CN112831395B - 用于纳米孔测序的类细胞膜 - Google Patents

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Abstract

发明提出了一种用于纳米孔测序的类细胞膜。该纳米孔测序的类细胞膜，包括双分子层，所述双分子层包括数个双分子层结构，所述双分子层结构包括亲水端和疏水端，所述亲水端具有碳碳双键端基，所述数个双分子层通过分子间作用力相连。该用于纳米孔测序的类细胞膜对于纳米孔蛋白的稳定作用高于磷脂双分子层。

Description

用于纳米孔测序的类细胞膜
技术领域
本发明涉及测序领域，具体地，本发明涉及用于纳米孔测序的类细胞膜。
背景技术
纳米孔测序技术(又称第四代测序技术)是最近几年兴起的新一代测序技术。目前测序长度可以达到150kb；目前市场上广泛接受的纳米孔测序平台是Oxford NanoporeTechnologies(ONT)公司的MinION纳米孔测序仪。它的特点是单分子测序，测序读长长(超过150kb)，测序速度快，测序数据实时监控，机器方便携带等。纳米孔分析技术起源于Coulter计数器的发明以及单通道电流的记录技术。生理与医学诺贝尔奖获得者Neher和Sakamann在1976年利用膜片钳技术测量膜电势，研究膜蛋白及离子通道，推动了纳米孔测序技术的实际应用进程。1996年，Kasianowicz等提出了利用α-溶血素对DNA测序的新设想，是生物纳米孔单分子测序的里程碑标志。随后，MspA孔蛋白、噬菌体Phi29连接器等生物纳米孔的研究报道，丰富了纳米孔分析技术的研究。Li等在2001年开启了固态纳米孔研究的新时代。经过十几年的发展，现如今固态纳米孔技术日益发展成熟。目前用于DNA测序的纳米孔有两类：生物纳米孔(由某种蛋白质分子镶崁在磷脂膜上组成)和固态纳米孔(包括各种硅基材料、SiNx、碳纳米管、石墨烯、玻璃纳米管等)。DNA链的直径非常小(双链DNA直径约为2nm，单链DNA直径约为1nm)，对所采用的纳米孔的尺寸要求较苛刻。
因而，纳米孔测序领域仍有待发展。
发明内容
目前纳米孔测序领域，制约纳米孔测序的一个关键因素是承载纳米孔蛋白的类细胞膜的稳定性。目前类细胞膜常使用磷脂双分子层制备，由于磷脂具有天然的疏水段和亲水段，在界面排布时，其疏水段在中间，亲水段在两边，从而形成双分子层的结构。但是由于磷脂双分子层分子与分子间没有很强的相互作用，导致形成的双层膜很不稳定，实验操作或者纳米孔芯片移动过程中都会导致磷脂双分子层的破坏，从而严重影响了测序的进行。
基于上述问题的发现，发明人提出了利用嵌段共聚物模拟磷脂双分子层成膜，嵌段共聚物可以由亲水-疏水两嵌段构成，也可以由亲水-疏水-亲水三嵌段构成，其成膜原理跟磷脂双分子层类似，但是由于其分子与分子间存在的相互作用强于磷脂双分子层，故稳定性比磷脂层略好。发明人通过将双键引入嵌段共聚物的亲水段，待聚合物成膜，纳米孔蛋白嵌入完成后，将聚合物两端的双键跟溶液中的水凝胶单体分子共聚合交联，达到将聚合物膜分子牢牢绑在一起的效果，从而最大限度提高聚合物膜的稳定性。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种用于纳米孔测序的类细胞膜。根据本发明的实施例，所述纳米孔测序的类细胞膜，包括双分子层，所述双分子层包括数个双分子层结构，所述双分子层结构包括亲水端和疏水端，所述亲水端具有碳碳双键端基，所述数个双分子层通过分子间作用力相连。其中，所述分子间作用力包括范德华力、氢键等作用力。发明人利用具有碳碳双键端基的嵌段共聚物发生自组装形成双分子层替代磷脂双分子层作为纳米孔蛋白的类细胞膜，其分子间的相互作用力强于磷脂双分子层，且可以根据需要使末端修饰的双键发生自交联和/或与溶液中的游离单体交联，由此，根据本发明实施例的用于纳米孔测序的类细胞膜对于纳米孔蛋白的稳定作用高于磷脂双分子层。