ES2642862T3 - Aislamiento de biomoléculas - Google Patents

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Abstract

Un método de manipulación de un líquido de muestra que contiene partículas magnéticas que tienen moléculas diana unidas a las mismas y un líquido de encapsulación, siendo el líquido de muestra y el líquido de encapsulación inmiscibles, comprendiendo el método: hacer circular el líquido de encapsulación en un conducto; hacer circular el líquido de muestra que contiene las partículas magnéticas en el conducto de manera que el líquido de muestra (a) sea rodeado por el líquido de encapsulación y (b) esté localizado en un sitio de atrapamiento predeterminado dentro del conducto; inmovilizar las partículas magnéticas en el sitio de atrapamiento aplicando un campo magnético en el sitio de atrapamiento; y hacer circular un líquido de elución en el conducto de manera que (a) el líquido de elución esté rodeado por el líquido de encapsulación, (b) el líquido de muestra se haga circular lejos del sitio de atrapamiento, y (c) el líquido de elución circule al sitio de atrapamiento y rodee las partículas magnéticas inmovilizadas, liberando así las biomoléculas diana de las partículas magnéticas.

Description

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DESCRIPCION
Aislamiento de biomoleculas ANTECEDENTES
El aislamiento de biomoleculas es una parte cntica de cualquier sistema de procesamiento de muestras. Con el desarrollo de los sistemas de analisis molecular automatizados, la mayor restriccion esta ahora en la preparacion de la muestra y la purificacion de la muestra diana.
Para todos los procesos bioqmmicos, el aislamiento y la purificacion de la muestra diana es cntico para su exito. Las limitaciones en el proceso de analisis bioqmmico - piro-secuenciacion, ligacion de acidos nucleicos, reaccion en cadena de la polimerasa, PCR digital, qPCR, secuenciacion de acidos nucleicos, deteccion de protemas / enriquecimiento de protemas, recubrimiento de perlas geneticas, deteccion de celulas raras y enriquecimiento de celulas - y no se limitan a estas, son debido a las concentraciones de partida de la diana y el nivel de inhibidores bioqmmicos presentes dentro de la muestra de reaccion usada en el analisis.
Para la mayona de los analisis bioqmmicos se realiza una serie de etapas de pre-analisis en la muestra para aislar la diana de la muestra inicial y eliminar los inhibidores bioqmmicos. Estas etapas normalmente son trabajosas y, por ultimo lugar, reducen las concentraciones de partida de la diana.
El metodo actual preferido de purificacion de muestra hace uso de columnas de centrifugacion. Sin embargo, las columnas de centrifugacion requieren varias etapas de centrifugacion y de aim que no puedan ser integradas con una plataforma de preparacion de genotecas de ADN automatizada. Similarmente, una tecnica de purificacion para la purificacion de fragmentos de acido nucleico a partir de geles de agarosa tambien requiere etapas de centrifugacion para lograr el aislamiento de acidos nucleicos.
Una tecnica usada para la purificacion de muestras es la purificacion basada en perlas paramagneticas. Este metodo ofrece un enfoque que puede proporcionar tasas de recuperacion de ADN mejoradas y condiciones de tampon ajustables que pueden usarse para unir selectivamente tamanos de fragmentos de ADN espedficos.
La purificacion basada en perlas paramagneticas es un proceso discontinuo en pocillos estaticos. El metodo actual implica pipetear la mezcla de perlas - perlas paramagneticas y un tampon - en un pocillo de una placa de microtitulacion junto con la muestra inicial. La disolucion se pipetea, se mezcla y se incuba a temperatura ambiente para permitir que el ADN se una a las perlas. La placa de microtitulacion se pone entonces sobre una placa magnetica. Las perlas que mantienen el ADN unido se mueven hacia el borde de la placa y son mantenidas por el iman. A continuacion, el sobrenadante (que contiene residuo) se elimina usando una pipeta y se desecha. Tras esto se realizan entonces varias etapas de lavado para eliminar el residuo residual presente sobre / en el sedimento de perlas. El etanol es pipeteado a la placa que contiene el sedimento de perlas, se incuba y luego se elimina usando una pipeta. Esta etapa de lavado se repite dos veces. Entonces se anade un tampon de elucion. La placa se saca de la placa magnetica y el tampon de elucion se mezcla mediante mezcla con pipeta. La placa de microtitulacion se coloca de nuevo sobre la placa magnetica. El eluyente que contiene el ADN purificado se extrae entonces usando una pipeta.
El protocolo basado en perlas paramagneticas es un proceso laborioso y no se automatiza facilmente debido al gran numero de etapas de pipeteado requeridas. Los altos numeros de etapas de pipeteado tambien producen grandes volumenes iniciales y finales de muestra, produciendo altos costes de reactivo por punto de datos.
Una aplicacion, y no se limita a esta aplicacion, es para la purificacion de muestras mejorada para las plataformas de secuenciacion de nueva generacion. Muchas de las plataformas de secuenciacion de nueva generacion requieren genotecas de ADN constituidas de fragmentos de ADN dentro de un intervalo espedfico de longitudes de pares de bases. Ademas, estos fragmentos de ADN necesitan ser marcados con secuencias de nucleotidos espedficas (adaptadores) para permitir que las secuencias se amplifiquen usando PCR y para permitir que los fragmentos de genotecas se hibriden con la celda de flujo del secuenciador. Tambien pueden anadirse indices espedficos de secuencia a los fragmentos de ADN para identificar muestras individuales cuando se multiplexa la muestra dentro de una unica celda de flujo. La tagmentacion de ADN (el ADN se fragmenta y marca con adaptadores) y la adicion de adaptadores e indices comunes se logran en dos reacciones biologicas separadas. Tras estas reacciones, la genoteca de ADN se limpia para eliminar el exceso de nucleotidos, enzimas, cebadores, sales y otros contaminantes. Por consiguiente, el flujo de trabajo requerido para tagmentar el ADN, purificar el ADN tagmentado, anadir adaptadores e indices comunes y purificar el producto de genoteca final es complejo y laborioso.
Los sistemas y metodos brevemente explicados en el presente documento pueden ayudar a lograr la manipulacion de muestras que esta libre de contaminacion, de bajo volumen, alto rendimiento, bajo coste y/o de alta concentracion de muestra.
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SUMARIO
Dispositivos, sistemas y metodos de uso de perlas paramagneticas para el aislamiento y procesamiento de biomoleculas.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
La FIG. 1 es un diagrama que ilustra el sistema de purificacion basado en capilares de flujo continuo.
La FIG. 2 es un diagrama que ilustra el sistema de purificacion basado en capilares de flujo bidireccional.
La FIG. 3 es un diagrama que ilustra las etapas de limpieza magnetica para el sistema de purificacion basado en capilares de flujo continuo.
La FIG. 4 ilustra un metodo que puede implementarse como programacion de controlador.
La FIG. 5 ilustra un metodo que puede implementarse como programacion de controlador.
La FIG. 6 ilustra un metodo que puede implementarse como programacion de controlador.
La FIG. 7 muestra los resultados de espectrofotometna que demuestran tasas de recuperacion comparables entre el protocolo de control y el protocolo de limpieza capilar. La concentracion de ADN recuperado / eluido (amplicon de actina-beta) se representa para tanto la purificacion basada en perlas de control como la purificacion basada en perlas en capilares.
La FIG. 8 muestra una imagen de gel que muestra las manchas del producto Nextera para la limpieza de control y limpieza en capilares.
La FIG. 9 muestra los resultados de qPCR que muestran el producto Nextera recuperado del protocolo de control y el protocolo de limpieza en capilares.
La FIG. 10 muestra un resultado de gel que confirma la recuperacion del amplicon de 285 pb usando la purificacion basada en perlas en un capilar. Comparando productos no purificados (carriles 102, 103) con productos purificados (carriles 104, 105), es evidente que no se eliminaron satisfactoriamente productos espedficos tales como el dfmero de cebador(el carril 101 es un marcador).
La FIG. 11 muestra un resultado de qPCR del ejemplo de Descontaminacion de capilares - reutilizacion
La FIG. 12 ilustra un metodo que puede implementarse como programacion de controlador.
La FIG. 13 ilustra un metodo que puede implementarse como programacion de controlador.
La FIG. 14 ilustra un metodo de enriquecimiento de celulas con analisis optico que puede implementarse como programacion de controlador.
La FIG. 15 ilustra un metodo de enriquecimiento de celulas que puede implementarse como programacion de controlador.
La FIG. 16 ilustra un metodo de funcionalizacion de perlas paramagneticas que puede implementarse como programacion de controlador.
La FIG. 17 ilustra un metodo de limpieza y eliminacion de perlas paramagneticas usadas que pueden implementarse como programacion de controlador.
La FIG. 18 ilustra un metodo de interaccion con tecnologfa de celdas de lfquido compuesto que puede implementarse como programacion de controlador.
DESCRIPCION DETALLADA
La presente divulgacion proporciona en algunas realizaciones sistemas y metodos para el aislamiento de biomoleculas dentro de un conducto. El conducto puede tener flujo en cualquier direccion y esta controlado por un controlador.
En una realizacion, con referencia a la FIG. 1A, una bala que contiene perlas paramagneticas y muestra 2 y tampon de fluido inmiscible 3 circula dentro de un conducto 1. La muestra puede incluir biomoleculas diana, inhibidores de procesos bioqmmicos y contaminantes. El conducto tiene, en una localizacion a lo largo de la longitud, una fuente para generar un campo magnetico 4. Con referencia a la FIG. 1B, las perlas paramagneticas y la bala de muestra 2 y la bala de tampon de elucion 5 se separan por un fluido inmiscible 3. Las perlas paramagneticas y la bala de muestra 2 llegan a la fuente de campo magnetico 4 con lo que las perlas son capturadas dentro del campo magnetico. Con referencia a la FIG. 1C, las perlas paramagneticas y la bala de muestra 2 continuan circulando dentro del conducto 1
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mientras que las perlas paramagneticas con biomoleculas diana unidas 6 siguen capturadas por la fuente de campo magnetico. Con referencia a la FIG. 1D, el tampon de elucion 5 llega a la fuente de campo magnetico y envuelve las perlas paramagneticas capturadas. Las biomoleculas diana unidas son liberadas en el tampon de elucion a medida que circula a lo largo del conducto 1. Con referencia a la FIG. 1E, el tampon de elucion y las biomoleculas diana 7 continuan dentro del conducto 1 para dispensacion o analisis adicional.
