JP2020202778A

JP2020202778A - 培養方法

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Publication number: JP2020202778A
Application number: JP2019111807A
Authority: JP
Inventors: 昌治竹内; Shoji Takeuchi; 香苗酒井; Kanae Sakai
Original assignee: Toyota Boshoku Corp; University of Tokyo NUC
Current assignee: Toyota Boshoku Corp; University of Tokyo NUC
Priority date: 2019-06-17
Filing date: 2019-06-17
Publication date: 2020-12-24
Anticipated expiration: 2039-06-17
Also published as: JP7344016B2; WO2020255637A1; CN113966386A; US20220298460A1

Abstract

【課題】複数のサンプルを各々が独立した状態で培養可能な新たな培養方法を提供する。【解決手段】表面３Ａに、相互に独立した複数のウェル１を有する板状のマイクロチャンバー３を用いた微生物の培養方法であって、ゲル化温度が５℃以上２０℃以下のアガロースが含有された液体培地と、前記微生物と、を混合して混合物を得る工程と、表面３Ａを上にした状態で、混合物をウェル１に内包する工程と、ウェルに混合物が内包されたマイクロチャンバー３を所定温度範囲で保温する工程と、を備える、培養方法。【選択図】図１

Description

本開示は、培養方法に関する。

微生物の培養方法として、例えば、以下の方法が知られている（非特許文献１〜３参照）。
非特許文献１では、微生物としての放線菌をディープウェルプレートにて培養方法が開示されている。
非特許文献２では、微生物としてのコウジカビをフッ素系オイル内に培地と共に内包して培養する培養方法が開示されている。この培養方法では、Ｗａｔｅｒｉｎｏｉｌマイクロドロップレット（油中液滴）が用いられている。
非特許文献３では、小さな穴の形成された板状のデバイスを半透膜で挟み込んだ状態とし、周りの環境中の栄養素を取り込んで培養する方法が開示されている。

Ｓ．Ｓｉｅｂｅｎｂｅｒｇｅｔａｌ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ２０１０．１０９（３）．２３０−２３４Ｔ．Ｂｅｎｅｙｔｏｎｅｔａｌ．ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｐｏｒｔｓ２０１６．７．２７２２３Ｄ．Ｎｉｃｈｏｌｓｅｔａｌ．ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ２０１０．７６（８）．２４４５−２４５０

しかし、従来の培養方法は、複数のサンプル（微生物）を培養する場合に、複数のサンプルの各々が独立した状態で培養する方法としては、実際には、必ずしも十分とは言えず、新たな培養方法が切望されていた。
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、複数のサンプルを各々が独立した状態で培養可能な新たな培養方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、新規な微生物の培養方法を開発した。
そして、この方法によれば、従来法による問題点を解決でき、複数のサンプルを各々が独立した状態で培養できるということを見いだした。この成果に基づいて、次の発明を提供する。

〔１〕表面に、相互に独立した複数のウェルを有する板状のマイクロチャンバーを用いた微生物の培養方法であって、
ゲル化温度が５℃以上２０℃以下のアガロースが含有された液体培地と、前記微生物と、を混合して混合物を得る工程と、
前記表面を上にした状態で、前記アガロースの前記ゲル化温度よりも高い温度の前記混合物を前記ウェルに内包する工程と、
前記ウェルに前記混合物が内包された前記マイクロチャンバーを所定温度範囲で保温する工程と、を備える、培養方法。

本開示の微生物の培養方法では、相互に独立した複数のウェルを有する板状のマイクロチャンバーを用いる。微生物は、アガロースともに、ウェル内に内包された状態で、培養される。複数のウェルは、相互に独立しているから、各々のウェルに内包された微生物同士は、混ざることなく、独立した状態で培養できる。
また、液体培地には、ゲル化温度が５℃以上２０℃以下のアガロースが含有されている。よって、混合物を、微生物が死滅しない温度まで温めてゾルとすることができ、このゾルをウェルに入れることができるから、混合物をウェルに入れ易くなる。

