。
これらの鳥型結核菌特異的エピトープは、アミノ酸配列
中のＧｌｙ−１６９〜Ｇｌｎ−３１９およびＬｅｕ−３
１８〜Ｇｌｙ−３３０に地図で示された。
【０００８】本明細書中で用いられる若干の用語を以下
のように定義する。
のように定義する。
【０００９】増幅プライマーは、標的配列に対するハイ
ブリダイゼーション後のプライマーの伸長による標的配
列の増幅のためのプライマーである。ＳＤＡ増幅プライ
マー（標的結合配列）の３′末端は、標的配列の３′末
端にハイブリッド形成する。標的結合配列は、増幅プラ
イマーに対して標的特異性を与える。ＳＤＡ増幅プライ
マーは、その５′末端付近に制限エンドヌクレアーゼの
認識部位を更に含む。その認識部位は、Ｇ．ウォーカー
ら（1992年，PNAS，上記）によって記載されたように、
認識部位が半修飾されている場合にＤＮＡ二重らせんの
一方の鎖にニックを入れるであろう制限エンドヌクレア
ーゼに対する。ＳＤＡ増幅プライマーは、「Ｓ」プライ
マーと称することもできる（例えば、二本鎖配列の増幅
に対して１対の増幅プライマーを用いる場合、Ｓ1およ
びＳ2）。標的結合配列は、その標的特異性を決定する
プライマーの部分であるので、標的の末端に特別な配列
を必要としない増幅法に対して、増幅プライマーは、概
して、本質的に標的結合配列だけから本質的に成る。例
えば、ＰＣＲを用いる本発明による標的配列の増幅は、
表１の増幅プライマーの標的結合配列から成る増幅プラ
イマーを用いるであろう。標的に対して付加された制限
エンドヌクレアーゼ認識部位以外の特別な配列を必要と
する増幅法に対して（例えば、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡまた
は転写に基く増幅に対してＲＮＡポリメラーゼプロモー
ター）、必要とされる特別な配列は、オリゴヌクレオチ
ドの製造のための化学合成のような常套法を用いて、表
１で示された標的結合配列に対して結合することができ
る。
ブリダイゼーション後のプライマーの伸長による標的配
列の増幅のためのプライマーである。ＳＤＡ増幅プライ
マー（標的結合配列）の３′末端は、標的配列の３′末
端にハイブリッド形成する。標的結合配列は、増幅プラ
イマーに対して標的特異性を与える。ＳＤＡ増幅プライ
マーは、その５′末端付近に制限エンドヌクレアーゼの
認識部位を更に含む。その認識部位は、Ｇ．ウォーカー
ら（1992年，PNAS，上記）によって記載されたように、
認識部位が半修飾されている場合にＤＮＡ二重らせんの
一方の鎖にニックを入れるであろう制限エンドヌクレア
ーゼに対する。ＳＤＡ増幅プライマーは、「Ｓ」プライ
マーと称することもできる（例えば、二本鎖配列の増幅
に対して１対の増幅プライマーを用いる場合、Ｓ1およ
びＳ2）。標的結合配列は、その標的特異性を決定する
プライマーの部分であるので、標的の末端に特別な配列
を必要としない増幅法に対して、増幅プライマーは、概
して、本質的に標的結合配列だけから本質的に成る。例
えば、ＰＣＲを用いる本発明による標的配列の増幅は、
表１の増幅プライマーの標的結合配列から成る増幅プラ
イマーを用いるであろう。標的に対して付加された制限
エンドヌクレアーゼ認識部位以外の特別な配列を必要と
する増幅法に対して（例えば、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡまた
は転写に基く増幅に対してＲＮＡポリメラーゼプロモー
ター）、必要とされる特別な配列は、オリゴヌクレオチ
ドの製造のための化学合成のような常套法を用いて、表
１で示された標的結合配列に対して結合することができ
る。
【００１０】バンパープライマーすなわち外部プライマ
ーは、ＳＤＡによって増幅させることができる標的を生
じるのに用いられるプライマーである。バンパープライ
マーは、バンパープライマーの伸長が下流の増幅プライ
マーおよびその伸長生成物を置換するように、増幅プラ
イマーの上流の標的配列に対してアニーリングする。バ
ンパープライマーは、「Ｂ」プライマーと称することも
できる（例えば、１対の増幅プライマーの伸長生成物を
置換するのに１対のバンパープライマーを用いる場合、
Ｂ1およびＢ2）。バンパープライマーの伸長は、増幅プ
ライマーの伸長生成物を置換する一つの方法であるが、
加熱もまた、ある種の増幅反応において適当である。
ーは、ＳＤＡによって増幅させることができる標的を生
じるのに用いられるプライマーである。バンパープライ
マーは、バンパープライマーの伸長が下流の増幅プライ
マーおよびその伸長生成物を置換するように、増幅プラ
イマーの上流の標的配列に対してアニーリングする。バ
ンパープライマーは、「Ｂ」プライマーと称することも
できる（例えば、１対の増幅プライマーの伸長生成物を
置換するのに１対のバンパープライマーを用いる場合、
Ｂ1およびＢ2）。バンパープライマーの伸長は、増幅プ
ライマーの伸長生成物を置換する一つの方法であるが、
加熱もまた、ある種の増幅反応において適当である。
【００１１】標的または標的配列という用語は、増幅さ
れる核酸配列を意味する。これらは、増幅される元の核
酸配列、増幅される元の核酸配列の相補的第二鎖、およ
び増幅反応によって生成される元の配列のコピーのどち
らかの鎖を含む。これらのコピーは、増幅プライマーが
ハイブリッド形成する元の標的配列のコピーをそれらが
含んでいるという事実により、増幅可能な標的配列とし
ても役立つ。
れる核酸配列を意味する。これらは、増幅される元の核
酸配列、増幅される元の核酸配列の相補的第二鎖、およ
び増幅反応によって生成される元の配列のコピーのどち
らかの鎖を含む。これらのコピーは、増幅プライマーが
ハイブリッド形成する元の標的配列のコピーをそれらが
含んでいるという事実により、増幅可能な標的配列とし
ても役立つ。
【００１２】増幅反応中に生じる標的配列のコピーは、
増幅生成物、アンプリマーまたはアンプリコンと称され
る。
増幅生成物、アンプリマーまたはアンプリコンと称され
る。
【００１３】伸長生成物という用語は、増幅プライマー
のハイブリダイゼーションおよび標的配列を鋳型として
用いるポリメラーゼによる増幅プライマーの伸長によっ
て生成された標的配列の一本鎖コピーを意味する。
のハイブリダイゼーションおよび標的配列を鋳型として
用いるポリメラーゼによる増幅プライマーの伸長によっ
て生成された標的配列の一本鎖コピーを意味する。
【００１４】検定プローブという用語は、検定の検出ま
たは同定部分で用いられる任意のオリゴヌクレオチドを
意味する。本発明において、検定プローブは、ミコバク
テリアの複合体−、群−または種特異的検出または同定
に用いられるプローブである。検出用プローブおよび捕
捉プローブは検定プローブの例である。
たは同定部分で用いられる任意のオリゴヌクレオチドを
意味する。本発明において、検定プローブは、ミコバク
テリアの複合体−、群−または種特異的検出または同定
に用いられるプローブである。検出用プローブおよび捕
捉プローブは検定プローブの例である。
【００１５】検定範囲または検定範囲配列は、検定プロ
ーブがハイブリッド形成する標的配列の部分または他の
核酸である。
ーブがハイブリッド形成する標的配列の部分または他の
核酸である。
【００１６】種特異的という用語は、同属の他の種また
は異なる属の種の実質的な検出または増幅を伴わない微
生物の種の検出または増幅を意味する。属特異的とは、
異なる属の種の実質的な検出または増幅を伴わない、あ
る属の種の大多数の検出または増幅を意味する。群−ま
たは複合体特異的とは、同属の他の種または異なる属の
種の実質的な検出または増幅を伴わない、ある選択され
た群（例えば、ＭＡＣ）の同類種の大多数の検出または
増幅を意味する。
は異なる属の種の実質的な検出または増幅を伴わない微
生物の種の検出または増幅を意味する。属特異的とは、
異なる属の種の実質的な検出または増幅を伴わない、あ
る属の種の大多数の検出または増幅を意味する。群−ま
たは複合体特異的とは、同属の他の種または異なる属の
種の実質的な検出または増幅を伴わない、ある選択され
た群（例えば、ＭＡＣ）の同類種の大多数の検出または
増幅を意味する。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＭＡＣを含
む全２８種類の血液型亜型で見出された標的配列の複合
体特異的増幅に用いることができるオリゴヌクレオチド
プライマーを提供する。該標的配列は、ミコバクテリア
のα抗原の一部分をコードするＢＣＧ８５−Ｂ遺伝子の
６３ヌクレオチドセグメント（ヌクレオチド５０６〜５
６８）である。したがって、一つの対の増幅プライマー
は、鳥型結核菌およびＭ．イントラセルレア両方のＢＣ
Ｇ８５−Ｂ遺伝子からの標的配列を増幅する。更に提供
されるのは、鳥型結核菌およびＭ．イントラセルレア両
方の検定範囲に対してハイブリッド形成する検出用プロ
ーブである。これら二つの種間の配列変異のために、種
特異的検定プローブを設計することもできる。本発明の
プライマーはまた、ヒトのクローン病および家畜のヨー
ネ病に関係した鳥型結核菌の亜種であるパラ結核菌のＢ
ＣＧ８５−Ｂ標的配列の増幅および検出を可能にする。
む全２８種類の血液型亜型で見出された標的配列の複合
体特異的増幅に用いることができるオリゴヌクレオチド
プライマーを提供する。該標的配列は、ミコバクテリア
のα抗原の一部分をコードするＢＣＧ８５−Ｂ遺伝子の
