JP6918308B2 - 核酸の検出方法及びそのためのキット - Google Patents

Description

本発明は、例えばマイクロＲＮＡのような、試料中の核酸の検出方法に関する。

近年、マイクロＲＮＡ(miRNA)が、がんやその他の疾患のバイオマーカーとして注目されている。従来、特定の塩基配列を持つmiRNAの検出は、次世代シークエンサーによるダイレクトシーケンシングや、逆転写リアルタイムＰＣＲを駆使して行われている。しかしながら、これらの方法では、高価な装置が必要であり、また、検出に時間がかかる。

本願発明者らは、先に、脂質二重膜中に形成されたナノポアにmiRNAを通過させることにより、miRNAを検出する方法を提案した（非特許文献１）。しかしながら、この方法では、塩基配列特異性が低く、所定の塩基配列を持つ標的miRNA以外のmiRNAも検出されてしまうという問題がある。

T. Osaki, K. Kamiya, S. Fujii, and S. Takeuchi, Proc. MEMS 2016, 315 (2016)

本発明は、miRNAのような核酸を、高価な装置を必要とすることなく、短時間に、かつ、塩基配列特異的に検出することができる、核酸の検出方法及びそのためのキットを提供することである。

本願発明者らは、鋭意研究の結果、標識されたリポソームに結合され、支持体に固定化された又は支持体に固定化可能なように修飾された、前記標的核酸と相補的な塩基配列を含む、リポソーム結合一本鎖核酸と標的核酸とをハイブリダイズさせ、形成された二本鎖核酸に二本鎖特異的ヌクレアーゼを作用させて核酸を切断して標識を有するリポソームを遊離させ、この遊離されたリポソームの標識を検出することにより、塩基配列特異的に標的核酸を検出できることに想到し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、特定の塩基配列を持つ、試料中の標的核酸の検出方法であって、
前記標的核酸とリポソーム結合一本鎖核酸をハイブリダイズさせて二本鎖核酸を形成する、二本鎖核酸形成段階であって、前記リポソーム結合一本鎖核酸は、標識されたリポソームが一本鎖核酸に結合されて、かつ、支持体に固定化された又は支持体に固定化可能なように修飾され、前記標的核酸と相補的な塩基配列を含むものである、二本鎖核酸形成段階と、
形成された二本鎖核酸に、二本鎖特異的ヌクレアーゼを作用させて核酸を切断し、前記リポソームを遊離させる、リポソーム遊離段階と、
遊離したリポソームが持つ前記標識を検出する、標識検出段階とを含み、
前記標識がナノポアを持つ物質であり、該物質が前記リポソームと融合して該リポソームにナノポアが形成されており、前記標識検出段階は、遊離したリポソームのみを選択的に脂質二重膜と融合させ、該脂質二重膜にナノポアを形成する、ナノポア形成段階と、形成されたナノポアにイオンを通過させ、その際の電流を測定する、電流測定段階とを含む、
標的核酸の検出方法を提供する。

また、本発明は、標識されたリポソームに結合され、支持体に固定化された又は支持体に固定化可能なように修飾された、標的核酸と相補的な塩基配列を持つ一本鎖核酸を含み、前記標識が、ナノポアを持つ物質である、上記本発明の方法を行うためのキットを提供する。

本発明によれば、miRNAのような核酸を、高価な装置を必要とすることなく、短時間に、かつ、塩基配列特異的に検出することができる。

本発明の実施例で作製した、ナノポアを有するリポソームが結合され、他端に磁性粒子が結合された、リポソーム結合一本鎖核酸の模式図である。 液滴接触法により脂質二重膜を形成する方法を説明するための模式図である。 本発明の方法において電流測定に好ましく用いることができるダブルウェルチャンバー(DWC)と電流測定回路の模式図である。 本発明の第２の実施形態を説明するための模式図である。 本発明の実施例で得られた、イオン電流の測定結果を示す図である。 本発明の実施例で得られた、イオン電流の測定結果を示す図である。

本発明の好ましい態様である、前記標識がナノポアを持つ物質であり、該物質が前記リポソームと融合して該リポソームにナノポアが形成されており、前記標識検出段階は、遊離したリポソームのみを選択的に脂質二重膜と融合させ、該脂質二重膜にナノポアを形成する、ナノポア形成段階と、形成されたナノポアにイオンを通過させ、その際の電流を測定する、電流測定段階とを含む態様について説明する。この態様には、大別して第１の実施形態と第２の実施形態がある。以下、それぞれについて説明する。

１． 第１の実施形態
まず、本発明の好ましい一実施形態である、二本鎖核酸形成段階と、リポソーム遊離段階とを第１の容器（例えば試験管）内で行い、ナノポア形成段階と電流測定段階とを第２の容器（例えばダブルウェルチャンバー(DWC)）内で行う方法について説明する。

(1) 標的核酸
本発明の方法により検出すべき試料中の標的核酸としては、検出することが望まれる、特定の塩基配列を持つ核酸であれば特に限定されず、ＤＮＡでもＲＮＡでもよいが、ＲＮＡは、後述する二本鎖特異的ヌクレアーゼにより切断されないのでＲＮＡの方が好ましい。ここで、「特定の塩基配列」は、検出が望まれる核酸の既知の塩基配列である。ここで、「既知の塩基配列」とは、本発明の方法を実施する者にとって既知という意味であり、必ずしも公知である必要はない。「特定の塩基配列を持つ核酸」とは、その核酸の塩基配列が、その特定の塩基配列と同一であることを意味する。標的核酸のサイズは、特に限定されないが、検出特異性の観点から、塩基数が１８〜４０個のものが好ましく、特に２０〜２５個のものが好ましい。特にがんやその他の疾患のバイオマーカーとして注目を集めているmiRNAが好ましい。また、標的核酸を含む試料としては、特に限定されないが、生体から分離された体液又はその希釈物が好ましく、特に血液試料（全血、血清、血漿を包含する）又はその希釈物が好ましい。

