CN107604055A - 用VspI检测人胃癌LINC00520基因rs8012083多态性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用VspI检测人胃癌LINC00520基因rs8012083多态性的方法，包括以下步骤：抽提样品的基因组DNA；提供扩增人LINC00520基因多态性rs8012083位点附近序列的正向引物和反向引物，以提取的待测人基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获取扩增产物；使用限制性内切酶对获取的扩增产物进行酶切，获取相应的酶切产物；将酶切产物采用3％的琼脂糖凝胶进行电泳，以判定LINC00520基因多态性rs8012083的各基因型。本发明的方法简单、快速、安全、准确、灵敏度高,值得在临床和研究中推广，并可借鉴用于其它多态性基因的分型。

Description

用VspI检测人胃癌LINC00520基因rs8012083多态性的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用VspI检测人胃癌LINC00520基因rs8012083多态性的方法。

背景技术

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性,包括碱基的置换/插入和缺失等形式。SNP是人类可遗传的变异中最常见的一种，现已广泛用于简单和复杂疾病的遗传连锁分析/关联分析及疾病易感基因的定位，指导易感基因克隆。较常见的单碱基多态性位点的检测方法包括聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP),三引物等位基因扩增法(TP-PCR)和测序等，这些方法虽各有优点,但也各有其不足之处。

CAPs(cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites)CAPs技术又称为PCR-RFLP，限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)技术。PCR-RFLP是一种快速,简便,准确的检测SNP基因型的经典方法。其原理是：限制性内切酶是一类识别DNA特异位点(通常4-6bp)，并在特异位点进行切割的酶类。酶切位点的特异性意味着对特定等位基因的完全消化会产生同样的片段序列。而碱基的置换、插入和缺失可以产生或消除一个特定酶切位点，从而改变酶切后产生片段的大小和数目。这些酶切片段带型的不同称为限制性片段长度多态性。如果SNP产生和消除了某个限制性内切酶位点，则可以通过对PCR产物进行酶切、电泳加以检测。该方法的优点在于快速简单，终点判断准确。但其主要缺点在于酶切位点的选择，要求待测多态性位点和某一酶切位点相关。PCR-RFLP酶的选择具有局限性，并不是所有的SNP位点都可以用这种方法来鉴别，且部分内切酶价格昂贵，实验成本高。三引物等位基因扩增法(TP-PCR)是一种不需要限制性内切酶和连接酶的重组DNA方法。反应体系中有2种模板和3种引物,从而在同一个反应体系中产生一个重组DNA分子。这种方法的主要优点是快速，不依赖连接片段的限制酶位点。但其缺点是扩增效率低，扩增特异性差，无法保证PCR产物的特异性和稳定性，分型结果易造成误判。Taqman荧光探针法是一种新型高效准确的基因分型方法，其优点是检测灵敏度高，分型准确。但该方法需要昂贵的仪器和较长的步骤，成本较高。

胃癌(Gastric cancer，GC)是我国最常见的恶性肿瘤之一，每年新发和死亡病例分别为40.5万和32.5万，约占全球胃癌新发和死亡病例的42.5％和45.0％。2012年全国癌症登记数据显示，胃癌的年龄标化发病率和死亡率分别位居我国恶性肿瘤发病和死因顺位的第2位和第3位，虽然两者近年均呈明显的下降趋势。但随着人口的增长和老龄化的加速，每年新发病例依然在增加。全球胃癌患者5年生存率不足25％。主要由于胃癌癌前病变和早期癌患者缺乏特异性症状，80％患者被诊断时已处于疾病进展期，虽然我国对进展期胃癌治疗水平显著提升，但胃癌的早期诊断率依然有待提高。

胃癌是基因和环境等多因素协同或序贯作用下，并在神经-内分泌-免疫调控下，对阶段进行性发展并具有高低特异性的全身性疾病。长链非编码基因间RNA(longintergenic non-protein coding RNA 520，LINC00520)其编码基因位于人类染色体14q22.3。LINC00520长约20kb,为高度保守的长链非编码RNA，在多种组织中广泛地表达。LINC00520是2012年新发现的基因，它与西班牙儿童肥胖具有相关性。LncRNA在不同癌症患者与健康者中的差异表达也预示着LncRNA可能与癌症的发生发展密切相关。LINC00520在由致癌PI3K转化的乳腺上皮细胞中增加，其表达增加依赖于突变PIK3CA的敲除。表达谱分析强调LINC00520在人类乳腺癌中升高，尤其在基底样乳腺癌中优先富集。研究表明ShRNA介导LINC00520的消耗阻止乳腺癌细胞的迁移LINC00520由致癌基因Src、PIK3CA和STAT3调节，可能有助于乳腺癌的分子病因学研究。2015年陈明政等研究表明LINC00520在细胞株HK-1中呈低表达，LINC00520在非鼻咽癌组表达水平高于鼻咽癌组。LINC00520在鼻咽癌与鼻咽良性疾病中表达水平的改变提示其差异表达与鼻咽癌的发生发展有关。近年来LINC00520在肿瘤领域的研究取得了较大进展，但其在胃癌领域的研究开展相对较少，因此将一定功能相关的LINC00520位点多态性与胃癌结合起来可以更好的探讨其对胃癌形成过程的作用，揭示其与胃癌发生的关联性进而探讨其中的具体分子机制。

