JP2019532642A - ナノポアを通した誘導による核酸検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)試料を標的ポリヌクレオチド中の配列に結合するガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質と接触させることであって、ガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が試料中に存在する任意の標的ポリヌクレオチドと複合体を形成する、接触させることと、
(b)試料を、膜貫通ポアを含む膜と接触させることと、
(c)膜を挟んで電位差を印加することと、
(d)複合体と膜貫通ポアとの相互作用から生じる効果の存在または不在について監視して複合体の存在または不在を決定し、それによって試料中の標的ポリヌクレオチドを検出することと、を含む、方法を提供する。
(a)試料を標的ポリヌクレオチド中の配列に結合するガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質と接触させることであって、ガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が試料中に存在する任意の標的ポリヌクレオチドと複合体を形成する、接触させることと、
(b)試料をナノポアと接触させることと、
(c)ナノポアを挟んで電位差を印加することと、
(d)複合体とナノポアとの相互作用から生じる効果の存在または不在について監視して複合体の存在または不在を決定し、それによって試料中の標的ポリヌクレオチドを検出することと、を含む、方法も提供される。
−標的ポリヌクレオチド中の配列に結合するヌクレオチド配列、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質およびアダプター配列、ならびに/または表面に連結することができるアンカーに結合するヌクレオチド配列を含む、ガイドポリヌクレオチド、
−本発明の2つ以上のガイドポリヌクレオチドのパネル、
−本発明のガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質を含む、ガイドポリヌクレオチド/ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体、
−ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質および表面に連結することができるアンカーを含む、キット、ならびに
−試料中の二本鎖ポリヌクレオチドを含む標的を検出する方法であって、
(a)試料を第1のプローブおよび第2のプローブと接触させることであって、第1のプローブおよび第2のプローブが、試料中に存在する任意の標的ポリヌクレオチドと複合体を形成し、第1のプローブが、標的二本鎖ポリヌクレオチド中の第1の配列に結合し、表面に連結することができるアンカーを含み、第2のプローブが、標的二本鎖ポリヌクレオチド中の第2の配列に結合し、アダプター配列を含む、接触させることと、
(b)試料を膜貫通ポアと接触させることと、
(c)膜貫通ポアに電位を印加することと、
(d)複合体と膜貫通ポアとの相互作用から生じる効果の存在または不在について監視して複合体の存在または不在を決定し、それによって試料中の標的二本鎖ポリヌクレオチドを検出することと、を含む、方法を提供する。
本発明は、試料中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、(a)試料を標的ポリヌクレオチド中の配列に結合するガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質と接触させることであって、ガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が試料中に存在する任意の標的ポリヌクレオチドと複合体を形成する、接触させることと、(b)試料を、膜貫通ポアを含む膜と接触させることと、(c)膜を挟んで電位差を印加することと、(d)複合体と膜貫通ポアとの相互作用から生じる効果の存在または不在について監視して複合体の存在または不在を決定し、それによって試料中の標的ポリヌクレオチドを検出することと、を含む、方法を提供する。ステップ(a)および(b)は、同時にまたはいずれかの順序で連続して実施され得る。
(i)試料をそれに結合している第1の末端伸長部に相補的な配列を含む第1の捕捉オリゴヌクレオチドを有する表面と、ガイドポリヌクレオチド/ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質/標的ポリヌクレオチド複合体が表面に結合するように接触させることと、
(ii)表面に結合しているガイドポリヌクレオチド/ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質/標的ポリヌクレオチド複合体を競合オリゴヌクレオチドと、ガイドポリヌクレオチド/ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質/標的ポリヌクレオチド複合体が表面から放出されるように接触させることと、
(iii)ガイドポリヌクレオチド/ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質/標的ポリヌクレオチド複合体をそれに結合している第2の末端伸長部に相補的な配列を含む第2の捕捉オリゴヌクレオチドを有するビーズと、ガイドポリヌクレオチド/ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質/標的ポリヌクレオチド複合体がビーズに結合するように接触させることと、任意に
(iv)ビーズを膜貫通ポアに送達することと、を含み得る。
ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)などの核酸であり得る。ポリヌクレオチドは、DNAの1本の鎖にハイブリダイズされたRNAの1本の鎖を含み得る。ポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知の任意の合成核酸、例えば、ペプチド核酸(PNA)、グリセロール核酸(GNA)、トレオース核酸(TNA)、ロックド核酸(LNA)、またはヌクレオチド側鎖を有する他の合成ポリマーであり得る。PNA骨格は、ペプチド結合によって連結した繰り返しN−(2−アミノエチル)−グリシン単位で構成されている。GNA骨格は、ホスホジエステル結合によって連結した繰り返しグリコール単位で構成されている。TNA骨格は、ホスホジエステル結合によって共に連結した繰り返しトレオース糖で構成されている。LNAは、上記のように、リボース部分における2’酸素および4’炭素を接続する余分な架橋を有するリボヌクレオチドから形成される。
ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、ガイドポリヌクレオチドに結合し、ガイドポリヌクレオチドが結合するポリヌクレオチドに結合する任意のタンパク質であり得る。ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、非限定的な例として、標的ポリヌクレオチド認識ドメインおよび少なくとも1つのヌクレアーゼドメインを含み得る。認識ドメインは、ガイドポリヌクレオチド(例えばRNA)および標的ポリヌクレオチド(例えばDNA)を結合する。ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質は、二本鎖ポリヌクレオチドの一方もしくは両方の鎖を切断する1つのヌクレアーゼドメインを含有し得るか、または第1のヌクレアーゼドメインが標的ポリヌクレオチドの一方の鎖の開裂のために配置され、第2のヌクレアーゼドメインが標的ポリヌクレオチドの相補鎖の開裂のために配置される、2つのヌクレアーゼドメインを含有し得る。ヌクレアーゼドメインは、活性または不活性であり得る。例えば、ヌクレアーゼドメイン、または2つのヌクレアーゼドメインの一方もしくは両方は、突然変異によって不活性化され得る。
ガイドポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができ、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質に結合することもできる配列を含む。ガイドポリヌクレオチドは、それが標的ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質に結合することを可能にする任意の構造を有し得る。
試料は、任意の適切な試料であり得る。試料は、典型的には、標的ポリヌクレオチドのうちの少なくとも1つを含有することが知られているか、または含有するらしいと疑われるものである。方法は、膜貫通ポアへの送達のための標的ポリヌクレオチドを選択するのに使用することができる。試料の他の成分は洗い流され得、例えば、それらは膜貫通ポアを含む細胞から洗い流され得る。かかる他の成分は、下記:折り畳まれても折り畳まれなくてもよいタンパク質、ペプチド、炭水化物、非標的ポリヌクレオチドなどのポリマー、および細胞破片のうちの1つ以上を含む。