En una realizacion, con referencia a la FIG. 2A, tras la desunion de las biomoleculas diana en el tampon de elucion 24 de las perlas paramagneticas 23 en la fuente de campo magnetico 22, en el conducto 20 se invierte el flujo. Con referencia a la FIG. 2C, el tampon de elucion y las biomoleculas diana vuelven en el flujo sobre las perlas paramagneticas capturadas 23 por la fuente de campo magnetico 22 para volver a la localizacion de aspiracion original para la dispensacion.
En una realizacion, con referencia a la FIG. 3A, tras la desunion de las biomoleculas diana en el tampon de elucion 36 de las perlas paramagneticas 35 capturadas por la fuente de campo magnetico 34 en el conducto 31, el fluido inmiscible 33 va seguido de una bala de eliminacion y limpieza de perlas 32. Con referencia a la FIG. 3B, como la bala de eliminacion y limpieza de perlas 32 envuelve las perlas paramagneticas 35, se elimina la fuente de campo magnetico 34 (ffsicamente o se cambia a un estado apagado). Con referencia a la FIG. 3C, las perlas paramagneticas 35 son respondidas en la bala de eliminacion y limpieza 32 y continuan circulando a lo largo del conducto 31 como la bala 37. Este proceso de eliminacion y limpieza de perlas permite la reutilizacion del conducto 31 y previene cualquier contaminacion cruzada de muestras.
En una realizacion, el metodo comprende del uso de un tubo capilar, una bomba y un campo magnetico localizado en una localizacion a lo largo de la longitud del tubo capilar. Primero, una bala de una mezcla de perlas, que incluye un tampon y perlas con un recubrimiento bioqmmico, y la biomolecula diana es atrafda en el tubo capilar. Las perlas pueden ser perlas magneticas con un recubrimiento bioqmmico o perlas no magneticas (sflice, ceramica, un polfmero, etc.) con un recubrimiento paramagnetico. Esto va seguido de una bala de fluido inmiscible, por ejemplo aire o aceite y luego seguido de balas discretas de etanol, aire, aceite y tampon de elucion. Las balas circulan dentro del tubo pasando al campo magnetico localizado, donde tras ser atrapadas las perlas paramagneticas dentro del campo magnetico, mientras los otros componentes de la bala de perlas-mezcla continuan circulando a lo largo del tubo, eliminando todas las moleculas no unidas de las perlas paramagneticas. El flujo de balas continuo trae a continuacion una bala de aceite o aire, que se usa como tampon para prevenir la mezcla de la bala de perlas-mezcla con la bala de etanol. La bala de etanol limpia cualquier contaminante restante de las perlas paramagneticas. Esta etapa de limpieza puede repetirse dependiendo del protocolo de la secuencia de recogida de balas inicial. Despues de que la bala de etanol haya pasado, pasa un tampon de aceite antes de la bala de tampon de elucion para prevenir que cualquier elemento traza de etanol a lo largo del tubo se mezcle con la bala de tampon de elucion. El tampon de elucion circula entonces sobre las perlas paramagneticas, liberando las dianas de biomolecula de las perlas paramagneticas en la bala de tampon de elucion. La bala continua circulando a lo largo del tubo para procesamiento y analisis biologico adicional.
En una realizacion, tras el paso de la bala de tampon de elucion sobre las perlas paramagneticas, se invierte la direccion de flujo, y se dispensa el tampon de elucion con biomoleculas diana del sistema.
En una realizacion, tras el paso de la bala de tampon de elucion, se elimina el campo magnetico y una siguiente bala de etanol devuelve las perlas paramagneticas al flujo dentro del tubo capilar. Esta bala va seguida entonces de una bala de aceite, una bala de etanol y una bala de aceite para limpiar el tubo capilar y prevenir cualquier contaminacion de las siguientes reacciones de bala.
En una realizacion, las balas de etanol van siempre seguidas de balas de aire; esto ayuda a garantizar la eliminacion de cualquier etanol dentro del sistema. La bala de aire permite la evaporacion de etanol en el aire.
Ejemplos de biomoleculas incluyen (y no se limitan a) celulas, acidos nucleicos, protemas, enzimas, sangre, saliva y material organico.
La mezcla de perlas normalmente esta constituida de perlas en una disolucion de tampon que incluye polietilenglicol (PEG) y sales.
El tamano de perla normalmente esta dentro del intervalo de 0,1 a 500 micrometres.
Las perlas son magneticas o tienen un recubrimiento magnetico aplicado.
El material de perla puede ser un polfmero, ceramica o metal con un recubrimiento magnetico aplicado.
En una realizacion, las perlas estan funcionalizadas para la union a celulas.
En una realizacion, las perlas estan funcionalizadas para la union a acido nucleico.
En una realizacion, las perlas estan funcionalizadas para o limitadas a la union de enzimas, reactivos, cebadores o material organico.
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Los aceites usados para generar fases inmiscibles pueden incluir y no se limitan a aceite de silicona, aceite de perfluorocarbono y aceite de perfluoropolieter.
Los tampones de elucion pueden incluir y no estar limitados a agua esteril; agua esteril con tampones de pH anadidos para mantener un pH dentro de un intervalo deseado dependiendo de las aplicaciones.
El conducto puede ser un tubo capilar.
El material del conducto puede ser un polfmero, ceramica o metal.
El conducto puede tener una superficie hidrofoba.
El conducto puede ser un tubo capilar de polfmero, tal como un tubo capilar de material de PTFE.
El diametro del conducto normalmente esta dentro de un intervalo de 10 micrometros a 10 milfmetros de diametro.
En una realizacion, el conducto tiene un espesor de pared de al menos 10 micrometros o mas.
La forma interna del conducto puede ser (y no esta necesariamente limitada a) un perfil que es redondo, cuadrado, ovalado, rectangular, tener una superficie ondulada, tener al menos una superficie plana, o tener caractensticas de potenciamiento de la superficie.
El caudal dentro del conducto normalmente esta dentro del intervalo de 0,00001 pl/hora a 1000 ml/min.
La forma externa del conducto puede ser (y no esta necesariamente limitada a) un perfil que es redondo, cuadrado, ovalado, rectangular, tener una superficie ondulada, tener al menos una superficie plana, o tener caractensticas de potenciamiento de la superficie.
En una realizacion, el conducto es un canal grabado sobre un sustrato.
En una realizacion, el conducto es un canal moldeado sobre un chip.
En una realizacion, el conducto esta integrado en un sistema de analisis basado en chip.
Al menos uno o mas campos magneticos estan localizados a lo largo de la longitud del conducto. El campo magnetico puede ser generado por un iman permanente o por algun metodo electromagnetico.
En una realizacion, los campos magneticos son controlables, pueden ser desactivados por cualquier movimiento / eliminacion del iman o la desenergizacion / neutralizacion del campo electromagnetico.
En una realizacion, las fuentes de campo magnetico estan dispuestas circunferencialmente alrededor del conducto que genera multiples polos.
En una realizacion, las fuentes de campo magnetico estan dispuestas a lo largo de la longitud del conducto para generar multiples polos.
En una realizacion, el flujo a traves del sistema se genera por presion positiva.
En una realizacion, el flujo a traves del sistema se genera por presion negativa.
En una realizacion, el metodo comprende el uso de un tubo capilar, una bomba y un campo magnetico localizado en
una localizacion a lo largo de la longitud del tubo capilar. Primero, una bala de una mezcla de perlas (tampon y
perlas con un recubrimiento bioqmmico) es atrafda en el tubo capilar. Esto va seguido de una bala de fluido inmiscible, por ejemplo aire o aceite y luego seguido de una bala de la muestra para la purificacion. Despues de esto, llega una bala inmiscible adicional y balas discretas adicionales de etanol, aire, aceite y tampon de elucion. Las balas circulan dentro del tubo pasando por el campo magnetico localizado, con lo cual las perlas paramagneticas son atrapadas dentro del campo magnetico, mientras que los otros componentes de la bala de perlas-mezcla continuan circulando a lo largo del tubo. El caudal y campo magnetico estan controlados para garantizar que se dejen tiempos de residencia suficientes para que el proceso bioqmmico sea realizado. Los fluidos que circulan continuan a lo largo del conducto, uniendo productos a las perlas y eliminando todas las moleculas no unidas de las perlas paramagneticas. El flujo continuo de balas lleva balas de aceite o aire, que se usan como tampon para prevenir la mezcla de las balas basadas en agua, por ejemplo y sin limitacion, mezcla de perlas, balas de etanol y de tampon de dilucion. La bala de etanol limpia cualquier contaminante restante de las perlas paramagneticas. Esta etapa de limpieza puede repetirse dependiendo del protocolo de la secuencia de recogida de balas inicial. Despues de que la bala de etanol haya pasado, pasa un tampon de aceite antes de la bala de tampon de elucion para prevenir que cualquier elemento traza de etanol a lo largo del tubo se mezcle con la bala de tampon de elucion. El tampon de elucion circula entonces sobre las perlas paramagneticas liberando las dianas de biomolecula de las perlas paramagneticas en la bala de tampon de elucion. La bala continua circulando a lo largo del tubo para procesamiento y analisis biologicos adicionales.
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Las balas a^das en el sistema pueden incluir y no se limitan a las siguientes; mezcla de perlas; aceite; tampon de elucion; etanol; agua; aire; muestra; mezcla bioqmmica (reactivos, enzimas, etc.), mezcla de funcionalizacion de perlas; glucosa; tampon; aditivos; marcadores opticos; marcadores fluorescentes; y celulas.
Las secuencias de balas usadas dentro del dispositivo incluyen y no se limitan a las siguientes:
Mezcla de perlas y muestra - aceite - tampon de elucion.
Mezcla de perlas y muestra - aceite - tampon de elucion.
Mezcla de perlas y muestra - aire - aceite - tampon de elucion.
Mezcla de perlas y muestra- aire - etanol - aceite - tampon de elucion.
Mezcla de perlas y muestra- aceite - etanol - aceite - tampon de elucion.
Mezcla de perlas y muestra - aire - etanol - aire - etanol - aire - aceite - tampon de elucion.
