CN105624031A - 核酸扩增反应装置和核酸扩增方法 - Google Patents

核酸扩增反应装置和核酸扩增方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105624031A
CN105624031A CN201510795998.3A CN201510795998A CN105624031A CN 105624031 A CN105624031 A CN 105624031A CN 201510795998 A CN201510795998 A CN 201510795998A CN 105624031 A CN105624031 A CN 105624031A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
acid amplification
amplification reaction
stopper
region
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510795998.3A
Other languages
English (en)
Inventor
上原雅行
井手上公太郎
花村雅人
齐藤祐司
山口明美
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Seiko Epson Corp
Original Assignee
Seiko Epson Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Seiko Epson Corp filed Critical Seiko Epson Corp
Publication of CN105624031A publication Critical patent/CN105624031A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01LCHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01LCHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
    • B01L7/525Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples with physical movement of samples between temperature zones
    • B01L7/5255Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples with physical movement of samples between temperature zones by moving sample containers
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01LCHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/508Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above
    • B01L3/5082Test tubes per se
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01LCHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
    • B01L7/525Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples with physical movement of samples between temperature zones
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686Polymerase chain reaction [PCR]
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01LCHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06Fluid handling related problems
    • B01L2200/0621Control of the sequence of chambers filled or emptied
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01LCHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06Fluid handling related problems
    • B01L2200/0631Purification arrangements, e.g. solid phase extraction [SPE]
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01LCHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06Fluid handling related problems
    • B01L2200/0673Handling of plugs of fluid surrounded by immiscible fluid
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01LCHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/10Integrating sample preparation and analysis in single entity, e.g. lab-on-a-chip concept
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01LCHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00Additional constructional details
    • B01L2300/08Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0832Geometry, shape and general structure cylindrical, tube shaped
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01LCHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00Additional constructional details
    • B01L2300/08Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0832Geometry, shape and general structure cylindrical, tube shaped
    • B01L2300/0838Capillaries
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01LCHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00Additional constructional details
    • B01L2300/08Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/087Multiple sequential chambers
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01LCHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00Additional constructional details
    • B01L2300/18Means for temperature control