方法は、ガイドポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質、および標的ポリヌクレオチドによって形成された複合体と膜貫通ポアとの相互作用から生じる効果の存在または不在について監視して、複合体の存在または不在を決定することを含む。効果は、ガイドポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質、および標的ポリヌクレオチドが膜貫通ポアと相互作用することによって形成された複合体を示す。効果は、複合体、標的ポリヌクレオチド、またはガイドポリヌクレオチドの成分のうちの1つに付着しているアダプターのポアを通る転座によって引き起こされ得る。効果は、複合体、標的ポリヌクレオチド、またはガイドポリヌクレオチドの成分のうちの1つに付着しているアダプターのポアを通る転座を示す。
アダプターは、少なくとも1つの一本鎖ポリヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド領域を含み得る。一本鎖ポリヌクレオチドは、それらがポアを通過することができ、異なる方法でポアを通って流れる電流に影響を及ぼす少なくとも2つの異なる領域に容易に分類することができるので、有用である。例えば、異なる配列を有するポリヌクレオチドの異なる領域は、典型的には異なる方法でポアを通って流れる電流に影響を及ぼす。少なくとも2つの異なる領域は、好ましくは異なるヌクレオチドの少なくとも2つのストレッチに対応する。例えば、一本鎖ポリヌクレオチド領域は、アデニンヌクレオチドのストレッチおよび脱塩基ヌクレオチドのストレッチを含み得る。各ストレッチは、異なる方法でポアを通って流れる電流に影響を及ぼすであろう。
ガイドポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質、および標的ポリヌクレオチドを含む複合体は、アンカーを用いて膜に連結させることができる。複合体を膜に連結するために、1つ以上のアンカーが使用され得る。典型的には、1つ以上のアンカーは、標的ポリヌクレオチド、ガイドポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質上などの複合体の同じ成分上に存在する。あるいは、1つ以上のアンカーは、ガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質上などの異なる成分上に存在し得る。
リーダー配列は、典型的には、ポリマーを含むポリマーは、好ましくは、負に荷電されている。ポリマーは、好ましくは、ポリヌクレオチド、例えばDNAもしくはRNA、修飾ポリヌクレオチド(例えば、脱塩基DNA)、PNA、LNA、ポリエチレングリコール(PEG)、またはポリペプチドである。リーダーは、好ましくは、ポリヌクレオチドを含み、より好ましくは、一本鎖ポリヌクレオチドを含む一本鎖リーダー配列は、最も好ましくは、DNAの一本鎖、例えばポリdTセクションを含む。リーダー配列は、好ましくは、1つ以上のスペーサーを含む。
ナノポア配列決定に使用するためのY−プアダプターは、当該技術分野において既知である。Yアダプターは、典型的には、(a)二本鎖領域と、(b)一本鎖領域または他方の末端において相補的ではない領域とを含む。Yアダプターは、一本鎖領域を含む場合、オーバーハングを有するとして記載され得る。Yアダプター中の非相補領域の存在は、二本鎖部分とは異なり2本の鎖が典型的には互いにハイブリダイズしないため、アダプターにY形状を与える。Yアダプターは、1つ以上のアンカーを含み得る。
ナノポア配列決定に使用するためのヘアピンループアダプターは、当該技術分野において既知である。ヘアピンループは、二本鎖ポリヌクレオチドの一端に提供することができ、方法は、好ましくは、ポリヌクレオチドの一端にヘアピンループを有するポリヌクレオチドを提供することをさらに含む。ポリヌクレオチドの2つの鎖は、一端でヘアピンループと連結され得る。
ビーズ、典型的にはマイクロ粒子を使用して、複合体を膜貫通ポアに送達することができる。これは、WO2016/059375に記載されている。本発明の方法では、任意の数のマイクロ粒子を使用することができる。例えば、方法は、単一のマイクロ粒子、または2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、50、100、1,000、5,000、10,000、100,000、500,000、もしくは1,000,000個以上のマイクロ粒子を使用し得る。2つ以上のマイクロ粒子が使用される場合、マイクロ粒子は同じであり得る。あるいは、異なるマイクロ粒子の混合物が使用され得る。
本発明に従い、任意の膜を使用することができる。好適な膜は、当該技術分野で周知である。膜は、好ましくは、両親媒性層または固体層である。
膜は、典型的には、各膜が好ましくは膜貫通ポアを含む、膜のアレイの一部である。したがって、本発明は、膜のアレイを使用して標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。
ナノポアは、ナノメートルスケールの少なくとも1つの寸法を有する孔である。ナノポアは、ポア形成タンパク質によって、またはシリコンもしくはグラフェンなどの合成材料中の穴として作成され得る。あるいは、ナノポアは、これらのハイブリッド、例えば合成膜中に設定されたタンパク質チャネルであり得る。ナノポアはまた、DNA折り紙ポアまたはガラスキャピラリーであり得る。ナノポアは、典型的には約20nm未満の直径であるが、最大約100nmの直径であり得る。
本発明の方法は、疾患または状態を診断または予後診断するために使用することができる。疾患または状態は、好ましくは、癌、冠状動脈性心疾患、心血管疾患、結核、または敗血症である。
ポリヌクレオチド結合タンパク質は、ポリヌクレオチドに結合することができ、かつポアを通るその移動を制御することができる任意のタンパク質であり得る。タンパク質がポリヌクレオチドに結合するか否かを判定することは、当該技術分野において簡単である。タンパク質は、典型的には、ポリヌクレオチドの少なくとも1つの特性と相互作用するか、またはそれを修飾する。タンパク質は、それを開裂して個々のヌクレオチドまたはヌクレオチドのより短い鎖、例えばジヌクレオチドまたはトリヌクレオチドを形成することによってポリヌクレオチドを修飾し得る。部分は、特定の位置にそれを配向するか、またはそれを移動させる、例えばその移動を制御することによってポリヌクレオチドを修飾し得る。
方法は、標的ポリヌクレオチドを特徴付けることを伴い得る。標的ポリヌクレオチドがポアと接触するとき、標的ポリヌクレオチドの1つ以上の特徴を示す1つ以上の測定は、ポリヌクレオチドがポアに対して移動する際に行われる。
方法は、遊離ヌクレオチドもしくは遊離ヌクレオチド類似体、および/またはポリヌクレオチド結合タンパク質の作用を容易にする酵素補因子の存在下で実施され得る。方法はまた、遊離ヌクレオチドまたは遊離ヌクレオチド類似体の不在下および酵素補因子の不在下で実施され得る。遊離ヌクレオチドは、上記に論じられる個々のヌクレオチドのいずれかの1つ以上であり得る。遊離ヌクレオチドには、アデノシン一リン酸(AMP)、アデノシン二リン酸(ADP)、アデノシン三リン酸(ATP)、グアノシン一リン酸(GMP)、グアノシン二リン酸(GDP)、グアノシン三リン酸(GTP)、チミジン一リン酸(TMP)、チミジン二リン酸(TDP)、チミジン三リン酸(TTP)、ウリジン一リン酸(UMP)、ウリジン二リン酸(UDP)、ウリジン三リン酸(UTP)、シチジン一リン酸(CMP)、シチジン二リン酸(CDP)、シチジン三リン酸(CTP)、環状アデノシン一リン酸(cAMP)、環状グアノシン一リン酸(cGMP)、デオキシアデノシン一リン酸(dAMP)、デオキシアデノシン二リン酸(dADP)、デオキシアデノシン三リン酸(dATP)、デオキシグアノシン一リン酸(dGMP)、デオキシグアノシン二リン酸(dGDP)、デオキシグアノシン三リン酸(dGTP)、デオキシチミジン一リン酸(dTMP)、デオキシチミジン二リン酸(dTDP)、デオキシチミジン三リン酸(dTTP)、デオキシウリジン一リン酸(dUMP)、デオキシウリジン二リン酸(dUDP)、デオキシウリジン三リン酸(dUTP)、デオキシシチジン一リン酸(dCMP)、デオキシシチジン二リン酸(dCDP)、およびデオキシシチジン三リン酸(dCTP)が挙げられるが、これらに限定されない。遊離ヌクレオチドは、好ましくは、AMP、TMP、GMP、CMP、UMP、dAMP、dTMP、dGMP、またはdCMPから選択される。遊離ヌクレオチドは、好ましくは、アデノシン三リン酸(ATP)である。酵素補因子は、ポリヌクレオチド結合タンパク質が機能することを可能にする因子である。酵素補因子は、好ましくは、二価金属カチオンである。二価金属カチオンは、好ましくは、Mg2+、Mn2+、Ca2+、またはCo2+である。酵素補因子は、最も好ましくは、Mg2+である。
様々な異なる種類の測定を行うことができる。これは、電気的測定および光学的測定を含むが、これらに限定されない。蛍光の測定を含む適切な光学的方法は、J.Am.Chem.Soc.2009,131 1652−1653によって開示されている。考えられる電気的測定としては、電流測定、インピーダンス測定、トンネル効果測定(Ivanov AP et al.,Nano Lett.2011 Jan 12;11(1):279−85)、およびFET測定(国際出願第WO2005/124888号)が挙げられる。光学的測定は、電気的測定と組み合わされ得る(Soni GV et al.,Rev Sci Instrum.2010 Jan;81(1):014301)。測定は、膜貫通電流測定、例えば、ポアを通過するイオン電流の測定であり得る。