マイクロチャンバーの一例を示す斜視図である。ウェルの一例を示す断面図である。混合工程を説明する概念図である。内包工程を説明する概念図である。保温工程を説明する概念図である。生育状態の確認方法の一例の概念図である。培養時間０時間のウェルの観察像である。培養時間０時間のウェルの観察像である。培養時間２０時間のウェルの観察像である。培養時間２０時間のウェルの観察像である。培養時間７日のウェルの観察像である。

ここで、本開示の望ましい例を示す。
〔２〕前記混合物を前記ウェルに内包する際には、板部材によって前記混合物のゾルを前記ウェルに押し込む、〔１〕に記載の培養方法。
板部材によって混合物のゾルをウェルに押し込むことで、ウェルに混合物を十分に内包することができる。
〔３〕前記ウェルの底面は、フラットとされ、
前記微生物の培養状態を確認する際には、前記マイクロチャンバーの裏面側から、前記底面に存在する前記微生物を観察することで確認する、〔１〕又は〔２〕に記載の培養方法。
表面側から微生物を観察する場合には、微生物を含んだ混合物の表面に凹凸が存在するため、観察しにくい場合がある。本構成では、マイクロチャンバーの裏面側から、フラットな底面に存在する微生物を観察するから、観察が容易である。

以下、本開示を詳しく説明する。なお、"ｘ〜ｙ"という範囲を示す表記は、特に断りが無い限り、当該範囲にｘとｙが入るものとする。

１．微生物１３の培養方法の各用語の説明
本開示の微生物１３の培養方法は、表面３Ａに、相互に独立した複数のウェル１を有する板状のマイクロチャンバー３を用いる。微生物１３の培養方法は、ゲル化温度が５℃以上２０℃以下のアガロースが含有された液体培地１１と、微生物１３と、を混合して混合物１５を得る工程と、表面３Ａを上にした状態で、混合物１５をウェル１に内包する工程と、ウェル１に混合物１５が内包されたマイクロチャンバー３を所定温度範囲で保温する工程と、を備える。

（１）微生物１３
微生物１３の種類は、特に限定されない。微生物１３としては、例えば、放線菌、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、及び枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）等の細菌、カビ及び酵母等の真菌、ラン藻（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）等の微細藻類、ラビリンチュラ類（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｅａ）等が挙げられる。

（２）マイクロチャンバー３
マイクロチャンバー３は、表面３Ａに複数の窪みたるウェル１を有する板状部材である。
マイクロチャンバー３の材質は、特に限定されない。材質としては、例えば、シリコーン樹脂が好適に用いられる。シリコーン樹脂としては、特に制限されないが、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチルフェニルシロキサン、ポリメチルハイドロジェンシロキサン、ポリメチルメトキシシロキサン、ポリメチルビニルシロキサン等が好ましい。これらのシリコーン樹脂は１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）は、透明であり、マイクロチャンバー３の裏面３Ｂ側から、ウェル１内の微生物１３の培養状態を容易に確認できるから、特に好ましい。

マイクロチャンバー３の平面形状及び大きさは、特に限定されない。
マイクロチャンバー３の平面形状は、例えば矩形状、円形等を採用することができる。
マイクロチャンバー３の大きさは、その平面形状が矩形状の場合には、取扱い性及び生産性の観点から、５ｍｍ×１０ｍｍ以上が好ましく、７ｍｍ×１２ｍｍ以上がより好ましく、１０ｍｍ×１５ｍｍ以上が更に好ましい。他方、マイクロチャンバー３の大きさは、取扱い性及び生産性の観点から、３５ｍｍ×４０ｍｍ以下が好ましく、３３ｍｍ×３８ｍｍ以下がより好ましく、２５ｍｍ×３０ｍｍ以下が更に好ましい。これらの観点から、マイクロチャンバー３の大きさは、その平面形状が矩形状の場合には、５ｍｍ×１０ｍｍ〜３５ｍｍ×４０ｍｍが好ましく、７ｍｍ×１２ｍｍ〜３３ｍｍ×３８ｍｍがより好ましく、１０ｍｍ×１５ｍｍ〜２５ｍｍ×３０ｍｍが更に好ましい。