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01LCHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00Additional constructional details
    • B01L2300/18Means for temperature control
    • B01L2300/1805Conductive heating, heat from thermostatted solids is conducted to receptacles, e.g. heating plates, blocks
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01LCHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/043Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces magnetic forces
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01LCHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0457Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces passive flow or gravitation
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01LCHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0475Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure
    • B01L2400/0478Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure pistons

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种即使反应时间短也能够得到足够的核酸扩增反应产物的核酸扩增反应装置和核酸扩增方法。核酸扩增反应装置包含:安装部,可安装填充有核酸扩增反应液和比重小于核酸扩增反应液且不与核酸扩增反应液混合的液体的核酸扩增反应容器;第1加热部,将所述核酸扩增反应容器的第1区域加热到第1温度;第2加热部,将所述核酸扩增反应容器的第2区域加热到第2温度;和驱动机构,对第1配置和第2配置进行切换,上述第1配置为第1区域在重力作用的方向位于第2区域的下方,上述第2配置为第2区域在重力作用的方向位于上述第1区域的下方,核酸扩增反应液的镁离子浓度为1.8mM~9.0mM。

Description

核酸扩增反应装置和核酸扩增方法
技术领域
本发明涉及一种核酸扩增反应装置和核酸扩增方法。
背景技术
近年来,随着基因利用技术的发展,基因诊断、基因治疗等利用基因的医疗受到瞩目,除此之外,在农业、畜牧业领域也开发出多种将基因用于品种鉴别、品种改良的方法。作为用于利用基因的技术,PCR(聚合酶链式反应,PolymeraseChainReaction)法等核酸扩增技术正在广泛普及。近年来,开发了能够用更短的时间得到核酸扩增反应产物的PCR装置(例如,专利文献1)。核酸扩增反应用试剂的制备中,重要的是氯化镁浓度的设定,若低浓度则收量减少,若高浓度则阻碍核酸扩增反应或可能成为非特异性扩增的原因。在众多的已知种类的市售品中,进行核酸扩增的反应液中的氯化镁的推荐浓度为1.5mM(例如,参照非专利文献1、2)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2012-115208
非专利文献
非专利文献1:东洋纺株式会社Lifescience事业部,PCR相关故障分析的网页,http://www.toyobo.co.jp/seihin/xr/lifescience/products/product/jisshirei/archives/2008/04/post_21.html
非专利文献2:Lifetechnologies公司,TaqDNA聚合酶和PlatinumTaq抗体的说明书,6页,http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/productnotes/f_050711_taq-ts-tl-mkt-hl.pdf
发明内容
发明人在使用了上述的PCR装置的核酸扩增反应中,发现如果缩短反应时间,特别是缩短退火时间或退火和延伸时间,则与反应时间长的情况相比得不到足够量的核酸扩增反应产物。因此本发明的课题在于提供一种即使反应时间短也能够得到足够量的核酸扩增反应产物的核酸扩增反应装置和核酸扩增方法。
本发明是为了解决上述课题中的至少一部分而进行的,能够以以下方式实现。
本发明的一个实施方式是一种核酸扩增反应装置,包含:安装部,可安装填充有核酸扩增反应液和比重小于核酸扩增反应液且不与核酸扩增反应液混合的液体的核酸扩增反应容器;第1加热部,将核酸扩增反应容器的第1区域加热到第1温度;第2加热部,将核酸扩增反应容器的第2区域加热到第2温度;驱动机构,对第1配置和第2配置进行切换,其中,上述第1配置为第1区域在重力作用的方向位于第2区域的下方,上述第2配置为第2区域在重力作用的方向位于第1区域的下方;并且,核酸扩增反应液的镁离子浓度为1.8mM~9.0mM。核酸扩增反应液的镁离子浓度可以为2.0mM~7.5mM。核酸扩增反应装置进一步具有控制驱动机构的控制部,控制部保持上述第1配置的时间可以为4.5秒以下,保持上述第2配置的时间可以为18秒以下。控制部保持上述第1配置的时间可以为4秒以下。控制部保持上述第2配置的时间可以为6秒以下。
本发明的另一实施方式是一种核酸扩增反应用筒,上述核酸扩增反应用筒具备:管、核酸扩增反应用容器和柱塞,其中,上述管在其内部依次具备由第1油构成的第1塞子、由不与油混合的、对结合有核酸的核酸结合性固相载体进行清洗的清洗液构成的第2塞子、由第2油构成的第3塞子、由不与油混合的、从结合有核酸的核酸结合性固相载体溶出上述核酸的溶出液构成的第4塞子、由第3油构成的第5塞子、由不与油混合的、进行核酸扩增反应的核酸扩增反应液构成的第6塞子、由第4油构成的第7塞子,上述核酸扩增反应用容器与管的第7塞子侧连通,且包含油,上述柱塞安装于管的第1塞子侧的开口部,从管的第7塞子侧向核酸扩增反应用容器推出液体,并且,溶出液和核酸扩增反应液的混合液的镁离子浓度为1.8mM~9.0mM。
本发明的另一实施方式是一种核酸扩增反应用筒,上述核酸扩增反应用筒具备管、核酸扩增反应容器和柱塞,上述管在其内部依次具备由第1油构成的第1塞子;由不与油混合的、对结合有核酸的核酸结合性固相载体进行清洗的清洗液构成的第2塞子;由第2油构成的第3塞子、由不与油混合的、从结合有核酸的核酸结合性固相载体溶出上述核酸的溶出液构成的第4塞子;由第3油构成的第5塞子;上述核酸扩增反应用容器与管的第5塞子侧连通,且包含油,上述柱塞安装于管的第1塞子侧的开口部,从管的第5塞子侧向核酸扩增反应用容器推出液体,核酸扩增反应用容器包含由不与油混合的、进行核酸扩增反应的核酸扩增反应液形成的液滴,并且,溶出液和核酸扩增反应液的混合液的镁离子浓度为1.8mM~9.0mM。
本发明的另一实施方式是一种酸扩增反应用筒,上述酸扩增反应用筒具备:管、核酸扩增反应用容器和柱塞,上述管在其内部依次具备由第1油构成的第1塞子;由不与油混合的、对结合有核酸的核酸结合性固相载体进行清洗的清洗液构成的第2塞子;由第2油构成的第3塞子;由不与油混合的、从结合有核酸的核酸结合性固相载体溶出上述核酸的溶出液构成的第4塞子;由第3油构成的第5塞子;上述核酸扩增反应用容器与管的第5塞子侧连通,且包含油,上述柱塞安装于管的第1塞子侧的开口部,从管的第5塞子侧向上述核酸扩增反应用容器推出液体,并且,溶出液的镁离子浓度为1.8mM~9.0mM。
本发明的另一实施方式是一种核酸扩增方法,上述核酸扩增方法包含如下工序:将核酸扩增反应容器的第1区域加热到第1温度的工序,上述核酸扩增反应容器填充有核酸扩增反应液和比重小于核酸扩增反应液且不与核酸扩增反应液混合的液体;将核酸扩增反应容器的第2区域加热到比上述第1温度低的第2温度的工序;在第1配置保持第1时间,使核酸扩增反应液在第1区域移动的工序,上述第1配置为第1区域在重力作用的方向位于第2区域的下向;在第2配置保持第2时间,使核酸扩增反应液在第2区域移动的工序,第2区域在重力作用的方向位于第1区域的下方;并且,核酸扩增反应液的镁离子浓度为1.8mM~9.0mM。第1时间可以为4.5秒以下,第2时间可以为18秒以下。
