CN108624699A - 用于鉴定中华鲟亲缘关系的双重pcr微卫星标记及其鉴定方法 - Google Patents
用于鉴定中华鲟亲缘关系的双重pcr微卫星标记及其鉴定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108624699A CN108624699A CN201810312498.3A CN201810312498A CN108624699A CN 108624699 A CN108624699 A CN 108624699A CN 201810312498 A CN201810312498 A CN 201810312498A CN 108624699 A CN108624699 A CN 108624699A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pcr
- affiliation
- mandarin sturgeon
- individual
- microsatellite marker
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了用于鉴定中华鲟亲缘关系的双重PCR微卫星标记及其应用,属于动物分子遗传学领域。本发明提供了中华鲟的双重PCR微卫星标记和利用该标记可以鉴定中华鲟个体之间的亲缘关系应用方法。利用本发明提供的微卫星标记可以快速鉴定个体之间的亲缘关系,避免了个体之间近亲繁殖。本发明提供的微卫星标记扩增结果具有高度的多态性和稳定性,并且本发明提供的双重PCR微卫星标记所消耗的财力和人力都比传统的PCR反应减少了一半,具有巨大的实用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于鉴定中华鲟亲缘关系的双重PCR微卫星标记及其应用,属于动物分子遗传学领域。
背景技术
中华鲟是全世界20余种鲟科鱼类中分布纬度最低,体型最大的鱼,为我国特有的的物种。上世纪70年代,长江里的繁殖群体能达到1万余尾,由于环境污染、过度捕捞、栖息地丧失等诸多因素中华鲟已濒临灭绝。对濒危物种的保护不仅保护濒危物种的个体而且对濒危物种的基因也有进行了解和保护,进而制定良好的育种政策,防止近亲繁殖。但是直至今日对中华鲟的遗传性研究十分有限,急需从分子方向对中华鲟进行研究。
微卫星标记是目前研究濒危动物保护遗传学中最理想的一类方式,微卫星具有多态性高、共显性遗传、遍布整个基因组等优势,广泛应用于动物遗传性研究。微卫星标记多重PCR是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物,同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。多重PCR 具有高效性、系统性、经济简便性等优点。有关中华鲟的微卫星标记多重PCR国内外未见报道。本发明利用5组中华鲟微卫星标记的双重PCR反应体系实现了对中华鲟个体之间的亲缘关系的测量进而确定个体之间的亲缘关系,为中华鲟的遗传管理、人工繁殖配种制定、遗传背景分析提供了坚实的技术支持。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于鉴定中华鲟亲缘关系的双重PCR微卫星标记及其在鉴定个体之间亲缘关系的应用方法。
技术方案
用于鉴定中华鲟亲缘关系的双重PCR微卫星标记及其应用的双重PCR微卫星标记引物如下:
用于鉴定中华鲟亲缘关系的双重PCR微卫星标记及其应用,其步骤为:取中华鲟组织样品;提取中华鲟样品DNA;利用所示的微卫星位点对中华鲟样品进行PCR扩增;把PCR扩增产物在10%的聚丙烯酰胺胶上进行电泳分离;根据分离结果统计PCR扩增产物的基因型;根据各个个体的基因分型结果用NTsys软件画出各个个体之间的聚类分析图,确定个体之间的亲缘关系。
所述的PCR反应体系是25ul:10×PCR Buffer 2-3ul,2.5mmol/L dNTP 0.1-1ul,MgCl2 1-2ul,反应体系中两对引物的上下游引物各0.5-1.5ul,Taq酶0.1-0.5ul,DNA模板1-5ul,超纯水 10-15ul。
所述的PCR反应体系是25ul:10×PCR Buffer 2.5ul,2.5mmol/LdNTP 0.5ul,MgCl2 1.5ul,反应体系中两对引物的上下游引物各1ul,Taq酶0.3ul,DNA模板3ul,超纯水13.2ul。
所述的PCR反应程序为:94℃预变性2-5min;94℃变性15-45s,退火温度56℃复性15-45s,72℃延伸15-45s,15-45个循环;72℃延伸8-15min;4℃保存。
所述的PCR反应程序为:94℃预变性3min;94℃变性30s,退火温度56℃复性30s,72℃延伸30s,30个循环;72℃延伸10min;4℃保存。
所述的PCR产物用质量浓度为8-15%的非变性聚丙烯酰胺胶进行电泳。
与现有技术相比,本发明具有以下的优点:
利用本发明提供的用于鉴定中华鲟亲缘关系的双重PCR微卫星标记及其应用可以实现对中华鲟的遗传多样性检测、个体识别,还可以计算个体之间的亲缘关系的远近,避免个体之间产生近亲繁殖,这为中华鲟的选育工作提供了重要的研究基础。并且本发明所提供的双重 PCR微卫星标记消耗的财力和人力都比传统的PCR减少了一半,具有巨大的推广价值。
附图说明
图1为个体之间的亲缘关系分析图。
具体实施方式
实施例1
从中国长江三峡集团公司中华鲟研究所取48尾中华鲟,采集中华鲟的鳍条,提取中华鲟的基因组DNA,提取方式采取传统的酚-氯仿抽提途径。
每个个体取0.1g尾鳍放于1.5ml的离心管内,剪碎,加入450μLSTE抽提缓冲液(10mmol/L Tris-HCl,pH8.0;1mmol/L EDTA,pH8.0)、35μL SDS(10%)、15μL蛋白酶K(0.2%)。
将离心管放入放在55℃的水浴锅内水浴1个小时至澄清透明。
在离心管内加入700ul Tris饱和酚,放在震荡机上混匀30分钟,4℃下12000转/min 离心10min,将上清液转移入另一个干净的eppendorf管中(注意用尖端剪平的1mL管头吸取上清液,以防混淆下层沉淀)。
在上清液中加入等体积酚仿醇混合物(酚、氯仿、异戊醇比例为25:24:1),振荡混匀15min后,4℃下12000转/min离心10min,吸上清液于另一新Eppendorf管中。
上清液中加入等体积氯仿,振荡混匀15min后,4℃下12000转/min离10min,吸取上清液。
加入-20℃预冷的无水乙醇1mL沉淀DNA,收集沉淀。
用70%乙醇洗涤沉淀两次,干燥后加入200μL TE(10mmol/LTris-HCl,pH 8.0;0.1mmol/L EDTA,pH 8.0),室温充分溶解。