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种承载有纳米孔蛋白的用于纳米孔测序的类细胞膜。根据本发明的实施例，所述承载有纳米孔蛋白的用于纳米孔测序的类细胞膜包括：交联双分子层，所述交联双分子层由前面所述的类细胞膜的双分子层通过碳碳双键端基自交联形成；纳米孔蛋白，所述纳米孔蛋白设置于所述交联双分子层空隙内。根据本发明的实施例的类细胞膜通过端基双键发生自交联使得纳米孔蛋白被固定在类细胞膜之间，由此稳定性更高，且纳米孔蛋白不会脱落。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种承载有纳米孔蛋白的用于纳米孔测序的类细胞膜。根据本发明的实施例，所述承载有孔蛋白的用于纳米孔测序的类细胞膜包括：凝胶结构，至少部分的凝胶结构由凝胶单体与至少部分的前面所述的类细胞膜的双分子层通过碳碳双键端基交联形成；纳米孔蛋白，所述纳米孔蛋白设置于所述类细胞膜的双分子层空隙内。换句话说，类细胞膜的双分子层与缓冲液中游离单体相互交联，缓冲液中的单体也可相互交联形成凝胶，单体与双分子层交联将双分子层稳定包裹在凝胶环境中，而纳米孔蛋白又设置于所述双分子层空隙内。根据本发明的实施例的类细胞膜通过端基双键与凝胶单体发生交联使得纳米孔蛋白被固定在类细胞膜之间，由此稳定性更高，且纳米孔蛋白不会脱落。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种制备前面所述的用于纳米孔测序的类细胞膜的方法。根据本发明的实施例，将具有碳碳双键端基的嵌段共聚物自组装成膜，以便获得所述类细胞膜。根据本发明的一个具体实施例，自组装成膜可以是通过鼓泡的方式进行的。根据本发明实施例的方法制备获得的用于纳米孔测序的类细胞膜对于纳米孔蛋白的稳定作用高于磷脂双分子层。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种制备前面所述的承载有纳米孔蛋白的用于纳米孔测序的类细胞膜的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将纳米孔蛋白设置于前面所述的类细胞膜中，以便获得所述承载有纳米孔蛋白的用于纳米孔测序的类细胞膜。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种纳米孔测序装置。根据本发明的实施例，所述纳米孔测序装置包括纳米孔，所述纳米孔中设置有前面所述的承载有纳米孔蛋白的用于纳米孔测序的类细胞膜或依据前面所述的方法制备的承载有纳米孔蛋白的用于纳米孔测序的类细胞膜。由此，测序过程中纳米孔的类细胞膜能长时间稳定，且纳米孔蛋白不会脱落，能完成长时间测序。
在本发明的第七方面，本发明提出了一种纳米孔测序方法。根据本发明的实施例，所述方法包括利用前面所述的纳米孔测序装置对待测样核酸品进行测序，以便获得待测核酸样品的序列。由此，能长时间测序。
附图说明
图1是根据本发明实施例的交联结果图；
图2是根据本发明实施例的不交联的聚合物双层膜稳定性测试结果；
图3是根据本发明实施例的聚合物单独交联膜的稳定性测试结果；
图4是根据本发明实施例的聚合物与凝胶交联膜(插完蛋白后交联)的稳定性测试结果；以及
图5是根据本发明实施例的聚合物与凝胶交联膜(先交联后插蛋白)的稳定性测试结果。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，用于形成本申请的两亲嵌段共聚物的单体为常见的单体，该两亲嵌段共聚物含有亲、疏水段，端基具有OH修饰，端基羟基可进一步被修饰为碳碳双键，两亲嵌段共聚物可以是两嵌段(亲水-疏水)也可以是三嵌段(亲水-疏水-亲水)。
