WO2023229010A1 - 微生物の検出方法及び検出デバイス - Google Patents

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WO2023229010A1
WO2023229010A1 PCT/JP2023/019510 JP2023019510W WO2023229010A1 WO 2023229010 A1 WO2023229010 A1 WO 2023229010A1 JP 2023019510 W JP2023019510 W JP 2023019510W WO 2023229010 A1 WO2023229010 A1 WO 2023229010A1
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WO
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section
channel
separation
complex
nucleic acid
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PCT/JP2023/019510
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泰一 前田
友紀 石川
敦 一柳
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キッコーマン株式会社
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
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    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to a detection method and a detection device for detecting microorganisms.
  • PCR, ATP assay, immunological detection methods, etc. have been mainly used to measure risk microorganisms in foods.
  • PCR has good specificity and detection sensitivity, it is complicated to operate and requires specialized equipment, ATP assay cannot specifically detect microorganisms, and immunological detection has low sensitivity.
  • ATP assay cannot specifically detect microorganisms
  • immunological detection has low sensitivity.
  • Microfluidic channels are a technology that can be used for cell separation and chemical processing of cells.
  • microorganisms are detected using a paper microfluidic chip, but only five types of microorganisms are detected in each genus, and microorganisms cannot be discriminated in units of microbial species. Furthermore, it requires a highly concentrated bacterial sample, and is not satisfactory in terms of specificity and sensitivity.
  • Patent Document 2 by injecting a prepared sample into a microchannel, microorganisms are confined cell by cell in microscopic capsules, and after recovery, the bacteria are lysed and the genome sequence is decoded. In this method, sample preparation and operations after collecting microorganisms are relatively complicated.
  • nanopore is a technology that can detect minute objects.
  • nucleic acids are detected using a solid state nanopore in which holes are formed on a SiN substrate using a TEM.
  • an object of the present invention is to provide a simple detection method and detection device that specifically and sensitively detects microorganisms.
  • the present inventors conducted extensive research to provide a simple detection method and detection device that specifically and sensitively detects microorganisms, and found that a lytic part for lysing microorganisms and a lytic part that communicates with the lytic part.
  • the inventors have discovered a microfluidic device equipped with a separation section for separating nucleic acids from a microbial lysate formed in the section, and have completed the present invention.
  • the present invention relates to, for example, the following [1] to [9].
  • the bacteriolytic agent includes a surfactant.
  • a complex forming part that communicates with the separation part and forms the nucleic acid separated by the separation part into a protein-nucleic acid complex The device according to any one of [1] to [3], further comprising a detection section that communicates with the complex formation section and includes means for detecting the complex.
  • the complex forming section includes a channel holding a substance capable of forming a protein-nucleic acid complex with the specific nucleic acid derived from the microorganism.
  • [6] The device according to [5], wherein the substance is CRISPR-dCas9 to which sgRNA specific to the specific nucleic acid is bound, or a protein marker that specifically binds to the specific nucleic acid.
  • the detection section includes means for electrochemically or optically detecting the complex.
  • the detection section detects the complex using a nanopore.
  • the method of [12] further comprising a complex forming step of forming the nucleic acid separated in the separation section into a protein-nucleic acid complex in the complex forming section.
  • [15] A method for detecting microorganisms in a sample using the device according to any one of [1] to [3], [9] and [10].
  • [16] A lysis step in which microorganisms in the sample are lysed in the lysis section; a separation step of separating nucleic acids from a microbial lysate in a separation section; The method according to [15], comprising, in the detection section, detecting the nucleic acid separated in the separation section.
  • microorganisms can be detected easily and specifically and with high sensitivity through a series of operations.
  • the present invention is particularly easy to use for detecting food-poisoning microorganisms, and is therefore widely and preferably used in various fields such as food manufacturing, distribution, and retail, medical, dental, and pharmaceutical fields, and various environmental measurements.
  • FIG. 1 is a microscopic image showing the results of verifying the bacteriolytic effect using four types of bacteriolytic agents in Example 1.
  • 2 is a graph showing the lysis rate of Bacillus cereus using SDS in Example 1.
  • 1 is a graph showing the lysis rate of Bacillus cereus using SDS and Proteinase K in Example 1.
  • 1 is an electrophoretic photograph showing the results of verifying the influence of SDS on complex formation in Example 1.
  • 2 is a graph showing the evaluation results of current inhibition by the formed nucleic acid-protein complex in Example 1.
  • 1 shows a device 1 of one embodiment. 2 illustrates a mechanism of microorganism detection by the device of one embodiment.
  • 3 shows various flow path structures of the lysing part in Example 2.
  • 3 is a graph showing the degree of bacteriolysis (viability rate) according to various lysing section flow path structures in Example 2.
  • Various bacteriolytic agents in Example 3 are shown.
  • 3 is a graph showing the degree of bacteriolysis (viability rate) by various bacteriolytic agents in Example 3.
  • 3 is a graph showing the degree of bacteriolysis (nucleic acid recovery rate) by BugBuster and sulfobetaine in Example 3.
  • 3 is a graph showing the degree of bacteriolysis (nucleic acid recovery rate) by various bacteriolytic agents in Example 3.
  • FIG. 12 is a graph showing the results of examining the combination of the lytic section flow path structure and the lytic agent in Example 4.
  • 3 is a graph showing the degree of bacteriolysis (nucleic acid recovery rate) for other food poisoning bacteria in Example 5.
  • FIG. 6 is a conceptual diagram of complex formation using a FRET evaluation system in Example 6.
  • 7 shows various channel structures of the composite forming part in Example 7.
  • 7 is a graph showing the composite formation rate obtained using various channel structures in Example 7.
  • Three types of pretreatment integrated channels in Example 8 are shown.
  • the pretreatment integrated channel ver. shown in FIG. 20(B) The detailed structure of 2-1 is shown.
  • the pretreatment integrated channel ver. shown in FIG. 2-1 shows the detailed structure of the separation branch flow path section 33.
  • the degree of bacteriolysis (nucleic acid recovery rate) obtained by three types of pretreatment integrated flow channels in Example 8 is shown.
  • the structure of three types of pretreatment integrated flow channels and the composite formation rate by these pretreatment integrated flow channels in Example 8 are shown.
  • An integrated flow path in Example 8 is shown.
  • the integrated device and the detection results (duration time) of Bacillus cereus using the integrated device in Example 8 are shown.
  • the detection results (duration time) of Bacillus cereus using the integrated device in Example 8 are shown.
  • the detection results (duration time) of Bacillus cereus using the integrated device in Example 8 are shown.
  • the detection results (duration time) of Bacillus cereus using the integrated device in Example 8 are shown.
  • the detection results (duration time) of Bacillus cereus using the integrated device in Example 8 are shown.
  • Example 9 is a plot diagram showing the detection results of Bacillus cereus using the integrated device in Example 9.
  • the detailed structures of Channel 6 and Channel A in Example 2 are shown.
  • the detailed structure of Channel H and Channel I in Example 2 is shown.
  • the detailed structures of Channel G and Channel J in Example 2 are shown.
  • the detailed structure of Channel C and Channel D in Example 2 is shown.
  • the device of one embodiment is a microfluidic device 1 for detecting microorganisms in a sample, and includes a lysis section 2 for lysing microorganisms, and a lysis section 2 in communication with the lysis section 2 to remove microorganisms formed in the lysis section. and a separation section 3 for separating nucleic acids from a lysate.
  • the bacteriolytic section 2 includes a channel for holding a lytic agent for dissolving microorganisms
  • the separating section 3 includes means for separating nucleic acids and other substances contained in the lysate.
  • the microfluidic device 1 may further include a complex formation section 4 and a detection section 5.
  • the test sample can be a sample that can contain any microorganisms, and includes, for example, various food samples, various water samples, various reagent samples, various culture medium samples, and biological samples such as saliva, urine, and sweat.
  • the sample may be liquid or solid, preferably liquid.
  • the amount of sample input is not particularly limited, and in the case of a liquid, it may be, for example, 1 ⁇ l to 100 ml, preferably 1 ⁇ l to 10 ml, more preferably 5 ⁇ l to 5 ml, and 50 to 500 ⁇ l. is particularly preferred.
  • the microorganisms that can be detected are not particularly limited, and include, for example, various hazardous lactic acid bacteria from the viewpoint of food hygiene and contact infection (e.g., lactic acid bacteria included in the genera Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus, etc.), yeasts (e.g., film-producing yeast), and yeasts that cause off-flavors such as Brettanomyces spp.), molds (e.g. molds included in Penicillium spp. and Eurotium spp.), and other bacteria (e.g.
  • various hazardous lactic acid bacteria from the viewpoint of food hygiene and contact infection
  • yeasts e.g., film-producing yeast
  • yeasts that cause off-flavors such as Brettanomyces spp.
  • molds e.g. molds included in Penicillium spp. and Eurotium spp.
  • other bacteria e.g.
  • the detection target is not limited to microorganisms, but may be any sample that can contain nucleic acids.
  • the lower limit for detection of microorganisms may vary depending on the type of microorganism and the detection means, but may be, for example, 100 to 1000 cfu/ml, preferably 10 to 100 cfu/ml.
  • the bacteriolytic agent is not particularly limited, and includes, for example, a surfactant that can dissolve lipids in the cell membrane of microorganisms.
  • surfactants include alkyl sulfates (e.g., dodecyl sulfate, octyl sulfate, decyl sulfate, tetradecyl sulfate, hexadecyl sulfate, octadecyl sulfate), alkylbenzene sulfonates (e.g., 4-octyl sulfate), Benzene sulfonate, 4-decylbenzene sulfonate, 4-dodecylbenzene sulfonate, 4-tetradecylbenzene sulfonate, 4-hexadecylbenzene sulfonate, 4-octadecylbenzene
  • nonanesulfonate decanesulfonate, undecanesulfonate, dodecanesulfonate, tetradecanesulfonate, hexadecanesulfonate, octadecanesulfonate
  • fatty acid salts For example, caprylate, pelargonate, caprate, laurate, myristate, pentadecylate, palmitate, margarate, stearate, arachidate), acyl sarcosinate (e.g.
  • Anionic surfactants such as octoyl sarcosinate, dodecanoyl sarcosinate, decanoyl sarcosinate), cholate, deoxycholate, quaternary ammonium salts (e.g. decyltrimethylammonium salt, dodecyltrimethylammonium salt, tetradecyltrimethylammonium salt, hexadecyltrimethylammonium salt, octadecyltrimethylammonium salt, eicosyltrimethylammonium salt), pyridinium salt (e.g.
  • Ions that can be paired with anionic surfactants or amphoteric surfactants include sodium ions, potassium ions, lithium ions, magnesium ions, calcium ions, iron ions, silver ions, copper ions, nickel ions, zinc ions, Examples include cations such as cobalt ions, and an example of dodecyl sulfate includes sodium dodecyl sulfate (SDS).
  • Pairing ions of cationic surfactants or amphoteric surfactants include anions such as fluoride ion, chloride ion, bromide ion, iodide ion, hydroxide ion, etc., and quaternary ammonium
  • An example of a salt is dodecyltrimethylammonium bromide (DTAB).
  • DTAB dodecyltrimethylammonium bromide
  • the amphoteric surfactant may form a salt with an anion and a cation contained in the same molecule.
  • the concentration of the surfactant used as a bacteriolytic agent is not particularly limited as long as it can dissolve lipids in cell membranes, but for example, it may be from 0.001% (w/v) to 10% (w/v), It is preferably 0.01% (w/v) to 1% (w/v).
  • the bacteriolytic agent may further contain an enzyme capable of decomposing proteins within microbial cells.
  • the enzyme is not particularly limited, and includes, for example, protease K, papain, ginger protease, trypsin, chymotrypsin, pepsin, pancreatin, elastase, lysozyme, and the like.
  • the device 1 of one embodiment includes a bacteriolysis section 2 and a separation section 3 provided in a microchannel.
  • a microfluidic device 1 according to another embodiment includes a bacteriolysis section 2, a separation section 3, a complex formation section 4, and a detection section 5 provided in a microchannel (FIG. 7).
  • the microfluidic device 1 of one embodiment will be described below based on FIGS. 7 and 8.
  • components indicated by reference numbers that are not shown in FIGS. 7 and 8 are shown in FIGS. 22 and 23, which illustrate a part of Example 8 in the microfluidic device 1 shown in FIG. Shown below.
  • the device main body 1 is provided with a microchannel, and a part of the microchannel is provided with a bacteriolytic section 2, a separation section 3, a complex forming section 4, and a detection section 5, and a sample is passed through the bacteriolytic section.
  • the microorganisms are lysed while passing through the channel together with the lytic agent.
  • the obtained microorganism lysate (lysate) exits from the outlet 2c for discharging the lysate, enters the separation section 3 from the inlet 3a of the separation section, and is separated from nucleic acids by the separation means provided in the separation section 3.
  • the nucleic acid is further separated from other substances (contaminants such as cell membrane debris and proteins; Waste) from the inlet of the complex forming section, that is, the inlet 4a (inlet 3) that receives the first resultant, and then transferred to the complex forming section 4. It flows into.
  • the protein-nucleic acid complex is formed by the nucleic acid passing through a channel provided in the complex forming section 4 that holds a substance capable of forming a protein-nucleic acid complex (also referred to as a "complex-forming substance"). is formed, and finally flows to the detection section 5, where the presence or absence of a specific nucleic acid is detected.
  • the channel for holding the lytic agent in the lysis section 2 (channels from 2a to 2c) and the channel for holding the complex forming substance in the complex forming section 4 (channels from 4a to 4c) are , may have the same channel structure or different channel structures; for example, Channel 6 shown in FIG. 1(a), and various channel structures shown in FIG. 10 and FIG. It's fine.
  • the material of the microfluidic device main body is not particularly limited, and examples include, but are not limited to, plastic resins such as polydimethylsiloxane (PDMS).
  • the shape of the microfluidic device is also not limited, and the size is not particularly limited as long as it is a normal size for a microfluidic device.
  • the diameter of the microchannel connecting the bacteriolysis section, separation section, complex formation section, and detection section is not particularly limited, but may be, for example, from 20 ⁇ m to 15 mm, preferably from 100 ⁇ m to 0.5 mm.
  • the bacteriolytic section 2 performs a process of dissolving microorganisms contained in a sample using a bacteriolytic agent. By this treatment, the microorganisms are lysed, and a lysate solution in which the nucleic acids contained in the microorganism cells are dissolved can be obtained.
  • the lysis time in the bacteriolysis zone may be as long as the microorganisms are lysed, for example, from 1 minute to 8 hours, preferably from 5 minutes to 30 minutes.
  • the bacteriolytic section 2 has an inlet 2a (inlet 1) for receiving a sample, an inlet 2b (inlet2) for receiving a lysing agent, and an outlet 2c for discharging a lysing solution.
  • the lysis channel 2S includes a first lysis channel section 21, a second lysis channel section 22, a lysis branch channel section 23, a lysis mixing channel section 24, including.
  • the first lysis channel section 21 is a channel from the inlet 2a to the lysis branch section 23a.
  • the lysis branch section 23a is a part where the sample provided from the first lysis channel section 21 is branched and provided to the lysis branch channel section 23.
  • the second bacteriolytic flow path section 22 is a flow path from the inlet 2b to the bacteriolytic confluence section 23b.
  • the bacteriolytic branch channel section 23 extends along the outer periphery of the rectangular region in plan view.
  • the lysis branch channel section 23 surrounds the inlet 2b and the second lysis channel section 22.
  • the above-mentioned bacteriolytic branch section 23a may be defined as a part of the bacteriolytic branch channel section 23.
  • a lysis confluence section 23b is set on a side opposite to one side of the lysis branch channel section 23 including the lysis branch section 23a.
  • the end of the lysis mixing channel section 24 and the end of the second lysis channel section 22 are connected to the lysis confluence section 23b.
  • the lysis merging section 23b merges the sample provided from the lysis branch channel section 23 and the lytic agent provided from the second lysis channel section 22, and provides the merged product to the lysis mixing channel section 24. . That is, the ends of the lysis branch channel section 23, the second lysis channel section 22, and the lysis mixing channel section 24 are connected to the lysis confluence section 23b.
  • the lysis mixing channel section 24 is a section for mixing the sample coming from the lysis branch channel section 23 and the lytic agent coming from the inlet 2b to lyse the sample.
  • the design of the flow path 2S of the bacteriolytic section 2 is not particularly limited, it is possible to use a device that actively mixes the two liquids of the bacteriolytic agent and the sample (for example, bacterial suspension) without forming a laminar flow, for example, Placing protrusions or obstacles in the lysis mixing channel 24, extending the lysis mixing channel 24 as much as possible, mixing fine particles into the mixture of the lytic agent and sample, and intersecting the two liquids.
  • the channel lysis rate can be increased by increasing the width ratio of the immediately preceding channel, that is, the width ratio of the channels that merge at the lysis merging section 23b.
  • the lysis rate in the lysis area 2 is 50% or more (viable bacteria rate is less than 50%), 60% or more (viable bacteria rate is less than 40%), 70% or more (viable bacteria rate is less than 30%), or 80% or more. (viability rate is less than 20%) or 90% or more (viability rate is less than 10%), and the viability rate can be measured, for example, by the method shown in the Examples.
  • the degree of lysis can also be calculated (defined) by the nucleic acid recovery rate.
  • the nucleic acid recovery rate can be measured, for example, by the method described in the Examples.
  • the lysis mixing flow path section 24 may have a configuration that changes the flow state (pressure, speed) within the flow path. As shown in FIGS. 10(c), 10(d), and 10(f), such a configuration includes a configuration in which portions with a large flow path area and portions with a small flow path area are alternately arranged.
  • a configuration for changing the flow state (pressure, speed) a configuration for changing the flow direction (FIG. 10(e) or (h)), or a configuration including a branch part (FIG. 10(g)) is available. Can be mentioned.
  • the width of the lysis channel 2S may be the same overall, but the width of the channel may be changed in order to increase the lysis rate.
  • the width of the channel 2S is not particularly limited, and may be, for example, 10 ⁇ m to 1000 ⁇ m, 50 ⁇ m to 500 ⁇ m, 50 ⁇ m to 200 ⁇ m, or 100 ⁇ m to 200 ⁇ m.
  • the length of the lysis channel 2S is not particularly limited, and the shorter the length of the portion excluding the lysis mixing channel section 24, the less sample is lost and the detection accuracy is higher.
  • the length of the lysis mixing channel 24 should be long enough to allow sufficient mixing of the lytic agent and the sample, for example, 1 mm or more, 3 mm or more, 5 mm or more, 7 mm or more, or 10 mm or more. It's good.
  • the length of the lysis mixing channel section 24 is too long, sample loss will occur, so the length may be 500 mm or less, 400 mm or less, 300 mm or less, 200 mm or less, 100 mm or less, or 50 mm or less. Specific examples include the widths and lengths shown in FIGS. 32-35.