(2) リポソーム結合一本鎖核酸
本実施形態の方法では、ナノポアを有するリポソームに結合され、支持体に固定化可能なように修飾された、前記標的核酸と相補的な塩基配列を含む、リポソーム結合一本鎖核酸が用いられる。下記実施例で作製した、好ましいリポソーム結合一本鎖核酸の模式図を図１に示す。図１中、上段右側の図が、磁気粒子１０に多数（図１では４個）のリポソーム結合一本鎖核酸１２が結合されている様子を示す模式図であり、図１の下段が、各リポソーム結合一本鎖核酸１２を拡大して示す模式図、図１の上段左側の図が、リポソーム結合一本鎖核酸１２中のリポソーム部分を拡大して示す模式図である。なお、図示される各要素の形状や寸法比率は実物とは異なる。図１の下段の図に示されるように、一本鎖核酸１２の末端（図示の例では５’末端）にはコレステロール１４を介してリポソーム１６が結合されている。このリポソーム１６の拡大模式図が図１の上段左側に示されている。リポソーム１６は、脂質二重膜１８から成り、この脂質二重膜１８に所々（図示の例では３箇所）、チャネルタンパク質であるα−ヘモリシン２０が融合している。α−ヘモリシン２０は、ナノポアを持つチャネルタンパク質であるので、α−ヘモリシン２０が融合している部分には、ナノポア２２が形成されている。これにより、このリポソーム１６は、ナノポア２２を有することになる。一方、一本鎖核酸１２の、リポソーム１６とは反対側の末端（図示の例では３’末端）には、ビオチン２４が結合され、このビオチンと、磁性粒子１０上に固定化されているストレプトアビジン２６との特異的結合により、一本鎖核酸１２が磁性粒子１０に結合されている。

以下、図１に例示されるようなリポソーム結合一本鎖核酸について説明する。

一本鎖核酸の一端にリポソームを結合する方法自体は公知である。すなわち、例えば、一本鎖核酸の一末端（５’末端又は３’末端）にコレステロールを結合し、一方、常法によりリポソームを形成し、このコレステロール結合一本鎖核酸とリポソームとを接触させることにより、コレステロールを介してリポソームと一本鎖核酸とが結合される。一本鎖核酸の一端にコレステロールを結合する方法は公知であり、例えば、コレステリル-トリエチレングリコール-ホスホラミダイトを、10%テトラヒドロフランのアセトニトリル溶液に溶解し、一本鎖核酸と混合して15分室温でインキュベートし、次いで10%ジエチルアミンを含むアセトニトリルで処理することにより行うことができる。なお、所望の塩基配列を持つ一本鎖核酸の一末端に、コレステロールが結合されたコレステロール結合一本鎖核酸を合成する商業サービスも存在するので、このような商業サービスを利用することも可能である。

上記リポソームはナノポアを有する。ナノポアは、直径がナノメートルのオーダーの微小な透孔である。ナノポアは、リポソームの外側と内側に向かって開口しており、イオンが通過可能なものである。ナノポアを持つ物質としては、このようなサイズのチャネルを持つチャネルタンパク質を好ましく用いることができる。チャネルタンパク質は、分子内にチャネルと呼ばれる透孔を有するタンパク質であり、生体内ではこのチャネルを介して各種イオン等の輸送が行われる。チャネルタンパク質としては、α−ヘモリシン、外膜タンパク質(Outer membrane protein) F (OmpF)、マイコバクテリウム・スメグマチスポリン(Mycobacterium smegmatis porin) A （MspA）、ストレプトリジンO等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。また、リポソームのような脂質二重膜に形成することが可能な、このような透孔として、金属錯体や人工ペプチドも利用することができる。ここで、利用可能な金属錯体としては、MOP(Metal organic polyhedra)を挙げることができる。また、利用可能な人工ペプチドとしては、相互に架橋を施し透孔を安定化した人工アラメチシンを挙げることができる。これらは、脂質二重膜に保持可能であることが報告されている。

これらのナノポアを持つ物質を、リポソームの脂質二重膜に保持することにより、ナノポアを持つリポソームを調製することができる。α−ヘモリシンのようなチャネルタンパク質は、生体内では、脂質二重膜である細胞膜等に保持されているので容易に脂質二重膜に保持させることができる。すなわち、チャネルタンパク質の存在下でリポソームを形成したり、リポソーム形成後にチャネルタンパク質をリポソームと接触させることによりリポソームの脂質二重膜にチャネルタンパク質を保持させることができる（例えば、特開2014-100672号公報、特開2015-077559号公報等）。また、下記実施例では、リポソーム形成後に、リポソーム存在下で、無細胞系タンパク質合成キット（市販品）を用いて、α−ヘモリシン遺伝子を発現させ、生産されたα−ヘモリシンをリポソームの脂質二重膜に保持しているが、このような方法も可能である。

前記リポソーム結合一本鎖核酸は、支持体に固定化可能なように修飾されている。ここで、支持体は、固相であれば特に限定されないが、好ましくは、容器の内面（側面及び／又は底面）である。リポソーム結合一本鎖核酸は、支持体に固定化可能なように修飾されている。これは、例えば、リポソーム結合一本鎖核酸の、リポソームとは反対側の末端に磁性粒子（「磁気ビーズ」とも呼ばれる）を結合することにより行うことができる。磁性粒子は、容器の外部から磁場をかけることにより、容器の内面に固定化することができるので、一末端に磁性粒子を結合することは、「支持体に固定化可能なように修飾されている」に該当する。磁性粒子としては、アミノ基やカルボキシル基等の種々の官能基を表面に有するものが市販されているので、カルボジイミド等のカップリング剤を用いて核酸を支持体に共有結合することができる。また、磁性粒子として、表面にストレプトアビジンを固定化したものも市販されており、これを用いることもできる（図１参照）。この場合には、リポソーム結合一本鎖核酸の、リポソームとは反対側の末端にビオチンを結合し、このビオチンをストレプトアビジンと結合させることにより、該末端に磁性粒子を結合することができる。なお、核酸の一端にビオチンを結合することは広く行われており、所望の塩基配列を持つ一本鎖核酸の一端にビオチンを結合したものを合成する商業サービスも存在する。あるいは、磁性粒子以外の粒子（ビーズ）であって、支持体に固定化可能な粒子に結合したものであってもよい。例えば、ストレプトアビジンが固定化されたアガロースビーズが市販されているので、上記と同様にリポソーム結合一本鎖核酸の一端にビオチン結合して、ストレプトアビジン固定化アガロースに結合したものであってもよい。ストレプトアビジン固定化アガロースは、第２の容器の内面にビオチンを固定化しておけば、余剰のストレプトアビジンとビオチンとの結合により第２の容器の内面に固定化可能である。さらに、リポソーム結合一本鎖核酸の一端にビオチン結合したものであってもよい。この場合、第２の容器の内面にストレプトアビジンを固定化しておけば、リポソーム結合一本鎖核酸を第２の容器の内面に固定化することが可能である。