６３ヌクレオチドセグメント（ヌクレオチド５０６〜５
６８）である。したがって、一つの対の増幅プライマー
は、鳥型結核菌およびＭ．イントラセルレア両方のＢＣ
Ｇ８５−Ｂ遺伝子からの標的配列を増幅する。更に提供
されるのは、鳥型結核菌およびＭ．イントラセルレア両
方の検定範囲に対してハイブリッド形成する検出用プロ
ーブである。これら二つの種間の配列変異のために、種
特異的検定プローブを設計することもできる。本発明の
プライマーはまた、ヒトのクローン病および家畜のヨー
ネ病に関係した鳥型結核菌の亜種であるパラ結核菌のＢ
ＣＧ８５−Ｂ標的配列の増幅および検出を可能にする。
【００１８】
【課題を解決するための手段】ＭＡＣ種のＢＣＧ８５−
Ｂ遺伝子の標的フラグメントの複合体特異的増幅および
検出を可能にする増幅プライマーおよび検定プローブを
提供する。本発明は、更に、鎖置換増幅（ＳＤＡ）によ
るＢＣＧ８５−Ｂ遺伝子中のＭＡＣ特異的標的の増幅に
特に有用であるオリゴヌクレオチドプローブおよびプラ
イマーを提供する。標的の増幅は、ＭＡＣ標的の存在ま
たは該標的が由来する特定のＭＡＣ種の識別を示すもの
としてまたは検出することができる。本発明のプライマ
ーは、鳥型結核菌およびＭ．イントラセルレア両方の標
的を、増幅プライマーハイブリダイゼーション部位の標
的のヌクレオチド配列がこれらの種間で異なるにもかか
わらず効率よく増幅し、ＳＤＡにおいて鳥型結核菌かま
たはＭ．イントラセルレアの標的の１０〜１００程度の
僅かな初期コピーの検出を可能にすることが分かった。
増幅された標的配列は、本発明の検定プローブに対する
ハイブリダイゼーションによって検出することができ
る。
Ｂ遺伝子の標的フラグメントの複合体特異的増幅および
検出を可能にする増幅プライマーおよび検定プローブを
提供する。本発明は、更に、鎖置換増幅（ＳＤＡ）によ
るＢＣＧ８５−Ｂ遺伝子中のＭＡＣ特異的標的の増幅に
特に有用であるオリゴヌクレオチドプローブおよびプラ
イマーを提供する。標的の増幅は、ＭＡＣ標的の存在ま
たは該標的が由来する特定のＭＡＣ種の識別を示すもの
としてまたは検出することができる。本発明のプライマ
ーは、鳥型結核菌およびＭ．イントラセルレア両方の標
的を、増幅プライマーハイブリダイゼーション部位の標
的のヌクレオチド配列がこれらの種間で異なるにもかか
わらず効率よく増幅し、ＳＤＡにおいて鳥型結核菌かま
たはＭ．イントラセルレアの標的の１０〜１００程度の
僅かな初期コピーの検出を可能にすることが分かった。
増幅された標的配列は、本発明の検定プローブに対する
ハイブリダイゼーションによって検出することができ
る。
【００１９】最初に、比較の配列情報を得るために、鳥
型結核菌以外のミコバクテリアのＢＣＧ８５−Ｂ遺伝子
を、ＰＣＲによって表１の配列番号：１４および配列番
号：１５を増幅プイラマーとして用いて増幅させた。遺
伝子の増幅部分は、鳥型結核菌配列のヌクレオチド４１
８〜６３５であった。次に、増幅生成物を配列順序決定
し、そしてそのようにして得られた配列をプライマー設
計用に整列させた。ＳＤＡによって用いるために開発さ
れたプライマーの例を表１で示す。更に示されているの
はＭＡＣ標的の検出用プローブである。増幅プライマー
中の典型的な制限エンドヌクレアーゼ認識部位（従来の
ＳＤＡに対してＨｉｎｃＩＩおよびｔＳＤＡに対してＢ
ｓｏＢＩ）を太字で示し、そして標的特異性（すなわ
ち、複合体特異性）を与える標的結合配列をイタリック
体で示す。鳥型結核菌において上流の増幅プライマー
（配列番号：１および配列番号：３〜６）がハイブリッ
ド形成するＢＣＧ８５−Ｂ遺伝子配列は、菌株ＡＴＣＣ
１５７６９と完全なワトソン・クリック相補性である
が、Ｍ．イントラセルレアＡＴＣＣ１３９５０とは５′
末端で一つのヌクレオチド誤対合を示す。プライマー配
列は、他のミコバクテリアの配列といくつかのヌクレオ
チド誤対合を示す。
型結核菌以外のミコバクテリアのＢＣＧ８５−Ｂ遺伝子
を、ＰＣＲによって表１の配列番号：１４および配列番
号：１５を増幅プイラマーとして用いて増幅させた。遺
伝子の増幅部分は、鳥型結核菌配列のヌクレオチド４１
８〜６３５であった。次に、増幅生成物を配列順序決定
し、そしてそのようにして得られた配列をプライマー設
計用に整列させた。ＳＤＡによって用いるために開発さ
れたプライマーの例を表１で示す。更に示されているの
はＭＡＣ標的の検出用プローブである。増幅プライマー
中の典型的な制限エンドヌクレアーゼ認識部位（従来の
ＳＤＡに対してＨｉｎｃＩＩおよびｔＳＤＡに対してＢ
ｓｏＢＩ）を太字で示し、そして標的特異性（すなわ
ち、複合体特異性）を与える標的結合配列をイタリック
体で示す。鳥型結核菌において上流の増幅プライマー
（配列番号：１および配列番号：３〜６）がハイブリッ
ド形成するＢＣＧ８５−Ｂ遺伝子配列は、菌株ＡＴＣＣ
１５７６９と完全なワトソン・クリック相補性である
が、Ｍ．イントラセルレアＡＴＣＣ１３９５０とは５′
末端で一つのヌクレオチド誤対合を示す。プライマー配
列は、他のミコバクテリアの配列といくつかのヌクレオ
チド誤対合を示す。
【００２０】
【表１】
【００２１】配列番号：１および配列番号：２は、従来
のＳＤＡにおいて標的の複合体特異的増幅に有用であ
る。ｔＳＤＡのための増幅プイラマーを対にした組合わ
せ（配列番号：３〜６と配列番号：７〜１０）で検査し
て、ＭＡＣ標的の増幅を確証した。試験されたプライマ
ー対全部が標的を検出可能な水準まで増幅した後、その
検定感度についてスクリーニングした。配列番号：１お
よび配列番号：２は、従来のＳＤＡにおいて最高の増幅
効率を示したが、配列番号：４および配列番号：８は、
ｔＳＤＡにおいて最高の増幅効率を示した。配列番号：
４／配列番号：８増幅プライマー対を用いる鳥型結核菌
およびＭ．イントラセルレア両方におけるＢＣＧ８５−
Ｂ標的の検出感度は、１０〜１００初期ゲノムであると
推定された。ヌクレオチド誤対合の存在は、完全に相補
的な複合体と比較して、プライマー−標的複合体を不安
定にさせると考えられたが、増幅効率が有意に減少する
ようには見えなかった。増幅反応および増幅プライマー
の伸長における標的配列に対する増幅プライマーの初期
ハイブリダイゼーションは、増幅プライマーによって与
えられた完全に相補的な配列と隣接した所望の標的配列
のコピーを生成する。したがって、誤対合は訂正され、
そしてこれらの末端に修飾された標的が増幅される。し
たがって、鳥型結核菌およびＭ．イントラセルレア両方
の修飾された標的の末端配列は同一になるが、増幅プラ
イマーを結合する配列間の検定範囲は未変化のままであ
り、鳥型結核菌およびＭ．イントラセルレアの増幅生成
物を区別することを可能にするであろう。出願人は、増
幅に適当な修飾された標的を生じるように、標的に対す
る誤対合プライマーの十分なハイブリダイゼーションが
存在する限りにおいて、核酸増幅のこの独特の特徴は、
増幅反応がプライマー／標的誤対合の有害な作用を克服
することを可能にすると仮定した。これは、このシステ
ムにおいて誤対合にかかわらず観察された高い増幅効率
を説明しうる。更に、増幅および検出反応条件の常套の
最適化は、検定感度をなお一層増加させると予想され
る。
のＳＤＡにおいて標的の複合体特異的増幅に有用であ
る。ｔＳＤＡのための増幅プイラマーを対にした組合わ
せ（配列番号：３〜６と配列番号：７〜１０）で検査し
て、ＭＡＣ標的の増幅を確証した。試験されたプライマ
ー対全部が標的を検出可能な水準まで増幅した後、その
検定感度についてスクリーニングした。配列番号：１お
よび配列番号：２は、従来のＳＤＡにおいて最高の増幅
効率を示したが、配列番号：４および配列番号：８は、
ｔＳＤＡにおいて最高の増幅効率を示した。配列番号：
４／配列番号：８増幅プライマー対を用いる鳥型結核菌
およびＭ．イントラセルレア両方におけるＢＣＧ８５−
Ｂ標的の検出感度は、１０〜１００初期ゲノムであると
推定された。ヌクレオチド誤対合の存在は、完全に相補
的な複合体と比較して、プライマー−標的複合体を不安
定にさせると考えられたが、増幅効率が有意に減少する
ようには見えなかった。増幅反応および増幅プライマー
の伸長における標的配列に対する増幅プライマーの初期
ハイブリダイゼーションは、増幅プライマーによって与
えられた完全に相補的な配列と隣接した所望の標的配列
のコピーを生成する。したがって、誤対合は訂正され、
そしてこれらの末端に修飾された標的が増幅される。し
たがって、鳥型結核菌およびＭ．イントラセルレア両方
の修飾された標的の末端配列は同一になるが、増幅プラ
イマーを結合する配列間の検定範囲は未変化のままであ
り、鳥型結核菌およびＭ．イントラセルレアの増幅生成
物を区別することを可能にするであろう。出願人は、増
幅に適当な修飾された標的を生じるように、標的に対す
る誤対合プライマーの十分なハイブリダイゼーションが
存在する限りにおいて、核酸増幅のこの独特の特徴は、
増幅反応がプライマー／標的誤対合の有害な作用を克服
することを可能にすると仮定した。これは、このシステ
ムにおいて誤対合にかかわらず観察された高い増幅効率
を説明しうる。更に、増幅および検出反応条件の常套の
最適化は、検定感度をなお一層増加させると予想され
る。
【００２２】本発明の増幅プライマーは、ＰＣＲ、従来
のＳＤＡ、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡおよびＴＡＳのような他