本发明的又一实施方式是一种核酸扩增方法,该核酸扩增方法进行规定次数的循环,上述循环包括如下工序:将核酸扩增反应液在不与核酸扩增反应液混合的液体的第1温度的第1区域中保持4.5秒以下的时间的工序;在比第1温度低的第2温度的第2区域中使核酸扩增反应液移动的工序;将核酸扩增反应液在第2区域中保持18秒以下的时间的工序;并且,核酸扩增反应液的镁离子浓度为1.8mM~9.0mM。
根据本发明,能够提供一种新的核酸扩增反应装置和核酸扩增方法。
附图说明
图1是本发明的一个实施方式中的核酸扩增反应容器的截面图。g表示重力的方向。
图2是本发明的一个实施方式涉及的升降式PCR装置的立体图。(A)表示关闭盖的状态,(B)表示打开盖的状态。
图3是本发明的一个实施方式涉及的升降式PCR装置的主体的分解立体图。
图4是示意地表示本发明的一个实施方式涉及的升降式PCR装置的主体的沿图2(A)的A-A线的截面的截面图。(A)表示第1配置,(B)表示第2配置。
图5是本发明的一个实施方式涉及的筒的说明图。
图6是表示镁离子浓度与核酸扩增反应产物量的关系的图。
图7是表示镁离子浓度与核酸扩增反应产物量的关系的图。
图8是表示钾离子浓度与核酸扩增反应产物量的关系的图。
图9是表示钾离子浓度与核酸扩增反应产物量的关系的图。
图10是表示镁离子浓度与核酸扩增反应产物量的关系的图。
图11是表示镁离子浓度与核酸扩增反应产物量的关系的图。
图12是表示核酸扩增反应液中的镁离子浓度为5mM时的本发明的实施例和比较例中的有无特异性扩增产物和非特异性扩增产物的图。
图13是表示核酸扩增反应液中的镁离子浓度为5mM时的本发明的实施例和比较例中的有无特异性扩增产物和非特异性扩增产物的图。
具体实施方式
本发明的目的、特征、优点及其构思,通过本说明书的记载对本领域技术人员而言是明确的,根据本说明书的记载,只要是本领域技术人员,就能容易地再现本发明。以下记载的发明的实施方式和具体的实施例等表示本发明优选的实施方式,是用于例示或说明而示出的,本发明不限于这些。对本领域技术人员而言,可以确定在本说明书中公开的本发明的意图和范围内,基于本说明书的记载,可以进行各种改变和修饰。
(1)核酸扩增反应容器
本发明的方法中使用的核酸扩增反应容器包含反应液和与反应液比重不同而发生相分离的液体,且具有密闭了的容器,反应液为液滴状,液体包含油和添加剂。
图1是核酸扩增反应容器100的截面图。图1表示在核酸扩增反应容器装入了反应液的状态。
本发明中使用的核酸扩增反应容器100包括容器150和密封部120而构成。核酸扩增反应容器100的大小、形状没有特别限定,例如,可以考虑不与反应液140混合的液体130的量、导热系数、容器150和密封部120的形状或操作的容易度中的至少一个而进行设计。
核酸扩增反应容器100的容器150可以由透明的材质形成。因此,可以从核酸扩增反应容器100的外部对容器150内的反应液140的移动进行观察,或者可以用于实时荧光定量PCR等从容器150的外部进行测定等的用途。应予说明,本说明书中所说的“透明”的情况是指能够确保可从容器150的外部观察容器150内的反应液140的程度的可视性,只要满足该条件,可以不必使核酸扩增反应容器100的整体为透明。
核酸扩增反应容器100的用途没有特别限定,例如用于实时荧光定量PCR这样的伴有荧光测定的用途时,容器150优选由自发荧光小的材质形成。容器150优选为可耐受PCR中的加热的材质。而且,容器150的材质优选为对核酸、蛋白质的吸附少且不阻碍由聚合酶等引起的酶反应的材质。作为满足这些条件的材质,没有特别限定,例如,可以为聚丙烯、聚乙烯、环烯烃聚合物(例如,ZEONEX(注册商标)480R)、耐热玻璃(例如PYREX(注册商标)玻璃)等或它们的复合材料,优选聚丙烯。
在图1所示的核酸扩增反应容器100中,容器150形成为圆筒状,中心轴方向(图1中的上下方向)为长边方向。这里使用的容器150优选为管,也可以为小型离心用管、设计成PCR用的管,但通过具有长边方向,即为细长的形状,从而例如使用后述的升降型的热循环仪,以在容器150内的液体130中形成温度不同的区域的方式对核酸扩增反应容器100进行温度控制时,易于增加不同的区域之间的距离。由此,易于对应容器150内的每个区域,将液体130控制为不同的温度,因此,能够实现适于PCR的热循环。应予说明,升降型的热循环仪是通过在充满容器150的液体中形成至少2个温度区域,使与液体发生相分离的反应液140在这些温度区域间往返移动而实现热循环的装置。
容器150的形状只要具有长边方向,就没有特别限定,用于升降型PCR装置时,在大致圆筒形状中内径D与长边方向的长度L之比优选为1:5~1.5:20的范围。而且,内径D更优选为1.5~2mm,长度L更优选为10~20mm。
容器150具有开口部和密封开口部的密封部120,容器150中含有反应液140和与反应液140比重不同且发生相分离的液体130。通过密封部120密封开口部时,优选在容器150内不残留空气。这是因为如果在容器150内残留气泡,则妨碍反应液140的移动。密封部120可以由与容器150相同的材质形成。密封部120的结构只要是能够密闭容器150的结构即可,例如,可以为螺帽、栓、嵌入等结构。在图1中,密封部120为螺帽的结构。
核酸扩增反应液140可以含有核酸扩增反应用试剂和扩增对象的靶核酸。作为靶核酸,例如,可举出由血液、尿、唾液、骨髓液、组织等被检测物制备的DNA,或将由这些被检测物制备的RNA进行逆转录而成的cDNA等。核酸扩增反应用试剂可以含有用于扩增靶核酸的引物对、缓冲液、聚合酶、dNTP、MgCl2和用于对靶核酸的扩增产物进行检测的荧光标记等。DNA聚合酶没有特别限定,优选耐热性的酶、PCR用酶,例如,Taq聚合酶、Tfi聚合酶、Tth聚合酶或者它们的改良型等大量市售品,优选进行热启动的DNA聚合酶。只要dNTP的浓度为适合于所使用的酶的浓度即可,通常可以将dNTP设为10~1000μM,优选设为100~500μM。
反应液140中的镁离子(Mg2+)的浓度优选为1.8mM~9.0mM,更优选为2.0mM~7.5mM。Mg2+的来源没有特别限定,可以来自氯化镁,也可以来自硫酸镁,优选Mg2+来自氯化镁。
反应液140中的总离子浓度没有特别限定,可以是高于50mM的浓度,优选高于100mM高的浓度,更优选高于120mM的浓度,进一步优选高于150mM的浓度,更进一步优选高于200mM的浓度。上限优选500mM以下,更优选300mM以下,进一步优选200mM以下。引物用寡核苷酸分别使用0.1~10μM,优选使用0.1~1μM。
反应液140还可以含有表面活性剂。表面活性剂没有特别限定,可例示NP40、TritonX-100、Tween20等。表面活性剂的浓度没有特别限定,优选不阻碍核酸扩增反应的浓度,可以为0.001%~0.1%以下,优选为0.002%~0.02%,最优选为0.005%~0.01%。表面活性剂可以从上述的酶的储液带入,也可以与上述的酶的储液相独立地将表面活性剂溶液添加到反应液140。
通过作为液体130使用不与反应液140混合的物质,将反应液140加入容器150时,反应液140与液体130发生相分离,因此在液体130中可使反应液140形成为液滴状。这样,反应液140在液体130中能够以液滴状保持。
液体130优选比重小于反应液140的液体。此时,将反应液140加入液体130中时,由于反应液140的液滴的比重大于液体130,所以由于重力作用而向重力作用的方向移动。另外,液体130也可以为比重大于反应液140的液体。此时,反应液140的液滴比重小于液体130,因此由于重力作用而朝向与重力作用的方向相反的方向移动。
液体130优选含有油,例如,可使用硅油或矿物油。这里,有机硅表示具有硅氧键作为主骨架的低聚物或聚合物。本说明书中,将有机硅中的在热循环处理中使用的温度带中为液体状态的物质特别称为硅油。另外,在本说明书中,将由石油精制且在热循环处理中使用的温度带中为液体的物质称为矿物油。这些油对热的稳定性高,例如还易于得到粘度为5×103Nsm-2以下的制品,因此适用于升降型的PCR装置。
作为硅油,可例示ShinetsuSilicone公司制的KF-96L-0.65cs、KF-96L-1cs、KF-96L-2cs、KF-96L-5cs、DowCorningToray公司制的SH200CFLUID5CS、或者MomentivePerformanceMaterialsJapan合同会社制的TSF451-5A、TSF451-10等二甲基硅油。作为矿物油,可例示含有碳原子数14~20左右的烷烃作为主成分的矿物油。即,例示出正十四烷、正十五烷、正十六烷、正十七烷、正十八烷、正十九烷、正二十四烷。
油的粘性没有特别限定,优选为90cs以下,更优选为70cs以下,进一步优选为50cs以下,更进一步优选为30cs以下,这样,优选粘性小的油,由此,如后所述反应液沉降时,能够更顺畅地沉降。