リポソーム結合一本鎖核酸は、検出すべき標的核酸と相補的な塩基配列を含む。ここで、「相補的な」とは、完全に相補的である場合のみならず、完全に相補的ではなくても、塩基配列に基づいて特異的に結合可能な程度の相補性を持つ場合も包含される。通常、ミスマッチの塩基数が２個以下の場合には許容可能な程度に相補的である。もっとも、完全に相補的であることが好ましい。

リポソーム結合一本鎖核酸のサイズは、標的核酸と同じであってもよいが、ハイブリダイゼーションの効率を高める観点から、標的核酸よりも長いことが好ましい。リポソーム結合一本鎖核酸と標的核酸がハイブリダイズした状態で、リポソーム結合側及びその反対側の末端に３〜１０塩基程度の一本鎖領域が存在するようにリポソーム結合一本鎖核酸のサイズと、標的核酸との相補領域の位置を設定することが好ましい。

(3) 二本鎖核酸形成段階
次に、標的核酸と前記リポソーム結合一本鎖核酸をハイブリダイズさせて二本鎖核酸を形成する。この二本鎖核酸形成段階では、標的核酸が二本鎖核酸である場合、まず、試料を標的核酸の変性温度（通常、９４℃〜９９℃、好ましくは９８℃）に維持して変性処理を行う。標的核酸の変性を十分行うために、変性温度で、１５秒〜６０秒程度維持することが好ましい。なお、標的核酸が一本鎖核酸の場合には変性処理は不要であるが、一本鎖であっても、分子内ハイブリダイゼーション等によりループ等の二次的な構造を取ることが少なくないので、一本鎖核酸の場合でも変性処理を行うことが好ましい。

変性処理後、試料を冷却して、試料温度を標的核酸の融解温度(Tm)よりも低くかつ二本鎖特異的ヌクレアーゼの作用温度範囲内まで低下させる。冷却後、上記したリポソーム結合一本鎖核酸及び、好ましくは、二本鎖特異的ヌクレアーゼを添加する。添加するリポソーム結合一本鎖核酸の量は、想定される試料中の標的核酸よりも過剰量であることが好ましく、特に限定されないが、通常、反応液中の終濃度として、一本鎖核酸の濃度で、通常、0.0１nM〜10000nM程度、好ましくは、0.1nM〜100nM程度である。なお、二本鎖核酸の融解温度は、核酸の鎖長とGC含量から周知の計算式により計算可能であり、多くのマイクロＲＮＡでは、５０℃〜６０℃程度である。二本鎖特異的ヌクレアーゼは、至適温度は５０℃前後であるが、作用温度範囲は広く、室温下でも作用する。酵素反応の効率の観点からは、至適温度近辺を採用することが望ましいが、磁性粒子等の粒子との結合にストレプトアビジンを用いている場合には、ストレプトアビジンの熱変性を防止する上で、より低い温度を採用することが好ましく、室温から４０℃程度、さらには、３７℃±２℃程度の温度を採用することが好ましい。この冷却過程は、単に変性温度（例えば９８℃）に設定された恒温槽から、冷却後の最終温度（例えば３７℃）に設定された恒温槽に第１の容器を移すことにより行うことができる。また、反応液の媒体として用いられる緩衝液も、特に限定されず、通常のハイブリダイゼーションにおいて常用されているものであって、二本鎖特異的ヌクレアーゼが作用可能（好ましくはマグネシウムイオンを含む）な緩衝液であればよい。なお、最後の電流測定段階では、脂質二重膜内に形成されたナノポアを通過するイオン電流を測定するので、水溶液の液滴には、カリウム塩のような、水中で電離して陽イオンを生じる物質を含めておくことが好ましい。

この段階において、試料中に標的核酸が含まれていない場合には、ハイブリダイゼーションは起きず、二本鎖は形成されない。

(4) リポソーム遊離段階
次に、形成された二本鎖核酸に、二本鎖特異的ヌクレアーゼを作用させて核酸を切断し、前記リポソームを遊離させる。この段階は、二本鎖特異的ヌクレアーゼの存在下、反応液の温度を二本鎖特異的ヌクレアーゼの作用温度範囲内に維持することにより行うことができる。反応液中の二本鎖特異的ヌクレアーゼの終濃度は、特に限定されないが、通常、１unit/ml〜500unit/ml程度、好ましくは10unit/ml〜100unit/ml程度である。リポソーム遊離段階の時間は、特に限定されないが、１５分以上が好ましく、２０分〜１時間程度が好ましい。

なお、変性処理後の試料を冷却後、リポソーム結合一本鎖核酸のみを試料に添加して二本鎖形成段階を行い、次いで、二本鎖特異的ヌクレアーゼを添加してリポソーム遊離段階を行うことも可能であるが、リポソーム結合一本鎖核酸と二本鎖特異的ヌクレアーゼを同時又は連続的に添加して、二本鎖形成段階とリポソーム遊離段階とを同時並行的に行うことが効率の観点から好ましい。この場合、個々の分子に着目すれば、先に二本鎖が形成され、次いでリポソームが遊離されるので、二本鎖形成段階が先にあって、次にリポソーム遊離段階があるが、反応液全体でみれば、二本鎖形成段階とリポソーム遊離段階は、同時並行的に進行する。