  • the separation section 3 receives the lysing solution from the lysis section 2. Separation section 3 separates nucleic acids and impurities contained in the lysate. For example, the separation unit 3 may separate and remove impurities from the lysate. The separation unit 3 separates and removes impurities from the lysate and provides the resultant product (liquid containing nucleic acid) to the complex formation unit 4 provided on the downstream side.
  • the separation means in the separation unit 3 is not particularly limited as long as it is capable of separating nucleic acids and substances other than nucleic acids (non-nucleic acid substances, sometimes referred to as "contaminants" in this specification), for example, separation based on molecular size.
  • separation means centrifugal separation means, and hydraulic filtration separation means, among which separation means using hydraulic filtration is preferred.
  • hydrodynamic filtration the size of selected cells and substances can be adjusted arbitrarily by designing the microchannel structure by considering it as an analog of a resistance circuit such as an electric circuit.
  • the degree of separation changes depending on the size and shape of the microorganisms, as well as the state of aggregation of the microorganisms. It is possible to obtain.
  • the following flow path design is performed. Design multiple sub-flow channels on both sides of the main flow channel that can draw out a constant flow rate. As the liquid flowing in the main channel is withdrawn to the sub-channel, cells and particles flowing in the main channel are gradually pressed against the wall of the main channel. Once the amount of water drawn into the sub-channel is determined, the amount of water flowing into each of the main channel/sub-channel is calculated as the width ratio of the main channel. Theoretically, more than half of the particles flowing near the wall are included in the flow of water drawn into the subchannel.In other words, when the water drawn into the subchannel is visualized, the distance from the wall of the main channel is beyond the radius of , they are withdrawn into the secondary channel.
  • the flow rate drawn into the sub-channel can be changed, thereby making it possible to control the size of cells and particles remaining in the main channel.
  • microorganisms whose membranes have been damaged by the bacteriolytic agent are relatively large and enter the main flow, while smaller molecules such as nucleic acids contained in microorganisms are allowed to enter the main flow.
  • the present invention targets the nucleic acid that has flowed into the sub-channel.
  • the separation section 3 of one embodiment includes an inlet 3a, a contaminant collection port 3b, an outlet 3c, and a separation unit 30.
  • the separation unit 30 supplied with the lysis solution from the inlet 3a discharges the first resultant containing nucleic acid from the outlet 3c, and discharges the second resultant containing contaminants from the contaminant collection port 3b.
  • the second resultant contains contaminants with a large molecular size and may also contain nucleic acids.
  • the first resultant contains a highly pure nucleic acid and may contain a small amount of impurities, but is preferably free of impurities.
  • the nucleic acid recovery rate of the separation unit 3 can be defined as the ratio (nucleic acid recovery rate) of the amount of nucleic acid in the first resultant recovered from the outlet 3c to the amount of nucleic acid in the lysate introduced into the inlet 3a.
  • the nucleic acid recovery rate may be 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, or 90% or more, and the nucleic acid recovery rate can be measured, for example, by the method shown in the Examples.
  • the separation section 3 includes a first separation channel section 31, a second separation channel section 32, and a separation branch channel section 33.
  • the first separation channel section 31 connects the inlet 3a to the separation unit 30.
  • the position where the first separation channel section 31 is connected is approximately at the center in the direction in which the separation unit 30 extends.
  • the entrance 3a does not need to be a physical component.
  • the inlet 3a is a part defined as a part that receives the lysate.
  • the outlet 2c connected to the inlet 3a is a part defined as a part that discharges the lysate to the inlet 3a, and does not need to be a physical component like the inlet 3a.
  • the first separation channel section 31 may include a first narrow channel section 311, a large diameter channel section 312, and a second narrow channel section 313.
  • the diameter of the large-diameter flow path section 312 may be about five times larger than that of the first narrow-diameter flow path section 311 .
  • a first narrow-diameter flow path section 311 is arranged on the inlet 3a side, and a second narrow-diameter flow path section 313 is arranged on the outlet 3c side. That is, the second narrow-diameter flow path portion 313 is connected to the separation unit 30 .
  • a large diameter channel section 312 is arranged between the first small diameter channel section 311 and the second small diameter channel section 313 .
  • the second separation channel section 32 connects the output of the separation unit 30 to the outlet 3c.
  • the position where the second separation channel section 32 is connected is approximately at the center in the direction in which the separation unit 30 extends. That is, the first separation channel section 31 and the second separation channel section 32 may be arranged in a straight line on a certain imaginary line.
  • the second resultant containing foreign matter is discharged to the foreign matter collection port 3b.
  • the contaminant collection port 3b includes a chamber having a volume capable of pooling the second resultant.
  • FIG. 23 is an enlarged view of an example of the second separation channel section 32.
  • the second separation channel section 32 includes a small diameter channel section 321, a first large diameter channel section 322, and a second large diameter channel section 323.
  • the input end of the narrow diameter channel section 321 is connected to the separation unit 30.
  • the output end of the second large-diameter flow path section 323 is connected to the contaminant collection port 3b.
  • a first large-diameter flow path section 322 is arranged between the small-diameter flow path section 321 and the second large-diameter flow path section 323 .
  • the flow path diameter of the first large diameter flow path section 322 is larger than the flow path diameter of the narrow diameter flow path section 321 but smaller than the flow path diameter of the second large diameter flow path section 323 . That is, in the second separation flow path section 32, the flow path diameter gradually increases as it approaches the contaminant collection port 3b.
  • the diameter of the small diameter channel portion 321 may be 20 ⁇ m
  • the diameter of the first large diameter channel portion 322 may be 25 ⁇ m
  • the diameter of the second large diameter channel portion 323 may be 500 ⁇ m.
  • the length of the small diameter channel section 321 is longer than the length of the first large diameter channel section 322.
  • the length of the small diameter channel portion 321 is 1 cm
  • the length of the first large diameter channel portion 322 is 3.9 mm.
  • the separation branch channel section 33 connects the first portion 30a that outputs the first resultant from the separation unit 30 and the second portion 30b that outputs the first resultant to the outlet 3c.
  • the separation branch channel portion 33 has a U-shape when viewed from above.
  • the separation branch channel section 33 includes an outlet 3c that is a confluence section connected to the end of the inlet 4a of the composite forming section.
  • the outlet 3c may be arranged approximately at the center of one side of the separation branch channel section 33.
  • the outlet 3c is connected to the composite forming part 4.
  • the outlet 3c connects to a composite branch channel section 43 (FIG. 19(a)).
  • the separation branch channel section 33 can also serve as a composite branch channel section 43 that is a part of a composite channel 4S described later.
  • the first composite channel section 41, the second composite channel section 42, and the composite branch channel section 43 can be omitted, and the outlet 3c is connected to the composite mixing channel section 44 ( Figure 22).
  • 3c in FIG. 22 may be used as the outlet 3c of the separating section 3
  • 30a and 30b in FIG. 2 may be used as the outlet 3c of the separating section 3 (FIG. 1(b)).
  • the separation branch flow path section 33 in FIG. 22 can be used as a composite branch flow path section 43
  • the outlet 3c in FIG. 22 can be used as 43b.
  • the complex forming unit 4 causes the first resultant to react with the complex forming substance to form a complex.
  • a substance (complex forming substance) capable of forming a protein-nucleic acid complex with a specific nucleic acid in the nucleic acid (microorganism-derived nucleic acid) in the first resultant separated in the separating section 3 is added.
  • a holding microchannel is provided.
  • the complex-forming substance examples include CRISPR-dCas9 to which sgRNA specific to the above-mentioned specific nucleic acid is bound, and protein markers that specifically bind to the above-mentioned specific nucleic acid.
  • the specific nucleic acid (herein sometimes referred to as "target nucleic acid”) may be a gene or a part thereof specific to the microbial species or genus that can identify the microbial species or genus. preferable.
  • the target nucleic acid may be a lecithinase gene or a cereuride synthesis gene, or a portion thereof.
  • the time for forming the complex in the complex forming section 4 is not particularly limited, and may be, for example, from 1 minute to 8 hours, preferably from 5 minutes to 30 minutes.
  • the flow path design of the complex forming part is not particularly limited, the two liquids of the solution of the lytic agent and the complex forming substance do not form a laminar flow, but are actively mixed as described above, so that the complex can be formed. rate can be increased. That is, the composite forming section may be provided with a configuration that changes the above-mentioned flow state (pressure, speed).
  • the complex formation rate may be 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, or 90% or more, and the complex formation rate can be measured, for example, by the method shown in the Examples.
  • the target nucleic acid and CRISPR-dCas9 to which sgRNA specific to the target nucleic acid is bound can form a complex through Watson-Crick base pair DNA-RNA interaction. Further, in order to detect the complex, it may be labeled (for example, Patent Document 3).
  • the length of the sgRNA is not particularly limited, and is preferably 20 residues or more.
  • sgRNA may be a single molecule, or it may be two or more molecules, such as a complex of CRISPR RNA (crRNA), which is the homing device inherent in bacteria and archaea, and trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA). There may be.
  • Examples of the complex include a complex of Cas9 and sgRNA in which nuclease and nickase activities have been completely eliminated due to introduction of mutations into D10A and H840A, deletion of the active site, etc., or a complex of Cas9 and tracrRNA or crRNA.
  • Examples of Cas proteins include Cas9, which is classified as a type II CRISPR/Cas system, as well as crRNA-Cascade-Cas3 complexes of type I or type III CRISPR-Cas systems, crRNA-Csm (III-A), or Cmr (III -B) complex, Cas12f (Cpf1)-crRNA complex of type V CRISPR-Cas system.
  • crRNA-Csf2-Cas11 complex of the type IV CRISPR-Cas system examples include crRNA-Cas13, a type VI CRISPR-Cas system that targets RNA sequences.
  • the origin of the Cas protein mentioned above is not particularly limited.
  • the protein marker that specifically binds to the target nucleic acid is preferably one that can bind to the target nucleic acid by having a secondary structure of the protein such as a helix recognize the nucleic acid sequence.
  • protein markers include TALE (transcription activator-like effector), ZF (zinc-finger), and pentatricopeptide repeat (PPR) proteins.
  • the complex forming part 4 may have a structure similar to that of the bacteriolytic part 2 (FIGS. 1 and 19).
  • the complex forming section 4 of one embodiment has an inlet 4a for receiving the first resultant, an inlet 4b (inlet3) for receiving the complex forming substance, and an outlet 4c for discharging the complex.
  • the composite formation section 4 has a composite flow path 4S that connects the inlets 4a, 4b and the outlet 4c.
  • the composite channel 4S includes a first composite channel section 41, a second composite channel section 42, a composite branch channel section 43, and a composite mixing channel section 44.
  • the first composite channel section 41 is a channel from the inlet 4a to the composite branch section 43a.
  • the composite branch part 43 a is a part where the first resultant provided from the first composite flow path part 41 is branched and provided to the composite branch flow path part 43 .
  • the second composite channel section 42 is a channel from the inlet 4b to the composite merging section 43b.
  • the composite branch flow path section 43 extends along the outer periphery of the rectangular region in plan view.
  • the composite branch channel section 43 surrounds the inlet 4b and the second composite channel section 42.
  • the aforementioned composite branch section 43a may be defined as a part of the composite branch channel section 43.
  • a composite merging portion 43b is set on a side opposite to one side of the composite branch channel portion 43 including the composite branch portion 43a.
  • An end of the composite mixing channel section 44 and an end of the second composite channel section 42 are connected to the composite merging section 43b.
  • the complex merging section 43b allows the sample provided from the complex branch channel section 43 and the complex-forming substance provided from the second complex channel section 42 to merge together, and converts the merged material into a complex mixed flow. It is provided to the road section 44. That is, the end portions of the composite branch channel section 43, the second composite channel section 42, and the composite mixing channel section 44 are connected to the composite confluence section 43b.
  • the composite mixing channel section 44 is a section for mixing the first resultant coming from the composite branching channel section 43 and the complex forming substance coming from the inlet 4b to form a complex.
  • the design of the complex channel 4S of the complex formation section 4 is not particularly limited, but may be similar to the design of the channel 2S of the bacteriolysis section 2 (FIGS. 10 and 19).
  • the complex formation rate in the complex forming section 4 may be 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, or 90% or more, and the complex formation rate may be, for example, as shown in the examples. It can be measured by the method shown below.
  • the composite mixing flow path section 44 may have a configuration that changes the flow state (pressure, speed) within the flow path. As shown in FIG. 19(d), such a configuration includes a configuration in which portions with a large flow path area and portions with a small flow path area are arranged alternately. Further, as a configuration for changing the flow state (pressure, speed), a configuration for changing the flow direction (FIG. 19(e)), or a configuration including a branch part (FIGS. 10(f), (g), (h)).
  • the width of the composite channel 4S may be the same overall, the width of the channel may be changed in order to increase the composite formation rate.
  • the width of the composite channel 4S is not particularly limited, and may be, for example, 10 ⁇ m to 1000 ⁇ m, 50 ⁇ m to 500 ⁇ m, 50 ⁇ m to 20 ⁇ m, or 100 ⁇ m to 200 ⁇ m.
  • the length of the composite channel 4S is not particularly limited, and the shorter the length of the portion excluding the composite mixing channel section 44, the less sample is lost, and the detection accuracy is higher.
  • the length of the complex mixing flow path section 44 should be long enough to sufficiently mix the first resultant and the complex forming substance, for example, 1 mm or more, 3 mm or more, 5 mm or more, 7 mm. or more, or 10 mm or more.
  • the length of the composite mixing channel section 44 is too long, sample loss will occur, so the length may be 500 mm or less, 400 mm or less, 300 mm or less, 200 mm or less, 100 mm or less, or 50 mm or less. Specific examples include the widths and lengths shown in FIGS. 32-35.
  • the detection unit 5 including means for detecting the complex is not particularly limited, and is preferably equipped with means for detecting the complex electrochemically or optically, for example, using a nanopore. It is preferable that the complex be detected by using the method. Furthermore, it may include means for detecting the nucleic acid by real-time PCR or immunological methods.
  • Nanopores can be performed, for example, by a mechanism as described in Non-Patent Document 1.
  • a nanopore is a lipid bilayer membrane with a transmembrane protein embedded therein, and the transmembrane protein has an opening (nanopore).
  • a voltage is applied to both sides of the lipid bilayer membrane, a current flows, but when the complex fits into the opening of this nanopore, the current value inside the nanopore decreases temporarily (blocking), and the current value does not pass through the nanopore. Or, if it kicks out, the presence of the complex can be detected by recovering the current value.
  • nucleic acids in the case of nucleic acids, they can be distinguished from complexes because their small size means that they remain in the nanopore for a short time, or that the change in current value during passage is small (small blocking).
  • CRISPR-dCas9 in the case of CRISPR-dCas9 that is not bound to nucleic acid, it is positively charged under the measurement pH conditions and does not enter the nanopore (FIG. 9).
  • Non-Patent Document 1 The method used in Non-Patent Document 1 is called a solid state nanopore.
  • Solid-state nanopores are formed by irradiating a solid material such as silicon nitride or graphene with an electron beam using semiconductor microfabrication technology. Solid-state nanopores require large-scale equipment to fabricate, and current issues remain regarding the cost of pore fabrication and the reliability of pore diameter.
  • the nanopores used in the present invention are called biological nanopores that utilize membrane proteins.
  • Biological nanopores are formed by the spontaneous association and insertion of membrane proteins into the membrane, so pore formation is easy, and the pore diameter can be adjusted on a protein molecule basis by protein engineering modification. . Therefore, it is possible to design and construct a pore with a diameter that matches the size of the target nucleic acid-protein complex, making detection with higher sensitivity possible.
  • the method for adjusting the pore diameter is not particularly limited, but for example, if the pore is a type in which multiple membrane protein monomers associate to form a pore, it may be necessary to eliminate or provide structural steric hindrance when the monomers interact with each other.
  • the pore diameter can be increased or decreased.
  • the number of monomers that form a pore can be controlled by making the main chain of the monomer more rigid through amino acid mutations or by reducing the molecular fluctuations of the monomer through experiments at low temperatures.
  • pores of any diameter can be formed by creating pores with a desired diameter using DNA or the like and recruiting membrane protein monomers there.
  • an arbitrary pore diameter can be formed by introducing random amino acid mutations into the monomer and selecting molecules that form an arbitrary pore diameter.
  • the monomer is not limited to a pure membrane protein; for example, a pore modified with a protein marker can be created by binding and co-expressing the monomer and a protein marker.
  • a target nucleic acid is added to such a modified pore, the target nucleic acid can be detected due to a decrease in current value due to binding of the target nucleic acid and a protein marker.
  • a protein marker with an optimal size for a pore whose diameter is adjusted, more sensitive detection can be achieved.
  • the size of the nanopore is not particularly limited as long as it can be adjusted according to the size of the complex, but may be, for example, 1 to 100 nm, preferably 15 to 40 nm.
  • Optical detection includes, for example, fluorescence detection, absorption detection, and spectral detection such as infrared spectroscopy, near-infrared spectroscopy, and Raman spectroscopy.
  • the microfluidic device 1 may be, for example, an integrated device in which a bacteriolysis section and a separation section are provided on a device substrate made of glass or a resin material, and the microfluidic device 1 may be an integrated device in which a bacteriolysis section, a separation section, and a complex formation section are provided. It may be an integrated device provided with a bacteriolysis section, a separation section, a complex formation section, and a detection section.
  • the microfluidic device 1 may include additional equipment connected to the device substrate in order to perform its functions.
  • the microfluidic device 1 may include a pump and a tube connected to the device substrate (specifically, the inlet and/or outlet of each functional part).
  • the microfluidic device 1 of one embodiment includes a lysis section 2, a separation section 3 that communicates with the lysis section, a complex formation section 4 that communicates with the separation section 3, and a detection section 5 that communicates with the complex formation section 4.
  • the detection section 5 uses a means for detecting the complex formed in the complex formation section 4, for example, means for electrochemically or optically detecting the complex, particularly a detection means using nanopores. It is preferable to have one.
  • a microfluidic device 1 includes a bacteriolysis section 2, a separation section 3 that communicates with the bacteriolysis section, and a detection section 5 that communicates with the separation section 3. That is, it is not necessary to include a composite forming part.
  • the detection unit 5 includes means for detecting the nucleic acid obtained in the separation unit 3, such as detection means using real-time PCR or an immunological method.
  • a method for detecting microorganisms in a sample in one embodiment is a method using a microfluidic device of the present invention. It is also preferred that the microfluidic device used is an integrated device.
  • the detection method of one embodiment includes a lysis step in which microorganisms in a sample are lysed in a lysis section, and a separation step in which a nucleic acid is separated from a lysate of the microorganisms in a separation section.
