JP2000197479A - 微生物の単離方法 - Google Patents
微生物の単離方法Info
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- agarose
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 種々の微生物種が混在する試料から、平板培
養法では単離が困難な微生物種を単離することができる
方法を提供する。 【解決手段】 微生物生細胞を含む試料液中の微生物細
胞をアガロースゲル微小粒子中に包括すること、それに
よって少なくとも一部が一個の微生物細胞を有するアガ
ロースゲル微小粒子の集団が得られ、上記アガロースゲ
ル微小粒子集団を、上記試料中に含まれている微生物の
内平板培養法にてコロニーを形成する微生物が増殖でき
るような増殖環境下におくこと、および上記増殖環境に
おかれたアガロースゲル微小粒子集団から一個の微生物
細胞を有するアガロースゲル微小粒子をセルソーターに
より識別して分離すること、からなる微生物の単離方
法。
養法では単離が困難な微生物種を単離することができる
方法を提供する。 【解決手段】 微生物生細胞を含む試料液中の微生物細
胞をアガロースゲル微小粒子中に包括すること、それに
よって少なくとも一部が一個の微生物細胞を有するアガ
ロースゲル微小粒子の集団が得られ、上記アガロースゲ
ル微小粒子集団を、上記試料中に含まれている微生物の
内平板培養法にてコロニーを形成する微生物が増殖でき
るような増殖環境下におくこと、および上記増殖環境に
おかれたアガロースゲル微小粒子集団から一個の微生物
細胞を有するアガロースゲル微小粒子をセルソーターに
より識別して分離すること、からなる微生物の単離方
法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、微生物の単離方法
に関し、特に通常の平板培養法では単離が困難な微生物
を単離する方法に関する。
に関し、特に通常の平板培養法では単離が困難な微生物
を単離する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】微生物の単一コロニーまたは単一細胞の
分離は、従来、複数種の微生物が混在する試料液を平板
培地に播き、培養後形成されたコロニーを単離する、平
板培養法によりなされてきた。しかし、この平板培養法
は、使用された培地や環境下では増殖できず、したがっ
てコロニーを形成できない微生物種は単離することがで
きない。そこで、培地や環境を種々変えて平板培養分離
が繰り返されるが、あらゆる未知の微生物が増殖できる
ような培地や環境を想定し作成することは実際上できな
い。
分離は、従来、複数種の微生物が混在する試料液を平板
培地に播き、培養後形成されたコロニーを単離する、平
板培養法によりなされてきた。しかし、この平板培養法
は、使用された培地や環境下では増殖できず、したがっ
てコロニーを形成できない微生物種は単離することがで
きない。そこで、培地や環境を種々変えて平板培養分離
が繰り返されるが、あらゆる未知の微生物が増殖できる
ような培地や環境を想定し作成することは実際上できな
い。
【０００３】したがって、種々の微生物が混在する試料
から平板培養法により単離できる微生物種は、限られた
ものになる。例えば、V. Torsvikら(Appl. Environ. Mi
crobiol. 56, 782-787 (1990))は、土壌中の微生物につ
いて、全菌数中に占めるコロニーを形成できる菌数は
０．３％であったと報告している。M. Wagner ら（App
l. Environ.Microbiol. 59, 1520-1525 (1993)）は、活
性汚泥中の全菌数中、コロニーを形成できる菌数は、１
ないし１５％にすぎないと報告している。J. T.Staley
ら（Annu. Rev. Microbiol. 39, 66-68 (1985)）は、中
性を示す湖水中の全菌数に占めるコロニーを形成できる
菌数の割合は０．１ないし１％であったと報告してい
る。また、R. L. Fergusonら（Appl. Environ. Microbi
ol. 42, 49-55 (1984)）、およびK. Kogureら(Can. J.
Microbiol. 25, 415-420 (1979)、およびCan. J. Micor
obiol. 26, 318-323 (1980))は、海水中の微生物につい
て検討し、海水中の全菌数に対するコロニー形成能を有
する菌数の割合は０．００１ないし０．１％であると報
告している。さら、J. G. Jones (Freshwater Biol.7,
67-91 (1997))は、湖水とその沈澱物について、コロニ
ー形成能を有する菌種の全菌種に対する割合はいずれも
０．２５％であったと報告している。
から平板培養法により単離できる微生物種は、限られた
ものになる。例えば、V. Torsvikら(Appl. Environ. Mi
crobiol. 56, 782-787 (1990))は、土壌中の微生物につ
いて、全菌数中に占めるコロニーを形成できる菌数は
０．３％であったと報告している。M. Wagner ら（App
l. Environ.Microbiol. 59, 1520-1525 (1993)）は、活
性汚泥中の全菌数中、コロニーを形成できる菌数は、１
ないし１５％にすぎないと報告している。J. T.Staley
ら（Annu. Rev. Microbiol. 39, 66-68 (1985)）は、中
性を示す湖水中の全菌数に占めるコロニーを形成できる
菌数の割合は０．１ないし１％であったと報告してい
る。また、R. L. Fergusonら（Appl. Environ. Microbi
ol. 42, 49-55 (1984)）、およびK. Kogureら(Can. J.