嵌段共聚物中的亲水单体和疏水单体不受特别限制。根据本发明的一个具体实施例，亲水单体可以为亲水性非离子型单体，如2-甲基-2-恶唑啉，丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟丙酯、N-羟甲基丙烯酰胺，甲基丙烯酸叔丁基氨基乙酯、甲基丙烯酸二甲氨基乙脂、甲基丙烯酸二乙氨基乙脂，甲基丙烯酸缩水甘油酯，环氧乙烷等。
根据本发明的一个具体实施例，疏水单体包括具有饱和的或不饱和的烷基、羟基烷基、烷基烷氧基、芳基烷氧基、烷基芳基烷氧基、芳基和芳基-烷基、烷基磺酸酯、芳基磺酸酯、硅氧烷及其组合的烯属不饱和单体。根据本发明的一个具体实施例，疏水单体的实例包括苯乙烯、α-甲基苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸甲酯、丙烯酸2-乙基己酯、丙烯酸辛酯、丙烯酸月桂酯、丙烯酸硬脂酯、丙烯酸山嵛酯、甲基丙烯酸2-乙基己酯、甲基丙烯酸辛酯、甲基丙烯酸月桂酯、甲基丙烯酸硬脂酯、甲基丙烯酸山嵛酯、2-乙基己基丙烯酰胺、辛基丙烯酰胺、月桂基丙烯酰胺、硬脂基丙烯酰胺、山嵛基丙烯酰胺、丙烯酸丙酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸戊酯、丙烯酸己酯、1-乙烯基萘、2-乙烯基萘、3-甲基苯乙烯、4-丙基苯乙烯、叔丁基苯乙烯、4-环己基苯乙烯、4-十二烷基苯乙烯、2-乙基-4-苄基苯乙烯和4-(苯基丁基)苯乙烯。也可以组合使用疏水单体。根据本发明的一个具体实施例，疏水单体可以选自硅氧烷、芳基磺酸酯以及饱和的和不饱和的任选具有官能性端基的烷基部分，其中烷基部分具有5-24个碳原子。例如，该烃基部分具有6-18个碳原子，该烷基部分具有8-16个碳原子。
用于纳米孔测序的类细胞膜
在本发明的第一方面，本发明提出了一种用于纳米孔测序的类细胞膜。根据本发明的实施例，所述纳米孔测序的类细胞膜，包括双分子层，所述双分子层包括数个双分子层结构，所述双分子层结构包括亲水端和疏水端，所述亲水端具有碳碳双键端基，所述数个双分子层通过分子间作用力相连。其中，所述分子间作用力包括范德华力、氢键等作用力。发明人利用具有碳碳双键端基的嵌段共聚物发生自组装形成双分子层替代磷脂双分子层作为纳米孔蛋白的类细胞膜，其分子间的相互作用力强于磷脂双分子层，且可以根据需要使末端修饰的双键发生自交联和/或者双键与缓冲液体系中游离的单体交联，形成水凝胶包裹的类细胞膜，由此，根据本发明实施例的用于纳米孔测序的类细胞膜对于纳米孔蛋白的稳定作用高于磷脂双分子层。
承载有纳米孔蛋白的用于纳米孔测序的类细胞膜
在本发明的第二方面，本发明提出了一种承载有纳米孔蛋白的用于纳米孔测序的类细胞膜。根据本发明的实施例，所述承载有纳米孔蛋白的用于纳米孔测序的类细胞膜包括：交联双分子层，所述交联双分子层由前面所述的类细胞膜的双分子层通过碳碳双键端基自交联形成；纳米孔蛋白，所述纳米孔蛋白设置于所述交联双分子层空隙内。根据本发明的实施例的类细胞膜通过端基双键发生自交联使得纳米孔蛋白被固定在类细胞膜之间，由此稳定性更高。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种承载有纳米孔蛋白的用于纳米孔测序的类细胞膜。根据本发明的实施例，所述承载有孔蛋白的用于纳米孔测序的类细胞膜包括：凝胶结构，至少部分的凝胶结构由凝胶单体与至少部分的前面所述的类细胞膜的双分子层通过碳碳双键端基交联形成；纳米孔蛋白，所述纳米孔蛋白设置于所述类细胞膜的双分子层空隙内。换句话说，类细胞膜的双分子层与缓冲液中游离单体相互交联，缓冲液中的单体也可相互交联形成凝胶，单体与双分子层交联将双分子层稳定包裹在凝胶环境中，而纳米孔蛋白又设置于所述双分子层空隙内。根据本发明的实施例的类细胞膜通过端基双键与凝胶单体发生交联使得纳米孔蛋白被固定在类细胞膜之间，由此稳定性进一步显著提高，且纳米孔蛋白不会脱落。
根据本发明的实施例，所述凝胶结构进一步由凝胶单体相互交联形成的。