マイクロチャンバー３の厚みｔ１（図２参照）は、特に限定されない。
マイクロチャンバー３の厚みｔ１は、ウェル１の深さ１Ｃを十分に確保する観点から、３５０μｍ以上が好ましく、４００μｍ以上がより好ましく、４５０μｍ以上が更に好ましい。他方、マイクロチャンバー３の厚みｔ１は、取扱い性及び生産性の観点から、６５０μｍ以下が好ましく、６００μｍ以下がより好ましく、５５０μｍ以下が更に好ましい。これらの観点から、マイクロチャンバー３の厚みｔ１は、３５０μｍ〜６５０μｍが好ましく、４００μｍ〜６００μｍより好ましく、４５０μｍ〜５５０μｍが更に好ましい。

マイクロチャンバー３は、ウェル１内に微生物１３と液体培地１１の混合物１５をスムーズに内包できるという観点から、親水化処理されていることが好ましい。親水化処理は、特に限定されないが、例えば、Ｏ_２アッシャーによる親水化処理が好適に採用される。

（３）ウェル１
ウェル１の平面形状及び大きさは、特に限定されない。
ウェル１の平面形状は、例えば円形、矩形等を採用することができる。ウェル１の平面形状は、ウェル１内に混合物１５をスムーズに内包できるという観点から、円形が好ましい。
ウェル１の大きさは、その平面形状が円形の場合には、微生物１３の培養空間を十分に確保する観点から、径１Ａ（図２参照）は３５０μｍ以上が好ましく、４００μｍ以上がより好ましく、４５０μｍ以上が更に好ましい。他方、ウェル１の大きさは、より多くのサンプルを同時に評価するという観点から、径１Ａは６５０μｍ以下が好ましく、６００μｍ以下がより好ましく、５５０μｍ以下が更に好ましい。これらの観点から、ウェル１の大きさは、その平面形状が円形の場合には、径１Ａは３５０μｍ〜６５０μｍが好ましく、４００μｍ〜６００μｍより好ましく、４５０μｍ〜５５０μｍが更に好ましい。

ウェル間距離１Ｂ（図２参照）は、特に限定されない。
ウェル間距離１Ｂは、各ウェル１内の微生物１３をそれぞれ独立した環境で培養する観点から、１００μｍ以上が好ましく、１２０μｍ以上がより好ましく、１５０μｍ以上が更に好ましい。他方、ウェル間距離１Ｂは、より多くの微生物１３を同時に培養するという観点から、３００μｍ以下が好ましく、２８０μｍ以下がより好ましく、２５０μｍ以下が更に好ましい。これらの観点から、ウェル間距離１Ｂは、１００μｍ〜３００μｍが好ましく、１２０μｍ〜２８０μｍより好ましく、１５０μｍ〜２５０μｍが更に好ましい。
なお、ウェル間距離１Ｂは、隣接するウェル１を仕切る壁の厚みに相当する。

ウェル１の深さ１Ｃ（図２参照）は、特に限定されない。
ウェル１の深さ１Ｃは、ウェル１内に微生物１３の培養空間を十分に確保する観点から、４０μｍ〜１６０μｍが好ましく、６０μｍ〜１４０μｍより好ましく、８０μｍ〜１２０μｍが更に好ましい。なお、ウェル１の深さ１Ｃが、一定でない場合には、本明細書では、ウェル１の深さ１Ｃは、最も深い場所における値を採用する。