Mezcla de perlas y muestra - aceite - etanol - aceite - etanol - aire - aceite - tampon de elucion.
Mezcla de perlas y muestra - aceite - etanol - aceite - etanol - aire - aceite - mezcla bioqmmica - aceite - tampon de elucion.
Mezcla de perlas - aceite - muestra - aceite - etanol - aire - aceite - mezcla bioqmmica - aceite - tampon de elucion.
Mezcla de perlas - aceite - mezcla de funcionalizacion de perlas - aceite - tampon de suspension
Mezcla de perlas - aceite - mezcla de funcionalizacion de perlas - aceite - muestra - aceite - etanol - aire - aceite - mezcla bioqmmica - aceite - tampon de elucion.
Estas secuencias y otras pueden incluir una etapa adicional (es decir, paso de bala) para la eliminacion de las perlas del sistema. Esta etapa puede realizarse con un controlador y una perturbacion en el campo magnetico a lo largo del tubo.
En una realizacion se usa deteccion optica en la fuente de campo magnetico.
En una realizacion se usa deteccion optica aguas arriba de la fuente de campo magnetico para el analisis de balas.
En una realizacion se usa deteccion optica aguas abajo de la fuente de campo magnetico para el analisis de balas.
En una realizacion se usan multiples lmeas paralelas de tubos capilares pasado un unico campo magnetico.
En una realizacion se usan multiples lmeas paralelas de tubos capilares pasados varios campos magneticos localizados.
En una realizacion se ensamblan juntas al menos una o mas lmeas de conductos en un casete para la integracion en un sistema con una bomba y controlador.
En una realizacion se dispensa el tampon de elucion con las moleculas diana en una celda de lfquido compuesto para procesamiento y analisis bioqmmico adicional.
En una realizacion se usan tubos capilares desechables. Estos tubos son sustituidos para cada proceso de muestra. En una realizacion, el conducto es reutilizable.
En una realizacion, donde el conducto es reutilizable, se usa vapor dentro del sistema para descontaminar y limpiar el sistema.
En una realizacion, donde el conducto es reutilizable, se usa blanqueador dentro del sistema para descontaminar y limpiar el sistema.
En una realizacion, donde el conducto es reutilizable, se usan enzimas de digestion de ADN comerciales dentro del sistema para descontaminar y limpiar el sistema.
Algunas realizaciones engloban un sistema de manipulacion de muestras que tiene una perla paramagnetica y entrada de fluido de muestra, una entrada de fluido inmiscible, una entrada de tampon de elucion, un conducto de fluido, una fuente de campo magnetico, un sistema de manipulacion de lfquidos y un controlador operativamente conectado al sistema de manipulacion de lfquidos y fuente de campo magnetico. En algunas realizaciones, el controlador puede ser programado para: (1) atraer una bala de perlas paramagneticas y muestra (a) pasada una fuente de campo magnetico, (b) donde las perlas paramagneticas y biomoleculas diana unidas son capturadas (c) y
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los contenidos de muestra restante continuan circulando dentro de la bala pasada la fuente de campo magnetico; (2) atraer una bala de fluido inmiscible; (3) atraer una bala de tampon de elucion, (a) pasar un fuente de campo magnetico, (d) donde las biomoleculas diana unidas son liberadas en el tampon de elucion de las perlas paramagneticas en el campo magnetico (e) y la bala continua circulando dentro del conducto para dispensar o para analisis adicional. Diagramas de flujo a modo de ejemplo se muestran en las FIGS. 4-6, 12-18.
En algunas realizaciones, el sistema de manipulacion de lfquidos comprende un conducto y driver. En algunas realizaciones, el controlador puede ser programado para accionar el driver para hacer que el conducto lleve a cabo las etapas (1) y (2), entonces atraer una bala para el protocolo de limpieza, que es generalmente una bala de etanol, y entonces llevar a cabo las etapas (3) y (4) (FIG. 5). En algunas realizaciones, el controlador tambien puede ser programado para accionar el driver para hacer que el conducto despues de la etapa (5) y antes de la etapa (3), (6) atraiga una bala de reactivos bioqmmicos (FIG. 6).
En algunas realizaciones, la fuente de campo magnetico comprende un iman fijo. En algunas realizaciones, el controlador puede ser programado para accionar el driver para hacer que el conducto lleve a cabo las etapas (1), (2),
(3) y (4) y atraiga (a) la bala pasada la fuente de campo magnetico (FIG. 12). En algunas realizaciones, el controlador puede ser programado para accionar el driver para hacer que el conducto lleve a cabo las etapas (1), (2), (5), (6), (3), y (4) mientras que realiza la operacion (a) (FIG. 13).
En algunas realizaciones, el controlador puede ser programado para accionar el driver para hacer que el conducto (7) atraiga una bala de perlas paramagneticas, y (8) atraiga una bala de anticuerpos y (9) atraiga una bala de muestra biologica y entonces la etapa (3), mientras que realiza las operaciones (a) y (f) de deteccion optica en la fuente de campo magnetico, seguido de la etapa (4) (FIG. 14). En algunas realizaciones, el controlador puede no realizar la operacion (f) (FIG. 15).
En algunas realizaciones, la fuente de campo magnetico comprende una fuente de campo magnetico de estado variable.
En algunas realizaciones, el controlador puede ser programado para accionar el driver para hacer que el conducto (10) atraiga una bala de perlas paramagneticas y entonces (11) atraiga una bala de mezcla de funcionalizacion de perlas paramagneticas mientras que realiza la operacion (a), luego (12) atraiga la bala de tampon de perlas paramagneticas y para que el controlador cambie el estado de la fuente de campo magnetico para realizar (f) la circulacion de las balas pasada la fuente de campo magnetico en el estado apagado antes de (13) dispensar un volumen de perlas paramagneticas funcionalizadas en un tampon (FIG. 16).
En algunas realizaciones, el controlador se programa ademas para la siguiente etapa (4), (5) y (6), mientras que se realiza (a), para (12) atraer una bala de tampon de perlas paramagneticas y cambiar la fuente de campo magnetico para realizar (f) seguido de las etapas (5) y luego (6) antes de (14) dispensar un volumen de perlas paramagneticas usadas en una disolucion de tampon (FIG. 17).
En algunas realizaciones, el controlador se programa ademas para (15) atraer lfquido de encapsulacion de la entrada de lfquido de encapsulacion y (16) descargar el lfquido de encapsulacion atrafdo sobre una superficie libre de un lfquido portador y aproximar a una caractenstica de estabilizacion antes de la etapa (4). En algunas realizaciones, el controlador puede ser programado para llevar a cabo la etapa (13) o etapa (14) en lugar de la etapa
(4) .
La purificacion basada en perlas en capilares ofrece varias ventajas en comparacion con el protocolo estandar. El modo automatizado de limpieza elimina el tiempo de manipulacion, reduciendo significativamente el tiempo de protocolo total. Se cree que el enfoque tambien puede mejorar la repetibilidad de las etapas de purificacion de ADN. El enfoque de capilares microflmdicos permite la limpieza de volumenes de nanolitros sin las significativas perdidas de volumen asociadas a pipetear pequenos volumenes. Esto permite el procesamiento de volumenes de muestra extremadamente pequenos y reduce el consumo de reactivos. Otro factor cntico en los protocolos de purificacion estandar es la variabilidad inducida por el usuario. Los presentes sistemas y metodos eliminan esta variabilidad del protocolo de purificacion.
Aplicaciones
Limpieza en capilares y procesamiento de celdas de liquido compuesto
En una realizacion, el tampon de elucion con las biomoleculas diana se dispensa en una celda de fluido inmiscible dispuesta sobre una superficie libre de un fluido portador mutuamente inmiscible. La celda de fluido compuesto resultante puede ser transportada, y/o incorporada, y/o mezclada, y/o puede realizarse en ella procesamiento bioqmmico.
En una realizacion, el tampon de elucion con las biomoleculas diana se dispensa en una celda de fluido inmiscible dispuesta en una superficie libre de un fluido portador mutuamente inmiscible con una caractenstica de estabilizacion mecanica.
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En una realizacion, las secuencias de fluidos a^das al conducto generan una celda de Kquido compuesto tras la dispensacion sobre una superficie libre de un fluido portador mutuamente inmiscible, desde el conducto.
En una realizacion, las perlas paramagneticas se dispensan siguiendo un protocolo de limpieza de conductos en una celda de lfquido compuesto para la re-funcionalizacion de la superficie.
En una realizacion, el fluido atrafdo en el conducto para procesamiento es una celda de lfquido compuesto.
En una realizacion, la celda de lfquido compuesto atrafda en el sistema tiene perlas paramagneticas y tampon.
En una realizacion, la celda de lfquido compuesto atrafda en el sistema contiene la muestra inicial.
En una realizacion, la celda de lfquido compuesto atrafda en el sistema contiene el tampon de elucion para liberar las biomoleculas diana.
En una realizacion, la celda de lfquido compuesto atrafda en el sistema contiene una mezcla bioqmmica para procesar las perlas paramagneticas en la fuente de campo magnetico en el conducto.
En una realizacion, la tecnologfa de celda de lfquido compuesto se usa para incorporar las perlas paramagneticas y la muestra inicial. La tecnologfa de lfquido compuesto previene la contaminacion y permite la facilidad de procesamiento y/o incubacion; y/o almacenamiento; y/o transporte; y/o mezcla de la muestra antes de la purificacion.
En una realizacion, se generan multiples celdas de fluido compuesto en paralelo.
Ejemplos de sistemas de celdas de lfquido compuesto a los que pueden adaptarse los presentes sistemas y metodos se desvelan, por ejemplo, en el documento WO/2012/011091.