Microbiol. 25, 415-420 (1979)、およびCan. J. Micor
obiol. 26, 318-323 (1980))は、海水中の微生物につい
て検討し、海水中の全菌数に対するコロニー形成能を有
する菌数の割合は０．００１ないし０．１％であると報
告している。さら、J. G. Jones (Freshwater Biol.7,
67-91 (1997))は、湖水とその沈澱物について、コロニ
ー形成能を有する菌種の全菌種に対する割合はいずれも
０．２５％であったと報告している。
【０００４】このように、平板培養法によっては単離で
きない微生物種が多いにも拘わらず、その必要性は、食
品産業、医薬品産業、水質等の環境保全、医療等におい
て強く望まれている。また、深海などの極端な環境、ま
たはヒト等の高等動物、昆虫、土壌原生動物もしくは海
洋生物等の生物体内から、平板培養法では単離できな
い、したがって未だ単離されていない微生物種を単離
し、微生物の新規機能を見出し利用したり、その天然環
境下における有害な活性を抑制することにおいても、単
離が困難な微生物種を分離することは必要である。
きない微生物種が多いにも拘わらず、その必要性は、食
品産業、医薬品産業、水質等の環境保全、医療等におい
て強く望まれている。また、深海などの極端な環境、ま
たはヒト等の高等動物、昆虫、土壌原生動物もしくは海
洋生物等の生物体内から、平板培養法では単離できな
い、したがって未だ単離されていない微生物種を単離
し、微生物の新規機能を見出し利用したり、その天然環
境下における有害な活性を抑制することにおいても、単
離が困難な微生物種を分離することは必要である。
【０００５】ゆえに、複数の微生物種が混在する試料か
ら、平板培養法では単離できないような単一の微生物種
を分離する方法の改善が強く望まれている。
ら、平板培養法では単離できないような単一の微生物種
を分離する方法の改善が強く望まれている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、種々の微生物種が混在する試料から、平板培養
法では単離が困難な微生物種を単離することができる方
法を開発することにある。
目的は、種々の微生物種が混在する試料から、平板培養
法では単離が困難な微生物種を単離することができる方
法を開発することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】上記課題は、微生物生細
胞を含む試料液中の微生物細胞をアガロースゲル微小粒
子中に包括すること、それによって少なくとも一部が一
個の微生物細胞を有するアガロースゲル微小粒子の集団
が得られ、上記アガロースゲル微小粒子集団を、上記試
料中に含まれている微生物の内平板培養法にてコロニー
を形成する微生物が増殖できるような増殖環境下におく
こと、および、上記増殖環境におかれたアガロースゲル
微小粒子集団から一個の微生物細胞を有するアガロース
ゲル微小粒子をセルソーターにより識別して分離するこ
と、により達成できた。
胞を含む試料液中の微生物細胞をアガロースゲル微小粒
子中に包括すること、それによって少なくとも一部が一
個の微生物細胞を有するアガロースゲル微小粒子の集団
が得られ、上記アガロースゲル微小粒子集団を、上記試
料中に含まれている微生物の内平板培養法にてコロニー
を形成する微生物が増殖できるような増殖環境下におく
こと、および、上記増殖環境におかれたアガロースゲル
微小粒子集団から一個の微生物細胞を有するアガロース
ゲル微小粒子をセルソーターにより識別して分離するこ
と、により達成できた。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明の方法において取り扱うこ
とができる微生物生細胞を含む試料は、土壌、泥、湖
水、河水、沼水、植物および動物等の温和な環境から採
取されるもの、深海、高温多湿地、極寒地、火山地、強
酸性地、高塩地、乾燥地および腐敗などにより少数の微
生物種が大量に存在する天然環境等の極端な環境から採
取されるもの、病院や食品工場における空気および活性
汚泥や食品加工産業原料（風味付け汁等）等の人工的環
境から採取されるもの、ならびに金属表面等の人工的特
殊環境から採取されるもの等、いかなるものも含まれ
る。
とができる微生物生細胞を含む試料は、土壌、泥、湖
水、河水、沼水、植物および動物等の温和な環境から採
取されるもの、深海、高温多湿地、極寒地、火山地、強
酸性地、高塩地、乾燥地および腐敗などにより少数の微
生物種が大量に存在する天然環境等の極端な環境から採
取されるもの、病院や食品工場における空気および活性
汚泥や食品加工産業原料（風味付け汁等）等の人工的環
境から採取されるもの、ならびに金属表面等の人工的特
殊環境から採取されるもの等、いかなるものも含まれ
る。
【０００９】単離できる微生物はその分類学的位置に拘
わることなく、すべての微生物種が含まれる。例えば、
真正細菌（細菌、放線菌等）、古細菌（好塩菌、高温好
酸菌、メタン生成菌等）、真核生物（真菌、藻類、原生
動物等）およびウイルス（ファージを含む）等である。
これらの微生物は、従来の微生物の単離方法（平板培養
法）においてはその生育培地（栄養）や環境を予め知っ
ている必要があったが、この発明の方法を用いる場合に
は、栄養や生育環境を知らなくとも、単一細胞の分離ま
では可能であり、本発明の著しい利点である。
わることなく、すべての微生物種が含まれる。例えば、
真正細菌（細菌、放線菌等）、古細菌（好塩菌、高温好
酸菌、メタン生成菌等）、真核生物（真菌、藻類、原生
動物等）およびウイルス（ファージを含む）等である。
これらの微生物は、従来の微生物の単離方法（平板培養
法）においてはその生育培地（栄養）や環境を予め知っ
ている必要があったが、この発明の方法を用いる場合に
は、栄養や生育環境を知らなくとも、単一細胞の分離ま
では可能であり、本発明の著しい利点である。