ウェル１が形成された部分のマイクロチャンバー３の厚みｔ２（図２参照）、すなわち、ウェル１の底面１Ｄから裏面３Ｂまでの距離は、特に限定されない。マイクロチャンバー３の厚みｔ２は、マイクロチャンバー３の裏面３Ｂ側から、ウェル１内の微生物１３の培養状態を観察する場合には、マイクロチャンバー３を透して観察し易いという観点から、６００μｍ以下が好ましく、５００μｍ以下がより好ましい。他方、マイクロチャンバー３の厚みｔ２は、ウェル１の底面１Ｄが破れることを防止する観点から、３００μｍ以上が好ましく、３５０μｍ以上がより好ましくい。これらの観点から、マイクロチャンバー３の厚みｔ２は、３００μｍ〜６００μｍが好ましく、３５０μｍ〜５００μｍより好ましい。なお、厚みｔ２が、一定でない場合には、本明細書では、厚みｔ２は、最も厚い（最も大きい）場所における値を採用する。
ウェル１の底面１Ｄは、フラット（平坦）であることが望ましい。底面１Ｄフラットであると、マイクロチャンバー３の裏面３Ｂ側から、底面１Ｄ付近の微生物１３を観察する際に、ピントが合わせやすく、観察し易い。

１つのマイクロチャンバー３におけるウェル１の個数は、特に限定されず、マイクロチャンバー３の大きさ等に応じて適宜選択される。
例えば、２０ｍｍ×２５ｍｍの面積当たり、１００個〜１００００個とすることできる。

（４）液体培地１１
液体培地１１には、ゲル化温度（ゲル化点）が５℃以上２０℃以下のアガロースが含有されている。このアガロースは、ゲル化温度が低く、低融点アガロースとも呼ばれている。なお、ゲル化温度は、アガロース水溶液が冷却するにつれてゲルを形成する温度を意味する。
液体培地１１におけるアガロースの濃度は、特に限定されない。
アガロースの濃度は、蒸発防止の観点から、０．１％（ｗ／ｖ）以上が好ましく、０．５％（ｗ／ｖ）以上がより好ましく、０．７％（ｗ／ｖ）以上が更に好ましい。他方、混合物１５の流動性を十分に確保して、混合物１５をウェル１へスムーズに内包するという操作性の観点から、３．０％（ｗ／ｖ）以下が好ましく、２．０％（ｗ／ｖ）以下がより好ましく、１．５％（ｗ／ｖ）以下が更に好ましい。これらの観点から、アガロースの濃度は、０．１％（ｗ／ｖ）〜３．０％（ｗ／ｖ）が好ましく、０．５％（ｗ／ｖ）〜２．０％（ｗ／ｖ）より好ましく、０．７％（ｗ／ｖ）〜１．５％（ｗ／ｖ）が更に好ましい。

また、液体培地１１には、通常、炭素源、窒素源が含まれている。炭素源としては、グルコース、フラクトース、キシロース、サッカロース、マルトース、可溶性デンプン、糖蜜、グリセロール、マンニトール等の一般的に使用されているものが、いずれも使用できるが、これらに限られるものではない。窒素源としては、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、肉エキス、カザミノ酸、コーンスティープリカー、大豆タンパク、脱脂大豆、綿実カス等の天然窒素源の他に、尿素等の有機窒素源、並びに硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等の無機窒素源を用いることができる。
この他、必要に応じリン酸塩、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸銅等の無機塩及びビタミン等も微量栄養源として使用できる。これらの培地成分は微生物１３の生育を害しない濃度であれば特に制限はない。炭素源の含有量は０．１％〜１０％（ｗ／ｖ）が好ましい。窒素源の含有量は０．１％〜５％（ｗ／ｖ）が好ましい。
液体培地１１のｐＨは４〜１０であることが好ましく、５〜９がより好ましい。

２．微生物１３の培養方法の各工程の説明
（１）混合工程
混合工程では、図３に例示されるように、液体培地１１と微生物１３とを混合して混合物１５を得る。
液体培地１１と微生物１３の混合割合は特に限定されない。微生物１３の培養状態を観察し易くするという観点から、混合物１５の微生物１３の濁度（ＯＤ）が０．０５〜０．１５になるように混合割合を調整することが好ましく、０．０８〜０．１２になるように混合割合を調整することがより好ましい。

本明細書における「濁度」は、微生物１３の増殖を培養液（ここでは、微生物１３が含有された液体培地１１たる混合物１５）の濁り具合（培養液中の菌体量）で測定する、最も一般的な簡便で迅速な測定法である。光を培養液に当て、その透過光がどのくらい散乱、及び吸収によって阻まれるかを測定する。微生物１３は微粒子であるため、微生物１３の量と培養液の濁度とは比例関係にある。濁度は、例えば、以下のようにして測定される。