液体130可以含有添加剂。作为添加剂,例如,可以使用X-22-160AS、X-22-3701E、KF-857、KF-859、KF-862、KF-867、KF-6017、KF-8005(以上,ShinetsuSilicone公司)等改性硅油,SR1000、SS4230、SS4267、YR3370(以上,Momentiv公司)等有机硅树脂,XS66-C1191(Momentive社)等氟改性有机硅树脂等,除此之外,TSF4703、TSF4708、XF42-C5196、XF42-C5197(以上,Momentive公司)等改性硅油。添加剂的浓度没有特别限定,可以考虑容器的结构、材质、形状等来决定。例如,优选为1%(v/v)~50%(v/v),更优选为2%(v/v)~20%(v/v),进一步优选为5%(v/v)。
(2)核酸扩增反应装置的装置构成
在本实施方式中,作为进行核酸扩增反应的核酸扩增反应容器,使用管型的核酸扩增反应用管100。以下,将PCR作为核酸扩增反应的一个例子,对适于核酸扩增反应用管100的升降式核酸扩增反应装置(以下,均称为升降式PCR装置)的一个例子进行详细说明。
图2表示升降式PCR装置1的一个例子。图2(A)为关闭升降式PCR装置1的盖50的状态,图2(B)为打开升降式PCR装置1的盖50的状态,表示在安装部11安装有核酸扩增反应用管100的状态。图3是实施方式涉及的升降式PCR装置1中的主体10的分解立体图。图4是示意地表示实施方式涉及的升降式PCR装置1中的主体10的沿图2(A)的A-A线的截面的截面图。
如图2(A)所示,该升降式PCR装置1包含主体10和驱动机构20。如图3所示,主体10包含安装部11、第1加热部12和第2加热部13。在第1加热部12与第2加热部13之间设有隔离件14。在本实施方式的主体10中,第1加热部12配置于底板17一侧,第2加热部13配置于盖50一侧。在本实施方式的主体10中,第1加热部12、第2加热部13和隔离件14被固定于凸缘16、底板17和固定板19。
安装部11是安装后述的核酸扩增反应用管100的结构。如图2(B)和图3所示,本实施方式的安装部11是以插入方式安装核酸扩增反应用管100的插槽结构,成为核酸扩增反应用管100插入贯通第1加热部12的第1加热块12b、隔离件14和第2加热部13的第2加热块13b的孔的结构。安装部11的数量可以为多个,在图2(B)的例子中,在主体10中设有20个安装部11。
该升降式PCR装置1包含将核酸扩增反应用管100相对于第1加热部12和第2加热部13保持在规定的位置的结构。更具体而言,如图4所示,可以将构成后述的核酸扩增反应用管100的流路110的第1区域111通过第1加热部12进行加热,可以将构成后述的核酸扩增反应用管100的流路110的第2区域112通过第2加热部13进行加热。本实施方式中,决定核酸扩增反应用管100的位置的结构为底板17,如图4(A)所示,通过将核酸扩增反应用管100插入直到与底板17接触的位置,能够相对于第1加热部12和第2加热部13将核酸扩增反应用管100保持在规定的位置。
第1加热部12在安装部11安装有核酸扩增反应用管100时,将后述的核酸扩增反应用管100的第1区域111的温度加热到第1温度。在图4(A)所示的例子中,第1加热部12在主体10中配置于对核酸扩增反应用管100的第1区域111进行加热的位置。
第1加热部12可以包括产生热的机构和将产生的热传递给核酸扩增反应用管100的部件。在图3所示的例子中,第1加热部12包括第1加热器12a和第1加热块12b。在本实施方式中,第1加热器12a为筒式加热器(Cartridgeheater),通过导线15与未图示的外部电源连接。第1加热器12a插入到第1加热块12b,第1加热器12a发热从而对第1加热块12b进行加热。第1加热块12b是将从第1加热器12a产生的热传递给核酸扩增反应用管100的部件。在本实施方式中为铝制的块。
在安装部11安装有核酸扩增反应用管100时,第2加热部13将核酸扩增反应用管100的第2区域112加热到与第1温度不同的第2温度。在图4(A)所示的例子中,第2加热部13在主体10中配置于对核酸扩增反应用管100的第2区域112进行加热的位置。如图3所示,第2加热部13包括第2加热器13a和第2加热块13b。第2加热部13加热的核酸扩增反应用管100的区域和加热的温度与第1加热部12不同,除此之外,与第1加热部12相同。
在本实施方式中,第1加热部12和第2加热部13的温度由未图示的温度传感器和后述的控制部控制。第1加热部12和第2加热部13的温度优选以使核酸扩增反应用管100被加热到所希望的温度进行设定。在本实施方式中,通过将第1加热部12控制为第1温度,将第2加热部13控制为第2温度,能够将核酸扩增反应用管100的第1区域111加热到第1温度,将核酸扩增反应用管100的第2区域112加热到第2温度。本实施方式中的温度传感器为热电偶。
驱动机构20是对安装部11、第1加热部12和第2加热部13进行控制的机构,由此控制第1区域和第2区域的配置。在本实施方式中,驱动机构20包含未图示的马达和驱动轴,驱动轴和主体10的凸缘16连接。本实施方式中的驱动轴相对于安装部11的长边方向垂直地设置,马达动作时,主体10以驱动轴为旋转的轴旋转。
本实施方式的升降式PCR装置1包含未图示的控制部。控制部对后述的第1温度、第2温度、第1时间、第2时间和热循环的循环数中的至少一项进行控制。在控制部控制第1时间或第2时间的情况下,通过控制部控制驱动机构20的动作,从而对将安装部11、第1加热部12和第2加热部13被保持为规定的配置的时间进行控制。本发明的实施方式中,控制部以如下方式控制驱动机构,即,将核酸扩增反应液140在第1温度的第1区域保持4.5秒以下的时间,优选保持4秒以下的时间(第1时间),在第2温度的第2区域使核酸扩增反应液140移动,接着在第2区域将核酸扩增反应液140保持18秒以下的时间,优选保持12秒以下的时间,进一步优选保持6秒以下的时间(第2时间)。这里,第2温度低于第1温度。即使对应控制的每个项目设置不同的机构,控制部也可以对全部项目一并进行控制,本实施方式的升降式PCR装置1中的控制部为电子控制,全面控制上述项目。本实施方式的控制部包含未图示的CPU等处理器和ROM(只读存储器,ReadOnlyMemory)、RAM(随机存储器,RandomAccessMemory)等存储装置。在存储装置中存储用于控制上述各项目的各种程序、数据等。另外,存储装置具有暂时存储各种处理的处理中数据、处理结果等的工作区域。
如图3和图4(A)的例子所示,本实施方式的主体10在第1加热部12和第2加热部13之间设有隔离件14。本实施方式的隔离件14是保持第1加热部12或第2加热部13的部件。在本实施方式中,隔离件14为隔热材料,在图4(A)的例子中,安装部11贯通隔离件14。
本实施方式的主体10包含固定板19。固定板19是保持安装部11、第1加热部12和第2加热部13的部件。在图2(B)和图3所示的例子中,2张固定板19嵌合于凸缘16,固定第1加热部12、第2加热部13和底板17。
本实施方式的升降式PCR装置1包含盖50。在图2(A)和图4(A)的例子中,安装部11被盖50覆盖。盖50可以通过固定部51固定于主体10。在本实施方式中,固定部51为磁铁。如图2(B)和图3的例子所示,在主体10与盖50接触的面设有磁铁。虽未在图2(B)和图3中示出,但在盖50接触主体10的磁铁的位置也设有磁铁,如果用盖50覆盖安装部11,则盖50通过磁力被固定于主体10。
应予说明,优选固定板19、底板17、盖50和凸缘16使用隔热材料而形成。
(3)使用升降式PCR装置的热循环处理
本发明的核酸扩增方法的特征在于,是进行规定次数的循环的核酸扩增方法,该循环包括如下工序:将核酸扩增反应液在不与该核酸扩增反应液混合的液体的第1温度的第1区域中保持4.5秒以下的时间,优选保持4秒以下的时间;在比第1温度低的第2温度的第2区域使核酸扩增反应液移动的工序;将核酸扩增反应液在第2区域中保持18秒以下的时间,优选保持12秒以下的时间,更优选保持6秒以下的时间;核酸扩增反应液中的镁离子浓度为1.8mM~9.0mM。以下,记载具体实现该方法的实施方式的例子。图4(A)和图4(B)是示意地表示升降式PCR装置1的沿图2(A)的A-A线的截面的截面图。图4(A)和图4(B)表示在升降式PCR装置1中安装有核酸扩增反应用管100的状态。图4(A)表示第1配置,图4(B)表示第2配置。以下,对使用核酸扩增反应用管100的情况下的、使用了实施方式涉及的升降式PCR装置1的热循环处理进行说明。
如图1的例子所示,实施方式涉及的核酸扩增反应用管100包括流路110和密封部120。在流路110中填充有反应液140和比重小于反应液140且不与反应液140混合的液体130,并被密封部120密封。