の核酸増幅プロトコールにおいても有用である。具体的
に、標的配列に対するプライマーの特異的ハイブリダイ
ゼーション、標的配列を鋳型として用いるプライマーの
伸長およびその伸長生成物の標的配列からの分離または
置換を用いるいずれの増幅プロトコールも、本発明の増
幅プライマーを用いることができる。特別な非標的結合
配列を必要としない増幅法（例えば、ＰＣＲ）に対し
て、増幅プライマーは、表１で挙げた増幅プライマーの
標的結合配列だけから成ることができる。表１で図示さ
れたプライマー配列は、ＳＤＡに必要とされ且つＳＤＡ
による増幅に先立つ標的生成反応において標的に対して
付加される特別な非標的結合配列（制限エンドヌクレア
ーゼ認識部位）を含む。標的に対して結合された他の特
別な非標的結合配列（例えば、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡおよ
びＴＡＳによって必要とされるＲＮＡポリメラーゼプロ
モーター）を必要とする増幅法は、選択された増幅法に
よって必要とされる配列に対して付加された本明細書中
で開示された標的結合配列を含む増幅プライマーを用い
ることができる。同様に、従来のＳＤＡまたはｔＳＤＡ
に適当な異なった制限エンドヌクレアーゼ認識部位を、
典型的な制限エンドヌクレアーゼ認識部位に代用するこ
とができる。本発明の標的結合配列のこれらの適応に
は、規定の配列のオリゴヌクレオチドの慣用的な製造法
（例えば、化学合成）および選択された増幅反応のプラ
イマーに対する構造的必要条件に関する当業者に容易に
入手可能な情報だけが必要である。本発明の標的結合配
列は、したがって、製造、スクリーニングおよび最適化
のための常套法だけを用いる種々の増幅反応でのＭＡＣ
特異的標的増幅および検出に対して容易に適応すること
ができる。
のＳＤＡ、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡおよびＴＡＳのような他
の核酸増幅プロトコールにおいても有用である。具体的
に、標的配列に対するプライマーの特異的ハイブリダイ
ゼーション、標的配列を鋳型として用いるプライマーの
伸長およびその伸長生成物の標的配列からの分離または
置換を用いるいずれの増幅プロトコールも、本発明の増
幅プライマーを用いることができる。特別な非標的結合
配列を必要としない増幅法（例えば、ＰＣＲ）に対し
て、増幅プライマーは、表１で挙げた増幅プライマーの
標的結合配列だけから成ることができる。表１で図示さ
れたプライマー配列は、ＳＤＡに必要とされ且つＳＤＡ
による増幅に先立つ標的生成反応において標的に対して
付加される特別な非標的結合配列（制限エンドヌクレア
ーゼ認識部位）を含む。標的に対して結合された他の特
別な非標的結合配列（例えば、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡおよ
びＴＡＳによって必要とされるＲＮＡポリメラーゼプロ
モーター）を必要とする増幅法は、選択された増幅法に
よって必要とされる配列に対して付加された本明細書中
で開示された標的結合配列を含む増幅プライマーを用い
ることができる。同様に、従来のＳＤＡまたはｔＳＤＡ
に適当な異なった制限エンドヌクレアーゼ認識部位を、
典型的な制限エンドヌクレアーゼ認識部位に代用するこ
とができる。本発明の標的結合配列のこれらの適応に
は、規定の配列のオリゴヌクレオチドの慣用的な製造法
（例えば、化学合成）および選択された増幅反応のプラ
イマーに対する構造的必要条件に関する当業者に容易に
入手可能な情報だけが必要である。本発明の標的結合配
列は、したがって、製造、スクリーニングおよび最適化
のための常套法だけを用いる種々の増幅反応でのＭＡＣ
特異的標的増幅および検出に対して容易に適応すること
ができる。
【００２３】本発明のプライマーは、多数の異なる標的
が同時に増幅される増幅反応（多種増幅または多種化
（multiplexing））においても有用である。例えば、Ｓ
ＤＡを用いる多種増幅は、米国特許第5,470,723号明細
書および米国特許第5,422,252号明細書で記載され、そ
れらの開示は本明細書に援用される。そこで開示された
ように、アダプタープライマーを用いると、ＢＣＧ８５
−Ｂ標的の末端配列を第二標的の一方の末端に付加する
ことができるし、そして第二標的の末端配列をＢＣＧ８
５−Ｂ標的の一方の末端に付加することができる。例え
ば、アダプタープライマーを製造するために、本明細書
中で開示されたＢＣＧ８５−Ｂ増幅プライマーの標的結
合配列の５′末端を、第二標的に対する増幅プライマー
の標的結合配列と実質的に同一であるアダプター配列に
対して結合することができる。第二標的に対して、アダ
プタープライマーは、第二標的に対してハイブリッド形
成する３′標的結合配列および、ＢＣＧ８５−Ｂに対す
る増幅プライマーの標的結合配列と実質的に同一である
５′配列を含む。それぞれの標的の末端セグメントを他
の一端に対して付加した後、それらを、ＢＣＧ８５−Ｂ
増幅プライマーおよび第二標的の増幅プライマーを含ん
で成る一つの対の増幅プライマーを用いて同時に増幅さ
せることができる。例えば、本発明のプライマーを、Ｉ
Ｓ６１１０増幅プライマーおよび適当なアダプタープラ
イマーと一緒に用いて、検定の検出部分での群または種
の同定と共に、種特異的（ヒト型結核菌）および複合体
特異的（ＭＡＣ）標的を同時に増幅することができる。
或いは、本発明のプライマーを、１６Ｓプライマーおよ
び適当なアダプタープライマーと一緒に用いて、検定の
検出部分でのＭＡＣの群特異的同定またはミコバクテリ
アの属特異的同定と共に、ミコバクテリウム属特異的お
よびＭＡＣ種特異的標的を同時に増幅することができ
る。
が同時に増幅される増幅反応（多種増幅または多種化
（multiplexing））においても有用である。例えば、Ｓ
ＤＡを用いる多種増幅は、米国特許第5,470,723号明細
書および米国特許第5,422,252号明細書で記載され、そ
れらの開示は本明細書に援用される。そこで開示された
ように、アダプタープライマーを用いると、ＢＣＧ８５
−Ｂ標的の末端配列を第二標的の一方の末端に付加する
ことができるし、そして第二標的の末端配列をＢＣＧ８
５−Ｂ標的の一方の末端に付加することができる。例え
ば、アダプタープライマーを製造するために、本明細書
中で開示されたＢＣＧ８５−Ｂ増幅プライマーの標的結
合配列の５′末端を、第二標的に対する増幅プライマー
の標的結合配列と実質的に同一であるアダプター配列に
対して結合することができる。第二標的に対して、アダ
プタープライマーは、第二標的に対してハイブリッド形
成する３′標的結合配列および、ＢＣＧ８５−Ｂに対す
る増幅プライマーの標的結合配列と実質的に同一である
５′配列を含む。それぞれの標的の末端セグメントを他
の一端に対して付加した後、それらを、ＢＣＧ８５−Ｂ
増幅プライマーおよび第二標的の増幅プライマーを含ん
で成る一つの対の増幅プライマーを用いて同時に増幅さ
せることができる。例えば、本発明のプライマーを、Ｉ
Ｓ６１１０増幅プライマーおよび適当なアダプタープラ
イマーと一緒に用いて、検定の検出部分での群または種
の同定と共に、種特異的（ヒト型結核菌）および複合体
特異的（ＭＡＣ）標的を同時に増幅することができる。
或いは、本発明のプライマーを、１６Ｓプライマーおよ
び適当なアダプタープライマーと一緒に用いて、検定の
検出部分でのＭＡＣの群特異的同定またはミコバクテリ
アの属特異的同定と共に、ミコバクテリウム属特異的お
よびＭＡＣ種特異的標的を同時に増幅することができ
る。
【００２４】アダプターに媒介された多種化において用
いられるプライマーの構造および機能は、米国特許第5,
470,723号明細書および米国特許第5,422,252号明細書で
記載されている。これらの技法を用いると、本発明のＢ
ＣＧ８５−Ｂ増幅プイラマーの標的結合配列を、プライ
マー構築のための常套法を用いてアダプター配列に対し
て付加し且つＢＣＧ８５−Ｂ標的および任意の選択され
た第二標的の多種増幅に用いることができる。例えば、
本発明のプライマーおよび上記特許で開示されたプライ
マーは、例えば、表２で示された多種プライマーを用い
て、ＭＡＣ特異的標的（ＢＣＧ８５−Ｂ）およびヒト型
結核菌（Ｍ．ｔｂ）種特異的標的（ＩＳ６１１０）のｔ
ＳＤＡ多種増幅に適応することができる。標的結合配列
をイタリック体で示し、制限エンドヌクレアーゼ認識部
位を太字で示し、そしてアダプター配列に下線を施して
いる。
いられるプライマーの構造および機能は、米国特許第5,
470,723号明細書および米国特許第5,422,252号明細書で
記載されている。これらの技法を用いると、本発明のＢ
ＣＧ８５−Ｂ増幅プイラマーの標的結合配列を、プライ
マー構築のための常套法を用いてアダプター配列に対し
て付加し且つＢＣＧ８５−Ｂ標的および任意の選択され
た第二標的の多種増幅に用いることができる。例えば、
本発明のプライマーおよび上記特許で開示されたプライ
マーは、例えば、表２で示された多種プライマーを用い
て、ＭＡＣ特異的標的（ＢＣＧ８５−Ｂ）およびヒト型
結核菌（Ｍ．ｔｂ）種特異的標的（ＩＳ６１１０）のｔ
ＳＤＡ多種増幅に適応することができる。標的結合配列
をイタリック体で示し、制限エンドヌクレアーゼ認識部
位を太字で示し、そしてアダプター配列に下線を施して
いる。
【００２５】
【表２】
