JP2014176302A - 核酸増幅反応装置及び核酸増幅方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明の核酸増幅反応装置は、(A)核酸が結合した核酸結合性固相担体から前記核酸が溶出する溶出液を含むプラグを有するチューブと、前記チューブと連通し、前記溶出液と相分離するオイルを含む核酸増幅反応容器と、を備えるカートリッジを装着する装着部を有する回転体と、(B)前記核酸増幅反応容器の内部に温度勾配を形成するヒーターとを備え、(C)前記回転体が回転して前記カートリッジの姿勢が変化することによって、前記核酸増幅反応容器の内部において、前記チューブから導入された前記溶出液を含む液滴が移動する。
【選択図】図8
Description
このような装置によれば、核酸溶出処理が行われるチューブと一緒に核酸増幅反応容器の姿勢を変化させるので、処理時間の短縮化が可能になる。
ことが望ましい。これにより、回転体を小型化できる。
このような方法によれば、核酸溶出処理が行われるチューブと一緒に核酸増幅反応容器の姿勢を変化させるので、処理時間の短縮化が可能になる。
まず、PCR装置50(核酸増幅反応装置)に装着されるカートリッジについて説明した後、本実施形態のPCR装置50の構成・動作について説明する。
図1A及び図1Bは、カートリッジ1の説明図である。図2A〜図2Cは、カートリッジ1の動作説明図である。図2Aは、カートリッジ1の初期状態の説明図である。図2Bは、図2Aの状態からプランジャー10を押して、シール12Aが下シリンジ22に接触したときの側面図である。図2Cは、プランジャー10を押した後のカートリッジ1の説明図である。
図3A〜図3Dは、タンク3の説明図である。
カートリッジ本体9は、プランジャー10と、チューブ20と、PCR容器30とを有する。
以下、図2A〜図2Cを参照しながら、プランジャー10について説明する。
以下、図2A〜図2Cを参照しながら、チューブ20について説明する。
チューブの外形の長手方向に垂直な断面の形状も限定されない。さらにチューブの肉厚(内部の空洞の側面から外部の表面までの寸法)も特に限定されない。チューブが円筒状の場合、その内径(内部の空洞の長手方向に垂直な断面における円の直径)は、例えば、0.5mm以上2mm以下とすることができる。チューブの内径がこの範囲であると、チューブの材質、液体の種類において広範な範囲で液体のプラグを形成しやすい。先端はよりテーパー状に細くなっていることが好ましく、0.2mm以上1mm以下とすることができる。そして、キャピラリー23の末端の内径(キャピラリー23の開口径)を小さくすることによって、PCR容器30内で液滴化した反応液47がキャピラリー23の開口に吸着して離れなくなることを抑制できる。但し、キャピラリー23の末端の内径を小さくし過ぎると、多数の小さな液滴の反応液47が形成されてしまう。なお、キャピラリー23の末端以外の部分まで末端と同様に細径化すると、各プラグの体積を確保する必要性からカートリッジ1が長くなってしまい、望ましくない。
0.2u/μL AMV逆転写酵素(日本ジーン)
0.125u/μL Gene Taq NT PCR酵素(日本ジーン)
0.5mM dNTP
1.0μM プライマー(forward)
1.0μM プライマー(reverse)
0.5μM プローブ(Taq man)
4.0mg/mL BSA
x1 バッファー(MgCl2 7mM; Tris pH9.0 25mM; KCl 50mM)
反応液プラグ47の体積は、特に限定されず、核酸を吸着させた粒子等の量などを指標として適宜設定することができる。例えば、粒子等の体積が、0.5μLである場合には、反応液プラグ47の体積は、0.5μL以上であれば十分であり、0.8μL以上5μL以下とすることが好ましく、1μL以上3μL以下とすることがさらに好ましい。反応液プラグ47の体積がこれらの範囲であれば、例えば、核酸結合性固相担体の体積を0.5μLにしても、担体から核酸を十分溶出することができる。
図5A及び図5Bは、PCR容器30の周辺の説明図である。図5Aは、初期状態の説明図である。図5Bは、プランジャー10が押された後の状態の説明図である。以下、図2A〜図2Cも参照しながら、PCR容器30について説明する。
図6Aは、PCR装置50の内部構成の斜視図である。図6Bは、PCR装置50の主要構成の側面図である。図7は、PCR装置50のブロック図である。PCR装置50は、カートリッジ1を用いて、核酸溶出処理及び熱サイクル処理を行うものである。