本発明はまた、本発明の方法における使用のためのキットを提供する。キットは、典型的には、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質および膜に連結することができるアンカーを含む。キットは、ガイドポリヌクレオチド、アダプター配列、ポリヌクレオチドに沿って移動することができるポリヌクレオチド結合タンパク質、および/またはリーダー配列のうちの1つ以上をさらに含み得る。キットは、マイクロ粒子をさらに含み得る。
この実施例は、ナノポアによる混合物中の特定の標的ポリヌクレオチドの検出方法を記載する。この実施例では、標的DNAは、標的ポリヌクレオチドに結合する2種類のCRISPR−Casプローブを用いて同定される。第1のものは、コレステロールタグ付きCRISPR−Casプローブを介して標的ポリヌクレオチドを膜にアンカリングする伸長部を含有する。第2のもの(「分析物」)は、結合ポリヌクレオチド結合タンパク質(ヘリカーゼ)を保有する伸長部を担持し、ナノポアを通る分析物上のバーコード配列のポリヌクレオチド結合タンパク質制御移動を介して間接的に標的ポリヌクレオチドを明確に同定する。
オリゴヌクレオチドAR131およびAR132を、各々40μMで、10mMのトリス−Cl(pH8.0)、1mMのEDTA、100mMのNaCl中、95℃〜25℃、毎分0.6℃でアニールした。ハイブリダイズさせたDNAは、「コレステロールhyb」(ONLA17351)として知られていた。
ヘリカーゼを使用して、CsgGナノポアを通した、「コレステロールhyb」を介してトリブロックコポリマーにテザリングされた、Cas接触型プレ配列決定ミックスの移動を制御した。図8は、標的DNA中のそれらの同族部位に結合している2つのCRISPR−dCas9プローブを担持する標的DNA分子を示す。図23は、ナノポアを通る分析物のヘリカーゼ制御転座から生じる電気信号を示す。例となる信号は、「アンカープローブ」および「ヘリカーゼプローブ」の両方が標的DNAと接触したことを示す。データは、テザリングされたCRISPR−dCas9複合体を介した標的ポリヌクレオチドの固定化が標的DNAポリヌクレオチドを首尾よく同定したことを実証する。
この実施例は、ナノポア配列決定による混合物からの特定の20nt標的DNAポリヌクレオチド配列(「標的」)を含有する断片の直接富化および配列決定方法を記載し、標的DNAは、コレステロールタグ付きCRISPR−Casプローブと接触し、ナノポアを通るDNAの移動は、DNAモータータンパク質によって制御される。この例では、「標的」は、その配列によって直接的に明確に同定されている。結合CRISPR−Casプローブは、ヘリカーゼの転座を一時的にストールさせ得、よってまた、試料をさらに明確に同定するために使用され得る。
オリゴヌクレオチドAR131およびAR132は、各々40μMで、10mM Tris−Cl(pH8.0)、1mM EDTA、100mM NaCl中、95℃〜25℃、毎分0.6℃でアニールされた。ハイブリダイズされたDNAは、「コレステロールhyb」(ONLA17351)として知られていた。
ヘリカーゼを使用して、CsgGナノポアを通した、「コレステロールhyb」を介してトリブロックコポリマーにテザリングされた、Cas接触型プレ配列決定混合物の移動を制御した。図9は、その同族部位およびコレステロールテザーに結合している末端装填ヘリカーゼ、CRISPR−dCas9を担持する標的DNA分子を示す。図15は、ヘリカーゼの経路、およびその転座が結合CRISPR−dCas9複合体の遭遇時どのように一時的にストールされ得るかを示す。図22は、ナノポアを通る標的DNA(この場合、λDNAの3.6キロベース断片)のヘリカーゼ制御転座および転座事象の途中の1つのかかる一時的ストール事象から生じる電気信号を示す。例となる信号は、dCas9が標的DNAと接触したこと、およびヘリカーゼがdCas9と接触したことを示す。データは、テザリングされたCRISPR−dCas9複合体を介する標的ポリヌクレオチドの固定化が首尾よく富化し(図21参照)、他の非特異的断片よりも優先して標的DNAポリヌクレオチドを配列決定したことを実証する。
この実施例は、ナノポア配列決定によるDNAポリヌクレオチド(「DNA」)の混合物からの特定の20nt標的DNAポリヌクレオチド配列(「標的」)を含有する断片の直接富化および配列決定方法を記載し、標的DNAは、コレステロールタグ付きCRISPR−Casプローブと接触する。この実施例では、オリゴヌクレオチドの混合物は、DNAの混合物の各末端でY−アダプター上に装填されたポリヌクレオチド結合タンパク質を担持する。この例では、Y−アダプターは、ストール部位を含有しないが、Y−アダプターにハイブリダイズされたコレステロール部分を含有するテザーオリゴヌクレオチドを介して膜表面にアンカリングされる。モータータンパク質は、結合CRISPR−Cas複合体を含有しない混合物中の任意のDNAを完全に巻き戻し、それによって膜から非標的DNAを放出する。さらに、E.coliエキソヌクレアーゼIなどのエキソヌクレアーゼは、DNAモーター転座と同時に標的の非転座鎖、および完全に巻き戻される試料中の任意の非標的DNAを分解するために使用され得る。ポリヌクレオチド結合タンパク質は、結合CRISPR−Cas複合体を含有する任意のDNAを部分的に巻き戻すが、ナノポアとは無関係なCRISPR−Cas複合体の遭遇時にストールする。ナノポアによる標的の捕捉時、CRISPR−Cas複合体は、印加電位によって標的から除去され、それによって標的上のポリヌクレオチド結合タンパク質の転座を再開する。分析物の配列およびストールの位置は、試料を明確に同定するために使用され得る。
オリゴヌクレオチドAR131およびAR132は、各々40μMで、10mM Tris−Cl(pH8.0)、1mM EDTA、100mM NaCl中、95℃〜25℃、毎分0.6℃でアニールされた。ハイブリダイズDNAは、「コレステロールhyb」(ONLA17351)として知られていた。
ヘリカーゼを、非加水分解性ATP類似体ATPγSの存在下で標的の両方の末端にライゲーションし、結合CRISPR−dCas9を含有しないか、またはナノポアとは無関係なCRISPR−dCas9ストールに先行する、任意の標的DNAを巻き戻すために使用した。CRISPR−dCas9およびライゲーションされたY−アダプターを、「コレステロールhyb」を介して、および標的の両方の末端にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを介して、トリブロックコポリマーにテザリングした。図28は、膜表面への標的の固定化を示す。標的は結合CRISPR−dCas9プローブを担持し、MgATPの不在下で、ヘリカーゼは標的DNAの末端に位置する。図29は、MgATPの添加時の結合CRISPR−dCas9複合体への両方のヘリカーゼの転座およびストーリングを示す。ストーリングは、一方または両方のヘリカーゼによって達成され得る。図30は、電位の印加時のナノポアによる標的分析物の捕捉を示す。図31は、ナノポアによる標的の捕捉時のヘリカーゼによる結合CRISPR−dCas9複合体の除去を示す。図32は、初期のプレdCas9転座事象(B)、ストーリング(C)、および転座の再開(D)を含む、MgATPの添加の約2350秒後のトレース例を示す。ストールからの再開は、強調および拡大される(E)。
オリゴヌクレオチド
tracrRNA
全体を通して使用されるtracrRNAは、IDTから購入された67量体であった(「Alt−R(商標)」tracrRNA、カタログ番号1072534)
この実施例は、標的/プローブ複合体の直接検出による混合物からの特定の20nt標的DNAポリヌクレオチド配列(「標的」)を含有する断片の検出方法を記載し、標的DNAは、CRISPR−Casプローブと接触する。この実施例では、「標的」は、ナノポアと相互作用する標的/プローブ複合体によって与えられる固有の信号によって明確に同定される。この場合、ポアはDNAの一本鎖を収容するのにだけ十分に大きい(図14)。
両方の末端で末端修復およびdAテール化された3.6kb長のラムダDNAを、ヘリカーゼを有さないSK007アダプター(ONLA16389、上+ONLA19936、下+ONLA19750、ブロッカー)にライゲーションした。これを次いで、以下のように、SPRIビーズを用いて精製した:0.4体積当量のAMPure XP SPRI磁性ビーズ(Beckman Coulter)を混合物に添加し、得られた混合物を5分間21℃で撹拌した。磁性ビーズを磁性分離機を用いてペレット化し、上清を吸引し、100μlの50mMのトリス−Cl、2.5MのNaCl、20%PEG8,000(25℃でpH7.5)をビーズにまだラック上にある間に添加し、ペレットを360°回転させてラック上でペレットを洗浄した。ビーズをもう一回直ちにペレット化し、上清を吸引し、その後チューブをラックから取り出し、25mMのトリス−Cl、20mMのNaCl(25℃でpH7.5)を含有する45μlのバッファーをビーズに添加して、5分間21℃でのインキュベーションによってDNAを溶出した。ビーズを磁性分離機を用いてペレット化し、溶出液を保持した。これは、「二重−Y3.6kb」である。