Algunos metodos de manipulacion de un lfquido de muestra que contiene partfculas magneticas y un lfquido de encapsulacion inmiscible incluyen: hacer circular el lfquido de encapsulacion en un conducto; hacer circular el lfquido de muestra en el conducto de manera que el lfquido de muestra (a) sea rodeado por el lfquido de encapsulacion y (b) este localizado en un sitio de atrapamiento predeterminado dentro del conducto; inmovilizar las partfculas magneticas en el sitio de atrapamiento aplicando un campo magnetico en el sitio de atrapamiento; y hacer circular un lfquido de elucion en el conducto de manera que (a) el lfquido de elucion sea rodeado por el lfquido de encapsulacion, (b) el lfquido de muestra circule lejos del sitio de atrapamiento, y (c) el lfquido de elucion circule al sitio de atrapamiento y rodee las partfculas magneticas inmovilizadas. Las moleculas diana pueden unirse a las partfculas magneticas. La union puede producirse en el lfquido de muestra antes de la circulacion del lfquido de muestra, o en otros puntos en el proceso o en otro medio lfquido. Las moleculas diana, por ejemplo, biomoleculas, tambien pueden ser liberadas (no unidas) de las partfculas magneticas rodeando las partfculas con el lfquido de elucion. Las partfculas pueden o pueden no ser movilizadas durante el proceso. Por ejemplo, las partfculas pueden ser movilizadas cuando el lfquido de muestra esta en el sitio de atrapamiento, cuando el lfquido de elucion esta en el sitio de atrapamiento, o cuando otro fluido esta en el sitio de atrapamiento. El metodo tambien puede incluir movilizar las partfculas magneticas en el lfquido de elucion, y hacer circular el lfquido de elucion lejos del sitio de atrapamiento junto con las partfculas magneticas y/o moleculas diana liberadas. El lfquido de elucion tambien puede hacerse circular lejos del sitio de atrapamiento con las moleculas diana, mientras que las partfculas magneticas siguen inmovilizadas.
Los metodos tambien pueden incluir hacer circular uno o mas fluidos de limpieza en el conducto al sitio de atrapamiento de manera que (a) el fluido de limpieza sea rodeado por el lfquido de encapsulacion, y (b) el fluido de limpieza rodee las partfculas magneticas inmovilizadas. Las partfculas magneticas pueden ser movilizadas en el fluido de limpieza mientras que el fluido de limpieza esta en el sitio de atrapamiento. El fluido de limpieza tambien puede hacerse circular en el conducto lejos del sitio de atrapamiento. Si estan movilizadas, las partfculas magneticas pueden ser llevadas junto con el fluido de limpieza. Alternativamente, las partfculas magneticas pueden ser movilizadas en el fluido de limpieza en el sitio de atrapamiento, luego inmovilizadas otra vez. Entonces, el fluido de limpieza puede hacerse circular en el conducto lejos del sitio de atrapamiento mientras que las partfculas magneticas quedan en el sitio de atrapamiento. Tambien puede hacerse circular un segundo fluido de limpieza en el conducto.
Algunos metodos de manipulacion de un primer lfquido de muestra que contiene partfculas magneticas, un segundo lfquido de muestra y un lfquido de encapsulacion, siendo ambos lfquidos de muestra inmiscibles con el lfquido de encapsulacion, incluyen: hacer circular el lfquido de encapsulacion en un conducto; hacer circular el primer lfquido de muestra en el conducto de manera que el primer lfquido de muestra (a) sea rodeado por el lfquido de encapsulacion y (b) este localizado en un sitio de atrapamiento predeterminado dentro del conducto; inmovilizar las partfculas magneticas en el sitio de atrapamiento aplicando un campo magnetico en el sitio de atrapamiento; hacer circular el primer lfquido de muestra en el conducto de manera que el primer lfquido de muestra se haga circular lejos del sitio de atrapamiento mientras que las partfculas magneticas siguen inmovilizadas en el sitio de atrapamiento; y hacer circular el segundo lfquido de muestra en el conducto de manera que el segundo lfquido de muestra (a) sea rodeado por el lfquido de encapsulacion y (b) rodee las partfculas magneticas inmovilizadas.
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El segundo Kquido de muestra puede contener moleculas diana, por ejemplo, biomoleculas, que se unen a las pardculas magneticas cuando el segundo Kquido de muestra rodea las partfculas magneticas. Las partfculas magneticas pueden o bien seguir inmovilizadas en el segundo lfquido de muestra, o pueden ser movilizadas en el segundo lfquido de muestra. Los metodos tambien pueden incluir, despues de hacer circular el segundo lfquido de muestra, hacer circular un lfquido de elucion en el conducto de manera que (a) el lfquido de elucion sea rodeado por el lfquido de encapsulacion, (b) el segundo lfquido de muestra se haga circular lejos del sitio de atrapamiento, y (c) el lfquido de elucion circule al sitio de atrapamiento y rodee las partfculas magneticas inmovilizadas. Hacer circular el lfquido de elucion puede incluir liberar las biomoleculas diana de las partfculas magneticas rodeando las partfculas magneticas con el lfquido de elucion. Las partfculas magneticas pueden o bien estar movilizadas en el lfquido de elucion o seguir inmovilizadas en el lfquido de elucion.
Los metodos tambien pueden incluir usar un fluido de limpieza, por ejemplo: despues de hacer circular el segundo lfquido de muestra, hacer circular un primer lfquido de limpieza en el conducto de manera que (a) el primer lfquido de limpieza sea rodeado por el lfquido de encapsulacion, (b) el segundo lfquido de muestra se haga circular lejos del sitio de atrapamiento, y (c) el primer lfquido de limpieza circule al sitio de atrapamiento y rodee las partfculas magneticas inmovilizadas; y despues de hacer circular el primer lfquido de limpieza, hacer circular un lfquido de elucion en el conducto de manera que (a) el lfquido de elucion sea rodeado por el lfquido de encapsulacion, (b) el primer lfquido de limpieza se haga circular lejos del sitio de atrapamiento, y (c) el lfquido de elucion circule al sitio de atrapamiento y rodee las partfculas magneticas inmovilizadas.
En cualquiera de los metodos desvelados en el presente documento, el lfquido de muestra y el lfquido de encapsulacion pueden constituir una celda de lfquido compuesto en algun punto durante, o a traves de, el metodo desvelado. Similarmente, en cualquiera de los metodos desvelados, pueden usarse marcadores conjuntamente con las moleculas diana. Tales marcadores pueden detectarse por interrogatorio optico o fluorescente del sitio de atrapamiento. En cualquiera de estos metodos, el conducto podna ser, por ejemplo, un tubo capilar.
Un sistema de manipulacion de lfquidos puede incluir un conducto que tiene un sitio de atrapamiento predeterminado, una bomba configurada para aplicar presion positiva, presion negativa, o ninguna presion externa a una localizacion en el conducto, una fuente de campo magnetico configurada para aplicar un campo magnetico en el sitio de atrapamiento cuando se activa y sustancialmente ningun campo magnetico cuando no se activa, y un controlador operativamente unido a la bomba y la fuente de campo magnetico de manera que el controlador pueda activar la bomba y/o la fuente de campo magnetico. El controlador puede ser programado para: activar la bomba de manera que un lfquido de encapsulacion se haga circular en el conducto; activar la bomba de manera que un lfquido de muestra se haga circular en el conducto de tal forma que el lfquido de muestra (a) sea rodeado por el lfquido de encapsulacion y (b) este localizado en el sitio de atrapamiento dentro del conducto, conteniendo el lfquido de muestra partfculas magneticas; activar la fuente de campo magnetico de manera que las partfculas magneticas se inmovilicen en el sitio de atrapamiento; y activar la bomba de manera que un lfquido de elucion se haga circular en el conducto de tal forma que (a) el lfquido de elucion sea rodeado por el lfquido de encapsulacion, (b) el lfquido de muestra se haga circular lejos del sitio de atrapamiento, y (c) el lfquido de elucion circule al sitio de atrapamiento y rodee las partfculas magneticas. Mas generalmente, el controlador puede ser programado para activar la bomba y activar y/o desactivar la fuente de campo magnetico, para llevar a cabo cualquiera de los metodos desvelados. El conducto puede ser, por ejemplo, un tubo capilar. La bomba puede configurarse para aplicar presion positiva y/o presion negativa al conducto. Por ejemplo, la bomba puede configurarse para hacer circular un fluido en el conducto en una direccion bajo presion positiva y hacer circular un fluido en el conducto en otra direccion bajo presion negativa.
Secuenciacion
Muchas plataformas de secuenciacion de nueva generacion (NGS) requieren genotecas de ADN constituidas de fragmentos de ADN dentro de un intervalo espedfico de longitudes de pares de bases. Ademas, estos fragmentos de ADN necesitan ser marcados con secuencias de nucleotidos espedficas (adaptadores) para permitir que las secuencias se amplifiquen usando PCR y para permitir que los fragmentos de genoteca se hibriden con la celda de flujo del secuenciador. Tambien pueden anadirse indices espedficos de secuencia a los fragmentos de ADN para identificar muestras individuales cuando se multiplexa la muestra dentro de una unica celda de flujo. La tagmentacion de ADN (el ADN se fragmenta y marca con adaptadores) y la adicion de adaptadores e indices comunes se logran en dos reacciones biologicas separadas. Tras estas reacciones, la genoteca de ADN se limpia para eliminar el exceso de nucleotidos, enzimas, cebadores, sales y otros contaminantes. Por consiguiente, el flujo de trabajo requerido para tagmentar el ADN, purificar el ADN tagmentado, anadir adaptadores e indices comunes y purificar el producto de genoteca final es complejo y laborioso. En una realizacion, el sistema de limpieza basado en capilares puede usarse para automatizar las etapas de purificacion de muestras y aislamiento de ADN requeridas dentro de la secuenciacion genetica. Un ejemplo completo de este proceso se desvela a continuacion.
Recubrimiento de perlas por secuenciacion genetica
La preparacion de perlas por secuenciacion genetica es un proceso por el que pequenas perlas son recubiertas en una qmmica espedfica de la aplicacion. En una realizacion, el recubrimiento de perlas con antelacion al cribado genetico se logra haciendo circular una bala de perlas-mezcla, seguido de la qmmica de cebadores espedficos
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usada para recubrir las perlas dentro del conducto pasado el campo magnetico estacionario. Entonces se pasa una bala de tampon de elucion, en la que la concentracion de perlas puede controlarse por el volumen de tampon de elucion usado dentro de la bala. El campo magnetico se elimina y la mezcla de perlas funcionalizadas circula a lo largo del conducto para el procesamiento adicional.
En una realizacion, el flujo dentro del conducto puede ser invertido y la mezcla de perlas funcionalizadas se dispensa para almacenamiento o procesamiento bioqmmico adicional.