根据本发明的实施例，所述交联在紫外光或者化学交联剂的条件下进行的。在紫外光照射或者化学交联剂分解的条件下，能使得嵌段共聚物的双键发生交联或者嵌段共聚物的双键与凝胶单体发生交联。
根据本发明的实施例，所述凝胶单体包括选自聚乙二醇-二甲基丙烯酸、甲基丙烯酸2-羟乙基酯和N-乙烯基吡咯烷酮的至少之一，所述凝胶单体通过交联的方式与所述交联双分子层连接。由此，类细胞膜更稳定，固定纳米孔蛋白更牢固。
根据本发明的实施例，所述纳米孔蛋白为hemolysin蛋白。
制备前面所述的用于纳米孔测序的类细胞膜的方法
在本发明的第四方面，本发明提出了一种制备前面所述的用于纳米孔测序的类细胞膜的方法。根据本发明的实施例，将具有碳碳双键端基的嵌段共聚物自组装成膜，以便获得所述类细胞膜。根据本发明的一个具体实施例，自组装成膜可以是通过鼓泡的方式进行的。根据本发明实施例的方法制备获得的用于纳米孔测序的类细胞膜对于纳米孔蛋白的稳定作用高于磷脂双分子层。
根据本发明的实施例，所述成膜是在纳米孔测试装置的纳米孔中进行的。
根据本发明的实施例，所述嵌段共聚物为两嵌段(亲水-疏水)或三嵌段(亲水-疏水-亲水)。
根据本发明的实施例，所述自组装是在膜片钳技术下进行的。根据本发明的一个具体实施例，所述膜片钳技术可以是：搭建纳米孔测试装置，使用Axopatch 200B PatchClam(Axon公司)膜片钳与数据采集卡1550A(Axon公司)搭建信号采集平台，使用带有100um的孔的槽(warner，BCH-M13)，向进行实验的槽两边的池子中都加入1mL的缓冲液，并分别通过Ag/AgCl连接膜片钳系统。其中，所述缓冲液不受特别限制，只要是不含阻聚剂的缓冲液就能达到本发明的效果，根据本发明的一个具体实施例，所述缓冲液包括1M KCl，10mMtris，1mM EDTA，pH 8.0。
根据本发明的实施例，所述共聚物是以溶解在正庚烷或者硅油中的形式提供的，所述共聚物的浓度为10mg/mL。根据本发明的一个具体实施例，所述共聚物在溶解前进一步包括干燥处理。
根据本发明的一个具体实施例，所述类细胞膜是通过如下方式获得的：带有150μm孔的阵列芯片先通入1ml的缓冲液，所述缓冲液的成分为1M KCl，10mM tris，1mM EDTA，pH8.0，后通入2μl溶解后的带双键的三嵌段共聚物的正癸烷溶液或者硅油溶液，在孔的周围利用鼓泡的方法成聚合物膜，然后再通入缓冲液将多余的油相冲走。同时，cis端的电极接地，trans端的电极施加180mV的电压，观察电流变化，当电流从超载变成0时，停止鼓泡；再施加1V的电压，观察膜是否能够被击破，在1V的作用下膜可以被击破，再重新鼓泡形成膜，测电容值在35pF-85pF，即可认为是双层聚合物膜，也就是本发明的用于纳米孔测序的类细胞膜。
根据本发明的实施例，所述纳米孔蛋白为hemolysin蛋白等膜蛋白
制备前面所述的承载有纳米孔蛋白的用于纳米孔测序的类细胞膜的方法
在本发明的第五方面，本发明提出了一种制备前面所述的承载有纳米孔蛋白的用于纳米孔测序的类细胞膜的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将纳米孔蛋白设置于前面所述的类细胞膜中，以便获得所述承载有纳米孔蛋白的用于纳米孔测序的类细胞膜。
根据本发明的实施例，将纳米孔蛋白设置于所述的类细胞膜中是通过如下方式实现的：1)所述纳米孔蛋白插入所述类细胞膜的双分子层空隙内；2)将插有所述纳米孔蛋白的类细胞膜进行交联处理，所述交联包括所述类细胞膜的双分子层与凝胶单体的交联。即纳米孔蛋白可以在交联前先插入类细胞膜中，然后再进行交联处理。
根据本发明的实施例，将纳米孔蛋白设置于所述的类细胞膜中是通过如下方式实现的：1)将所述类细胞膜进行交联处理，所述交联包括所述类细胞膜的双分子层与凝胶单体的交联；2)使所述纳米孔蛋白扩散进入交联处理后的类细胞膜中。即也可以先交联形成水凝胶，然后通过扩散作用将纳米孔蛋白从水凝胶中扩散进类细胞膜中。