LINC00520基因rs8012083位点多态性在人群中存在三种基因型：AA型(人基因组rs8012083多态位点的两个等位基因碱基均为A)，AG型(人基因组rs8012083多态位点的两个等位基因碱基分别为A和G)和GG型(人基因组rs8012083多态位点的两个等位基因碱基均为G)(美国国立卫生研究院国立医学图书馆生物信息技术中心，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。

目前人LINC00520基因多态rs8012083的鉴定常采用PCR-RFLP方法。但是目前鉴定人LINC00520基因多态rs8012083时常使用的限制性内切酶价格昂贵(关于部分内切酶的参考价格可参考后面的表1)，实验成本高，难以在实验室中普及使用。

因此，本领域存在对操作简单、成本低、使用范围广的新型检测SNP方法的需求。

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种操作简单、成本低、适用范围广泛的用VspI检测人胃癌LINC00520基因rs8012083多态性的方法，在节约实验成本的前提下，改进PCR-RFLP技术，通过创造酶切位点法(Created Restriction Site PCR,CRS-PCR)，应用引物3’端错配技术,在PCR产物进行酶切电泳后进行基因型的鉴定，来开发经济、快速的检测人LINC00520基因rs8012083基因多态性的试剂盒。

其技术方案如下：

用VspI检测人胃癌LINC00520基因rs8012083多态性的方法，包括以下步骤：

(a)抽提样品的基因组DNA；

(b)提供扩增人LINC00520基因多态性rs8012083位点附近序列的正向引物和反向引物，以步骤(a)提取的待测人基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获取扩增产物；

(c)使用限制性内切酶对(b)中获取的扩增产物进行酶切，获取相应的酶切产物；

(d)将酶切产物采用3％的琼脂糖凝胶进行电泳，以判定LINC00520基因多态性rs8012083的各基因型。

进一步，步骤(b)中所述正向引物和反向引物的设计与合成具体为：碱基序列信息从NCBI的dbSNP数据库获取，在CHIP网站上进行核对，确定LINC00520多态位点碱基变异数据。含LINC00520rs8012083的部分基因序列如SEQ:ID:NO:1所示；基因序列的第507个碱基R代表了A/G多态，即为rs8012083的多态性位点。根据rs8012083的具体序列和多态性碱基的位置采用Primer Premier 6.0设计，设置引物长度和扩增目的片段长度等参数进行引物设计，根据GC含量和退火温度等选择最优上下游引物，再将此引物与Pubmed中的Blast序列比对功能(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行引物比对，最终确定的上下游引物，正向引物序列如SEQ:ID:NO:2所示；反向引物序列如SEQ:ID:NO:3所示，其中反向引物序列中倒数第2位碱基为T(扩增产物的对应位置为错配碱基A)，因此错配后PCR产物中多态附近序列由GTTACT或ATTACT更改为GTTAAT或ATTAAT(其中第1个碱基G/A为多态位点，第5个碱基A为错配碱基)。因此扩增产物中A等位基因片段可被识别ATTAAT序列的限制性内切酶识别(即A等位基因片段可被内切酶切开)；进而可以根据片段切开情况来判断多态基因型。

按照正向引物序列和反向引物序列合成引物，引物的合成可以采用本领域通用的方法(如固相合成法)，亦可委托生物公司合成并检测正向和反向引物。

进一步，步骤(b)中PCR扩增反应中制备PCR扩增体系具体为：2×Taq PCR Mix7.5μl，双蒸水5.9μl，上游引物0.3μl下游引物0.3μl以及模板DNA1.0μl，充分混匀后即得15.0μlPCR扩增反应体系；按照第一阶段：94℃变性5min，第二阶段共包括35个循环三个步骤，首先94℃变性30s，54℃退火45s，最后72℃延伸45s，第三阶段：72℃延伸5min，最终4℃储存以备用，即得长为157bp的PCR扩增产物。扩增后的产物序列如SEQ:ID:NO:4所示。

进一步，步骤(c)中进行酶切的酶切体系具体为：：PCR反应产物5μl，限制性内切酶0.5μl，Buffer1.0μl以及无核酸酶纯水8.5μl共计15μl酶切体系，于水浴锅中37℃酶切1-16h，即得酶切产物。综合考虑经济实用性以及简单操作性最终选择VspI进行酶切鉴定。

进一步，步骤(d)琼脂糖凝胶电泳，确定基因多态性具体为：将酶切产物用3％的琼脂糖凝胶在4-10V/cm的条件下，电泳20-40min，至紫外灯下能分清明显的条带后并拍照鉴定。对于不同的基因型，rs8012083位点不同基因型展现出不同的条带，野生基因型AA，长为138bp，19bp两条带；杂合基因型AG，长为157bp，138bp及19bp三条带；杂合基因型GG，157bp一条带。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明采用创造酶切位点法(Created Restriction Site PCR,CRS-PCR)，利用引物碱基错配技术设计检测LINC00520多态性rs8012083。由于这种方法应用了引物3’端错配技术，PCR产物进行酶切电泳后即可进行基因型的鉴定工作,因此在实际运用中具有很大的灵活性，且检测方法简单易行，是一种进行单碱基突变位点基因型鉴定的较好方法。本发明所提供得检测人胃癌易感基因LINC00520多态性rs8012083基因分型方法简单、快速、安全、准确、灵敏度高，值得在临床和研究中推广，并可借鉴用于其它多态性基因的分型。