リポソーム遊離段階では、二本鎖特異的ヌクレアーゼの作用により、二本鎖核酸のみが選択的に切断される。切断の結果、リポソーム結合一本鎖核酸から、リポソームが遊離する。ただし、通常、リポソームには、切断された一本鎖核酸の断片は結合しているが、後のナノポア形成段階では問題なく脂質二重膜にナノポアが形成されるので、「リポソームが遊離する」は、リポソームに切断後の一本鎖核酸の断片が結合したリポソームが遊離する場合を包含する。一方、標的核酸と二本鎖を形成しなかったリポソーム結合一本鎖核酸は、切断されないので、リポソームは一本鎖核酸から遊離されない。すなわち、試料中に、標的核酸が含まれていない場合には、リポソームは一本鎖核酸から遊離されない。二本鎖特異的ヌクレアーゼとしては、ＤＮＡのみを切断するものが好ましい。このような二本鎖特異的ヌクレアーゼを用いると、標的核酸がマイクロＲＮＡのようなＲＮＡで、一本鎖核酸がＤＮＡの場合、ＤＮＡのみが切断され、ＲＮＡである標的核酸は切断されない。このため、ＤＮＡの切断後、標的ＲＮＡが再び一本鎖となって、異なるリポソーム結合一本鎖核酸とハイブリダイズし、先に述べたメカニズムにより再度リポソームが遊離され、これが繰り返される。したがって、１分子の標的ＲＮＡが、複数のリポソームを次々に遊離させることができ、標的ＲＮＡの検出感度が向上する。このように、１分子の標的ＲＮＡが、複数のリポソームを次々に遊離させる場合には、反応液全体としてみれば、二本鎖形成段階とリポソーム遊離段階は、同時並行的に行われている。なお、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＤＮＡのみを切断する二本鎖特異的ヌクレアーゼは市販されているので、市販品を好ましく用いることができる。

(5) ナノポア形成段階
(i) 脂質二重膜の形成
次に、第２の容器（好ましくはDWC)内に脂質二重膜を形成する。脂質二重膜の形成方法は、周知であり、例えば、一般的な脂質二重膜形成法である液滴接触法により形成することができる。この方法は、有機溶媒中に形成した二つの脂質単分子膜を接触させることで、接触界面に脂質二重膜を形成する周知の方法であり、例えば特開2012-81405号公報、特開2014-100672号公報及び特開2015-077559号公報等に記載されており、下記実施例にも具体的に記載されている。好ましい具体例では、第２の容器として、下記実施例に記載するようなダブルウェルチャンバー(DWC)を用い、DWCの境界部分に脂質二重膜を形成することができる。すなわち、DWCの２つのチャンバーのそれぞれに脂質二重膜形成性脂質溶液を添加し、各チャンバーに水又は水溶液を添加して前記脂質溶液中に水又は水溶液の液滴を形成させ、この状態で放置して２つの液滴の接触部分に脂質二重膜を形成させることができる。DWCを用いて液滴接触法により形成された脂質二重膜の模式図を図２に示す。図２中、２８ａ、２８ｂは、DWCの各チャンバー内にそれぞれ形成された、脂質単分子膜で囲包された水性液滴であり、それらの周囲は、脂質３２を含む有機溶媒である。DWCの各チャンバーの境界部分で、各脂質単分子膜が接触し、この部分に脂質二重膜３０が形成される。なお、脂質二重膜の形成方法は、液滴接触法に限定されるものではなく、種々の公知の方法を包含するいずれの方法により形成されたものであってもよい。

脂質二重膜を形成後、リポソーム遊離段階後の反応液を添加してもよいが、脂質二重膜を形成する際、一方のチャンバーに添加する水溶液として、リポソーム遊離段階後の反応液を用いることが好ましい。

次に、リポソーム遊離段階で遊離したリポソームのみを選択的に前記脂質二重膜と融合させ、該脂質二重膜にナノポアを形成する。リポソームと脂質二重膜との融合は、単にリポソームが脂質二重膜と接触することにより自動的に行われる。試料中に標的核酸が存在する場合、リポソーム遊離段階後の反応液中には、一本鎖核酸から遊離したリポソームと、一本鎖核酸に結合されたままのリポソームが混在している。このうち、一本鎖核酸から遊離したリポソームのみを選択的に脂質二重膜と融合させる。これは、リポソーム結合一本鎖核酸として、上記した、磁性粒子に結合したものを用い、第２の容器の外部から磁場をかけることにより容易に行うことができる。すなわち、第２の容器の外部から磁場をかけた状態で、第２の容器にリポソーム遊離段階後の反応液を添加すると、切断されなかったリポソーム結合一本鎖核酸は、磁性粒子が磁力により引っ張られて第２の容器の内面に固定化される。磁性粒子は、添加直後から、第２の容器の内面に向かって引っ張られているので、リポソーム結合一本鎖核酸のリポソームは、脂質二重膜と融合できない。これに対し、リポソーム遊離段階で、一本鎖核酸が切断されて遊離したリポソームには、もはや磁性粒子が結合していないので、磁力によって第２の容器の内面に向かって引っ張られることがないので、リポソームが脂質二重膜と十分に接触して融合し、脂質二重膜内にナノポアが形成される。同様に、第２の容器内面にビオチン又はアビジンを固定化し、リポソーム結合一本鎖核酸として、ビオチン修飾したもの又は、ストレプトアビジン固定化アガロースビーズに結合したものを用いる場合も、ビオチン−アビジン結合は極めて親和性が高いので、磁性粒子を用いた場合と同様、遊離したリポソームのみが脂質二重膜と融合すると考えられる。なお、第２の容器としては、上記のとおりDWCが好ましく、この場合、リポソーム遊離段階からの反応液は、DWCの２個のチャンバーのうちの片方又は両方に添加される（両方のチャンバーに添加する場合であって、磁性粒子を用いる場合は、両チャンバーの外側から磁場をかける）。なお、ナノポア形成段階は、上記したリポソーム遊離段階と同程度の温度下で行うことも可能であるが、室温下でも十分反応が進むので、室温下で行うことが簡便である。

以上から明らかなように、試料中に標的核酸が含まれていない場合には、リポソーム遊離段階でリポソームが遊離しないので、脂質二重膜中にナノポアは形成されず、従って、次の電流測定段階では、電流は測定されない。