根据本发明的实施例上述制备方式使得纳米孔蛋白被固定在类细胞膜之间，稳定性更高，且纳米孔蛋白不会脱落。
根据本发明的实施例，交联处理前，进一步包括检测电容，电容值为35～85pF，优选为50pF。由此，能保证仅插入一个纳米孔蛋白。根据本发明的一个具体实施例，向cis端加入1μl的纳米孔蛋白，使其在共聚物膜上进行自组装，检测电流，当电流值为110pA左右，此时可认为只有一个纳米孔蛋白插入。
根据本发明的实施例，所述纳米孔蛋白为hemolysin蛋白等膜蛋白。
根据本发明的实施例，也可以使用加入7.5％～15％w/v(g/ml)的聚乙二醇甲基丙烯酸单体的缓冲液，使用紫外光(30W，280nm)在距离孔约5cm的地方照射1小时，使共聚物与单体在紫外作用下进行交联。达到更好固定聚合物膜以及孔蛋白的效果。待交联完毕后，通入膜蛋白使其放置24小时左右插孔。该方式是先交联后插蛋白的方式。
根据本发明的实施例，也可以使用加入7.5％～15％w/v的聚乙二醇甲基丙烯酸单体的缓冲液，然后加入膜蛋白，等待一定时间(1小时内)使膜蛋白插入到类双层膜中，后使用紫外光(30W，280nm)在距离孔约5cm的地方照射1小时，使共聚物与单体在紫外作用下进行交联。该方式是先插蛋白后交联的方式。
根据本发明的实施例，所述交联处理在紫外光或者化学引发剂的作用下进行的。根据本发明的一个具体实施例，使用紫外光(30W，280nm)在距离纳米孔约5cm的地方照射1小时，使共聚物和溶液中的单体发生交联。
纳米孔测序装置
在本发明的第六方面，本发明提出了一种纳米孔测序装置。根据本发明的实施例，所述纳米孔测序装置包括纳米孔，所述纳米孔中设置有前面所述的承载有纳米孔蛋白的用于纳米孔测序的类细胞膜或依据前面所述的方法制备的承载有纳米孔蛋白的用于纳米孔测序的类细胞膜。由此，测序过程中纳米孔的类细胞膜能长时间稳定，且纳米孔蛋白不会脱落，能完成长时间测序。
纳米孔测序方法
在本发明的第七方面，本发明提出了一种纳米孔测序方法。根据本发明的实施例，所述方法包括利用前面所述的纳米孔测序装置对待测样核酸品进行测序，以便获得待测核酸样品的序列。由此，能长时间测序。
下面介绍本发明的具体实施例。
实施例1嵌段共聚物不交联成膜
1、将不修饰的三嵌段共聚物(6PMOXA-33PDMS-6PMOXA)溶于氯仿中，后将其在氩气的环境下进行干燥，并将干燥后的共聚物溶解在正癸烷或者硅油中，得到浓度为10mg/mL的溶解产物。
2、搭建纳米孔测试装置，使用Axopatch 200B Patch Clam(Axon公司)膜片钳与数据采集卡1550A(Axon公司)搭建信号采集平台，使用带有150um的孔的槽，向进行实验的槽两边的池子中都加入1mL的缓冲液(1M KCl，10mM tris，1mM EDTA，pH 8.0)，并分别通过Ag/AgCl连接膜片钳系统。
3、通入2μl 10mg/ml的带双键的三嵌段共聚物的正癸烷溶液或者硅油溶液，在孔的周围利用鼓泡的方法成聚合物膜，同时，cis端的电极接地，trans端的电极施加180mV的电压，观察电流变化，当电流从超载变成0时，停止鼓泡；再施加1V的电压，观察膜是否能够被击破，在1V的作用下膜可以被击破，再重新鼓泡形成膜，测电容值在35pF-85pF，即可认为是双层聚合物膜。
4、向cis端加入1μl的1μg/ml的hemolysin蛋白，使其在共聚物膜上进行自组装，检测电流，当电流值为110pA左右，此时可认为只有一个蛋白插入。
5.监测在该状态下，膜的寿命。
该方案可以成膜，但成膜不稳定，寿命只有6小时左右，结果如图2所示。
实施例2嵌段共聚物自交联
1、合成端基带双键(甲基丙烯酸酯)的三嵌段共聚物(6PMOXA-33PDMS-6PMOXA)，将其在氩气的环境下进行干燥，并将干燥后的共聚物溶解在正癸烷或者硅油中，得到浓度为10mg/mL的溶解产物。