附图说明

图1是LINC00520rs8012083位点的电泳图谱；

图2是LINC00520rs8012083位点AA基因型测序图谱；

图3是LINC00520rs8012083位点AG基因型测序图谱；

图4是LINC00520rs8012083位点GG基因型测序图谱。

具体实施方式

下面结合附图和实施例进一步说明本发明的技术方案。

本发明的方法包括以下步骤：

(a)抽提样品的基因组DNA；

(b)提供扩增人LINC00520基因多态性rs8012083位点附近序列的正向引物和反向引物，以步骤(a)提取的待测人基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获取扩增产物；

(c)使用限制性内切酶对(b)中获取的扩增产物进行酶切，获取相应的酶切产物；

(d)将酶切产物采用3％的琼脂糖凝胶进行电泳，以判定LINC00520基因多态性rs8012083的各基因型。

其中，经电泳后有一条条带者为GG基因型，两条条带者AA为基因型，三条条带者为AG基因型。上述方法中涉及的扩增、抽提基因组、酶切等技术均可采用本领域的常规操作方法。

其中，所述反向引物其3’末端与多态rs8012083碱基相隔2位碱基,反向引物倒数第2位碱基为T(扩增产物的对应位置为错配碱基A)，以便在扩增产物中与多态A等位基因形成ATTAAT结构(第1个碱基A为多态等位基因，第5个碱基A为错配碱基)。

本发明的方法可以通过引物上的错配碱基将SNP附近的序列改变为可被预先确定的限制性内切酶识别的序列。因此，可以克服传统的PCR-RFLP方法所存在的需要采用昂贵内切酶的缺陷，进而大大降低了检测SNP的成本。具体而言：由于该反向引物序列中倒数第2位碱基为T(扩增产物的对应位置为错配碱基A)，因此错配后PCR产物中多态附近序列由GTTACT或ATTACT更改为GTTAAT或ATTAAT(其中第1个碱基G/A为多态位点，第5个碱基A为错配碱基)。因此扩增产物中A等位基因片段可被识别ATTAAT序列的限制性内切酶识别(即A等位基因片段可被内切酶切开)；进而，可以根据片段切开情况来判断多态基因型。更具体地，经序列分析可知，基因原始序列中G/A多态可由表1中前两种内切酶识别。如通过碱基错配PCR将多态性位点后面第4位碱基C改变为A，则该多态为A等位基因经PCR扩增后包含ATTAAT序列可被识别ATTAAT序列的限制性内切酶VspI识别，而G等位基因不能切开。

本发明提供了一种检测胃癌易感基因的方法，由于识别特定位点的限制性内切酶VspI适用范围广，价钱较为经济，进而大大降低了检测SNP的成本。经序列分析发现，检测该G/A多态的方法可使用表1中的3种酶，其中前两种酶价格昂贵，且酶切效果不理想。在采用创造酶切位点法(Created Restriction Site PCR,CRS-PCR)对反向引物序列中倒数第2位碱基由G改变为T后，PCR产物中多态附近序列生成ATTAAT序列，从而可被限制性内切酶VspI识别。由于识别特定位点的限制性内切酶VspI适用范围广，价钱较为经济，进而大大降低了检测SNP的成本。因此，综合考虑简单操作性与经济实用性，限制性内切酶VspI是不二选择。

表1中提供的限制性内切酶的价格从NEB公司(http://www.neb-china.com)，限制性内切酶的选择从WatCut限制性内切酶分析软件上获取(http://watcut.uwaterloo.ca/template.php？act＝snp_new)，以此作为限制性内切酶识别位点和价格的参考。

表1几种限制性内切酶识别序列及其价格

在本发明的实施中，正向引物和反向引物的设计采用Primer6.0软件进行，设计的原则综合考虑引物对PCR扩增的灵敏度、特异度以及扩增效率的影响。按照碱基互补配对的原则设计引物，引物长度一般在15～30碱基之间，过长或短均会造成特异性差，过长还会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。引物GC含量在40％～60％之间，Tm值最好接近72℃，GC含量过高或过低都不利于引发反应。碱基要随机分布，引物自身及引物之间不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构使引物本身复性。引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。扩增产物的单链不能形成二级结构。引物应具有特异性，引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测，以确保其与其它基因不具有互补性。

在此基础上，最终选取的上游引物为5’-TGAGGAGATAAGGAGGGTAT-3’，下游引物为5’-GGGTTGAGGTCAGGCATT-3’。由此引物扩增出的面的片段157bp，扩增产物如下：TGAGGAGATA AGGAGGGTAT ACACACTAAT AACCATGTTG TATTAAAAAT GTACAGGAGC CTTGTGACCTGACCAAGGAC AAGATGTTTT GCAACCCTTT GGACTCCTGC TGATGCCTGG ATGTCTGTGG TCACTT RTTAATGCCTG ACCTCAACCC(157bp)