【００２６】増幅生成物が生成されるＭＡＣ種は、ハイ
ブリダイゼーションによって同定されまたは区別され
て、検定の検出部分でプローブを検定することができ
る。ハイブリダイゼーションによる検出に対して、検出
用プローブ（例えば、配列番号：１３）は、典型的に、
検出可能な標識を付けられる。検出可能な標識は、標的
核酸に対するプローブのハイブリダイゼーションを示す
ものとして直接的にかまたは間接的に検出することがで
きる残基である。標識の直接的検出に対して、プローブ
は、放射性同位体を付けられ且つオートラジオグラフィ
ーによって検出されうるしまたは蛍光残基を付けられ且
つ当該技術分野において知られているように蛍光によっ
て検出されうる。或いは、プローブは、標識を検出可能
にするのに更に別の試薬を必要とする標識を付けること
によって間接的に検出することができる。間接的に検出
可能な標識としては、例えば、化学発光物質、目に見え
る反応生成物を生じる酵素、および標識された特異的結
合パートナー（例えば、抗体または抗原／ハプテン）に
対して結合することによって検出することができるリガ
ンド（例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジ
ン、ハプテン、抗体または抗原）がある。特に有用な標
識としては、（標識されたアビジンまたはストレプトア
ビジンに対して結合することによって検出可能な）ビオ
チンおよび（着色反応生成物を生じる酵素基質の添加に
よって検出可能な）西洋ワサビペルオキシダーゼまたは
アルカリ性ホスファターゼのような酵素がある。このよ
うな標識をオリゴヌクレオチドに対して加えるまたはこ
のような標識をオリゴヌクレオチド中に包含させる方法
は当該技術分野において周知であり、そしてこれらの方
法はいずれも、本発明において用いるのに適している。
ブリダイゼーションによって同定されまたは区別され
て、検定の検出部分でプローブを検定することができ
る。ハイブリダイゼーションによる検出に対して、検出
用プローブ（例えば、配列番号：１３）は、典型的に、
検出可能な標識を付けられる。検出可能な標識は、標的
核酸に対するプローブのハイブリダイゼーションを示す
ものとして直接的にかまたは間接的に検出することがで
きる残基である。標識の直接的検出に対して、プローブ
は、放射性同位体を付けられ且つオートラジオグラフィ
ーによって検出されうるしまたは蛍光残基を付けられ且
つ当該技術分野において知られているように蛍光によっ
て検出されうる。或いは、プローブは、標識を検出可能
にするのに更に別の試薬を必要とする標識を付けること
によって間接的に検出することができる。間接的に検出
可能な標識としては、例えば、化学発光物質、目に見え
る反応生成物を生じる酵素、および標識された特異的結
合パートナー（例えば、抗体または抗原／ハプテン）に
対して結合することによって検出することができるリガ
ンド（例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジ
ン、ハプテン、抗体または抗原）がある。特に有用な標
識としては、（標識されたアビジンまたはストレプトア
ビジンに対して結合することによって検出可能な）ビオ
チンおよび（着色反応生成物を生じる酵素基質の添加に
よって検出可能な）西洋ワサビペルオキシダーゼまたは
アルカリ性ホスファターゼのような酵素がある。このよ
うな標識をオリゴヌクレオチドに対して加えるまたはこ
のような標識をオリゴヌクレオチド中に包含させる方法
は当該技術分野において周知であり、そしてこれらの方
法はいずれも、本発明において用いるのに適している。
【００２７】増幅生成物を検出する一つの方法は、検定
範囲に対して特異的にハイブリッド形成したプライマー
のポリメラーゼ伸長を用いる。そのプライマーを上記の
ように、例えば、放射性同位体によって標識し、その結
果、標識はアンプリコン特異的伸長生成物中にプライマ
ーと一緒に包含される。プライマー伸長による検出は、
Ｇ．ウォーカーら（1992年，Nucl.Acids Res.およびPNA
S、上記）によって記載されている。配列番号：１３
は、少なくとも一つのＭＡＣ種からの標的の存在を示す
増幅したＢＣＧ８５−Ｂ標的の検出のための本発明の増
幅プライマーと一緒にプライマー伸長検出用プローブと
して用いることができる。増幅生成物を検出する第二の
方法は、ビオチニル化オリゴヌクレオチド捕捉プローブ
および、Ｃ．Ａ．スパーゴ（Spargo）ら（1993年，Mole
c.Cell.Probes 7,395-404）によって記載の酵素結合オ
リゴヌクレオチド検出用プローブを用いて増幅生成物を
検出する化学発光検定である。検定範囲中の異なる部位
に対するこれら二つのプローブのハイブリダイゼーショ
ン後、複合体をストレプトアビジン被覆マイクロウェル
プレート上で捕捉し、そして化学発光シグナルを生じさ
せ且つルミノメーターで読み取る。配列番号：１３は、
この種類の捕捉／検出用検定において（検出可能な標識
に結合した）検出用プローブまたは（固相捕捉に適当な
リガンドに結合した）捕捉プローブとして用いることが
できる。
範囲に対して特異的にハイブリッド形成したプライマー
のポリメラーゼ伸長を用いる。そのプライマーを上記の
ように、例えば、放射性同位体によって標識し、その結
果、標識はアンプリコン特異的伸長生成物中にプライマ
ーと一緒に包含される。プライマー伸長による検出は、
Ｇ．ウォーカーら（1992年，Nucl.Acids Res.およびPNA
S、上記）によって記載されている。配列番号：１３
は、少なくとも一つのＭＡＣ種からの標的の存在を示す
増幅したＢＣＧ８５−Ｂ標的の検出のための本発明の増
幅プライマーと一緒にプライマー伸長検出用プローブと
して用いることができる。増幅生成物を検出する第二の
方法は、ビオチニル化オリゴヌクレオチド捕捉プローブ
および、Ｃ．Ａ．スパーゴ（Spargo）ら（1993年，Mole
c.Cell.Probes 7,395-404）によって記載の酵素結合オ
リゴヌクレオチド検出用プローブを用いて増幅生成物を
検出する化学発光検定である。検定範囲中の異なる部位
に対するこれら二つのプローブのハイブリダイゼーショ
ン後、複合体をストレプトアビジン被覆マイクロウェル
プレート上で捕捉し、そして化学発光シグナルを生じさ
せ且つルミノメーターで読み取る。配列番号：１３は、
この種類の捕捉／検出用検定において（検出可能な標識
に結合した）検出用プローブまたは（固相捕捉に適当な
リガンドに結合した）捕捉プローブとして用いることが
できる。
【００２８】本発明のＢＣＧ８５−Ｂ標的配列の検定範
囲の常套分析により、鳥型結核菌、パラ結核菌および／
またはＭ．イントラセルレア増幅生成物の検出用に、本
明細書中で提供された配列情報を用いて更に別の検定プ
ローブを設計することができる。配列番号：１３は、検
出用プローブとして用いられた場合、３種類のＭＡＣ種
全部の標的を検出する。しかしながら、鳥型結核菌およ
びＭ．イントラセルレアの増幅生成物の検定範囲はいく
つかのヌクレオチド位置で互いに異なるので、所望の標
的の検定範囲に特異的な検定プローブを用いてそれらの
種を区別することもできる。
囲の常套分析により、鳥型結核菌、パラ結核菌および／
またはＭ．イントラセルレア増幅生成物の検出用に、本
明細書中で提供された配列情報を用いて更に別の検定プ
ローブを設計することができる。配列番号：１３は、検
出用プローブとして用いられた場合、３種類のＭＡＣ種
全部の標的を検出する。しかしながら、鳥型結核菌およ
びＭ．イントラセルレアの増幅生成物の検定範囲はいく
つかのヌクレオチド位置で互いに異なるので、所望の標
的の検定範囲に特異的な検定プローブを用いてそれらの
種を区別することもできる。
【００２９】
実施例１ ＭＡＣ種のＢＣＧ８５−Ｂ標的の検出感度を試験して、
ＳＤＡによって検出されうる鳥型結核菌株ＡＴＣＣ２５
２９１およびＭ．イントラセルレアＡＴＣＣ１３９５０
の最小限の初期ゲノムコピー数を決定した。ミコバクテ
リアゲノムＤＮＡを単離し且つヒト胎盤ＤＮＡ ５０ｎ
ｇ中で希釈した。ＳＤＡ反応は、本質的には、Ｇ．ウォ
ーカーら（1992年，Nucl.Acids Res.，上記）によって
記載のようにまたは公開欧州特許出願第0684315号明細
書で記載のように、反応当り１０6、１０5、１０4、１
０3、１０2および０初期ミコバクテリアゲノム並びに試
験される具体的なプライマー対に適当な制限エンドヌク
レアーゼを用いて行われた。ｔＳＤＡ反応は、１０初期
ゲノムを含む希釈液を更に含んだ。引き続きの増幅反応
の汚染除去を促進するために、公開欧州特許出願第0624
643号明細書で記載のように、ｄＵＴＰをＴＴＰの代わ
りに置き換えた。酵素の添加および増幅反応の開始の前
に、試料を２分間煮沸した後、ＵＮＧ１単位と一緒に４
１℃で２分間インキュベートして、混入したアンプリコ
ンを全て分解した。ＵＮＧと一緒に３０分間インキュベ
ーション後、増幅反応に適当な温度で試料を５分間平衡
させ、そして酵素を加えた。従来のＳＤＡ反応に対し
て、反応混合物は４１℃で平衡させた。次に、Ｈｉｎｃ
ＩＩおよびエキソ-クレノウポリメラーゼを加え、そし
て増幅反応を４１℃で２時間進行させた。ｔＳＤＡ反応
はＢｓｏＢＩおよびＢｓｔポリメラーゼを含み且つ５２
℃で３０分間インキュベートした。増幅は、試料を５分
間沸騰させることによって終結した。増幅した生成物