流路110以反应液140接近对置的内壁地移动的方式而形成。这里,流路110的“对置的内壁”表示流路110的壁面的位于彼此相对的位置的2个区域。“接近”表示反应液140与流路110的壁面的距离近,包含反应液140接触流路110的壁面的情况。因此,“反应液140接近对置的内壁地移动”表示“在相对于流路110的壁面的位于相对的位置的2个区域的两方距离近的状态下,反应液140移动”,即,反应液140沿对置的内壁移动。
在图1的例子中,核酸扩增反应用管100的外形为圆柱状,在中心轴方向(图1中的上下方向)形成有流路110。就流路110的形状而言,相对于流路110的长边方向垂直的方向的截面,即相对于流路110的某区域中的反应液140移动的方向垂直的截面(以此作为流路110的“截面”)为圆形的筒状。因此,在本实施方式的核酸扩增反应用管100中,流路110的对置的内壁是包含构成流路110的截面的直径的流路110的壁面上的2点的区域,反应液140沿对置的内壁在流路110的长边方向移动。
核酸扩增反应用管100的第1区域111是通过第1加热部12加热到第1温度的流路110的一部分区域。第2区域112是通过第2加热部13加热到第2温度的与第1区域111不同的流路110的一部分区域。在本实施方式的核酸扩增反应用管100中,第1区域111是包含流路110的长边方向的一方的端部的区域,第2区域112是包含流路110的长边方向的另一方的端部的区域。在图4(A)和图4(B)所示的例子中,流路110的包含密封部120侧的端部的、由虚线围起的区域为第2区域112,包含远离密封部120的一侧的端部的、由虚线围起的区域为第1区域111。
如图1所示,流路110包含液体130和反应液的液滴140。液体130和反应液140根据(1)核酸扩增反应容器的记载而准备。
以下,参照图4(A)和图4(B)对使用实施方式涉及的升降式PCR装置1的热循环处理进行说明。在图4(A)和图4(B)中,箭头g的方向(图中的下方向)为重力作用的方向。本实施方式中,对作为热循环处理的例子进行往返PCR(ShuttlePCR:2阶段温度PCR)的情况进行说明。应予说明,以下说明的各工序表示热循环处理的一个例子。可以根据需要更换工序的顺序、连续或并行地进行2个以上的工序、或追加工序。
往返PCR是反复高温和低温这2个阶段的温度处理对反应液实施从而扩增反应液中的核酸的方法。在高温处理中发生双链DNA的解离,在低温处理中发生退火(引物与单链DNA结合的反应)和延伸反应(以引物为起点合成DNA的互补链的反应)。
通常,往返PCR中的高温为80℃~100℃之间的温度,低温为50℃~70℃之间的温度。一般,各温度下的处理进行规定时间,保持在高温的时间比保持在低温的时间短。高温和低温的时间没有特别限定,可以根据扩增对象的核酸、引物的种类等而任意设定。例如,可以设为高温为1秒~10秒左右,低温为4秒~60秒左右,也可以根据反应条件设为比上述时间更长的时间。为了缩短整个核酸扩增反应所需的时间,优选高温为4.5秒以下,低温为18秒以下,或者,优选高温为4秒以下,低温为6秒以下。
应予说明,由于根据使用的试剂的种类、量,适当的时间、温度和循环数(反复高温和低温的次数)不同,所以优选在考虑试剂的种类、反应液140的量决定适当的方案的基础上进行反应。
首先,将核酸扩增反应用管100安装于安装部11。在本实施方式中,向填充有液体130的流路110导入反应液140后,将被密封部120密封的核酸扩增反应用管100安装于安装部11。反应液140的导入可以使用微量移液器、喷墨方式的分注装置等进行。在将核酸扩增反应用管100安装于安装部11的状态下,第1加热部12在包含第1区域111的位置与核酸扩增反应用管100接触,第2加热部13在包含第2区域112的位置与核酸扩增反应用管100接触。
在此,安装部11、第1加热部12和第2加热部13的配置为第1配置。如图4(A)所示,第1配置使核酸扩增反应用管100的第1区域111位于重力作用的方向的流路110的最下部。在第1配置中,因为第1区域111位于重力作用的方向的流路110的最下部,所以比重大于液体130的反应液140位于第1区域111。在本实施方式中,如果将核酸扩增反应用管100安装于安装部111,则通过盖50覆盖安装部11,使升降式PCR装置1开始工作。
接下来,通过第1加热部12和第2加热部13对核酸扩增反应用管100进行加热。第1加热部12和第2加热部13将核酸扩增反应用管100的不同区域加热到不同温度。即,第1加热部12将第1区域111加热到第1温度,第2加热部13将第2区域112加热到第2温度。由此,在流路110的第1区域111与第2区域112之间形成温度在第1温度与第2温度之间逐渐变化的温度梯度。这里,从第1区域111向第2区域112形成温度变低的温度梯度。因为本实施方式的热循环处理为往返PCR,所以第1温度设为适于双链DNA解离的温度,第2温度设为适于退火和延伸反应的温度。
因为安装部11、第1加热部12和第2加热部13的配置为第1配置,所以对核酸扩增反应用管100进行加热时,核酸扩增反应液140被加热至第1温度。经过第1时间时,通过驱动机构20来驱动主体10,将安装部11、第1加热部12和第2加热部13的配置从第1配置切换到第2配置。第2配置是使第2区域112在重力作用的方向位于流路110的最下部的配置。换言之,在安装部11、第1加热部12和第2加热部13处于与第1配置不同的规定的配置时,第2区域112是位于重力作用的方向的流路110的最下部的区域。本实施方式的升降型PCR装置1中,驱动机构20通过控制部对驱动主体10进行旋转控制。若将驱动轴作为旋转轴,利用马达对凸缘16进行驱动旋转,则固定于凸缘16的安装部11、第1加热部12和第2加热部13旋转。因为驱动轴是相对于安装部11的长边方向垂直的方向的轴,所以通过马达的动作使驱动轴旋转时,安装部11、第1加热部12和第2加热部13旋转。在图4(A)和图4(B)所示的例子中,使主体10旋转180°。由此,能够将安装部11、第1加热部12和第2加热部13的配置从第1配置向第2配置切换。
在此,因为第1区域111和第2区域112的重力作用的方向的位置关系与第1配置相反,所以反应液140因重力作用而从第1区域111向第2区域112移动。在安装部11、第1加热部12和第2加热部13的配置到达第2配置时,若驱动机构20的动作停止,则安装部11、第1加热部12和第2加热部13的配置被保持在第2配置。在第2配置中,经过第2时间时,再次旋转,直到到达规定的次数为止,通过这样边更换第1位置和第2位置边进行旋转,进行核酸扩增反应。将对第1位置和第2位置进行一次更换作为1个循环。
核酸扩增反应液140从第1区域移动到第2区域的时间可以任意设定,但优选更短。例如,该时间可以为5秒以内,更优选为2秒以内,最优选为1秒以内。
另外,在本实施方式中,使用往返PCR作为PCR法,也可以使用在热变性、退火和延伸反应中改变温度的PCR法(3阶段温度PCR)。此时,除退火温度以外设定延伸反应温度,使核酸扩增反应液维持在退火温度,之后以规定时间维持在延伸反应温度即可。
(4)筒
本发明涉及的核酸扩增反应容器可以与图5例示的筒201连通。图5所示的筒与日本特开2014-176304中记载的构成相同。在此,对该筒的构成和使用方法进行概述。
筒201由罐203和筒主体209构成,该筒主体209包括柱塞210、管220和核酸扩增反应容器230。构成筒201的试剂盒中,与罐203和筒主体209一起预先准备有适配体205。可以通过介由适配体205连接罐203和筒主体209来组装筒201。但是,也可以是将罐203直接安装于筒主体209的构成。
在罐203中,进行核酸提取处理,核酸与磁珠(未图示)结合。如图5A所示,管220在其内部从上游侧依次具备第1油塞子244、清洗液塞子245、第2油塞子246、溶出液塞子247、第3油塞子248。换句话说,在水溶性的塞子(清洗液塞子245或溶出液塞子247)的两侧配置有油塞子。这里,“塞子”表示在管内特定的液体占有一部分区域时的液体。油与其它溶液发生相分离(不与其它溶液混合),因此,由油构成的塞子具有防止其两侧的水溶性的塞子相互混合的功能。油的种类没有特别限定,优选为与上述液体130中使用的油相同的油。优选在塞子之中、塞子之间没有气泡和其它液体,只要磁珠能够通过塞子,也可以存在气泡、其它的液体。
通过使磁铁沿管220在外部移动,从而从罐203进入管220的磁珠在管220内移动,通过清洗液塞子245,到达溶出液塞子247。结合于磁珠的核酸在清洗液塞子245内被清洗液清洗,在溶出液塞子247中溶出。
清洗液塞子245可以由被油的塞子分隔开的多个塞子构成。清洗液塞子245由多个塞子构成时,各塞子的液体可以相同,也可以不同。其中,只要有至少1个清洗液的塞子,其它塞子的液体就没有特别限定,优选全部的塞子为清洗液。清洗液塞子245被分割的数量例如可以考虑管220的长度、清洗的对象等而适当设定。此时,溶出液侧的清洗液最优选为酸性溶液,其它清洗液优选含有醇。