下划线部分分别为正向引物和反向引物，第137位碱基R代表G/A多态即SNP位点rs8012083。第141位碱基为错配后的碱基A(原为碱基C)。该长为157bp的扩增产物经限制性内切酶VspI酶切后可产生157bp，138bp，19bp共三种片段类型。基因型判定结果：野生基因型AA，长为138bp，19bp两条带；杂合基因型AG，长为157bp，138bp及19bp三条带；杂合基因型GG，157bp一条带。

凝胶电泳分为琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，琼脂糖(Agarose)是一种线性多糖聚合物，系从红色海藻产物琼脂中提取而来的。当琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质，其密度是由琼脂糖的浓度决定的，可用于DNA片段的制备电泳。聚丙烯酰胺凝胶主要有两种方式：一是用于分离和纯化双链DNA片段的非变性聚丙烯酰胺凝胶，二是用于分离及纯化单链DNA片段的变性聚丙烯酰胺凝胶。但综合考虑实用性、便利性以及经济性，使用琼脂糖凝胶电泳不失为一种最佳选择。在本发明中，目的扩增产物使用限制性核酸内切酶VspI 3U水浴锅中酶切1-16h。酶切产物采用3％的琼脂糖进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯照射下根据不同的条带判断野生纯合基因型，杂合基因型以及突变纯合基因型。

在本发明的具体实施方案中，本发明检测人LINC00520基因多态rs8012083的具体步骤如下：

(l)提取待测人基因组DNA模板，所述人基因组DNA模板为人体任何部分取得的人基因组模板。

(2)PCR扩增基因组DNA，对提取的模板基因组DNA进行PCR扩增，获得含多态附近序列的PCR产物。

(3)对PCR扩增产物用限制性核酸内切酶VspI进行酶切反应，得到酶切产物；

(4)酶切产物使用琼脂糖进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯照射下根据不同的条带判断野生纯合基因型，杂合基因型以及突变纯合基因型。

下面对上述各个主要步骤进行详细描述：

(1)引物设计与合成

碱基序列信息从NCBI的dbSNP数据库获取，在CHIP网站上进行核对，确定LINC00520多态位点碱基变异数据。含LINC00520rs8012083的部分基因序列如下：ATAAGTTATA AATATTAAAT GCAAAAGAAG GGAGCTTTTA TAGTCAGTAT TACCTATGTT GTTACTAACCTCAGAAAGGG CTACTGAAGG GAGCTGTATG TGGCAAGATG CTGCCAGTTC TGTGACTTTC TTGTTTGCCTGCTGCATTAC TTTGGACAGC TGCCTAGAAT GACCTTTATT GTTTATGGTG GAGCTGCACA TGTAACAGTGAAGAGAAATC TAACATAGTT GACTCCATCT TGCTTCTAAC CTCACAAGCT AACTGCCTTT TCTCATTTCTGCATGCAGGC CGAGGTAACT CTGGTAGAAA TTTAGTTTAT AGTTTAATTT AAAGCAAAGG TGATAACAGTCCCTTCCCAA AACTAACCCC TGAGGAGATA AGGAGGGTAT ACACACTAAT AACCATGTTG TATTAAAAATGTACAGGAGC CTTGTGACCT GACCAAGGAC AAGATGTTTT GCAACCCTTT GGACTCCTGC TGATGCCTGGATGTCTGTGG TCACTT R TTACTGCCTG ACCTCAACCC CTAACCTCCT CCTTGTTTCC CTTTCCCCAATATAAAAACA AGCTTGAGAT TCATGCCTTT ATTTTCATTT TTTCAAGATG GAGTCTTGCT CTGTTGCCCAGGCTGGAGTG CAGTGGCACG ATCTCGGCTC ACTACAACCT CCACCTCCTA GGTTAAGCAA TTCTCCTGCCTCAGCCTCCT GAGTAGCTGG GATTGCAGGC ATGTGCCACC ATGCCCAGCT AATTTTTGTA TTTTTAGTAGAGATGGGGTT TCACCATATT GACCAGGCTG CTGTCAAACT CCTGACCTCA TGATTCCCCC GCCTTGGGCTCCCAAAATGC TGGGATTACA GGTGTGAGCC ACTGCGCCTG GCCGAGATTC ATGCCTTTAA AGATGGTTCTTTACAACACT AGTCTGCCAT CTTCTTGGTT TGTTGGCCAT TGAAATAGTC GTTTTGCTTC CCCCAGCACCTTGTCTCTTG ACTTACTAGC TATTGTGCCG TGAGTGGTAT GAGTTTTGTA CCTGACAACA CACATATAAACCAAACAAAAAAGTAATTTT CAATTATAAA TCTCTTATAG TGTGTTTAAG CAAGCATAAG AACATGCATGTGTTGTAAGA ATGATAAAAA GATAATATCT AGTTTTGGCT AAGTGGTGGG GCAAAGCACT TCTTGTCTCCTGTTGGCAGG AGTTTGAACT GGCATAATTT TTCTGAAAGA AAATTTGGAA AAATTCTTTA AACACTAAAAGTGCGTATTT TTTGATGTAA CAATGCCATT TCTAGCAATG TATTCTAAAG ATATAATTAC AGTTTTGAACAGAGATTTAG CTATAAGGAT GTTCATTGTA GCATTGTTTA CAATAACAAT GAAAATTAGA AATGACTTACATGTCCAATA ATAGAATATT GGTAAAATAA ATTATAGTTT TTCCATACAA CAGAATAATT AGCAGCCAGTACAAACTGAG TTGTAGCAGA ATTTTTAATG ATACAATATA TTGTTAAGTC AGTTAAGCAG GCCATAAATAGTACATTCAG CCTGACTGTA ATTTGTTACA AAAAACAAGC ATGTGCAACT TTGATTTTCT AGCTTCCTCTAGCAACAAGA GGCTACACTT GTT