CRISPR−dCas9複合体が存在しない場合、またはCRISPR−dCas9複合体が二重−Y3.6kb中に存在するcrRNA配列を有さない場合、得られる信号は、典型的には<0.5秒持続する60〜80pAでの事象に特徴的である。図33および34は、それに結合しているCRISPR−dCas9複合体がポアを通って転座しない二重−Y3.6kbを示す。
この実施例は、標的/プローブ複合体の直接検出による混合物からの特定の20ヌクレオチド標的DNAポリヌクレオチド配列(「標的」)を含有する断片の検出方法を記載し、標的DNAは、CRISPR−Casプローブと接触する。この例では、「標的」は、ナノポアと相互作用する標的/プローブ複合体によって与えられる固有の信号によって明確に同定される。この場合、ポアは、プローブが付着している二本鎖DNAを収容するのに十分に大きい(図12参照)。
3.6kb長のラムダDNAを調製および精製した。これは3.6kbである。
CRISPR−dCas9複合体が存在しない場合、またはCRISPR−dCas9複合体が3.6kb中のDNA配列に相補的であるcrRNA配列を有さない場合、得られる信号は、3.6kbがポアを通過するときに短命電流偏向のものである(図37)。3.6kbが、上記のように3.6kb中に見られるDNA配列に相補的であるcrRNA配列を有するCRISPR−dCas9複合体に結合している場合、信号は、ポアを通過するCRISPR−dCas9複合体を表す追加のサブレベルを有する(図38)。複数のCRISPR−dCas9複合体がDNAに結合している場合、各複合体は、電流に対して別々の偏向を引き起こす(図39)。dCasが修飾または装飾される場合、信号は、各複合体が細孔を通過するときに変化する(図40)。複合体によって引き起こされる電流偏向の信号位置の変化は、ポリヌクレオチド(例えばDNA)についての情報を提供するために使用することができる。
この実施例は、標的分子の富化後のナノポア配列決定による複雑なバックグラウンドにおける特定のポリヌクレオチドの検出方法を記載する。この実施例では、標的DNA分子は、主にその配列によって同定される。標的分子は、dCas9分子上の捕捉部分を介した「プルダウン」によってバックグラウンドから分離される。dCas9は、好ましくは、Escherichia coliのリボソーム16S(rrs)遺伝子に対するcrRNAによって標的分子に結合する。「オフターゲット」効果は、捕捉ビーズ表面上でのその後の精製前に過剰な未結合dCas9を除去するためのSPRI精製ステップと組み合わせて、結合dCas9タンパク質に熱および塩ストレスを加えることによって低減する。標的DNA分子は、ナノポア配列決定に適合され、dCas9は、アダプター上に装填された酵素によって変位されるまでその標的に結合したままである。
E.coli全ゲノムライブラリー、ONLA18816(NCBI参照配列:NC_000913.3)を、製造業者の指示に従って、Covaris gTubeを用いるE.coli高分子量ゲノムDNAの約5.9kbの中央サイズへのランダム断片化によって調製した。このライブラリーを次いで、製造業者の指示に従って、NEB Ultra IIキットを使用して末端修復およびdAテール化した。末端修復およびdAテーリング後、断片化ゲノムDNAを、0.4×SPRI精製に供し、0.1×TE中でSPRIビーズから溶出した。
図42は、MinKNOW 1.7.14ソフトウェアで標準ベースライン配列決定スクリプトを実行するOxford Nanopore Technologies MinIONフローセルを使用して上記プロトコルを用いる6時間の配列決定ランにわたって収集されたデータを示す。このプルダウンに使用される単一のcrRNAプローブ、AR400は、dCas9を図42Dに列挙される7つの16Sリボソーム遺伝子部位の各々に誘導すると予想され、1つの位置は、位置viiとして同定され、PAM部位に対して−2位に単一の不一致を担持し、別の位置は、ピークiとして同定され、PAM部位に対して−6位に単一の不一致を担持する。約4.6Mbのゲノムのうち、約35kb(約0.76%)のインプットDNA(7×中央リード長、5.9kb)が標的と考えられ得る。92,942配列決定リードがこのランから得られ、標準的なベースコールおよびアラインメント解析ワークフローを通して配置された。85,126リードをE.coliMG1655ゲノム(NC_000913.3)にマッピングすることができ、そのうち62,943(73.9%)が各予想プローブハイブリダイゼーション位置の3つの中央リード長内にマッピングされた。配列決定リードのパイルアップは、位置i、ii、iii、iv、vおよびviの各々について9,000〜10,000倍のカバレッジ深度をもたらした。
この実施例は、標的分子の富化後の、ナノポア配列決定による複雑なバックグラウンドにおける特定のポリヌクレオチドの検出方法を記載する。この実施例では、標的DNA分子は、主にその配列によって同定される。標的分子は、dCas9分子上の捕捉部分を介した「プルダウン」によってバックグラウンドから分離される。dCas9は、好ましくは、Escherichia coliのリボソーム16S(rrs)遺伝子に対するcrRNAによって標的分子に結合する。「オフターゲット」効果は、dCas9タンパク質に熱および塩ストレスを加えること、続いてtracrRNAに特異的な捕捉表面上のdCas9−標的複合体の精製および溶出、ならびにdCas9−標的複合体のcrRNAに特異的な第2の特異的捕捉表面への転移によって最小化される。第1の「精製」ビーズからの標的の放出は、トーホールド変位として知られる現象によってもたらされる。標的DNA分子は、ナノポア配列決定に適合され、dCas9は、アダプター上に装填された酵素によって変位されるまでその標的に結合したままである。
E.coli全ゲノムライブラリー、ONLA18816を、製造業者の指示に従って、Covaris gTubeを用いるE.coli高分子量ゲノムDNAの約7kbの中央サイズへのランダム断片化によって調製した。このライブラリーを次いで、製造業者の指示に従って、NEB Ultra IIキットを使用して末端修復およびdAテール化した。末端修復、dAテール化、断片化ゲノムDNAを、0.4倍SPRI精製に供し、0.1倍TE中でSPRIビーズから溶出した。
図45は、非標的E.coliDNAからのE.coli16S遺伝子標的の富化に対する、熱ストレス、SPRI精製、精製ビーズ結合、トーホールド変位、および捕捉ビーズ結合のコンビナトリアル効果を示す。結果を、オンターゲットのリード%を示す、以下の表に要約する。
ONLP12326:S.pyogenes Cas9 D10A/H840A、TEV開裂可能なリンカーを有するC末端Twin−Strepタグ、括弧内太字はTEV(上記配列)によって開裂された部分を示す。
この実施例は、標的分子の富化後の、ナノポア配列決定による複雑なバックグラウンドにおける特定のポリヌクレオチドの検出方法を記載する。この実施例では、標的DNA分子は、主にその配列によって同定される。標的分子は、dCas9分子上の捕捉部分を介した「プルダウン」によってバックグラウンドから分離される。dCas9は、好ましくは、Escherichia coliのリボソーム16S(rrs)遺伝子に対するcrRNAによって標的分子に結合する。オフターゲット、すなわち不一致領域の結合は、dCas9を「特異性強化型dCas9」として知られるdCas9酵素の突然変異誘導体のそうでなければ野生型のバックグラウンドで置換すること、ならびに捕捉ビーズ表面上でのその後の精製の前に過剰な未結合dCas9を除去するためのSPRI精製ステップと組み合わせて、結合dCas9タンパク質に熱および塩ストレスを加えることによって低減する。標的DNA分子は、ナノポア配列決定に適合され、dCas9は、アダプター上に装填された酵素によって変位されるまでその標的に結合したままである。
E.coli全ゲノムライブラリー、ONLA18816を、製造業者の指示に従って、Covaris gTubeを用いるE.coli高分子量ゲノムDNAの約5.9kbの中央サイズへのランダム断片化によって調製した。このライブラリーを次いで、製造業者の指示に従って、NEB Ultra IIキットを使用して末端修復およびdAテール化した。末端修復およびdAテーリング後、断片化ゲノムDNAを、0.4×SPRI精製に供し、0.1×TE中でSPRIビーズから溶出した。
図46は、MinKNOW 1.7.14ソフトウェアで標準ベースライン配列決定スクリプトを実行するOxford Nanopore Technologies MinIONフローセルを使用して上記プロトコルを用いる6時間の配列決定ランにわたって収集されたデータを示す。このプルダウンに使用される単一のcrRNAプローブ、AR191は、dCas9を図42、Dに列挙される7つの16Sリボソーム遺伝子部位の各々に誘導すると予想され、1つの位置は、文字CおよびDとして同定され、PAM部位に対して−2位に単一の不一致を担持する。この位置は、図42、Dにおいて同定されるピークviiに対応する。CまたはDとして同定される不一致ピークに対する最大ピークの高さの比は、野生型dCas9および「特異性強化型」dCas9バリアントについてそれぞれ3.33:1および9.45:1であった。
ONLP12296:「特異性強化型dCas9」として知られる、S.pyogenes Cas9 D10A/H840A/K848A/K1003A/R1060A:TEV開裂可能なリンカーを有するC末端Twin−Strepタグ、括弧内太字はTEV(上記配列)によって開裂された部分を示す。