(6) 電流測定段階
次に、上記のようにして、脂質二重膜に形成されたナノポアを通過するイオン電流を測定する。イオン電流が生じるためには、上記のとおり、二本鎖核酸形成／リポソーム遊離段階に用いる緩衝液中に、カリウム塩のような水中で電離して陽イオンを生じる物質を含有させておくことが好ましい。なお、脂質二重膜に形成されたナノポアを通るイオン電流を測定することは、公知であり、例えば、上記した特開2014-100672号公報、特開2015-077559号公報等に記載されている。

第２の容器としてDWCを用いた場合の、イオン電流測定のための回路の好ましい１例を図３に模式的に示す。図３中、３０は脂質二重膜、３３はDWC、３４はリポソーム遊離段階後の反応液、３５は、もう一方のチャンバーに添加した水溶液、３６は、有機溶媒中の脂質溶液、３８は、Ag/AgCl電極のような電極、４０はパッチアンプ回路である。計測は、印加電圧を30mV〜120mV程度、サンプリングレートを1kHz〜10kHz程度、ローパスフィルターを0.5kHz〜2kHz程度に設定して行うことができるが、計測条件は、これに限定されるものではない。

試料中に標的核酸が存在する場合、上記のとおり、ナノポア形成段階で脂質二重膜中にナノポアが形成されるので、このナノポアを通るイオン電流が測定される。一方、試料中に標的核酸が存在しない場合には、ナノポア形成段階で脂質二重膜中にナノポアが形成されないので、ナノポアを通るイオン電流は測定されない。したがって、測定電流の有無により、試料中の標的核酸を検出することが可能になる。

なお、ナノポア形成段階と同時に電流測定を開始することも可能であり、この場合、ナノポア形成段階と電流測定段階は、同時並行で行われる。ナノポア形成段階と電流測定段階は、同時並行で行う場合には、電流を測定しながら、ナノポア形成も進行するので、脂質二重膜に形成されるナノポアの数が、電流測定中に増加し得る。これが起きると、ナノポアの数が増えるたびに測定電流が増加するので、測定電流が段階状に増大する。これにより、検出の感度が一層向上する。

なお、上記した方法では、各段階の条件を一定にすれば、試料中の標的核酸の量に依存した測定電流が得られるので、本発明の方法により、標的核酸の定量も可能である。なお、定量を行う場合には、必然的に「検出」も行われるので、本発明の「検出方法」には、定量を行う場合も包含される。

２． 第２の実施形態
上記した第１の実施形態では、リポソーム遊離段階までを試験管のような第１の容器内で行い、ナノポア形成段階以降をDWCのような第２の容器内で行ったが、全段階（ただし、試料の変性処理は除く）を１つの容器内で行うことも可能である。

この第２の実施形態で用いるリポソーム結合一本鎖核酸は、第１の実施形態の場合と同様でもよいし、予め容器（好ましくはDWCのチャンバー）の内面（支持体）に固定化しておいてもよい。この固定化は、図１に示すような、リポソーム結合一本鎖核酸に磁性粒子を結合させておいて、磁力により容器内面に固定化することによっても行うことができるが、予め容器の内面に固定化しておいてもよいので、磁性粒子を用いる必要はなく、周知の様々な方法により、容器の内面に固定化することもできる。核酸の直接的な固定化は、この分野において種々の方法が周知であり、そのいずれをも採用することができる。例えば、支持体にアミノ基を設けておき、カルボジイミド等のカップリング剤を用いて核酸を支持体に共有結合することができる。

第２の実施形態では、二本鎖核酸形成段階、リポソーム遊離段階、ナノポア形成段階及び電流測定段階を１つの容器内で行うので、これらの段階を同時並行して進めることもできる。なお、二本鎖核酸形成段階における最初の標的核酸の変性処理は、高温のため、脂質二重膜を損傷する恐れがあるので、別の容器で行うことが好ましい。試料液（リポソーム結合一本鎖核酸を含む又は含まない）を、DWCの一方のチャンバーにおける水溶液として用いて、上記した液滴接触法により脂質二重膜を形成することができる。リポソーム結合一本鎖核酸として、磁性粒子が結合されているものは、磁力により容器の内面に固定化することができるので、試料液に含めておくことができる。リポソーム結合一本鎖核酸が予め容器の内面に固定化されている場合には、試料液はリポソーム結合一本鎖核酸を含まない。

脂質二重膜を形成後、二本鎖核酸形成段階、リポソーム遊離段階、ナノポア形成段階及び電流測定段階の各段階は、それぞれ、第１の実施形態の説明において上記した条件下で行うことができる。ただし、容器内に脂質二重膜が存在する状態で、二本鎖核酸形成段階及びリポソーム遊離段階を行うので、必然的にナノポア形成段階も同時進行する。電流測定段階は、脂質二重膜の形成直後から開始してもよいし、１５分以上のリポソーム遊離段階後に開始してもよい。電流測定開始後も、二本鎖核酸形成段階、リポソーム遊離段階、ナノポア形成段階はそれぞれ進行するので、４つの段階は同時進行する。

第２の実施形態における各段階を、試料中に標的核酸が存在する場合と存在しない場合について、図４に模式的に示す。ここでは、標的核酸がmiRNAであり、二本鎖特異的ヌクレアーゼは、二本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡのうちのＤＮＡを切断するものである場合が示されている。図４の左欄が試料中に標的miRNAが含まれている場合、右欄が試料中に標的miRNAが含まれていない場合（標的miRNA以外のmiRNAやＤＮＡを含む）について示している。

図４中、図１〜図３に登場した同様な要素には同じ参照番号が付されている。図４中、１０は磁性粒子、１２は一本鎖ＤＮＡ、１６はナノポアを有するリポソーム、３０はDWCの境界に形成された脂質二重膜、４２はDWCの一方のチャンバーの側壁内面、４４が標的miRNA、４６が標的miRNA以外のmiRNAやＤＮＡである。