回転機構60は、カートリッジ1及びヒーターを回転させる機構である。回転機構60がカートリッジ1及びヒーターを上下反転させることによって、PCR容器30の流路形成部35内において液滴状の反応液47が移動し、熱サイクル処理が行われることになる。
磁石移動機構70は、磁石71を移動させる機構である。磁石移動機構70は、カートリッジ1内の磁気ビーズ7を磁石71に引き寄せるとともに、磁石71を移動させることによって磁気ビーズ7をカートリッジ1内で移動させる。磁石移動機構70は、一対の磁石71と、昇降機構73と、揺動機構75とを有する。
押圧機構80は、カートリッジ1のプランジャー10を押す機構である。プランジャー10が押圧機構80によって押されることによって、カートリッジ1の反応液プラグ47及びオイルプラグがPCR容器30に押し出され、PCR容器30のオイル中に液滴状の反応液47が形成される。
蛍光測定器55は、PCR容器30の反応液47の輝度を測定する測定器である。蛍光測定器55は、カートリッジ1のPCR容器30の底35Aと対向するように、回転体61よりも下側に配置されている。蛍光測定器55は、低温側ヒーター65Cの挿入穴64Aの下側開口からPCR容器30の底35Aにある反応液47の輝度を測定することになる。なお、蛍光測定器55は、マルチプレックスPCRに対応できるように、複数の波長域の輝度検出が可能であると望ましい。
コントローラー90は、PCR装置50の制御を行う制御部である。コントローラー90は、例えばCPUなどのプロセッサーと、ROMやRAMなどの記憶装置とを有する。記憶装置には各種プログラム及びデータが記憶されている。また、記憶装置は、プログラムを展開する領域を提供する。プロセッサーが記憶装置に記憶されたプログラムを実行することによって、各種の処理が実現される。
(1)カートリッジ1の装着動作
図9A〜図9Dは、カートリッジ1の装着時のPCR装置50の状態の説明図である。図9Aは、カートリッジ1の装着前の初期状態の説明図である。図9Bは、待機状態の説明図である。図9Cは、カートリッジ1の装着直後の説明図である。図9Dは、カートリッジ1の装着状態での初期状態の説明図である。
・磁石71の上下動
図10は、磁石71を下方向に移動させたときの磁気ビーズ7の挙動の概念図である。カートリッジ1内の磁気ビーズ7は、磁石71に引き寄せられる。このため、カートリッジ1の外部で磁石71が移動すると、カートリッジ1内の磁気ビーズ7が磁石71とともに移動する。
磁石71を上下方向に移動させている間、コントローラー90は、揺動用モーター75Aを駆動させて、カートリッジ1を挟む一対の磁石71を前後方向に揺動させても良い。
図14A〜図14Cは、液滴形成処理の説明図である。図14Aは、磁石71を引き上げたときのPCR装置50の状態の説明図である。図14Bは、回転体61を45度回転させた状態の説明図である。図14Cは、押圧機構80のロッド82がプランジャー10を押した状態の説明図である。
図15A及び図15Bは、熱サイクル処理の説明図である。図15Aは、反応液47に低温側の温度処理を施す状態の説明図である。図15Bは、反応液47に高温側の温度処理を施す状態の説明図である。各図の左側にはPCR装置50の状態が示されており、各図の右側にはPCR容器30の流路形成部35の内部の状態が示されている。
図15Aに示すように、回転体61が基準位置にあるとき、蛍光測定器55がカートリッジ1のPCR容器30の底35Aと対向する。そのため、反応液47の蛍光測定時には、コントローラー90は、回転体61を基準位置にした状態で、低温側ヒーター65Cの挿入穴64Aの下側開口からPCR容器30の底35Aにある反応液47の蛍光強度を蛍光測定器55に測定させる。
上記の通り、核酸増幅反応装置であるPCR装置50は、カートリッジ1を装着する装着部(固定部63及び挿入穴64A)を有する回転体61と、核酸増幅反応容器であるPCR容器30の内部に温度勾配を形成するPCR用ヒーター(高温側ヒーター65B及び低温側ヒーター65C)とを備えている。回転体61に装着されるカートリッジ1は、溶出液を含む反応液プラグ47を有するチューブ20と、オイルを含むPCR容器30とを備えている。そして、PCR装置50は、回転体61が回転してカートリッジ1の姿勢が変化することによって、PCR容器30の内部において、チューブ20から導入された液滴状の反応液47が移動する。これにより、核酸溶出処理が行われるチューブ20と一緒にPCR容器20の姿勢が変化してポリメラーゼ反応を行うことができるので、処理時間の短縮化が可能になる。