ONLP12326:S.pyogenes Cas9 D10A/H840A、TEV開裂可能なリンカーを有するC末端Twin−Strepタグ、括弧内太字はTEV(上記配列)によって開裂された部分を示す。
この実施例は、標的分子の富化後の、ナノポア配列決定による複雑なバックグラウンドにおける特定のポリヌクレオチドの検出方法を記載する。この実施例では、標的DNA分子を主にその配列によって同定し、リード方向性バイアスに対する触媒活性(「生きた」、野生型)および死んだ(D10A/H840A)Cas9の効果を調査した。方向性バイアスは、特定のリード方向について富化するために使用され得る。標的分子は、Cas9分子上の捕捉部分を介した「プルダウン」によってバックグラウンドから分離される。Cas9は、好ましくは、Escherichia coliのリボソーム16S(rrs)遺伝子に対するcrRNAによって標的分子に結合する。「オフターゲット」効果は、捕捉ビーズ表面上でのその後の精製前に過剰な未結合Cas9を除去するためのSPRI精製ステップと組み合わせて、結合Cas9タンパク質に熱および塩ストレスを加えることによって低減する。標的DNA分子は、ナノポア配列決定に適合され、Cas9は、アダプター上に装填された酵素によって変位されるまでその標的に結合したままである。
E.coli全ゲノムライブラリー、ONLA18816を、製造業者の指示に従って、Covaris gTubeを用いるE.coli高分子量ゲノムDNAの約5.9kbの中央サイズへのランダム断片化によって調製した。このライブラリーを次いで、製造業者の指示に従って、NEB Ultra IIキットを使用して末端修復およびdAテール化した。末端修復およびdAテーリング後、断片化ゲノムDNAを、0.4×SPRI精製に供し、0.1×TE中でSPRIビーズから溶出した。
図47は、プルダウンに触媒不活性Cas9(「死んだ」、A)または活性Cas9(「生きた」、B)のいずれかを用いて、MinKNOW 1.7.14ソフトウェアで標準ベースライン配列決定スクリプトを実行するOxford Nanopore Technologies MinIONフローセルを使用して上記プロトコルを用いる6時間の配列決定ランにわたって収集されたデータを示す。このプルダウンに使用される単一のcrRNAプローブ、AR400は、Cas9を図42、Dに列挙される7つの16Sリボソーム遺伝子部位の各々に誘導すると予想される。この例において上昇したインキュベーション温度に起因する、追加のピーク、*も見られる。それぞれCおよびDとして同定される、「死んだ」および「生きた」Cas9のカバレッジ方向性プロットは、生きたCas9によって課されるわずかな追加の方向性バイアスを実証する。
ONLP12326:S.pyogenes Cas9 D10A/H840A、TEV開裂可能なリンカーを有するC末端Twin−Strepタグ、括弧内太字はTEV(上記配列)によって開裂された部分を示す。
この実施例は、標的分子の富化後の、ナノポア配列決定による複雑なバックグラウンドにおける特定のポリヌクレオチドの混合物の検出を多重化するための方法を記載する。この例では、同じE.coli全ゲノム試料を、crRNAプローブの異なる組み合わせを含む複数の別々の富化dCas9「プルダウン」に供した。各試料を特定のDNAバーコードアダプター配列とライゲーションし、全ての試料を同じフローセルを用いて同時に配列決定し、それらのバーコードアダプターを用いて同定することを可能にした。
E.coli全ゲノムライブラリー、ONLA18816を、製造業者の指示に従って、Covaris gTubeを用いるE.coli高分子量ゲノムDNAの約5.9kbの中央サイズへのランダム断片化によって調製した。このライブラリーを次いで、製造業者の指示に従って、NEB Ultra IIキットを使用して末端修復およびdAテール化した。末端修復およびdAテーリング後、断片化ゲノムDNAを、0.4×SPRI精製に供し、0.1×TE中でSPRIビーズから溶出した。500ngのこのライブラリーを次に、Oxford Nanopore TechnologiesのNative Barcoding Kit 1D(Cat#EXP−NBD103)からの7つのネイティブバーコード(NB)アダプター、NB01、NB02、NB03、NB04、NB05、NB06、およびNB07の各々に、製造業者の指示に従ってライゲーションした。
図48、Dは、上記の多重化プロトコルを用いる6時間の配列決定ランにわたって収集された、E.coliゲノムに対して整列させたリードからのカバレッジプロットを示す。試料を、MinKNOW 1.7.14ソフトウェアで標準ベースライン配列決定スクリプトを実行する単一のOxford Nanopore Technologies MinIONフローセルにかけ、使用されるNative Barcoding Kitに適したOxford Nanopore Technologiesワークフローを用いて分析した。
ONLP12326:S.pyogenes Cas9 D10A/H840A、TEV開裂可能なリンカーを有するC末端Twin−Strepタグ、括弧内太字はTEV(上記配列)によって開裂された部分を示す。
この実施例は、標的分子の富化後の、ナノポア配列決定による複雑なバックグラウンドにおける特定のポリヌクレオチドの検出方法を記載する。この実施例では、標的DNA分子は、主にその配列によって同定される。標的分子は、dCas9分子上の捕捉部分を介した「プルダウン」によってバックグラウンドから分離される。dCas9は、好ましくは、Escherichia coliのリボソーム16S(rrs)遺伝子に対するcrRNAによって標的分子に結合する。「オフターゲット」効果は、ビーズ表面上でのその後の捕捉前に過剰な未結合dCas9を除去するためのSPRI精製ステップと組み合わせて、結合dCas9タンパク質に熱および塩ストレスを加えることによって低減する。
E.coli全ゲノムライブラリー、ONLA18816を、製造業者の指示に従って、Covaris gTubeを用いるE.coli高分子量ゲノムDNAの約5.9kbの中央サイズへのランダム断片化によって調製する。このライブラリーを、製造業者の指示に従って、NEB Ultra IIキットを使用して末端修復およびdAテール化する。末端修復およびdAテーリング後、断片化ゲノムDNAを、0.4×SPRI精製に供し、0.1×TE中でSPRIビーズから溶出する。この試料は、「dA−テール化lゲノムDNA」として知られている。
上記のワークフローの各々からの結果は、図42に描写されるもの、すなわち、全ゲノム試料からのE.coli rrs遺伝子の標的化富化と非常に類似した結果をもたらす。この例における唯一の相違は、配列決定アダプターを付着するための末端調製の方法である。バーコードの連続的なライゲーションを介して、1D2アダプター、続いて酵素装填配列決定アダプターを付着する能力は、ナノポア配列決定の単一分子精度を高める。トランスポザーゼを介したアダプターの結合、続いてクリックケミストリーを介した酵素フリーライゲーションを行う能力は、エンドユーザーにより大きな利便性を与え、より速い試料調製時間を可能にし得る。PCRアダプターを付着する能力は、エンドユーザーにかなり改善された感度を与え、はるかに少ない投入量の出発材料から富化標的の検出を可能にし得る。
ONLP12326:S.pyogenes Cas9 D10A/H840A、TEV開裂可能なリンカーを有するC末端Twin−Strepタグ、括弧内太字はTEV(上記配列)によって開裂された部分を示す。
この実施例は、標的分子の富化後の、ナノポア配列決定による複雑なバックグラウンドにおける特定のポリヌクレオチドの検出方法を記載する。この例では、標的DNA分子は、主にその配列によって同定される。標的分子は、触媒活性(「生きた」、野生型)Cpf1(ONLP12350)または不活性(E993AまたはD908A)dCpf1(ONLZ11882またはONLZ11883)上の捕捉部分を介した「プルダウン」によってバックグラウンドから分離される。Cpf1またはdCpf1は、好ましくは、Escherichia coliのリボソーム16S(rrs)遺伝子に対するcrRNAによって標的分子に結合する。「オフターゲット」効果は、ビーズ表面上でのその後の捕捉前に過剰な未結合Cpf1またはdCpf1を除去するためのSPRI精製ステップと組み合わせて、結合Cpf1またはdCpf1タンパク質に熱および塩ストレスを加えることによって低減する。
E.coli全ゲノムライブラリー、ONLA18816を、製造業者の指示に従って、Covaris gTubeを用いるE.coli高分子量ゲノムDNAの約5.9kbの中央サイズへのランダム断片化によって調製する。このライブラリーを、製造業者の指示に従って、NEB Ultra IIキットを使用して末端修復およびdAテール化する。末端修復およびdAテーリング後、断片化ゲノムDNAを、0.4×SPRI精製に供し、0.1×TE中でSPRIビーズから溶出する。この試料は、「dA−テール化lゲノムDNA」として知られている。
上記のワークフローからの結果は、図42に描写されるものおよび図47に描写されるもの、すなわち、全ゲノム試料からのE.coli rrs遺伝子の標的化富化と非常に類似した結果をもたらす。生きたCpf1は、方向性バイアスを課し得る。この実施例における相違は、RNPを形成するために使用されるCRISPRタンパク質(すなわち、Cas9またはdCas9ではなく、Cpf1またはdCpf1)、およびRNPを形成するための単一DNA伸長型crRNAの使用である。