  • the detection method may further include a complex forming step of forming the nucleic acid separated in the separation section into a protein-nucleic acid complex in the complex formation section; It may further include a detection step of detecting a protein-nucleic acid complex.
  • a method for detecting microorganisms in a sample includes using a microfluidic device. a step of lysing the microorganism to obtain a lysate of the microorganism; separating the nucleic acid from the lysate obtained above, and further, It may include a step of forming the separated nucleic acid into a protein-nucleic acid complex, and further, The method may also include a step of detecting the complex.
  • a detection method includes a lysis step in which microorganisms in a sample are lysed in a lysis section, a separation step in which a nucleic acid is separated from a microorganism lysate obtained in the lysis section in a separation section, and a detection step in a detection section. , and a detection step of detecting the nucleic acid separated by the separation section.
  • Example 1 Fabrication of device and detection of microorganisms The design software Illustrator (manufactured by Adobe Inc.) was used to design the flow path.
  • the designed flow paths (Channel 6, Channel 1) are shown in FIG.
  • the width of the channel 6 is 100 ⁇ m, and the detailed structure of the channel is the same as that in FIG. 32(a).
  • the company then sent the design drawings to Tokyo Process Service (TOPRO) and requested that they create a photomask.
  • the photomask was made to have a size of 4 inches, light shielding/transmitting parts: white parts were light shielding, black parts were transparent, and film surface: the printed surface was as designed when viewed from the glass surface.
  • a 4-inch Si wafer was placed in a plasma generator (Yamato Scientific PR-200) with the mirror surface facing up, and treated at 100 W for 30 seconds.
  • the wafer after plasma treatment was set in the center of a spin coater, and SU-8 resist manufactured by Nihon Kapaku Co., Ltd. (SU-8 3025 for Channel 1 and SU-8 3050 for Channel 6) was used in the center of the wafer. It was applied using a dropper with a cut off tip. After spreading the resist over the entire surface of the wafer using a dropper, the spin coater was rotated to uniformly coat the resist. The rotation speed was 500 rpm x 30 seconds, 500 ⁇ 4000 rpm (10 seconds), and 4000 rpm x 30 seconds. After incubating at 95°C for 30 minutes or more, the temperature was lowered to 65°C to solidify the resist. After returning to room temperature, the film thickness was measured.
  • UV exposure A mask was set on the Si wafer so that the Cr surface was in contact with the wafer, and exposed for 5 seconds using a 150W UV exposure device (manufactured by Nanotech). After exposure, the sample was incubated again at 95° C. for 30 minutes.
  • the cored PDMS and glass slide were placed in a plasma generator with the surfaces to be bonded facing up, and after being treated at 100 W for 10 seconds, the glass slide was taken out onto a petri dish with tweezers, and the PDMS was pasted on the glass slide. Silicone tubes of appropriate diameters were inserted into the inlet and outlet of the channel for evaluation.
  • Bacillus cereus strain JCM17690 strain possessing the cereuride synthase gene
  • Bacillus cereus strain NBRC3836 strain not possessing the cereuride synthase gene
  • the glycerol stock was streaked onto a standard agar medium and plated overnight at 30°C under aerobic conditions.
  • the cells were subcultured into a trypto soy broth liquid medium and cultured with shaking at 30°C overnight. The next day, after estimating the number of bacteria by colony counting, a dilution series of the culture solution was prepared with peptone-added saline.
  • Bacteriolytic agent and microorganism suspension Bacteriolytic agent and microorganism suspension (Bacillus cereus suspended in 0.9% saline to a bacterial concentration of 10 7 cfu/ml) at 3.0 ⁇ l/min or 4.0 ⁇ l/min using a syringe pump. suspension) respectively.
  • Bacteriolytic agents include B-PER manufactured by Thermofisher, cationic dodecyltrimethylammonium bromide (DTAB, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), nonionic Triton X-100 (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and anionic sodium dodecyl sulfate ( After adding SDS (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to a final concentration of 1% and reacting at room temperature for 15 hours, the nucleic acids were stained with GelRed manufactured by Biotium. The results are shown in Figure 2. Regarding DTAB and Triton Fluorescence of the aggregates was observed. On the other hand, for SDS, the red fluorescence intensity decreased significantly, suggesting that the internal nucleic acids were efficiently diffusing out of the bacterial cells. From this result, , SDS, an anionic surfactant, was considered suitable for nucleic acid extraction.
  • each bacteriolytic agent and microorganism suspension were added at 8.0 ⁇ l/min using a syringe pump in a Chanel 6 flow path.
  • Bacillus cereus suspension suspended in 0.9% saline was delivered to each tube. Thereafter, it was connected to the inlet of Chanel 1 using a 1 mm diameter tube, and a sample was collected from the outlet of the subchannel (nucleic acid collection port).
  • the bacteriolysis rate was calculated by quantitative PCR.
  • the primers, enzymes, etc. attached to the Cycleave PCRTM Bacillus cereus (CRS gene) Detection Kit (Takara Bio Inc.) were used.
  • the lysate collected from the outlet of the sub-channel was purified using QIAquick Gel Extraction Kit (manufactured by Qiagen) and verified under the following conditions. Hold (initial denaturation): 95°C, 10s ⁇ 3 steps PCR: 45 cycles (95°C, 5s ⁇ 55°C, 10s ⁇ 72°C, 20 seconds).
  • the SDS concentration after passing through Channel 6 and Channel 1 was calculated to be about 0.0225%.
  • lipid bilayer membrane membrane capacity 65-70 pF suitable for insertion of membrane proteins was inserted using a trace rod.
  • the formation of pores due to the association of membrane proteins on the lipid bilayer membrane and the entry of molecules into the pores were detected by changes in the current value.
  • the analysis was performed using Clampex (free software), and the current inside the pores was detected by Blocking conductance, which is calculated from the current value when the current is inhibited, and the duration time during which the current is inhibited were calculated.
  • FIG. 6(D) The results of plotting the detected Blocking conductance and Duration time are shown in FIG. 6(D).
  • Example 2 Examination of the flow path structure of the bacteriolytic part (comparison of viable bacteria rate depending on the flow path structure)
  • a plurality of channels were designed so that the lytic agent and microorganisms could be mixed more efficiently within the channel, and among them, Channel A, C, D, G , H, I, and J channels were used for evaluation (Figure 10). Details of the structures of these Chanels are shown in FIGS. 32 to 35. Note that the channel lengths (length from 2b to 2c) of Channel 6 and Channel A were both 2.5 cm, and the width (diameter) of the channel was 100 ⁇ m unless otherwise specified.
  • a syringe pump was used to pump 0.1% SDS and a microorganism suspension (bacteria number concentration 10 10 cfu/ml) at a rate of 5.0 ⁇ l/min, and a sample was collected from the outlet (2c).
  • the recovered solution was diluted 10 5 times with peptone water, plated on a 100 ⁇ l plate, and cultured overnight at 30°C. The number of bacteria before flowing into the channel was compared with the number of bacteria counted in the recovered solution, and the viable rate was calculated.
  • Example 3 Study of lytic agents (comparison of viability rate using lytic agents) The degree of bacteriolysis of various bacteriolytic agents was compared. Chanel 6 of Example 1 was used throughout the evaluation. The bacteriolytic agents used in the evaluation are shown in Figure 12. Various bacteriolytic agents and microbial suspensions (bacteria number concentration 10 9 cfu/ml) were pumped at 5.0 ⁇ l/min using a syringe pump, and samples were collected from the outlet (2c). Incidentally, the concentration of each addition was adjusted so that the final concentration was the critical micelle concentration (CMC).
  • CMC critical micelle concentration
  • the recovered solution was diluted 104 times with peptone water, plated on a 100 ⁇ l plate, and cultured overnight at 30°C. The number of bacteria before flowing into the channel was compared with the number of bacteria counted in the recovered solution, and the viable rate was calculated.
  • Example 4 Examination of the combination of the lytic part flow path structure and the lytic agent (comparison of the degree of bacteriolysis when the lytic agent and the flow path structure are combined) Regarding the bacteriolytic effect, whether there was a synergistic effect between the channel structure and the bacteriolytic agent was verified by comparing the amount of nucleic acid recovered.
  • Channel 6 and Channel H of Example 1 were used as channel structures, and SDS, BugBuster, and SB-14 were used as bacteriolytic agents.
  • Example 5 Examination of other food-poisoning bacteria (bacteriolytic verification with other food-poisoning bacteria) We verified whether this bacteriolytic process could be extended to other food-poisoning bacteria.
  • Channel H was used, and three types of bacteriolytic agents were used: SDS, commonly used benzalkonium chloride (BC), and SB-14.
  • SDS commonly used benzalkonium chloride
  • SB-14 Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, and Salmonella enterica were used as target food poisoning bacteria.
  • Various bacteria were detected using Takara Bio Inc.'s quantitative PCR kit, Cycleave PCR TM Listeria monocytogenes (inlA gene) Detection Kit, Cyclave PCR TM Staphylococcus aureus (DnaJ). gene) Detection Kit, CyclavePCR TM Salmonella Detection Kit Ver. 2.0 was used for each. The pretreatment and measurement conditions were the same as for Bacillus cereus.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • CesA and dCas9 were each dye-modified using commercially available kits. CesA was modified with fluorescein, and dCas9 was modified with Alexa Fluor 546.
  • Label IT trademark
  • MilliQ trademark
  • 5 ⁇ l of 10 ⁇ Labeling Buffer 5 ⁇ l of 1 mg/ml cesA plasmid
  • 1 ⁇ l of Label IT Reagent were mixed and incubated at 37° C. for 1 hour to react. After the reaction, purification was performed by ethanol precipitation to obtain the desired product.
  • Alexa Fluor TM 546 NHS Ester (Succinimidyl Ester, Invitrogen) was used for dye modification to dCas9. 1 ⁇ l of 10 mg/ml Alexa Fluor 546 dissolved in DMF, 6.7 ⁇ l of 15 mg/ml dCas9, and 13.3 ⁇ l of 0.2 M NaHCO 3 (pH 8.3) were mixed and reacted by incubating at room temperature for 1 hour. Purification was performed using an Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter (Merck) to obtain the desired product.
  • Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter Merck
  • Example 7 Examination of various channel structures in the complex forming section (comparison of complex formation reactions using various channel structures) The channel structure shown in FIG. 19 was used to evaluate the ability to form a complex.
  • Channel 7 was designed to have a flow path length twice that of Channel 6, and Channel 5 was designed to have a flow path length half that of Channel 6.
  • Channel I we designed Channel I4, which doubled the number of branching and merging sections. Because there was a concern that increasing the number of branching and merging sections would cause clogging in the channel, the design was designed to double the width of the channel from the middle.
  • the width of the channel (from 4b to 4d, length 1.25 cm) from 4b to the midpoint of 4b and 4c (channel central part 4d) is 100 ⁇ m
  • the midpoint of 4b and 4c The width of the channel from (channel central portion 4d) to 4c (from 4d to 4c, length 1.25 cm) was set from 100 ⁇ m to 200 ⁇ m.
  • Channel I2 which has the same number of branching and merging sections as Channel I, but whose channel width is doubled midway through, was also used for evaluation).
  • Fluorescein-modified cesA and Alexa Fluor 546-modified dCas9 were added to 1 ⁇ H Buffer (manufactured by Takara) at final concentrations of 0.25 ⁇ g/ml and 2.5 ⁇ g/ml, respectively, to each channel. Furthermore, in order to prevent dye adsorption within the channel, BSA was added to a final concentration of 0.2%.
  • the cesA solution and the dCas9 solution were delivered separately from two inlets (4a and 4b) at a rate of 5.0 ⁇ l/min using a syringe pump, and 10 ⁇ l of each sample was collected from the outlet 4c.
  • FIG. 20 shows the results of comparing the composite formation rates in various channels. No improvement in the formation rate was observed in Channel 5, Channel 7, and Channel G, in which the channel length was changed from Channel 6 in Example 1. Furthermore, even in Channel H, where a high bacteriolytic effect was observed in the bacteriolysis step, no noticeable improvement was observed. On the other hand, in Channel I to which branching and merging parts were added, an improvement in the complex formation rate was observed. Changing the width of the channel midway did not affect the formation of the complex, and no clogging was actually observed in the channel. Furthermore, in Channel I4, where the number of branching and merging parts was increased, the complex formation rate was further improved. This result suggested that the "branching and merging" structure within the flow path influenced complex formation, and that among the channels examined, Channel I4 was optimal.
  • Example 8 Study on integrated detection device (evaluation of degree of bacteriolysis in pretreatment integrated channel)
  • a device herein sometimes referred to as a "pretreatment integrated flow path" in which a "lysing section,” a “separation section,” and a “complex formation section” are integrally connected is constructed.
  • the effect was investigated.By using the same method as in Example 1 to create an integrated pretreatment channel, and adding the microbial solution and lytic agent from inlet 1 (2a) and inlet 2 (2b), the integrated We verified whether nucleic acids could be recovered from the outlet 4c, which is the outlet of the flow channel.Three types of integrated flow channels were used to evaluate the degree of bacteriolysis.The integrated flow channel ver.
  • FIG. 25 shows the structure of the newly designed pre-treatment integrated channel.
  • the version that showed the highest bacteriolytic effect. 2-2 (FIG. 25(A)
  • the flow path incorporating Channel I was installed in ver. 3-1 (FIG. 25(B))
  • the flow path incorporating Channel I4 is ver. 3-2 ( Figure 25(C)).
  • the composite formation rates were compared for these three types of pretreatment integrated channels.
  • Pretreatment + Preparation of integrated detection channel By treating the outlet 4c of the pre-processing integrated flow path as a detection chamber (detection section), an integrated device (herein referred to as "pre-processing + detection integrated flow path" or simply (sometimes referred to as an "integrated channel”).
  • pre-processing + detection integrated flow path By treating the outlet 4c of the pre-processing integrated flow path as a detection chamber (detection section), an integrated device (herein referred to as "pre-processing + detection integrated flow path” or simply (sometimes referred to as an "integrated channel”).
  • the aforementioned pretreatment integrated flow path ver.
  • a hole with a diameter of 6 mm was made in the outlet 4c of 2-2 so that a certain amount of solution would accumulate in the detection part (FIG. 26(A)).
  • the thickness of the PDMS material was adjusted to 10 to 13 mm (FIG. 26(B)).
  • Bacillus cereus (1 x 10 3 cfu/ml) was added from inlet 1 of the integrated device ( Figure 27 (A)), lytic agent (sulfobetaine-14) was added from inlet 2, and 1 x H buffer (TAKARA Co., Ltd.) was added from inlet 3.
  • a mixture of the dCas9/sgRNA complex and Streptolysin O (final concentration 30 nM) dissolved in dCas9/sgRNA complex (manufactured by Manufacturer, Inc.) was flowed into the device at flow rates of 5.0 ⁇ l/min, 5.0 ⁇ l/min, and 4.0 ⁇ l/min, respectively.
  • Ta Electrochemical detection of Bacillus cereus using an integrated device
  • Figure 27 (B) shows the results of analyzing and plotting each signal, using the current value that dropped from the current value observed when the pore was open as Blocking (pA), and the time that the current value was maintained as Duration time. It is shown in FIG. 27(C) and FIG. 27(D).
  • Figure 27B shows the results of analyzing and plotting each signal, using the current value that dropped from the current value observed when the pore was open as Blocking (pA), and the time that the current value was maintained as Duration time. It is shown in FIG. 27(C) and FIG. 27(D).
  • FIG. 28(A) Five signals with blocking of 400 pA or more and Duration time of 30 seconds or more are shown in FIG. 28(A). Looking at the shape of the signals when Bacillus cereus, bacteriolytic agent, and dCas9/sgRNA were introduced into the flow channel (signal numbers 70, 73, 78, and 80), the molecules entered the pores and the current value decreased. When observed, a flat signal was observed similar to the baseline (FIG. 28(C)). On the other hand, when Bacillus cereus and a lytic agent were injected (signal number 3), signal disturbance was observed after the current value dropped (FIG. 28(B)).
  • Example 9 Detection of Bacillus cereus using an integrated device (collection and lysis of Bacillus cereus in formulated milk powder)
  • One bag (13 g) of a stick of modified milk powder (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd.) was dissolved in 100 ml of boiling water, cooled, and Bacillus cereus was added at a final concentration of 1 x 10 3 cfu/ml.
  • this was filtered through a cellose acetate membrane (manufactured by Advantech) with a pore size of 0.8 ⁇ m.
  • the membrane was washed three times with 10 ml of saline.
  • 0.5 ml of sulfobetaine-14 was loaded onto the membrane and the lysate was collected.
  • the Bacillus cereus lysate collected from the membrane was allowed to flow into the device from inlet 1 and inlet 2 of the integrated device (FIG. 27(A)) at a flow rate of 8.0 ⁇ l/min. After 20 minutes, the flow rate was changed to 5.0 ⁇ l/min, and at the same time, a mixture of dCas9/sgRNA complex and Streptolysin O (final concentration 30 nM) dissolved in 1 ⁇ H buffer (manufactured by TAKARA) was injected from inlet 3 at flow rate 4. The flow rate was 0 ⁇ l/min. After 60 minutes, after removing the solution in the chamber, the flow was started again.
  • a silver wire glass electrode was inserted into the oil layer, and a reference electrode was inserted into a water bath into which a voltage was applied at 100 mV.
  • a lipid bilayer membrane is formed by moving the electrode up and down in the Z-axis direction using a hydraulic manipulator (Shoji, K., et al., Anal. Chem., 2020, 92, 10856-10862), and the current generated by pore insertion is A stepwise increase in the value and a decrease in the current value when a molecule was inserted into the pore were detected. After converting to an ABF file, it was analyzed using Clampex (free software).
  • FIG. 31 shows the results of analyzing and plotting each signal using Blocking (pA) and the time that the current value was maintained as Duration time.
  • pA Blocking
  • the signals had a duration time of 1 second or less (FIGS. 31(A) and (C)). From this result, it is considered that impurities such as milk fat, protein, and lactose contained in the modified milk powder are probably unable to enter the pores because they do not have an electric charge.
  • SYMBOLS 1 Microfluidic device, 2... Bacteriolytic part, 2a... Inlet for receiving a sample, 2b... Inlet for receiving a lysing agent, 2c... Outlet for discharging a lysing solution, 2S... Lysing channel, 21... First lysing channel part, 22... Second lysis channel section, 23... lysis branch channel section, 24... lysis mixing channel section, 23a... lysis branch section, 23b... lysis confluence section, 3... separation section, 3a... inlet, 3b...