波長６６０ｎｍの単波長の光を培養液に入射し、透過光を分光光度計により測定する。ここで入射光と透過光の強さを、それぞれＩ_０、Ｉ、透過層の厚みをＬ、吸光度をτとし、次式によって求めた吸光度を培養液の濁度（ＯＤ）と定義する。

（２）内包工程
内包工程では、表面３Ａを上にした状態で、アガロースのゲル化温度よりも高い温度の混合物１５をウェル１に内包する（図４参照）。
アガロースのゲル化温度よりも高い温度は、微生物１３を死滅させずに、混合物１５をゾルにするという観点から、２０℃〜４０℃が好ましく、３０℃〜３７℃がより好ましい。
混合物１５をウェル１に内包する際には、ウェル１に混合物１５を十分に内包するという観点から、板部材１７で混合物１５をウェル１に押し込むことが好ましい（図４（Ａ）（Ｂ）参照）。
板部材１７としては、特に限定されないが、例えば、ガラス板を採用することができる。ガラス板を用いることで、ガラス板を透して混合物１５の内包状態（充填状態）を容易に確認できる。ガラス板は、ピラニア溶液を用いたピラニア洗浄によって、有機物等を除去したものが好ましい。なお、ピラニア溶液は、硫酸と過酸化水素の混合物である。
混合物１５をウェル１に内包した後に、混合物１５の上面１５Ａの上に、水１６を添加してもよい（図４（Ｃ）（Ｄ）参照）。このように水１６を添加することで、保温工程における混合物１５の乾燥が抑制される。

（３）保温工程
保温工程では、ウェル１に混合物１５が内包されたマイクロチャンバー３を所定温度範囲で保温する（図５参照）。
所定温度範囲とは、微生物１３の種類に応じて適宜選択され、微生物１３の培養に適した温度範囲である。例えば、放線菌の場合には２５℃〜３０℃である。
保温に際しては、例えば、恒温槽１９が用いられる（図５参照）。
なお、所定温度範囲で保温する時間は、特に限定されず、微生物１３に応じて適宜変更できる。保温時間は、好ましくは２時間〜１０日間であり、より好ましくは１０時間〜７日である。

（４）生育状態の確認
本開示の培養方法では、微生物１３の生育状態の確認を行ってもよい。例えば、図６に示すように倒立型顕微鏡のステージ２１の上に、マイクロチャンバー３を置いて、マイクロチャンバー３の下側から、すなわち図６の矢印の方向から観察して、微生物１３の生育状態の確認ができる。

３．本実施形態の効果
本開示の微生物１３の培養方法によれば、相互に独立した複数のウェル１を有する板状のマイクロチャンバー３を用いる。微生物１３は、アガロースともに、ウェル内に内包された状態で、培養される。複数のウェル１は、相互に独立しているから、各々のウェル１に内包された微生物１３同士は、混ざることなく、独立した状態で培養できる。

以下、実施例により更に具体的に説明する。

１．マイクロチャンバー３の作製
（１）マイクロチャンバー鋳型の作製
２．５インチのシリコンウエハに、ＳＵ８−５０（レジスト、日本化薬社製）を１ｍＬ載せた。ＳＵ８−５０中の気泡を除去した後、スピンコーターで回転数１０００ｒｐｍとすることで、シリコンウエハにＳＵ８−５０を塗布した。ＳＵ８−５０を塗布したシリコンウエハに対して、６５℃１５分の加熱、９５℃４０分の加熱、放冷一時間（４０℃以下まで冷ます）を順に実施した。その後、ＳＵ８−５０を塗布したシリコンウエハの上に、マイクロチャンバーをパターニングしたクロムマスク（鋳型）を被せ、マスクアライナーで１９秒露光した。そして、６５℃２分、９５℃１５分のポストベイクをした後、ＳＵ８ｄｅｖｅｌｏｐｅｒとイソプロピルアルコールでシリコンウエハを洗浄し現像することで、高さ１００μｍのＳＵ８のマイクロチャンバー鋳型を作製した。