は、５′末端に32Ｐによって標識された配列番号：１３
のハイブリダイゼーションによって検出された。ハイブ
リッド形成した検出用プローブは、Ｔ４ポリメラーゼを
用いて（３７℃，１０分間）診断長さまで伸長された。
伸長は、５０％尿素５μＬ、０．５Ｘ ＴＢＥ、１０ｍ
Ｍ Ｎａ2ＥＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノ ールブル
ー／シレンシアノールの添加によって終結した。伸長生
成物は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびオート
ラジオグラフィーによって分析された。
ＳＤＡによって検出されうる鳥型結核菌株ＡＴＣＣ２５
２９１およびＭ．イントラセルレアＡＴＣＣ１３９５０
の最小限の初期ゲノムコピー数を決定した。ミコバクテ
リアゲノムＤＮＡを単離し且つヒト胎盤ＤＮＡ ５０ｎ
ｇ中で希釈した。ＳＤＡ反応は、本質的には、Ｇ．ウォ
ーカーら（1992年，Nucl.Acids Res.，上記）によって
記載のようにまたは公開欧州特許出願第0684315号明細
書で記載のように、反応当り１０6、１０5、１０4、１
０3、１０2および０初期ミコバクテリアゲノム並びに試
験される具体的なプライマー対に適当な制限エンドヌク
レアーゼを用いて行われた。ｔＳＤＡ反応は、１０初期
ゲノムを含む希釈液を更に含んだ。引き続きの増幅反応
の汚染除去を促進するために、公開欧州特許出願第0624
643号明細書で記載のように、ｄＵＴＰをＴＴＰの代わ
りに置き換えた。酵素の添加および増幅反応の開始の前
に、試料を２分間煮沸した後、ＵＮＧ１単位と一緒に４
１℃で２分間インキュベートして、混入したアンプリコ
ンを全て分解した。ＵＮＧと一緒に３０分間インキュベ
ーション後、増幅反応に適当な温度で試料を５分間平衡
させ、そして酵素を加えた。従来のＳＤＡ反応に対し
て、反応混合物は４１℃で平衡させた。次に、Ｈｉｎｃ
ＩＩおよびエキソ-クレノウポリメラーゼを加え、そし
て増幅反応を４１℃で２時間進行させた。ｔＳＤＡ反応
はＢｓｏＢＩおよびＢｓｔポリメラーゼを含み且つ５２
℃で３０分間インキュベートした。増幅は、試料を５分
間沸騰させることによって終結した。増幅した生成物
は、５′末端に32Ｐによって標識された配列番号：１３
のハイブリダイゼーションによって検出された。ハイブ
リッド形成した検出用プローブは、Ｔ４ポリメラーゼを
用いて（３７℃，１０分間）診断長さまで伸長された。
伸長は、５０％尿素５μＬ、０．５Ｘ ＴＢＥ、１０ｍ
Ｍ Ｎａ2ＥＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノ ールブル
ー／シレンシアノールの添加によって終結した。伸長生
成物は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびオート
ラジオグラフィーによって分析された。
【００３０】オートラジオグラフィーにおいて、検出さ
れる最小限の初期標的量である増幅プライマー対配列番
号：１／配列番号：２は、鳥型結核菌に対して１００お
よびＭ．イントラセルレアに対して１０００であり、そ
れぞれ、感度１〜１００および１００〜１０００を示し
た。ｔＳＤＡにおいて検出された初期標的の最小数は以
下の通りであった。
れる最小限の初期標的量である増幅プライマー対配列番
号：１／配列番号：２は、鳥型結核菌に対して１００お
よびＭ．イントラセルレアに対して１０００であり、そ
れぞれ、感度１〜１００および１００〜１０００を示し
た。ｔＳＤＡにおいて検出された初期標的の最小数は以
下の通りであった。
【００３１】 ＃初期ゲノム プライマー対 鳥型結核菌 Ｍ．イントラセルレア 配列番号：３／配列番号：７ １０2 １０2 配列番号：３／配列番号：８ １０2 １０2 配列番号：４／配列番号：７ １０3 １０2 配列番号：４／配列番号：８ １０2 １０2
【００３２】したがって、感度は、Ｍ．イントラセルレ
アの全プライマー対に対して、並びに鳥型結核菌の配列
番号：３／配列番号：７、配列番号：３／配列番号：８
および配列番号：４／配列番号：８に対して１０〜１０
０初期標的であると推定された。配列番号：４／配列番
号：７は、鳥型結核菌において１００〜１０００初期標
的の検出感度を与えた。
アの全プライマー対に対して、並びに鳥型結核菌の配列
番号：３／配列番号：７、配列番号：３／配列番号：８
および配列番号：４／配列番号：８に対して１０〜１０
０初期標的であると推定された。配列番号：４／配列番
号：７は、鳥型結核菌において１００〜１０００初期標
的の検出感度を与えた。
【００３３】実施例２ ＢＣＧ８５−Ｂ標的増幅についての検定のＭＡＣ特異性
を、インダーリードら、上記によって記載された２８Ｍ
ＡＣ血液型亜型で検査した。１０5ゲノムコピーを含む
核血液型亜型の細胞溶解産物を、従来のＳＤＡおよびｔ
ＳＤＡ反応において配列番号：１／配列番号：２および
配列番号：４／配列番号：８増幅プライマー対を用いて
増幅させた。増幅および増幅生成物の検出は前に記載さ
れた通りであった。
を、インダーリードら、上記によって記載された２８Ｍ
ＡＣ血液型亜型で検査した。１０5ゲノムコピーを含む
核血液型亜型の細胞溶解産物を、従来のＳＤＡおよびｔ
ＳＤＡ反応において配列番号：１／配列番号：２および
配列番号：４／配列番号：８増幅プライマー対を用いて
増幅させた。増幅および増幅生成物の検出は前に記載さ
れた通りであった。
【００３４】ＢＣＧ８５−Ｂ標的を、ｔＳＤＡおよび従
来のＳＤＡによって２８ＭＡＣ血液型亜型それぞれにお
いて検出可能に増幅させた。次に、増幅プライマーの種
および属交差反応性を、以下の微生物において配列番
号：１／配列番号：２プライマー対を用いて試験して、
従来のＳＤＡによって反応当り１０7ゲノムコピーを増
幅させた。試験されたミコバクテリアは、Ｍ．ケロネエ
（ＴＭＣ１５４３）、Ｍ．フォルツイツム（ＴＭＣ２８
０８）、Ｍ．ガストリ（gastri）（ＬＣＤＣ１３０
１）、Ｍ．ゴルドネエ（ＴＭＣ１３１８）、Ｍ．カンサ
シイ（ＴＭＣ１２０１）、Ｍ．マリヌム（marinum）
（ＬＣＤＣ８０１）、Ｍ．ミクロティ（ＬＣＤＣ２０
３）、Ｍ．スクロフラセウム（ＴＭＣ１３０２）、ヒト
型結核菌（ＶＡ４４）、Ｍ．キセノピ（xenopi）（ＬＣ
ＤＣ１９０１）、ウシ型結核菌（ＣＤＣ５２）、ウシ型
結核菌−ＢＣＧ（ＣＤＣ４）、Ｍ．アフリカヌム（ＡＴ
ＣＣ３５７１１）、Ｍ．マルモエンス（malmoense）
（ＢＤＤＩＳ３４７２）、Ｍ．フラベセンス（flavesce
ns）（ＬＣＤＣ２６０１）、Ｍ．テレエ（terrae）（Ｂ
ＤＤＩＳ３０１０）、Ｍ．ヘモフィルム（ＡＴＣＣ２７
５４８）、Ｍ．ゲネベンス（genevense）（ＰＩＲ）お
よびＭ．スズルガイ（szulgai）（ＴＭＣ１３２８）で
あった。試験された非ミコバクテリア種は、ジフテリア
菌（Corynebacterium diphtheriae）（ＡＴＣＣ１１９
１３）、コリネバクテリウム・キセローシス（Coryneba
cterium xerosis）（ＡＴＣＣ３７３）、コリネバクテ
リウム・シュードジフテリティクム（Corynebacterium
pseudodiphthericum）（ＡＴＣＣ１０７００）、ノカル
ジア・アステロイデス（Nocardia asteroides）（ＡＴ
ＣＣ３３０８）、ノカルジア・ブラジリエンシス（Noca
rdia brasiliensis）（ＡＴＣＣ１９２９６）、ノカル
ジア・オリエンタリス（Norcardia orientalis）（ＡＴ
ＣＣ１９７９５）、ストレプトミセス・ソマリエンシス
（Streptomyces somaliensis）（ＡＴＣＣ１３２０
１）、ストレプトミセス・グリセウス（Streptomyces g
riseus）（ＡＴＣＣ１０１３７）、ストレプトミセス・
アルブス（Streptomyces albus）（ＡＴＣＣ３００
４）、ストレプトミセス・ゲダネンシス（Streptomyces
gedanensis）（ＡＴＣＣ４８８０）、イスラエル放線
菌（Actinomyces israelii）（ＡＴＣＣ１００４９）、
ユーバクテリウム・レンツム（Eubacterium lentum）
（ＡＴＣＣ４３０５５）、ロドコッカス・エクイ（Rhod
ococcus equi）（ＡＴＣＣ６９３９）、ロドコッカス・
ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）（ＡＴＣＣ
１３８０８）、ざ瘡プロピオンバクテリウム（Propioni
bacterium acnes）（ＡＴＣＣ６９１９）、アクチノプ
ランス・アウランティコラー（Actinoplanesauranticol
or）（ＡＴＣＣ１５３３０）、ストレプトスポランジウ
ム・ビリジアルブム（Streptosporangium viridialbu
m）（ＡＴＣＣ３３３２８）およびストレプトベルティ
シリウム・アルボベルティシラツム（Streptoverticill
ium alboverticillatum）（ＡＴＣＣ２９８１８）であ
った。前述の微生物、並びにスメグマ菌（M.smegmati
s）（ＴＭＣ１５３３）およびＭ．シミエー（simiae）
（ＤＩＳ２３００、ＤＩＳ２３０１およびＤＩＳ２３０
８）もまた、ｔＳＤＡにおいて配列番号：４／配列番
号：８を用いて試験された。鳥型結核菌（ＡＴＣＣ２５