第2実施形態は、第1実施形態とは異なる構成のカートリッジ1をPCR装置50に装着している。
図16A及び図16Bは、第2実施形態のカートリッジ1の説明図である。図17Aは、第2実施形態のカートリッジ1の初期状態の説明図である。図17Bは、図17Aの状態からプランジャー10を押して、シール12Aが下シリンジ22に接触したときの側面図である。図17Cは、プランジャー10を押した後の第2実施形態のカートリッジ1の説明図である。なお、第2実施形態のカートリッジ1のチューブ20は、第1実施形態の反応液プラグ47の代わりに、溶出液プラグ47A、オイルプラグ47B、及び核酸増幅反応液プラグ47Cを備えている。オイルプラグ47Bは、その両側の水溶性のプラグである溶出液プラグ47Aと核酸増幅反応液プラグ47Cが互いに混和することを防止する。
第2実施形態のPCR装置50の構造は、第1実施形態と同様である。このため、PCR装置50の構造(回転機構60、磁石移動機構70、押圧機構80、蛍光測定器55、コントローラー90等)については説明を省略し、ここでは、第2実施形態のカートリッジ1を装着したときのPCR装置50の動作について説明する。
第2実施形態のカートリッジ1の装着時の状態は、第1実施形態の図9A〜図9Dと同様である。第2実施形態では、図9Cに示すように、カートリッジ1が装着部62に対して正常な位置に固定されると、チューブ20の溶出液プラグ47Aが溶出用ヒーター65Aと対向することになる(これに対し、第1実施形態では、チューブ20の反応液プラグ47が溶出用ヒーター65Aと対向している)。
第2実施形態の核酸溶出処理時の状態は、第1実施形態の図11A〜図11Cと同様である。
第2実施形態の液滴形成処理時の状態は、第1実施形態の図14A〜図14Cと同様である。
上記の実施形態は、本発明の理解を容易にするためのものであり、本発明を限定して解釈するためのものではない。本発明は、その趣旨を逸脱することなく、変更、改良され得ると共に、本発明にはその等価物が含まれることは言うまでもない。
前述のPCR装置50は、熱サイクル処理として所定サイクル数にてカートリッジ1の姿勢を変化させて、PCR容器30を上下反転させていた。但し、カートリッジ1の姿勢を変化させる回数は、複数回に限られるものではなく、1回でも良い。
溶出液プラグ47Aを逆転写反応液プラグと溶出液プラグに分けても良い。この場合、洗浄液で洗浄された核酸結合性固相担体を逆転写反応液プラグに移動させて、逆転写反応液プラグ中で逆転写反応をさせる。この反応は、用いられる逆転写酵素に適した条件で行うことができる。例えば、逆転写反応液を、30〜50℃、好ましくは42〜45℃に加熱し、その中で核酸結合性固相担体を一定時間保持することで、RNAを担体に結合させたままで、逆転写反応を起こさせることができる。加熱方法としては、特に限定されないが、例えば、チューブの逆転写反応液プラグに対応する位置に、ヒートブロック等の熱媒体を接触させる方法や、ヒーター等の熱源を用いる方法、電磁加熱による方法などを例示することができる。保持時間も、実施者が適時選択できるが、10秒〜5分、好ましくは30秒から1分、保持すればよい。この段階で合成されたcDNAは、RNAと結合したままの状態で、固相担体に結合している。
その後、核酸結合性固相担体を溶出液プラグに移動させる。ここで、核酸結合性固相担体から核酸、特にcDNAを効率よく遊離させるために、溶出液プラグを加熱するのが好ましい。加熱方法としては、特に限定されないが、逆転写反応液プラグの加熱で用いるのと同様の方法を用いることができる。加熱温度は、40℃より高ければ良く、50℃以上が好ましく、60℃以上がより好ましい。加熱温度の上限は特に限定されないが、70℃以下であることが好ましく、65℃以下であることがより好ましく、60℃以下であることがさらに好ましく、60℃であることが最も好ましい。
核酸結合性固相担体から核酸を遊離させた後、磁石を用いて、核酸結合性固相担体を溶出液プラグから上方に移動させる。核酸結合性固相担体が溶出液プラグに混入していなければ、どこに移動させても構わない。
このように逆転写反応液プラグと溶出液プラグを分けることによって、逆転写反応と核酸溶出をそれぞれ高効率な条件で行うことが可能になる。
本実験例では、図19に示すように、上述の核酸抽出用キットのうち、チューブ200の内部に、第1プラグ210ないし第7プラグ270を有する構成を使用した。