Estos metodos proporcionan una forma conveniente de manipulacion y combinacion de volumenes inferiores al microlitro que actualmente no es posible lograr usando tecnicas convencionales, reduciendo asf los volumenes iniciales de muestra y mejorando la eficiencia del recubrimiento de perlas que reduce el volumen de reaccion. El procesamiento adicional usando PCR y ciclado termico y secuenciacion genetica es espedfico de la aplicacion.
El uso de esta tecnologfa simplifica enormemente el procedimiento de recogida para estos volumenes diana relativamente pequenos. El sistema facilita el 100 % de recuperacion de volumen, ya que la muestra biologica en procesamiento no causa ninguna perdida por pipeteado. Estas caractensticas hacen mas facil la automatizacion del proceso bioqmmico.
Seleccion de tamano de ARN pequenos
La secuenciacion de moleculas de ARN pequeno se complica por la arrolladora cantidad de productos no espedficos de fondo despues de la transcripcion inversa, cuya longitud es marginalmente mas pequena que la de las moleculas diana pequenas. Actualmente, las moleculas de ADNc diana pequenas (transcritas de forma inversa a partir de ARN) son seleccionadas por tamano cortando la banda de electroforesis en gel deseada. Normalmente, se extrae el ADN de la rebanada de gel, se anade a una reaccion de PCR y luego se limpia usando un enfoque basado en columna de centrifugacion. El flujo de trabajo es laborioso y la tasa de rendimiento / recuperacion de ADN es mala.
En una realizacion, la purificacion y la seleccion de tamano se logran bombeando los reactivos necesarios en un capilar. Se extraen volumenes espedficos de disolucion de ADN-perla, etanol, aire y tampon de elucion y se hacen circular dentro de un conducto. Como la disolucion de ADN-perla circula a traves de un campo magnetico, las perlas y el ADN unido se eliminan de la disolucion para formar un sedimento en la pared del conducto. El sedimento de perla-ADN se lava a medida que las balas de etanol posteriores circulan pasado el sedimento inmovilizado. Entonces se eluye el ADN de las perlas y en disolucion a medida que el tampon de elucion circula pasado el sedimento de perlas. Las bombas se invierten y se recupera el eluyente que contiene ADN purificado para las etapas posteriores del flujo de trabajo de preparacion de genotecas de NGS.
En una realizacion, se mezclan perlas paramagneticas con producto de ADNc. Usando las propiedades de seleccion de tamano de las perlas magneticas seleccionando condiciones de tampon espedficas (pueden unirse diferentes tamanos de ADN usando diferentes condiciones de tampon), las moleculas de ADNc pequeno pueden ser unidas exclusivamente a las perlas, mientras que las moleculas restantes quedan en disolucion y se entregan a residuos. Las moleculas diana pequenas se eluyeron entonces a medida que el tampon de elucion paso el sedimento de perlas fijas.
En una realizacion, el proceso de seleccion de tamano se realiza sin balas de etanol.
Seleccion de tamano de genotecas de ADN para la secuenciacion de NGS
Cada uno de los siguientes secuenciadores de nueva generacion tiene una longitud de lectura optima (pares de bases). Durante la construccion de genotecas, el ADN se fragmenta en moleculas de ADN con un amplio intervalo de longitudes de pares de bases. La seleccion de tamano se realiza actualmente usando perlas paramagneticas sobre una placa de microtitulacion y es laborioso y padece ineficiencias de errores de pipeteado y variaciones del protocolo de usuario. El sistema de conductos basados en capilares puede usarse para la seleccion de tamano de genotecas de ADN.
Purificacion de acidos nucleicos
El sistema de conductos basados en capilares puede usarse para la purificacion y/o aislamiento de muestras antes y/o despues de la PCR. Las perlas paramagneticas se usan como sitios para la purificacion y/o aislamiento del acido nucleico.
Pueden usarse perlas paramagneticas para eliminar el exceso de trifosfatos de desoxinucleotido no incorporados, sales y enzimas despues de la PCR. Se requiere la eficiente eliminacion de estos contaminantes para garantizar el exito en aplicaciones aguas abajo tales como genotipificacion, secuenciacion de Sanger y de nueva generacion. La purificacion basada en perlas ofrece alta tasa de recuperacion de amplicones, eficiente eliminacion de contaminantes y flexibilidad en la limpieza. Ejemplos de algunos de los posibles metodos de realizacion se dan a continuacion.
Enriquecimiento de protemas
Tambien puede realizarse enriquecimiento de proteinas usando el sistema de conductos basados en capilares. Las perlas paramagneticas se usan como sitios para enriquecer las proteinas diana.
Las perlas se recubren con un medio con una alta afinidad por los anticuerpos. Se anaden anticuerpos espedficos 5 para una protema diana a las perlas, acoplandose a los sitios de union localizados sobre la superficie de la perla. Entonces se anaden muestras biologicas que contienen proteinas diana, uniendose a los anticuerpos. La aplicacion de un campo magnetico permite la separacion y el aislamiento de la muestra biologica que contiene moleculas de fondo. Desechar el sobrenadante y anadir un tampon de elucion proporciona protema diana purificada. Puede lograrse el enfoque de enriquecimiento de proteinas basado en perlas usando el sistema basado en capilares, que 10 permite el enriquecimiento de proteinas en un modo automatizado de alto rendimiento.
Estructuras de acido nucleico sintetico construidas:
Pueden usarse perlas paramagneticas en sistemas similares a los brevemente explicados aqu para ayudar en el ensamblaje de estructuras de acido nucleico (oligonucleotidos).
Perlas magneticas proporcionan grandes relaciones de superficie con respecto a volumen importantes en la 15 exposicion de qmmica unida relevante. La smtesis de oligonucleotidos se lleva a cabo por una adicion escalonada de restos de nucleotidos al extremo 5' de la cadena en crecimiento hasta que se ensambla la secuencia deseada. Las etapas incluyen desbloqueo (destritilacion) donde los grupos funcionales se eliminan por una disolucion de acido antes del acoplamiento. El acoplamiento introduce y une fosforamidito de nucleosido para formar la siguiente base. La terminacion asegura entonces prevenir la elongacion de cadena adicional. Esto se realiza normalmente tratando 20 los soportes solidos con anhfdrido acetico y 1-metilimidazol. Entones se realiza la oxidacion para aumentar la estabilidad.
Enriquecimiento / aislamiento de celulas
Pueden usarse perlas paramagneticas para aislar y enriquecer celulas diana de una muestra biologica. Este enfoque enriquece celulas directamente de la muestra biologica sin usar columnas, asegurando la alta viabilidad celular y 25 rendimiento. Esto es particularmente importante en aplicaciones tales como el analisis de celulas tumorales en enfermedad residual minima donde las celulas diana son extremadamente raras.
El enriquecimiento se logra anadiendo perlas paramagneticas recubiertas con anticuerpos contra marcadores celulares espedficos a una muestra biologica. Las celulas diana se unen a las perlas y se separan usando un iman. Entonces se desecha el sobrenadante que contiene las celulas de fondo. Las celulas diana pueden entonces 30 recuperarse para analisis. Este enfoque de aislamiento y enriquecimiento de celulas basado en perlas paramagneticas puede implementarse en un sistema basado en capilares, que permite el enriquecimiento de celulas automatizado y la integracion con otras tecnologfas microflmdicas para el analisis aguas abajo.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos ilustran realizaciones particulares, pero no deben considerarse como limitantes del alcance 35 de la materia desvelada.
Purificacion y recuperacion de un amplicon de 285 pb
Este ejemplo presenta datos del sistema de purificacion de acidos nucleicos basado en capilares de GenCell Biosystems. Este experimento se realizo para demostrar que el sistema de purificacion en capilares era capaz de purificar y recuperar producto de PCR.
40 Se usaron cebadores directos e inversos que se dirigen a un fragmento de 285 pb en el gen de beta-actina para amplificar el producto previsto usando pCr. Este producto se uso entonces para evaluar el rendimiento del instrumento de purificacion de perlas paramagneticas basado en capilares. Se pipetearon 18 pl de mezcla de perlas- tampon (AMPure Xp, Agencourt) a 10 pl de producto de PCR en un tubo de PCR. La concentracion de 1,8* de perlas-mezcla garantiza que se recuperen fragmentos superiores a 100 pb. Se mezclo con pipeta la mezcla de 45 perlas-ADN y se incubo a temperatura ambiente durante 5 minutos para permitir que el ADN se uniera a las perlas, como se recomendo por el protocolo AMPure Xp. Se aspiro la disolucion de perlas-ADN de 28 pl en un tubo capilar de PTFE (400 micrometros de diametro interno), seguido de dos balas de 5 pl de etanol al 70 %, una bala de 10 pl de aire, 2,5 pl de aceite de polidimetilsiloxano y 10 pl de tampon de elucion (agua libre de nucleasa). La secuencia de mezcla de ADN-perlas, balas de etanol, aire, aceite y tampon de elucion se bombearon a un caudal constante de 50 10 pl/min usando una bomba de jeringa (PHD 2000, Harvard Apparatus). La secuencia descrita de reactivos imito las
etapas de purificacion especificadas por el protocolo de AMPure Xp. Se retiraron las perlas y el ADN diana unido de la disolucion de perlas-ADN a la pared del capilar a medida que la disolucion paso un iman. Las balas de etanol pasaron sobre el sedimento de ADN-perlas ahora fijo, lavando el sedimento y eliminando los contaminantes residuales. Entonces se administraron las balas de aire y aceite pasado el sedimento, eliminando el etanol residual. 55 En la etapa final del proceso de purificacion, la bala de tampon de elucion eluyo el ADN diana de las perlas y en
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disolucion a medida que paso por el sedimento de perlas. Se invirtio la bomba y el eluyente se recupero en un tubo de PCR esteril para analisis. Este experimento se realizo por duplicado. Los eluyentes se analizaron entonces usando electroforesis en gel.
Puede observarse un resultado de electroforesis en gel que compara las dos muestras de eluyente con el producto de beta-actina de 285 pb no purificado en la FIG 10. Observando la FIG. 10, es evidente que la tecnica de purificacion capilar descrita recupero satisfactoriamente los 385 pb. Comparando las bandas de eluyente con las bandas de producto de PCR no limpiadas es evidente que el procedimiento de purificacion no elimino productos espedficos tales como el dfmero de cebador.