（２）マイクロチャンバー３の作製
ＰＤＭＳ主剤と硬化剤を１０：１で混合し、脱気した溶液５ｇを、ＳＵ８のマイクロチャンバー鋳型に流し込み、１時間真空引きした後、７５℃で２時間硬化させた。固まったＰＤＭＳからＳＵ８の鋳型を除去することで、ＰＤＭＳ製のマイクロチャンバー３（寸法２０ｍｍ×２５ｍｍ）を得た。
ウェル１の平面形状は、円形（径：５００μｍ）とした。ウェル１の深さ１Ｃは１００μｍであり、ウェル間距離１Ｂは２００μｍであり、ウェル数は５００であった。

２．微生物１３の培養
液体培地１１としては、以下の組成のものを用いた。なお、アガロースとして、Ａ２５７６−Ａｇａｒｏｓｅ（Ｕｌｔｒａ−ｌｏｗＧｅｌｌｉｎｇＴｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙｇｒａｄｅ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ｇｅｌｐｏｉｎｔ≦２０℃）を用いた。
微生物１３としては、放線菌を用いた。
液体培地１１と微生物１３を混合して混合物１５とした（図３参照）。この際、混合物１５における放線菌（微生物１３）の濁度（ＯＤ）が０．１になるように、液体培地１１と放線菌（微生物１３）を混合した。
混合物１５は、２８℃で保温した。
＜培地組成＞
酵母エキス：４ｇ
麦芽エキス：１０ｇ
グルコース：４ｇ
蒸留水：１Ｌ
ｐＨ：７．３
アガロース濃度：１％（ｗ／ｖ）

ＰＤＭＳ製マイクロチャンバー３をＯ_２アッシャーで親水化処理した（１２５Ｗ、１０ｓｅｃ）。
ウェル１が形成された表面３Ａを上にしたマイクロチャンバー３に、ゾル状態の混合物１５を載せた。ピラニア洗浄したガラス板（板部材１７）をマイクロチャンバー３の表面３Ａに押しつけて、混合物１５を加圧し、混合物１５をウェル１内に内包させた（図４（Ａ）（Ｂ）参照）。
その後、ガラス板（板部材１７）を除去し、混合物１５の上面１５Ａの上に、水１６（蒸留水）を添加した（図４（Ｃ）（Ｄ）参照）。
そして、ウェル１に混合物１５が内包されたマイクロチャンバー３を２８℃で静置して、放線菌（微生物１３）を培養した（図５参照）。
培養時間が、０時間、２０時間、７日のときに、倒立型顕微鏡を用いてマイクロチャンバー３のウェル１に内包された放線菌（微生物１３）の生育状態を確認した（図６参照）。

３．評価結果
図７，８に、培養時間０時間のウェル１の観察像を示す。図９，１０に、培養時間２０時間のウェル１の観察像を示す。培養時間０時間の観察像と、培養時間２０時間の観察像を比較すると、培養時間２０時間では、樹状に菌糸が生育していることが分かる。培養時間２０時間においても、菌糸は、ウェル１内で成長しており、ウェル１外には侵出していないことが分かる。
図１１に、培養時間７日のウェル１の観察像を示す。培養時間７日でも、樹状に菌糸が生育していることが分かった。すなわち、図１１中、丸い破線で囲んだエリアに菌糸の集合体が観察された。このように、培養時間７日においても、菌糸は、ウェル１内で成長しており、ウェル１外には侵出していないことが分かった。よって、本実施例の培養方法では、７日という長期間においても、区画された微小空間内で微生物１３を長期間（数日間）、培養できることが確認された。
なお、非特許文献２のＷａｔｅｒｉｎｏｉｌマイクロドロップレット（油中液滴）法では、菌糸が伸びて３２時間後には、マイクロドロップレットを破壊するため、区画された微小空間内で微生物１３を長期間（数日間）、培養できない。
また、非特許文献３のＩＣｈｉｐ法では、区画した微生物１３が生産する化合物が半透膜を透過して他の微生物に影響を与えるため、各微生物１３を独立した環境で培養できない。この方法で、化合物の漏出を防ぐために、環境中（土壌中等）から取り出してデバイスを使うと、培地が乾燥してしまうため、長期間の培養ができない。
本実施例の培養方法は、非特許文献２のＷａｔｅｒｉｎｏｉｌマイクロドロップレット（油中液滴）法や、非特許文献３のＩＣｈｉｐ法の欠点がなく、本実施例の培養方法は、区画された微小空間内で微生物１３を独立した状態で長期間（数日間）、培養できる。