まず、容量3mLのポリエチレン製容器130に、375μLの吸着液、及び1μLの磁性ビーズ分散液を収容した。吸着液は、76質量%のグアニジン塩酸塩、1.7質量%のエチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム二水和物、及び10質量%のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートの水溶液(東洋紡製、MagExtractor−Genome−、NPK−1)を用いた。また、磁性ビーズ原液としては、50体積%の磁性シリカ粒子及び20質量%の塩化リチウムが含有されたものを用いた。
ヒトから採取した血液を、ピペットを用いて容器130の口121から50μL入れ、容器130に蓋122をして手で30秒間振って撹拌した。その後、容器130の蓋122を外してチューブ200に接続した。なお、チューブ200には両端に栓110が為されており、第1プラグ210側の栓110を外してチューブ200に容器130を接続した。
ここで、第1プラグ210、第3プラグ230、第7プラグ270、第5プラグ250は、シリコンオイルとした。第2プラグ220の第1洗浄液は、76質量%のグアニジン塩酸塩の水溶液とした。また、第4プラグ240の第2洗浄液は、pHが8.0のトリス−塩酸緩衝液(溶質濃度5mM)とした。第6プラグ260の溶出液は、滅菌水とした。
そして、永久磁石410を動かして、容器130内の磁性ビーズ125をチューブ200内に導入した。そして、磁性ビーズ125を第6プラグ260まで移動させた。磁性ビーズ125がチューブ200内の各プラグに存在した時間はおよそ以下の通りであった。第1、3、7プラグ:各3秒、第2プラグ:20秒、第4プラグ:20秒、第6プラグ:30秒。なお、第2プラグ220及び第4プラグ240においては、磁性ビーズを振動させる等の操作は行わなかった。また、第2プラグ220、第4プラグ240、及び第6プラグ260の体積は、それぞれ、25μL、25μL、及び1μLとした。
次いで、チューブの第7プラグ側の栓110を取り外し、容器120を手で変形させて、第7プラグ270及び第6プラグ260をPCRの反応容器に吐出させた。この操作は、磁性ビーズを永久磁石によって動かして、第2プラグ220まで退避させた上でおこなった。
そして、その抽出液に19μLのPCRの反応試薬を加え、リアルタイムPCRを定法に従って行った。PCRの反応試薬の内訳は、ライトサイクラー480ジェノタイピングマスター(ロシュ・ダイアグノスティックス社製4 707 524)4μL、滅菌水で1000倍希釈したSYBR Green I(ライフテクノロジーズ社製S7563)0.4μL、100μMのβアクチン検出用プライマー(F/R)各0.06μL、滅菌水14.48μLである。実験例1のPCRの増幅曲線を図20に示す。なお、図20の縦軸は、蛍光輝度であり、横軸はPCRのサイクル数である。
実験例2では、一般的な核酸抽出法により核酸の抽出を行った。
まず、容量1.5mLのポリエチレン製容器(エッペンドルフチューブ)に、375μLの吸着液、及び20μLの磁性ビーズ分散液を収容した。吸着液、磁性ビーズ分散液の組成としては、上記実験例と同様である。
次にヒトから採取した血液を容器の口からピペットを用いて50μL導入し、容器に蓋をして、ボルテックスミキサーで10分間撹拌し、磁気スタンド及びピペットを操作してB/F分離操作を行った。この状態では、容器内には磁性ビーズ及び少量の吸着液が残存していた。
次いで容器に実験例1と同じ組成の第1洗浄液を450μL導入し、蓋をして5秒間ボルテックスミキサーにより撹拌し、磁気スタンド及びピペットを操作して第1洗浄液を除去した。この操作を2回繰り返した。この状態では、容器内には磁性ビーズ及び少量の第1洗浄液が残存していた。
次いで容器に実験例1と同じ組成の第2洗浄液を450μL導入し、蓋をして5秒間ボルテックスミキサーにより撹拌し、磁気スタンド及びピペットを操作して第1洗浄液を除去した。この操作を2回繰り返した。この状態では、容器内には磁性ビーズ及び少量の第2洗浄液が残存していた。
そして、滅菌水(溶出液)50μLを容器に加え、蓋をして10分間ボルテックスミキサーにより撹拌し、磁気スタンド及びピペットを操作して上澄み液を回収した。この上澄み液が標的核酸を含んでいる。
そしてその抽出液から1μLを分注し、さらに19μLのPCRの反応試薬を加え、リアルタイムPCRを定法に従って行った。PCRの反応試薬の内訳は、ライトサイクラー480ジェノタイピングマスター(ロシュ・ダイアグノスティックス社製4 707 524)4μL、滅菌水で1000倍希釈したSYBR Green I(ライフテクノロジーズ社製S7563)0.4μL、100μMのβアクチン検出用プライマー(F/R)各0.06μL、滅菌水14.48μLである。このときの増幅曲線を図20に示す。