Tasas de recuperacion de ADN: Comparacion con protocolos de aislamiento de ADN convencionales
Este ejemplo presenta datos del sistema de purificacion de acidos nucleicos en capilares de GenCell Biosystems, comparando las tasas de recuperacion entre el protocolo de purificacion basado en perlas convencional y el protocolo de purificacion basado en perlas en capilares. Estos experimentos se usaron para evaluar el rendimiento del enfoque de purificacion basado en perlas en capilares.
Se uso el amplicon de beta-actina de 285 pb como el molde de ADN para la purificacion. El amplicon se purifico y se recupero siguiendo el protocolo de purificacion basado en perlas en capilares brevemente expuesto anteriormente en el ejemplo Purificacion y recuperacion de un amplicon de 285 pb. Este experimento se realizo por cuadruplicado y las muestras de eluyente se almacenaron para el analisis.
En un experimento separado, se limpiaron 10 pl de la disolucion de molde que contema el amplicon de 285 pb siguiendo el protocolo de AMPure Xp. Se pipetearon 18 pl de la mezcla de perlas AMPure Xp a un pocillo de una placa de microtitulacion de 96 pocillos que contema 10 pl de la disolucion de molde. Se mezclo con pipeta la mezcla de ADN-perlas y se incubo a temperatura ambiente durante 5 minutos. La placa de microtitulacion se dispuso en una placa magnetica para separar las perlas que conteman ADN unido de la disolucion. El sobrenadante se aspiro usando una pipeta y se desecho. Se anadieron 200 pl de etanol al 70 % al sedimento de perlas y se incubo durante 30 segundos a temperatura ambiente. Entonces se aspiro el etanol usando una pipeta y se desecho. Esto se repitio para un total de dos lavados. Tras la etapa de lavado final, el sedimento se dejo secar para garantizar que se eliminaron todas las trazas de etanol. Se anadieron 10 pl de tampon de elucion (agua libre de nucleasa) al pocillo y se pipetearon al sedimento de perlas de la placa magnetica, eluyendo el ADN de las perlas y en disolucion. La placa de microtitulacion se dispuso sobre la placa magnetica y el eluyente se transfirio a una nueva placa. Este experimento se realizo por triplicado y las muestras se almacenaron para el analisis.
Los eluyentes recuperados del protocolo de limpieza convencional y los enfoques de limpieza en capilares se cuantificaron usando mediciones de espectrofotometna UV-vis (NanoDrop 2000, Thermo Scientific). Los resultados de cuantificacion por espectrofotometna UV-vis pueden observarse en la FIG. 7. Los resultados de cuantificacion mostrados en la FIG. 7 demuestran que las tasas de recuperacion de limpieza en capilares son identicas a las logradas usando el protocolo convencional. Este resultado confirma que la tasa de recuperacion de ADN es igual a la lograda usando el protocolo de AMPure Xp convencional. El enfoque de purificacion de ADN en capilares brevemente expuesto aqrn ofrece purificacion altamente automatizada sin una compensacion en el rendimiento.
Preparacion de genotecas de ADN
Este ejemplo ilustra como la purificacion basada en perlas en capilares puede incorporarse en un protocolo de preparacion de genotecas de ADN para secuenciacion de nueva generacion. Los datos presentados aqrn demuestran que las etapas de purificacion actualmente realizadas despues de diversos procesos biologicos dentro de un protocolo de preparacion de genotecas de ADN pueden sustituirse usando el enfoque de limpieza en capilares, que ofrece un enfoque de alto rendimiento automatizado a la preparacion de genotecas de ADN para secuenciadores de nueva generacion.
En este ejemplo, se implemento la limpieza en capilares en vez de las etapas de limpieza actualmente usadas en el kit de preparacion de muestras Nextera (Illumina). Se preparo una reaccion de tagmentacion de 9 pl. Esta reaccion contuvo ADN genomico de control, tampon molecular de alto peso, mezcla de enzimas Nextera y agua libre de nucleasa. En esta reaccion, el ADN se fragmenta y se marca con adaptadores. La reaccion de tagmentacion se preparo e incubo a 55 °C durante 5 minutos. Tras la tagmentacion, la muestra se purifico usando el sistema de purificacion basado en perlas en capilares en lugar del kit Zymo DNA Clean and Concentrator (Zymo Research) recomendado. Se anadieron 9 pl de producto tagmentado a 16,2 pl de disolucion de perlas AMPure Xp, se mezclo con pipeta y se incubo a temperatura ambiente durante 5 minutos. Entonces se aspiro la disolucion de ADN-perlas en un capilar de PTFE (400 micrometros de diametro interno). El capilar se cargo entonces con 2,5 pl de aire, una bala de 10 pl de tampon de union de ADN, una bala de 2,5 pl de aire, dos balas de 5 pl de etanol, se separo por una bala de 2,5 pl de aire, una bala de 10 pl de aire, una bala de 2,5 pl de aceite y una bala de 15 pl de tampon eluyente (agua libre de nucleasa). Se bombeo el tren de las balas de reactivo a 10 pl/min usando una bomba de jeringa (PHD2000, Harvard). Se retiraron las perlas y el ADN diana unido de la disolucion de perlas-ADN a la pared del capilar a medida que la disolucion paso un iman. Entonces, el tampon de union de ADN (Zymo Clean and Concentrator Kit, Zymo Research) paso el sedimento de perlas inmovilizado, disociando la enzima transposasa del
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ADN diana fragmentado - un inhibidor de PCR conocido. Tras esto, las etapas de lavado en etanol pasaron el sedimento de perlas-ADN, eliminando los contaminantes residuales. Entonces, las balas de aire y de aceite pasaron el sedimento, eliminando el etanol residual. Finalmente, se eluyo el ADN tagmentado de las perlas a medida que el tampon de elucion paso el sedimento. Se invirtio la bomba y se recupero el tampon de elucion para las posteriores etapas del protocolo de preparacion de genotecas Nextera.
Se anadieron 11 pl de la elucion a una reaccion de PCR (25 pl de volumen final). Entonces se realizo PCR de ciclos limitados usando un GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems), segun las condiciones de ciclado termico especificadas por el protocolo Nextera. La reaccion de PCR se calento a 72 °C durante 3 minutos, 95 °C durante 30 segundos, seguido de 9 ciclos de 95 °C durante 10 segundos, 62 °C durante 30 segundos, 72 °C durante 3 minutos. Durante la etapa de PCR, se anaden sitios compatibles de PCR en puente e indices espedficos a los extremos del ADN tagmentado. Tras la etapa de PCR de ciclos limitados, se purifico el producto de genotecas de ADN usando la limpieza basada en perlas en capilar en lugar del kit Zymo DNA Clean and Concentrator (Zymo Research) recomendado o el kit de purificacion AMPure Xp. Se anadieron 15 pl de la reaccion de PCR de 25 pl a 25 pl de la disolucion de perlas AMPure Xp, se mezclo con pipeta y se incubo a temperatura ambiente durante 5 minutos. La disolucion de perlas-ADN se aspiro en un capilar de PTFE (400 micrometros de diametro interno). Entonces, el capilar se cargo con 2,5 pl de aire, dos balas de 5 pl de etanol, se separo una bala de aire, y seguido de una bala de 10 pl de aire, una bala de 2,5 pl de aceite y una bala de 15 pl de tampon eluyente (agua libre de nucleasa). Se retiraron las perlas y el ADN diana unido de la disolucion de perlas-ADN a la pared del capilar a medida que la disolucion paso un iman. Tras esto, las etapas de lavado de etanol pasaron el sedimento de perlas-ADN, eliminando los contaminantes residuales. Entonces, las balas de aire y de aceite pasaron el sedimento, eliminando el etanol residual. Finalmente, se eluyeron las secuencias de genotecas de ADN de las perlas a medida que el tampon de elucion paso el sedimento. Se invirtio la bomba y se recupero el tampon de elucion para el analisis. Este experimento se realizo por duplicado.
Se analizaron genotecas de ADN recuperadas usando electroforesis en gel. El resultado de la electroforesis en gel puede observarse en la FIG. 8. Examinando el resultado del gel, es evidente que las dos etapas de limpieza en capilar implementadas en el protocolo Nextera limpiaron y purificaron satisfactoriamente las secuencias de genotecas. Pueden observarse bandas manchadas correspondientes a los fragmentos de genotecas de ADN superiores a 200 pb en la FIG. 8, que demuestran que la limpieza basada en perlas en capilares es eficaz en eliminar la enzima transposasa despues de la tagmentacion y purificacion de productos despues de la tagmentacion y PCR de ciclos limitados. Esto verifica que el sistema de limpieza basado en perlas en capilares es una alternativa factible a las etapas de purificacion convencionales dentro de un protocolo de preparacion de genotecas de ADN.
Preparacion de genotecas de ADN: Comparacion con protocolos de purificacion de ADN convencional
Este ejemplo valida el sistema de purificacion basado en perlas en capilares para su uso en un protocolo de preparacion de genotecas de ADN. El protocolo de preparacion de genotecas de ADN se condujo segun protocolo y con las etapas de limpieza en capilares. Entonces se comparo el producto de genotecas final de ambos experimentos, confirmando la eficacia de las etapas de limpieza en capilares en lugar de las etapas de limpieza convencionales.
Se llevo a cabo el protocolo de preparacion de genotecas Nextera usando las etapas de limpieza en capilares despues de la tagmentacion y despues de la PCR de ciclos limitados, como se describe en la preparacion de genotecas de ADN del ejemplo previo. Esto se realizo por duplicado y el producto de genoteca final se recupero y se guardo para el analisis.