４．実施例の効果
本実施例の培養方法によれば、微生物１３は、アガロースともに、ウェル１内に内包された状態で、培養される。複数のウェル１は、相互に独立しているから、各々のウェル１に内包された微生物１３同士は、混ざることなく、独立した状態で培養できる。よって、この培養方法は、Ｗａｔｅｒｉｎｏｉｌマイクロドロップレット（油中液滴）法の欠点、すなわち、区画外への微生物１３の侵出という欠点がない。また、この培養方法は、ＩＣｈｉｐ法（非特許文献３）の欠点、すなわち、区画外への化合物の侵出という欠点がない。
本実施例の培養方法によれば、寸法２０ｍｍ×２５ｍｍのマイクロチャンバー３で、５００ウェルを配置している。本実施例の培養方法では、このように多数のウェル１を有するマイクロチャンバー３を用いるから、従来法よりも多くのサンプルの培養が可能となる。例えば、従来法が９６サンプルしか同時に培養できないとすると、本実施例の培養方法によれば、約５倍多くのサンプルを同時に培養可能である。

前述の例は単に説明を目的とするものでしかなく、本発明を限定するものと解釈されるものではない。本発明を典型的な実施形態の例を挙げて説明したが、本発明の記述及び図示において使用された文言は、限定的な文言ではなく説明的及び例示的なものであると理解される。ここで詳述したように、その形態において本発明の範囲又は本質から逸脱することなく、添付の特許請求の範囲内で変更が可能である。ここでは、本発明の詳述に特定の構造、材料及び実施例を参照したが、本発明をここにおける開示事項に限定することを意図するものではなく、むしろ、本発明は添付の特許請求の範囲内における、機能的に同等の構造、方法、使用の全てに及ぶものとする。

本発明は上記で詳述した実施形態に限定されず、本発明の請求項に示した範囲で様々な変形又は変更が可能である。

本発明の培養方法は、多検体の微生物の培養に有用である。

１ …ウェル
１Ａ …径
１Ｂ …ウェル間距離
１Ｃ …深さ
１Ｄ …底面
３ …マイクロチャンバー
３Ａ …表面
３Ｂ …裏面
１１ …液体培地
１３ …微生物
１５ …混合物
１５Ａ…上面
１６ …水
１７ …板部材
１９ …恒温槽
２１ …ステージ
ｔ１ …厚み
ｔ２ …厚み

Claims

表面に、相互に独立した複数のウェルを有する板状のマイクロチャンバーを用いた微生物の培養方法であって、
ゲル化温度が５℃以上２０℃以下のアガロースが含有された液体培地と、前記微生物と、を混合して混合物を得る工程と、
前記表面を上にした状態で、前記アガロースの前記ゲル化温度よりも高い温度の前記混合物を前記ウェルに内包する工程と、
前記ウェルに前記混合物が内包された前記マイクロチャンバーを所定温度範囲で保温する工程と、を備える、培養方法。
前記混合物を前記ウェルに内包する際には、板部材によって前記混合物のゾルを前記ウェルに押し込む、請求項１に記載の培養方法。
前記ウェルの底面は、フラットとされ、
前記微生物の培養状態を確認する際には、前記マイクロチャンバーの裏面側から、前記底面に存在する前記微生物を観察することで確認する、請求項１又は２に記載の培養方法。