ONLP12350:Acidaminococcus sp.Cpf1、TEV開裂可能なリンカーを有するN末端Twin−Strepタグ、括弧内太字はTEVによって開裂された部分を示す:
この実施例は、ナノポア検出によるヒトバックグラウンドにおける特定のバクテリオファージラムダポリヌクレオチドの迅速な検出および定量化のための方法を記載する。この実施例では、標的DNAを、表面上への標的分子の固定化に使用され得る親和性タグを保有する1つ以上のdCas9−RNP複合体(複数可)(「固定化dCas9複合体(複数可)」)に接触させ、1つ以上のさらなるdCas9−RNP複合体(「バーコードCas9複合体(複数可)」)は、第2の領域において標的DNA分子と接触する。「バーコードdCas9複合体」は、その電流シグネチャーがdCas9がその標的に結合していることを確認するために使用される、酵素装填アダプター分子を保有する。標的領域の存在は、バーコードによって同定され、一方で非標的DNAに対する標的の検出の感度は、膜表面上への固定化によって向上する。よって、dCas9複合体の両方の種類は、バーコード配列の検出を成功させるために、同じ標的分子に結合している必要がある。この例では、非標的DNAを洗い流す必要はない。
バクテリオファージラムダ全ゲノムライブラリー(NEB Cat#N3013)を、製造業者の指示に従って、Covaris gTubeを用いるE.coli高分子量ゲノムDNAの約5kbの中央サイズへのランダム断片化によって調製する。ヒト全ゲノムライブラリーも、製造業者の指示に従って、Covaris gTubeを用いる高分子量ゲノムDNA(Sigma Aldrich、Cat#000000011691112001)の約5kbの中央サイズへのランダム断片化によって調製する。
図52は、上記の例を漫画形態で示す。ナノポア配列決定リードアウトは、酵素装填アダプターCに依存する(バーコード配列bをもたらすようにベースコールされ得る)特徴的な事象L1によって中断され、その頻度は、標的分析物(膜テザリング種G、および溶液種H)の濃度に依存し、膜テザリング種Gは、ナノポアへのその近接のため、ナノポアJによって優先的に捕捉される。一定量のヒト非標的DNAに対する標的分析物(バクテリオファージラムダ)の滴定は、標的分析物濃度に対する事象L1の頻度のプロットMをもたらす。ゼロ標的分析物濃度(N)での事象L1の頻度は、溶液から捕捉される(すなわち、表面にテザリングされていない)種Hの検出の「偽陽性」またはバックグラウンド率を示す。
ONLP12326:S.pyogenes Cas9 D10A/H840A、TEV開裂可能なリンカーを有するC末端Twin−Strepタグ、括弧内太字はTEV(上記配列)によって開裂された部分を示す。
CRISPR−dCas9複合体が存在しない場合、またはCRISPR−dCas9複合体が3.6kb中のDNA配列に相補的であるcrRNA配列を有さない場合、得られる信号は、3.6kbがポアを通過するときに短命電流偏向のものである(図37)。3.6kbが、上記のように3.6kb中に見られるDNA配列に相補的であるcrRNA配列を有するCRISPR−dCas9複合体に結合している場合、信号は、ポアを通過するCRISPR−dCas9複合体を表す追加のサブレベルを有する(図38)。複数のCRISPR−dCas9複合体がDNAに結合している場合、各複合体は、電流に対して別々の偏向を引き起こす(図39)。dCasが修飾または装飾される場合、信号は、各複合体がポアを通過するときに変化する(図40)。複合体によって引き起こされる電流偏向の信号位置の変化は、ポリヌクレオチド(例えばDNA)についての情報を提供するために使用することができる。
Claims (75)
- 試料中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、
(a)前記試料を前記標的ポリヌクレオチド中の配列に結合するガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質と接触させることであって、前記ガイドポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、前記試料中に存在する任意の標的ポリヌクレオチドと複合体を形成する、接触させることと、
(b)前記試料を、膜貫通ポアを含む膜と接触させることと、
(c)前記膜にわたり電位差を印加することと、
(d)前記複合体の存在または不在を決定し、それによって前記試料中の前記標的ポリヌクレオチドを検出するように、前記複合体と前記膜貫通ポアとの相互作用から生じる効果の存在または不在を監視することと、を含む、方法。 - 前記ガイドポリヌクレオチドが、ガイドRNAであり、前記ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、RNA誘導型エフェクタータンパク質である、請求項1に記載の方法。
- 前記RNA誘導型エフェクタータンパク質が、RNA誘導型エンドヌクレアーゼまたは前記RNA誘導型エンドヌクレアーゼであり、RNA誘導型エンドヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性が無効化されている、請求項2に記載の方法。
- (i)前記RNA誘導型エンドヌクレアーゼの1つ以上の触媒ヌクレアーゼ部位が不活性化されている、および/または
(ii)前記RNA誘導型エンドヌクレアーゼがCas、Cpf1、もしくはC2c2である、請求項3に記載の方法。 - 前記Casが、Cas9である、請求項4に記載の方法。
- 前記標的ポリヌクレオチドが、二本鎖であるか、もしくは二本鎖領域を含み、および/またはDNA、DNA/RNAハイブリッド、またはRNAである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(b)の前に前記標的ポリヌクレオチドに特異的に結合していない任意のポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質を選択的に変性させること、および/または前記標的ポリヌクレオチドに特異的に結合していない任意のポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質を除去することをさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的ポリヌクレオチドに特異的に結合していない任意のポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、約50℃〜約60℃まで加熱することによって変性する、請求項7に記載の方法。
- 前記標的ポリヌクレオチドに特異的に結合していないポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、前記試料中の前記ポリヌクレオチドをビーズまたはカラムに結合させることによって、前記ガイドポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質、および標的ポリヌクレオチドを含む前記複合体から分離される、請求項7または8に記載の方法。
- ポリエチレングリコール(PEG)および塩化ナトリウムを前記試料に添加し、前記試料をカルボキシル基でコーティングされた常磁性ビーズと、前記試料中に存在する前記ポリヌクレオチドが前記ビーズに結合するように接触させることを含む、請求項9に記載の方法。
- 前記ガイドポリヌクレオチドが、前記標的ポリヌクレオチド中の配列に結合するヌクレオチド配列と、前記ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質に結合するヌクレオチド配列とを含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ガイドポリヌクレオチドが、前記標的ポリヌクレオチド中の配列に結合するcrRNAとtracrRNAとを含むガイドRNAである、請求項11に記載の方法。
- 前記ガイドRNAが、sgRNAである、請求項12に記載の方法。
- 前記ガイドポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質、または前記標的ポリヌクレオチドが、それに付着している前記膜に連結することができるアンカーを有する、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アンカーが、コレステロールを含む、請求項14に記載の方法。
- 前記アンカーが、前記ガイドポリヌクレオチド上の伸長部にハイブリダイズされたポリヌクレオチドを介して前記ガイドポリヌクレオチドに付着している、請求項14または15に記載の方法。
- 前記ガイドポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質、または前記標的ポリヌクレオチドが、それに付着している表面に結合することができる結合部分を有する、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記表面が、ビーズの表面である、請求項17に記載の方法。