【００１０】採取された試料が固形物である場合は、採
取環境に近いｐＨや浸透圧等を配慮した水に懸濁し（こ
の段階で、特に極端な環境から採取された試料を取り扱
う場合、試料中の微生物を死滅させてはならない）、必
要により通常の生物より大きなサイズの粒子を適当な方
法で除く。次いで、試料中に含まれる菌数が多い試料に
ついては、通常試料中の菌数が１ｘ１０７／ｍｌになる
程度に希釈するのが好ましい。試料によっては、希釈度
を種々変えて試験する必要があることもある。
取環境に近いｐＨや浸透圧等を配慮した水に懸濁し（こ
の段階で、特に極端な環境から採取された試料を取り扱
う場合、試料中の微生物を死滅させてはならない）、必
要により通常の生物より大きなサイズの粒子を適当な方
法で除く。次いで、試料中に含まれる菌数が多い試料に
ついては、通常試料中の菌数が１ｘ１０７／ｍｌになる
程度に希釈するのが好ましい。試料によっては、希釈度
を種々変えて試験する必要があることもある。
【００１１】上記のような試料液中の微生物細胞をアガ
ロースゲル微小粒子中に包括せしめる。アガロースゲル
微小粒子中に微生物細胞を包括せしめると、アガロース
ゲル微小粒子集団中には、一個の微生物細胞しか有しな
いアガロースゲル微小粒子が含まれている。本発明にお
いては、一個の微生物細胞しか有しないアガロースゲル
微小粒子がその集団中に多いほど好ましい。
ロースゲル微小粒子中に包括せしめる。アガロースゲル
微小粒子中に微生物細胞を包括せしめると、アガロース
ゲル微小粒子集団中には、一個の微生物細胞しか有しな
いアガロースゲル微小粒子が含まれている。本発明にお
いては、一個の微生物細胞しか有しないアガロースゲル
微小粒子がその集団中に多いほど好ましい。
【００１２】そのような、一個の微生物細胞しか有しな
いアガロースゲル微小粒子がより多いアガロースゲル微
小粒子集団は、本発明者らの研究によれば、以下の方法
により得ることができる。
いアガロースゲル微小粒子がより多いアガロースゲル微
小粒子集団は、本発明者らの研究によれば、以下の方法
により得ることができる。
【００１３】先ず、上記試料溶液とアガロース溶液と
を、アガロースのゲル化温度より高い温度下にて、混合
する。溶液中アガロースの濃度は、使用するアガロー
ス、特にそのゲル化温度と、分離する微生物等に依存し
ているが、通常２％前後が好ましい。
を、アガロースのゲル化温度より高い温度下にて、混合
する。溶液中アガロースの濃度は、使用するアガロー
ス、特にそのゲル化温度と、分離する微生物等に依存し
ているが、通常２％前後が好ましい。
【００１４】アガロースはゲル化温度が低いものが望ま
しく、例示すれば、Ｓｉｇｍａ社のType VII （Low Gel
ling Temperature）が好ましい。高い温度でしか溶解し
ないアガロースを使用すると、以下の工程において試料
中の微生物を死滅させるおそれがある。
しく、例示すれば、Ｓｉｇｍａ社のType VII （Low Gel
ling Temperature）が好ましい。高い温度でしか溶解し
ないアガロースを使用すると、以下の工程において試料
中の微生物を死滅させるおそれがある。
【００１５】次に上記試料／アガロース混合液を乳化す
る。乳化は、どのような方法でもよく、例えば、内圧式
超小型膜乳化モジュール（例えばＳＰＧテクノ株式会社
製）を用いて行うことができる。
る。乳化は、どのような方法でもよく、例えば、内圧式
超小型膜乳化モジュール（例えばＳＰＧテクノ株式会社
製）を用いて行うことができる。
【００１６】内圧式乳化モジュールによる乳化は次のよ
うにして行う。アガロースがゲル化しない温度に予め調
整した油分（例えばミネラルオイル（Sigma社のLight W
hiteOil等））を入れた容器を適当な微細孔を有する膜
にて二室に分割し、一方の部屋は加圧できるようにし、
他方の部屋（加圧されていない）は攪拌できるようにす
る。アガロースがゲル化しない温度にした試料／アガロ
ース混合液を加圧室に滴下し加圧すると、加圧室から非
加圧室に膜の微細孔を通って液が通過し、攪拌されてい
る非加圧室にて乳化液が生成される。
うにして行う。アガロースがゲル化しない温度に予め調
整した油分（例えばミネラルオイル（Sigma社のLight W
hiteOil等））を入れた容器を適当な微細孔を有する膜
にて二室に分割し、一方の部屋は加圧できるようにし、
他方の部屋（加圧されていない）は攪拌できるようにす
る。アガロースがゲル化しない温度にした試料／アガロ
ース混合液を加圧室に滴下し加圧すると、加圧室から非
加圧室に膜の微細孔を通って液が通過し、攪拌されてい
る非加圧室にて乳化液が生成される。
【００１７】次いで、得られた乳化液をアガロースのゲ
ル化温度以下に冷却するとアガロースゲルの微小粒子が
形成される。必要により、アガロースゲル微小粒子を例
えば７０ミクロンナイロンメッシュに通し大きな粒子を
除く。
ル化温度以下に冷却するとアガロースゲルの微小粒子が
形成される。必要により、アガロースゲル微小粒子を例
えば７０ミクロンナイロンメッシュに通し大きな粒子を
除く。
【００１８】このような方法により、集団中の大部分の
アガロースゲル微小粒子が一個の微生物細胞しか有しな
いアガロースゲル微小粒子集団が得られる。
アガロースゲル微小粒子が一個の微生物細胞しか有しな
いアガロースゲル微小粒子集団が得られる。
【００１９】アガロースゲル微小粒子を包み込んでいる
細胞の数は、光学顕微鏡観察でも知ることができるが、
光学顕微鏡で観察できるアガロースゲル微小粒子の数
は、少数でしかあり得ない。
細胞の数は、光学顕微鏡観察でも知ることができるが、
光学顕微鏡で観察できるアガロースゲル微小粒子の数
は、少数でしかあり得ない。
【００２０】本発明者らの研究によれば、セルソーター
によっても、一個の微生物細胞を有するアガロースゲル
微小粒子を、それ以外のアガロースゲル微小粒子から識
別することができることがわかった。セルソーターを使
用することにより、極めて多くの数のアガロースゲル微