利用本发明提供的5组中华鲟微卫星标记的双重PCR反应体系中的微卫星引物对这184 个中华鲟个体的DNA进行PCR反应,PCR反应体系是25ul:10×PCR Buffer 2.5ul,2.5mmol/L dNTP 0.5ul,MgCl2 1.5ul,每组反应体系两对引物的上下游引物各1ul,Taq酶0.3ul,DNA模板3ul,超纯水13.2ul。PCR反应程序为:94℃预变性3min;94℃变性30s,退火温度复性30s, 72℃延伸30s,30个循环;72℃延伸10min;4℃保存。PCR产物用10%的聚丙烯酰胺胶进行电泳和银染。
所述的5组中华鲟微卫星标记的双重PCR反应体系中的微卫星引物对如下:
用软件BIO-PROFIL判断聚丙烯酰胺胶显示的各个个体的等位基因片段的大小,根据这 48个个体在5组双重PCR体系中的等位基因大小,用NTsys软件画出各个个体之间的亲缘关系分析图,如下图1所示。根据聚类分析结果可以判断各个个体之间的亲缘关系,鉴别出全部的中华鲟个体,从而确定每条中华鲟之间的亲缘关系。从图1可得出,第1、3、14、43、32、34、35、37、27和41号个体为一个家系,亲缘关系比较近,他们之间不宜配对繁殖。第4、30、8和33号个体为一个家系,亲缘关系比较近,他们之间不宜配对繁殖。其余个体为一个家系,亲缘关系比较近,他们之间不宜配对繁殖。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国长江三峡集团公司中华鲟研究所
<120> 用于鉴定中华鲟亲缘关系的双重PCR微卫星标记及其应用
<130> 20
<160> 20
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcaacttata cacaaataca gtgggt 26
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agcaagtcct gtgccttatc a 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tattgcatga agctgtgcgc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aggggcgaat gatactgcac 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
agctgcttct acaccgacac 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gtgcccaaga tagcgcaaaa 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cgaatgaaat tgacgcaaac 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ccatttattt tggccaccag 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gctttgcgca ctctttccat 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ggcactccac tccactgtac 20
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
aaagggaact tcatcttttc ca 22
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gttttgccat gccaatcttt 20
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tcagtgcatt aacttacatt ttgca 25
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
agagtcctct tcatgacaca ca 22
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tctggatagc tggccttctg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
aactgtgcaa aaggggaaga 20
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
aaagcgcgct gtttgtgt 18
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
aaacaaatcc aggagcgaag 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
agccccatct gcaatactgt 20
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ctgatggcat atcacatgct t 21
Claims (7)
1.用于鉴定中华鲟亲缘关系的双重PCR微卫星标记,其特征在于,所述的双重PCR微卫星标记引物如下:
2.采用权利要求1所述的用于鉴定中华鲟亲缘关系的双重PCR微卫星标记的应用,其特征在于,鉴定中华鲟亲缘关系的应用具体方法如下:
取中华鲟组织样品,提取中华鲟样品DNA;利用权利要求1所示的微卫星位点对中华鲟样品DNA进行PCR扩增;把PCR扩增产物在聚丙烯酰胺胶上进行电泳分离;根据分离结果统计个体在所有微卫星位点中PCR扩增产物的基因型;根据个体的基因分型结果用NTsys软件画出各个个体之间的聚类分析图,确定个体之间的亲缘关系。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,PCR反应体系是25ul:10×PCR Buffer 2-3ul,2.5mmol/L dNTP 0.1-1ul,MgCl2 1-2ul,反应体系中两对引物的上下游引物各0.5-1.5ul,Taq酶0.1-0.5ul,DNA模板1-5ul,超纯水10-15ul。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,PCR反应体系是25ul:10×PCR Buffer2.5ul,2.5mmol/L dNTP 0.5ul,MgCl2 1.5ul,反应体系中两对引物的上下游引物各1ul,Taq酶0.3ul,DNA模板3ul,超纯水13.2ul。