- 前記結合部分が、前記ガイドポリヌクレオチド上の末端伸長部である、請求項17または18に記載の方法。
- 前記ガイドポリヌクレオチドが、任意選択に前記ガイドポリヌクレオチド上の末端伸長部である、2つの結合部分を含む、請求項17〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ガイドポリヌクレオチドが、第1の末端伸長部および第2の末端伸長部を含み、前記方法が、ステップ(b)の前に、
(i)前記ガイドポリヌクレオチド/ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質/標的ポリヌクレオチド複合体が前記表面に結合するように、前記試料を、それに結合している前記第1の末端伸長部に相補的な配列を含む第1の捕捉オリゴヌクレオチドを有する表面と接触させることと、
(ii)前記ガイドポリヌクレオチド/ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質/標的ポリヌクレオチド複合体が前記表面から放出されるように、前記表面に結合している前記ガイドポリヌクレオチド/ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質/標的ポリヌクレオチド複合体を、競合オリゴヌクレオチドと接触させることと、
(v)前記ガイドポリヌクレオチド/ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質/標的ポリヌクレオチド複合体が前記ビーズに結合するように、前記ガイドポリヌクレオチド/ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質/標的ポリヌクレオチド複合体を、それに結合している前記第2の末端伸長部に相補的な配列を含む第2の捕捉オリゴヌクレオチドを有するビーズと接触させることと、任意選択に
(vi)前記ビーズを前記膜貫通ポアに送達することと、を含む、請求項20に記載の方法。 - 前記膜および/またはビーズに連結していないガイドポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質、および/またはポリヌクレオチドを洗い流すステップをさらに含む、請求項14〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的ポリヌクレオチドが、リーダー配列を含む、請求項1〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ガイドポリヌクレオチドが、それに付着しているアダプターを有し、任意選択に前記アダプターがバーコードおよび/またはリーダー配列を含む、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
- ポリヌクレオチド結合タンパク質が、リーダー配列に付着している、請求項23または24に記載の方法。
- ステップ(d)が、前記ポアを通した前記アダプター、前記標的ポリヌクレオチド、または前記ガイドポリヌクレオチドの転座によって引き起こされる効果について監視することを含む、請求項21〜25のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(a)が、前記試料および膜貫通ポアを、
(a)第1のガイドポリヌクレオチドおよび第1のポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質であって、前記第1のガイドポリヌクレオチドが、前記標的ポリヌクレオチド中の第1の配列に結合し、それに付着しているアダプターを有する、第1のガイドポリヌクレオチドおよび第1のポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質と、ならびに
(b)第2のガイドポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質であって、前記第2のガイドポリヌクレオチドが、前記標的ポリヌクレオチド中の第2の配列に結合し、前記第2のガイドポリヌクレオチドまたは前記第2のポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、それに付着している表面に連結することができるアンカーを有する、第2のガイドポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質と、に接触させることを含む、請求項1〜26のいずれか一項に記載の方法。 - (i)前記第1および第2のポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が同じであり、前記第2のポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、それに付着しているアンカーを有さないか、または
(ii)前記第1および第2のポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、異なるRNA誘導型エフェクタータンパク質である、請求項27に記載の方法。 - 前記アダプターの前記膜貫通ポアとの相互作用を検出することを含む、請求項27または28に記載の方法。
- 前記アダプターが、バーコードを含む、請求項29に記載の方法。
- ステップ(a)が、前記試料を2つ以上の第1のガイドポリヌクレオチドと接触させることであって、前記2つ以上の第1のガイドポリヌクレオチドが、異なるポリヌクレオチド配列に結合する、接触させることを含む、請求項27〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記2つ以上の第1のガイドポリヌクレオチド複合体上の前記アダプターが、異なるバーコードを含む、請求項31に記載の方法。
- 前記異なるポリヌクレオチド配列が、同じ標的ポリヌクレオチド内にあるか、または前記標的ポリヌクレオチド中に存在し得る代替配列である、請求項31または32に記載の方法。
- 前記代替配列が、SNPを含む、請求項33に記載の方法。
- ステップ(a)が、前記試料を2つ以上の第2のガイドポリヌクレオチド/ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体と接触させることであって、前記2つ以上の第2のガイドポリヌクレオチドが、異なるポリヌクレオチド配列に結合する、接触させることを含む、請求項27〜34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記異なる標的配列が、異なる標的ポリヌクレオチド中に存在する、請求項31、32、または35に記載の方法。
- 前記試料が、それに付着しているポリヌクレオチド結合タンパク質を有するポリヌクレオチドを含む、請求項1〜26のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(c)の前に、前記ポリヌクレオチド結合タンパク質を前記ポリヌクレオチドに沿って移動させるステップであって、前記ポリヌクレオチド結合タンパク質の移動が、前記標的ポリヌクレオチドに結合しているガイドポリヌクレオチド/ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体に到達すると停止する、ステップを含む、請求項37に記載の方法。
- ステップ(d)において前記膜貫通ポアが、前記標的ポリヌクレオチドに結合している前記ガイドポリヌクレオチド/ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体が前記ポアを通した前記標的ポリヌクレオチドの転座中に前記複合体から変位されるように寸法決定される、請求項38に記載の方法。
- 前記ガイドポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、それに付着しているビーズに連結することができる結合部分を有し、ステップ(a)において前記ガイドポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、ビーズに連結しているか、またはステップ(a)が、前記試料をビーズと接触させることをさらに含む、請求項37または38に記載の方法。
- 前記標的ポリペプチドの量または前記標的ポリヌクレオチドの1つ以上の特徴を決定することをさらに含む、請求項1〜40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上の特徴が、(i)前記標的ポリヌクレオチドの長さ、(ii)前記標的ポリヌクレオチドの同一性、(iii)前記標的ポリヌクレオチドの配列、(iv)前記標的ポリヌクレオチドの二次構造、および(v)前記標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否か、から選択される、請求項41に記載の方法。
- 前記標的ポリヌクレオチドが、それに付着している膜に連結することができるアンカーを有し、前記ガイドポリヌクレオチドが、それに付着しているアダプターおよび/またはリーダー配列を有する、請求項1〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アダプターの前記膜貫通ポアとの相互作用を検出することを含む、請求項43に記載の方法。