２９１）、Ｍ．イントラセルレア（ＡＴＣＣ１３９５
０）およびパラ結核菌（Linda）は、陽性対照として包
含された。
来のＳＤＡによって２８ＭＡＣ血液型亜型それぞれにお
いて検出可能に増幅させた。次に、増幅プライマーの種
および属交差反応性を、以下の微生物において配列番
号：１／配列番号：２プライマー対を用いて試験して、
従来のＳＤＡによって反応当り１０7ゲノムコピーを増
幅させた。試験されたミコバクテリアは、Ｍ．ケロネエ
（ＴＭＣ１５４３）、Ｍ．フォルツイツム（ＴＭＣ２８
０８）、Ｍ．ガストリ（gastri）（ＬＣＤＣ１３０
１）、Ｍ．ゴルドネエ（ＴＭＣ１３１８）、Ｍ．カンサ
シイ（ＴＭＣ１２０１）、Ｍ．マリヌム（marinum）
（ＬＣＤＣ８０１）、Ｍ．ミクロティ（ＬＣＤＣ２０
３）、Ｍ．スクロフラセウム（ＴＭＣ１３０２）、ヒト
型結核菌（ＶＡ４４）、Ｍ．キセノピ（xenopi）（ＬＣ
ＤＣ１９０１）、ウシ型結核菌（ＣＤＣ５２）、ウシ型
結核菌−ＢＣＧ（ＣＤＣ４）、Ｍ．アフリカヌム（ＡＴ
ＣＣ３５７１１）、Ｍ．マルモエンス（malmoense）
（ＢＤＤＩＳ３４７２）、Ｍ．フラベセンス（flavesce
ns）（ＬＣＤＣ２６０１）、Ｍ．テレエ（terrae）（Ｂ
ＤＤＩＳ３０１０）、Ｍ．ヘモフィルム（ＡＴＣＣ２７
５４８）、Ｍ．ゲネベンス（genevense）（ＰＩＲ）お
よびＭ．スズルガイ（szulgai）（ＴＭＣ１３２８）で
あった。試験された非ミコバクテリア種は、ジフテリア
菌（Corynebacterium diphtheriae）（ＡＴＣＣ１１９
１３）、コリネバクテリウム・キセローシス（Coryneba
cterium xerosis）（ＡＴＣＣ３７３）、コリネバクテ
リウム・シュードジフテリティクム（Corynebacterium
pseudodiphthericum）（ＡＴＣＣ１０７００）、ノカル
ジア・アステロイデス（Nocardia asteroides）（ＡＴ
ＣＣ３３０８）、ノカルジア・ブラジリエンシス（Noca
rdia brasiliensis）（ＡＴＣＣ１９２９６）、ノカル
ジア・オリエンタリス（Norcardia orientalis）（ＡＴ
ＣＣ１９７９５）、ストレプトミセス・ソマリエンシス
（Streptomyces somaliensis）（ＡＴＣＣ１３２０
１）、ストレプトミセス・グリセウス（Streptomyces g
riseus）（ＡＴＣＣ１０１３７）、ストレプトミセス・
アルブス（Streptomyces albus）（ＡＴＣＣ３００
４）、ストレプトミセス・ゲダネンシス（Streptomyces
gedanensis）（ＡＴＣＣ４８８０）、イスラエル放線
菌（Actinomyces israelii）（ＡＴＣＣ１００４９）、
ユーバクテリウム・レンツム（Eubacterium lentum）
（ＡＴＣＣ４３０５５）、ロドコッカス・エクイ（Rhod
ococcus equi）（ＡＴＣＣ６９３９）、ロドコッカス・
ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）（ＡＴＣＣ
１３８０８）、ざ瘡プロピオンバクテリウム（Propioni
bacterium acnes）（ＡＴＣＣ６９１９）、アクチノプ
ランス・アウランティコラー（Actinoplanesauranticol
or）（ＡＴＣＣ１５３３０）、ストレプトスポランジウ
ム・ビリジアルブム（Streptosporangium viridialbu
m）（ＡＴＣＣ３３３２８）およびストレプトベルティ
シリウム・アルボベルティシラツム（Streptoverticill
ium alboverticillatum）（ＡＴＣＣ２９８１８）であ
った。前述の微生物、並びにスメグマ菌（M.smegmati
s）（ＴＭＣ１５３３）およびＭ．シミエー（simiae）
（ＤＩＳ２３００、ＤＩＳ２３０１およびＤＩＳ２３０
８）もまた、ｔＳＤＡにおいて配列番号：４／配列番
号：８を用いて試験された。鳥型結核菌（ＡＴＣＣ２５
２９１）、Ｍ．イントラセルレア（ＡＴＣＣ１３９５
０）およびパラ結核菌（Linda）は、陽性対照として包
含された。
【００３５】従来のＳＤＡかまたは好熱性ＳＤＡにおい
て試験された非ミコバクテリア種のいずれにおいても、
増幅生成物は検出されなかった。ミコバクテリアの内、
従来のＳＤＡを用いた３種類のＭＡＣ種およびＭ．スズ
ルガイにおいてのみ検出可能な増幅が生じた。ｔＳＤＡ
において、Ｍ．スズルガイおよびＭ．シミエー（ＤＩＳ
２３０８）は、ＭＡＣに加えて陽性であった。更に別の
研究は、Ｍ．スズルガイおよびＭ．シミエー（ＤＩＳ２
３０８）両方の培養物および／またはＤＮＡ試料がＭ．
イントラセルレアによって汚染されていたことを示し、
したがって、最初の結果は偽陽性によると考えられた。
Ｍ．テレエ、Ｍ．フラベセンスおよびＭ．マルモエンス
はｔＳＤＡにおいて僅かに陽性であったが、ＭＡＣ種に
対して得られた強い陽性結果とは容易に区別された。ｔ
ＳＤＡの条件下での３種類の非ＭＡＣ種における検出の
この最小水準は、したがって、非現実的であると考えら
れ且つＭＡＣ標的の複合体特異的検出のための本発明の
プライマーおよびプローブの使用を妨げない。
て試験された非ミコバクテリア種のいずれにおいても、
増幅生成物は検出されなかった。ミコバクテリアの内、
従来のＳＤＡを用いた３種類のＭＡＣ種およびＭ．スズ
ルガイにおいてのみ検出可能な増幅が生じた。ｔＳＤＡ
において、Ｍ．スズルガイおよびＭ．シミエー（ＤＩＳ
２３０８）は、ＭＡＣに加えて陽性であった。更に別の
研究は、Ｍ．スズルガイおよびＭ．シミエー（ＤＩＳ２
３０８）両方の培養物および／またはＤＮＡ試料がＭ．
イントラセルレアによって汚染されていたことを示し、
したがって、最初の結果は偽陽性によると考えられた。
Ｍ．テレエ、Ｍ．フラベセンスおよびＭ．マルモエンス
はｔＳＤＡにおいて僅かに陽性であったが、ＭＡＣ種に
対して得られた強い陽性結果とは容易に区別された。ｔ
ＳＤＡの条件下での３種類の非ＭＡＣ種における検出の
この最小水準は、したがって、非現実的であると考えら
れ且つＭＡＣ標的の複合体特異的検出のための本発明の
プライマーおよびプローブの使用を妨げない。
【００３６】
【００３７】配列番号：1: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 37 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:1: TTGAATAGTT TCTTACAAGT TGACGATCCT CGGCGAT 37
【００３８】配列番号：2: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 37 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:2: TTGAATAGTT TCTTACAAGT TGACAGAGCG ATCCGGC 37
【００３９】配列番号：3: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 37 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:3: ACCGCATCGA ATGCATGTCT CGGGGATCCT CGGCGAT 37
【００４０】配列番号：4: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 38 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:4: ACCGCATCGA ATGCATGTCT CGGGGGATCC TCGGCGAT 38
【００４１】配列番号：5: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 39 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:5: ACCGCATCGA ATGCATGTCT CGGGCGGATC CTCGGCGAT 39
【００４２】配列番号：6: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 40 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:6: ACCGCATCGA ATGCATGTCT CGGGCCGGAT CCTCGGCGAT 40
【００４３】配列番号：7: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 37 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:7: CGATTCCGCT CCAGACTTCT CGGGAGAGCG ATCCGGC 37
【００４４】配列番号：8: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 38 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:8: CGATTCCGCT CCAGACTTCT CGGGGAGAGC GATCCGGC 38