基因序列的第507个碱基R代表了A/G多态，即为rs8012083的多态性位点。根据rs8012083的具体序列和多态性碱基的位置采用Primer Premier 6.0设计，设置引物长度和扩增目的片段长度等参数进行引物设计，根据GC含量和退火温度等选择最优上下游引物，再将此引物与Pubmed中的Blast序列比对功能(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行引物比对，最终确定的上下游引物为：

正向引物序列：5’-TGAGGAGATAAGGAGGGTAT-3’

反向引物序列：5’-GGGTTGAGGTCAGGCATT-3’

其中反向引物序列中倒数第2位碱基为T(扩增产物的对应位置为错配碱基A)，因此错配后PCR产物中多态附近序列由GTTACT或ATTACT更改为GTTAAT或ATTAAT(其中第1个碱基G/A为多态位点，第5个碱基A为错配碱基)。因此扩增产物中A等位基因片段可被识别ATTAAT序列的限制性内切酶识别(即A等位基因片段可被内切酶切开)；进而，可以根据片段切开情况来判断多态基因型。

按照正向引物序列和反向引物序列合成引物，引物的合成可以采用本领域通用的方法(如固相合成法)，亦可委托生物公司合成并检测正向和反向引物。

(2)制备PCR扩增体系：2×Taq PCR Mix7.5μl，双蒸水5.9μl，上游引物0.3μl下游引物0.3μl以及模板DNA1.0μl，充分混匀后即得15.0μlPCR扩增反应体系；按照第一阶段：94℃变性5min，第二阶段共包括35个循环三个步骤，首先94℃变性30s，54℃退火45s，最后72℃延伸45s，第三阶段：72℃延伸5min，最终4℃储存以备用，即得长为157bp的PCR扩增产物。扩增后的产物序列为：

TGAGGAGATA AGGAGGGTAT ACACACTAAT AACCATGTTG TATTAAAAAT GTACAGGAGCCTTGTGACCT GACCAAGGAC AAGATGTTTT GCAACCCTTT GGACTCCTGC TGATGCCTGG ATGTCTGTGGTCACTT R TTAATGCCTG ACCTCAACCC下划线部分分别为正向引物和反向引物，第137位碱基R代表G/A多态即SNP位点rs8012083。第141位碱基为错配后的碱基A(原为碱基C)。

(3)酶切体系：PCR反应产物5μl，限制性内切酶0.5μl，Buffer1.0μl以及无核酸酶纯水8.5μl共计15μl酶切体系，于水浴锅中37℃酶切1-16h，即得酶切产物。综合考虑经济实用性以及简单操作性最终选择VspI进行酶切鉴定。

(4)琼脂糖凝胶电泳，确定基因多态性：将酶切产物用3％的琼脂糖凝胶在4-10V/cm的条件下，电泳20-40min，至紫外灯下能分清明显的条带后并拍照鉴定。对于不同的基因型，rs8012083位点不同基因型展现出不同的条带(见图1)，野生基因型AA，长为138bp，19bp两条带；杂合基因型AG，长为157bp，138bp及19bp三条带；杂合基因型GG，157bp一条带。各基因型均经测序以进一步鉴定，测序结果(见图2-4)显示与现有技术测得的结果完全相同。

实施例1.胃癌患者外周血全血标本测定人LINC00520rs8012083多态性

1材料与方法

1.1主要仪器与试剂

仪器：BCD-228CH冰箱(新飞电器)，HH-2数显恒温水浴锅(华峰仪器)，SmartGe凝胶成像仪(北京赛智创业)，GT9612梯度PCR仪(百泰克生物)，WD900SL23-2型号微波炉(格兰仕电器)，DG-300C型电泳仪(鼎国昌盛生物)等。

试剂：NEP004-1DNA提取试剂盒(鼎国昌盛生物)，50bp DNA Ladder(莱风生物)，2×Taq PCR Mix(莱风生物)，VspI(NEB)，琼脂糖(SIGMA)等。

1.2引物设计

在NCBI的dbSNP数据库中，查找LINC00520rs8012083的核苷酸序列，在引物设计软件Primer Premier 6.0中设计，设置引物长度和扩增目的片段长度等参数进行引物设计，根据GC含量和退火温度等选择最优上下游引物，再将此引物与Pubmed中的Blast序列比对功能(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行引物比对，最终确定的上下游引物为：