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Abstract

本発明に係る、試料中の微生物を検出するためのマイクロ流体デバイス１は、上記試料中の微生物を溶解するための溶菌部２と、上記溶菌部２と連通して、上記溶菌部２で形成された微生物の溶解物から核酸を分離するための分離部３とを備え、上記溶菌部２は、微生物を溶解するための溶菌剤を保持する流路を備え、上記分離部３は、上記溶解物中に含まれる核酸と他の物質とを分離できる手段を備える。

Description

微生物の検出方法及び検出デバイス
　本発明は、微生物を検出するための検出方法及び検出デバイスに関する。
　食品のリスク微生物の測定には主にＰＣＲやＡＴＰアッセイ、免疫学的検出法などが用いられてきた。しかし、ＰＣＲは特異性及び検出感度がよいものの、操作が煩雑で専用な装置が必要であり、ＡＴＰアッセイ法では微生物を特異的に検出することができず、免疫学的検出法には感度の問題があり、特異性・感度・操作の簡便さの３点を同時に満足させるものではなかった。
　マイクロ流路は細胞の分離、細胞の化学処理の場として活用できる技術である。例えば、特許文献１ではｐａｐｅｒ　ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ　ｃｈｉｐを用いて微生物を検出しているが、検出している微生物は属単位で５種類に過ぎず、微生物種の単位で微生物を判別できるものではない。また、高濃度の菌体サンプルが必要であり、特異性・感度の点で満足できるものではない。
　また、特許文献２では調製したサンプルをマイクロ流路に注入することで、微生物を１細胞ごとに微小なカプセルに閉じ込め、回収後溶菌してゲノム配列を解読している。この方法ではサンプル調製や微生物回収後の操作が比較的煩雑となる。
　一方、ナノポアは微小な物体を検出できる技術である。非特許文献１では、ｓｏｌｉｄ　ｓｔａｔｅ　ｎａｎｏｐｏｒｅと呼ばれる、ＳｉＮ基盤上にＴＥＭで孔を開けたものを使用して核酸の検出を行っている。
ＵＳ２０２０／０２９８２３３Ａ１ ＵＳ２０２１／０２４６４９５Ａ１ 特表２０１７－５３０６９５号公報
YANG, Wayne, et al., Detection of CRISPR-dCas9 on DNA with solid-state nanopores, Nano letters, 2018, 18.10: 6469-6474.
　上記のように、従来マイクロ流路による分離、ナノポアによる検出など技術は知られているものの、これまで、マイクロ流路とナノポアを接続し、微生物の分離から検出までを、特異性・感度・操作の簡便さの面で満足できるレベルで達成する技術は知られていない。
　そこで本発明は、微生物を特異的にかつ感度よく検出する簡便な検出方法及び検出デバイスを提供することを目的とする。
　本発明者らは、微生物を特異的にかつ感度よく検出する簡便な検出方法及び検出デバイスを提供すべく鋭意研究したところ、微生物を溶解するための溶菌部と、溶菌部と連通して、溶菌部で形成された微生物の溶解物から核酸を分離するための分離部とを備えるマイクロ流体デバイスを見出し、本発明の完成に至った。
　本発明は、例えば、以下の［１］～［９］に関する。
［１］　試料中の微生物を検出するためのマイクロ流体デバイスであって、
　上記試料中の微生物を溶解するための溶菌部と、
　上記溶菌部と連通して、上記溶菌部で形成された微生物の溶解物から核酸を分離するための分離部と
を備え、
　上記溶菌部は、微生物を溶解するための溶菌剤を保持する流路を備え、上記分離部は、上記溶解物中に含まれる核酸と他の物質とを分離できる手段を備える、デバイス。
［２］　上記溶菌剤が、界面活性剤を含む、［１］のデバイス。
［３］　上記分離部の分離手段が、分子サイズによる分離手段、遠心による分離手段、又は水力学的フィルトレーションによる分離手段である、［１］又は［２］のデバイス。
［４］　上記分離部と連通して、上記分離部で分離された核酸をタンパク質－核酸複合体に形成する複合体形成部と、
　上記複合体形成部と連通して、上記複合体を検出するための手段を含む検出部と
をさらに備える、［１］～［３］のいずれかのデバイス。
［５］　上記複合体形成部が、上記微生物由来の特定の核酸と、タンパク質－核酸複合体を形成できる物質を保持している流路を備える、［４］のデバイス。
［６］　上記物質が、上記特定の核酸に特異的なｓｇＲＮＡが結合されているＣＲＩＳＰＲ－ｄＣａｓ９、又は、上記特定の核酸に特異的に結合するタンパク質マーカーである、［５］のデバイス。
［７］　上記検出部において、電気化学的に又は光学的に上記複合体を検出する手段を備えている、［４］～［６］のいずれかのデバイス。
［８］　上記検出部において、ナノポアを用いて上記複合体を検出する、［４］～［６］のいずれかのデバイス。
［９］　上記分離部と連通して、上記分離部で分離された核酸を検出するための手段を含む検出部をさらに備える、［１］～［３］のいずれかのデバイス。
［１０］　上記検出部において、リアルタイムＰＣＲ又は免疫学的方法によって上記核酸を検出する、［９］のデバイス。
［１１］　［１］～［８］のいずれかのデバイスを用いた、試料中の微生物を検出するための方法。
［１２］　溶菌部において、試料中の微生物を溶解する溶菌工程と、
　分離部において、溶菌部で得られた微生物の溶解物から核酸を分離する分離工程と
を含む、［１１］の方法。
［１３］　複合体形成部において、分離部で分離された核酸をタンパク質－核酸複合体に形成する複合体形成工程をさらに含む、［１２］の方法。
［１４］　検出部において、複合体形成部で形成されたタンパク質－核酸複合体を検出する検出工程をさらに含む、［１３］の方法。
［１５］　［１］～［３］、［９］及び［１０］のいずれかのデバイスを用いた、試料中の微生物を検出するための方法。
［１６］　溶菌部において、試料中の微生物を溶解する溶菌工程と、
　分離部において、微生物の溶解物から核酸を分離する分離工程と、
　検出部において、分離部で分離された核酸を検出する検出工程と
を含む、［１５］の方法。
　本発明の検出デバイス及び該デバイスを用いた検出方法によれば、一連の操作によって、微生物を特異的にかつ感度よく検出する簡便に検出できる。本発明は特に食中毒微生物の検出に簡便に用いられ、したがって、食品製造・流通・小売り、医歯薬領域、各種環境測定などの様々な分野において広く好ましく用いられる。
実施例１における、一実施形態のＣｈａｎｎｅｌ　６（ａ）及びＣｈａｎｎｅｌ　１（ｂ）の模式図を示す。 実施例１における、４種類の溶菌剤を用いて溶菌効果を検証した結果を示す顕微鏡画像である。 実施例１における、ＳＤＳを用いたセレウス菌の溶菌率を示すグラフである。 実施例１における、ＳＤＳ及びＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋを用いたセレウス菌の溶菌率を示すグラフである。 実施例１における、ＳＤＳによる複合体の形成への影響を検証した結果を示す電気泳動写真である。 実施例１における、形成された核酸－タンパク質複合体による電流阻害の評価結果を示すグラフである。 一実施形態のデバイス１を示す。 一実施形態のデバイスによる微生物検出のメカニズムを示す。 ナノポアによる複合体の検出のメカニズムを示す。 実施例２における各種溶菌部流路構造を示す。 実施例２における、各種溶菌部流路構造による溶菌度（生菌率）を示すグラフである。 実施例３における各種溶菌剤を示す。 実施例３における、各種溶菌剤による溶菌度（生菌率）を示すグラフである。 実施例３における、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒおよびスルホベタインによる溶菌度（核酸回収率）を示すグラフである。 実施例３における、各種溶菌剤による溶菌度（核酸回収率）を示すグラフである。 実施例４における、溶菌部流路構造と溶菌剤との組み合わせを検討した結果を示すグラフである。 実施例５における、他の食中毒菌に対する溶菌度（核酸回収率）を示すグラフである。 実施例６における、ＦＲＥＴ評価系を用いた複合体形成の概念図である。 実施例７における複合体形成部の各種流路構造を示す。 実施例７における、各種流路構造を用いて得られた複合体形成率を示すグラフである。 実施例８における３種類の前処理一体型流路を示す。 実施例８における、図２０（Ｂ）に示す前処理一体型流路ｖｅｒ．２－１の詳細構造を示す。 実施例８における、図２２に示す前処理一体型流路ｖｅｒ．２－１の分離分岐流路部３３の詳細構造を示す。 実施例８における、３種類の前処理一体型流路による溶菌度（核酸回収率）を示す。 実施例８における、３種類の前処理一体型流路の構造及びそれら前処理一体型流路による複合体形成率を示す。 実施例８における、一体型流路を示す。 実施例８における、一体型デバイス及びそれを用いたセレウス菌の検出結果（Ｄｕｒａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ）を示す。 実施例８における、一体型デバイスを用いたセレウス菌の検出結果（Ｄｕｒａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ）を示す。 実施例８における、一体型デバイスを用いたセレウス菌の検出結果（Ｄｕｒａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ）を示す。 実施例８における、一体型デバイスを用いたセレウス菌の検出結果（Ｄｕｒａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ）を示す。 実施例９における、一体型デバイスを用いたセレウス菌の検出結果を示すプロット図である。 実施例２における、Ｃｈａｎｎｅｌ　６およびＣｈａｎｎｅｌ　Ａの詳細構造を示す。 実施例２における、Ｃｈａｎｎｅｌ　ＨおよびＣｈａｎｎｅｌ　Ｉの詳細構造を示す。 実施例２における、Ｃｈａｎｎｅｌ　ＧおよびＣｈａｎｎｅｌ　Ｊの詳細構造を示す。 実施例２における、Ｃｈａｎｎｅｌ　ＣおよびＣｈａｎｎｅｌ　Ｄの詳細構造を示す。
〔デバイス〕
　一実施形態のデバイスは、試料中の微生物を検出するためのマイクロ流体デバイス１であり、微生物を溶解するための溶菌部２と、溶菌部２と連通して、溶菌部で形成された微生物の溶解物から核酸を分離するための分離部３とを備える。ここで、溶菌部２は、微生物を溶解するための溶菌剤を保持する流路を備え、分離部３は、溶解物中に含まれる核酸と他の物質とを分離できる手段を備える。マイクロ流体デバイス１は、さらに複合体形成部４を備えてもよく、さらに検出部５を備えてもよい。
　被験試料は、任意の微生物を含み得る試料であり得、例えば、各種食品サンプル、各種水サンプル、各種試薬サンプル、各種培地サンプル、唾液や尿、汗といった生体サンプルが挙げられる。試料は、液状であっても固体であってもよく、液体であることが好ましい。試料の投入量は特に限定されず、液体の場合は例えば、１μｌ～１００ｍｌであればよく、１μｌ～１０ｍｌであることが好まし、５μｌ～５ｍｌであることがより好ましく、５０～５００μｌであることが特に好ましい。
　検出できる微生物としては、特に限定されず、例えば、食品衛生や接触感染の観点から種々の危害乳酸菌(例えばラクトバチルス属、ストレプトコッカス属、ラクトコッカス属等に含まれる乳酸菌)、酵母(例えば産膜酵母やブレタノマイセス属などのオフフレーバーの原因酵母等)、カビ(例えばペニシリウム属、ユーロチウム属等に含まれるカビ)、その他の細菌(例えばバチルス属、カンピロバクター属、大腸菌群、ブドウ球菌属、サルモネラ属、リステリア属、マイコプラズマ属、レジオネラ属、クロストリジウム属、ビブリオ属に含まれる細菌)、薬剤耐性菌（例えばメチシリン耐性黄色ブドウ球菌、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌、ペニシリン耐性肺炎球菌）、ウイルス(例えばノロウイルス、コロナウイルス等)が挙げられる。また、検出対象は微生物に限らず、核酸を含み得る任意の試料であってもよい。微生物の検出の下限は微生物の種類及び検出手段によって異なり得るが、例えば、１００～１０００ｃｆｕ／ｍｌであればよく、１０～１００ｃｆｕ／ｍｌであることが好ましい。
　溶菌剤は、特に限定されず、例えば微生物の細胞膜の脂質を溶解できる界面活性剤が挙げられる。界面活性剤としては、例えば、アルキル硫酸エステル塩（例えば、ドデシル硫酸塩、オクチル硫酸塩、デシル硫酸塩、テトラデシル硫酸塩、ヘキサデシル硫酸塩、オクタデシル硫酸塩）、アルキルベンゼンスルホン酸塩（例えば、４－オクチルベンゼンスルホン酸塩、４－デシルベンゼンスルホン酸塩、４－ドデシルベンゼンスルホン酸塩、４－テトラデシルベンゼンスルホン酸塩、４－ヘキサデシルベンゼンスルホン酸塩、４－オクタデシルベンゼンスルホン酸塩）、αオレフィンスルホン酸塩、アルカンスルホン酸塩（例えば、ノナンスルホン酸塩、デカンスルホン酸塩、ウンデカンスルホン酸塩、ドデカンスルホン酸塩、テトラデカンスルホン酸塩、ヘキサデカンスルホン酸塩、オクタデカンスルホン酸塩）、脂肪酸塩（例えば、カプリル酸塩、ペラルゴン酸塩、カプリン酸塩、ラウリン酸塩、ミリスチン酸塩、ペンタデシル酸塩、パルミチン酸塩、マルガリン酸塩、ステアリン酸塩、アラキジン酸塩）、アシルサルコシン酸塩（例えば、オクトイルサルコシン酸塩、ドデカノイルサルコシン酸塩、デカノイルサルコシン酸塩）、コール酸塩、デオキシコール酸塩等のアニオン性界面活性剤、例えば、第四級アンモニウム塩（例えば、デシルトリメチルアンモニウム塩、ドデシルトリメチルアンモニウム塩、テトラデシルトリメチルアンモニウム塩、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム塩、オクタデシルトリメチルアンモニウム塩、エイコシルトリメチルアンモニウム塩）、ピリジニウム塩（例えば、１－デシルピリジニウム塩、１－ドデシルピリジニウム塩、１－テトラデシルピリジニウム塩、１－ヘキサデシルピリジニウム塩、Ｎ－セチル－２－メチルピリジニウム塩、Ｎ－セチル－３－メチルピリジニウム塩、Ｎ－セチル－４－メチルピリジニウム塩、１－オクタデシルピリジニウム塩、１－エイコシルピリジニウム塩）、ホスホニウム塩（例えば、テトラエチルホスホニウム塩、トリブチルメチルホスホニウム塩、テトラブチルホスホニウム塩、テトラ－ｎ－オクチルホスホニウム塩、トリブチルドデシルホスホニウム塩、トリブチルヘキサデシルホスホニウム塩、メチルトリフェニルホスホニウム塩、テトラフェニルホスホニウム塩）、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルジメチルベンジルアンモニウム塩等のカチオン性界面活性剤、アルキルジメチルアミンオキシド、アルキルカルボキシベタイン等の両イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（例えば、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００））、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ　２０））、脂肪酸ソルビタンエステル、アルキルモノグリセリルエーテル、脂肪酸ジエタノールアミド、アルキルポリグルコシド等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。アニオン性界面活性剤もしくは両イオン性界面活性剤の対となるイオンとしては、ナトリウムイオン、カリウムイオン、リチウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、鉄イオン、銀イオン、銅イオン、ニッケルイオン、亜鉛イオン、コバルトイオン等のカチオンが挙げられ、ドデシル硫酸塩の一例としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が挙げられる。カチオン性界面活性剤もしくは両イオン性界面活性剤の対となるイオンとしては、フッ化物イオン、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、水酸化物イオン等のアニオンが挙げられ、第四級アンモニウム塩の一例としては、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム（ＤＴＡＢ）が挙げられる。両イオン性界面活性剤は、同一分子内に含まれるアニオンとカチオンで塩を形成していても良い。溶菌剤として使用する界面活性剤濃度は、細胞膜の脂質を溶解できる濃度であれば特に限定されないが、例えば、０．００１％（ｗ／ｖ）～１０％（ｗ／ｖ）であればよく、０．０１％（ｗ／ｖ）～１％（ｗ／ｖ）であることが好ましい。
　溶菌剤は、界面活性剤のほか、微生物細胞内のタンパク質を分解できる酵素をさらに含んでもよい。酵素としては、特に限定されず、例えばプロテアーゼＫ、パパイン、ショウガプロテアーゼ、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パンクレアチン、エラスターゼ、リゾチーム等が挙げられる。
　一実施形態のデバイス１はマイクロ流路に設けられている溶菌部２及び分離部３を備える。別の実施形態のマイクロ流体デバイス１は、マイクロ流路に設けられている溶菌部２、分離部３、複合体形成部４及び検出部５を備えている（図７）。
　以下図７及び図８に基づき、一実施形態のマイクロ流体デバイス１を説明する。なお、以下の説明において、図７、図８に図示されていない参照番号が示す構成要素は、図７に示すマイクロ流体デバイス１における実施例８の一部を詳細に図示した図２２、図２３に示す。デバイス本体１において、マイクロ流路が設けられており、マイクロ流路の一部に、溶菌部２、分離部３、複合体形成部４及び検出部５が設けられており、試料が溶菌部に繋がる入口、すなわち、試料を受け入れる入口２ａ（ｉｎｌｅｔ１）から投入され、溶菌剤を受け入れる入口２ｂ（ｉｎｌｅｔ２）にまで流れ、溶菌部２に設けられている微生物を溶解するための溶菌剤を保持する流路を通過することによって、微生物が溶菌剤とともに流路を通過しながら溶解される。得られた微生物の溶解物（溶菌液）が、溶菌液を排出する出口２ｃから出て、分離部の入口３ａから分離部３に入り、分離部３に設けられている分離手段によって、核酸と他の物質（細胞膜の残骸、タンパク質等の夾雑物；Ｗａｓｔｅ）とに分離され、核酸がさらに複合体形成部の入口、すなわち、第１結果物を受け入れる入口４ａ（ｉｎｌｅｔ３）から複合体形成部４に流れていく。核酸が、複合体形成部４に設けられているタンパク質－核酸複合体を形成できる物質（「複合体形成物質」ともいう）を保持している流路を通過することで、タンパク質－核酸複合体に形成され、最後に検出部５に流れ、特定の核酸の有無が検出される。なお、溶菌部２における溶菌剤を保持する流路（２ａから２ｃまでの流路）と、複合体形成部４における複合体形成物質を保持する流路（４ａから４ｃまでの流路）とは、同じ流路構造であっても、異なる流路構造を有してもよく、例えば図１の（ａ）に示すＣｈａｎｎｅｌ　６、図１０及び図１９に示す各種流路構造を備えたものであってよい。