小粒子を観察することができ、それによって、集団中に
一個の微生物細胞を包括するアガロースゲル微小粒子の
存在頻度が低くとも、そのようなアガロースゲル微小粒
子を見出すことができるようになり、本発明の方法が実
施可能な方法となった。
によっても、一個の微生物細胞を有するアガロースゲル
微小粒子を、それ以外のアガロースゲル微小粒子から識
別することができることがわかった。セルソーターを使
用することにより、極めて多くの数のアガロースゲル微
小粒子を観察することができ、それによって、集団中に
一個の微生物細胞を包括するアガロースゲル微小粒子の
存在頻度が低くとも、そのようなアガロースゲル微小粒
子を見出すことができるようになり、本発明の方法が実
施可能な方法となった。
【００２１】上記微生物細胞を包み込んでいるアガロー
スゲル微小粒子集団を、上記試料中に含まれている微生
物の内、平板培養法にてコロニーを形成する微生物が増
殖できるような増殖環境下におく。かくして、平板培養
にてコロニーを形成することができる微生物種はアガロ
ースゲル微小粒子中においても通常増殖して、アガロー
スゲル微小粒子中にその微生物種の複数の細胞が存在す
るようになる。一方、平板培養において増殖できないよ
うな微生物種は、アガロースゲル微小粒子中においても
通常増殖することができず、アガロースゲル中の細胞数
は、増殖前の一個に止まっている。
スゲル微小粒子集団を、上記試料中に含まれている微生
物の内、平板培養法にてコロニーを形成する微生物が増
殖できるような増殖環境下におく。かくして、平板培養
にてコロニーを形成することができる微生物種はアガロ
ースゲル微小粒子中においても通常増殖して、アガロー
スゲル微小粒子中にその微生物種の複数の細胞が存在す
るようになる。一方、平板培養において増殖できないよ
うな微生物種は、アガロースゲル微小粒子中においても
通常増殖することができず、アガロースゲル中の細胞数
は、増殖前の一個に止まっている。
【００２２】「試料中に含まれている微生物の内、平板
培養法にてコロニー形成する微生物が増殖できるような
増殖環境」は、平板培養の培地（栄養）や環境（嫌気性
／好気性、ｐＨ、温度、浸透圧等）とほぼ同じである
が、固体培養（平板培養）と液体培養（アガロース微小
粒子の懸濁液）の相違による変更を平板培養の培地や環
境に加えなければならない場合には、例えば酸素や栄養
源としてのガス（例えば炭化水素ガス資化菌についての
炭化水素）の補給）等、必要な変更を平板培養の培地や
環境条件に加える。このようなことはこの分野ではよく
知られている。
培養法にてコロニー形成する微生物が増殖できるような
増殖環境」は、平板培養の培地（栄養）や環境（嫌気性
／好気性、ｐＨ、温度、浸透圧等）とほぼ同じである
が、固体培養（平板培養）と液体培養（アガロース微小
粒子の懸濁液）の相違による変更を平板培養の培地や環
境に加えなければならない場合には、例えば酸素や栄養
源としてのガス（例えば炭化水素ガス資化菌についての
炭化水素）の補給）等、必要な変更を平板培養の培地や
環境条件に加える。このようなことはこの分野ではよく
知られている。
【００２３】試料中に含まれている、または含まれてい
るであろう微生物がコロニーを形成できる平板培養の培
地や環境は、実際に予め試験することにより容易に知る
ことができる。また試料の分離源が当然わかっているの
で、そこに含まれているであろう微生物を推測すること
ができ、その推測に基づいて容易にそれら微生物が増殖
するであろう平板培養の培地や環境を推定することがで
きる。試料中に種々の微生物種が含まれていて、それぞ
れが異なる平板培養の培養条件でしか増殖できない場合
には、それら異なるそれぞれの増殖環境下にアガロース
ゲル微小粒子をおくのが好ましい。これによって、どの
ような条件でも分離できない微生物種を分離することが
できる確率が高くなる。
るであろう微生物がコロニーを形成できる平板培養の培
地や環境は、実際に予め試験することにより容易に知る
ことができる。また試料の分離源が当然わかっているの
で、そこに含まれているであろう微生物を推測すること
ができ、その推測に基づいて容易にそれら微生物が増殖
するであろう平板培養の培地や環境を推定することがで
きる。試料中に種々の微生物種が含まれていて、それぞ
れが異なる平板培養の培養条件でしか増殖できない場合
には、それら異なるそれぞれの増殖環境下にアガロース
ゲル微小粒子をおくのが好ましい。これによって、どの
ような条件でも分離できない微生物種を分離することが
できる確率が高くなる。
【００２４】上記増殖環境は、したがって、通常平板培
養法に用いれられる完全培地を使用する等、大多数の微
生物にとって望ましい環境である。しかし、古生物や極
端な環境から採取された試料を取り扱う場合には、古生
物やその試料中に含まれていることが予想される微生物
にとって望ましいと考えられる環境を配慮する必要があ
る。さもなければ殆ど全部が単細胞のままゲル中に止ま
ることになるか、あるいは多くの微生物が死滅するおそ
れさえもある。もちろん上記増殖環境は、すべての微生
物種が増殖するような環境である必要はなく（そのよう
な環境を整えることもできないが）、要するにある環境
下に置いて、よく増殖するものと死滅しないが増殖はで
きないものとを区別できればよいのである。
養法に用いれられる完全培地を使用する等、大多数の微
生物にとって望ましい環境である。しかし、古生物や極
端な環境から採取された試料を取り扱う場合には、古生
物やその試料中に含まれていることが予想される微生物
にとって望ましいと考えられる環境を配慮する必要があ
る。さもなければ殆ど全部が単細胞のままゲル中に止ま
ることになるか、あるいは多くの微生物が死滅するおそ
れさえもある。もちろん上記増殖環境は、すべての微生
物種が増殖するような環境である必要はなく（そのよう
な環境を整えることもできないが）、要するにある環境
下に置いて、よく増殖するものと死滅しないが増殖はで
きないものとを区別できればよいのである。