溶出液塞子247的溶出液是指使吸附于核酸结合性固相载体的核酸从载体溶出到液体中,其后进行逆转录反应和聚合酶反应的液体。因此,溶出液可以是水、缓冲液,也可以以成为核酸溶出后的溶出液直接用于逆转录反应和聚合酶反应的缓冲液溶液的方式预先进行制备。用于制成缓冲液的盐只要不阻碍酶反应,就没有特别限定,优选使用Tris、HEPES、PIPES、磷酸等的盐。另外,为了逆转录反应,也可以含有逆转录酶、dNTP和逆转录酶用引物(寡核苷酸)。而且,作为反应阻碍抑制剂,优选含有BSA(牛血清白蛋白)或明胶。溶剂优选为水,更优选实质上不含有醇、异丙醇等有机溶剂和离液物质。
溶出液中含有的dNTP、盐的浓度是考虑经冷冻干燥的核酸扩增反应试剂中的dNTP、盐的浓度而最终适于使用的酶的浓度即可,通常,dNTP可以为10~1000μM,优选为100~500μM,Cl-可以为1~2000mM,优选为200~700mM,总离子浓度没有特别限定,可以是高于50mM高的浓度,优选高于100mM的浓度,更优选高于120mM的浓度,进一步优选高于150mM的浓度,更进一步优选高于200mM的浓度。上限优选500mM以下,更优选300mM以下,进一步优选200mM以下。引物用寡核苷酸使用0.1~10μM,优选使用0.1~1μM。若BSA或明胶的浓度为1mg/mL以下,则反应阻碍抑制效果小,若为10mg/mL以上,则存在阻碍逆转录反应或其后的酶反应的可能性,因此优选1~10mg/mL。使用明胶时,其来源可例示牛皮、猪皮、牛骨,没有特别限定。明胶难以溶解时,可以加热使其溶解。
在与管220连通的核酸扩增反应容器230中进行上述的热循环处理。核酸扩增反应容器230用与上述的液体130相同的不与核酸扩增反应液混合的液体充满。溶出液塞子247从管220被推到核酸扩增反应容器230中时,成为液滴状,成为液滴状的溶出液247沉降。在核酸扩增反应容器230内沉降的溶出液247与核酸扩增反应容器230中的包含核酸扩增反应试剂的核酸扩增反应液混合。核酸扩增反应容器230中,可以含有经冷冻干燥的核酸扩增反应试剂,被溶出液247溶解而成为核酸扩增反应液。
作为另一实施方式,管220不仅包含第1油塞子244、清洗液塞子245、第2油塞子246、溶出液塞子247、第3油塞子248,还可以在它们的下游包含核酸扩增反应液塞子和第4油塞子。此时,溶出液和核酸扩增反应液混合的混合液被推到核酸扩增反应容器内。
通过在核酸扩增反应容器230中形成有上述的加热部加热到第1温度的第1区域和加热到比第1温度低的第2温度的第2区域,反复使筒101整体与其加热部一起上下翻转,从而使液滴状的核酸扩增反应液在第1与第2区域之间移动,实施热循环处理,核酸扩增。
用于使与筒连通的核酸扩增反应容器如上所述地旋转而进行核酸扩增反应的装置结构,没有特别限定。例如,可以利用上述的日本特开2014-176304中记载的装置构成来旋转核酸扩增反应容器进行本发明的热循环处理。
使用上述例示的筒时,可以使溶出液和核酸扩增反应液的混合液的镁离子浓度为1.8mM~9.0mM,优选为2.0mM~7.5mM。
作为又一实施方式,溶出液塞子247还包含上述的核酸扩增反应试剂,在被推到核酸扩增反应容器230中而成为液滴状的溶出液247中可以进行上述的热循环处理。换句话说,本方式中,核酸扩增反应容器中可以不包含核酸扩增反应试剂,溶出液的镁离子浓度可以为1.8mM~9.0mM,优选为2.0mM~7.5mM。
实施例
以下,根据实施例进一步详细说明本发明,本发明不限定于实施例。
<实施例1>以往的PCR装置和本发明涉及的PCR装置中的镁离子浓度与核酸扩增反应效率的关系
(1)使用以往的PCR装置的情况(比较例)
作为比较例,使用LifeTechnologies公司的StepOnePlus作为PCR装置,模板使用A型流感病毒(以下,均记为InfA)的质粒DNA进行核酸扩增反应(PCR)。这里,使用退火温度与延伸反应温度相同的往返PCR法。
制备核酸扩增反应液内的镁离子浓度为1.5mM的反应液,作为反应液1,制备核酸扩增反应液内的镁离子浓度为5.0mM的反应液,作为反应液2。
反应液1和2的组成如下。核酸扩增反应使用10μL的核酸扩增反应液,下述的各成分的液量表示每10μL反应液的液量。
(反应液1)
※5×缓冲液的组成:MgCl2:7.5mM、KCl:125mM、Tris-HCl(PH9.0):250mM
※反应液中的终浓度:MgCl2:1.5mM,KCl:25mM,Tris-HCl(PH9.0):50mM
(反应液2)
※5×缓冲液的组成:MgCl2:25mM,KCl:125mM,Tris-HCl(PH9.0):250mM
终浓度:MgCl2:5mM,KCl:25mM,Tris-HCl(PH9.0):50mM
另外,引物和探针的序列如下。
(引物序列)
InfA正向引物:5'-GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3'(序列号1)
InfA反向引物:5'-AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA-3'(序列号2)
(探针序列)
InfATaqMan-探针:
5'FAM-CACAAATCCTAAAATTCCCT-BHQ1-3'(序列号3)
PCR条件如下。
热启动条件:98℃2分钟
热循环条件:热变性98℃15秒
退火和延伸55℃30秒
50循环
对各反应液各进行2次PCR。将结果示于图6。纵轴的荧光亮度越高,表示得到更多的核酸扩增反应产物。
由图6可知,比较例的PCR装置中,反应液中的镁离子浓度为1.5mM的情况和5.0mM的情况下,核酸扩增反应效率是同等的。这里,就反应效率的高低而言,相对于循环数的荧光亮度越高,反应效率越高,相对于循环数的荧光亮度越低,反应效率越低。
(2)使用本发明涉及的升降式PCR装置的情况(实施例)
使用上述的升降式PCR装置代替上述比较例中使用的PCR装置,准备核酸扩增反应液中的镁离子浓度为1.0mM、1.5mM、2.0mM、5.0mM、7.5mM、或10.0mM的6种反应液,以上述的InfA的质粒为模板,使用上述的引物和探针进行PCR。
反应液的组成如下。
※5×缓冲液的组成:MgCl2:5.0mM、7.5mM、10mM、25mM、37.5mM或50.0mM,KCl:125mM,Tris-HCl(PH9.0):250mM
※终浓度:MgCl2:1.0mM、1.5mM、2.0mM、5.0mM、7.5mM或 10.0mM,KCl:25mM,Tris-HCl(PH9.0):50mM
PCR条件如下。
热启动条件:98℃10秒
热循环条件:98℃3秒-60℃6秒
50循环
将结果示于图7。镁离子浓度为2.0mM、5.0mM和7.5mM时,反应效率特别高。另一方面,1.0mM和10.0mM时几乎看不到扩增。
换句话说,PCR反应时间短时,在镁离子浓度高于作为推荐浓度的1.5mM的浓度下,与1.5mM的情况相比存在反应效率提高的浓度范围。
<实施例2>本发明涉及的PCR装置中的镁离子浓度和钾离子浓度与核酸扩增反应效率的关系
(1)镁离子浓度为1.5mM时的钾离子浓度的影响
实施例1中,使核酸扩增反应液中的镁离子浓度为1.5mM,使核酸扩增反应液中的KCl浓度为0mM、25mM或65mM,核酸扩增反应使用1.6μL的反应液,除此之外,与实施例1同样地进行核酸扩增反应。
各核酸扩增反应液的组成如下。
※5×缓冲液的组成:KCl:0mM、125mM或325mM,MgCl2:25mM,Tris-HCl(PH9.0):250mM
终浓度:KCl:0mM、25mM或65mM,MgCl2:5.0mM,Tris-HCl(PH9.0):50mM
将结果示于图8。KCl的浓度不影响反应效率。
(2)镁离子浓度为5.0mM时的钾离子浓度的影响
实施例1中,使核酸扩增反应液中的镁离子浓度为5.0mM,使核酸扩增反应液中的KCl浓度为0mM、10mM、25mM、50mM或65mM,除此之外,与实施例1同样地进行核酸扩增反应。
各核酸扩增反应液的组成如下。
※5×缓冲液的组成:KCl:0mM、50mM、125mM、250mM或325mM,MgCl2:7.5mM,Tris-HCl(PH9.0):250mM
终浓度:KCl:0mM、10mM、25mM、50mM或65mM,MgCl2:1.5mM,Tris-HCl(PH9.0):50mM
将结果示于图9。KCl的浓度即使在镁离子浓度为5.0mM的情况下,也不对反应效率造成影响。另外,无论KCl的浓度如何,镁离子浓度为5.0mM的情况与1.5mM的情况相比反应效率高。
<实施例3>本发明涉及的PCR装置中的镁离子浓度与核酸扩增反应效率的关系
实施例1(2)中,将模板变为InfB(B型流感病毒)的质粒,使镁离子浓度为1.5mM或5.0mM,除此之外,与实施例1同样地进行PCR。将结果示于图10。