　マイクロ流体デバイス本体の材質は、特に限定されず、例えばポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等のプラスチック樹脂を挙げることできるが、これらに限定されない。マイクロ流体デバイスの形状も限定されず、大きさはマイクロ流体デバイスとしての通常の大きさであればよく、特に限定されない。溶菌部、分離部、複合体形成部及び検出部を繋ぐマイクロ流路の径も特に限定されないが、例えば、２０μｍ～１５ｍｍであればよく、１００μｍ～０．５ｍｍであることが好ましい。
＜溶菌部＞
　溶菌部２は、試料に含まれた微生物を、溶菌剤によって溶解する処理を行う。この処理によって、微生物が溶菌され、微生物細胞内に含まれる核酸が溶解された溶菌液を得ることができる。溶菌部における溶解時間は、微生物が溶解されればよく、例えば、１分～８時間であればよく、５分～３０分であることが好ましい。
　溶菌部２は、試料を受け入れる入口２ａ（ｉｎｌｅｔ１と、溶菌剤を受け入れる入口２ｂ（ｉｎｌｅｔ２）と、溶菌液を排出する出口２ｃとを有する。さらに、溶菌部２は、入口２ａ、２ｂと出口２ｃとを繋ぐ溶菌流路２Ｓを有する。溶菌流路２Ｓは、第１溶菌流路部２１と、第２溶菌流路部２２と、溶菌分岐流路部２３と、溶菌混合流路部２４と、を含む。
　第１溶菌流路部２１は、入口２ａから溶菌分岐部２３ａまでの流路である。溶菌分岐部２３ａは、第１溶菌流路部２１から提供される試料が分流されて、溶菌分岐流路部２３に提供される部分である。第２溶菌流路部２２は、入口２ｂから溶菌合流部２３ｂまでの流路である。
　溶菌分岐流路部２３は、平面視して矩形領域の外周辺に沿って延びる。例えば、溶菌分岐流路部２３は、入口２ｂ及び第２溶菌流路部２２を囲む。前述の溶菌分岐部２３ａは、溶菌分岐流路部２３の一部分であると定義してもよい。溶菌分岐部２３ａを含む溶菌分岐流路部２３の一辺とは逆側の辺には、溶菌合流部２３ｂが設定される。溶菌合流部２３ｂには、溶菌混合流路部２４の端部と第２溶菌流路部２２の端部とが接続されている。溶菌合流部２３ｂは、溶菌分岐流路部２３から提供される試料と第２溶菌流路部２２から提供される溶菌剤とが合流すると共に、合流したものを溶菌混合流路部２４に提供する。つまり、溶菌合流部２３ｂには、溶菌分岐流路部２３、第２溶菌流路部２２及び溶菌混合流路部２４の端部が接続される。
　溶菌混合流路部２４は、溶菌分岐流路部２３から来る試料と、入口２ｂから来る溶菌剤とを混合し、溶菌するための部分である。溶菌混合流路部２４で試料と溶菌剤が十分に混合することで、溶菌率が高くなり、それによって検出精度も高くなる。
　また、溶菌部２の流路２Ｓのデザインは特に限定はされないが、溶菌剤と試料（例えば、菌懸濁液）の二液が層流とならず、積極的に混合される工夫、例えば、溶菌混合流路部２４内に突起物・障害物を配置すること、溶菌混合流路部２４を可能な限り延長すること、溶菌剤と試料の混合液に微粒子を混合すること、二液が交わる直前の流路幅比、すなわち、溶菌合流部２３ｂにおいて合流する流路の幅比を大きくすることなどにより、流路溶菌率を上げることができる。溶菌部２における溶菌率は、５０％以上（生菌率が５０％未満）、６０％以上（生菌率が４０％未満）、７０％以上（生菌率が３０％未満）、８０％以上（生菌率が２０％未満）、または９０％以上（生菌率が１０％未満）であってよく、生菌率は例えば実施例に示す方法によって測定することができる。溶菌度はまた核酸回収率によって算出（定義）することができる。核酸回収率は、例えば実施例に記載の方法によって測定することができる。
　所望の混合状態および溶菌率を得るためには、例えば、溶菌混合流路部２４において、流れの状態（圧力、速度）を変化させることが考えられる。すなわち、溶菌混合流路部２４は、流路内において、流れの状態（圧力、速度）を変化させる構成を有してもよい。このような構成としては、図１０（ｃ）、（ｄ）、（ｆ）に示すように、大きい流路面積の部分と小さい流路面積の部分とを交互に配置する構成が挙げられる。また、流れの状態（圧力、速度）を変化させる構成としては、流れの方向を変化させる構成（図１０（ｅ）または（ｈ）、或いは、分岐部を備える構成（図１０（ｇ））が挙げられる。
　溶菌流路２Ｓの幅は、全体的に同じであってもよいが、溶菌率を高めるために、流路の幅を変えてもよい。流路２Ｓの幅は特に限定されず、例えば１０μｍ～１０００μｍ、５０μｍ～５００μｍ、５０μｍ～２００μｍ、または１００μｍ～２００μｍであってもよい。また、溶菌流路２Ｓの長さは、特に限定されず、溶菌混合流路部２４を除いた部分の長さは、短いほうが試料のロスが少なく検出精度が高くなる。一方、溶菌混合流路部２４の長さは、溶菌剤と試料が十分に混合できる程度の長さを有したほうがよく、例えば、１ｍｍ以上、３ｍｍ以上、５ｍｍ以上、７ｍｍ以上、または１０ｍｍ以上であってよい。一方で、溶菌混合流路部２４の長さが長すぎると、試料のロスが生じるため、５００ｍｍ以下、４００ｍｍ以下、３００ｍｍ以下、２００ｍｍ以下、１００ｍｍ以下、または５０ｍｍ以下であってよい。具体例としては、図３２～３５に示す幅と長さが挙げられる。
＜分離部＞
　分離部３は、溶菌部２から溶菌液を受け入れる。分離部３は、溶菌液に含まれた核酸と夾雑物とを分離する。例えば、分離部３は、溶菌液から夾雑物を分離して取り除くものであってもよい。分離部３は、溶菌液から夾雑物を分離して取り除いた結果物（核酸を含む液体）を、下流側に設けられている複合体形成部４に提供する。
　分離部３における分離手段は、核酸と核酸以外の物質（非核酸物質、本明細書において「夾雑物」という場合がある）を分離できる手段であれば、特に限定されず、例えば分子サイズによる分離手段、遠心による分離手段、又は水力学的フィルトレーションによる分離手段が挙げられ、そのうち、水力学的フィルトレーションによる分離手段であることが好ましい。水力学的フィルトレーションは、マイクロ流路構造を電気回路のような抵抗回路のアナログとみなして流路設計を行うことで、選抜される細胞・物質のサイズを任意に調節できる。例えば、微生物懸濁液または溶菌液を流した場合、微生物のサイズや形状に加えて、微生物の集合状態によって分離度が変化するため、流路内での分離度から、微生物の形態学的情報を入手することが可能である。
　水力学的フィルトレーションを用いた分離を行う際には、次のような流路設計を行う。メインとなる主流路の両脇に、一定の流量を引き抜くことができる副流路を複数設計する。主流路に流れる液体が副流路へ引き抜かれることにより、主流路に流れる細胞や微粒子が主流路の壁に徐々に押し付けられる。副流路に引き抜かれる量が決定すれば、主流路/副流路それぞれに流れる水が主流路の幅比として計算される。壁付近を流れる粒子が、理論上副流路に引き抜かれる水の流れに半分以上含まれる、すなわち、副流路に引き抜かれる水を可視化した際、主流路の壁からの距離が、細胞や微粒子の半径を超えると、それらは副流路へ引き抜かれる。副流路の幅や段数によって、副流路へ引き抜く流量を変えることができ、それにより、メイン流路に残る細胞や微粒子のサイズを制御することができる。このような分離理論を使うことにより、溶菌剤により膜損傷を受けた微生物（細胞の残骸など）はサイズが比較的大きいため主流路へ、一方、微生物に含まれる核酸といったサイズの小さな分子は副流路へ流入する（Masumi Yamada，Minoru Seki, Hydrodynamic filtration for on-chip particle concentration and classification utilizing microfluidics, Lab on a Chip, 2005, 5.11: 1233-1239.）。本発明は、該副流路に流入された核酸を測定対象とする。
　一実施形態の分離部３は、入口３ａと、夾雑物回収口３ｂ、出口３ｃと、分離ユニット３０を含む。入口３ａから溶菌液が提供された分離ユニット３０は、核酸を含む第１結果物を出口３ｃから排出すると共に、夾雑物を含む第２結果物を夾雑物回収口３ｂから排出する。第２結果物は分子サイズの大きい夾雑物を含み、核酸も含み得る。第１結果物は純度の高い核酸を含み、少量の夾雑物を含み得るが、夾雑物を含まないものであることが好ましい。分離部３の核酸回収率は、入口３ａに投入した溶菌液における核酸量に対する出口３ｃから回収した第１結果物における核酸量の比率（核酸回収率）と定義することができ、分離部３の核酸回収率は５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上であってよく、核酸回収率は例えば実施例に示す方法によって測定することができる。
　分離部３は、第１分離流路部３１と、第２分離流路部３２と、分離分岐流路部３３と、を含む。第１分離流路部３１は、入口３ａを分離ユニット３０に接続する。分離ユニット３０において、第１分離流路部３１が接続される位置は、分離ユニット３０の延びる方向におけるほぼ中央である。なお、入口３ａは、物理的な構成要素である必要はない。入口３ａは、溶菌液を受け入れる部分として定義される部位である。また、入口３ａに接続する出口２ｃは、溶菌液を入口３ａに排出する部分として定義される部位であり、入口３ａと同様に物理的な構成要素である必要はない。
　一実施形態において（図２２）、第１分離流路部３１は、第１細径流路部３１１と、太径流路部３１２と、第２細径流路部３１３と、を含んでもよい。一例として、太径流路部３１２の直径は、第１細径流路部３１１の５倍ほど大きくてもよい。入口３ａ側に第１細径流路部３１１が配置され、出口３ｃ側に第２細径流路部３１３が配置される。つまり、分離ユニット３０には、第２細径流路部３１３が接続されている。そして、第１細径流路部３１１と第２細径流路部３１３との間に太径流路部３１２が配置される。
　第２分離流路部３２は、分離ユニット３０の出力を出口３ｃに接続する。分離ユニット３０において、第２分離流路部３２が接続される位置は、分離ユニット３０の延びる方向におけるほぼ中央である。つまり、第１分離流路部３１と第２分離流路部３２とは、ある仮想線上の配置された一直線のものであってもよい。夾雑物を含む第２結果物は、夾雑物回収口３ｂへ排出される。夾雑物回収口３ｂは、第２結果物をプールできる容積を有するチャンバを備える。
　図２３は、第２分離流路部３２の一例の拡大図である。第２分離流路部３２は、細径流路部３２１と、第１太径流路部３２２と、第２太径流路部３２３と、を含む。細径流路部３２１の入力端は、分離ユニット３０に接続されている。第２太径流路部３２３の出力端は、夾雑物回収口３ｂに接続されている。そして、細径流路部３２１と第２太径流路部３２３との間には第１太径流路部３２２が配置されている。第１太径流路部３２２の流路径は、細径流路部３２１の流路径より大きいが第２太径流路部３２３の流路径より小さい。つまり、第２分離流路部３２では、夾雑物回収口３ｂに近づくにしたがって段階的に流路径が大きくなっている。一例として、細径流路部３２１の直径は２０μｍであり、第１太径流路部３２２の直径は２５μｍであり、第２太径流路部３２３の直径は５００μｍであってもよい。また、細径流路部３２１の長さは、第１太径流路部３２２の長さより長い。例えば、細径流路部３２１の長さは１ｃｍであり、第１太径流路部３２２の長さは３．９ｍｍである。
　分離分岐流路部３３は、分離ユニット３０から第１結果物を出力する第１部分３０ａおよび第１結果物を出力する第２部分３０ｂを出口３ｃに接続する。分離分岐流路部３３は、平面視して、コ字状を呈する。分離分岐流路部３３は、複合体形成部の入口４ａの端部に接続する合流部である出口３ｃを含む。出口３ｃは、分離分岐流路部３３の一辺における略中央に配置されてもよい。その結果、分離ユニット３０から出口３ｃに至る第１の経路３３１と、分離ユニット３０から出口３ｃに至る別の第２の経路３３２とは、流路長さを同じにすることができる。
　出口３ｃが複合体形成部４に接続する。一実施形態において、出口３ｃが複合体分岐流路部４３（図１９（ａ））に接続する。別の実施形態において、分離分岐流路部３３は後述の複合体流路４Ｓの一部である複合体分岐流路部４３を兼ねることができる。この場合、第１複合体流路部４１、第２複合体流路部４２、および複合体分岐流路部４３を省略することができ、出口３ｃが複合体混合流路部４４に接続する（図２２）。この場合は、図２２の３ｃを分離部３の出口３ｃとしてもよく、図２の３０ａおよび３０ｂを分離部３の出口３ｃとしてもよい（図１（ｂ））。後者の場合は、図２２の分離分岐流路部３３を複合体分岐流路部４３とし、図２２の出口３ｃを４３ｂとすることができる。
＜複合体形成部＞
　複合体形成部４は、第１結果物と複合体形成物質とを反応させ、複合体を形成する。複合体形成部４において、分離部３で分離された第１結果物中の核酸（微生物由来の核酸）中の特定の核酸と、タンパク質－核酸複合体を形成できる物質（複合体形成物質）を保持しているマイクロ流路が設けられている。
　該複合体形成物質としては、例えば上記特定の核酸に特異的なｓｇＲＮＡが結合されているＣＲＩＳＰＲ－ｄＣａｓ９、上記特定の核酸に特異的に結合するタンパク質マーカーが挙げられる。特定の核酸（本明細書において、「標的核酸」という場合がある）としては、該微生物種又は微生物属を特定できる、該微生物種又は微生物属に特異的な遺伝子又はその一部であることが好ましい。例えば、微生物がセレウス菌である場合、標的核酸はレシチナーゼ遺伝子若しくはセレウリド合成遺伝子又はこれらの一部であってよい。
　複合体形成部４において、複合体を形成させる時間は特に限定されず、例えば、１分～８時間であればよく、５分～３０分であることが好ましい。また、複合体形成部の流路デザインは特に限定はされないが、溶菌剤と複合体形成物質の溶液の二液が層流とならず、上述の積極的に混合される工夫により、複合体形成率を上げることができる。すなわち、複合体形成部は、上述の流れの状態（圧力、速度）を変化させる構成を備えてもよい。複合体形成率は、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上であってよく、複合体形成率は例えば実施例に示す方法によって測定することができる。
　標的核酸と標的核酸に特異的なｓｇＲＮＡが結合されているＣＲＩＳＰＲ－ｄＣａｓ９とが、ワトソン－クリック型塩基対のＤＮＡ－ＲＮＡ相互作用によって複合体を形成できる。また、複合体を検出するために、標識してもよい（例えば特許文献３）。該ｓｇＲＮＡの長さは特に限定されず、２０残基以上であることが好ましい。また、ｓｇＲＮＡは一分子であってもよく、例えば細菌や古細菌が本来持つ帰巣装置であるＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との複合体のように二分子以上であってもよい。複合体として、Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａへの変異導入、活性部位の欠損などによりヌクレアーゼ及びニッカーゼ活性が完全に消失しているＣａｓ９とｓｇＲＮＡの複合体、あるいはＣａｓ９とｔｒａｃｒＲＮＡ若しくはｃｒＲＮＡとの複合体が挙げられる。Ｃａｓタンパク質としては、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに分類されるＣａｓ９のほか、例えばＩ型またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのｃｒＲＮＡ－Ｃａｓｃａｄｅ－Ｃａｓ３複合体、ｃｒＲＮＡ－Ｃｓｍ（ＩＩＩ－Ａ）あるいはＣｍｒ（ＩＩＩ－Ｂ）複合体、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのＣａｓ１２ｆ（Ｃｐｆ１）－ｃｒＲＮＡ複合体が挙げられる。また、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのｃｒＲＮＡ－Ｃｓｆ２－Ｃａｓ１１複合体が挙げられる。ＲＮＡ配列を標的とするＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ１３が挙げられる。上述したＣａｓタンパク質の由来は特に限定されない。
　標的核酸に特異的に結合するタンパク質マーカーは、ヘリックスなどのタンパク質の二次構造が核酸配列を認識することによって、標的核酸に結合できるものであることが好ましい。タンパク質マーカーとしては、ＴＡＬＥ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ　ｅｆｆｅｃｔｏｒ）、ＺＦ（Ｚｉｎｃ－Ｆｉｎｇｅｒ）、Ｐｅｎｔａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ　ｒｅｐｅａｔ（ＰＰＲ）タンパク質などが挙げられる。
　複合体形成部４は、溶菌部２と同じような構造を有してもよい（図１、図１９）。一実施形態の複合体形成部４は、第１結果物を受け入れる入口４ａと、複合体形成物質を受け入れる入口４ｂ（ｉｎｌｅｔ３）と、複合体を排出する出口４ｃとを有する。さらに、複合体形成部４は、入口４ａ、４ｂと出口４ｃとを繋ぐ複合体流路４Ｓを有する。複合体流路４Ｓは、第１複合体流路部４１と、第２複合体流路部４２と、複合体分岐流路部４３と、複合体混合流路部４４と、を含む。
　第１複合体流路部４１は、入口４ａから複合体分岐部４３ａまでの流路である。複合体分岐部４３ａは、第１複合体流路部４１から提供される第１結果物が分流されて、複合体分岐流路部４３に提供される部分である。第２複合体流路部４２は、入口４ｂから複合体合流部４３ｂまでの流路である。
　複合体分岐流路部４３は、平面視して矩形領域の外周辺に沿って延びる。例えば、複合体分岐流路部４３は、入口４ｂ及び第２複合体流路部４２を囲む。前述の複合体分岐部４３ａは、複合体分岐流路部４３の一部分であると定義してもよい。複合体分岐部４３ａを含む複合体分岐流路部４３の一辺とは逆側の辺には、複合体合流部４３ｂが設定される。複合体合流部４３ｂには、複合体混合流路部４４の端部と第２複合体流路部４２の端部とが接続されている。複合体合流部４３ｂは、複合体分岐流路部４３から提供される試料と第２複合体流路部４２から提供される複合体形成物質とが合流すると共に、合流したものを複合体混合流路部４４に提供する。つまり、複合体合流部４３ｂには、複合体分岐流路部４３、第２複合体流路部４２及び複合体混合流路部４４の端部が接続される。
　複合体混合流路部４４は、複合体分岐流路部４３から来る第１結果物と、入口４ｂから来る複合体形成物質とを混合し、複合体を形成するための部分である。複合体混合流路部４４で第１結果物と複合体形成物質が十分に混合することで、複合体形成率が高くなり、それによって検出精度も高くなる。