正向引物序列：5’-TGAGGAGATAAGGAGGGTAT-3’

反向引物序列：5’-GGGTTGAGGTCAGGCATT-3’

其中反向引物序列中倒数第2位碱基为T(扩增产物的对应位置为错配碱基A)，因此错配后PCR产物中多态附近序列由GTTACT或ATTACT更改为GTTAAT或ATTAAT(其中第1个碱基G/A为多态位点，第5个碱基A为错配碱基)。因此扩增产物中A等位基因片段可被识别ATTAAT序列的限制性内切酶识别(即A等位基因片段可被内切酶切开)；进而，可以根据片段切开情况来判断多态基因型。

按照正向引物序列和反向引物序列合成引物，引物的合成可以采用本领域通用的方法(如固相合成法)，亦可委托生物公司合成并检测正向和反向引物。

1.3限制性内切酶的选择

根据dbSNP中rs8012083位点的碱基序列，用WatCut在线限制性内切酶分析软件，在线搜索获得可识别突变位点的限制性内切酶的信息，综合考虑其酶切特异性及经济适用性选择最佳的限制性内切酶VspI。

1.4从胃癌患者全血中提取待测样本的基因组DNA

严格按照离心柱型DNA提取试剂盒操作步骤提取基因组DNA。

l)在1.5ml离心管中加入300μl血细胞后，再加入900μl细胞裂解液混和均匀，在冰上放置10min后，在离心机中12000rpm离心1min，弃上清，再次加入900μl细胞裂解液，用枪吹起沉淀并混匀后，重复上述步骤；

2)向沉淀物中加入600μl solution B溶液，用移液枪轻轻吹起沉淀后，加入10μl蛋白酶K混匀，在70℃水浴锅中放置10min后，12000rpm离心5min；

3)将离心管中的上清转入编过号的新的离心管中，再向新的离心管中加入500μl无水乙醇，期间可能会出现絮状沉淀物，该絮状物即为DNA；

4)将混匀的液体转入离心柱中(若一次转不完，可分次转入)，室温静置2min，再12000rpm离心1min，弃废液；

5)加入700μl已加入相应体积无水乙醇的solution C漂洗液，室温静置2min，12000rpm离心1min，弃废液；

6)加入700μl已加入相应体积无水乙醇的solution D漂洗液，室温静置2min，12000rpm离心1min，弃废液；

7)加入500μl solution D漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液；

8)再次离心2min，将离心柱置于新的编过号的离心管中，敞口放入37℃恒温箱内10min直至无明显乙醇味；

9)在硅基质膜中央加入已经预热到65℃的solution E 100μl，室温放置5min，12000rpm离心1min，重复上述步骤一次，终离心后的液体即为提取出的基因组DNA；

10)吸取2μl提取出的DNA用NanoPhotometer Pearl微量分光光度计测定其浓度和纯度。

2结果

2.1 PCR扩增

(1)根据提取基因组DNA的浓度，将研究对象的DNA进行稀释，使终浓度为20μg/μl。

(2)PCR扩增体系为2×Taq PCR Mix 7.5μl、上游引物和下游引物各0.3μl、模板DNA1.0μl，最后用双蒸水补充总体积至15μl。

(3)rs8012083位点的PCR反应条件：第一个阶段为预变性阶段，94℃/5min；第二个阶段包括三个步骤共35个循环，依次设置为94℃/35s、54℃退火时间45s、72℃/30s；第三个阶段72℃/5min。

2.2酶切反应

酶切体系为PCR扩增产物5μl、上限制性内切酶0.5μl、Buffer 1.0μl，最后用双蒸水补充总体积至15μl。混匀后置于水浴锅中37℃水浴1-16小时。

2.3基因型的判定

表2 rs8012083位点基因型判定

实施例2.人胃癌组织标本测定人LINC00520rs8012083多态性

与实施例1的步骤基本相同，只是采用下面的方法从胃癌组织标本中提取DNA作为待测DNA。

获取手术切取的胃癌组织，采用酚-氯仿法提取胃癌组织的基因组DNA作为待测DNA，提取步骤如下：

1)将胃癌组织块解冻，用生理盐水洗去血污，剪取0.1g的组织进行碾磨，加入1ml的灭菌水，颠倒混匀，10000rpm离心10min，弃上清。管底应该有沉淀，以上步骤重复两次。