Se llevo a cabo el protocolo de preparacion de genotecas Nextera segun el protocolo recomendado con una alteracion - se realizo la limpieza post-tagmentacion usando el kit de purificacion AMPure Xp. La reaccion de tagmentacion se preparo como se describe en la preparacion de genotecas de ADN del ejemplo previo. Entonces se purifico la reaccion de tagmentacion de 9 pl usando el kit de purificacion AMPure Xp. Se anadieron 9 pl de producto tagmentado a 16,2 pl de la disolucion de perlas AMPure Xp en un pocillo de una placa de microtitulacion, se mezclo con pipeta y se incubo a temperatura ambiente durante 5 minutos. La placa de microtitulacion se dispuso sobre una placa magnetica para separar perlas que conteman ADN unido de la disolucion. El sobrenadante se aspiro usando una pipeta y se desecho. Se anadieron 200 pl de tampon de union de ADN al sedimento de perlas y se incubo durante 60 segundos a temperatura ambiente para disociar la enzima transposasa del ADN tagmentado. Se anadieron 200 pl de etanol al 70 % al sedimento de perlas y se incubo durante 30 segundos a temperatura ambiente. Entonces se aspiro el etanol usando una pipeta y se desecho. Esto se repitio para un total de dos lavados. Tras la etapa de lavado final, el sedimento se dejo secar para garantizar que se eliminaron todas las trazas de etanol. Se anadieron 15 pl de tampon de elucion (agua libre de nucleasa) al pocillo y se pipetearon al sedimento de perlas, que se elimino de la placa magnetica para permitir la resuspension de las perlas en el tampon de elucion, eluyendo ADN de las perlas y en disolucion. Se sustituyo la placa de microtitulacion sobre la placa magnetica y se separaron las perlas y el eluyente y el eluyente se transfirio a una reaccion de PCR (25 pl de volumen final).
Se realizo PCR de ciclos limitados, como se describe en la preparacion de genotecas de ADN de los ejemplos. Tras la PCR, se anadieron 15 pl de la reaccion de PCR de 25 pl a 25 pl de disolucion de perlas AMPure Xp en un pocillo de una placa de microtitulacion. Se mezclo con pipeta la mezcla de ADN-perlas y se incubo a temperatura ambiente
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durante 5 minutos. La placa de microtitulacion se dispuso sobre una placa magnetica para separar las perlas que conteman ADN unido de la disolucion. Se aspiro el sobrenadante usando una pipeta y se desecho. Se anadieron 200 pl de etanol al 70 % al sedimento de perlas y se incubo durante 30 segundos a temperatura ambiente. Entonces se aspiro el etanol usando una pipeta y se desecho. Esto se repitio durante un total de dos lavados. Tras la etapa de lavado final, el sedimento se dejo secar para garantizar que se eliminaran todas las trazas de etanol. Se anadieron 15 pl de tampon de elucion (agua libre de nucleasa) al pocillo y se pipeteo al sedimento de perlas, que se elimino de la placa magnetica para permitir la resuspension de las perlas en el tampon de elucion y la liberacion del ADN de las perlas y en disolucion. Se sustituyo la placa de microtitulacion sobre la placa magnetica para separar las perlas de la disolucion y el eluyente que contema el producto de genoteca final se transfirio a una nueva placa para el analisis. Este experimento se realizo por duplicado.
Se analizaron los productos de genoteca finales recuperados usando el protocolo convencional y el protocolo con etapas de eliminacion en capilar incorporadas usando electroforesis en gel. El resultado del gel puede observarse en la FIG. 8. Examinando este resultado del gel, es evidente que la intensidad de la mancha y el tamano de los productos recuperados del protocolo de limpieza en capilar es aproximadamente igual al de las genotecas preparadas usando el protocolo convencional. Esto demuestra que implementar las etapas de purificacion basadas en perlas en capilares en el protocolo da tasas de recuperacion y calidad de genotecas similares a las obtenidas usando el protocolo convencional. El enfoque basado en capilares ofrece un enfoque de alto rendimiento libre de trabajo que puede integrarse con otras tecnologfas de arquitectura abierta para ofrecer un sistema de preparacion de genotecas de ADN completamente automatizado.
Preparacion de genotecas de ADN de bajo volumen: Comparacion con protocolos de purificacion de ADN convencionales
Este ejemplo resalta la eficiencia del sistema de purificacion basado en perlas en capilares en la preparacion de genotecas de ADN de bajo volumen. El protocolo de preparacion de genotecas de ADN se condujo segun el protocolo y con las etapas de limpieza en capilares para volumenes de reaccion reducidos. Entonces se comparo el producto de genoteca final de ambos experimentos, confirmando las ventajas de emplear las etapas de limpieza en capilares en lugar de las etapas de limpieza convencionales cuando se preparan genotecas de ADN de volumen pequeno.
En la primera parte de este experimento, se preparo una reaccion de tagmentacion de 2,5 pl y se incubo a 55 °C durante 5 minutos. Tras la tagmentacion, se anadio la reaccion de tagmentacion de 2,5 pl a 4,5 pl de disolucion de perlas AMPure Xp, se mezclo con pipeta y se incubo a temperatura ambiente durante 5 minutos. La disolucion se purifico usando el protocolo AMPure Xp con la etapa de adicion del tampon de union de ADN, como se describe en el ejemplo previo. El producto tagmentado se eluyo en 1,1 pl de agua libre de nucleasa y se anadio a la reaccion de PCR. Entonces se purifico la reaccion de PCR de 2,5 pl segun el protocolo de AMPure Xp y el producto de genoteca final se eluyo en 4 pl de agua libre de nucleasa y se guardo para el analisis. En la segunda parte de este experimento, se purificaron volumenes identicos usando etapas de limpieza en capilares, como se describe en el ejemplo previo. Ambos enfoques se realizaron por duplicado.
Los productos de genotecas de ADN finales se anadieron a una reaccion de PCR de 20 pl y se analizaron usando PCR cuantitativa (qPCR). Los cebadores directos e inversos fueron espedficos para los adaptadores anadidos al extremo de los fragmentos de genotecas de ADN, asegurando que solo senan cuantificados los fragmentos listos para el secuenciador. Se uso qmmica de deteccion con SYBR green. Los patrones suministrados por KAPA Biosystems tambien se ejecutaron en la misma placa de qPCR, permitiendo la cuantificacion absoluta del kit de genoteca recuperado. La placa de qPCR se sometio a 40 ciclos (ABi StepOne, LifeTechnologies) segun el kit KAPA Biosystems Library Quant.
El resultado de qPCR puede observarse en la FIG. 9. Las dos genotecas recuperadas usando la limpieza en capilar tienen valores del ciclo de cuantificacion (Cq) mas tempranos que las genotecas recuperadas usando el protocolo convencional. El Cq se define como el numero de ciclos al que la senal de fluorescencia supera el nivel de fluorescencia de fondo y esta relacionado con la cantidad de producto de partida. Los valores de Cq para el producto limpiado en capilares fueron 2,8 y 2,9. Los valores de Cq para el producto limpiado usando metodos convencionales fueron 3,6 y 4,0, significativamente mas tarde que el producto limpiado en capilares. Esto demuestra que la limpieza en capilares ofrece tasas de recuperacion superiores cuando se preparan genotecas de ADN a partir de volumenes pequenos. Esto puede atribuirse a las reducidas perdidas de muestra asociadas al enfoque en capilares en comparacion con el protocolo convencional donde los errores de pipeteado son significativos.
Las tasas de recuperacion de genotecas de ADN superiores asociadas a la limpieza en capilares se sustentan ademas en el siguiente ejemplo.
Recuperacion de ADN de volumenes de muestra bajos usando aislamiento basado en perlas en capilares
Este ejemplo verifica que el enfoque de limpieza en capilares tiene excelentes tasas de recuperacion cuando se manipulan volumenes pequenos de genotecas de ADN. En este ejemplo, se realizaron varios experimentos para investigar la recuperacion de genotecas de ADN usando limpieza en capilares.
Se realizo el protocolo de Nextera completo, siguiendo el protocolo convencional. Se almaceno el producto de genoteca de ADN final y se uso como molde. Se anadieron 2,5 jl de genoteca de ADN a 4,5 jl de disolucion de perlas AMPure Xp, se mezclo con pipeta y se sometio al procedimiento de limpieza en capilares brevemente expuesto en los ejemplos previos. El producto recuperado se anadio entonces a una reaccion de PCR. Se realizaron 5 controles positivos que conteman 2,5 jl de molde por triplicado y se analizaron. El producto de genoteca recuperado y los controles positivos se analizaron usando qPCR. El control positivo y los valores de Cq del eluyente se
presentan en la Tabla 1. Los valores de Cq de control positivo representan la cantidad de partida del producto de
genoteca de ADN antes de cualquier proceso de purificacion. Debido a que se usaron 2,5 jl de producto de
genoteca de ADN en los controles positivos y se introdujeron en el proceso de limpieza en capilar de volumen
10 pequeno, los valores de Cq para ambos deben ser iguales, suponiendo una eficiencia de recuperacion del 100 %. Examinando los valores de Cq para los controles positivos y el eluyente, es evidente que la mayona, si no todo el producto de genoteca, se recupera despues de someter la muestra a la limpieza basada en perlas en capilares. Los valores de Cq del eluyente son aproximadamente iguales a los controles positivos, que demuestran la eficiente recuperacion del producto de genotecas de ADN.
15 Este ejemplo confirma que el enfoque de limpieza en capilares es capaz de recuperar eficientemente la genoteca de ADN devolumenes pequenos.
Tabla 1
Prueba 1 Prueba 2 Prueba 3 Prueba 4
Descripcion
Cq Cq Cq Cq
Control positivo 1
4,8 5,0 4,5 5,4
Control positivo 2
5,1 4,9 4,4 5,3
Control positivo 3
5,0 5,1 4,4 5,2
Control positivo promedio
4,96 5,0 4,43 5,3
Eluyente
4,7 4,7 6,0 5,3
Descontaminacion de capilares - reutilizacion
20 El procedimiento de limpieza en capilares brevemente explicado en los ejemplos previos normalmente purifica muestras de alta concentracion tales como producto de PCR o genoteca de ADN. Inevitablemente, el capilar esta contaminado con pequenas cantidades de ADN diana, ya que las perlas se separan de la disolucion y se mantienen en la pared del capilar. Sin desechar la lmea, esto conducina a contaminacion remanente entre muestras. Claramente, esto no es altamente deseable. Este ejemplo demuestra que una serie de etapas de lavado elimina o 25 destruye suficientemente cualquier acido nucleico que quede en el capilar despues de realizar la purificacion basada en perlas en capilares - que permite la reutilizacion del capilar.