2、搭建纳米孔测试装置，使用Axopatch 200B Patch Clam(Axon公司)膜片钳与数据采集卡1550A(Axon公司)搭建信号采集平台，使用带有150um的孔的槽，向进行实验的槽两边的池子中都加入1mL的缓冲液(1M KCl，10mM tris，1mM EDTA，pH 8.0，含0.5％光引发剂，如Irgacure 2959)，并分别通过Ag/AgCl连接膜片钳系统。
3、通入2μl 10mg/ml的带双键的三嵌段共聚物的正癸烷溶液或者硅油溶液，在孔的周围利用鼓泡的方法成聚合物膜，同时，cis端的电极接地，trans端的电极施加180mV的电压，观察电流变化，当电流从超载变成0时，停止鼓泡；再施加1V的电压，观察膜是否能够被击破，在1V的作用下膜可以被击破，再重新鼓泡形成膜，测电容值在35pF-85pF，即可认为是双层聚合物膜。
4、使用紫外光(30W，280nm)在距离孔约5cm的地方照射15min，使共聚物发生自交联。
5、向cis端加入1μl的1μg/ml的hemolysin蛋白，使其在共聚物膜上进行自组装，检测电流，当电流值为110pA左右，此时可认为只有一个蛋白插入。
6.监测在该状态下，膜的寿命。
该方案是聚合物单独交联形成的膜，形成的膜较不交联的聚合物稳定，可以稳定成膜10天，但是30cm高度下一摔膜即破裂，结果如图3所示。
实施例3嵌段共聚物与水凝胶交联(先插蛋白后交联)
1、合成两端带有甲基丙烯酸酯的三嵌段共聚物(6PMOXA-33PDMS-6PMOXA)，将其在氩气的环境下进行干燥，并将干燥后的共聚物溶解在正癸烷或者硅油中，得到浓度为10mg/mL的溶解产物。
2、搭建纳米孔测试装置，使用Axopatch 200B Patch Clam(Axon公司)膜片钳与数据采集卡1550A(Axon公司)搭建信号采集平台，使用带有100μm的孔的槽，向进行实验的流体槽内加入1mL的含10％w/v的聚乙二醇-二甲基丙烯酸单体的缓冲液(1M KCl，10mM tris，1mM EDTA，pH 8.0，含0.5％光引发剂Irgacure)，并分别通过Ag/AgCl连接膜片钳系统。3、通入2μl 10mg/ml的带双键的三嵌段共聚物的正癸烷溶液或者硅油溶液，在孔的周围利用鼓泡的方法成聚合物膜，同时，cis端的电极接地，trans端的电极施加180mV的电压，观察电流变化，当电流从超载变成0时，停止鼓泡；再施加1V的电压，观察膜是否能够被击破，在1V的作用下膜可以被击破，再重新鼓泡形成膜，测电容值在35pF-85pF，即可认为是双层聚合物膜。
4、向进行实验的流体槽内加入1mL的含10％w/v的聚乙二醇-二甲基丙烯酸单体的缓冲液(1M KCl，10mM tris，1mM EDTA，pH 8.0，含0.5％光引发剂Irgacure)，以冲走多余的油相。
5、向cis端加入1μl的1μg/ml的hemolysin蛋白，使其在共聚物膜上进行自组装，检测电流，当电流值为110pA左右，此时可认为只有一个蛋白插入。
6、使用紫外光(30W，280nm)在距离孔约5cm的地方照射一小时，使共聚物与凝胶在紫外作用下进行交联。
7.监测在该状态下，膜的寿命。
该方案可稳定成膜一个月以上，可耐30cm高度的摔打，结果如图4所示。
实施例4嵌段共聚物与水凝胶交联(先交联后插蛋白)
1.合成两端带有甲基丙烯酸酯的三嵌段共聚物(6PMOXA-33PDMS-6PMOXA)，将其在氩气的环境下进行干燥，并将干燥后的共聚物溶解在正癸烷或者硅油中，得到浓度为10mg/mL的溶解产物。
2.搭建纳米孔测试装置，使用Axopatch 200B Patch Clam(Axon公司)膜片钳与数据采集卡1550A(Axon公司)搭建信号采集平台，使用带有100um的孔的槽，向进行实验的流体槽内加入1mL的含10％w/v的聚乙二醇-二甲基丙烯酸单体的缓冲液(1M KCl，10mM tris，1mM EDTA，pH 8.0，含0.5％光引发剂Irgacure)，并分别通过Ag/AgCl连接膜片钳系统。