【００２５】具体的には、特に温和な環境から採取され
た試料については、培地について例示すれば、NUTRIENT
BROTH (DIFCO社)やTORYPTIC SOY BROTH (DIFCO社)を用
いたり、乳酸菌の分離を目指す場合にはGYP-S培地（１
％グルコース、１％酵母エキス、０．５％ペプトン、
０．２％酢酸ナトリウム、０．５％Tween80、０．５％
塩溶液、ｐＨ６．８）や酵母、酢酸菌、乳酸菌等の生育
に適したGYMP培地（１％グルコース、０．５％酵母エキ
ス、０．３％麦芽エキス、０．５％ペプトン、ｐＨ６．
０）等がある。
た試料については、培地について例示すれば、NUTRIENT
BROTH (DIFCO社)やTORYPTIC SOY BROTH (DIFCO社)を用
いたり、乳酸菌の分離を目指す場合にはGYP-S培地（１
％グルコース、１％酵母エキス、０．５％ペプトン、
０．２％酢酸ナトリウム、０．５％Tween80、０．５％
塩溶液、ｐＨ６．８）や酵母、酢酸菌、乳酸菌等の生育
に適したGYMP培地（１％グルコース、０．５％酵母エキ
ス、０．３％麦芽エキス、０．５％ペプトン、ｐＨ６．
０）等がある。
【００２６】次いで、セルソーターを使用して、上記増
殖環境下においた後も一個の微生物細胞しか含まないア
ガロースゲル微小粒子を識別し分離すれば、平板培養法
によりコロニーを形成しない微生物種の単一細胞を高い
確率で得ることができる。
殖環境下においた後も一個の微生物細胞しか含まないア
ガロースゲル微小粒子を識別し分離すれば、平板培養法
によりコロニーを形成しない微生物種の単一細胞を高い
確率で得ることができる。
【００２７】セルソーター（Flow cytometry and cell
sorting system, FC／CS）は、ここでは１５ｍＷの空冷
アルゴンイオンレーザーを搭載したEPICS ELITE ESP (C
oulter社)を使用したが、同様な機能を有するものであ
ればどのようなものでもよい。ここでは、フローセルの
ノズル部分は直径１００μｍのものを使用し、サンプル
は分離操作に入る前に孔径４０μｍのセルストライナー
を用いて不要な凝集塊を除いた。しかしこの前処理は、
必要により行えばよい。
sorting system, FC／CS）は、ここでは１５ｍＷの空冷
アルゴンイオンレーザーを搭載したEPICS ELITE ESP (C
oulter社)を使用したが、同様な機能を有するものであ
ればどのようなものでもよい。ここでは、フローセルの
ノズル部分は直径１００μｍのものを使用し、サンプル
は分離操作に入る前に孔径４０μｍのセルストライナー
を用いて不要な凝集塊を除いた。しかしこの前処理は、
必要により行えばよい。
【００２８】微生物（アガロースゲル微小粒子）の分別
・識別は、粒子の大きさを表すレーザー光の前方散乱光
強度（Forward scatter (FS)）、粒子の内部構造の複雑
性を表すレーザー光の側方散乱光強度（Side Scatter
(SS)）、および細胞が特定の蛍光染料により染色される
か否かを知ることができる蛍光強度（FL）の三個のパラ
メーターの内、二個（二次元）または三個（三次元）の
組み合わせにより行う。
・識別は、粒子の大きさを表すレーザー光の前方散乱光
強度（Forward scatter (FS)）、粒子の内部構造の複雑
性を表すレーザー光の側方散乱光強度（Side Scatter
(SS)）、および細胞が特定の蛍光染料により染色される
か否かを知ることができる蛍光強度（FL）の三個のパラ
メーターの内、二個（二次元）または三個（三次元）の
組み合わせにより行う。
【００２９】すなわち、一個しか微生物細胞を含まない
アガロースゲル微小粒子と複数個の微生物細胞を含むア
ガロースゲル微小粒子とは、ＦＳとＳＳとを用いて識別
することができる。また、必要があれば、生きている細
胞と死滅した細胞とは、例えばＣＦＤＡ(carboxyfluore
scein acetoxymethyl ester)やＣＦＤＡ―ＡＭ(carboxy
fuoresceindiacetate acetoxymethyl ester)等の生菌を
死滅させることなく蛍光染色できる色素を用いて（ＦＬ
シグナル）識別することができる。
アガロースゲル微小粒子と複数個の微生物細胞を含むア
ガロースゲル微小粒子とは、ＦＳとＳＳとを用いて識別
することができる。また、必要があれば、生きている細
胞と死滅した細胞とは、例えばＣＦＤＡ(carboxyfluore
scein acetoxymethyl ester)やＣＦＤＡ―ＡＭ(carboxy
fuoresceindiacetate acetoxymethyl ester)等の生菌を
死滅させることなく蛍光染色できる色素を用いて（ＦＬ
シグナル）識別することができる。
【００３０】ＦＳシグナルは、２°ないし２０°の散乱
光をフォトダイオードで検出し、ＳＳおよびＦＬシグナ
ルはレーザー光に対して９０°で集光し、４８８ｎｍ二
色長経路フィルター（dichroic long-pass filter）に
よってスプリットした光をフォトマルチプライヤーチュ
ーブで検出した。４８８ｎｍレーザーブロックフィルタ
ー(laser blocking filter)を用いることによって、自
家蛍光から散乱光フラクションを除いた。
光をフォトダイオードで検出し、ＳＳおよびＦＬシグナ
ルはレーザー光に対して９０°で集光し、４８８ｎｍ二
色長経路フィルター（dichroic long-pass filter）に
よってスプリットした光をフォトマルチプライヤーチュ
ーブで検出した。４８８ｎｍレーザーブロックフィルタ
ー(laser blocking filter)を用いることによって、自
家蛍光から散乱光フラクションを除いた。
【００３１】蛍光は５５０ｎｍ二色長経路フィルターで
分離し、５２５ｎｍパスフィルター（pass filter）を
通過したものをＦＬ１シグナル（５２０―５３０ｎｍ）