【００４５】配列番号：9: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 39 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:9: CGATTCCGCT CCAGACTTCT CGGGCGAGAG CGATCCGGC 39
【００４６】配列番号：10: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 40 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:10: CGATTCCGCT CCAGACTTCT CGGGCCGAGA GCGATCCGGC 40
【００４７】配列番号：11: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 13 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:11: CAACGCCGCA GTC 13
【００４８】配列番号：12: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 13 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:12: GACGGGTCGA GCA 13
【００４９】配列番号：13: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 15 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:13: GATCCTGGCC GTCAA 15
【００５０】配列番号：14: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 17 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:14: TCCTGACCAG CGAGCTG 17
【００５１】配列番号：15: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 18 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:15: CCGGCGTCAC CCATCGCC 18
【００５２】配列番号：16: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 40 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:16: ACCGCATCGA ATGCATGTCT CGGGTGTACT GAGATCCCCT 40
【００５３】配列番号：17: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 29 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:17: GAGAGCGATC CGGCAAGGCG TACTCGACC 29
【００５４】配列番号：18: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 29 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: 配列番号:18: GTACTGAGAT CCCCTGGATC CTCGGCGAT 29
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:325） (72)発明者 クリスティーン・エイ・ロストコウスキー アメリカ合衆国メリーランド州21224，ボ ルチモア，イースト・プラット・ストリー ト 3000 (72)発明者 キース・シー・ウィリアムズ アメリカ合衆国メリーランド州21236，ボ ルチモア，ヒザーミル・ロード 8625 (72)発明者 レスリー・エイ・ストリングフェロー アメリカ合衆国メリーランド州21771，マ ウント・エアリー，ウッドビル・ロード 5829
Claims (10)
- 【請求項１】 配列番号：１、配列番号：２、配列番
号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、
配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９および配列
番号：１０の標的結合配列から成る群より選択される標
的結合配列並びに、場合により増幅反応に必要な配列か
ら成るオリゴヌクレオチド。 - 【請求項２】 増幅反応に必要な配列が、鎖置換増幅の
際に制限エンドヌクレアーゼによってニックを入れられ
る制限エンドヌクレアーゼ認識部位である請求項１に記
載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項３】 鳥型結核菌複合体の標的核酸配列を増幅
する方法であって、 （ａ）該標的核酸に対して（ｉ）配列番号：１、配列番
号：３、配列番号：４、配列番号：５および配列番号：
６の標的結合配列から成る群より選択される標的結合配
列並びに、場合により増幅反応に必要な配列から成る第
一増幅プライマー、および（ii）配列番号：２、配列番
号：７、配列番号：８、配列番号：９および配列番号：
１０の標的結合配列から成る群より選択される標的結合
配列並びに、場合により増幅反応に必要な配列から成る
第二増幅プライマーをハイブリッド形成させ；そして （ｂ）ハイブリッド形成した第一および第二増幅プライ
マーを標的核酸配列上で伸長し、それによって標的核酸
配列を増幅することを含む上記方法。 - 【請求項４】 増幅反応に必要な配列が、鎖置換増幅の
際に制限エンドヌクレアーゼによってニックを入れられ
る制限エンドヌクレアーゼの認識部位である請求項３に
記載の方法。 - 【請求項５】 鳥型結核菌複合体の標的核酸配列を増幅
する方法であって、 （ａ）該標的核酸に対して（ｉ）配列番号：１、配列番
号：３、配列番号：４、配列番号：５または配列番号：
６から成る第一増幅プライマー、および（ii）配列番
号：２、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９ま
たは配列番号：１０から成る第二増幅プライマーをハイ
ブリッド形成させ；そして （ｂ）鎖置換増幅反応で標的核酸を増幅することを含む
上記方法。 - 【請求項６】 増幅した標的核酸を、検出用プローブに
対するハイブリダイゼーションによって検出することを
更に含む請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 第一および第二標的を同時に増幅する方
法であって、 （ａ）第一増幅プライマーを該第一標的に対してハイブ
リッド形成させ、該第一増幅プライマーは、配列番号：
１または配列番号：２の標的結合配列および、制限エン
ドヌクレアーゼの二本鎖半修飾認識部位の一方の鎖にニ
ックを入れる制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含
み、該第一増幅プライマーを伸長して第一伸長生成物を
生じ、そして該第一伸長生成物を置換し； （ｂ）該第一伸長生成物に対して、配列番号：２の標的
結合配列または配列番号：１の標的結合配列および、該
第二標的に対してハイブリッド形成する第二増幅プライ
マーの標的結合配列と実質的に同一の第一アダプター配
列から成る第一アダプタープライマーをハイブリッド形
成させ、該第二増幅プライマーは、制限エンドヌクレア
ーゼの認識部位を更に含み、該第一アダプタープライマ
ーを伸長して第二伸長生成物を生じ、そして該第二伸長
生成物を置換し； （ｃ）該第二増幅プライマーを該第二標的に対してハイ
ブリッド形成させ、該第二増幅プライマーを伸長して第
三伸長生成物を生じ、そして該第三伸長を置換し； （ｄ）該第三伸長生成物に対して、該第三伸長生成物に
対してハイブリッド形成する標的結合配列および、配列
番号：１の標的結合配列または配列番号：２の標的結合
配列から成る第二アダプター配列から成る第二アダプタ
ープライマーをハイブリッド形成させ、該第二アダプタ
ープライマーを伸長して第四伸長生成物を生じ、該第四
伸長生成物を置換し；そして （ｅ）該第一および第二増幅プライマーを用いて該第二
および第四伸長生成物を同時に増幅することを含む上記
方法。 - 【請求項８】 増幅した第一または第二標的を検出する
ことを更に含む請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 第一および第二標的を同時に増幅する方
法であって、 （ａ）第一増幅プライマーを該第一標的に対してハイブ
リッド形成させ、該第一増幅プイマーは、配列番号：４
または配列番号：８の標的結合配列および、制限エンド
ヌクレアーゼの二本鎖半修飾認識部位の一方の鎖にニッ
クを入れる制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含み、
該第一増幅プライマーを伸長して第一伸長生成物を生
じ、そして該第一伸長生成物を置換し； （ｂ）該第一伸長生成物に対して、配列番号：８の標的
結合配列または配列番号：４の標的結合配列および、該
第二標的に対してハイブリッド形成する第二増幅プライ