Se purifico el producto de PCR usando el enfoque de limpieza en capilar, siguiendo el protocolo exacto brevemente expuesto en el ejemplo de Recuperacion de ADN de volumenes de muestra bajos usando aislamiento basado en perlas en capilares. Entonces se paso una bala negativa de 9 jl en capilar (agua libre de nucleasa) a lo largo del 30 capilar y se recupero para investigar si la lmea estaba contaminada. Tras esto, se lleno el capilar con un reactivo de limpieza (LookOut DNA Erase, SigmaAldrich) durante 3 minutos. El reactivo de limpieza se bombeo al residuo y la lmea se lavo con agua esteril. Tras la descontaminacion, se pasaron dos balas negativas en capilar esteril de 9 jl a lo largo del capilar para investigar los niveles de contaminacion despues de las etapas de lavado. Se anadieron el eluyente recuperado y los negativos en capilar a reacciones de PCR. Tambien se prepararon controles positivos y 35 sin molde y se analizaron usando qPCR (ABi StepOne, LifeTechnologies). El resultado de qPCR puede observarse en la FIG. 11. Examinando la FIG. 11, es evidente que el capilar esta significativamente contaminado directamente despues de realizar la limpieza en capilares. Tras la etapa de descontaminacion, los valores de Cq negativos en capilar entran dentro de los valores de Cq de control sin molde. Los valores de Cq presentados por los controles sin molde y los negativos en capilar se corresponden con el producto dfmero de cebador. Los negativos en capilar 40 siguen siendo negativos para el producto diana, que indica la eficaz descontaminacion despues de lavar el capilar.
La implementacion de las etapas de lavado descritas permite la reutilizacion de la lmea despues de cada experimento de purificacion / seleccion de tamano.
Definicion
En la presente divulgacion, el uso del termino "bala" es intercambiable con el termino tapon, e indica un volumen 45 discreto de fluido que circula dentro del conducto.

Claims (15)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo de manipulacion de un Ifquido de muestra que contiene partfculas magneticas que tienen moleculas diana unidas a las mismas y un lfquido de encapsulacion, siendo el lfquido de muestra y el lfquido de encapsulacion inmiscibles, comprendiendo el metodo:
    hacer circular el lfquido de encapsulacion en un conducto;
    hacer circular el lfquido de muestra que contiene las partfculas magneticas en el conducto de manera que el lfquido de muestra (a) sea rodeado por el lfquido de encapsulacion y (b) este localizado en un sitio de atrapamiento predeterminado dentro del conducto;
    inmovilizar las partfculas magneticas en el sitio de atrapamiento aplicando un campo magnetico en el sitio de atrapamiento; y
    hacer circular un lfquido de elucion en el conducto de manera que (a) el lfquido de elucion este rodeado por el lfquido de encapsulacion, (b) el lfquido de muestra se haga circular lejos del sitio de atrapamiento, y (c) el lfquido de elucion circule al sitio de atrapamiento y rodee las partfculas magneticas inmovilizadas, liberando asf las biomoleculas diana de las partfculas magneticas.
  2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende ademas:
    unir las biomoleculas diana a las partfculas magneticas antes de la circulacion del lfquido de muestra en el conducto.
  3. 3. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende ademas movilizar las partfculas magneticas en el lfquido de elucion eliminando el campo magnetico despues de hacer circular el lfquido de elucion; opcionalmente que comprende ademas hacer circular el lfquido de elucion que contiene las partfculas magneticas movilizadas lejos del sitio de atrapamiento.
  4. 4. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende ademas hacer circular el lfquido de elucion que contiene las biomoleculas diana liberadas lejos del sitio de atrapamiento mientras que las partfculas magneticas siguen inmovilizadas por el campo magnetico aplicado; opcionalmente que comprende ademas:
    (a) hacer circular un primer fluido de limpieza en el conducto al sitio de atrapamiento de manera que (a) el
    fluido de limpieza este rodeado por el lfquido de encapsulacion, y (b) el primer fluido de limpieza rodee las
    partfculas magneticas inmovilizadas;
    movilizar las partfculas magneticas en el primer fluido de limpieza eliminando el campo magnetico; y
    hacer circular el primer fluido de limpieza que contiene las partfculas magneticas movilizadas en el conducto lejos del sitio de atrapamiento; opcionalmente que comprende ademas hacer circular un segundo fluido de limpieza en el conducto; o
    (b) hacer circular un primer fluido de limpieza en el conducto al sitio de atrapamiento de manera que (a) el
    fluido de limpieza este rodeado por el lfquido de encapsulacion, y (b) el primer fluido de limpieza rodee las
    partfculas magneticas inmovilizadas;
    movilizar las partfculas magneticas en el primer fluido de limpieza eliminando el campo magnetico;
    inmovilizar las partfculas magneticas movilizadas volviendo a aplicar el campo magnetico; y hacer circular el primer fluido de limpieza en el conducto lejos del sitio de atrapamiento y las partfculas magneticas inmovilizadas; opcionalmente que comprende ademas hacer circular un segundo fluido de limpieza en el conducto.
  5. 5. Un metodo de manipulacion de un primer lfquido de muestra que contiene partfculas magneticas, un segundo lfquido de muestra y un lfquido de encapsulacion, siendo ambos lfquidos de muestra inmiscibles con el lfquido de encapsulacion, comprendiendo el metodo:
    hacer circular el lfquido de encapsulacion en un conducto;
    hacer circular el primer lfquido de muestra que contiene partfculas magneticas en el conducto de manera que el primer lfquido de muestra (a) sea rodeado por el lfquido de encapsulacion y (b) este localizado en un sitio de atrapamiento predeterminado dentro del conducto;
    inmovilizar las partfculas magneticas en el sitio de atrapamiento aplicando un campo magnetico en el sitio de atrapamiento;
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    hacer circular el primer Ifquido de muestra en el conducto de manera que el primer Ifquido de muestra se haga circular lejos del sitio de atrapamiento mientras que las partfculas magneticas siguen inmovilizadas en el sitio de atrapamiento; y
    hacer circular el segundo lfquido de muestra en el conducto de manera que el segundo lfquido de muestra (a) este rodeado por el lfquido de encapsulacion y (b) rodee las partfculas magneticas inmovilizadas.
  6. 6. El metodo de la reivindicacion 5, en el que el segundo lfquido de muestra contiene biomoleculas diana que se unen a las partfculas magneticas cuando el segundo lfquido de muestra rodea las partfculas magneticas inmovilizadas.
  7. 7. El metodo de la reivindicacion 5 que comprende ademas, despues de hacer circular el segundo lfquido de muestra, hacer circular un lfquido de elucion en el conducto de manera que (a) el lfquido de elucion sea rodeado por el lfquido de encapsulacion, (b) el segundo lfquido de muestra se haga circular lejos del sitio de atrapamiento, y (c) el lfquido de elucion circule al sitio de atrapamiento y rodee las partfculas magneticas inmovilizadas.
  8. 8. El metodo de la reivindicacion 7, en el que hacer circular el lfquido de elucion comprende ademas liberar las biomoleculas diana de las partfculas magneticas rodeando las partfculas magneticas con el lfquido de elucion.
  9. 9. El metodo de la reivindicacion 7 que comprende ademas movilizar las partfculas magneticas en el lfquido de elucion eliminando el campo magnetico despues de hacer circular el lfquido de elucion.
  10. 10. El metodo de la reivindicacion 5 que comprende ademas:
    despues de hacer circular el segundo lfquido de muestra, hacer circular un primer lfquido de limpieza en el conducto de manera que (a) el primer lfquido de limpieza sea rodeado por el lfquido de encapsulacion, (b) el segundo lfquido de muestra se haga circular lejos del sitio de atrapamiento, y (c) el primer lfquido de limpieza circule al sitio de atrapamiento y rodee las partfculas magneticas inmovilizadas; y
    despues de hacer circular el primer lfquido de limpieza, hacer circular un lfquido de elucion en el conducto de manera que (a) el lfquido de elucion sea rodeado por el lfquido de encapsulacion, (b) el primer lfquido de limpieza se haga circular lejos del sitio de atrapamiento, y (c) el lfquido de elucion circule al sitio de atrapamiento y rodee las partfculas magneticas inmovilizadas.
  11. 11. El metodo de la reivindicacion 5, que comprende ademas movilizar las partfculas magneticas en el segundo lfquido de muestra eliminando el campo magnetico despues de hacer circular el segundo lfquido de muestra.
  12. 12. El metodo de la reivindicacion 5, en el que el segundo lfquido de muestra y el lfquido de encapsulacion constituyen una celda de lfquido compuesto.
  13. 13. El metodo de la reivindicacion 6 que comprende ademas detectar si un marcador esta presente por interrogatorio optico o fluorescente del sitio de atrapamiento.
  14. 14. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el conducto es un tubo capilar.
  15. 15. Un sistema de manipulacion de lfquidos que comprende un conducto que tiene un sitio de atrapamiento predeterminado, una bomba configurada para aplicar presion positiva, presion negativa, o ninguna presion externa a una localizacion en el conducto, una fuente de campo magnetico configurada para aplicar un campo magnetico en el sitio de atrapamiento cuando se active y sustancialmente ningun campo magnetico cuando no se active,
    un lfquido de encapsulacion,
    un lfquido de muestra,
    partfculas magneticas,
    un lfquido de elucion
    y un controlador operativamente unido a la bomba y la fuente de campo magnetico de manera que el controlador pueda activar la bomba y/o la fuente de campo magnetico, siendo el controlador programado para:
    activar la bomba de manera que un lfquido de encapsulacion se haga circular en el conducto;
    activar la bomba de manera que un lfquido de muestra se haga circular en el conducto de tal forma que el lfquido de muestra (a) sea rodeado por el lfquido de encapsulacion y (b) este localizado en el sitio de atrapamiento dentro del conducto, conteniendo el lfquido de muestra partfculas magneticas;
    activar la fuente de campo magnetico de manera que las partfculas magneticas se inmovilicen en el sitio de atrapamiento; y
    activar la bomba de manera que un Kquido de elucion se haga circular en el conducto de tal forma que (a) el lfquido de elucion sea rodeado por el lfquido de encapsulacion, (b) el lfquido de muestra se haga circular lejos del sitio de atrapamiento, y (c) el lfquido de elucion circule al sitio de atrapamiento y rodee las partfculas magneticas; opcionalmente en el que (a) el conducto es un tubo capilar; o (b) el lfquido de 5 encapsulacion, lfquido de muestra y lfquido de elucion se hacen circular por presion negativa aplicada por
    la bomba al conducto; o (c) el lfquido de encapsulacion, lfquido de muestra y lfquido de elucion se hacen circular por presion positiva aplicada por la bomba al conducto.
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