由图10可知,以InfB的质粒为模板的情况下,也得到了与以InfA的质粒为模板的情况相同的结果,换句话说,得到镁离子浓度为5.0mM的情况与1.5mM的情况相比反应效率更好的结果。也就是说,本发明无论核酸扩增反应的模板的种类如何,都能够提高反应效率。
<实施例4>改变聚合酶的情况
实施例1中,将聚合酶改为GeneTaqNT,使核酸扩增反应液中的镁离子浓度为1.5mM或5.0mM,除此之外,与实施例1同样地进行RT-PCR。将结果示于图11。
由图11可知,使DNA聚合酶为GeneTaqNT(株式会社NipponGene)的情况下,得到了与使用PlatinumTaq的情况相同的结果,换句话说,得到镁离子浓度为5.0mM的情况与1.5mM的情况相比反应效率较好这样的结果。也就是说,本发明无论DNA聚合酶的种类如何都能够提高反应效率。
<实施例5>单一PCR中的非特异性扩增反应的有无
将具有以下组成的反应液在上述的比较例的PCR装置中各使用10μL,在实施例的升降式PCR装置中各使用1.6μL,进行RT-PCR反应。
※5×缓冲液的组成:MgCl2:25mM,Tris-HCl(PH9.0):250mM,KCl:125mM
终浓度:MgCl2:5mM,Tris-HCl(PH9.0):50mM,KCl:25mM
(反应液2)
※5×缓冲液的组成:MgCl2:25mM,Tris-HCl(PH9.0):250mM,KCl:125mM
终浓度:MgCl2:5mM,Tris-HCl(PH9.0):50mM,KCl:25mM
反应液1与反应液2的区别仅为是否包含人总RNA。人总RNA的量如图12中记载的泳道(2)、(3)、(4)的说明所记载。应予说明,引物和探针的序列使用与实施例1相同的序列。
RT-PCR反应条件如下。
(比较例的PCR装置)
逆转录(RT)反应:50℃30分钟
逆转录酶失活反应:98℃2分钟
热循环:按以下的条件进行50次。
98℃15秒-55℃30秒
(实施例的升降式PCR装置)
逆转录(RT)反应:50℃60秒
逆转录酶失活反应:98℃10秒
热循环:按以下的条件进行50次。
98℃4秒-60℃6秒
换句话说,该试验中,因为扩增对象的核酸为InfA的RNA,反应液2包含人总RNA,所以对在容易引起非特异性扩增的条件下进行的扩增产物进行电泳,将结果示于图12。
图12中,比较例和实施例的泳道(1)为反应液1,换句话说,是不包含人总RNA的反应液的扩增产物的泳道,泳道(2)、(3)、(4)为反应液2,换句话说是包含人总RNA的反应液。
首先,如果对实施例和比较例的泳道(1)进行比较,则比较例中产生相当多的非特异性扩增产物,相对于此,实施例中,主要发生目标DNA的扩增,几乎不产生非特异性扩增产物。
另外,比较例泳道(2)中,发生了不能检测到目标DNA的扩增的程度的非特异性扩增。另一方面,实施例泳道(2)~(4)均得到与不包含人总RNA的反应液1的情况相同的结果,甚至在与比较例相比包含更多的人总RNA的反应液2中进行PCR的泳道(4)中,也几乎确认不到非特异性扩增。
<实施例6>多重PCR中的非特异性扩增的有无
从具有以下组成的反应液1和2取出1.6μL,在升降式PCR装置中进行PCR反应。
(反应液1)
※5×缓冲液的组成:MgCl2:25mM,Tris-HCl(PH9.0):250mM,KCl:125mM
终浓度:MgCl2:5mM,Tris-HCl(PH9.0):50mM,KCl:25mM
(反应液2)
※5×缓冲液的组成:MgCl2:25mM,Tris-HCl(PH9.0):250mM,KCl:125mM
终浓度:MgCl2:5mM,Tris-HCl(PH9.0):50mM,KCl:25mM
反应液1中,模板为InfA的质粒DNA,包含InfA扩增用引物对,而且包含与InfB的质粒DNA结合的引物对。与此相对,反应液2不包含InfB用的引物对,除此以外,是与反应液1相同的组成。
对于引物和探针的序列,InfA使用与实施例1相同的序列,InfB使用以下序列。
(InfB引物对)
InfB正向引物:5'-TCCTCAACTCACTCTTCGAGCG-3'(序列号4)
InfB反向引物:5'-CGGTGCTCTTGACCAAATTGG-3'(序列号5)
反应条件如下。
热启动反应:98℃10秒
热循环:按以下的条件进行50次。
高速条件(实施例):98℃4秒-60℃6秒
标准条件(比较例):98℃5秒-60℃20秒
对含有扩增产物的液体进行电泳,将结果示于图13。
图13中,比较例和实施例的泳道(1)是流过包含InfB用引物对的反应液1的泳道,泳道(2)是流过不包含InfB用引物对的反应液2的泳道。
由图13可知,比较例中,泳道(1)可看到非特异性扩增产物,另一方面,实施例1的泳道(1)中主要可确认特异性扩增产物。这样,PCR反应时间短的一方不易发生非特异性扩增。
符号说明
1…升降式PCR装置,10…主体,11…安装部,12…第1加热部,12a…第1加热器,12b…第1加热块,13…第2加热部,13a…第2加热器,13b…第2加热块,14…隔离件,15…导线,16…凸缘,17…底板,19…固定板,20…驱动机构,50…盖,51…固定部,100…核酸扩增反应容器或核酸扩增反应用管,110…流路,111…第1区域,112…第2区域,120…密封部,130…液体,140…核酸扩增反应液,150…容器,201…筒,203…罐,203B…变形部,205…适配体,209…筒主体,210…柱塞,211…筒状部,211A…安装台,212…棒状部,212A…密封,213…肋,220…管,221…上注射筒,222…下注射筒,223…毛细管,225…固定爪,226…导板,230…核酸扩增反应容器,231…密封形成部,232…油接受部,233…阶梯部,235…流路形成部,235A…底,244…第1油塞子,245…清洗液塞子,246…第2油塞子,247…溶出液塞子,248…第3油塞子,249…核酸扩增反应液塞子,250…第4油塞子。

Claims (11)

1.一种核酸扩增反应装置,包含:
安装部,能够安装填充有核酸扩增反应液和比重小于所述核酸扩增反应液且不与所述核酸扩增反应液混合的液体的核酸扩增反应容器;
第1加热部,将所述核酸扩增反应容器的第1区域加热到第1温度;
第2加热部,将所述核酸扩增反应容器的第2区域加热到第2温度;和,
驱动机构,对第1配置和第2配置进行切换,其中,所述第1配置为所述第1区域在重力作用的方向位于所述第2区域的下方,所述第2配置为所述第2区域在重力作用的方向位于所述第1区域的下方;
并且,所述核酸扩增反应液的镁离子浓度为1.8mM~9.0mM。
2.根据权利要求1所述的核酸扩增反应装置,其中,所述核酸扩增反应液的镁离子浓度为2.0mM~7.5mM。
3.根据权利要求1或2所述的核酸扩增反应装置,其中,进一步具有控制所述驱动机构的控制部,
所述控制部的保持所述第1配置的时间为4.5秒以下,保持所述第2配置的时间为18秒以下。
4.根据权利要求3所述的核酸扩增反应装置,其中,所述控制部的保持所述第1配置的时间为4秒以下。
5.根据权利要求3或4所述的核酸扩增反应装置,其中,所述控制部的保持所述第2配置的时间为6秒以下。
6.一种核酸扩增反应用筒,具备:管、核酸扩增反应用容器和柱塞,其中,
所述管在其内部依次具备:
由第1油构成的第1塞子;
由不与油混合的、对结合了核酸的核酸结合性固相载体进行清洗的清洗液构成的第2塞子;
由第2油构成的第3塞子;
由不与油混合的、从结合了核酸的核酸结合性固相载体溶出所述核酸的溶出液构成的第4塞子;
由第3油构成的第5塞子;
由不与油混合的、进行核酸扩增反应的核酸扩增反应液构成的第6塞子;
由第4油构成的第7塞子;
所述酸扩增反应用容器与所述管的第7塞子侧连通,且包含油,
所述柱塞安装于所述管的第1塞子侧的开口部,从管的第7塞子侧向所述核酸扩增反应用容器推出液体,
并且,所述溶出液和所述核酸扩增反应液的混合液的镁离子浓度为1.8mM~9.0mM。
7.一种核酸扩增反应用筒,具备:管、核酸扩增反应用容器和柱塞,其中,
所述管在其内部依次具备:
由第1油构成的第1塞子,
由不与油混合的、对结合了核酸的核酸结合性固相载体进行清洗的清洗液构成的第2塞子,
由第2油构成的第3塞子,
由不与油混合的、从结合了核酸的核酸结合性固相载体溶出所述核酸的溶出液构成的第4塞子,
由第3油构成的第5塞子,
所述核酸扩增反应用容器与所述管的第5塞子侧连通,且包含油,
所述柱塞安装于所述管的第1塞子侧的开口部,从管的第5塞子侧向所述核酸扩增反应用容器推出液体,
所述核酸扩增反应用容器包含由不与油混合的、进行核酸扩增反应的核酸扩增反应液形成的液滴,
并且,所述溶出液和所述核酸扩增反应液的混合液的镁离子浓度为1.8mM~9.0mM。
8.一种核酸扩增反应用筒,具备:管、核酸扩增反应用容器和柱塞,所述管在其内部依次具备:
由第1油构成的第1塞子,