として測定し、６００ｎｍ二色長経路フィルターおよび
５７５バンドパスフィルター（band pass filter）を通
過したものをＦＬ２（５７０―５８０ｎｍ）として測定
し、６７５ｎｍバンドパスフィルターを通過したものを
ＦＬ３（６６５―６８５ｎｍ）として測定した。
分離し、５２５ｎｍパスフィルター（pass filter）を
通過したものをＦＬ１シグナル（５２０―５３０ｎｍ）
として測定し、６００ｎｍ二色長経路フィルターおよび
５７５バンドパスフィルター（band pass filter）を通
過したものをＦＬ２（５７０―５８０ｎｍ）として測定
し、６７５ｎｍバンドパスフィルターを通過したものを
ＦＬ３（６６５―６８５ｎｍ）として測定した。
【００３２】かくして単一細胞を単離でき、得られた単
一細胞について、その増殖条件を、検討し、増殖できる
ようにすれば、通常の平板培養条件では分離できない微
生物を分離したことになる。
一細胞について、その増殖条件を、検討し、増殖できる
ようにすれば、通常の平板培養条件では分離できない微
生物を分離したことになる。
【００３３】
【実施例】実施例１ ラクトバシルス・プランタルム（Lactobacillus planta
rum）ＮＲＩＣ１０７９を試験菌として用いた。これを
５ｍｌのＧＹＰ―Ｓ培地（ｐＨ６．８）を用いて３０℃
にて後期対数増殖期まで静置培養した。得られた培養液
を細胞数が１ｘ１０７／ｍｌとなるように顕微鏡下で観
察しながらリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈し
た。一方、アガロース（Sigma社、Type VII）の２％水
溶液を電子レンジにて３０秒間処理し、溶解させて４０
℃に保温した。
rum）ＮＲＩＣ１０７９を試験菌として用いた。これを
５ｍｌのＧＹＰ―Ｓ培地（ｐＨ６．８）を用いて３０℃
にて後期対数増殖期まで静置培養した。得られた培養液
を細胞数が１ｘ１０７／ｍｌとなるように顕微鏡下で観
察しながらリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈し
た。一方、アガロース（Sigma社、Type VII）の２％水
溶液を電子レンジにて３０秒間処理し、溶解させて４０
℃に保温した。
【００３４】上記微生物含有希釈液１ｍｌと上記アガロ
ース溶液１ｍｌとを混ぜ、４０℃にてボルテックスミキ
サーを用いてよく攪拌混合した。次にミネラルオイル
（Sigma社、Light white oil）を満たしたＳＰＧ膜（膜
乳化モジュール、ＳＰＧテクノ社）中に上記混合液をシ
リンジを用いて加圧下に同じミネラルオイル中に押し出
して乳化させた。得られた乳化物を氷冷下に５分おきア
ガロースをゲル化させた。これにＰＢＳを加えて遠心場
にて二回過剰ミネラルオイルを洗い落とし、次いでこれ
を７０μｍのストレーナーに通し、ストレーナーを通過
した画分を得た。
ース溶液１ｍｌとを混ぜ、４０℃にてボルテックスミキ
サーを用いてよく攪拌混合した。次にミネラルオイル
（Sigma社、Light white oil）を満たしたＳＰＧ膜（膜
乳化モジュール、ＳＰＧテクノ社）中に上記混合液をシ
リンジを用いて加圧下に同じミネラルオイル中に押し出
して乳化させた。得られた乳化物を氷冷下に５分おきア
ガロースをゲル化させた。これにＰＢＳを加えて遠心場
にて二回過剰ミネラルオイルを洗い落とし、次いでこれ
を７０μｍのストレーナーに通し、ストレーナーを通過
した画分を得た。
【００３５】得られたアガロースゲル微小粒子をＧＹＰ
―Ｓ液体培地５ｍｌ中（約１ｘ１０ ６粒子／５ｍｌ）に
３０℃にて１５時間インキュベートした（増殖環境下に
置いた）。これにインキュベート前アガロースゲル微小
粒子５ｍｌを混ぜセルソーターにチャージした。
―Ｓ液体培地５ｍｌ中（約１ｘ１０ ６粒子／５ｍｌ）に
３０℃にて１５時間インキュベートした（増殖環境下に
置いた）。これにインキュベート前アガロースゲル微小
粒子５ｍｌを混ぜセルソーターにチャージした。
【００３６】セルソーターは、１５ｍＷの空冷アルゴン
イオンレーザーを搭載したEPICS ELITE ESP（Coulter
社）を用いた。フローセルのノズル部分は直径１００μ
ｍであった。アガロースゲル微小粒子を含む試料は、事
前に孔径４０μｍのセルストレイナーに通して凝集塊を
除いた。ＦＳシグナルとして２°ないし２０°の散乱光
をフォトダイオードを用いて検出した。ＳＳシグナルは
レーザー光に対して９０°で集光し、４８８ｎｍ二色長
経路フィルターによってスプリットした光をフォトマル
チプライヤーチューブで検出した。また、４８８ｎｍレ
ーザーブロックフィルターを用いて自家蛍光から散乱光
部分を除いた。
イオンレーザーを搭載したEPICS ELITE ESP（Coulter
社）を用いた。フローセルのノズル部分は直径１００μ
ｍであった。アガロースゲル微小粒子を含む試料は、事
前に孔径４０μｍのセルストレイナーに通して凝集塊を
除いた。ＦＳシグナルとして２°ないし２０°の散乱光
をフォトダイオードを用いて検出した。ＳＳシグナルは
レーザー光に対して９０°で集光し、４８８ｎｍ二色長
経路フィルターによってスプリットした光をフォトマル
チプライヤーチューブで検出した。また、４８８ｎｍレ
ーザーブロックフィルターを用いて自家蛍光から散乱光
部分を除いた。
【００３７】セルソーターサイトグラム（散乱光強度分
布および積分）は、インキュベート前アガロースゲル微
小粒子のＳＳシグナルの大きい一つの集団が観察される
（図１）。この集団のアガロースゲル微小粒子中には、
顕微鏡観察により一つのアガロースゲル微小粒子に一個
の細胞が存在していることが観察された。インキュベー
ト前アガロースゲル微小粒子とインキュベート後のアガ
ロースゲル微小粒子とを混ぜた場合には、セルソーター
サイトグラムによれば、上記一つの細胞を有するアガロ
ースゲル微小粒子と同じ位置の集団と、ＦＳおよびＳＳ
が各々高めにシフトして帯状になった集団に分離した