2)加入200μl的DNA裂解液，5μl的蛋白酶K混匀，55℃水浴过夜消化。

3)消化完成后加入等体积的酚氯仿混合液(1:1)，剧烈震荡，使其变成奶咖色。12000rpm离心10min。

4)取上清时避免触及中间介质以及下层液体。加入等体积的氯仿后颠倒混匀。12000rm离心10min。

5)取上清，注意避免触及中间介质以及下层液体。加入1/10的醋酸钠以及2.5倍的无水乙醇，颠倒混匀，12000rpm离心10min，弃上清。

6)加入1ml 70％乙醇，使其白色沉淀悬浮，颠倒混匀数次，12000rpm离心10min，弃上清，室温静置5-10min使乙醇挥发干净。

7)加入50μl灭菌水溶解DNA，即得胃癌组织基因组DNA，-20℃保存。

结果：将酶切产物用3％的琼脂糖凝胶电泳20-40min，至紫外灯下能分清明显的条带并拍照鉴定。对于不同的基因型，rs8012083位点不同基因型展现出不同的条带(见图1)，AA野生基因型，长为138bp,19bp两条带；AG杂合基因型，长为157bp，138bp及19bp三条带；GG杂合基因型，157bp一条带。各基因型均经测序以进一步鉴定，测序结果(见图2-4)显示与现有技术测得的结果完全相同。

从上述实施例可以看出，本发明针对使用CRS-PCR鉴定LINC00520多态性rs8012083位点，对传统PCR-RFLP法进行改进，应用了引物3’端错配技术，克服了传统PCR-RFLP法内切酶选择性低，价格昂贵，实验成本高等缺点，本研究建立的LINC00520rs8012083多态性的检测方法，内切酶价格十分便宜，同时PCR产物纯度较高，酶切结果易于分辨。该检测方法通过测序验证，其结果准确可靠。

SNP检测技术已经很成熟，较常见的单碱基多态性位点的检测方法包括测序、三引物等位基因扩增法(TP-PCR)、聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)等方法。这些方法虽各有优点,但也各有其不足之处。测序可以直接测出DNA序列中的所有突变位点的碱基替代情况,但该方法需要昂贵的仪器和较长的步骤,成本较高；TP-PCR方法准确性低,结果易造成误判；PCR-RFLP方法比较成熟,但要求待测多态性位点和某一酶切位点相关,酶的选择具有局限性,往往成本较高。

因此，鉴于本发明所使用的限制性内切酶价格低廉，且引物合成以及各试剂均较为经济，加之CRS-PCR操作简单，重复性好，因此是最经济有效的基因型检测方法。

本发明对传统PCR-RFLP技术进行改进，采用创造酶切位点法(CreatedRestriction Site PCR,CRS-PCR)，利用引物碱基错配技术设计检测LINC00520多态性rs8012083。由于这种方法应用了引物3’端错配技术,PCR产物进行酶切电泳后即可进行基因型的鉴定工作,因此在实际运用中具有很大的灵活性,且检测方法简单易行,是一种进行单碱基突变位点基因型鉴定的较好方法。本项发明的技术关键点是设计出的LINC00520多态性rs8012083的上下游引物，

正向引物序列：5’-TGAGGAGATAAGGAGGGTAT-3’

反向引物序列：5’-GGGTTGAGGTCAGGCATT-3’

以及限制性内切酶VspI的使用。本发明所提供得检测人胃癌易感基因LINC00520多态性rs8012083基因分型方法简单、快速、安全、准确、灵敏度高，值得在临床和研究中推广，并可借鉴用于其它多态性基因的分型。

以上所述仅为本发明最佳实施方式，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 河南省肿瘤医院

<120> 用VspI检测人胃癌LINC00520基因rs8012083多态性的方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1630

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ataagttata aatattaaat gcaaaagaag ggagctttta tagtcagtat tacctatgtt 60