- 前記アダプターが、バーコードを含む、請求項44に記載の方法。
- ステップ(a)が、前記試料を2つ以上のガイドポリヌクレオチドと接触させることであって、前記2つ以上のガイドポリヌクレオチドが、前記標的ポリヌクレオチド中の異なる配列に、または異なる標的ポリヌクレオチドの配列に結合する、接触させることを含む、請求項37〜45のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポアが、前記複合体全体が前記ポアを通過するように寸法決定される、請求項1〜26のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(a)後に、前記試料中の前記ポリヌクレオチドが断片化される、および/または前記ガイドポリヌクレオチドおよび/またはポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、前記標的ポリヌクレオチドに架橋される、請求項1〜47のいずれか一項に記載の方法。
- 試料中の二本鎖ポリヌクレオチドを含む標的を検出する方法であって、
(a)前記試料を第1のプローブおよび第2のプローブと接触させることであって、前記第1のプローブおよび前記第2のプローブが、前記試料中に存在する任意の標的ポリヌクレオチドと複合体を形成し、前記第1のプローブが、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中の第1の配列に結合し、表面に連結することができるアンカーを含み、前記第2のプローブが、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中の第2の配列に結合し、アダプター配列を含む、接触させることと、
(b)前記試料を膜貫通ポアと接触させることと、
(c)前記膜貫通ポアに電位を印加することと、
(d)前記複合体の存在または不在を決定し、それによって前記試料中の前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを検出するように、前記複合体と前記膜貫通ポアとの相互作用から生じる効果の存在または不在を監視することと、を含む、方法。 - (i)前記標的ポリヌクレオチドが、DNAおよび/またはRNAを含み、
(ii)任意の未結合プローブが、ステップ(c)の前に洗い流され、
(iii)ステップ(d)が、前記アダプターの前記膜貫通ポアとの相互作用について監視することを含み、
(iv)(a)前記第1のプローブおよび/または前記第2のプローブが、酵素を含み、任意選択に
前記第1のプローブおよび/もしくは前記第2のプローブが、ガイドRNA/RNA誘導型エフェクタータンパク質複合体であるか、または前記第1のプローブおよび/または前記第2のプローブが、RecAコーティングプローブであり、
(b)前記プローブが、PNA、BNA、LNA、γPNA、三重螺旋DNA、またはモルホリノプローブであり、
(v)前記第2のプローブが、ポリヌクレオチドに沿って移動することができるポリヌクレオチド結合タンパク質をさらに含み、任意選択に前記アダプターがリーダー配列を含み、前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が前記リーダー配列に結合しており、
(vi)前記アダプターが、バーコードを含み、
(vii)ステップ(a)が、前記試料および膜貫通ポアを2つ以上の第1のプローブと接触させることであって、前記2つ以上のプローブが、異なるヌクレオチド配列に結合し、任意選択に異なるバーコードを含み、任意選択に前記異なる配列が、同じ標的ポリヌクレオチド内に存在するか、前記標的ポリヌクレオチド中に存在し得る代替配列であるか、または異なる標的ポリヌクレオチド中に存在する、接触させることを含み、
(viii)ステップ(a)が、前記試料および膜貫通ポアを2つ以上の第2のプローブと接触させることであって、前記2つ以上のプローブが異なるヌクレオチド配列に結合する、接触させることを含む、請求項49に記載の方法。 - 前記試料が断片化ゲノムDNAを含むか、または前記試料がゲノムDNAを含み、ステップ(a)が前記ゲノムDNAを断片化することをさらに含む、請求項1〜50のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料が、対象からの生物学的流体である、請求項1〜51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的ポリヌクレオチドが、疾患および/または微生物と関連しているポリヌクレオチドである、請求項1〜52のいずれか一項に記載の方法。
- 前記疾患が、感染性疾患、心疾患、または癌である、請求項53に記載の方法。
- 前記試料が、T細胞DNAを含む、請求項1〜54のいずれか一項に記載の方法。
- 標的ポリヌクレオチド中の配列に結合するヌクレオチド配列、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質、アダプター、および/または表面に連結することができるアンカーに結合するヌクレオチド配列を含む、ガイドポリヌクレオチド。
- ガイドRNAである、請求項56に記載のガイドポリヌクレオチド。
- crRNAおよびtracrRNAを含み、前記crRNAおよびtracrRNAが、任意選択にsgRNA中に存在する、請求項57に記載のガイドポリヌクレオチド。
- (i)前記アンカーまたは(ii)前記アダプターが、前記tracrRNAの5’末端、前記tracrRNAの3’末端、前記crRNAの3’末端、または内部に存在し、前記tracrRNAおよびcrRNAが、sgRNAに含まれる、請求項57または58に記載のガイドポリヌクレオチド。
- それに付着しているポリヌクレオチドに沿って移動することができるポリヌクレオチド結合タンパク質をさらに含む、請求項56〜59のいずれか一項に記載のガイドポリヌクレオチド。
- 前記アンカーが、コレステロールである、請求項56〜60のいずれか一項に記載のガイドポリヌクレオチド。
- 請求項56〜61のいずれか一項に記載のガイドポリヌクレオチドと、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質とを含む、ガイドポリヌクレオチド/ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体。
- 前記ガイドポリヌクレオチドが、ガイドRNAであり、前記ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、RNA誘導型エフェクタータンパク質である、請求項62に記載の複合体。
- 前記RNA誘導型エフェクタータンパク質が、RNA誘導型エンドヌクレアーゼ、または前記RNA誘導型エンドヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性が無効化されているRNA誘導型エンドヌクレアーゼである、請求項63に記載の複合体。
- 前記RNA誘導型エンドヌクレアーゼの触媒ヌクレアーゼ部位のうちの1つ以上が不活性化されている、請求項64に記載の複合体。
- 前記RNA誘導型エンドヌクレアーゼが、Cas、Cpf1、またはC2c2である、請求項64または65に記載の複合体。
- 前記Casが、Cas9である、請求項66に記載の複合体。
- 請求項54〜59のいずれか一項に記載の2つ以上のガイドポリヌクレオチド、または請求項62〜67のいずれか一項に記載の2つ以上の複合体のパネル。
- (a)ガイドポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質、および表面に連結することができるアンカーを含む、キット。
- アダプターおよび/または(ii)ポリヌクレオチドに沿って移動することができるポリヌクレオチド結合タンパク質をさらに含む、請求項69に記載のキット。
- 請求項56〜61のいずれか一項に記載のガイドポリヌクレオチド、請求項62〜67のいずれか一項に記載のガイドポリヌクレオチド/ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質複合体、または請求項68に記載のガイドポリヌクレオチドもしくは複合体のパネルを含む、請求項69または70に記載のキット。
- 試料中の標的ポリヌクレオチドを検出するためのシステムであって、
ナノポアと、
ガイドポリヌクレオチド結合ドメインを含むポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質と、
前記標的ポリヌクレオチドの一部分中の配列に相補的である第1の部分、および前記ポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質の前記ガイドポリヌクレオチド結合ドメインに結合するように適合されている構造物を含むガイドポリヌクレオチドと、を含む、システム。 - 標的ポリヌクレオチドおよび/または膜をさらに含み、前記ナノポアが前記膜中に存在する、請求項72に記載のシステム。
- 前記標的ポリヌクレオチド、ガイドポリヌクレオチド、およびポリヌクレオチド誘導型エフェクタータンパク質が、複合体を形成する、請求項73に記載のシステム。
- 前記標的ポリヌクレオチドが、膜に連結している、請求項73または74に記載のシステム。
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