段階Ａ（図４右端参照）は、準備段階であり、磁力により、磁性粒子１０を側壁内面４２に結合することにより、リポソーム結合一本鎖ＤＮＡ１２を側壁内面４２に固定化する。リポソーム結合一本鎖ＤＮＡ１２を側壁内面４２に固定化された状態で、リポソームは、脂質二重膜３０と接触しない位置にある。なお、上記のとおり、磁性粒子１０を用いずに、共有結合等により、リポソーム結合一本鎖ＤＮＡ１２を側壁内面４２に固定化しておくことも可能である。

段階Ｂは、二本鎖形成段階であり、試料中に標的miRNAが含まれる場合（図中左側）には二本鎖核酸が形成されるが、試料中に標的miRNAが含まれない場合（図中右側）には、二本鎖核酸は形成されない。

段階Ｃは、リポソーム遊離段階であり、試料中に標的miRNAが含まれる場合（左側）には、二本鎖特異的ヌクレアーゼ（図中、「はさみ」で表示）により、一本鎖ＤＮＡ１２が切断されてリポソーム１６が遊離されるが、試料中に標的miRNAが含まれない場合（図中右側）には、二本鎖核酸が形成されていないため、リポソームも遊離されない。なお、段階Ｃにおいては、標的miRNAは切断されずに遊離するので、遊離した標的miRNAは再度、一本鎖ＤＮＡ１２とハイブリダイズして二本鎖を形成するので、シグナル（後の電流測定段階で測定されるイオン電流）が増大する。

段階Ｄは、ナノポア形成段階であり、試料中に標的miRNAが含まれる場合（左側）には、遊離したリポソーム１６が脂質二重膜３０と融合して、脂質二重膜中にナノポア２２が形成される（図では２個のナノポアが形成）が、試料中に標的miRNAが含まれない場合（図中右側）には、リポソームが遊離していないので、脂質二重膜３０中にナノポアは形成されない。

段階Ｅは、電流測定段階であり、試料中に標的miRNAが含まれる場合（左側）には、形成されたナノポア２２を介してイオン電流が流れ、シグナルが測定される。なお、電流測定段階中もナノポア形成段階は進行するので、脂質二重膜３０中に形成されるナノポア２２の数が増える度にイオン電流が増大し、階段状の電流が測定される。一方、試料中に標的miRNAが含まれない場合（図中右側）には、脂質二重膜３０中にナノポアは形成されていないので、イオン電流は０のままである。

以上のように、試料中にmiRNAが含まれる場合には、階段状の電流が測定され、試料中にmiRNAが含まれない場合には、電流が測定されないので、この方法により、試料中の標的miRNAを検出することができる。

以上、標識が、α−ヘモリシンのようなナノポアを持つ物質である場合について説明したが、標識は、これに限定されるものではなく、検出可能でリポソーム内に含ませるか又はリポソーム表面に結合させることが可能な物質であれば、いずれも採用することができる。このような標識は、例えば免疫測定の分野において広く用いられており、これらの周知の標識をいずれも採用することができる。すなわち、例えば、酵素標識、蛍光標識、化学発光標識、放射標識、金コロイド標識等を用いることができる。なお、リポソームは、薬剤送達システム(DDS)において多用されていることからも明らかなように、周知の方法により、様々な物質を封入することが可能であるので、免疫測定において常用されている上記標識以外の物質であっても、何らかの方法により検出可能な物質であれば、該物質をリポソーム内部に封入することにより標識として利用可能である。例えば、免疫測定において常用されている酵素標識の基質を標識として利用することも可能である。すなわち、リポソーム内に基質を封入し、封入された基質を酵素と反応させて検出することが可能である。また、リポソームは、上記したα−ヘモリシンのようなタンパク質を脂質膜に融合させることができるので、α−ヘモリシンに代えて酵素等のタンパク質をリポソームの脂質膜に融合又は結合することも可能である。

このような、検出可能でリポソーム内に含ませるか又はリポソーム表面に結合させることが可能な物質を標識として用いる場合、遊離したリポソームのみを選択的に回収し、回収された遊離のリポソーム内に封入された又はリポソーム表面に結合された標識を検出すればよい。遊離したリポソームのみを選択的に回収する操作は、単に、リポソーム遊離段階後の液相を回収することにより行うことができる。

例えば、酵素免疫測定で多用されている、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)のような酵素を標識としてリポソーム内に封入し、遊離したリポソーム内の酵素を測定する場合にはリポソーム遊離段階後の液相を回収し、ケミルミネッセンスを代表例とする周知の基質と混合することで遊離リポソーム濃度に応じて産生する基質分解産物を測定する。基質の種類に応じて検出方法は異なるが、発色基質の3, 3', 5, 5'-テトラメチルベンジジン（TMB）や4-クロロ-1-ナフトールなどを用いた場合は視認できる発色を得ることが可能であり、吸光分光計を用いると発色量を定量することも可能である。蛍光基質の10-アセチル-3,7-ジヒドロキシフェノキサジン（ADHP）と過酸化水素水を用いると、96穴プレートなどにより蛍光値を測定することが想定される。具体例の一つとして、HRP 0.1mg/ml、NaCl 300mM, HEPES-KOH (pH7.6) 15mM、ショ糖200mMを含むリポソームを作成し、遊離段階後にリポソーム液を回収する。TMB 発色用市販原液を規定希釈した溶液にTween-20（商品名）1%を含むTMB基質溶液100μlと混合し、室温、好ましくは37℃で30分反応させる。30分後、溶液が青色に呈するかを目視で判別し、遊離リポソームが回収されているかを判別する。このとき、プレートリーダー等で発色度合を数値化することも可能である。逆に、酵素反応の基質をリポソーム内に封入し、封入された基質を測定する場合には、具体的には次のようにして行うことができる。5-クロロメチルフルオレッセインジ-β-D-ガラクトピラノシド（CMFDG）1 mM、NaCl 300mM, HEPES-KOH (pH7.6) 15mM、ショ糖200mMを含むリポソームを作成し、遊離段階後にリポソーム液を回収する。次にβ-ガラクトシダーゼ１μM、NaCl 300mM, HEPES-KOH (pH7.6) 15mM、Tween-20（商品名）1%を含む溶液と混合し、室温、好ましくは37℃で30分反応させる。プレートリーダー等を用いて488nm領域の励起光を用いて515nm領域の蛍光波長を測定する。これらと同様に、標識として利用可能な他の種々の物質も、それぞれの物質について公知の方法により、検出することができる。