（図２）。帯状になっった集団は、顕微鏡観察の結果ア
ガロースゲル微小粒子中に複数の細胞を含んでいた。一
つの細胞を含むアガロースゲル微小粒子中の細胞は、Ｃ
ＦＤＡ染色により生きている細胞であることがわかっ
た。
布および積分）は、インキュベート前アガロースゲル微
小粒子のＳＳシグナルの大きい一つの集団が観察される
（図１）。この集団のアガロースゲル微小粒子中には、
顕微鏡観察により一つのアガロースゲル微小粒子に一個
の細胞が存在していることが観察された。インキュベー
ト前アガロースゲル微小粒子とインキュベート後のアガ
ロースゲル微小粒子とを混ぜた場合には、セルソーター
サイトグラムによれば、上記一つの細胞を有するアガロ
ースゲル微小粒子と同じ位置の集団と、ＦＳおよびＳＳ
が各々高めにシフトして帯状になった集団に分離した
（図２）。帯状になっった集団は、顕微鏡観察の結果ア
ガロースゲル微小粒子中に複数の細胞を含んでいた。一
つの細胞を含むアガロースゲル微小粒子中の細胞は、Ｃ
ＦＤＡ染色により生きている細胞であることがわかっ
た。
【００３８】実施例２ 活性汚泥曝気槽より採取した汚泥試料１ｇに生理食塩水
１０ｍｌを加えよく攪拌し、ガーゼ、次いで３５μｍの
ストレーナーに通した。得られた濾液を微生物を含む試
料液とした。
１０ｍｌを加えよく攪拌し、ガーゼ、次いで３５μｍの
ストレーナーに通した。得られた濾液を微生物を含む試
料液とした。
【００３９】この試料液について、実施例１に示した方
法によりアガロースゲル微小粒子を作製した。得られた
アガロースゲル微小粒子をNUTRIENT BROTH (DIFICO社)
５ｍｌ中（約１ｘ１０６粒子／５ｍｌ）に含ませ３０℃
にて２４時間振とうした。
法によりアガロースゲル微小粒子を作製した。得られた
アガロースゲル微小粒子をNUTRIENT BROTH (DIFICO社)
５ｍｌ中（約１ｘ１０６粒子／５ｍｌ）に含ませ３０℃
にて２４時間振とうした。
【００４０】インキュベート後のアガロースゲル微小粒
子を実施例１に示すようにしてセルソーターにより分割
した。その結果、NUTRIENT BROTH平板培養ではコロニー
を形成しない微生物を分離することができた。
子を実施例１に示すようにしてセルソーターにより分割
した。その結果、NUTRIENT BROTH平板培養ではコロニー
を形成しない微生物を分離することができた。
【００４１】実施例３ メロン腐敗物１ｇを生理食塩水１０ｍｌに懸濁し、懸濁
液を、ガーゼ、次いで３５μｍのストレーナーに通し、
得られた濾液を試料液とした。
液を、ガーゼ、次いで３５μｍのストレーナーに通し、
得られた濾液を試料液とした。
【００４２】この試料液について、実施例１に示した方
法によりアガロースゲル微小粒子を作製した。得られた
アガロースゲル微小粒子をＧＹＭＰ培地５ｍｌ（約１ｘ
１０ ６粒子／５ｍｌ）に含ませ、３０℃にて３時間イン
キュベートした。
法によりアガロースゲル微小粒子を作製した。得られた
アガロースゲル微小粒子をＧＹＭＰ培地５ｍｌ（約１ｘ
１０ ６粒子／５ｍｌ）に含ませ、３０℃にて３時間イン
キュベートした。
【００４３】次に、これに蛍光色素ＣＦＤＡを１０μモ
ル／ｍｌとなるように添加して、３０℃にてさらに一時
間インキュベートした。
ル／ｍｌとなるように添加して、３０℃にてさらに一時
間インキュベートした。
【００４４】インキュベート後のアガロースゲル微小粒
子を実施例１に示すようにしてセルソーターにより分割
した。
子を実施例１に示すようにしてセルソーターにより分割
した。
【００４５】その結果、アガロースゲル微小粒子のセル
ソーターサイトグラムは、増殖環境におく前にはおおむ
ね３つのグループ（サイトグラムを上下左右に四分割し
た左下、右上および右下区域のグループ）に分割された
（図３）。増殖環境においた後は、セルソーターサイト
グラムは、図４に示すように、右下区域のグループの割
合が減少していた。この右下区域グループのアガロース
ゲル微小粒子を採取して顕微鏡にて観察したところ一個
の細胞が含まれていて、生細胞ではあるが、ＧＹＭＰ平
板培養ではコロニーを形成することができなかった。
ソーターサイトグラムは、増殖環境におく前にはおおむ
ね３つのグループ（サイトグラムを上下左右に四分割し
た左下、右上および右下区域のグループ）に分割された
（図３）。増殖環境においた後は、セルソーターサイト
グラムは、図４に示すように、右下区域のグループの割
合が減少していた。この右下区域グループのアガロース
ゲル微小粒子を採取して顕微鏡にて観察したところ一個
の細胞が含まれていて、生細胞ではあるが、ＧＹＭＰ平
板培養ではコロニーを形成することができなかった。
【００４６】
【発明の効果】本発明の方法によれば、上に述べたよう
に、平板培養法では単離が困難な微生物種の単一細胞を
単離することができる。
に、平板培養法では単離が困難な微生物種の単一細胞を
単離することができる。
【図１】微生物細胞を包括しているアガロースゲル微小
粒子のセルソーターサイトグラム（散乱光強度分布およ
び積分）を示す。縦軸は側方散乱光強度（ＳＳ）を、横
軸は前方散乱光（ＦＳ）強度を、それぞれ表す。
粒子のセルソーターサイトグラム（散乱光強度分布およ
び積分）を示す。縦軸は側方散乱光強度（ＳＳ）を、横
軸は前方散乱光（ＦＳ）強度を、それぞれ表す。
【図２】微生物細胞を包括しているアガロースゲル微小
粒子のセルソーターサイトグラム（散乱光強度分布およ
び積分）を示す。縦軸は側方散乱光強度（ＳＳ）を、横
軸は前方散乱光（ＦＳ）強度を、それぞれ表す。
粒子のセルソーターサイトグラム（散乱光強度分布およ
び積分）を示す。縦軸は側方散乱光強度（ＳＳ）を、横
軸は前方散乱光（ＦＳ）強度を、それぞれ表す。
【図３】微生物細胞を包括しているアガロースゲル微小
粒子のセルソーターサイトグラム（散乱光強度分布およ
び積分）を示す。縦軸は５２０―５３０ｎｍ蛍光強度
（ＦＬ１）を、横軸は側方散乱光（ＳＳ）強度を、それ
ぞれ表す。
粒子のセルソーターサイトグラム（散乱光強度分布およ