3.通入2μl 10mg/ml的带双键的三嵌段共聚物的正癸烷溶液或者硅油溶液，在孔的周围利用鼓泡的方法成聚合物膜，同时，cis端的电极接地，trans端的电极施加180mV的电压，观察电流变化，当电流从超载变成0时，停止鼓泡；再施加1V的电压，观察膜是否能够被击破，在1V的作用下膜可以被击破，再重新鼓泡形成膜，测电容值在50pF-100pF，即可认为是双层聚合物膜。
4.向进行实验的流体槽内加入1mL的含10％w/v的聚乙二醇-二甲基丙烯酸单体的缓冲液(1M KCl，10mM tris，1mM EDTA，pH 8.0，含0.5％光引发剂Irgacure)，以冲走多余的油相。
5.使用紫外光(30W，280nm)在距离孔约5cm的地方照射一小时，使共聚物与凝胶在紫外作用下进行交联。
6.向cis端加入1μl的1μg/ml的hemolysin蛋白，使其在共聚物膜上进行自组装，检测电流，当电流值为110pA左右，此时可认为只有一个蛋白插入，静置过夜后等待蛋白插孔。
7.监测在该状态下，膜的寿命。
该方案可稳定成膜一个月以上，可耐30cm高度的摔打，结果如图5所示。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (19)

1.一种承载有纳米孔蛋白的用于纳米孔测序的类细胞膜，其特征在于，包括：
凝胶结构，至少部分的凝胶结构由凝胶单体与至少部分的类细胞膜的双分子层通过碳碳双键端基交联形成，所述凝胶单体包括选自聚乙二醇-二甲基丙烯酸、甲基丙烯酸2-羟乙基酯和N-乙烯基吡咯烷酮的至少之一；
纳米孔蛋白，所述纳米孔蛋白设置于所述类细胞膜的双分子层空隙内；
其中，所述类细胞膜包括双分子层，所述双分子层包括数个双分子层结构，所述双分子层结构包括亲水端和疏水端，所述亲水端具有碳碳双键端基，所述数个双分子层结构通过分子间作用力相连；
所述类细胞膜包括嵌段共聚物，所述嵌段共聚物包括亲水单体和疏水单体，所述亲水单体包括亲水性非离子型单体，所述疏水单体包括具有饱和的或不饱和的烷基、羟基烷基、烷基烷氧基、芳基烷氧基、烷基芳基烷氧基、芳基和芳基-烷基、烷基磺酸酯、芳基磺酸酯、硅氧烷及其组合的烯属不饱和单体。
2.根据权利要求1所述的类细胞膜，其特征在于，所述凝胶结构进一步由凝胶单体相互交联形成；
任选地，所述交联在紫外光或者化学引发剂的条件下进行的。
3.根据权利要求1所述的类细胞膜，其特征在于，所述亲水性非离子型单体为2-甲基-2-恶唑啉，丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟丙酯、N-羟甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸叔丁基氨基乙酯、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、甲基丙烯酸二乙氨基乙酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯或环氧乙烷。
4.根据权利要求1所述的类细胞膜，所述纳米孔蛋白为hemolysin蛋白。
5.一种制备用于纳米孔测序的类细胞膜的方法，其特征在于，
将具有碳碳双键端基的嵌段共聚物自组装成膜，以便获得所述类细胞膜；