以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

１． リポソーム結合一本鎖オリゴＤＮＡの作製
DOPE:DOPS:DOPC:コレステロール= 5:3:3:1 (重量比)、合計1.2 mg になるように、以下の量にて脂質混合液をガラスバイアルにて調製した。脂質溶液は全てクロロホルムに溶解したものである。
DOPE：1,2-ジオレイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（25 mg/ml)を20μＬ
DOPS：1,2-ジオレイル-sn-グリセロ-3-ホスフォ-L-セリン(50 mg/ml)を6μＬ
DOPC：1,2-ジオレイル-sn-グリセロ-3-ホスフォコリン(25 mg/ml)を12μＬ

これに、一本鎖ＤＮＡ（５’末端にコレステロール、３’末端にビオチンが結合）(10μM)を0.6μＬ添加した。一本鎖ＤＮＡの塩基配列は以下のとおりであった。
cccccccatctttaccagacagtgttaccccc （配列番号１）
なお、コレステロールとビオチンが結合された配列番号１の一本鎖ＤＮＡは、ユーロフィンジェノミクス社のカスタムオリゴ合成サービスにより外注した。更にクロロホルムを 50.4 μＬ、次いで、更にメタノールを10μＬ添加した。アルゴンガスを吹き付けて溶媒を揮発させ、ガラスバイアルの側壁に脂質フィルムを形成した。デシケータを用いてガラスバイアルを真空下にて2時間以上、保持した。

内液（NaCl 300mM, HEPES-KOH (pH7.6) 15mM、ショ糖200mM）200μＬで水和し、リポソームを作製した。外液（NaCl 300mM, HEPES-KOH (pH7.6) 15mM）300μＬを混和し、18000G、15分、4℃ で遠心し、リポソーム結合一本鎖ＤＮＡを調製した。

２． リポソームへのα−ヘモリシンの組み込み
１の遠心沈殿に、α−ヘモリシン遺伝子（塩基配列は、GenBank Accession No. WP_000857483に記載したものを参考にした（シグナル配列を除外）。ユーロフィンゲノミクス社から購入（合成依頼））5 nMを混合したPURE frex 2.0（ジーンフロンティア社製商品名）溶液20μＬを用いて懸濁した。３７℃で６時間インキュベートし、ヘモリシンを合成すると同時にリポソームの脂質膜に組み込んだ。外液（組成は上記、以下同じ）500μＬを用いてリポソーム液を懸濁、18000G、15分、4℃の遠心操作でリポソームを沈殿させ、上清を捨てて新しい外液1mLを用いて懸濁した。エクストルーダー装置(Avanti polar lipids社製)を用いてリポソームサイズを小さくした（フィルターサイズ100 nm）。

３．リポソーム結合一本鎖ＤＮＡの磁性ビーズへの結合
磁性ビーズ(dynabeads, myone streptavidin C1（商品名）、Thermo Fisher Scientific 社) 500μＬを外液500μＬで懸濁し、DynaMag装置(商品名、Thermo Fisher Scientific社)を用いてビーズをチューブ側壁に集め、外液を新たな外液1mLと交換してビーズを洗浄した。磁性ビーズ溶液500μＬと２で得られたリポソーム溶液500μＬを混和し、37℃で１時間インキュベートした。インキュベート中、数回の転倒混和を繰り返した。DynaMag装置を用いて外液を除去した。外液２（組成：Tris-HCl (pH7.0) 20mM、MgCl₂ 20mM、DTT 1mM, KCl 50mM, CaCl₂ 1m)500μＬを用いて磁性ビーズを懸濁した。

４． 標的miRNA等
標的miRNAは、miRNA-141（塩基配列：uaacacugucugguaaagaugg（配列番号２））であった。モック(mock)として、標的miRNA以外の以下のmiRNA及びＤＮＡも用いた。
miRNA-16 ：uagcagcacguaaauauuggcg （配列番号３）
DNA-20C141： ccatctttaccagacagtgttacccccccccccccccccccc (配列番号４）
百万種の混合microRNA：aucnnngugnnnugcnnnnauc (配列番号５）
＊N: 4塩基(A, U, C, G)がランダムに入っている
miRNA-141、miRNA-16、DNA-20C141はSigma-Aldrich社のカスタム一本鎖RNA、カスタムオリゴDNAの合成サービスで発注、調製した。百万種の混合microRNAは、ジーンデザイン社のカスタムRNA合成サービスで発注、調製した。

５． 二本鎖核酸形成、リポソーム遊離
上記miRNA又はDNA（濃度１μM、百万種の混合microRNAの場合は合計10μM)の溶液（溶媒は外液２（組成は上記、以下同じ））を、試験管内で、恒温槽を用いて９８℃、３０秒間、変性処理した。次に試験管を３７℃の恒温槽に移し、上記のとおり調製したリポソーム結合一本鎖ＤＮＡ（磁性ビーズ結合）を0.17nM（溶媒は外液２）と、二本鎖特異的ヌクレアーゼ（Evrogen社より購入、使用時の終濃度は10unit/ml）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。

６． ナノポア形成、電流測定
一方、DWC内に脂質二重膜を形成した。用いたDWCは、図３に示すものであり、円柱状の各チャンバーの直径は4mm、深さは3mmであった。片方のチャンバーの外縁部に、チャンバー内面から0.5mmの距離に、幅1.75mm、深さ3mmの磁性シート用の溝を構築した。この溝に、磁性シート（スガツネ社の超強力マグネットキャッチラバータイプNMS型）を挿入した。

DOPC:DOPE=3:1(質量比)、20mg/mlのn-デカン4.2μLをDWCの２つの円柱に滴下した。次に、上記５でインキュベートした後の溶液21μLを一方のチャンバーに添加し、他方のチャンバーには外液２を21μL添加して２つのチャンバーの境界に脂質二重膜を形成した。この状態で、電極間に60mVを印加し、サンプリングレート5kHz、ローパスフィルター1kHzでイオン電流（陽イオン）を測定した。