び積分）を示す。縦軸は５２０―５３０ｎｍ蛍光強度
（ＦＬ１）を、横軸は側方散乱光（ＳＳ）強度を、それ
ぞれ表す。
【図４】微生物細胞を包括しているアガロースゲル微小
粒子のセルソーターサイトグラム（散乱光強度分布およ
び積分）を示す。縦軸は５２０―５３０ｎｍ蛍光強度
（ＦＬ１）を、横軸は側方散乱光（ＳＳ）強度を、それ
ぞれ表す。
粒子のセルソーターサイトグラム（散乱光強度分布およ
び積分）を示す。縦軸は５２０―５３０ｎｍ蛍光強度
（ＦＬ１）を、横軸は側方散乱光（ＳＳ）強度を、それ
ぞれ表す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 土田 隆康 神奈川県横浜市戸塚区上倉田町1730−13 (72)発明者 馬目 章 茨城県つくば市千現１−20−13 レオパレ ス菊305号 (72)発明者 倉根 隆一郎 茨城県つくば市東一丁目１番３ 工業技術 院生命工学工業技術研究所内 Ｆターム(参考） 4B033 NA01 NA11 NA12 NA13 NB02 NB43 NB50 NB62 NC06 ND03 ND12 ND20 NF06 4B065 AA01X AA30X AA57X AA83X AA86X AA95X BB10 BB18 BB26 BC01 BD05 BD07 BD50 CA60
Claims (2)
- 【請求項１】 微生物生細胞を含む試料液中の微生物細
胞をアガロースゲル微小粒子中に包括すること、それに
よって少なくとも一部が一個の微生物細胞を有するアガ
ロースゲル微小粒子の集団が得られ、 上記アガロースゲル微小粒子集団を、上記試料中に含ま
れている微生物の内平板培養法にてコロニーを形成する
微生物が増殖できるような増殖環境下におくこと、およ
び上記増殖環境におかれたアガロースゲル微小粒子集団
から一個の微生物細胞を有するアガロースゲル微小粒子
をセルソーターにより識別して分離すること、からなる
微生物の単離方法。 - 【請求項２】 上記アガロースゲル微小粒子中への微生
物細胞の包括が、アガロースのゲル化温度より高い温度
にて、アガロース溶液と上記試料液とを混合し、得られ
た混合液に油分を加えて乳化物を形成させ、次いで、得
られた乳化物の温度をアガロースのゲル化温度より低い
温度にしてアガロースをゲル化させることにより調製さ
れる、請求項１に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP00224199A JP4257958B2 (ja) | 1999-01-07 | 1999-01-07 | 微生物の単離方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP00224199A JP4257958B2 (ja) | 1999-01-07 | 1999-01-07 | 微生物の単離方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000197479A true JP2000197479A (ja) | 2000-07-18 |
| JP4257958B2 JP4257958B2 (ja) | 2009-04-30 |
Family
ID=11523871
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP00224199A Expired - Lifetime JP4257958B2 (ja) | 1999-01-07 | 1999-01-07 | 微生物の単離方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4257958B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010041967A (ja) * | 2008-08-13 | 2010-02-25 | Waseda Univ | 微生物の単離培養方法及び培養キット |
| JP2014508516A (ja) * | 2011-01-28 | 2014-04-10 | アミリス， インコーポレイテッド | ゲルに封入されたマイクロコロニーのスクリーニング |
| WO2020255637A1 (ja) * | 2019-06-17 | 2020-12-24 | 国立大学法人東京大学 | 培養方法 |
-
1999
- 1999-01-07 JP JP00224199A patent/JP4257958B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010041967A (ja) * | 2008-08-13 | 2010-02-25 | Waseda Univ | 微生物の単離培養方法及び培養キット |
| JP2014508516A (ja) * | 2011-01-28 | 2014-04-10 | アミリス， インコーポレイテッド | ゲルに封入されたマイクロコロニーのスクリーニング |
| WO2020255637A1 (ja) * | 2019-06-17 | 2020-12-24 | 国立大学法人東京大学 | 培養方法 |
| JP2020202778A (ja) * | 2019-06-17 | 2020-12-24 | 国立大学法人 東京大学 | 培養方法 |
| CN113966386A (zh) * | 2019-06-17 | 2022-01-21 | 国立大学法人东京大学 | 培养方法 |
| JP7344016B2 (ja) | 2019-06-17 | 2023-09-13 | 国立大学法人 東京大学 | 培養方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4257958B2 (ja) | 2009-04-30 |
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