　複合体形成部４の複合体流路４Ｓのデザインは特に限定はされないが、溶菌部２の流路２Ｓのデザインと同様なものであってよい（図１０、図１９）。複合体形成部４における複合体形成率は、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上であってよく、複合体形成率は例えば実施例に示す方法によって測定することができる。
　所望の混合状態および複合体形成率を得るためには、例えば、複合体混合流路部４４において、流れの状態（圧力、速度）を変化させることが考えられる。すなわち、複合体混合流路部４４は、流路内において、流れの状態（圧力、速度）を変化させる構成を有してもよい。このような構成としては、図１９（ｄ）に示すように、大きい流路面積の部分と小さい流路面積の部分とを交互に配置する構成が挙げられる。また、流れの状態（圧力、速度）を変化させる構成としては、流れの方向を変化させる構成（図１９（ｅ））、或いは、分岐部を備える構成（図１０（ｆ）、（ｇ）、（ｈ））が挙げられる。
　複合体流路４Ｓの幅は、全体的に同じであってもよいが、複合体形成率を高めるために、流路の幅を変えてもよい。複合体流路４Ｓの幅は特に限定されず、例えば１０μｍ～１０００μｍ、５０μｍ～５００μｍ、５０μｍ～２０μｍ０、または１００μｍ～２００μｍであってもよい。また、複合体流路４Ｓの長さは、特に限定されず、複合体混合流路部４４を除いた部分の長さは、短いほうが試料のロスが少なく検出精度が高くなる。一方、複合体混合流路部４４の長さは、第１結果物と複合体形成物質が十分に混合できる程度の長さを有したほうがよく、例えば、１ｍｍ以上、３ｍｍ以上、５ｍｍ以上、７ｍｍ以上、または１０ｍｍ以上であってよい。一方で、複合体混合流路部４４の長さが長すぎると、試料のロスが生じるため、５００ｍｍ以下、４００ｍｍ以下、３００ｍｍ以下、２００ｍｍ以下、１００ｍｍ以下、または５０ｍｍ以下であってよい。具体例としては、図３２～３５に示す幅と長さが挙げられる。
＜検出部＞
　複合体を検出するための手段を含む検出部５は、特に限定されず、例えば、電気化学的に又は光学的に上記複合体を検出する手段を備えていることが好ましく、特に、ナノポアを用いて複合体を検出するものであることが好ましい。また、リアルタイムＰＣＲ又は免疫学的方法によって前記核酸を検出する手段を備えてもよい。
　ナノポアによる検出は、例えば非特許文献１に記載のようなメカニズムによって検出できることができる。ナノポアは、脂質二重膜の上に膜貫通タンパク質を埋め込んだものであり、膜貫通タンパク質が開口部（ナノポア）を有している。脂質二重膜の両側に電圧をかける際に、電流が流れるが、複合体がこのナノポアの開口部に嵌ると、ナノポア内の電流値が一時的に低下し（ブロッキング）、また、ナノポアを通過またはキックアウトしてしまうと電流値が回復することで、複合体の存在を検出することができる。一方、核酸の場合は、サイズが小さいので、ナノポアに留まる時間が短い、または通過する際の電流値の変化が小さい（小さいブロッキング）ため、複合体との区別ができる。一方、核酸に結合していないＣＲＩＳＰＲ－ｄＣａｓ９の場合は、測定ｐＨ条件では正に帯電しておりナノポア内に侵入しない（図９）。
　非特許文献１で用いられている手法は、Ｓｏｌｉｄ　ｓｔａｔｅナノポア（固体ナノポア）と呼ばれるものである。固体ナノポアは半導体微細加工技術により、窒化シリコンやグラフェンなどの固体材料に電子ビームを照射することによりナノポアを形成したものである。固体ナノポアは作製するために大規模な装置が必要であり、ポア作製のコストやポア径への信頼性に課題が残っているのが現状である。
　一方本発明で用いられたナノポアは膜タンパク質を利用した生体ナノポアと呼ばれるものである。生体ナノポアは膜タンパク質の自発的な会合と膜への挿入により形成されるためポア形成が容易で、かつタンパク質工学的な改変を行うことにより、タンパク質１分子単位でポア径を調節することができる。従ってターゲットである核酸－タンパク質複合体のサイズに合わせた径を持つポアを設計、構築することができ、より感度の高い検出が可能となる。
　ポア径の調節方法は特に限定されないが、例えば膜タンパク質モノマーが複数会合してポアを形成するタイプのポアであれば、モノマー同士が相互作用する際の構造的な立体障害を排除または付与することによりポアを形成するモノマー数を制御し、ポア径の増大または減少を行うことができる。また、アミノ酸変異によりモノマーの主鎖の剛直化あるいは低温での実験によりモノマーの分子的なゆらぎを減らすことで、ポアを形成するモノマー数を制御することができる。またＤＮＡなどで望みの直径のポアを作成し、そこの膜タンパク質モノマーをリクルートすることで、任意の径のポアが形成できる。または、モノマーにアミノ酸のランダム変異を導入し、任意のポア径を形成する分子を選別することで、任意のポア径を形成できる。モノマーは純粋な膜タンパク質に限定されず、例えば、モノマーとタンパク質マーカーを結合、共発現することで、タンパク質マーカーで修飾されたポアを作製することができる。このような修飾ポアに標的核酸を添加すると、標的核酸とタンパク質マーカーの結合による電流値の減少により、標的核酸が検出できる。また径を調節したポアに最適なサイズのタンパク質マーカーを選抜することにより、より感度の高い検出を達成できる。
　ナノポアのサイズは、複合体のサイズに合わせて調節すればよく特に限定されないが、例えば１～１００ｎｍであってよく、１５ｎｍ～４０ｎｍであることが好ましい。
　光学的に検出することは、例えば、蛍光検出、吸光検出のほか、赤外分光、近赤外分光、ラマン分光といった分光検出が挙げられる。
　マイクロ流体デバイス１は、例えば、ガラスまたは樹脂材料によって構成されたデバイス基板に溶菌部および分離部が設けられた一体型デバイスであってよく、また、溶菌部、分離部、および複合体形成部が設けられた一体型デバイス、もしくは、溶菌部、分離部、複合体形成部、および検出部が設けられた一体型デバイスであってもよい。なお、マイクロ流体デバイス１は、その機能を発揮するためにデバイス基板に接続される付加的な装置を備えてもよい。例えば、マイクロ流体デバイス１は、デバイス基板（具体的には、各機能部の入口および／または出口）に接続されるポンプ、チューブを備えてもよい。
　一実施形態のマイクロ流体デバイス１は、溶菌部２と、溶菌部と連通する分離部３と、分離部３と連通する複合体形成部４と、複合体形成部４と連通する検出部５を備えるものである。この場合は、検出部５が複合体形成部４で形成された複合体を検出する手段、例えば、電気化学的に又は光学的に前記複合体を検出する手段、特にナノポアを用いた検出手段を備えることが好ましい。
　別の実施形態のマイクロ流体デバイス１は、溶菌部２と、溶菌部と連通する分離部３と、分離部３と連通する検出部５を備えるものである。すなわち、複合体形成部を備えなくてもよい。この場合は、検出部５が分離部３で得られた核酸を検出する手段、例えば、リアルタイムＰＣＲ又は免疫学的方法による検出手段、を備えることが好ましい。
〔検出方法〕
　一実施形態の試料中の微生物を検出するための方法は、本発明のマイクロ流体デバイスを用いた方法である。また、使用されるマイクロ流体デバイスは一体化されたデバイス（一体型デバイス）であることが好ましい。
　一実施形態の検出方法は、溶菌部において、試料中の微生物を溶解する溶菌工程と、分離部において、微生物の溶解物から核酸を分離する分離工程とを含む。検出方法は、複合体形成部において、分離部で分離された核酸をタンパク質－核酸複合体に形成する複合体形成工程をさらに含んでもよく、また、検出部において、複合体形成部で形成されたタンパク質－核酸複合体を検出する検出工程をさらに含んでもよい。
　一実施形態の試料中の微生物を検出するための方法は、マイクロ流体デバイスを用いて、
　微生物を溶解して微生物の溶解物を得る工程と、
　上記得られた溶解物から核酸を分離する工程と
を含み、また、さらに、
　上記分離された核酸をタンパク質－核酸複合体に形成させる工程を含んでもよく、さらに、
　上記複合体を検出する工程
を含んでもよい。
　別の実施形態の検出方法は、溶菌部において、試料中の微生物を溶解する溶菌工程と、分離部において、溶菌部で得られた微生物の溶解物から核酸を分離する分離工程と、検出部において、分離部で分離された核酸を検出する検出工程とを含む。
実施例１　デバイスの作製および微生物の検出
（流路の設計とフォトマスク作成）
　流路の設計にはデザインソフトＩｌｌｕｓｔｒａｔｏｒ（アドビ株式会社製）を用いた。設計した流路（Ｃｈａｎｎｅｌ　６、Ｃｈａｎｎｅｌ　１）を図１に示す。Ｃｈａｎｎｅｌ　６の流路の幅は１００μｍであり、流路の詳細な構造は図３２（ａ）と同じである。その後東京プロセスサービス（ＴＯＰＲＯ）社に設計図を送付し、フォトマスク作成を依頼した。フォトマスクはサイズが４インチ、遮光／透過部：白部を遮光、黒部を透過、膜面：ガラス面から見て、印刷面がデザイン通りになるように作成した。
（マイクロ流路の鋳型作成）
　４インチＳｉウェハーを、ミラー面を上にしてプラズマ発生装置（ヤマト科学ＰＲ－２００）に入れ、１００Ｗ、３０秒で処理した。プラズマ処理後のウェハーをスピンコーターの中央部にセットし、ウェハー中央部に日本火薬社製ＳＵ－８レジスト（Ｃｈａｎｎｅｌ　１はＳＵ－８　３０２５を、Ｃｈａｎｎｅｌ　６はＳＵ－８　３０５０）をそれぞれ用いて、先端をカットしたスポイトにて滴下した。スポイトを使ってレジストをウェハー全面に広げた後、スピンコーターを回転させレジストを均一に塗布した。回転数は５００　ｒｐｍ×３０秒、５００→４０００　ｒｐｍ（１０秒）、４０００　ｒｐｍ×３０秒とした。９５℃で３０分以上温置したのち６５℃に温度を下げることでレジストを固化させた。室温に戻した後、膜厚を測定した。
（ＵＶ露光）
　Ｃｒ面がウェハーに接するようにマスクをＳｉウェハー上にセットし、ＵＶ露光装置（ナノテック社製）１５０Ｗで５秒露光した。露光後、再度９５℃で３０分温置した。
（現像と離型処理）
　ＳＵ－８　Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒをシャーレに入れ、ウェハーを浸して２，３分、適宜液面を揺らしながら現像した。ピンセットでウェハーをシャーレから上げ、傾けながら現像液を表裏両面にかけた。キムタオル上でコンプレッサーを当て、溶液を飛ばし、よく乾かした。その後、離型処理液として、ジメチルオクタデシルクロロシラン１％溶液（溶媒：トルエン）を作成し、シャーレに入れウェハーを浸して５分程度放置した。トルエンでウェハーを洗浄後、コンプレッサーで溶液を飛ばしてよく乾かした。
（ＰＤＭＳ作成）
　シリコンポッティング材ＳＩＬＰＯＴＴＭ１８４（ダウ・東レ社)Ｅｒａｓｔｏｍｅｒ　ＢａｓｅとＥｒａｓｔｏｍｅｒ　Ｃｕｒｉｎｇ　Ａｇｅｎｔを１０：１の割合で測り取り、混合した。作成した基盤上に調整液を流し込み、デシケータに入れ脱気した後、８５℃で３５分温置した。室温に戻した後、流路の周囲を切り出し、さらにトリミングした後、生検トレバンまたは皮ポンチ（２．０ｍｍ）で孔を開け、ピンセットで芯を抜いた。芯抜きしたＰＤＭＳ及びスライドガラスを、それぞれ貼り合わせる面を上にしてプラズマ発生装置に入れ、１００Ｗで１０秒処理後、シャーレの上にピンセットでスライドガラスを取り出し、ＰＤＭＳをスライドガラスに貼り付けた。流路の入口と出口に適切な径のシリコンチューブを差しこみ、評価に供した。
（セレウス菌株の培養）
　測定対象となるセレウス菌として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ　ＪＣＭ１７６９０株（セレウリド合成酵素遺伝子保有株）、ＮＢＲＣ３８３６株（セレウリド合成酵素遺伝子非保有株）を用いた。グリセロールストックから標準寒天培地上にストリークし、好気性条件下で、３０℃で一晩プレート培養を行った。トリプトソイブイヨン液体培地に植え継ぎ、３０℃で一晩振とう培養した。翌日、コロニーカウントにて菌数を概算した上で、ペプトン加食塩水で培養液の希釈系列を作製した。
（溶菌剤の選択）
　Ｃｈａｎｎｅｌ　６流路を検証に用いた。シリンジポンプを用いて３．０μｌ／ｍｉｎもしくは４．０μｌ／ｍｉｎで溶菌剤および微生物懸濁液（１０７　ｃｆｕ／ｍｌの菌濃度となるように０．９％食塩水に懸濁されたセレウス菌懸濁液）をそれぞれ送液した。溶菌剤には、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製Ｂ－ＰＥＲ、カチオン性のドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＤＴＡＢ、東京化成工業社、非イオン性のＴｒｉｔｏｎＸ－１００（富士フイルム和光純薬社）、アニオン性のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、富士フイルム和光純薬社）を終濃度１％になるように添加し、１５時間室温で反応させた後、Ｂｉｏｔｉｕｍ社製ＧｅｌＲｅｄにより核酸を染色して、キーエンス社のオールインワン蛍光顕微鏡ＢＺ－Ｘ８００を用いて観察を行った。結果を図２に示す。ＤＴＡＢ及びＴｒｉｔｏｎＸ－１００に関しては、Ｂ－ＰＥＲよりも赤色蛍光強度（図２中の明るい部分）は減少したものの、依然として菌体内に赤色の凝集体の蛍光が観察された。一方で、ＳＤＳに関しては、赤色蛍光強度が大きく減少しており、内部の核酸が効率的に菌体外へ拡散していることが示唆された。この結果から、核酸抽出にはアニオン性界面活性剤であるＳＤＳが適していると考えられた。
（ＳＤＳを用いたマイクロ流路内でのセレウス菌溶菌率の検証）
　溶菌部（溶菌流路）であるＣｈａｎｅｎｅｌ　６と分離部（分離流路）であるＣｈａｎｅｎｅｌ　１を用いた。溶菌剤としてＳＤＳを用いた。０．０５％、０．１％又は０．２％のＳＤＳ存在下、または０．１％ＳＤＳと２００μｇ／ｍｌ　ｐｒｏｔｅｉｎａｚｅ　Ｋ（富士フイルム和光純薬社製）、または０．０５％ＳＤＳと２００μｇ／ｍｌ　ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋでの溶菌率の検証を目的に、Ｃｈａｎｅｎｅｌ　６流路にシリンジポンプを用いて８．０μｌ／ｍｉｎで各溶菌剤および微生物懸濁液（１０７　ｃｆｕ／ｍｌの菌濃度となるように０．９％食塩水に懸濁されたセレウス菌懸濁液）をそれぞれ送液した。その後１ｍｍ径チューブでＣｈａｎｅｎｅｌ　１の入口に接続し、副流路出口（核酸回収口）からサンプルを採取した。
　溶菌率は、定量ＰＣＲにて算出した。プライマー、酵素などはＣｙｃｌｅａｖｅＰＣＲｔｍ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ（ＣＲＳ　ｇｅｎｅ）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社）に添付されているものを用いた。副流路出口から回収した溶菌液をＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により精製し、以下の条件により検証した。Ｈｏｌｄ（初期変性）：９５℃、１０ｓ→３ｓｔｅｐ　ＰＣＲ：４５ｃｙｃｌｅｓ（９５℃、５ｓ→５５℃、１０ｓ→７２℃、２０秒）。ｉｎ　ｖｉｔｒｏで同濃度の菌体液に、ＳＤＳ添加後一晩放置したサンプルのＣｔ値を「１００％溶菌した」コントロールと見なし、各ＳＤＳ濃度条件で流路内溶菌したサンプルの溶菌率をそれぞれ評価した。結果を図３に示す。０．２％ＳＤＳが最も溶菌率が高く６０％であった一方、０．１％ＳＤＳ、０．０５％ＳＤＳでは溶菌率が２０％以下であった。
　これまでのナノポア検出の検討において、「一定濃度以上のＳＤＳは脂質二重膜の形成を阻害する」ことが実験から確認され、ＳＤＳ濃度を下げても溶菌率を確保する必要が生じることが予測された。そこでＳＤＳ存在下でその溶菌効果を増強させるという報告（Mohammad, Shahriar et al. 2011“Effect of Proteinase-K on Genomic DNA Extraction from Gram-Positive Strains.” Stamford Journal of Pharmaceutical Sciences 4, no. 1: 53-57.)があるＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋを添加し、その溶菌率について検証した。図４に検証結果を示す。ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ添加により、０．１％ＳＤＳ添加時の溶菌度が２／３程度まで回復した。この結果から、ＳＤＳとｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋを併用することで、ＳＤＳ単独より溶菌率が向上することが示唆された。
（ＳＤＳ存在下での複合体形成の検証）
　溶菌、分離、複合体形成、および検出を一体型にするにあたり、溶菌の際に使用されるＳＤＳがｄＣａｓ９／ｓｇＲＮＡとターゲット核酸との複合体の形成を阻害する可能性があることが示唆された。そこで、Ｃｈａｎｎｅｌ　６とＣｈａｎｎｅｌ　１を経たサンプル内に含まれるＳＤＳ濃度において、複合体の形成が可能か否かについてｉｎ　ｖｉｔｒｏで検証した。
　０．２％のＳＤＳをＣｈａｎｎｅｌ　６に添加した場合、Ｃｈａｎｅｎｅｌ　６とＣｈａｎｎｅｌ　１を経た後のＳＤＳ濃度は約０．０２２５％であると算出された。１．５μｇ／μｌ　ｄＣａｓ９　ＮＬＳ（ニッポンジーン社製）３μｌ、２３μＭ　ｓｇＲＮＡ（５’－ＡＧＡＡＣＧＡＡＵＧＣＧＡＡＡＧＡＡＧＡＵＡＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ－３’（配列番号１）、ｃｅｓＡ遺伝子のＡＡＣＧＡＡＴＧＣＧＡＡＡＧＡＡＧＡＴＡＴＧＧ（配列番号２）をターゲットとし、ＮＥＢ社製ＥｎＧｅｎ　ｓｇＲＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔにて調整）１．５μｌを混合し、室温で５分間置いた。その後、１％ＳＤＳ　０．４５μｌ、セレウリド保有株から調整した８９ｎｇ／μｌ　ｃｅｓＡプラスミド　５μｌ、１０×Ｈバッファー（タカラ社製）２μｌ、ＭｉｌｌｉＱ（商標）水８．０５μｌを加え、３７度６０分温置した。その後、２．５μｌをとりグリセロール色素１μｌを添加、混合した。混合液はスーパーセップエース１０－２０％ゲル（富士フイルム和光純薬）とトリス－グリシンバッファー（ｐＨ９．５）を用いて、４℃、３０ｍＡで１３０分間泳動した。泳動後、１×ＧｅｌＲｅｄ溶液に浸し２０分間染色した。染色後ＵＶイメージャーにて撮影した。
　泳動後、染色したゲル写真を図５に示す。ＳＤＳ存在下／非存在下ともに、レーン２で見られたプラスミド単独のバンドはｄＣａｓ９／ｓｇＲＮＡを添加することで消失し、バンドがゲル上方にシフトしている（レーン３）ことから、約０．００２５％ＳＤＳは複合体の形成に影響を与えないことが示唆された。
（ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの複合体形成）
　Ｃｈａｎｎｅｌ　６で溶菌、Ｃｈａｎｎｅｌ　１で分離され、Ｃｈａｎｎｅｌ　１の出口（核酸回収口）から採取したサンプル４．５μｌに対し、０．１５μｇ／μｌ　ｄＣａｓ９　６μｌ、２．３μＭ　ｓｇＲＮＡ　３μｌとの混合溶液、１０×Ｈバッファー２μｌ、及びＭｉｌｌｉＱ（商標）水４．５μｌを加え、３７℃で６０分間温置した。溶液２．５μｌをとり、バッファー（２８０ｍＭ　ＫＣｌ、２０ｍＭ　ＤＴＴ、２０ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７））７．５μｌ、ＭｉｌｌｉＱ（商標）水３．１μｌ、ＳＬＯ（Ｓｔｒｅｐｔｏｌｙｓｉｎ　Ｏ、バイオアカデミア社製）１．９μｌ（終濃度１０００ｎＭ）を加えてナノポアでの評価に用いた。
（ｉｎ　ｖｉｔｒｏで形成した核酸－タンパク質複合体による電流阻害の評価）
　液的接触法により人工脂質二重膜を再構成できるマイクロデバイスの＋電極側の孔に、バッファー（１４０ｍＭ　ＫＣｌ、１０ｍＭ　ＤＴＴ、１０ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７）４．７μｌを添加した。―電極側には上述した複合体溶液４．７μｌを添加した。続いて各孔に脂質（Ａｖａｎｔｉ　Ｐｏｌａｒ　ｌｉｐｉｄｓ社製ＤｐｈＰＣ（１，２－ｄｉｐｈｙｔａｎｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）：シグマ社製Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ＝１：１（ｍｏｌ／ｍｏｌ））を添加し、ＰＩＣＯ２（テスラ社製）にセットした。１００ｍＶの電圧下、膜タンパク質が挿入されるのに適切な脂質二重膜（膜容量６５～７０ｐＦ）を、トレース棒を用いて形成した。脂質二重膜上での膜タンパク質の会合によるポア形成及びポア内部への分子の侵入を、電流値の変化により検出した。解析はＣｌａｍｐｅｘ（フリーソフト）により行い、ポア内の電流が阻害された場合の電流値から算出されるｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅと、電流が阻害された時間（Ｄｕｒａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ）を算出した。
　検出されたＢｌｏｃｋｉｎｇ　ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅとＤｕｒａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅをプロットした結果を図６（Ｄ）に示す。ＳＬＯのみ（図６（Ａ））、ＳＬＯとｃｅｓＡプラスミド（図６（Ｂ））及びＳＬＯとｄＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ（図６（Ｃ））を添加した場合では見られなかった長いＤｕｒａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅのシグナルが、ＳＬＯとマイクロ流路出口から回収した溶菌液を添加した場合にのみ検出された。この結果より、ｄＣａｓ９／ｓｇＲＮＡとターゲットであるｃｅｓＡプラスミドの複合体がポア内部に侵入するときにのみ
Ｄｕｒａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅが長いシグナルが観測されることが示唆された。
（マイクロ流路内での複合体形成）
　Ｃｈａｎｎｅｌ　１の副流路出口と１ｍｍ径チューブでＣｈａｎｎｅｌ　６の入口に接続した。もう一つの入口からは０．１２μｇ／ｍｌ　ｄＣａｓ９、２．７μＭ　ｓｇＲＮＡ、１１０×Ｈ　ｂｕｆｆｅｒを混合した溶液を、シリンジポンプを用いて８．０μｌ／ｍｉｎで流入した。出口からサンプルを採取し、電流阻害評価実験に供した。
（マイクロ流路内で形成した核酸－タンパク質複合体による電流阻害の評価）
　上述した方法と同様、ＰＩＣＯ２による電流値の評価に、マイクロ流路内で形成した核酸－タンパク質複合体を供した。結果を図６（Ｅ）に示す。ｉｎ　ｖｉｔｒｏで形成した複合体を評価した場合（図６（Ｄ））同様、長いＤｕｒａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅのシグナルが検出された。この結果より、流路内で形成した複合体がポア内部に侵入し、それが電流値の変化により検出されたことが示唆された。
実施例２　溶菌部の流路構造の検討（流路構造による生菌率比較）
　実施例１で用いたＣｈａｎｅｎｅｌ　６に加えて、溶菌剤と微生物との流路内での混合がより効率的に進むような流路を複数設計し、その中でＣｈａｎｎｅｌ　Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、およびＪ流路を評価に用いた（図１０）。これらのＣｈａｎｅｎｅｌの構造の詳細は図３２～３５に示す。なお、Ｃｈａｎｅｎｅｌ　６およびＣｈａｎｎｅｌ　Ａの流路長（２ｂから２ｃまでの長さ）は共に２．５ｃｍであり、また、特に記載がない限り流路の幅（径）は１００μｍであった。シリンジポンプを用いて５．０μｌ／ｍｉｎで０．１％ＳＤＳおよび微生物懸濁液（菌数濃度１０１０ｃｆｕ／ｍｌ）をそれぞれ送液し、出口（２ｃ）からサンプルを採取した。溶菌度の評価方法に用いたコロニーカウントに関しては、回収液をペプトン水により１０５倍に希釈して１００　μｌプレートに播種し、３０℃で一晩培養した。流路に流す前の菌数と回収液でカウントされた菌数を比較し、生菌率を算出した。
（試験結果：流路構造による生菌率比較）
　Ｃｈａｎｎｅｌ　ＧおよびＣｈａｎｎｅｌ　Ｊについては、流路内で詰まりが確認された。（ａ）のＣｈａｎｎｅｌ　６と比較して、いずれの流路も生菌数が低下し、効率的に溶菌が進行していることが示唆された（図１１）。特に、Ｃｈａｎｎｅｌ　Ｈにおいて最も顕著な効果が見られ、次いでＣｈａｎｎｅｌ　Ｃ、Ｃｈａｎｎｅｌ　Ｉ、Ｃｈａｎｎｅｌ　Ａ、Ｃｈａｎｎｅｌ　Ｄの順に効果があった。
実施例３　溶菌剤の検討
（溶菌剤による生菌率比較）
　各種溶菌剤の溶菌度を比較した。評価には一貫して実施例１のＣｈａｎｅｌ　６を用いた。評価に用いた溶菌剤を図１２に示す。シリンジポンプを用いて５．０μｌ／ｍｉｎで各種溶菌剤および微生物懸濁液（菌数濃度１０９ｃｆｕ／ｍｌ）をそれぞれ送液し、出口（２ｃ）からサンプルを採取した。なお、添加濃度はいずれも終濃度が臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）になるように調製した。溶菌度の評価方法に用いたコロニーカウントに関しては、回収液をペプトン水により１０４倍に希釈して１００μｌプレートに播種し、３０℃で一晩培養した。流路に流す前の菌数と回収液でカウントされた菌数を比較し、生菌率を算出した。
（試験結果：溶菌剤による生菌率比較）
　ＳＤＳに対し、テトラデシル硫酸ナトリウム（ＳＴＳ）、ラウロイルサルコシン（ＬＳ）において、より高い溶菌効果が見られた（図１３）。一方で、オクタデシル硫酸ナトリウム（ＳＯＳ）、コール酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウムにおいては、生菌率が高く、溶菌効果をほとんど示さなかった。この結果から、溶菌剤にはＳＴＳおよびＬＳが有効であると考えられた。
（ＢｕｇＢｕｓｔｅｒおよびスルホベタインでの溶菌度比較）
　生菌率比較の結果を受け、定量ＰＣＲによる核酸回収率の比較により、溶菌度をより詳細に比較することとした。プライマー、酵素などはＣｙｃｌｅａｖｅＰＣＲＴＭ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ（ＣＲＳ　ｇｅｎｅ）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社）に添付されているものを用いた。回収液をＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により精製し、以下の条件により検証した。Ｈｏｌｄ（初期変性）：９５℃、１０ｓ→３ｓｔｅｐ　ＰＣＲ：４５ｃｙｃｌｅｓ（９５℃、５ｓ→５５℃、１０ｓ→７２℃、２０秒）。ｉｎ　ｖｉｔｒｏで同濃度の菌体液に、溶菌剤添加後一晩放置したサンプルのＣｔ値を「１００％溶菌した」コントロールと見なし、各溶菌剤で流路内溶菌したサンプルの溶菌率をそれぞれ評価した。有効だと考えられたＳＴＳ、ＬＳの評価に先んじて、高い溶菌効果を示すとされる市販溶菌試薬ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｅｒｃｋ社）を検証に用いることとした。スルホベタインの炭素鎖を改変したスルホベタイン－８（ＳＢ－８）、スルホベタイン－１４（ＳＢ－１４）を比較対象に加え、核酸回収率を比較した。
（試験結果：ＢｕｇＢｕｓｔｅｒおよびスルホベタインでの溶菌度比較）
　結果を図１４に示す。各種スルホベタインの回収量を比較すると、炭素鎖が短くなったＳＢ－８は回収率が低下し、炭素鎖が長くなったＳＢ－１４では回収率が向上した。この結果から、ＳＢ－１４についても、ＳＴＳ、ＬＳと同様、溶菌剤として有効であると判断し、次の検証に用いることとした。
（ＳＴＳ、ＬＳ、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ、ＳＢ－１４での溶菌度比較）
　これまでの検討で高い溶菌効果が見られたＳＴＳ、ＬＳ、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ、ＳＢ－１４について、ＳＤＳを含めて核酸回収率を一連で比較することとした。
（試験結果：ＳＴＳ、ＬＳ、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ、ＳＢ－１４での溶菌度比較）
　ＳＤＳに対して、いずれの溶菌剤でもより高い核酸回収率が見られたが、その中でＳＢ－１４が最も高い回収率を示した（図１５）。この結果から、ＳＢ－１４が溶菌剤として最適であると判断した。
実施例４　溶菌部流路構造と溶菌剤との組み合わせの検討
（溶菌剤と流路構造を組合せた場合の溶菌度比較）
　溶菌効果に関して、流路構造と溶菌剤の相乗効果が見られるか、核酸回収量を比較することで検証した。流路構造として実施例１のＣｈａｎｎｅｌ　６、Ｃｈａｎｎｅｌ　Ｈ、溶菌剤としてＳＤＳ、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ、ＳＢ－１４を用いた。
（試験結果：溶菌剤と流路構造を組合せた場合の溶菌度比較）
　Ｃｈａｎｎｅｌ６の流路の中で比較すると溶菌剤に関しては、ＳＢ－１４、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ、ＳＤＳの順で溶菌率が高かった（図１６（Ａ））。この傾向はＣｈａｎｎｅｌ　Ｈで見ても同様であった（図１６（Ｂ））。また流路構造で比較すると、いずれの溶菌剤でもＣｈａｎｎｅｌ　６よりＣｈａｎｎｅｌ　Ｈの方が高い溶菌効果を示した。ここまでの結果から、溶菌効果の高い流路として「Ｃｈａｎｎｅｌ　Ｈ」が、溶菌剤として「ＳＢ－１４」が適切で、両者を組み合わせることにより、ＳＤＳおよびＣｈａｎｎｅｌ　６を用いた場合と比較して、溶菌率が６０％から８９％まで向上することが示唆された。
実施例５　他の食中毒菌の検討
（他の食中毒菌での溶菌検証）
　本溶菌工程を他の食中毒菌にも展開可能か検証を行った。流路に関しては、Ｃｈａｎｎｅｌ　Ｈを、溶菌剤として、ＳＤＳ、汎用的に用いられる塩化ベンザルコニウム（ＢＣ）、ＳＢ－１４の３種類を用いた。対象の食中毒菌として、Ｌｉｓｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｉｃａを用いた。各種菌は、タカラバイオ社の定量ＰＣＲキットである、ＣｙｃｌｅａｖｅＰＣＲＴＭ　Ｌｉｓｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ　（ｉｎｌＡ　ｇｅｎｅ）　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ、ＣｙｃｌｅａｖｅＰＣＲＴＭ　Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　（ＤｎａＪ　ｇｅｎｅ）　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ、ＣｙｃｌｅａｖｅＰＣＲＴＭ　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２．０をそれぞれ用いた。前処理、および測定条件はセレウス菌と同様に行った。
（試験結果：他の食中毒菌での溶菌検証）
　結果を図１７に示す。４菌種いずれも流路内で溶菌がなされることが示唆された。菌種ごとに見ると、Ｌｉｓｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｓはセレウス菌と同様の傾向を示した（図１７（Ａ）、（Ｂ））。一方で、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓではＳＤＳとＳＢ－１４が同程度の溶菌率を示し（図１７（Ｃ））、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｉｃａに関しては、ＳＤＳの方が高い溶菌率を示した（図１７（Ｄ））。これは、膜構造の違い（グラム陽性／陰性）に起因するものと考えられる。この結果から、菌種に応じて適切な溶菌剤を設定することで、本溶菌工程を様々な食中毒菌に展開できる可能性が示唆された。
実施例６　複合体形成の検討
（ＦＲＥＴ評価系を用いた複合体形成工程の検証）
　複合体形成を評価する検出系として、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用いることとした。ＦＲＥＴ法は、近接した２個の色素分子間で、励起エネルギーが直接移動する現象のことを指す。一方の分子で吸収された光のエネルギーが他方に移動し、エネルギーを受け取った分子から蛍光が放射される。
　この原理を用いて、セレウス菌由来の核酸であるｃｅｓＡプラスミド、タンパク質ｄＣａｓ９の複合体形成を評価することとした。具体的には、ｃｅｓＡ、ｄＣａｓ９をそれぞれ別の蛍光色素で修飾し、両者が複合体を形成した際、それぞれ修飾している緑と赤の蛍光色素が近接し、ＦＲＥＴが発生する仕組みである。概念図を図１８に示す。ＦＲＥＴにより増大する赤色蛍光強度を指標に、複合体形成を定量的に評価した。
（ｃｅｓＡおよびｄＣａｓ９への蛍光色素修飾）
　ｃｅｓＡとｄＣａｓ９には、それぞれ市販のキットを用いて色素修飾を行った。ｃｅｓＡにはフルオレセイン、ｄＣａｓ９にはＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ５４６をそれぞれ修飾した。まずｃｅｓＡに関して、Ｌａｂｅｌ　ＩＴ（商標）　ＴｒａｃｋｅｒＴＭ　Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いた。ＭｉｌｌｉＱ（商標）水３７．５μｌ、１０×Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ　５μｌ、１ｍｇ／ｍｌ　ｃｅｓＡ　プラスミド　５μｌ、Ｌａｂｅｌ　ＩＴ　Ｒｅａｇｎｅｎｔ　１μｌを混合し、３７℃で１時間インキュベートして反応させた。反応後、エタノール沈殿により精製を行い、目的物を得た。
　ｄＣａｓ９への色素修飾には、Ａｌｅｘａ　ＦｌｕｏｒＴＭ　５４６　ＮＨＳ　Ｅｓｔｅｒ（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　Ｅｓｔｅｒ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた。ＤＭＦに溶解させた、１０ｍｇ／ｍｌ　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５４６　１μｌ、１５ｍｇ／ｍｌ　ｄＣａｓ９　６．７μｌ、０．２Ｍ　ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．３）１３．３μｌを混合し、室温で１時間インキュベートして反応させた。Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　０．５ｍＬ遠心式フィルター（Ｍｅｒｃｋ社）を用いて、精製を行い、目的物を得た。
実施例７　複合体形成部における各種流路構造の検討
（各種流路構造による複合体形成反応比較）
　複合体形成能の評価には、図１９に示す流路構造を用いた。Ｃｈａｎｎｅｌ　７はその流路長がＣｈａｎｎｅｌ　６のそれの２倍であるように、Ｃｈａｎｎｅｌ　５はその流路長がＣｈａｎｎｅｌ　６のそれの半分であるようにそれぞれ設計した。また、Ｃｈａｎｎｅｌ　Ｉを応用して、分岐、合流部を２倍に増やしたＣｈａｎｎｅｌ　Ｉ４を設計した。分岐、合流部を増やすことによる流路内詰まりの懸念が考えられたため、流路幅を途中から２倍に太くした設計とした。具体的には、４ｂから、４ｂと４ｃの中点（流路中央部４ｄ）までの（４ｂから４ｄまで、長さ１．２５ｃｍ）の流路幅は１００μｍであり、４ｂと４ｃの中点（流路中央部４ｄ）から４ｃまで（４ｄから４ｃまで、長さ１．２５ｃｍ）の流路幅を１００μｍから２００μｍとした。この流路幅変更の影響を見るために、Ｃｈａｎｎｅｌ　Ｉと分岐、合流部の数は等しく、途中から流路幅が２倍に変更されるＣｈａｎｎｅｌ　Ｉ２も併せて評価に用いた）。各種流路に対し、フルオレセイン修飾ｃｅｓＡ、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ５４６修飾ｄＣａｓ９を、それぞれ終濃度０．２５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌとなるように１×Ｈ　Ｂｕｆｆｅｒ（タカラ社製）に添加した。また、流路内で色素吸着を防ぐために、ＢＳＡを終濃度０．２％になるように添加した。ｃｅｓＡ溶液、ｄＣａｓ９溶液を、それぞれ２つの入口（４ａおよび４ｂ）から別々にして、シリンジポンプを用いて５．０μｌ／ｍｉｎで送液し、出口４ｃからサンプルを１０μｌずつ採取した。あらかじめ、ＮｕｎｃＴＭ　ＭｉｃｒｏＷｅｌｌＴＭ　９６－Ｗｅｌｌ、Ｎｕｎｃｌｏｎ　Ｄｅｌｔａ－Ｔｒｅａｔｅｄ、Ｆｌａｔ－Ｂｏｔｔｏｍ　Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社）に１×Ｈ　Ｂｕｆｆｅｒを９０μｌ添加しておき、サンプリング液１０μｌをウェルに加え、トータル１００μｌとなるようにした。回収完了後、各種サンプルについて蛍光スペクトル測定を行った。蛍光測定には、蛍光プレートリーダー　Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（商標）Ｍ２００（ＴＥＣＡＮ社）を用いた。励起波長は４３０ｎｍとし、１ｎｍごとに蛍光強度を測定し、５７２ｎｍ～５８１ｎｍの蛍光強度を平均した値を用いた。マイクロチューブ内でｃｅｓＡ溶液およびｄＣａｓ９溶液を添加し、１時間インキュベートしたサンプルを「１００％複合体形成した」コントロールと見なし、このサンプル液の蛍光強度と比較して、流路内複合体形成したサンプルの複合体形成率を評価した。