マーの標的結合配列と実質的に同一の第一アダプター配
列から成る第一アダプタープライマーをハイブリッド形
成させ、該第二増幅プライマーは制限エンドヌクレアー
ゼの認識部位を更に含み、該第一アダプタープライマー
を伸長して第二伸長生成物を生じ、そして該第二伸長生
成物を置換し； （ｃ）該第二増幅プライマーを該第二標的に対してハイ
ブリッド形成させ、該第二増幅プライマーを伸長して第
三伸長生成物を生じ、そして該第三伸長を置換し； （ｄ）該第三伸長生成物に対して、該第三伸長生成物に
対してハイブリッド形成する標的結合配列および、配列
番号：４の標的結合配列または配列番号：８の標的結合
配列から成る第二アダプター配列から成る第二アダプタ
ー配列から成る第二アダプタープライマーをハイブリッ
ド形成させ、該第二アダプタープライマーを伸長して第
四伸長生成物を生じ、該第四伸長生成物を置換し；そし
て （ｅ）該第一および第二増幅プライマーを用いて該第二
および第四伸長生成物を同時に増幅することを含む上記
方法。 - 【請求項１０】 第一増幅プライマーが配列番号：８か
ら成り、第一アダプタープライマーが配列番号：１８か
ら成り、第二増幅プイラマーが配列番号：１６から成
り、そして第二アダプタープライマーが配列番号：１７
から成る請求項９に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US616398 | 1996-03-15 | ||
| US08/616,398 US5691143A (en) | 1996-03-15 | 1996-03-15 | Amplification and detection of the alpha antigen gene of mycobacterium avium complex species |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH104984A true JPH104984A (ja) | 1998-01-13 |
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ID=24469282
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9058834A Pending JPH104984A (ja) | 1996-03-15 | 1997-03-13 | 鳥型結核菌複合種の増幅および検出 |
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|---|---|
| US (1) | US5691143A (ja) |
| EP (1) | EP0795611A1 (ja) |
| JP (1) | JPH104984A (ja) |
Cited By (3)
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|---|---|---|---|---|
| WO2007129628A1 (ja) | 2006-05-02 | 2007-11-15 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | マイコバクテリウム・イントラセルラーレ検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたマイコバクテリウム・イントラセルラーレの検出方法 |
| WO2008075520A1 (ja) | 2006-12-18 | 2008-06-26 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | マイコバクテリウム・アビウム検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたマイコバクテリウム・アビウムの検出方法 |
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| US20020025519A1 (en) * | 1999-06-17 | 2002-02-28 | David J. Wright | Methods and oligonucleotides for detecting nucleic acid sequence variations |
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| FR2694754B1 (fr) * | 1992-08-12 | 1994-09-16 | Bio Merieux | Fragments d'ADN de mycobactéries, amorces d'amplification, sondes d'hybridation, réactifs et procédé de détection de détection de mycobactéries. |
| US5314801A (en) * | 1992-11-06 | 1994-05-24 | Becton, Dickinson And Company | Probes to Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, and Mycobacterium paratuberculosis |
| US5422252A (en) * | 1993-06-04 | 1995-06-06 | Becton, Dickinson And Company | Simultaneous amplification of multiple targets |
| US5470723A (en) * | 1993-05-05 | 1995-11-28 | Becton, Dickinson And Company | Detection of mycobacteria by multiplex nucleic acid amplification |
| US6136529A (en) * | 1993-09-03 | 2000-10-24 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid probes to Mycobacterium avium complex |
-
1996
- 1996-03-15 US US08/616,398 patent/US5691143A/en not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-03-12 EP EP97104197A patent/EP0795611A1/en not_active Withdrawn
- 1997-03-13 JP JP9058834A patent/JPH104984A/ja active Pending
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| US8188256B2 (en) | 2006-05-02 | 2012-05-29 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Primer and probe for detection of Mycobacterium intracellulare |
| WO2008075520A1 (ja) | 2006-12-18 | 2008-06-26 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | マイコバクテリウム・アビウム検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたマイコバクテリウム・アビウムの検出方法 |
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| WO2009145181A1 (ja) | 2008-05-28 | 2009-12-03 | 和光純薬工業株式会社 | マイコバクテリウム・イントラセルラー検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたマイコバクテリウム・イントラセルラーの検出方法 |
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| US10359424B2 (en) | 2008-05-28 | 2019-07-23 | Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation | Primer and probe for detection of Mycobacterium intracellulare, and method for detection of Mycobacterium intracellulare using the primer or the probe |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5691143A (en) | 1997-11-25 |
| EP0795611A1 (en) | 1997-09-17 |
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