所述嵌段共聚物包括亲水单体和疏水单体，所述亲水单体包括亲水性非离子型单体，所述疏水单体包括具有饱和的或不饱和的烷基、羟基烷基、烷基烷氧基、芳基烷氧基、烷基芳基烷氧基、芳基和芳基-烷基、烷基磺酸酯、芳基磺酸酯、硅氧烷及其组合的烯属不饱和单体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述嵌段共聚物为两嵌段或三嵌段。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述成膜是在纳米孔测试装置的纳米孔中进行的。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述自组装是在膜片钳技术下进行的。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述共聚物是以溶解在正庚烷或者硅油中的形式提供的，所述共聚物的浓度为10mg/mL。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述亲水性非离子型单体为2-甲基-2-恶唑啉，丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟丙酯、N-羟甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸叔丁基氨基乙酯、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、甲基丙烯酸二乙氨基乙酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯或环氧乙烷。
11.一种制备权利要求1～4任一项所述的承载有纳米孔蛋白的用于纳米孔测序的类细胞膜的方法，其特征在于，将纳米孔蛋白设置于类细胞膜中；
其中，所述类细胞膜包括双分子层，所述双分子层包括数个双分子层结构，所述双分子层结构包括亲水端和疏水端，所述亲水端具有碳碳双键端基，所述数个双分子层结构通过分子间作用力相连；
所述类细胞膜包括嵌段共聚物，所述嵌段共聚物包括亲水单体和疏水单体，所述亲水单体包括亲水性非离子型单体，所述疏水单体包括具有饱和的或不饱和的烷基、羟基烷基、烷基烷氧基、芳基烷氧基、烷基芳基烷氧基、芳基和芳基-烷基、烷基磺酸酯、芳基磺酸酯、硅氧烷及其组合的烯属不饱和单体。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，将纳米孔蛋白设置于所述的类细胞膜中是通过如下方式实现的：
1)将所述纳米孔蛋白插入所述类细胞膜的双分子层空隙内；2)将插有所述纳米孔蛋白的类细胞膜进行交联处理，所述交联包括所述类细胞膜的双分子层与凝胶单体的交联。
13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，将纳米孔蛋白设置于所述的类细胞膜中是通过如下方式实现的：
1)将所述类细胞膜进行交联处理，所述交联包括所述类细胞膜的双分子层与凝胶单体的交联；
2)使所述纳米孔蛋白扩散进入交联处理后的类细胞膜中。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其特征在于，交联处理前，进一步包括检测电容，电容值为35-85pF。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述电容值为50pF。
16.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述纳米孔蛋白为hemolysin蛋白。
17.根据权利要求12或13所述的方法，其特征在于，所述凝胶单体包括选自聚乙二醇-二甲基丙烯酸、甲基丙烯酸2-羟乙基酯和N-乙烯基吡咯烷酮的至少之一。
18.根据权利要12或13所述的方法，其特征在于，所述交联处理是在紫外光下或者化学引发剂下进行的。
19.一种纳米孔测序装置，其特征在于，包括纳米孔，所述纳米孔中设置有权利要求1～4任一项所述的承载有纳米孔蛋白的用于纳米孔测序的类细胞膜或依据权利要求11～18任一项所述的方法制备的承载有纳米孔蛋白的用于纳米孔测序的类细胞膜。
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