（試験結果：各種流路構造による複合体形成反応比較）
　図２０に各種流路での複合体形成率を比較した結果を示す。実施例１のＣｈａｎｎｅｌ　６から流路長を変更したＣｈｎａｎｎｅｌ　５およびＣｈａｎｎｅｌ　７、Ｃｈａｎｎｅｌ　Ｇでは形成率向上が見られなかった。さらに、溶菌工程で高い溶菌効果が見られたＣｈａｎｎｅｌ　Ｈにおいても、目立った向上は見られなかった。一方で、分岐、合流部を付与したＣｈａｎｎｅｌ　Ｉにおいては、複合体形成率に向上が見られた。流路幅の途中変更は、複合体形成においては影響せず、また実際に流路内の詰まりも見られなかった。さらに、分岐、合流部を増やしたＣｈａｎｎｅｌ　Ｉ４において、複合体形成率はさらに向上した。この結果から、複合体形成には、流路内の「分岐、合流」構造が影響しており、また検討したＣｈａｎｎｅｌの中、Ｃｈａｎｎｅｌ　Ｉ４が最適であることが示唆された。
実施例８　一体型検出デバイスの検討
（前処理一体型流路での溶菌度評価）
　本実施例では、「溶菌部」、「分離部」、および「複合体形成部」（を一体型に連結したデバイス（本明細書において「前処理一体型流路」と呼ぶ場合がある）の効果について検討した。実施例１と同じ方法で、前処理一体型流路を作製し、入口１（２ａ）および入口２（２ｂ）のそれぞれから微生物溶液および溶菌剤を添加することで、一体型流路の出口である出口４ｃから核酸が回収できるかどうか検証した。溶菌度評価には、３種類の一体型流路を用いた。最初に検討した一体型流路ｖｅｒ．１（図２１（Ａ））は、流路内抵抗を鑑みず連結を行った。流路内抵抗を鑑みて、流路構造を適宜に設計した流路がｖｅｒ．２－１である（図２１（Ｂ））。さらに、高い溶菌効果を示すＣｈａｎｎｅｌ　Ｈの構造を組み込んだ流路がｖｅｒ．２－２である（図２１（Ｃ））。ｖｅｒ．２－１の詳細構造は図２２および２３に示す。
（試験結果：前処理一体型流路での溶菌度評価）
　ｖｅｒ．１では、出口４ｃからの核酸回収量は１％に留まった（図２４）。この原因として、流路内抵抗を鑑みない設計としたため、流路内において逆流が生じ、大部分の核酸が出口４ｃにまで到達しなかった可能性が考えられた。一方で、流路内抵抗を鑑みて流路構造を適宜に設計したｖｅｒ．２－１では、全体の７割近い核酸を回収可能であった。さらに、ｖｅｒ．２－２では、その高い溶菌効果もあり、回収率が９割程度まで上昇した（図２４）。
（前処理一体型流路での複合体形成検証）
　続いて、前処理一体型流路における複合体形成率についても検討した。流路構造改変により、複合体形成能向上が見られた流路構造を、一体型流路の中に組み込んだ。図２５に新たに設計した前処理一体型流路の構造を示す。最も高い溶菌効果が見られたｖｅｒ．２－２（図２５（Ａ））に対して、複合体形成部において、Ｃｈａｎｎｅｌ　Ｉを組み込んだ流路をｖｅｒ．３－１（図２５（Ｂ））、Ｃｈａｎｎｅｌ　Ｉ４を組み込んだ流路をｖｅｒ．３－２とした（図２５（Ｃ））。これら３種の前処理一体型流路に関して、複合体形成率を比較した。
（試験結果：前処理一体型流路での複合体形成検証）
　ｖｅｒ．２－２、ｖｅｒ．３－１、ｖｅｒ．３－２で流複合体形成能を比較したところ、ｖｅｒ．３－２で最も高い複合体形成率が確認された（図２５）。この結果から、単独工程での複合体形成率比較検証と同様の傾向が見られることがわかった。以上の結果から、各種工程で効果が見られた流路構造を用いることで、一体型流路においても同様の傾向が見られることが示唆された。
（前処理＋検出一体型流路の作製）
　前処理一体型流路の出口４ｃを検出チャンバ（検出部）と見立てることで、前処理から検出までをシームレスに行える一体型デバイス（本明細書において「前処理＋検出一体型流路」または単に「一体型流路」と呼ぶことがある）を作製した。前述の前処理一体型流路ｖｅｒ．２－２の出口４ｃに、直径６ｍｍの穴を開け、一定量の溶液が検出部に蓄積するようにした（図２６（Ａ））。また、検出のハンドリングを考慮して、素材であるＰＤＭＳが１０～１３ｍｍの厚さになるように調整した（図２６（Ｂ））。このような構造にすることで、複合体を含む回収液である水層の上に脂質層を加え、両層の界面付近に検出部であるガラス銀電極を設置することが可能になった。
（一体型デバイスを用いたセレウス菌の電気化学的検出）
　一体型デバイス（図２７（Ａ））の入口１からセレウス菌（１×１０３ｃｆｕ/ｍｌ）を、入口２から溶菌剤（スルホベタイン－１４）を、入口３から１×Ｈバッファー（ＴＡＫＡＲＡ社製）に溶解したｄＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ複合体及びＳｔｒｅｐｔｏｌｙｓｉｎ　Ｏ（終濃度３０ｎＭ）の混合液を、それぞれ、５．０μｌ／ｍｉｎ、５．０μｌ／ｍｉｎ、４．０μｌ／ｍｉｎの流速でデバイス内に流入させた。４２分後、チャンバ内の溶液を除去した後、再び流入を開始した。１５分程度経過した後シリンジポンプを停止し、ヘキサデカンに溶解したＤＰｈＰＣ／Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（＝１：１(ｍｏｌ/ｍｏｌ)）を添加した。銀線ガラス電極を油層に差し込み、参照電極を流入した水槽に差し込み１００ｍＶで加電圧した。水圧マニュピレータにて電極をＺ軸型向に上下させることで脂質二重膜を形成し（Shoji, K., et al., Anal. Chem., 2020, 92, 10856-10862）、ポア挿入による電流値のステップ的な上昇とポア内に分子が挿入した際の電流値の低下を検出した。ＡＢＦファイルに変換後、Ｃｌａｍｐｅｘ（フリーソフト）により解析した。
（試験結果：一体型デバイスを用いたセレウス菌の検出）
　ポアが開いた状態で観測された電流値からの降下した電流値をＢｌｏｃｋｉｎｇ(ｐＡ)、その電流値を維持した時間をＤｕｒａｔｉｏｎ ｔｉｍｅとして、各シグナルを解析、プロットした結果を図２７（Ｂ）、図２７（Ｃ）、図２７（Ｄ）に示す。流路内にセレウス菌、溶菌剤、ｄＣａｓ９/ｓｇＲＮＡを流入した場合（図２７Ｂ）には、溶菌剤とｄＣａｓ９/ｓｇＲＮＡを流入した場合（図２７Ｃ）、セレウス菌、溶菌剤を流入した場合（図２７Ｄ）には見られないいくつかのシグナルがあることが明らかとなった。まず、Ｄｕｒａｔｉｏｎ ｔｉｍｅが１００秒以上で５０ｐＡ以下のシグナルが見られた（図２７（Ｂ））。次に、４００ｐＡ以上でＤｕｒａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅが０～７０秒程度のシグナルが見られた（図２７（Ｂ））。
　４００ｐＡ以上のＢｌｏｋｉｎｇかつ３０秒以上のＤｕｒａｔｉｏｎ ｔｉｍｅを持つ５つのシグナルについて図２８（Ａ）に示す。流路内にセレウス菌、溶菌剤、ｄＣａｓ９/ｓｇＲＮＡを流入した場合（シグナル番号７０、７３、７８、８０）についてシグナルの形を見てみると、分子がポア内に侵入し電流値の降下が見られた際には、ベースライン同様平坦なシグナルが観察された(図２８（Ｃ）)。対して、セレウス菌、溶菌剤を流入した場合（シグナル番号３）では、電流値降下後にシグナルの乱れが見られた(図２８（Ｂ）)。
　同様に、４００ｐＡ以上のＢｌｏｃｋｉｎｇかつ４秒以上２０秒以内のＤｕｒａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅを持つ９つのシグナル(図２９（Ａ）)についても、セレウス菌、溶菌剤、ｄＣａｓ９/ｓｇＲＮＡを流入した場合では平坦なシグナル(図２９（Ｃ）)、セレウス菌、溶菌剤を流入した場合にはシグナルの乱れが見られた(図２９（Ｂ）)。
　一方で、４００ｐＡ以上のＢｌｏｋｉｎｇかつ１秒以上４秒以内のＤｕｒａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅを持つシグナル（図３０（Ａ））については、セレウス菌、溶菌剤、ｄＣａｓ９／ｓｇＲＮＡを流入した場合でも、セレウス菌、溶菌剤を流入した場合でも同様の、平坦なシグナルが観察された（図３０（Ｂ）、図３０（Ｃ））。溶菌剤、ｄＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ　を流入させた場合、Ｄｕｒａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅが１秒以下のシグナルが多いことから（図２７（Ｃ））、ｄＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ　単独ではポアに詰まりにくいことが考えられる。一方、セレウス菌、溶菌剤（ＳＢ１４）を流入した場合では、Ｄｕｒａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅが１秒以上のシグナルが多いことから、おそらくマイナスチャージを帯びているため、セレウス菌由来核酸はポアに詰まりやすいと思われる（図２７（Ｄ））。
　上記の結果から、セレウス菌由来核酸がポアに詰まった場合、ポア内部で核酸が動くことにより、シグナルに乱れが生じているのではないかと考察される。一方で、セレウス菌由来核酸/ｄＣａｓ９/ｓｇＲＮＡ服合体はポア径と体積がフィットしていることから、ポア内部での動きが制限され、結果として平坦なシグナルが得られたのではないかと考えられる。一方で、４００ｐＡ以上のｂｌｏｃｋｉｎｇかつ４秒以内のＤｕｒａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅを示したシグナルについては、両者で明確な差が見られなかった。この結果は、一定時間ポアに分子が詰まらないと、ポア内部での分子の挙動がシグナルとして現れないことを示している。ただ、現状目視では差異が不明であるが、今後フーリエ変換や機械学習などでこれらのシグナルの差異を見分けることができれば、感度を向上させることが期待できる。
実施例９　一体型デバイスによるセレウス菌の検出
（調整粉乳中のセレウス菌の捕集と溶菌）
　調整粉乳（森永乳業社製）スティック１袋（１３ｇ）を熱湯１００ｍｌで溶解した後冷却し、セレウス菌を終濃度１×１０３ｃｆｕ／ｍｌとなるように添加した。次いで、これを孔径０．８μｍのｃｅｌｌｏｓｅ　ａｃｅｔａｔｅ製膜（アドバンテック社製）でろ過した。膜を生理食塩水１０ｍｌで３回洗浄した。最後にスルホベタイン－１４　０．５ｍｌを膜上にロードした後に溶菌液を回収した。
（一体型デバイスを用いた調整粉乳中のセレウス菌の電気化学的検出）
　一体型デバイス（図２７（Ａ））の入口１及び入口２から上記膜から回収したセレウス菌溶菌液を８．０μｌ／ｍｉｎの流速でデバイス内に流入させた。２０分後、流速を５．０μｌ／ｍｉｎに変更すると同時に、入口３から１×Ｈバッファー（ＴＡＫＡＲＡ社製）に溶解したｄＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ複合体及びＳｔｒｅｐｔｏｌｙｓｉｎ　Ｏ（終濃度３０ｎＭ）の混合液を流速４．０μｌ／ｍｉｎで流入させた。６０分後、チャンバ内の溶液を除去した後、再び流入を開始した。１５分程度経過した後シリンジポンプを停止し、ヘキサデカンに溶解したＤＰｈＰＣ／Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（＝１：１ (ｍｏｌ/ｍｏｌ)）を添加した。銀線ガラス電極を油層に差し込み、参照電極を流入した水槽に差し込み１００ｍＶで加電圧した。水圧マニュピレータにて電極をＺ軸型向に上下させることで脂質二重膜を形成し（Shoji, K., et al., Anal. Chem., 2020, 92, 10856-10862）、ポア挿入による電流値のステップ的な上昇とポア内に分子が挿入した際の電流値の低下を検出した。ＡＢＦファイルに変換後、Ｃｌａｍｐｅｘ（フリーソフト）により解析した。
（試験結果：一体型デバイスを用いた調整粉乳中のセレウス菌の検出）
　Ｂｌｏｃｋｉｎｇ(ｐＡ)、その電流値を維持した時間をＤｕｒａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅとして、各シグナルを解析、プロットした結果を図３１に示す。セレウス菌を添加していない場合、Ｄｕｒａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅが１秒以内のシグナルがほとんどであった（図３１（Ａ）、（Ｃ））。この結果から、調整粉乳中に含まれる乳脂肪やタンパク質、乳糖などの夾雑物は、おそらく電荷を持っていないせいでポア内に侵入することができないのではないかと考察される。
　対してセレウス菌を添加した場合、夾雑物と思われるＤｕｒａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅが１秒以内のシグナルに加え、セレウス菌非添加時には見られないシグナル（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｔｉｍｅが２００ｐＡ程度、Ｄｕｒａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅが数秒～数十秒のシグナル）が観察された（図３１（Ｂ）、（Ｄ））。この結果より、これらのシグナルがセレウス菌由来のシグナルであることが推察される。微生物の遺伝子を標的とする検出法として知られている定量ＰＣＲ法は、食品中の夾雑物による酵素反応の阻害やプローブ蛍光の阻害、プライマーのアニーリング阻害のためしばしば偽陰性となることが報告されている（https://foodmicrob.com/pcr-detection-bacteria-from-food/）。本願記載のナノポアを使用した遺伝子検出法では、夾雑物はポア内に侵入しにくいことから、ターゲット遺伝子とｄＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ複合体のみを効率よく検出できる可能性がある。
　１…マイクロ流体デバイス、２…溶菌部、２ａ…試料を受け入れる入口、２ｂ…溶菌剤を受け入れる入口、２ｃ…溶菌液を排出する出口、２Ｓ…溶菌流路、２１…第１溶菌流路部、２２…第２溶菌流路部、２３…溶菌分岐流路部、２４…溶菌混合流路部、２３ａ…溶菌分岐部、２３ｂ…溶菌合流部、３…分離部、３ａ…入口、３ｂ…夾雑物回収口、３ｃ…出口、３０…分離ユニット、３０ａ…第１結果物を出力する第１部分、３０ｂ…第１結果物を出力する第２部分、３１…第１分離流路部、３１１…第１細径流路部、３１２…太径流路部、３１３…第２細径流路部、３２…第２分離流路部、３２１…細径流路部、３２２…第１太径流路部、３２３…第２太径流路部、３３…分離分岐流路部、４…複合体形成部、４ａ…第１結果物を受け入れる入口、４ｂ…複合体形成物質を受け入れる入口、４ｃ…複合体を排出するの出口、４ｄ…流路中央部、４Ｓ…複合体流路、４１…第１複合体流路部、４２…第２複合体流路部、４３…複合体分岐流路部、４３ａ…複合体分岐部、４３ｂ…複合体合流部、４４…複合体混合流路部、５…検出部。

Claims (16)

  1. 　試料中の微生物を検出するためのマイクロ流体デバイスであって、
    　前記試料中の微生物を溶解するための溶菌部と、
    　前記溶菌部と連通して、前記溶菌部で形成された微生物の溶解物から核酸を分離するための分離部と
    を備え、
    　前記溶菌部は、微生物を溶解するための溶菌剤を保持する流路を備え、前記分離部は、前記溶解物中に含まれる核酸と他の物質とを分離できる手段を備える、デバイス。
  2. 　前記溶菌剤が、界面活性剤を含む、請求項１に記載のデバイス。
  3. 　前記分離部の分離手段が、分子サイズによる分離手段、遠心による分離手段、又は水力学的フィルトレーションによる分離手段である、請求項１に記載のデバイス。
  4. 　前記分離部と連通して、前記分離部で分離された核酸をタンパク質－核酸複合体に形成する複合体形成部と、
    　前記複合体形成部と連通して、前記複合体を検出するための手段を含む検出部と
    をさらに備える、請求項１に記載のデバイス。
  5. 　前記複合体形成部が、前記微生物由来の特定の核酸と、タンパク質－核酸複合体を形成できる物質を保持している流路を備える、請求項４に記載のデバイス。
  6. 　前記物質が、前記特定の核酸に特異的なｓｇＲＮＡが結合されているＣＲＩＳＰＲ－ｄＣａｓ９、又は、前記特定の核酸に特異的に結合するタンパク質マーカーである、請求項５に記載のデバイス。
  7. 　前記検出部において、電気化学的に又は光学的に前記複合体を検出する手段を備えている、請求項６に記載のデバイス。
  8. 　前記検出部において、ナノポアを用いて前記複合体を検出する、請求項６に記載のデバイス。
  9. 　前記分離部と連通して、前記分離部で分離された核酸を検出するための手段を含む検出部をさらに備える、請求項１に記載のデバイス。
  10. 　前記検出部において、リアルタイムＰＣＲ又は免疫学的方法によって前記核酸を検出する、請求項９に記載のデバイス。
  11. 　請求項１～８のいずれか一項に記載のデバイスを用いた、試料中の微生物を検出するための方法。
  12. 　溶菌部において、試料中の微生物を溶解する溶菌工程と、
    　分離部において、溶菌部で得られた微生物の溶解物から核酸を分離する分離工程と
    を含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 　複合体形成部において、分離部で分離された核酸をタンパク質－核酸複合体に形成する複合体形成工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 　検出部において、複合体形成部で形成されたタンパク質－核酸複合体を検出する検出工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 　請求項１～３、９及び１０のいずれか一項に記載のデバイスを用いた、試料中の微生物を検出するための方法。
  16. 　溶菌部において、試料中の微生物を溶解する溶菌工程と、
    　分離部において、溶菌部で得られた微生物の溶解物から核酸を分離する分離工程と、
    　検出部において、分離部で分離された核酸を検出する検出工程と
    を含む、請求項１５に記載の方法。

     
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