上記実験例から、以下のことが理解できる。
3 タンク、3A 蓋、3B 変形部、
5 アダプター、5A蓋、7 磁気ビーズ、
9 カートリッジ本体、
10 プランジャー、11 筒状部、11A 取付台、
12 棒状部、12A シール、13 リブ、
20 チューブ、21 上シリンジ、22 下シリンジ、
23 キャピラリー、25 固定爪、26 ガイド板、
30 PCR容器、31 シール形成部、
32 オイル受容部、32A オイル受容空間、
33 段差部、34A 上シール部、34B 下シール部、
35 流路形成部、35A 底、
36A 高温領域、36B 低温領域、
41 溶解液、42 オイル、43 洗浄液、
44 第1オイルプラグ、45 洗浄液プラグ、46 第2オイルプラグ、
47 反応液(PCR溶液)、
47A 溶解液、47B オイルプラグ、47C 核酸増幅反応液、
48 第3オイルプラグ、
50 PCR装置、51 ベース、52 支持台、53 側壁、
53A カートリッジ挿入口、55 蛍光測定器、
60 回転機構、61 回転体、
62 装着部、63 固定部、
63A ガイドレール、64A 挿入穴、
65 ヒーター、65A 溶出用ヒーター、
65B 高温側ヒーター、65C 低温側ヒーター、
65D スペーサー、66 回転用モーター、
70 磁石移動機構、71 磁石、72 アーム、
73 昇降機構、73A キャリッジ、
73B 昇降用モーター、73C キャリッジガイド、
73D ベルト、73E プーリー、
75 揺動機構、75A 揺動用モーター、75B 揺動回転軸、
80 押圧機構、81 プランジャー用モーター、82 ロッド、
90 コントローラー
Claims (9)
- (A)核酸が結合した核酸結合性固相担体から前記核酸が溶出する溶出液を含むプラグを有するチューブと、前記チューブと連通し、前記溶出液と相分離するオイルを含む核酸増幅反応容器と、を備えるカートリッジを装着する装着部を有する回転体と、
(B)前記核酸増幅反応容器の内部に温度勾配を形成するヒーターと
を備え、
(C)前記回転体が回転して前記カートリッジの姿勢が変化することによって、前記核酸増幅反応容器の内部において、前記チューブから導入された前記溶出液を含む液滴が移動する、
(D)核酸増幅反応装置。 - 請求項1に記載の核酸増幅反応装置であって、
前記回転体の回転軸は、前記核酸増幅反応容器よりも前記チューブ側に位置する
ことを特徴とする核酸増幅反応装置。 - 請求項1又は2に記載の核酸増幅反応装置であって、
前記装着部は、前記チューブを固定するチューブ固定部と、前記核酸増幅反応容器を固定する容器固定部とを有する
ことを特徴とする核酸増幅反応装置。 - 請求項1〜3のいずれかに記載の核酸増幅反応装置であって、
前記ヒーターが、前記回転体に設けられている
ことを特徴とする核酸増幅反応装置。 - 請求項1〜4のいずれかに記載の核酸増幅反応装置であって、
前記装着部に装着された前記カートリッジの前記プラグを加熱する溶出用ヒーターが設けられている
ことを特徴とする核酸増幅反応装置。 - 請求項1〜5のいずれかに記載の核酸増幅反応装置であって、
前記チューブに沿って磁石を移動させる磁石移動機構を更に有する
ことを特徴とする核酸増幅反応装置。 - 請求項6に記載の核酸増幅反応装置であって、
前記磁石移動機構は、前記磁石を揺動させて前記磁石と前記チューブとの距離を変化させる
ことを特徴とする核酸増幅反応装置。 - 請求項1〜7のいずれかに記載の核酸増幅反応装置であって、
前記チューブから前記核酸増幅反応容器へ液体を押し出すために前記カートリッジに設けられたプランジャーを押す押圧機構を更に有する
ことを特徴とする核酸増幅反応装置。 - (A)核酸が結合した核酸結合性固相担体から前記核酸を溶出する溶出液を含むプラグを有するチューブと、前記チューブと連通し、前記溶出液と相分離するオイルを含む核酸増幅反応容器と、を備えるカートリッジを装着部に装着すること、
(B)前記核酸増幅反応容器の内部に温度勾配を形成するとともに、前記装着部を有する回転体が回転して前記カートリッジの姿勢が変化することによって、前記核酸増幅反応容器の内部において、前記チューブから導入された前記溶出液を含む液滴が移動する、
(C)を行う核酸増幅方法。
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