７． 測定結果
電流の測定結果を図５及び図６に示す。図５中、(a)は、miRNAを添加しなかった場合（陰性対照）の結果を示し、電流は全く検出されなかった。(b)は、リポソーム結合一本鎖DNAを、磁性ビーズに結合せず、かつ、miRNAも添加せず、その他の処理を上記のとおり行った場合（陽性対照）の結果を示す。階段状の電流が検出された。(a)と(b)の比較から、磁性ビーズがチャンバー内面に固定化されていることが確認された。

(c)はモックであるmiRNA-16の測定結果、(d)はモックであるDNA-20C141の測定結果を示す。いずれの場合も、電流は検出されなかった。(e)は、標的miRNAであるmiRNA-141の測定結果であり、階段状の電流が検出された。(f)は、標的miRNAであるmiRNA-141とモックであるmiRNA-16との混合物の測定結果であり、標的miRNAが含まれていれば、他のmiRNAが混入していても階段状の電流が測定された。

図６は、(e)と同様、標的miRNAであるmiRNA-141を再度測定した結果を示し、階段状の電流が検出された。これに対し、標的miRNAとは異なる、１００万種類のmiRNA混合物を測定した場合、(b)に示されるように、階段状の電流は検出されなかった。

以上の実験から、本発明の方法により、塩基配列特異的に標的核酸を検出できることが確認された。

１０ 磁性粒子
１２ 一本鎖核酸
１４ コレステロール
１６ リポソーム
１８ リポソームの脂質二重膜
２０ α−ヘモリシン
２２ ナノポア
２４ ビオチン
２６ ストレプトアビジン
２８ａ 脂質単分子膜で囲包された水性液滴
２８ｂ 脂質単分子膜で囲包された水性液滴
３０ 脂質二重膜
３２ 脂質
３３ ダブルウェルチャンバー(DWC)
３４ リポソーム遊離段階後の反応液
３６ 有機溶媒中の脂質溶液
３８ 電極
４０ パッチアンプ回路
４２ DWCの一方のチャンバーの側壁内面
４４ 標的miRNA
４６ 標的miRNA以外のmiRNAやＤＮＡ

Claims (14)

1. 特定の塩基配列を持つ、試料中の標的核酸の検出方法であって、
   前記標的核酸とリポソーム結合一本鎖核酸をハイブリダイズさせて二本鎖核酸を形成する、二本鎖核酸形成段階であって、前記リポソーム結合一本鎖核酸は、標識されたリポソームが一本鎖核酸に結合されて、かつ、支持体に固定化された又は支持体に固定化可能なように修飾され、前記標的核酸と相補的な塩基配列を含むものである、二本鎖核酸形成段階と、
   形成された二本鎖核酸に、二本鎖特異的ヌクレアーゼを作用させて核酸を切断し、前記リポソームを遊離させる、リポソーム遊離段階と、
   遊離したリポソームが持つ前記標識を検出する、標識検出段階とを含み、
   前記標識がナノポアを持つ物質であり、該物質が前記リポソームと融合して該リポソームにナノポアが形成されており、前記標識検出段階は、遊離したリポソームのみを選択的に脂質二重膜と融合させ、該脂質二重膜にナノポアを形成する、ナノポア形成段階と、形成されたナノポアにイオンを通過させ、その際の電流を測定する、電流測定段階とを含む、
   標的核酸の検出方法。
2. 前記標的核酸の塩基数が１８個〜４０個である請求項１記載の方法。
3. 前記標的核酸がＲＮＡである請求項１又は２記載の方法。
4. 前記標的核酸がマイクロＲＮＡである請求項３記載の方法。
5. 前記一本鎖核酸がＤＮＡである請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記標的核酸がＲＮＡであり、前記二本鎖特異的ヌクレアーゼがＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＤＮＡを切断する活性を持つ、請求項５記載の方法。
7. 前記標識がナノポアを持つ物質であり、該物質が前記リポソームと融合して該リポソームにナノポアが形成されており、前記標識検出段階は、遊離したリポソームのみを選択的に脂質二重膜と融合させ、該脂質二重膜にナノポアを形成する、ナノポア形成段階と、形成されたナノポアにイオンを通過させ、その際の電流を測定する、電流測定段階とを含み、前記ナノポア形成段階及び電流測定段階は、リポソーム結合一本鎖核酸を内面に固定化した容器内で行う、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記リポソーム結合一本鎖核酸は、磁性粒子に結合され、前記容器内では、前記リポソーム結合一本鎖核酸は、前記容器の外部からかけられた磁場により、前記容器内の内面に固定化され、それによって前記脂質二重膜との接触が防止される、請求項７記載の方法。
9. 前記二本鎖核酸形成段階及び前記リポソーム遊離段階を第１の容器内で単一の操作で行い、前記脂質二重膜は、第２の容器内に形成され、前記ナノポア形成段階及び前記電流測定段階を第２の容器内で行う、請求項１、７及び８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記第２の容器がダブルウェルチャンバーであり、前記脂質二重膜は、両チャンバーの境界に形成される、請求項９記載の方法。
11. 前記二本鎖核酸形成段階及び前記リポソーム遊離段階は、反応液の温度を標的核酸の変性温度から、標的核酸の融解温度よりも低くかつ二本鎖特異的ヌクレアーゼの作用温度範囲内まで低下させ、二本鎖特異的ヌクレアーゼの存在下、二本鎖特異的ヌクレアーゼの作用温度範囲内で維持することを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 標識されたリポソームに結合され、支持体に固定化された又は支持体に固定化可能なように修飾された、標的核酸と相補的な塩基配列を持つ一本鎖核酸を含み、前記標識が、ナノポアを持つ物質である、請求項１記載の方法を行うためのキット。
13. 二本鎖形成段階及びリポソーム遊離段階を行う緩衝液をさらに含む請求項１２記載のキット。
14. ダブルウェルチャンバーをさらに含む請求項１３記載のキット。

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