由不与油混合的、对结合了核酸的核酸结合性固相载体进行清洗的清洗液构成的第2塞子,
由第2油构成的第3塞子,
由不与油混合的、从结合了核酸的核酸结合性固相载体溶出所述核酸的溶出液构成的第4塞子,
由第3油构成的第5塞子,
所述核酸扩增反应用容器与所述管的第5塞子侧连通,且包含油,
所述柱塞安装于所述管的第1塞子侧的开口部,从管的第5塞子侧向所述核酸扩增反应用容器推出液体,
并且,所述溶出液的镁离子浓度为1.8mM~9.0mM。
9.一种核酸扩增方法,包括如下工序:
将核酸扩增反应容器的第1区域加热到第1温度的工序,其中,所述核酸扩增反应容器填充有核酸扩增反应液和比重小于所述核酸扩增反应液且不与所述核酸扩增反应液混合的液体;
将所述核酸扩增反应容器的第2区域加热到比所述第1温度低的第2温度的工序;
在所述第1区域在重力作用的方向位于所述第2区域的下方的第1配置保持第1时间,使所述核酸扩增反应液移动到所述第1区域的工序;
在所述第2区域在重力作用的方向位于所述第1区域的下方的第2配置保持第2时间,使所述核酸扩增反应液移动到所述第2区域的工序;
其中,所述核酸扩增反应液的镁离子浓度为1.8mM~9.0mM。
10.根据权利要求9所述的核酸扩增方法,所述第1时间为4.5秒以下,所述第2时间为18秒以下。
11.一种核酸扩增方法,进行规定次数的循环,所述循环包括:
将核酸扩增反应液在不与所述核酸扩增反应液混合的液体的第1温度的第1区域中保持4.5秒以下的时间的工序,
在比第1温度低的第2温度的第2区域中使所述核酸扩增反应液移动的工序,
将所述核酸扩增反应液在所述第2区域中保持18秒以下的时间的工序,
并且,所述核酸扩增反应液的镁离子浓度为1.8mM~9.0mM。
CN201510795998.3A 2014-11-20 2015-11-18 核酸扩增反应装置和核酸扩增方法 Pending CN105624031A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014-235322 2014-11-20
JP2014235322A JP2016096762A (ja) 2014-11-20 2014-11-20 核酸増幅反応装置及び核酸増幅方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105624031A true CN105624031A (zh) 2016-06-01

Family

ID=54770792

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510795998.3A Pending CN105624031A (zh) 2014-11-20 2015-11-18 核酸扩增反应装置和核酸扩增方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20160145675A1 (zh)
EP (1) EP3023153A3 (zh)
JP (1) JP2016096762A (zh)
CN (1) CN105624031A (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1681940A (zh) * 2002-08-22 2005-10-12 基因类型股份有限公司 对小球隐孢子虫体内遗传变异进行的高分辨率分析
CN102146373A (zh) * 2010-01-25 2011-08-10 精工爱普生株式会社 核酸扩增方法、核酸扩增装置、以及核酸扩增用芯片
CN102533524A (zh) * 2010-12-14 2012-07-04 精工爱普生株式会社 生物芯片
CN103228360A (zh) * 2010-12-01 2013-07-31 精工爱普生株式会社 热循环装置和热循环方法
CN104046558A (zh) * 2013-03-13 2014-09-17 精工爱普生株式会社 核酸扩增反应用筒

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0910291D0 (en) * 2009-06-16 2009-07-29 Biochip Devises Pte Ltd Method for conducting multiple reactions in a single reaction tube
JP2014135942A (ja) * 2013-01-18 2014-07-28 Seiko Epson Corp 熱サイクル装置及び熱サイクル方法
JP2014176304A (ja) 2013-03-13 2014-09-25 Seiko Epson Corp 核酸増幅反応用カートリッジ
JP2014176305A (ja) * 2013-03-13 2014-09-25 Seiko Epson Corp 核酸増幅反応用カートリッジ

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1681940A (zh) * 2002-08-22 2005-10-12 基因类型股份有限公司 对小球隐孢子虫体内遗传变异进行的高分辨率分析
CN102146373A (zh) * 2010-01-25 2011-08-10 精工爱普生株式会社 核酸扩增方法、核酸扩增装置、以及核酸扩增用芯片
CN103228360A (zh) * 2010-12-01 2013-07-31 精工爱普生株式会社 热循环装置和热循环方法
CN102533524A (zh) * 2010-12-14 2012-07-04 精工爱普生株式会社 生物芯片
CN104046558A (zh) * 2013-03-13 2014-09-17 精工爱普生株式会社 核酸扩增反应用筒

Also Published As

Publication number Publication date
EP3023153A2 (en) 2016-05-25
JP2016096762A (ja) 2016-05-30
US20160145675A1 (en) 2016-05-26
EP3023153A3 (en) 2016-06-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2621390T5 (es) Reacción de amplificación oscilante para ácidos nucleicos
JP5764870B2 (ja) バイオチップ、反応装置及び反応方法
CN102533524B (zh) 生物芯片
EP2828409B1 (en) Single nucleotide detection method
JP6718956B2 (ja) 液体循環路を制御することができる核酸増幅用の反応チューブ
CN102533542B (zh) 热循环装置及热循环方法
US11905558B2 (en) System and method for sequencing
CN103103118B (zh) 一种核酸扩增与检测反应管
BR112015006566B1 (pt) Tubo de reação, e, método para preencher um tubo de reação
CN104046555A (zh) 核酸扩增反应用筒
CN111295443B (zh) 基于转座酶的基因组分析
CN101505875B (zh) 用于分析扩增的核酸的方法
CN104877988A (zh) 核酸扩增方法
CN105624031A (zh) 核酸扩增反应装置和核酸扩增方法
CN104946509A (zh) 核酸扩增反应用筒和核酸扩增装置
CN105567559A (zh) 核酸扩增反应装置和核酸检测方法
JP2011205925A (ja) 核酸増幅方法および核酸増幅用チップ
CN105624147A (zh) 核酸扩增方法
WO2017122128A2 (en) System and method for synthesis of dna particles and use thereof
JP2016168018A (ja) 核酸増幅反応装置及び核酸増幅方法
US20220170093A1 (en) System and method for sequencing
CN107988350A (zh) 一种用于dna测序文库杂交捕获的杂交缓冲液
CN104946508A (zh) 生物芯片
CN105567798A (zh) Dna中有无变异的判别方法
CN105132406A (zh) 物质扩增反应装置以及物质扩增方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20160601