5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,PCR反应程序为:94℃预变性2-5min;94℃变性15-45s,退火温度56℃复性15-45s,72℃延伸15-45s,15-45个循环;72℃延伸8-15min;4℃保存。
6.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,PCR反应程序为:94℃预变性3min;94℃变性30s,退火温度56℃复性30s,72℃延伸30s,30个循环;72℃延伸10min;4℃保存。
7.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,PCR产物用质量浓度为8-15%的非变性聚丙烯酰胺胶进行电泳。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810312498.3A CN108624699B (zh) | 2018-04-09 | 2018-04-09 | 用于鉴定中华鲟亲缘关系的双重pcr微卫星标记及其鉴定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810312498.3A CN108624699B (zh) | 2018-04-09 | 2018-04-09 | 用于鉴定中华鲟亲缘关系的双重pcr微卫星标记及其鉴定方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN108624699A true CN108624699A (zh) | 2018-10-09 |
CN108624699B CN108624699B (zh) | 2022-02-08 |
Family
ID=63704880
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201810312498.3A Active CN108624699B (zh) | 2018-04-09 | 2018-04-09 | 用于鉴定中华鲟亲缘关系的双重pcr微卫星标记及其鉴定方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN108624699B (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113621711A (zh) * | 2021-07-13 | 2021-11-09 | 武汉中科瑞华生态科技股份有限公司 | 用于鳙遗传多样性分析的双重pcr微卫星引物及应用 |
-
2018
- 2018-04-09 CN CN201810312498.3A patent/CN108624699B/zh active Active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
辛苗苗: ""基于SSR的中华鲟亲子鉴定和遗传特性研究"", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113621711A (zh) * | 2021-07-13 | 2021-11-09 | 武汉中科瑞华生态科技股份有限公司 | 用于鳙遗传多样性分析的双重pcr微卫星引物及应用 |
CN113621711B (zh) * | 2021-07-13 | 2023-09-22 | 武汉中科瑞华生态科技股份有限公司 | 用于鳙遗传多样性分析的双重pcr微卫星引物及应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN108624699B (zh) | 2022-02-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107142324B (zh) | 桑树est-ssr分子标记及其核心引物组和应用 | |
CN108642208B (zh) | 一种樟属及其近缘属植物通用ssr分子标记及其开发方法和应用 | |
CN107365874B (zh) | 亨利兜兰est-ssr标记引物、其开发方法及其应用 | |
CN103911372A (zh) | 豇豆叶绿体微卫星分子标记的多态性引物及其筛选方法、鉴定亲缘关系的方法 | |
CN113832243A (zh) | 基于kasp技术开发的用于茶树品种鉴定的核心snp标记 | |
CN103320425B (zh) | 一种用于大规模、高通量基因分型的贝类dna快速提取方法 | |
CN103667489B (zh) | 一种鉴定家鸭、番鸭和半番鸭的dna标记方法 | |
CN105525012A (zh) | 一种花生杂交种的分子鉴定方法 | |
CN107254542B (zh) | 西瓜肉色性状主效基因位点及其InDel分子标记和应用 | |
CN112126693B (zh) | 岩原鲤亲子鉴定试剂盒及其微卫星pcr鉴定方法 | |
CN108624699A (zh) | 用于鉴定中华鲟亲缘关系的双重pcr微卫星标记及其鉴定方法 | |
CN102321750A (zh) | 一种用分子标记快速筛选边鸡体重增长程度的方法 | |
CN110819720B (zh) | 一种快速鉴定南北方花鲈群体的InDel分子标记方法 | |
CN107937395A (zh) | 一种远海梭子蟹多态性微卫星分子标记及鉴定方法与应用 | |
CN114959056B (zh) | 一种鉴定雌性克氏原螯虾的ssr标记及其应用 | |
CN106636319A (zh) | 快速鉴别东白眉长臂猿和北白颊长臂猿的分子生物学方法 | |
CN108410963B (zh) | 一种基于微卫星荧光多重pcr的长鳍吻鮈亲子鉴定方法 | |
CN113373241B (zh) | 一种荷马条鳅属鱼类微卫星标记及其扩增引物和应用 | |
CN104073562B (zh) | 一种用于刀鲚不同生态型种群识别的分子标记 | |
CN108588231A (zh) | 中华鲟亲缘关系鉴定试剂盒及其应用 | |
CN104789650A (zh) | 芸薹属栽培种细胞质的分子检测方法 | |
CN112695098A (zh) | 一种闽清毛脚鸡种的鉴定方法 | |
CN103937882A (zh) | 一种松江鲈鱼微卫星标记的3重pcr检测方法 | |
CN112522422A (zh) | 一种基于coi基因片段的飘鱼和寡鳞飘鱼的分子鉴别方法 | |
CN108570509A (zh) | 一种脊尾白虾ec16 snp标记的检测方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |