CN101705295B - 利用特异性引物对大菱鲆ff0901微卫星标记的检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用特异性引物对大菱鲆FF0901微卫星标记的检测方法，首先提取大菱鲆基因组DNA；再利用大菱鲆微卫星富集文库中的含有微卫星序列，在其序列两端设计的特异性引物为正链5′-TTACGCTTCGCATCGCTCAT-3′，负链5′-TGCCAGGCCACCAGACG-3′，并对大菱鲆基因组DNA进行PCR扩增，将获得的PCR产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离；对产物出现的条带进行分析，并获得大菱鲆的遗传多态性图谱。本发明适用于大菱鲆群体遗传标记、系谱认证、遗传连锁图谱构建等检测技术；PCR扩增产物在大菱鲆群体检测中呈现较好多态性；本发明可快捷的获得大菱鲆的FF0901微卫星标记的遗传变异图谱，方便、快捷、准确，可直观地检测出大菱鲆每个个体的基因型。
Description
技术领域：
本发明属于大菱鲆DNA分子遗传标记技术，是一种检测大菱鲆FF0901微卫星标记技术方法。
背景技术：
本发明做出之前，国内外有类似的报道，国内中国水产科学院黄海水产研究所陈松林等(Molecular Ecology Notes 2007)发表的Isolation andcharacterization of polymorphic microsatellite loci from ESTlibrary of turbot(Scophthalmus maximus)and cross-speciesamplification，曾报道了大菱鲆部分微卫星位点的检测方法，但大菱鲆基因组文库并非自己构建，而是从已有的报道里选取的；孙效文等(ConservGenet 2009)发表的Isolation and characterization of microsatellitemarkers for turbo(Scophthalmus maximus)by screening SSR-enrichedlibrary，曾报道了大菱鲆部分基因组文库的构建、含微卫星序列的筛选等内容，但其有的引物扩增出的序列等位基因太少，多态性不高，从而导致应用时不能有效地区分不同群体或个体；西班牙Pardo等(Genome 2007)发表的Development and characterization of 248 novel microsatellitemarkers in turbot，曾报道用构建大菱鲆微卫星富集文库的方法筛选出248个微卫星位点，并设计了引物为构建遗传连锁图谱提供条件，但未见对每个引物多态性情况的报道。
发明内容：
本发明的目的是提出一种自主构建大菱鲆基因富集文库，并从中筛选出微卫星序列，在其两端设计特异性引物进行PCR检测，从而快速的检测大菱鲆每个个体在微卫星区的遗传变异，获得该引物对大菱鲆多态性图谱，通过图谱检测出每个个体的基因型，以期找到与该微卫星位点连锁的性状，为以后与传统方法结合进行育种工作奠定基础。
本发明是按照以下操作技术方案完成的：首先是提取大菱鲆基因组DNA并稀释备用；再利用大菱鲆基因组文库中的含有微卫星核心序列，在其两端设计特异性引物；然后使用该引物对大菱鲆不同地理群体或同一群体中不同个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行检测；利用产物出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，并获得大菱鲆的遗传多态性图谱。
提取大菱鲆基因组DNA将其稀释为50ng/ul，每个PCR反应中加入2ul，反应总体积为25ul。
FF0901微卫星核心序列及其两端保守序列为：
1 AGTCTAGAGA CCGCCGCAGG TTCCTGAGGG AACTCAATCT CTACTCTTCT
51 TCAAATTCTA GAGTGAAGAG TCCACCTCTC AGAGCTGAAC ATATATATTG
101 TATTTACGCT TCGCATCGCT CATGAGGCGC CTGTATTCAA TGTGTGGTGA
151 ATCAATCACC CGCACGCCAG CTCCGTTTCA CATCCTAACC CACGTGTCTG
201 ACTCCTCTGT CACAACTCAG ACACACACAC ACACACACAC ACACACACAC
251 ACAGTCTCAC CTGGAGCAAG GTGCTGCCTC CGTCTGGTGG CCTGGCAAAG
301 CTAACTGTAG CCTAGCATCC CCGTTACTCC ACTCGTTGGT GCGCGCGGTT
351 GTTTCCTCTT GTCCTTTCTT TTCTTTTCTT TTCTTTTCTT CACGATAAAC
401 GAGT；
根据其设计的特异性引物为：正链5’-TTACGCTTCGCATCGCTCAT-3’，负链5’-TGCCAGGCCACCAGACG-3’；使用引物时退火温度60℃。
PCR扩增的加样参数为：每个PCR反应总体积为25ul，包括100ng大菱鲆基因组DNA；10×PCR buffer，2.5ul；Mg2+，2mmol/L；Taq酶1U；dNTP各0.2mmol/L；本发明在FF0901微卫星核心序列两端设计的引物各0.2umol/L；加ddH2O至25ul。使用该引物时设置PCR仪的程序为94℃变性4min；94℃30sec，60℃50sec，72℃50sec，30个循环；72℃延伸7min，4℃保存。
PCR的产物检测：将PCR产物在浓度为8％变性聚丙烯酰胺凝胶，12W恒功率电泳1-1.5小时进行分离。将带有PAGE胶的板放入浓度为10％的冰醋酸溶液轻摇动至胶全部脱色；用超纯水漂洗胶板；加入显色液轻摇约30min；用超纯水快速冲洗胶板；把胶板转移到冷却的显色液中并轻摇至带纹出现；将胶板快速移动到10％的冰醋酸溶液中；用超纯水清洗玻璃板两次；将胶板置于室温下自然干燥；终反应即得到大菱鲆FF0901基因座位的多态性图谱。
本发明技术有以下特点：
(1)本发明可快捷的获得大菱鲆的FF0901遗传标记基因座位的遗传变异图谱，方法简便，所得结果可直观地检测出大菱鲆每个个体的基因型。
(2)本发明主要应用于大菱鲆群体间遗传标记、系谱认证、遗传图谱的构建以及与该位点连锁的性状筛选等。
(3)本发明所检测的FF0901遗传标记基因座是自主构建DNA富集文库发现的新的大菱鲆微卫星标记。
(4)经过条件优化之后，该引物能够准确的扩增出FF0901微卫星标记，PCR产物在大菱鲆群体检测中呈现较好多态性。
(5)相对于其它分子遗传标记技术而言微卫星标记符合孟德尔遗传模式，呈共显性遗传，因此，可以区分个体是纯合子或杂合子状态。
附图说明：
图1：发明的FF0901引物对大菱鲆31个个体的检测图谱：
编号1-31是大菱鲆的31个个体，M是50bp DNA Ladder标准分子量。
具体实施方式：
下面通过实施例结合附图详细叙述本发明在大菱鲆FF0901微卫星核心序列DNA分子遗传标记技术方法。
首先提取大菱鲆基因组DNA并稀释备用；再利用已构建的大菱鲆基因组文库中含有的微卫星位点序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对大菱鲆不同地理群体或群体内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行检测；利用产物出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，并获得大菱鲆该位点的遗传多态性图谱。
1.大菱鲆基因组DNA的提取：a、取新鲜样品的肌肉组织50-100mg，装入1.5mL离心管中。b、每管加入DNA提取缓冲液[0.4mol/L，NaCl，10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，2mmol/L EDTA(pH 8.0)，1％SDS，20μg/ml胰RNA酶]400μL，将组织尽量剪碎。C、每管中加10％SDS 40μL，再加入8μL蛋白酶K(20mg/ml)，混匀，55～65℃，3小时(其间每半小时混匀1次)，消化至溶液澄清。d、加300ul 6mol/L NaCl，在旋涡混合器上高速混合30秒，12000rpm离心30分钟，移上清400ul到另一离心管中。e、加入等体积400ul酚∶氯仿∶异戊醇(体积比为25∶24∶1)，缓慢颠倒混匀8分钟，12000rpm离心5-10分钟，取上清350ul于干净的离心管中(可视情况重复第5步操作)。f、加入等体积350u l异丙醇，混匀，置-20℃1小时，然后12000rpm离心15分钟，弃上清。g、每管加入-20℃预冷的浓度为70％乙醇650ul，缓慢颠倒几次，小心倒掉乙醇(小心沉淀丢失)，重复洗涤一次，然后倒去乙醇，吹干5-10分钟。h、用灭菌水充溶解后，定量将其稀释成50ng/ul的浓度备用。
2.微卫星引物的设计：
在大菱鲆微卫星富集基因组文库的基础上，得到FF0901微卫星核心序列及其两端保守序列为：
1 AGTCTAGAGA CCGCCGCAGG TTCCTGAGGG AACTCAATCT CTACTCTTCT
51 TCAAATTCTA GAGTGAAGAG TCCACCTCTC AGAGCTGAAC ATATATATTG
101 TATTTACGCT TCGCATCGCT CATGAGGCGC CTGTATTCAA TGTGTGGTGA
151 ATCAATCACC CGCACGCCAG CTCCGTTTCA CATCCTAACC CACGTGTCTG
201 ACTCCTCTGT CACAACTCAG ACACACACAC ACACACACAC ACACACACAC
251 ACAGTCTCAC CTGGAGCAAG GTGCTGCCTC CGTCTGGTGG CCTGGCAAAG
301 CTAACTGTAG CCTAGCATCC CCGTTACTCC ACTCGTTGGT GCGCGCGGTT
351 GTTTCCTCTT GTCCTTTCTT TTCTTTTCTT TTCTTTTCTT CACGATAAAC
401 GAGT；
利用SSR Hunter软件寻找并分析微卫星核心序列，根据微卫星DNA两侧的序列在同一物种相对于核心序列的高度保守性，在其两端设计特异性引物为：正链5’-TTACGCTTCGCATCGCTCAT-3’，负链5’-TGCCAGGCCACCAGACG-3’；使用引物时退火温度60℃。
3.PCR扩增：
加样量如下：大菱鲆基因组DNA(50ng/ul)，2ul；10×PCR buffer，2.5ul；Mg2+(25mmol/ul)，2ul；Taq酶(5U/ul)，0.2ul；dNTP(各10mmol/l)各0.5；本方法在FF0901微卫星核心序列两端设计的引物各(10Pmol/L)，2ul；加ddH2O至25ul。使用该引物时设置PCR仪的程序为94℃变性4min；94℃30sec，60℃50sec，72℃50sec，30个循环；72延伸7min，4℃保存。
4.PCR产物的检测：PCR反应结束后，将PCR产物在浓度为8％变性聚丙烯酰胺凝胶，12W恒功率电泳1-1.5小时进行分离。将带有PAGE胶的板放入1L新配制的浓度为10％的冰醋酸溶液中，轻轻摇动约30min，至胶全部脱色；用1L超纯水漂洗胶板，共2次，每次2min；加入1L显色液轻摇动30min；用超纯水快速冲洗胶板两面以除去凝胶表面的染色液；把胶板快速的转移到1L冷却的显色液中并轻轻摇动，直至带纹出现(约5-10min)；将胶板快速移动到10％的冰醋酸溶液中，轻摇3-5min；用超纯水清洗玻璃板两次。终反应即得到如图1所示的大菱鲆FF0901遗传的多态性图谱。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110>中国水产科学研究院黄海水产研究所
<120>题目利用特异性引物对大菱鲆FF0901微卫星标记的检测方法
<141>2009-11-16
<160>3
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<221>prim_bind
<222>(1)...(20)
<223>用于扩增FF0901的正向引物序列
<400>1
TTACGCTTCGCATCGCTCAT 20
<210>2
<211>17
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<221>prim_bind
<222>(1)...(17)
<223>用于扩增FF0901的反向引物序列
<400>2
TGCCAGGCCACCAGACG 17
<210>3
<211>400
<212>DNA
<213>大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)
<400>3
1 AGTCTAGAGA CCGCCGCAGG TTCCTGAGGG AACTCAATCT CTACTCTTCT
51 TCAAATTCTA GAGTGAAGAG TCCACCTCTC AGAGCTGAAC ATATATATTG
101 TATTTACGCT TCGCATCGCT CATGAGGCGC CTGTATTCAA TGTGTGGTGA
151 ATCAATCACC CGCACGCCAG CTCCGTTTCA CATCCTAACC CACGTGTCTG
201 ACTCCTCTGT CACAACTCAG ACACACACAC ACACACACAC ACACACACAC
251 ACAGTCTCAC CTGGAGCAAG GTGCTGCCTC CGTCTGGTGG CCTGGCAAAG
301 CTAACTGTAG CCTAGCATCC CCGTTACTCC ACTCGTTGGT GCGCGCGGTT
351 GTTTCCTCTT GTCCTTTCTT TTCTTTTCTT TTCTTTTCTT CACGATAAAC
401 GAGT
Claims (1)
1.一种利用特异性引物对大菱鲆FF0901微卫星标记的检测方法，其特征在于它的技术操作程序是：首先提取大菱鲆DNA；再利用大菱鲆基因组文库中FF0901克隆的微卫星DNA核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对大菱鲆不同地理群体或群体内不同个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；利用产物出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，并获得大菱鲆FF0901核心序列区的遗传多样性变异图谱；
所述的提取的大菱鲆基因组DNA，稀释为50ng/ul，在其每个PCR反应中加入2ul反应总体积为25ul；
所述的PCR扩增：其加样参数为：每个PCR反应总体积为25ul，包括100ng大菱鲆基因组DNA；10×PCR buffer，2.5ul；Mg2+，2mmol/L；Taq酶1U；dNTP各0.2mmol/L；FF0901微卫星核心序列两端设计的引物各0.2umol/L；加ddH2O至25ul；使用该引物时设置PCR仪的程序为94℃变性4min；94℃30sec，60℃50sec，72℃50sec，30个循环；72℃延伸7min，4℃保存；
所述的PCR产物进行检测：将PCR产物在浓度为8％变性聚丙烯酰胺凝胶，12W恒功率电泳1-1.5小时进行分离；将带有PAGE胶的板放入浓度为10％冰醋酸溶液中摇动至胶全部脱色；用超纯水漂洗胶板2次；加入显色液轻轻摇动；用超纯水快速冲洗胶板两面以除去凝胶表面的染色液；将胶板快速转移到冷却的显色液中直至带纹出现；将胶板快速移动到10％冰醋酸溶液中轻摇3-5min；用超纯水清洗玻璃板；将胶板置于室温下自然干燥；可得到大菱鲆FF0901基因座位的遗传多态性图谱；
其特征在于所述的FF0901微卫星的位点序列为：
1 AGTCTAGAGA CCGCCGCAGG TTCCTGAGGG AACTCAATCT CTACTCTTCT
51 TCAAATTCTA GAGTGAAGAG TCCACCTCTC AGAGCTGAAC ATATATATTG
101 TATTTACGCT TCGCATCGCT CATGAGGCGC CTGTATTCAA TGTGTGGTGA
151 ATCAATCACC CGCACGCCAG CTCCGTTTCA CATCCTAACC CACGTGTCTG
201 ACTCCTCTGT CACAACTCAG ACACACACAC ACACACACAC ACACACACAC
251 ACAGTCTCAC CTGGAGCAAG GTGCTGCCTC CGTCTGGTGG CCTGGCAAAG
301 CTAACTGTAG CCTAGCATCC CCGTTACTCC ACTCGTTGGT GCGCGCGGTT
351 GTTTCCTCTT GTCCTTTCTT TTCTTTTCTT TTCTTTTCTT CACGATAAAC
401 GAGT；
其核心序列的特异性引物序列为，正链5’-TTACGCTTCGCATCGCTCAT-3’，负链5’-TGCCAGGCCACCAGACG-3’；该引物的退火温度为60℃。
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