gttactaacc tcagaaaggg ctactgaagg gagctgtatg tggcaagatg ctgccagttc 120

tgtgactttc ttgtttgcct gctgcattac tttggacagc tgcctagaat gacctttatt 180

gtttatggtg gagctgcaca tgtaacagtg aagagaaatc taacatagtt gactccatct 240

tgcttctaac ctcacaagct aactgccttt tctcatttct gcatgcaggc cgaggtaact 300

ctggtagaaa tttagtttat agtttaattt aaagcaaagg tgataacagt cccttcccaa 360

aactaacccc tgaggagata aggagggtat acacactaat aaccatgttg tattaaaaat 420

gtacaggagc cttgtgacct gaccaaggac aagatgtttt gcaacccttt ggactcctgc 480

tgatgcctgg atgtctgtgg tcacttrtta ctgcctgacc tcaaccccta acctcctcct 540

tgtttccctt tccccaatat aaaaacaagc ttgagattca tgcctttatt ttcatttttt 600

caagatggag tcttgctctg ttgcccaggc tggagtgcag tggcacgatc tcggctcact 660

acaacctcca cctcctaggt taagcaattc tcctgcctca gcctcctgag tagctgggat 720

tgcaggcatg tgccaccatg cccagctaat ttttgtattt ttagtagaga tggggtttca 780

ccatattgac caggctgctg tcaaactcct gacctcatga ttcccccgcc ttgggctccc 840

aaaatgctgg gattacaggt gtgagccact gcgcctggcc gagattcatg cctttaaaga 900

tggttcttta caacactagt ctgccatctt cttggtttgt tggccattga aatagtcgtt 960

ttgcttcccc cagcaccttg tctcttgact tactagctat tgtgccgtga gtggtatgag 1020

ttttgtacct gacaacacac atataaacca aacaaaaaag taattttcaa ttataaatct 1080

cttatagtgt gtttaagcaa gcataagaac atgcatgtgt tgtaagaatg ataaaaagat 1140

aatatctagt tttggctaag tggtggggca aagcacttct tgtctcctgt tggcaggagt 1200

ttgaactggc ataatttttc tgaaagaaaa tttggaaaaa ttctttaaac actaaaagtg 1260

cgtatttttt gatgtaacaa tgccatttct agcaatgtat tctaaagata taattacagt 1320

tttgaacaga gatttagcta taaggatgtt cattgtagca ttgtttacaa taacaatgaa 1380

aattagaaat gacttacatg tccaataata gaatattggt aaaataaatt atagtttttc 1440

catacaacag aataattagc agccagtaca aactgagttg tagcagaatt tttaatgata 1500

caatatattg ttaagtcagt taagcaggcc ataaatagta cattcagcct gactgtaatt 1560

tgttacaaaa aacaagcatg tgcaactttg attttctagc ttcctctagc aacaagaggc 1620

tacacttgtt 1630

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgaggagata aggagggtat 20

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gggttgaggt caggcatt 18

<210> 4

<211> 157

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgaggagata aggagggtat acacactaat aaccatgttg tattaaaaat gtacaggagc 60

cttgtgacct gaccaaggac aagatgtttt gcaacccttt ggactcctgc tgatgcctgg 120

atgtctgtgg tcacttrtta atgcctgacc tcaaccc 157

Claims (5)

1.用VspI检测人胃癌LINC00520基因rs8012083多态性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)抽提样品的基因组DNA；

(b)提供扩增人LINC00520基因多态性rs8012083位点附近序列的正向引物和反向引物，以步骤(a)提取的待测人基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获取扩增产物；

(c)使用限制性内切酶对(b)中获取的扩增产物进行酶切，获取相应的酶切产物；

(d)将酶切产物采用3％的琼脂糖凝胶进行电泳，以判定LINC00520基因多态性rs8012083的各基因型。

2.根据权利要求1所述的用VspI检测人胃癌LINC00520基因rs8012083多态性的方法，其特征在于，步骤(b)中所述正向引物和反向引物的设计与合成具体为：碱基序列信息从NCBI的dbSNP数据库获取，在CHIP网站上进行核对，确定LINC00520多态位点碱基变异数据；含LINC00520rs8012083的部分基因序列如SEQ:ID:NO:1所示；基因序列的第507个碱基R代表了A/G多态，即为rs8012083的多态性位点；根据rs8012083的具体序列和多态性碱基的位置采用Primer Premier 6.0设计，设置引物长度和扩增目的片段长度的参数进行引物设计，根据GC含量和退火温度选择最优上下游引物，再将此引物与Pubmed中的Blast序列比对功能进行引物比对，最终确定的上下游引物，正向引物序列如SEQ:ID:NO:2所示；反向引物序列如SEQ:ID:NO:3所示，其中反向引物序列中倒数第2位碱基为T(扩增产物的对应位置为错配碱基A)，因此错配后PCR产物中多态附近序列由GTTACT或ATTACT更改为GTTAAT或ATTAAT；因此扩增产物中A等位基因片段能被识别ATTAAT序列的限制性内切酶识别；进而，根据片段切开情况来判断多态基因型；

按照正向引物序列和反向引物序列合成引物，引物的合成采用固相合成法，或者委托生物公司合成并检测正向和反向引物。

3.根据权利要求1所述的用VspI检测人胃癌LINC00520基因rs8012083多态性的方法，其特征在于，步骤(b)中PCR扩增反应中制备PCR扩增体系具体为：2×Taq PCR Mix7.5μl，双蒸水5.9μl，上游引物0.3μl下游引物0.3μl以及模板DNA1.0μl，充分混匀后即得15.0μlPCR扩增反应体系；按照第一阶段：94℃变性5min，第二阶段共包括35个循环三个步骤，首先94℃变性30s，54℃退火45s，最后72℃延伸45s，第三阶段：72℃延伸5min，最终4℃储存以备用，即得长为157bp的PCR扩增产物；扩增后的产物序列如SEQ:ID:NO:4所示。

4.根据权利要求1所述的用VspI检测人胃癌LINC00520基因rs8012083多态性的方法，其特征在于，步骤(c)中进行酶切的酶切体系具体为：PCR反应产物5μl，限制性内切酶0.5μl，Buffer1.0μl以及无核酸酶纯水8.5μl共计15μl酶切体系，于水浴锅中37℃酶切1-16h，即得酶切产物；综合考虑经济实用性以及简单操作性最终选择VspI进行酶切鉴定。

5.根据权利要求1所述的用VspI检测人胃癌LINC00520基因rs8012083多态性的方法，其特征在于，步骤(d)琼脂糖凝胶电泳，确定基因多态性具体为：将酶切产物用3％的琼脂糖凝胶在4-10V/cm的条件下，电泳20-40min，至紫外灯下能分清明显的条带后并拍照鉴定；对于不同的基因型，rs8012083位点不同基因型展现出不同的条带，野生基因型AA，长为138bp，19bp两条带；杂合基因型AG，长为157bp，138bp及19bp三条带；杂合基因型GG，157bp一条带。